JPH03998B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ (a) 緑葉植物の葉を固体部分と液体部分との
混合物からなるパルプに変換し、ただし該液体
部分が溶解しているリブロース１，５−二リン
酸カルボキシラーゼを含んでおり、 (b) 必要により、液体部分のPHをPH6.0から該蛋
白質が析出しない液体部分中の蛋白質の等電点
より十分上のPHまでの範囲内に調節し、 (c) 固体部分から液体部分を分離し、 (d) 該液体部分を該リブロース１，５−二リン酸
カルボキシラーゼが結晶化する温度に貯蔵する 諸工程からなることを特徴とするリブロース
１，５−二リン酸カルボキシラーゼを含む植物物
質の緑葉からリブロース１，５−二リン酸カルボ
キシラーゼを得る方法。 ２ リブロース１，５−二リン酸カルボキシラー
ゼの結晶を該液体から分離する請求の範囲第１項
記載の方法。 ３ 植物物質がたばこ植物からなる請求の範囲第
１項および第２項記載の方法。 ４ PHをPH5.3〜6.0の範囲内に調節する請求の範
囲第１項および第２項記載の方法。 ５ PHをPH5.3〜6.0の範囲内に調節する請求の範
囲第３項記載の方法。 ６ PHをPH5.4〜6.5の範囲内に調節する請求の範
囲第１項および第２項記載の方法。 ７ PHをPH5.4〜6.5の範囲内に調節する請求の範
囲第３項記載の方法。 ８ リブロース１，５−二リン酸カルボキシラー
ゼの分離後、液体部分のPHを溶解している蛋白質
の等電点またはそれ以下のPHに調節して該蛋白質
を析出させる請求の範囲第２項記載の方法。 ９ PHをPH4.0〜4.5の範囲内に調節する請求の範
囲第８項記載の方法。 １０ リブロース１，５−二リン酸カルボキシラ
ーゼが八角形結晶として結晶化する請求の範囲第
１項または第２項記載の方法。 １１ 植物物質がたばこ植物からなり、固体部分
が粗い粒状物質と細かい粒状物質とからなり、及
び、工程(d)で得られた液体部分からリブロース
１，５−二リン酸カルボキシラーゼを分離する工
程(e)をさらに含む請求の範囲第１項記載の方法。 １２ PHを調節する前に、粗い粒状物質を液体部
分から分離する請求の範囲第１１項記載の方法。 １３ 固体部分の分離前にPHを調節する請求の範
囲第１１項記載の方法。 １４ PHを5.3〜6.0の範囲内に調節する請求の範
囲第１１項，第１２項、および第１３項記載の方
法。 １５ PHを5.4〜5.6の範囲内に調節する請求の範
囲第１１項，第１２項、および第１３項記載の方
法。 １６ パルプを約48〜52℃の温度に加熱して該細
かい粒状の緑色物質を凝固させる請求の範囲第１
１項，第１２項、および第１３項記載の方法。 １７ 粗い粒状物質を液体部分から分離し、残留
物を約48〜52℃の温度に加熱して該細かい粒状の
緑色物質を凝固させる請求の範囲第１１項，第１
２項、および第１３項記載の方法。 １８ リブロース１，５−二リン酸カルボキシラ
ーゼの分離後、液体部分を溶解している蛋白質の
等電点以下に酸性にして該蛋白質を析出させる請
求の範囲第１１項，第１２項、および第１３項記
載の方法。 １９ PHを4.0〜4.5の範囲内に調節する請求の範
囲第１８項記載の方法。 ２０ たばこ植物の葉および茎部分をパルプに変
換する請求の範囲第１１項，第１２項、および第
１３項記載の方法。 ２１ 液体部分中の蛋白質の構造の一部を構成し
ているアミノ酸置換基の酸化を抑制するのに十分
な量で、還元剤を該植物物質に添加する請求の範
囲第１１項，第１２項、および第１３項記載の方
法。 ２２ 還元剤が２−メルカプトエタノールである
請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３ パルプに変換前に植物物質に該還元剤を添
加する請求の範囲第２１項記載の方法。 ２４ リブロース１，５−二リン酸カルボキシラ
ーゼが八角形結晶として析出する請求の範囲第１
１項，第１２項、および第１３項記載の方法。 発明の分野 広い面においては、本発明は植物の葉から蛋白
