WO1997005273A1 - Verfahren zur messung der konzentration eines enzyms durch photometrische absorptionsmessung eines enzymatisch gebildeten farbstoffs in einer messlösung - Google Patents

Verfahren zur messung der konzentration eines enzyms durch photometrische absorptionsmessung eines enzymatisch gebildeten farbstoffs in einer messlösung Download PDF

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WO1997005273A1
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stop
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Elke SEIDEL-MÜLLER
Detlef Hintzen
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/10—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases p-Nitrophenol derivatives

Definitions

  • the invention relates to an improved method for measuring the concentration of an enzyme, in which the concentration of the enzyme is determined by photometrically measuring in a measuring solution the concentration of a dye formed enzymatically by the reaction of the enzyme with a substrate solution determined a light absorption measurement.
  • the invention relates to the determination of an enzyme that originates from a biological sample or is present as a label of a reaction partner of an enzyme immunoassay, with the aid of which physiologically important biomolecules in biological samples are determined.
  • the invention relates to the field of enzyme immunoassays, in particular those enzyme immunoassays in which the enzyme label bound to a reaction partner of the detection system is alkaline phosphatase, which, when controlled, acts on a p-nitrophenyl phosphate.
  • Substrate leads to the formation of the yellow dye p-nitrophenol, its presence and amount is measured photometrically at an absorption maximum of 405 nm after the enzymatic dye-forming reaction has ended by adding an aqueous stop solution, usually a 2n or 3n sodium hydroxide solution or an aqueous EDTA solution.
  • an aqueous stop solution usually a 2n or 3n sodium hydroxide solution or an aqueous EDTA solution.
  • the invention relates equally to the determination of enzymes in biological samples, especially if they use comparable dye formation for enzyme measurement.
  • the invention also relates to a stop solution as part of a kit for an enzyme determination in biological samples or a determination of an analyte based on the principle of an enzyme immunoassay if this solution contains the dye amaranth dissolved.
  • Enzyme immunoassays for the purposes of the present description are all immunoassays for the determination of antigens, haptens, antibodies, including autoantibodies, and other biomolecules in which an enzyme label is used to label a test component serving as a tracer, the present application specifically the describes preferred use of alkaline phosphatase as an enzyme label.
  • the component of the test system serving as a tracer can be a labeled antigen which competes with the antigen to be determined, for example, for the binding sites of an antibody immobilized on a solid phase, but the tracer component can also be a labeled specific antibody or universal anti-species.
  • part of the tracer component used which is labeled with the enzyme alkaline phosphatase, is bound to a solid phase.
  • the solid phase can be any solid phase used in the present field, ie it can be particulate or microdisperse or it can be the wall of the test vessel, eg the test tube or the cavity of a microtiter plate. After the immunological reaction has been carried out, this solid phase is separated from the liquid phase of the reaction mixture and washed.
  • a solid solution is added to the solid phase, which is usually a p-nitrophenyl phosphate solution if an enzyme label in the form of alkaline phosphatase is used.
  • the solid phase is incubated with the substrate solution for a predetermined time, and then the dye-forming reaction is stopped by adding a stop solution. After the stop solution has been added, the amount of the enzymatically formed dye is measured photometrically.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • BAP bone-specific alkaline phosphatase
  • the enzymatic reaction is stopped by adding a stop solution without the appearance of the measuring solution being changed thereby. It is an object of the present invention to improve the practical implementation of methods for the determination of enzymes, including the determination of enzymes which are label-bound to a reaction partner of an enzyme immunoassay, in such a way that simple and immediate control over the correct stopping is achieved the dye-forming enzymatic reaction is possible without the measuring accuracy of the determination method being impaired.
  • This object is achieved in a method for measuring the concentration of an enzyme, in which the concentration of the enzyme is determined by determining the concentration of a dye formed enzymatically by the reaction of the enzyme with a substrate solution in a measuring solution by means of a light absorption measurement, Solved according to the invention in that the photometric determination is carried out in the presence of a further dye which is added to the measuring solution together with a stop solution to stop the enzymatic dye-forming reaction and whose presence is used to measure the concentration of the enzymatic formed dye does not interfere.
  • the added further dye is added to the measurement solution with a conventional aqueous stop solution to stop dye formation in a p-nitrophenylphosphate substrate under the action of alkaline phosphatase, which is present as a label of a reaction partner of an enzyme immunoassay .
  • the dye used is preferably amaranth.
  • Amaranth also naphthol red S
  • the solution of the dye amaranth in a sodium hy hydroxide solution is deep red.
