PL84076B1 - - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 25.02.1977 84076 MKlP C07d 99/14 int. ca.2 C07D 499/04 CZYrtLNIAl UrzedtJ Potent«wtgo 1 Twórca wynalazku: Uprawniony z patentu: Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen (Republika Federalna Niemiec) Sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego przez enzymatyczne rozszczepienie penicylin Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego (6-APS) przez enzymatycz¬ ne rozszczepienie penicylin.Podczas wytwarzania kwasu 6-aminopenicylano¬ wego (6-APS) roztwór penicyliny G zadaje sie szla- 5 mem bakteryjnym zawierajacym enzym acylaze pe¬ nicylinowa (P.A.), (B.C. 3.5.111). Wskutek dzialania enzymu odszczepia sie boczne ugrupowanie kar- bonamidowe penicyliny bez otwarcia pierscienia (3-laktamowego. Na dzialaniu tego enzymu opiera io sie sposób wytwarzania 6-APS z penicyliny G we¬ dlug opisu patentowego RFN nr 1 111 778.Zastosowanie szlamu bakteryjnego, nr E. coli ATCC 11 105, ma nastepujace wady: szlam bakte¬ ryjny zawiera oprócz wewnatrzkomórkowej P.A. 15 dalsze proteiny i enzymy, jak równiez skladniki po¬ zywki lub ich produkty przemiany, które powstaly przy fermentacji, które to zanieczyszczenia przy przeróbce nie daja sie calkowicie wymyc z kry_ stalizowanego 6-APS; szlam bakteryjny moze byc 20 uzyty tylko raz, a zawiera on zanieczyszczenia i in¬ ne enzymy, które dezaktywuja penicyline G i/lub 6-APS przez otwarcie pierscienia |3-laktamowego, ponadto szlam bakteryjny zawiera tylko niewielkie ilosci P.A. Wprowadzenie wiekszej ilosci materialu 25 enzymatycznego, np. w celu osiagniecia krótszego czasu reakcji i przez to lepszych wydajnosci 6-APS przy mniejszej zawartosci produktów obcych, prak¬ tycznie nie jest mozliwe. Wydajnosci 6-APS uzy¬ skiwane w przemysle zaleza od zmiennego powsta- 30 2 / wania P.A. w kazdorazowych szarzach fermenta¬ cyjnych. Calkowite oddzielenie komórek bakteryj¬ nych wymaga przy przeróbce szarz zawierajacych 6-APS dodatkowego nakladu pracy, co powoduje straty wydajnosci. W celu usuniecia zanieczyszczen typu protein, które moga wywolywac reakcje aler- genowe, potrzebne sa dalsze zabiegi oczyszczajace (opisy patentowe brytyjskie nr nr 1.169.696; 1.078.847; 1.114.311).Próby wytwarzania 5-APS przez enzymatyczne rozszczepianie za pomoca acylazy penicylinowej przylaczonej do nosnika sa wprawdzie znane (z pu¬ blikacji Urzedu Patentowego RFN nr nr 1 917 057, 1 907 365), nie mogly byc jednak wprowadzone do skali technicznej.Znane sposoby opisane w cytowanych wyzej pu¬ blikacjach nie moga byc prowadzone na skale tech¬ niczna, poniewaz wymienione mieszanki enzymowe zawieraja niewystarczajace ilosci zwiazanego ak¬ tywnego enzymu i nie sa korzystne do techniczne¬ go wykorzystania z powodu mechanicznych wlasci¬ wosci.W publikacji Urzedu Patentowego RFN nr 1917057 opisane sa wylacznie rózne rodzaje materialów nosnikowych, z którymi enzym acylazy penicylino¬ wej moze byc zwiazany. Miedzy innymi jako no¬ sniki wymienione sa takie jak zywice z polimerów etylenu i bezwodnika kwasu maleinowego, zywice z polimeru kwasu akrylowego oraz polisacharydy.Zywice z polimerów etylenu i bezwodnika kwasu 84 07684 076 3 maleinowego (EMA) sa najbardziej zblizone do no¬ snika zastosowanego w sposobie wedlug wynalazku.Wedlug podanego porównawczego przykladu