質の単離法に関する。別の面においては、本発明
は植物の緑葉からリブロース１，５−二リン酸カ
ルボキシラーゼを得る方法に関する。別のさらに
特別の面においては、本発明はたばこの葉からリ
ブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼを得
る方法に関する。 参照関連出願 本出願は1979年９月24日提出の本出願者らの係
属中の米国特許出願第78505号の一部継続出願で
あり、上記出願の記載を引用文献とする。 背景 たばこ、ほうれんそう、大豆、こむぎ、綿、む
らさきうまごやしを含め、ある種の植物の多汁葉
は固体10〜20％からなり、残りは水である。その
部分のうち、固体部分は水溶性部分と水不溶性部
分とからなり、後者は大部分葉の繊維状構造物質
から成つている。 水溶性化合物は２群に分けることができる。１
群は分子量が約10000を越えない糖、ビタミン、
アミノ酸およびその他の化合物のような比較的低
分子量の化合物を含む。第２の群は分子量が約
30000以上のほとんどもつぱら蛋白質である。 この蛋白質は２画分に分けることができる。１
画分は分子量が約30000〜100000の範囲である蛋
白質の混合物を含む。この蛋白質は時々「画分２
蛋白質」と呼ばれる。残りの画分は分子量約
550000を有する単一蛋白質からなり、時々「画分
１蛋白質」と呼ばれる。 画分１蛋白質は1947年にはじめて確認された。
次の研究はこの蛋白質が光合成に含まれる酵素で
あるという発見に導いた。そのとき以来、多数の
名前がつけられてきた。これらのなかにはリブロ
ース、１，５−二リン酸カルボキシラーゼ、カル
ボキシデイスムターゼ、リブロース１，５−二リ
ン酸カルボキシラーゼ、リブロース１，５−二リ
ン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼがある。 画分１蛋白質は葉の全蛋白質含量の25％までお
よび葉の固体物質の10％までを構成できる。1970
年にたばこの葉から結晶性画分１蛋白質を得るこ
とができることが発見された。 画分１蛋白質は純粋なときは無臭、無味、無色
で、高い栄養価をもつ。これらの性質から、およ
び高純度で得られることから、画分１蛋白質は動
物および人間に対する食品補充物として潜在的に
価値のある用途をもつと考えられる。人間の場
合、このような添加剤は高蛋白質またはその他の
特別な食餌の１成分であることができる。たとえ
ば、上記添加剤は腎臓病のため透析を必要とする
人の食餌への補充物として提案されてきている。 栽培植物中に比較的豊富にあるにもかかわら
ず、植物から画分１蛋白質を得るための当該技術
で既知の方法は商業的に可能ではないから、画分
１蛋白質は商業上重要な製品ではない。 画分１蛋白質を単離するための三つの基本的方
法が公表文献に記載されている。各公表の方法は
植物の葉または葉と茎をパルプにすることからは
じまり、ついでパルプから緑色ジユースをしぼ
る。細かい粒状の緑色顔料含有物質を含む緑色ジ
ユースをたとえば過または遠心分離によつて澄
明にして、液体から細かい粒状固体物質を分離す
る。生成液体はかつ色である。 画分１蛋白質単離のための記載の第１の方法
は、分子過によつてかつ色ジユース中の低分子
量化合物から部分分離すると同時に、画分１蛋白
質を濃縮することを伴なつた。細孔が画分１蛋白
質を通すことなく一層小さい分子を通すモレキユ
ラーシーブを使い、小分子がその細孔を通過する
ようにかつ色ジユースを加圧下に置した。 画分１蛋白質を含む溶液を約１／10に濃縮し、透 析して溶液中の小分子をさらに除去した。コロジ
オン型透析袋を使い透析を行なつた。上記袋の細
孔は画分１蛋白質の通過を許さないが、一層小さ
い分子を袋を通し水中に逃した。透析中、画分１
蛋白質の結晶が生成した。画分１蛋白質を単離す
るため開発された第２の方法は、葉から得られた
かつ色ジユースをセフアデツクスクロマトグラフ