  • the color change immediately shows whether a stop solution has already been added to a developed substrate solution or not. Without the stop solution, the substrate solution is yellow; after adding the stop solution, it is dark orange to red.
  • the photometric evaluation is usually carried out at a wavelength of 405 nm, which corresponds to a pronounced maximum of the absorption spectrum of p-nitrophenol.
  • a dye such as amaranth
  • the photometric is Measurement of the developed substrate as possible in the case of adding an undyed stop solution, although the measured solution differs significantly from the eye due to a different color from a customary developed and / or stopped substrate solution.
  • amaranth concentrations in 2N NaOH are, for example, between 5 and 50 ⁇ g / ml, a concentration of 20 ⁇ g / ml, as used in the control experiments described below, having proven very suitable.
  • a colored stop solution ensures, in a simple and safe manner, immediate visual control of the correct execution of the assay without the correctness of the results of the determination method being adversely affected.
  • the figure shows in a single diagram the spectra of the dye amaranth in a 2N NaOH stop solution and a typical spectrum of a p-nitrophenylphosphate substrate solution after development by alkaline phosphatase, which is bound to an immobilized tracer component of an enzyme immunoassay .
  • the determination of the neopterin concentration in a biological sample is carried out by allowing the neopterin to be determined from the sample to compete with an enzyme conjugate of neopterin and alkaline phosphatase for the binding sites of anti-neopterin antibodies which are immobilized on a solid phase, usually the walls of the cavities of a microtiter plate.
  • the extent of the binding of the enzyme conjugate of neopterin and alkaline phosphatase to the solid phase is inversely proportional to the neopterin concentration in a patient sample.
  • High neopterin values in the sample thus manifest themselves as low optical density (OD) after the subsequent substrate development in the photometric measurement of the substrate solution obtained.
  • the optical density is measured in a plate photometer with an absorption maximum of 405 nm.
  • the results of the measurement of the optical density of a sample are evaluated with reference to a standard curve (optical density versus concentration of neopterin standards), from which the neopterin concentration of a patient sample can be read directly.
  • the usual stop solution was an aqueous 2N NaOH solution.
  • the inked stop solution was prepared by reacting 0.2 g of a commercially available Amaranth dye (Amaranth SiCO pharm-85 E 123; BASF) in 40 ml of a 2N NaOH solution (stop solution elitest ® neopterin) dissolved. The solution obtained was further diluted 1: 250 with 2N NaOH. It had a concentration of 20 ⁇ g amaranth / ml 2N NaOH.
  • each patient serum was first mixed with 150 ⁇ l of a solution of a conjugate of neopterin and alkaline phosphatase in the cavities of an uncoated microtiter plate according to the work instructions. 150 ⁇ l of the mixture obtained were then transferred to a microtiter plate coated with neopterin antibodies.
  • the mixture was incubated at room temperature for 30 + 5 min and the reaction was then stopped by adding 100 ⁇ l of a 2N NaOH stop solution, either an unstained or a colored stop solution according to the invention.
  • the optical density was then measured in a plate photometer (Titertek Multiscan Plus MKII) at a wavelength of 405 nm, and the measurement results were evaluated on the basis of a standard curve which had been prepared under the same conditions using standards of known neopterin concentration.
  • Pat1 9.7 9.8 9.7 9.8
  • Pat3 7.4 6.7 7.4 6.7
  • Pat 8 13.9 15.3 13.9 15.3
  • Pat 9 6.7 5.7 6.7 5.7
  • Pat 12 13.1 13.9 13.1 .13.9
  • Pat 13 3.7 3.6 3.7 3.6
  • Pat 16 28.5 31.1 28.5 31.1

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Abstract

Verfahren zur Messung der Konzentration eines Enzyms, bei dem man die Konzentration des Enzyms dadurch bestimmt, daß man die Konzentration eines durch die Umsetzung des Enzyms mit einer Substratlösung enzymatisch gebildeten Farbstoffs in einer Meßlösung photometrisch durch eine Lichtabsorptionsmessung bestimmt, bei dem man die photometrische Bestimmung in Gegenwart eines der Meßlösung zugesetzten weiteren Farbstoffs durchführt, dessen Anwesenheit die Messung der Konzentration des enzymatisch gebildeten Farbstoffs nicht stört. Im Falle der Bestimmung von alkalischer Phosphatase aus einer biologischen Probe oder aus einem Enzymimmunoassay ist ein bevorzugter Farbstoff Amaranth, und er wird der Meßlösung vorzugsweise zusammen mit einer Stopplösung zum Abstoppen der enzymatischen farbstoffbildenden Reaktion zugesetzt.