IV otrzymano preparat enzymowy w postaci zelu, który po zastosowaniu do rozszczepienia penicylin do kwasu 6-aminopenicylinowego moze byc od¬ dzielony tylko przez odwirowanie. Preparaty o ze¬ lowej strukturze nie nadaja sie do zastosowania w skali technicznej z punktu oceny gospodarczej.Preparaty enzymowe — zastosowane w sposobie wedlug wynalazku — jako substancje proszkowe moga byc oddzielone po procesie, np. za pomoca prostej filtracji lub nawet na drodze sedymentacji i ponownie zastosowane do rozszczepiania peni¬ cylin.Proces wedlug wynalazku jest wiec bardzo prosty do przeprowadzenia i korzystny pod wzgledem eko¬ nomicznym.W oparciu o przeprowadzone próby stwierdzono, ze na 150 ml zelu znaleziono tylko 9,8 jednostek nierozpuszczalnego enzymu. Tego rodzaju waska specyficznie aktywnosc preparatu enzymowego, za¬ wierajacego znany nosnik umozliwia hydrolize en¬ zymatyczna tylko okolo 3 g penicyliny -G-W w ciagu 9 godzin, podczas gdy w sposobie wedlug wynalazku do enzymatycznego rozszczepienia wy¬ magane jest zastosowanie 110 g wilgotnej zywicy zwiazanej z enzymem, przy czym czas trwania re¬ akcji wynosi 6 godzin.Z powyzszego porównania wynika wiec, ze nie¬ korzystne byloby zastosowanie znanych zywic do przemyslowej produkcji GAPS.W przeciwienstwie do tego, preparaty enzymowe o wysokiej specyficznej aktywnosci zastosowane w sposobie wedlug wynalazku rozszczepiaja penicyli¬ ny do 6-APS z wysoka wydajnoscia i nadaja sie do stosowania w wielkoprzemyslowej produkcji 6-APS.Wszystkie wymienione wady eliminuje sposób wedlug wynalazku, w którym zamiast szlamu bak¬ teryjnego stosuje sie ascylaze penicylinowa, kowa¬ lencyjnie zwiazana z polimerem mieszanym z ami¬ du akrylowego, amidu N,N'-metylenobisakrylowego i bezwodnika kwasu maleinowego, nierozpuszczalna w wodzie.Rozszczepienie penicylin sposobem wedlug wyna¬ lazku za pomoca acylazy penicylinowej zwiazanej z nosnikiem daje sie przeprowadzic w prosty spo¬ sób równiez w skali wielkotechnicznej. Nierozpu¬ szczalny enzym zawiesza sie w roztworze 75—150.000 E/m penicyliny, jak soli potasowej penicyliny G.Enzymatyczne rozszczepienie prowadzi sie przy sta¬ lej wartosci pH 6—8. Do neutralizacji odszczepio- nego kwasu fenylooctowego uzywa sie wodnego roztworu alkaliów, np. lugu sodowego lub potaso¬ wego, lub organicznych amin, korzystnie trójetylo- aminy. Za pomoca trójetyloaminy utrzymuje sie ak¬ tywnosc nierozpuszczalnego enzymu nawet po wie¬ lokrotnym uzyciu.Enzymatyczne rozszczepienie sposobem wedlug wynalazku prowadzi sie korzystnie przy wartosci pH 7,8. Przy wartosciach pH powyzej 8,0 penicy¬ lina lub 6-APS moze sie dezaktywowac przez otwar¬ cie pierscienia (3-laktamowego. Przy nizszych war¬ tosciach pH równowaga przesuwa sie na korzysc 4 produktu wyjsciowego, wskutek czego rozszczepie¬ nie pozostaje niezupelne. Korzystnie pracuje sie przy pH 7,8. Korzystniej jest rozpoczac rozszcze¬ pienie przy nizszej wartosci pH i pod koniec re- akcji podwyzszyc stopniowo wartosc pH do 7,8.Szybkosc reakcji zalezy od wsadu enzymu zwia¬ zanego z nosnikiem. Tak wiec szarza do rozszcze¬ pienia o stezeniu 100 000 E/ml soli potasowej peni¬ cyliny G hydrolizuje calkowicie po 12 godzinach przy wartosci pH 7,8 i w temperaturze 38°C do 6-APS i kwasu fenylooctowego, jezeli na jednostke acylazy penicyliny zastosuje sie 105 