イーカラムを通すことを伴なつた。セフアデツク
スは重合糖の水不溶性の微視的ビードからなつて
いる。分離を行なうためセフアデツクスＧ−25ま
たはＧ−50が使われた。適当なビードを選択する
と、一層大きな分子を排除して小分子がビードの
構造の内部に浸透することを可能にする。それ
故、一層大きい分子はしつかり充填されたセフア
デツクスビード間の隙間の液体中にのみ見出され
る。この隙間空間は「空げき容積」と呼ばれる。 有効な分離を達成するためには、かつ色ジユー
スの容積はビードの全容積の約25％を越えること
はできない。ビードをまず緩衝液と平衡にさせ、
ついで同一緩衝液を含むかつ色ジユースの所定容
積をセフアデツクスカラムの頂部に層にしてお
く。 このかつ色液を緩衝溶液を使つてカラムから溶
出する。ジユースがカラムを下方に動くにつれ、
小分子はビードの内部へ浸透するから小分子の通
過は遅延される。他方、大きな画分１の分子はビ
ード間の隙間により形成された迷路を通りカラム
を一層はやい速度で下方に動き、透明かつ色溶液
としてカラムから出る。しかし、溶出は該溶液を
少なくとも２倍希釈する。一層小さい分子の除去
は画分１蛋白質の分子のまわりの環境を変えて、
結晶化に導びく。 最も新しく記載の方法は上記のようにセフアデ
ツクスＧ−25カラムを通しかつ色ジユースを通過
させる。たばこ以外の全植物の抽出の場合のよう
に、画分１蛋白質が結晶化しないときは、溶液が
30〜50％飽和まで硫酸アンモニウムを添加する。
こうすると無定形物質が沈殿し、これを遠心分離
により集める。分離後、沈殿が析出した容量より
も少ない容量の緩衝液に沈殿を再溶解し、これに
ポリエチレングリコール８％を添加する。この混
合物をシリカゲルを含む別の開放皿に隣接した開
放皿に入れ、二つの皿を密閉容器に閉じ込める。
水が蛋白質溶液から徐々に蒸発し、シリカゲルに
より吸収される。時間の経過と共に、画分１蛋白
質の結晶を発達する。 上記の従来の当該技術の方法は時間を浪費し、
費用がかかるか、またはその両者であることは当
業者には明らかである。しかし、本出願人の係属
中の米国特許出願第78505号において、葉をパル
プに変換し、パルプの液体部分を蛋白質を変性さ
せる温度以下の温度に加熱し、ついで液体部分を
画分１蛋白質、すなわちリブロース１，５−二リ
ン酸カルボキシラーゼが結晶化する温度に冷す工
程からなる画分１蛋白質の簡単な単離法が記載さ
れている。 発明の要約 本出願人の係属中の米国特許出願第78505号に
記載の発明以来、緑葉植物の葉からリブロース
１，５−二リン酸カルボキシラーゼを単離する一
層簡単な一層有効な方法が発見された。この点に
関し、当該方法の必須部分とはじめには考えられ
ていた加熱工程を大抵の場合はぶけることが発見
された。この改良法によると、葉から得られたパ
ルプの液体部分のPHを約６から蛋白質が変性し無
定形塊として析出するPHより上のPH、すなわち約
PH5.0で起る等電点より上の値までの範囲の値に
調節することによつて、リブロース１，５−二リ
ン酸カルボキシラーゼを結晶形で得る。不溶物質
を分離後、液体を好ましくは常温以下に冷しなが
ら放置して、画分１蛋白質を結晶化させる。PHが
減少すると、すなわち等電点近くになると、結晶
化が一層容易に起こることが一般に認められた。 本発明の目的は画分１蛋白質の改良単離法を提
供するにある。 他の目的は高い収率と純度で画分１蛋白質を得
ることである。 これらの目的およびその他の目的を本発明によ
り遂行する方式を、次の発明の詳細な説明で記載
する。

【発明の詳細な説明】

多種類の葉からリブロース１，５−二リン酸カ
ルボキシラーゼおよび低分子量蛋白質の単離に本
発明の方法を使用できる。しかし、たばこの葉、
特に未熟たばこの葉は特に高い蛋白質源であるか
ら、本発明の方法にこのような葉を使うのが好ま
しい。したがつて、本発明を特にたばこからのリ
ブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼの単