Description

Verfahren zur Messung der Konzentration eines Enzyms durch photometrische Absorptionsmessung eines enzymatisch gebilde¬ ten Farbstoffs in einer Meßlösung
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Mes¬ sung der Konzentration eines Enzyms, bei dem man die Konzen¬ tration des Enzyms dadurch bestimmt, daß man in einer Meßlö¬ sung die Konzentration eines durch die Umsetzung des Enzyms mit einer Substratlösung enzymatisch gebildeten Farbstoffs photometrisch durch eine Lichtabsorptionsmessung bestimmt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Bestimmung eines Enzyms, das aus einer biologischen Probe stammt oder als Label eines Reaktionspartners eines Enzym-Immunoassays vor¬ liegt, mit dessen Hilfe physiologisch wichtige Biomoleküle in biologischen Proben bestimmt werden.
Gemäß einem ihrer wichtisten Aspekte betrifft die Erfindung das Gebiet der Enzym-Immunoassays, und zwar insbesondere solche Enzym-Immunoassays, bei denen das an einen Reaktions- partner des NachweisSystems gebundene Enzymlabel alkalische Phosphatase ist, die bei ihrer kontrollierten Einwirkung auf ein p-Nitrophenylphosphat-Substrat zur Bildung des gelben Farbstoffs p-Nitrophenol führt, dessen Anwesenheit und Menge photometrisch bei einem Absorptionsmaximum von 405 nm gemes¬ sen wird, nachdem die enzymatische farbstoffbildende Reak¬ tion durch Zugabe einer wäßrigen Stopplösung, üblicherweise einer 2n oder 3n Natriumhydroxidlösung oder einer wäßrigen EDTA-Lösung, beendet wurde. Die Erfindung betrifft jedoch in gleichem Maße die Bestimmung von Enzymen in biologischen Proben, insbesondere, wenn diese eine vergleichbare Farb¬ stoffbildung für die Enzymmessung nutzen.
Die Erfindung betrifft auch eine Stopplösung als Bestandteil eines Kits für eine Enzymbestimmung in biologischen Proben oder eine nach dem Prinzip eines Enzym-Immunoassays arbei¬ tende Bestimmung eines Analyten, wenn diese Lösung den Farb¬ stoff Amaranth gelöst enthält.
Nachfolgend wird die Erfindung insbesondere unter Bezugnahme auf ihre Anwendung zur Verbesseung von Enzymimmunoassays näher beschrieben, es ist dem Fachmann jedoch ohne weiteres klar, daß sie auch bei anderen Bestimmungsverfahren genutzt werden kann, z.B. bei Verfahren zur Bestimmung von organ¬ spezifischer alkalischer Phosphatase in biologischen Proben, wie sie z.B. in der Patentanmeldung P 44 42 460.4 und der darin zitierten Literatur beschrieben sind.
Enzym-Immunoassays im Sinne der vorliegenden Beschreibung sind alle Immunoassays zur Bestimmung von Antigenen, Hapte- nen, Antikörpern, einschließlich von Autoantikörpern, sowie anderen Biomolekülen, bei denen zur Markierung einer als Tracer dienenden Testkomponente ein Enzymlabel verwendet wird, wobei die vorliegende Anmeldung speziell die bevor¬ zugte Verwendung von alkalischer Phosphatase als Enzymlabel beschreibt . Die als Tracer dienende Komponente des Testsy¬ stems kann ein markiertes Antigen sein, das beispielsweise mit dem zu bestimmenden Antigen um die Bindungsstellen eines an einer Festphase immobilisierten Antikörpers konkurriert, die Tracerkomponente kann jedoch auch ein markierter spezi¬ fischer Antikörper oder universeller Anti-Spezies-Antikörper oder ein markiertes Antikörperfragment oder ein markierter unspezifischer Binder oder ein markierter Partner eines Binderpaares wie z.B. Biotin/Avidin sein. Ergänzend wird auf die einschlägige Fachliteratur zu Enzym-Immunoassays oder ELISA-Assays verwiesen, z.B. auf das Buch "ELISA - Anwendung des Enzyme Linked Immunosorbent Assay im biologisch/medizi¬ nischen Labor", von D.M. Kemeny, Gustav Fischer Verlag, 1994. Von den genannten Enzym-Immunoassays sind auch dieje¬ nigen, bei denen irgendeine Art von markierten Antikörpern oder Antikörperfragmenten zum Einsatz kommt, dem Fachmann in verschiedenen Versionen gut bekannt . Die bekanntesten der¬ artigen Assays sind die sogenannten Sandwich- oder Zwei- seiten-Assays . Daß Assays, wie sie in den Patenten DE 41 20 412 Cl sowie 42 43 375 Cl der Anmelderin anhand von Ausführungsformen mit radioaktiv markierten Tracerkomponen¬ ten beschrieben werden, auch als Enzym-Immunoassays durch¬ geführt werden können, und daß daher die vorliegende Erfin¬ dung auch bei derartigen Verfahren zur Anwendung kommen kann, wird ergänzend ausdrücklich hervorgehoben.