jednostek pe¬ nicyliny G. (1 jednostke enzymatyczna [E] okresla sie jako taka aktywnosc, która hydrolizuje 1 i^mol penicyliny G w ciagu 1 minuty w temperaturze 37°C do 6-APS i kwasu fenylooctowego). Jezeli na jednostke acylazy penicylinowej stosuje sie 5X104 jednostek penicyliny G, to calkowite rozszczepienie trwa 6 godzin. Mozliwy jest równiez krótszy czas reakcji przy jeszcze wyzszym wsadzie enzymu. Od¬ powiednio trzeba tym dluzej prowadzic rozszcze¬ pienie, im mniej zastosuje sie enzymu. Jednakze czas rozszczepienia dluzszy niz 20 godzin prowadzi do straty wydajnosci wskutek dezaktywacji peni- cyliny i/lub 6-APS. Temperatura reakcji enzyma¬ tycznego rozszczepienia wynosi korzystnie 38°C.Przy nizszych temperaturach obniza sie aktywnosc enzymu. Jezeli rozszczepianie prowadzi sie w tem¬ peraturze 25 °C, nalezy doprowadzic dwa razy tyle enzymu, co w temperaturze 38°C, o ile maja byc osiagniete te same czasy reakcji. Aktywnosc nie¬ rozpuszczalnej acylazy penicylinowej zwiazanej z nosnikiem wyraznie obniza sie w roztworach o wyzszych stezeniach substratu. Rozszczepienie roz- tworu o stezeniu 75 000 E/ml penicyliny G trwa 12 godzin, a o stezeniu 150 000 E/ml — 15 godzin, je¬ zeli zmienia sie tylko stezenie, ale nie zmienia sie stosunek enzymu do penicyliny G. Korzystnie sto¬ suje sie roztwory o stezeniu 75 000—100 000 E/ml 40 penicyliny G.W przypadku, gdy stosuje sie sposób wedlug wynalazku, 6-APS daje sie latwo wyizolowac. Za¬ wartosc 0,05% wagowych acylazy penicylinowej zwiazanej na nosniku jest tak mala, ze 6-APS prak- 45 tycznie nie absorbuje sie na nosniku. Acylaza pe¬ nicylinowa zwiazana na nosniku daje sie oddzielic po rozszczepieniu przez odwirowanie lub odsacze¬ nie i zastosowac wielokrotnie w dalszych proce¬ sach rozszczepienia. 6-APS powstaly przy enzyma- 50 tycznym rozszczepianiu otrzymuje sie w postaci krystalicznej z roztworu reakcyjnego, który oddzie¬ la sie od nierozpuszczalnego enzymu i nastepnie zateza pod zmniejszonym cisnieniem, przez wytra¬ cenie w punkcie izoelektrycznym przy wartosci pH 55 4,3. Przy rozszczepieniu penicyliny G za pomoca nierozpuszczalnego preparatu enzymatycznego spo¬ sobem wedlug wynalazku uzyskuje sie znacznie wyzsze wydajnosci 6-APS, niz przy uzyciu szlamu E. coli. W ten sposób jak to wykazano w przykla- 60 dzie, wyizolowano 6-APS przy wielokrotnym zasto¬ sowaniu nierozpuszczalnej acylazy penicylinowej z przecietna wydajnoscia 87% wydajnosci teoretycz¬ nej. Czystosc preparatów wynosila przecietnie 97%.Otrzymany w ten sposób 6-APS nie zawiera zad- 65 nych protein stanowiacych zanieczyszczenia. Ubocz-84 076 6 ne dzialanie alergenowe, które spowodowane sa przez proteiny, sa wylaczone w przypadku 6-APS otrzymanego sposobem wedlug wynalazku.Przyklad I. Wytwarzanie kwasu 6-aminope- nicylanowego (6-APS). 57 g wilgotnej acylazy pe¬ nicylinowej zwiazanej z nosnikiem (specyficzna ak¬ tywnosc 0,044 E/mg), który stanowi polimer mie¬ szany zawierajacy 450 g akryloamidu, 30 g N,N'- -metylenobisakryloamidu i 150 g kwasu maleino¬ wego, oraz 160 g soli potasowej penicyliny G do¬ daje sie po kolei do 2500 ml wody i miesza w tem¬ peraturze 38°C. Mieszanine utrzymuje sie przy sta¬ lej warosci pH 7,8 przez dodawanie trójetyloamin}^.Po 12 godzinach trójetyloamina przestaje sie wia¬ zac. Enzym zwiazany z nosnikiem odsacza