離に関し記載する。 たばこ植物から葉を離した後、葉または小さい
植物が葉源である場合は葉と茎とを粉砕し、破砕
し、または他の方法でパルプに小さくし、固体か
ら葉の液体部分を遊離さす。好ましくは、パルプ
にする工程は還元剤の存在で実施する。この点に
関し、パルプにする工程は葉中に存在するフエノ
ールオキシダーゼ酵素を葉の蛋白質と接触させ
る。これは蛋白質の一次構造の一部分を構成する
チロシンのような芳香族アミノ酸の酵化をまね
く。この酸化はかつ色になることにより目でわか
るように蛋白質を変性し、その水溶解度を下げ
る。還元剤は事実この酸化を抑制する酸化防止剤
として作用する。 本発明で使うのに現在好ましい還元剤は２−メ
ルカプトエタノールである。このものは揮発性
で、下記のさらに処理中蒸発して、単離物質中に
ほとんどまたは全く残留物を残さないからであ
る。しかし、その他の還元剤も使用できる。この
なかにはメタ重亜硫酸ナトリウムおよびジチオト
レイトールのような試薬がある。たとえあつて
も、これらの試薬の残留物の分離は常法を使い行
なえる。酸化を制御するのに十分な還元剤の量は
たとえば選んだ試薬に依存し変化できる。２−メ
ルカプトエタノールの場合は、望ましくない酸化
を有効に抑制することは、処理する植物物質１Kg
当り該液体試薬約５mlを使つて達成できる。 植物物質の液体部分は画分１を含む植物蛋白質
および溶解形のその他の固体を含んでいる。パル
プの固体部分は粗い容易に分離される物質および
液体から分離困難な細かい粒状の緑色顔料含有物
質を含んでいる。粗い物質は葉物質をパルプに変
換した後すばやく液体部分から分離するのが好ま
しい。たとえば、チーズ布を使う簡単な過がこ
の分離を達成する。これを行なつたとき、なお細
かい粒状の緑色顔料含有物質を含んでいる液体部
分を必要なときは酸で、好ましくは塩酸で処理し
て、PHを望ましい範囲内に、すなわち約PH6.0か
ら液体部分中の蛋白質が変性しそれによつて無定
形塊として析出する等電点近くだがそれ以上の点
までの範囲内にする。この塊は画分１と画分２の
蛋白質物質の両者を含んでいる。蛋白質の等電点
は約PH5.0である。そこで、本発明に従いPHを調
節すべき実際的下限は約PH5.3である。液体を酸
性にした後、粗い物質の分離を実施できる。リン
酸および硫酸を含めその他の鉱酸も使用できる。 たばこの葉パルプの液体部分のPHは植物の年令
に従い変化することがわかつた。著しく若い植
物、すなわち約12インチ高さ以下の植物の場合
は、PHは約6.0以上の範囲である。植物が成熟す
るにつれ、液体部分のPHは下がり、すなわち液体
部分は当然一層酸性である。たとえば、18〜24イ
ンチの範囲の高さの植物からの液体のPHは約5.7
であり、一方24〜36インチの植物から得られた液
体部分は約5.3のPHを有していた。 最上の結果を得るためには、好ましくは液体の
PHを約5.4〜5.8の範囲に、最も好ましくは約5.4〜
5.6のPHに調節する。PHが約5.8以上であると、結
晶化は低PHよりも著しく遅い速度で起る。これに
対比し、PHを約5.4以下に調節すると、得られる
画分１蛋白質は望ましい物質を失なつている。PH
を等電点近くに調節すると、画分１蛋白質にその
変性で生じるものと類似の変化を起すと考えられ
る。たとえば、約5.4以下のPHで液体から結晶化
する画分１蛋白質を再溶解することは一層困難で
ある。 PHを好ましい範囲内5.4〜5.6に調節することに
よつて、細かい粒状緑色物質は一部分凝固するの
でその分離が容易になることも見出された。植物
葉緑素を含むこの物質は適当な方法で分離できる
が、遠心分離が便利で好ましい方法である。 ある場合には、特に一層成熟した植物からのパ
ルプ物質の場合には、または約5.6以上のPHを使
うときは、容易に分離するために細かい粒状緑色
物質を含む混合物を加熱する必要があり得る。加
熱工程は細かい粒状物質を上記のように遠心分離
により分離できる程度まで凝固する効果を有す
る。 緑色の細かい粒状物質の分離を容易にするた