Bei Enzym-Immunoassays, wie sie durch die vorliegende Erfin¬ dung verbessert werden, liegt am Ende der Umsetzung aller Reaktionspartner des immunologischen Testsystems ein Teil der eingesetzten Tracerkomponente, die mit dem Enzym alkali¬ sche Phosphatase markiert ist, an eine feste Phase gebunden vor. Die feste Phase kann dabei irgendeine auf dem vorlie¬ genden Fachgebiet verwendete feste Phase sein, d.h. sie kann teilchenformig oder mikrodispers vorliegen oder sie kann die Wand des Testgefäßes, z.B. des Teströhrchens oder der Kavi- tät einer Mikrotiterplatte, sein. Diese feste Phase wird nach der Durchführung der immunologischen Umsetzung von der flüssigen Phase der Reaktionsmischung abgetrennt und gewa¬ schen. Um festzustellen, ob und wieviel Enzymtracer an die feste Phase gebunden ist, wird die feste Phase mit einer Substratlδsung versetzt, die im Falle der Verwendung eines Enzymlabels in Form von alkalischer Phosphatase in der Regel eine p-Nitrophenylphosphat-Lösung ist. Die feste Phase wird mit der Substratlösung für eine vorgegebene Zeit inkubiert, und danach wird die farbstoffbildende Reaktion durch Zugabe einer Stopplösung gestoppt . Nach Zugabe der Stopplösung wird die Menge des enzymatisch gebildeten Farbstoffs photome¬ trisch gemessen.
Im Falle der enzymatischen Umwandlung von p-Nitrophenylphos- phat unter der Einwirkung alkalischer Phosphatase erfolgt das Abstoppen der Reaktion durch Zugabe einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung, die überlicherweise eine Konzentra¬ tion von 2n oder 3n aufweist, oder einer wäßrigen EDTA- Lösung (EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure) . Durch die Zugabe der Stopplösung wird zwar die farbstoffbildende Reaktion beendet, aber da die Stopplösung farblos ist und es bei ihrer Zugabe zu der enzymatisch entwickelten Substratlö¬ sung zu keiner Farbveränderung kommt, muß die mit der Assay- Durchführung betraute Person stets einen genauen Überblick darüber behalten, ob die Reaktion in einem bestimmten Te¬ strohrchen oder einer bestimmten Kavität einer Mikrotiter¬ platte abgestoppt wurde oder nicht. Es kommt jedoch immer wieder vor, daß die Aufmerksamkeit der den Test durchführen¬ den Person gestört wird oder die Bestimmung von einer ande¬ ren Person zu Ende geführt werden muß, so daß Unsicherheiten auftreten können, zu welchen Testrohrchen bzw. Kavitäten der Mikrotiter-Platte bereits Stopplösung zugesetzt wurde bzw. ob die Reaktion überhaupt bereits abgestoppt wurde. Eine Überprüfung z.B. durch eine pH-Messung kann nur dann erfol¬ gen, wenn man einen möglichen Fehler rechtzeitig vermutet, und sie kann die Durchführung der Bestimmung stören.
Ähnliches gilt für die direkte Bestimmung von z.B. knochen¬ spezifischer alkalischer Phosphatase (BAP) in einer biolo¬ gischen Probe durch Umsetzung einer Fraktion der Probe mit einem p-Nitrophenylphosphatsubstrat. Auch in diesem Falle wird die enzymatische Reaktion durch Zugabe einer Stopp¬ lösung abgestoppt, ohne daß sich das Aussehen der Meßlösung dadurch ändert. Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die praktische Durchführung von Verfahren zur Bestimmung von Enzymen, einschließlich einer Bestimmung von Enzymen, die als Label an einen Reaktionspartner eines Enzym-Immunoassays gebunden sind, so zu verbessern, daß eine einfache und unmittelbare Kontrolle über das ordnungsgemäße Abstoppen der farbstoff- bildenden enzymatischen Reaktion möglich ist, ohne daß die Meßgenauigkeit des Bestimmungsverfahrens beeinträchtig wird.