sie, prze¬ mywa 100 ml wody i 100 ml 0,2 molarnego roztwo¬ ru soli kuchennej i stosuje ponownie w. dalszych szarzach rozszczepienia. Przesacz lacznie z woda przemywajaca zateza sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem do 300 ml i wytraca 6-APS w punkcie izo- elektrycznym przy wartosci pH 4,3 w obecnosci 500 ml ketonu metyloizobutylowego. Po uplywie 3 godzin w temperaturze 5°C odsacza sie i przemy¬ wa 200 ml wody oraz 200 ml acetonu. Suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C. Temperatura topnienia 2,08°C, wydajnosc 88,3%.Acylaze penicylinowa zwiazana z nosnikiem za¬ stosowano po kolei dziesieciokrotnie do enzyma¬ tycznego rozszczepienia penicyliny G jak opisano uprzednio. Uzyskane wydajnosci zestawiono poni¬ zej: 2 rozszczepienia 87,8% 3 rozszczepienia 86,3% 4 rozszczepienia 88,2% rozszczepienia 87,5% 6 rozszczepienia 86,9% 7 rozszczepienia 88,1% 8 rozszczepienia 87,5% 9 rozszczepienia 85,0% rozszczepienia 86,5% wydajnosc 87,2% Przyklad II. 110 g wilgotnej acylazy penicy¬ linowej zwiazanej z nosnikiem (specyficzna aktyw¬ nosc 0,044 E/mg) miesza sie tak jak opisano w przykladzie I ze 160 g soli potasowej penicyliny G w 2500 ml wody w ciagu 6 godzin w temperatu¬ rze 38°C przy wartosci pH 7,8. Wydajnosc 6-APS wynosi 89,5% wydajnosci teoretycznej.Przyklad III. 30 g wilgotnej acylazy penicy- linowej zwiazanej z nosnikiem (specyficzna aktyw¬ nosc 0,044 E/mg) miesza sie tak jak opisano w przykladzie I ze 160 g soli potasowej penicyliny G w 2500 ml wody w ciagu 20 godzin w temperatu¬ rze 38°C i przy wartosci pH 7,8. Wydajnosc 6-APS wynosi 86,1%.Przyklad IV. 10 g EMA-MDX 840-211 miesza sie w 1250 ml 0,05 m buforu fosforanowego przy wartosci pH = 7,6. Nastepnie dodaje sie 100 ml 1% roztworu wodzianu hydrazyny i w 2 minuty potem dodaje sie 17,4 ml roztworu zawierajacego 1150 jednostek acylazy penicylinowej. Zawartosc protein roztworu enzymowego wynosi 20 mg/ml. Mieszani¬ ne miesza sie przez 2 godziny w lazni z lodem i po¬ zostawia na noc w lodówce w temperaturze 5°C.Otrzymany preparat jest o konsystencji zelu i moz¬ na go oddzielic tylko przez odwirowanie. Po prze¬ myciu kazdorazowo 250 ml 1 m NaCl, 05 m NaHC03, 1 m NaCl i wody otrzymuje sie 160 g substancji w postaci zelu. Aktywnosc enzymatyczna wynosi 0,06 jednostek/g, co stanowi 0,83% wprowadzonej aktywnosci enzymu. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia paten to we 1. Sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicyla- nowego przez enzymatyczne rozszczepienie penicy¬ lin z wykorzystaniem acylazy penicylinowej osa¬ dzonej na nosniku, znamienny tym, ze roztwory penicyliny przy wartosci pH 6—8, korzystnie przy wartosci pH 7—7,8, oraz w temperaturze 20—50°C, korzystnie w temperaturze 38°C, kontaktuje sie z zawiesinami acylaz penicylinowych, które zwiaza¬ ne sa kowalencyjnie z polimerem mieszanym z amidu akrylowego, amidu N,N'-metylenobisakrylo- wego i bezwodnika kwasu maleinowego w ciagu 3—20 godzin, po czym mieszanine zobojetnia sie i kwas 6-aminopenicyla.nowy wyodrebnia sie w znany sposób.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, zn stosuje sie roztwór penicyliny G. .
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze mieszanine zobojetnia sie przez wprowadzenie or¬ ganicznej aminy, korzystnie trójetyloaminy. u 20 25 30 35 40 PL