め、全パルプを加熱できる。しかし、粗い物質を
除去後残るパルプ部分を加熱することが好まし
い。 加熱工程は蛋白質が熱のみにより変性する温度
以下の温度で実施する必要がある。そこで、一般
には加熱工程は約52℃以下で実施すべきである。
ほぼこの温度で加熱すると蛋白質の沈殿を生じる
からである。パルプを約48℃（118〓）で多くて
約15分加熱することによつて良好な結果が得られ
た。約48℃以下の温度を使用できるが、一層長い
加熱時間を必要とする。 本出願人の係属中の米国特許出願第78505号に
記載のように、熱処理を連続式でまたはバツチ式
で実施できる。そこで、バツチ法では、パルプを
容器に入れ、パルプの部分または少なくともその
液体部分が蛋白質が変性する温度まで加熱されな
い条件下でパルプに熱を伝導する。上記のよう
に、好ましくはパルプを50±１℃に約15〜約20分
加熱する。 連続法では、パルプの特定容量が50±１℃に約
15〜約20分熱交換により加熱されるような温度に
加熱された液体に浸漬したコイルを通し不当にか
くはんすることなくパルプをポンプ送りし、つい
でパルプの温度を下げるため50℃以下の温度の液
体と接触しているコイルを通しポンプ送りする。 細かい粒状物質を凝固さすための上記のような
パルプの加熱は、単にPHを調節するよりも一層有
効である。しかし、細かい粒状物質を除去するた
め必要な場合にだけ加熱法を使うべきである。加
熱は画分１蛋白質の結晶化が起る時間を長くし、
ある場合には得られる蛋白質の量を減らす実際的
効果を有するからである。 示したように、凝固後たとえば遠心分離によつ
て液体部分から細かい粒状物質を分離できる。得
られる上澄液体はかつ色ジユースである。このジ
ユースを結晶化が起る温度に、ふつうは室温また
はそれより低い温度で貯蔵し、画分１蛋白質の結
晶を得る。かつ色ジユースを約８℃に冷却するこ
とにより特に良好な結果が得られた。必要な最大
貯蔵時間は多くて約16時間である。16時間を越え
る貯蔵はふつう収率を改善しないことを経験し
た。結晶化したリブロース１，５−二リン酸カル
ボキシラーゼを過または遠心分離（3000RPM、
５分）により上澄液から分離する。 リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ
の結晶形は従来の当該技術の方法を使つて得られ
る３形態とは異なつている。形態結晶は十二面
体形を有し、モレキユラーシーブまたはセフアデ
ツクスクロマトグラフイーを使う上記方法により
製造される。形態結晶は極度に薄い板形を有
し、著しく特別な条件下でのみまたＸ線結晶学研
究のためにはごく少量でしか製造されていない。
形態結晶は四角両錐であり、上記の硫酸アンモ
ニウムおよびポリエチレングリコール処理により
製造される。 これに対比し、ここに記載の方法で製造された
画分１蛋白質結晶は、当該技術で既知の他の三つ
の結晶形と異なり第４の形態をとる。そこで、本
発明の方法を使うと、顕微鏡検査により明らかな
八角形をもつ画分１蛋白質結晶が高収率で高純度
で得られる。 食塩（NaCl）を含む水に再溶解する形態結
晶に対比し、八角形結晶は未溶解で残るが、結晶
を水酸化ナトリウム（NaOH）でPH7.5またはそ
れより高いPHに調節した水に懸濁すると一般に溶
液になる。かつ色ジユースが当然5.3のPHを有す
る著しく成熟した植物、すなわち高さ24〜36イン
チの植物から得られた蛋白質は水（NaOHの添
加によりPH8.5）に再溶解できない。再溶解した
画分１蛋白質を緩衝液に対し透析し（３回、PH
7.5）、ついでセフアデツクスカラムを通すと、再
結晶するが、形態結晶となる。 かつ色ジユースから得られる画分１結晶は、汚
染物を除くため水洗することにより便利に精製で
きる。また遠心分離により上澄液から結晶の分離
が最もよく達成される。５分間の低速遠心分離
（3000RPM）で足りる。 画分１蛋白質のこの結晶化法はかつ色ジユース
から上記蛋白質を実質上完全に除去する。得られ