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zur Messung der Konzentration eines Enzyms, bei dem man die Konzentration des Enzyms dadurch bestimmt, daß man die Konzentration eines durch die Umsetzung des Enzyms mit einer Substratlösung enzymatisch gebildeten Farbstoffs in einer Meßlösung photo¬ metrisch durch eine Lichtabsorptionsmessung bestimmt, erfin¬ dungsgemäß dadurch gelöst, daß man die photometrische Be¬ stimmung in Gegenwart eines weiteren Farbstoffs durchführt, der der Meßlösung zusammen mit einer Stopplösung zum Ab¬ stoppen der enzymatischen farbstoffbildenden Reaktion zu¬ gesetzt wird und dessen Anwesenheit die Messung der Konzen¬ tration des enzymatisch gebildeten Farbstoffs nicht stört.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn man den zugesetzten weiteren Farbstoff der Meßlösung mit einer üblichen wäßrigen Stopplösung zum Stoppen der Farbstoffbildung in einem p- Nitrophenylphosphat-Substrat unter der Einwirkung von alka¬ lischer Phosphatase, die als Label eines Reaktionspartners eines Enzym-Immunoassays vorliegt, zugibt.
Vorzugsweise ist dann, wenn das Enzym alkalische Phosphatase ist und das Substrat p-Nitrophenylphopshat ist, der ver¬ wendete Farbstoff Amaranth. Amaranth (auch Naphtholrot S) ist die Trivialbezeichnung für den roten Azofarbstoff mit der chemischen Bezeichnung 1- (4-Sulfo-l-naphthylazo) -2- naphthol-3, 6-disulfonsäure. Seine Colour-Index Nr. ist CI. 16 185, die Chemical Abstracts Service Nr. ist CAS-Nr. 915- 67-3. Die Lösung des Farbstoffs Amaranth in einer Natriumhy- droxidlösung ist tiefrot.
Verwendet man eine Amaranth enthaltende Stopplösung, ist aufgrund der Farbveränderung sofort zu erkennen, ob einer entwickelten Substratlösung bereits eine Stopplösung zu¬ gesetzt wurde oder nicht. Ohne Stopplösung ist die Substrat- lösung gelb, nach Zugabe der Stopplösung ist sie dunkel- orange bis rot .
Es ist zwar an sich im Zusammenhang mit Immunoassays be¬ kannt, einzelnen Bestandteilen eines Kits zur Durchführung eines Enzym-Immunoassays Farbstoffe zuzusetzen, damit eine sofortige visuelle Kontrolle möglich ist, ob bestimmte Testkomponenten, z.B. bestimmte Puffer o.a., einer Reak¬ tionsmischung anleitungsgemäß zugesetzt wurden oder nicht. Derartige Farbstoffzusätze erfolgten jedoch bisher aus¬ schließlich zu den Komponenten des eigentlichen Reaktions¬ systems, jedoch nie zu Reagenzien für die Stufe der Farbent¬ wicklung in einer Substratlösung. Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß es möglich ist, die photometrische Auswertung der farbstoffbildenden enzymati¬ schen Reaktion störungsfrei auch in Anwesenheit eines Fremd¬ farbstoffs durchzuführen, wenn gewährleistet ist, daß dieser Licht einer Wellenlänge, wie sie für die photometrische Auswertung verwendet wird, unter den Testbedingungen nicht oder nicht nennenswert absorbiert. Das wird dadurch gewähr¬ leistet, daß man einen Farbstoff verwendet, dessen Absorp¬ tionsspektrum unter den Bedingungen, die nach Zugabe der Stopplösung in der entwickelten Substratlösung herrschen, ein ausgeprägtes Absorptionsminimum bei der Wellenlänge des Meßlichts aufweist. Bei Verwendung einer NaOH-Stopplösung bedeutet das, daß sein Absorptionsspektrum im stark Alkali¬ schen, d.h. bei einem pH von verdünnter NaOH, z.B. pH 10 bis 14, die geforderten Eigenschaften aufweisen muß. Außerdem darf der Farbstoff nicht mit dem Substrat, einem der enzyma¬ tisch daraus gebildeten Produkte oder dem Enzym selbst in irgendeine störende reaktive oder sonstige Wechselwirkung treten .
Im Falle der enzymatischen Bildung von p-Nitrophenol aus p-Nitrophenylphosphat erfolgt die photometrische Auswertung üblicherweise bei einer Wellenlänge von 405 nm, die einem ausgeprägten Maximum das Absorptionsspektrums von p-Nitro¬ phenol entspricht. Indem der Stopplösung ein Farbstoff wie Amaranth zugesetzt wird, dessen Absorptionsspektrum im gleichen Bereich ein ausgeprägtes Minimum aufweist und der daher das Meßlicht bestenfalls in einem vernachlässigbaren Ausmaß absorbiert und der auch nicht mit den in der Sub¬ stratlösung enthaltenen Substanzen reagiert, ist die photo¬ metrische Messung des entwickelten Substrats wie im Falle der Zugabe einer ungefärbten Stopplösung möglich, obwohl die vermessene Lösung sich für das Auge aufgrund einer anderen Farbe deutlich von einer üblichen entwickelten und/oder abgestoppten Substratlösung unterscheidet.
Der Gehalt des Farbstoffs Amaranth in der Stopplösung muß dabei hoch genug sein, so daß noch ein deutlicher Farbeffekt erhalten wird, sollte jedoch andererseits auch nicht zu hoch sein, damit sich die geringe Eigenabsorption von Amaranth bei der Meßwellenlänge von 405 nm nicht störend auswirken kann und die Amaranth-Konzentration keinen Einfluß auf die Meßergebnisse hat. Geeignete Amaranth-Konzentrationen in 2n NaOH liegen beispielsweise zwischen 5 und 50 μg/ml, wobei sich eine Konzentration von 20 μg/ml, wie sie bei den nach¬ folgend beschriebenen Kontrollversuchen verwendet wurde, als sehr geeignet erwiesen hat.
Die Verwendung einer gefärbten Stopplösung gemäß der vor¬ liegenden Erfindung gewährleistet auf einfache und sichere Weise eine sofortige visuelle Kontrolle der korrekten Assay- Durchführung, ohne daß die Korrektheit der Ergebnisse des Bestimmungsverfahrens negativ beeinflußt wird.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Beispiels noch näher erläutert.
Die Figur zeigt in einem einzigen Diagramm die Spektren des Farbstoffs Amaranth in einer 2n NaOH-Stopplösung sowie ein typisches Spektrum einer p-Nitrophenylphosphat-Substratlö¬ sung nach der Entwicklung durch alkalische Phosphatase, die an eine immobiliserte Tracerkomponente eines Enzym-Immunoas¬ says gebunden ist.
Versuchs-Beispiel
Zur Prüfung der Frage, ob es möglich ist, einer Stopplösung zum Abstoppen der enzymatischen Umwandlung eines p-Nitro¬ phenylphosphat-Substrats einen Farbstoff zuzusetzen, ohne die Meßergebnisse zu verfälschen, wurde ein Kontrollversuch unter Verwendung von Bestandteilen eines handelsüblichen quantitativen Enzym-Immunoassays zur Bestimmung von Neopte- rin in Serum, Plasma und Urin (ELItest® Neopterin der B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH) durchgeführt.
Bei dem ELItest® Neopterin erfolgt die Bestimmung der Neop- terin-Konzentration in einer biologischen Probe dadurch, daß man das zu bestimmende Neopterin aus der Probe mit einem Enzymkonjugat aus Neopterin und alkalischer Phosphatase um die Bindungsstellen von Anti-Neopterin-Antikörpern konkur¬ rieren läßt, die an einer festen Phase, üblicherweise die Wände der Kavitäten einer Mikrotiter-Platte, immobilisiert sind.
Das Ausmaß der Bindung des Enzymkonjugats aus Neopterin und alkalischer Phosphatase an die feste Phase ist umgekehrt proportional zur Neopterin-Konzentration in einer Patienten¬ probe. Hohe Neopterin-Werte in der Probe äußern sich somit nach der nachfolgenden Substratentwicklung bei der photome¬ trischen Vermessung der erhaltenen Substratlösung als nied¬ rige optische Dichte (OD) . Die optische Dichte wird dabei in einem Plattenphotometer bei einem Absorptionsmaximum von 405 nm gemessen. Die Aus¬ wertung der Ergebnisse der Messung der optischen Dichte einer Probe erfolgt unter Bezugnahme auf eine Standardkurve (optische Dichte gegen Konzentration von Neopterin-Stan- dards) , aus der die Neopterin-Konzentration einer Patienten¬ probe direkt ablesbar ist.
Bezüglich weiterer Einzelheiten der Testdurchführung und der üblichen Reagenzien wird auf die Arbeitsanleitung ELItest® Neopterin der Anmelderin verwiesen.