る上澄液は画分２蛋白質、その他の可溶性固体、
およびあつたとしても未結晶化画分１蛋白質を含
んでいる。等電点以下に、すなわちPH5.0以下に
酸性にすることによつて、画分２蛋白質を上澄液
から除去できる。これは溶液中の蛋白質を沈殿さ
せる。塩酸またはその他の適当な酸の添加により
PHを約4.0〜4.5に調節することにより、蛋白質の
最高収率が得られる。得られる沈殿を遠心分離
（3000RPM、５分）により集めることができる。
沈殿を水洗し、ふたたび遠心分離により集めると
きは、汚染物を除去できる。 葉を刈入れ、これをパルプに変換し（粉砕、破
砕、またはその他の適当な方法によることができ
る）、PHを調節し、必要ならば加熱工程を行ない、
液体部分から固体物質を分離する間の時間経過
は、できるだけ刈入れ後すぐに遂行する必要があ
る。これらの工程の遂行における遅延は得られる
リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼの
収率を下げる。そこで、葉を刈入れる場所または
その付近でこれらの操作を行なうのが好ましい。 次の実施例は本発明のさらに詳細を示す。 実施例 １ 型NC95のたばこ植物を作物当り0.5平方フイー
トの作物密度で、18〜24インチの高さに達するま
で栽倍した。葉が濃緑色となるように該植物を栽
倍した。植物の全空気中部分を刈入れ、１ガロン
の大きさのウオーリングブレンダーに導入するの
に十分小さい片に切断した。ブレンダーの羽根を
水約200mlで蔽つた。（ウオーリングブレンダーは
羽根を液体中に沈めなければ植物物質を破解しな
い。しかし、リーツデイスインテグレーターのよ
うな他の装置では、水の添加は不必要である。） 刈り入れた植物物質から得られた粗く切り込ん
だ茎と葉の１Kgバツチを、２−メルカプトエタノ
ール５mlと共に水に添加し、滑らかなパルプにま
で配合した。濃いホツトケーキバターのコンシス
テンシーを有する得られたパルプは約1.2の容
量からなつていた。パルプ中の粗い物質を８イン
チ直径の32メツシユふるい上に支持された24／20
メツシユチーズ布の２層の上にあけた。上記ふる
いは捕集フラスコ内へ流出する大きな斗のなか
に置かれていた。 このように処理し、パルプ1.2から緑色顔料
含有物質を含む液体約1.0が得られた。この
「緑色ジユース」は異なる調製物において約5.7〜
5.9のPHを有していた。 この緑色ジユースを各々500mlの等しい試料に
分割した。１試料を25℃に保ち、他の試料は50℃
に10分加熱した。ついで両試料をベツクマン超遠
心機で／8000RPMのＲ−21回転子で30分同時に
遠心分離した。この高い遠心力は全ての緑色を沈
殿として除去し、透明な「かつ色ジユース」を残
した。かつ色ジユースの各試料、すなわち加熱試
料と加熱してない試料を等しい部分に分割し、一
つを８℃で貯蔵し、他を25℃で放置した。各試料
から画分１蛋白質の等しい量が結晶化した。結晶
化はすべての場合26時間以内に完結したが、かつ
色ジユースを冷凍した場合結晶が一層迅速にあら
われた。この実施例はリブロース１，５−二リン
酸カルボキシラーゼの結晶を得るのに、液体部分
の加熱は必須ではなかつたことを示している。 実施例 ２ 実施例１の操作を使い、高さ18〜24インチのた
ばこ植物からPH5.7を有する緑色ジユースを得た。
この緑色ジユースを二つの等しい部分に分割し
た。一つの部分のPHを水酸化ナトリウムを使いPH
6.2に調節した。両部分を50℃に10分加熱して、
適当な遠心分離を使う細かい粒状緑色物質の除去
を容易にした。緑色物質を除去後、かつ色ジユー
スの２試料を８℃で貯蔵した。数時間以内に、PH
5.7のかつ色ジユースでは結晶があらわれた。PH
6.2を有する試料では24時間後でさえ結晶はあら
われなかつた。同様の実験で、PH5.3を有する高
さ24〜36インチのたばこ植物から得られたかつ色
ジユースは30分以内に結晶を生じ、結晶が最初に
あらわれた後３時間以内に完全な結晶化が起つ
た。しかし、得られた画分１蛋白質はPH８〜8.5
で再溶解しなかつた。かつ色液がPH5.8である高
さ18〜24インチのたばこ植物を使つた別の実験
で、画分１蛋白質の結晶は12時間ではあらわれな
かつた。結晶化は16時間以内に完結した。これら
のデータから画分１蛋白質の結晶の生成は一層低
いPHで一層迅速に起ることがわかる。 実施例 ３ 実施例１の方法を使い、12インチ以下の高さの
著しく若いたばこ植物から緑色ジユースを得た。
こうして得たジユースはPH6.0を有していた。得
られた全ジユースを二つの等しい部分に分割し、
各部分をさらに処理するために四つの等しい試料
にさらに分割した。PH6.0を有するもとの部分の
各々から１試料を対照として使つた。各部分から
の１試料を塩酸で処理してPH5.8にし、別のもの
をPH5.6に調節し、別のものをPH5.4に調節した。
一つの部分の４試料を50℃に10分加熱した。これ
らの４試料および他の部分からの４試料を遠心分
離して細かい粒状の緑色物質を分離した。 全試料を８℃で放置して画分１蛋白質の結晶を
生成させた。結晶が最初にあらわれた時間を記録
し、結晶化が完結したとき、得られた結晶の量を
記録した。かつ色ジユースを分光測光的に分析
し、かつ色ジユースを汚染している微粉砕緑色粒
状物質の量を測定した。結果を次の第１表に示
す。

【表】 これらのデータから、画分１蛋白質の結晶化を
起すのに加熱は必要ではなくて、事実大抵の場合
結晶化速度を遅らせ、得られる蛋白質の量を減ら
すことがさらにわかる。PHを下げる効果は結晶化
が起る速度を明らかに増すことである。さらに、
試料の加熱は細かい粒状の緑色物質の分離を容易
にしたが、PHを5.4〜5.6に調節すると未加熱試料
でも緑色物質の完全な分離が起つた。 緑色ジユースおよび画分１蛋白質の結晶化後の
かつ色ジユースの分析遠心分離から得られたシユ
リーラン模様を比較することにより、PHを望む範
囲に調節した緑色ジユースからの画分１蛋白質の
分離効率を決定した。前者は２本のよく分離した
ピークを示し、その一つは画分１蛋白質に相当
し、他は画分２蛋白質に相当する。後者では、画
分２蛋白質に相当する単一のピークのみ観察され
る。分析遠心分離法は画分１蛋白質の0.1mg／ml
程度の少量を検出できるから、結晶化完結後は、
溶液中に残つている画分１蛋白質の濃度は１％以
下であると確信をもつて言える。これに対比し、
セフアデツクスカラムを使う従来の当該技術のク
ロマトグラフイー法から得られた母液は、画分２
蛋白質のほかに、未結晶化画分１蛋白質約30％を
含んでいた。 上記から、本発明は植物物質から蛋白質、特に
画分１蛋白質を得る便利な方法を提供することが
わかる。こうして、本発明の方法は従来の当該技
術の方法で必要としたような費用のかかる精巧な
分子過およびセフアデツクスカラムの必要性を
回避する。さらに、還元剤および液体のPHの調節
に使う酸以外の化学試薬を必要としない。還元剤
が２−メルカプトエタノールの場合は、画分１蛋
白質を得るための処理中蒸発し、または使う場合
の加熱工程中追出される。該液体をうすめる必要
がないから、画分２蛋白質の回収も簡単である。
最後に、液体部分から画分２蛋白質および未結晶
化画分１蛋白質の除去後、液体部分は従来の当該
技術の方法で得られる残留物を使う場合よりも一
層経済的に回収できる価値ある低分子量化合物を
なお含んでいる。これらは天然形で未希釈だから
である。これに対比し、従来の当該技術の方法で
得られた残留物はその方法で使われる化学薬品に
より汚染されており、また画分１蛋白質の分離中
希釈されており、さらに回収を複雑にする。本改
良法はまた大抵の場合本出願人の係属中の米国特
許出願第78505号に記載の加熱工程を使うことを
不必要とする。 本発明を現在好ましい具体化に関して記載して
きた。しかし、本発明の上記記載から、請求の範
囲によつてのみ限定される本発明の範囲から離れ
ることなく当該方法の変形が可能なことは当業者
には明らかである。