Es wurden 16 Patientenseren nach der Vorschrift der Arbeits¬ anleitung zum ELItest® Neopterin vermessen, wobei für jedes Serum zu Vergleichszwecken die erhaltene optische Dichte in der Substratlösung einmal nach Zugabe der üblichen ungefärb¬ ten Stopplösung und einmal nach Zugabe einer erfindungs- gemäßen Stopplösung, die Amaranth enthielt, gemessen wurde.
Die übliche Stopplösung war eine wäßrige 2n NaOH-Lösung.
Die eingefärbte Stopplösung wurde dadurch hergestellt, daß man 0,2 g eines handelsüblichen Amaranth-Farbstoffs (Sico- pharm-Amaranth 85 E 123; BASF) in 40 ml einer 2n NaOH-Lösung (Stopplösung ELItest® Neopterin) auflöste. Die erhaltene Lösung wurde mit 2n NaOH 1:250 weiter verdünnt. Sie wies eine Konzentration von 20 μg Amaranth/ml 2n NaOH auf.
Zur Messung von 16 Patientenseren wurden gemäß Arbeitsanlei¬ tung zuerst 50 μl jedes Patientenserums mit jeweils 150 μl einer Lösung eines Konjugats aus Neopterin und alkalischer Phosphatase in den Kavitäten einer unbeschichteten Mikroti- ter-Platte gemischt. 150 μl der erhaltenen Mischung wurden dann in eine mit Neopterin-Antikörpern beschichtete Mikroti- ter-Platte überführt.
Nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln wurde die flüssige Phase abgesaugt, und es wurden 350 μl einer Waschlösung zugegeben und abgesaugt. Der Wasch¬ schritt wurde dreimal wiederholt.
Nach dem Entfernen der letzten Waschlösung wurden jeweils 100 μl einer p-Nitrophenylphosphat-Substratlösung zugegeben.
Zur Farbentwicklung inkubierte man 30 + 5 min bei Raumtem¬ peratur und stoppte dann die Reaktion durch Zugabe von 100 μl einer 2n NaOH Stopplösung, und zwar entweder einer unge¬ färbten oder einer erfindungsgemäßen eingefärbten Stopp¬ lösung.
Danach wurde die optische Dichte in einem Plattenphotometer (Titertek Multiscan Plus MKII) bei 405 nm Wellenlänge gemes¬ sen, und die Meßergebnisse wurden anhand einer Standardkurve ausgewertet, die unter gleichen Bedingungen unter Verwendung von Standards bekannter Neopterin-Konzentration erstellt worden war.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammen¬ gefaßt, wobei die Meßergebnisse jeweils für Versuch unter Verwendung einer farbstoffreien und einer farbstoffhaltigen Stopplösungen mit und ohne Abzug des Blindwerts ("Blank": Messung der Substratlösung plus Stopplδsung ohne Enyzm) angegeben werden.
Tabelle
mit B/B max ohne B/B mit B/B ohne B/B
Amaranth Amaranth %ma /Vπaranth %maxAmaranth °/^ax ohne Bl-abzu. ohne Bl-abzu. mit Bl-abzu. mit Bl-abzu.
Blank 129 9 99 7 —
STD1 1376 100 1333 100 1247 100 1234 100
STD2 868 63 829 62 739" 59 730 59
STD3 674 49 659 49 546 44 560 45
STD4 423 31 396 30 294 24 297 24
STD5 308 22 276 21 179 14 177 14
Kontl 7 7.2 7 7.2
Kont ll 16,1 16.1 16,1 16.1
Pat1 9,7 9.8 9.7 9,8
Pat2 7,4 6.9 7.4 6,9
Pat3 7,4 6.7 7.4 6.7
Pat4 6,4 5.8 6.4 5,8
Pat 5 5,7 5.5 5.7 5,5
Pat6 (78.1) (75,9) (78.1) (75,9)
Pat7 4,8 4.5 4.8 4.5
Pat 8 13,9 15.3 13,9 15.3
Pat 9 6,7 5.7 6.7 5.7
Pat 10 8.1 7.4 8.1 7,4
Pat 11 6.7 6.4 6.7 6,4
Pat 12 13.1 13,9 13.1 .13,9
Pat 13 3.7 3.6 3.7 3,6
Pat 14 3.8 3.6 3,8 3.6
Pat 15 5.5 5.3 5.5 5.3
Pat 16 28.5 31.1 28.5 31.1
STD = Standard; Pat = Patient; Kont = Kontrolle; B = Bindung;
Es ist klar zu erkennen, daß die Anwesenheit von Amaranth in der Stopplösung keinen signifikanten Einfluß auf die Me߬ ergebnisse hatte, die für die einzelnen Patienten erhalten wurden.
In ähnlicher Weise konnte festgestellt werden, daß die Anwesenheit von Amaranth in der Stopplösung keinen signifi¬ kanten Einfluß auf die Form und Lage der Standardkurve ausübte.
In weiteren Versuchen konnte sichergestellt werden, daß auch bei anderen handelsüblichen Assays, bei denen mit alkali- scher Phosphatase als Enzymlabel gearbeitet wird, durch die Verwendung einer gefärbten Stσpplösung keine Beeinträchti¬ gung der Meßergebnisse erhalten wird. Das gilt beispiels¬ weise für die Bestimmung von Anti-TPO-Autoantikörpern, Anti- Tg-Autoantikörpern sowie des Hormons ACTH mit Hilfe handels¬ üblicher Assay-Kits der Anmelderin.
In jedem der Fälle wurden nicht nur weitgehend identische und reproduzierbare Ergebnisse erhalten, sondern in jedem der Fälle war der Unterschied zwischen Substratlösungen mit und ohne Zusatz der eingefärbten Stopplösung sofort visuell erkennbar.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Messung der Konzentration eines Enzyms, bei dem man die Konzentration des Enzyms dadurch bestimmt, daß man die Konzentration eines durch die Umsetzung des Enzyms mit einer Substratlösung enzymatisch gebildeten Farb¬ stoffs in einer Meßlösung photometrisch durch eine Licht- absorptionsmessung bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man die photometrische Bestimmung in Gegenwart eines weiteren Farbstoffs durchführt, der der Meßlösung zusammen mit einer Stopplösung zum Abstoppen der enzymatischen farbstoffbilden¬ den Reaktion zugesetzt wird und dessen Anwesenheit die Messung der Konzentration des enzymatisch gebildeten Farb¬ stoffs nicht stört.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zugesetzte weitere Farbstoff so ausgewählt ist, daß er Licht der Wellenlänge des für die photometrische Absorp¬ tionsmessung verwendeten Lichts nicht oder nur unwesentlich absorbiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich¬ net, daß die Konzentration des zugesetzten Farbstoffs so gewählt wird, daß einerseits seine Anwesenheit in der Meßlö¬ sung visuell deutlich feststellbar ist, daß sich aber ande¬ rerseits eine eventuelle geringfügige Absorption von Licht der Wellenlänge des für die photometrische Absorptionsmes¬ sung verwendeten Lichts nicht auf die Bestimmung der Konzen¬ tration des enzymatisch gebildeten Farbstoffs auswirkt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym einer biologischen Probe ent¬ stammt oder an einen Reaktionspartner eines Enzymimmunoas- says gebunden ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine organspezifische alkali¬ sche Phosphatase, insbesondere knochenspezifische alkalische Phosphatase (BAP) , aus einer biologischen Probe ist und die Substratlösung eine p-Nitrophenylphosphat-Lösung ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym alkalische Phosphatase ist, die als Label eines Reaktionspartners eines Enzym-Immunoas¬ says vorliegt, und daß die Substratlösung eine p-Nitrophe¬ nylphosphat-Lösung ist.
7. Verfahren nach einem der Anspürche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die photometrische Bestimmung des enzy¬ matisch gebildeten Farbstoffs mit Licht einer Wellenlänge von 405 nm erfolgt und der zugesetzte Farbstoff ein Absorp¬ tionsminimum im Bereich von 390 bis 420 nm aufweist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Farbstoff Amaranth verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Amaranth in einer 2 bis 4n NaOH - Stopplösung oder einer EDTA-Stopplösung mit einer Konzentration von 5 - 50 μg Amaranth/ml Stopplösung verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Phosphatase als Label an ein Antigen oder einen Antikörper gebunden ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Phosphatase als Label eines Bestandteils eines Enzymimmunoassays zur Bestimmung von Neopterin, ACTH, anti-TPO-Autoantikörpern und anti-Thyreoglobulin-Autoanti- körpern vorliegt.
12. Stopplösung zum Stoppen der farbstoffbildenden Umwand- lungsreaktion eines p-Nitrophenylphosphat-Substrats unter der Einwirkung von alkalischer Phosphatase, die einer biolo¬ gischen Probe entstammt oder an einen Reaktionspartner eines Enzym-Immunoassays gebunden ist, in Form einer 2n bis 4n NaOH - Lösung oder einer EDTA-Lösung, dadurch gekennzeich¬ net, daß in der Stopplösung der Farbstoff Amaranth aufgelöst ist.
13. Stopplösung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie 5 bis 50 μg Amaranth/ml Stopplösung enthält.
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