DE4216002C2

DE4216002C2 - Verfahren zur Bestimmung des Dextrangehaltes in Zucker, in zuckerhaltigen Lösungen, Säften und Sirupen sowie Test-Kit zur Dextranbestimmung

Info

Publication number: DE4216002C2
Application number: DE4216002A
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr Bienwald; Maria Dr Schultze; Christa Dr Scholz
Original assignee: Fzb Biotechnik 12489 Berlin De GmbH; FZB BIOTECHNIK GmbH
Current assignee: Bienwald Bernd Dr 13055 Berlin De Schultze M
Priority date: 1991-05-13
Filing date: 1992-05-12
Publication date: 1994-11-17
Anticipated expiration: 2012-05-13
Also published as: DE4216002A1

Description

1. Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Dextrangehaltes in Zucker, in zuckerhaltigen Lösungen, Säften und Sirupen sowie ein Test-Kit zur Dextranbestimmung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Anwendungsgebiete sind die Lebensmittel- und Getränkeindustrie sowie die Biotechnologie.

2. Charakteristik des Standes der Technik

In der Zuckerindustrie können Dextrane durch mikrobielle Kontami nation des Rohmaterials (insbesondere Zuckerrohr) in den Zucker saft gelangen. Die Dextrane stören den Produktionsablauf, indem sie im Zuckersaft schleimige, schwer filtrierbare Niederschläge bilden. Geringe Anteile der Dextrane können auch noch im Weißzuc ker enthalten sein. Die Qualität des Weißzuckers wird mit stei gendem Dextrangehalt geringer. Bei der Verarbeitung von Zuckern mit hohem Dextrangehalt können Probleme auftreten.

So z. B. können Zusätze solcher Zucker zu Spirituosen unerwünschte Trübungen hervorrufen. Die Bestimmung des Dextrangehaltes ist deshalb ein wichtiger Bestandteil der Qualitätskontrolle des Zuckers. Traditionell wird der Dextrangehalt über eine Messung der Trübung bestimmt, die nach Zusatz von Ethanol zur wäßrigen Lösung des Zuckers auftritt (J. S. KENIRY et al.; Int. Sugar J. 71 (1969) 230-233). Dieser einfach auszuführende Test ist jedoch unspezifisch und störanfällig. Nach einer von ROBERTS vorgeschlagenen verbesserten Methode wird das Dextran mit alka lischer CuSO₄-Lösung als Cu-Komplex gefällt, abgetrennt und mit Phenol-Schwefelsäure kolorimetrisch bestimmt (E. J. ROBERTS; Proc. Sugar Process. Res. Conf.; (Pub. 1983) 1943-156). Die Methode ist weniger störanfällig, aber ebenfalls nicht spezi fisch. Spezifische enzymatische Methoden wurden von RICHARDS und SAYAMA vorgeschlagen (G. N. RICHARDS, C. STOKIE; Int. Sugar U. 76 (1974) 103-107; K. SAYAMA; T. KAMATA; Seito Gÿutsu KENKYO 36 (1988) 59-67 ref. CA 109 (1988) 172 449 p.).

Bei der Methode von RICHARDS werden Saccharose und andere stören ne niedermolekulare Bestandteile der Zuckerlösung durch eine Dialyse abgetrennt. Die dialysierte Lösung wird mit Dextranase behandelt, die dabei entstehenden niedermolekularen Spaltprodukte durch eine zweite Dialyse isoliert und nach einer Farbreaktion mit Phenol-Schwefelsäure photometrisch bestimmt. Nachteilig ist hierbei die umständliche Handhabung und der hohe Zeitaufwand. SAYAMA behandelte Zuckerlösungen mit Dextranase, trennte die Spaltprodukte des Dextrans durch Gelchromatographie ab und bestimmte sie photometrisch nach der Farbreaktion mit Phenol- Schwefelsäure. Parallel dazu wurde eine Probe als Leerwert ohne Zusatz von Dextranase der Gelchromatographie unterworfen und analog bestimmt. Problematisch ist bei dieser Methode die Abtren nung der Dextran-Spaltprodukte von den bereits in der Zuckerprobe enthaltenen störenden niedermolekularen Kohlenhydraten und ande ren Verbindungen. Außerdem muß mit hohen Leerwerten gerechnet werden. Ein weiterer Nachteil dieser bekannten enzymatischen Methoden besteht in der Verwendung des aggressiven und sehr giftigen Phenol-Schwefelsäure-Reagens.

3. Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines schnellen und einfach durchführbaren Verfahrens zur Dextranbestimmung in Zucker, zuckerhaltigen Lösungen, Säften und Sirupen sowie die Bereitstellung eines Test-Kits zur bequemen Durchführung des Verfahrens.

4. Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Dextrane enzyma tisch weitestgehend zu niedermolekularen reduzierenden Oligosacchariden zu spalten und diese nach einer geeigneten Farbreaktion photometrisch zu bestimmen.

Erfindungsgemäß wird das Verfahren durchgeführt, indem man

- aus der zu bestimmenden Probe durch Gelfiltration die Dextran fraktion abtrennt,
- die abgetrennte Dextranfraktion mit Endo-Dextranasen, die innerhalb kurzer Zeit die Dextrane weitestgehend zu niedermole kularen reduzierenden Oligosacchariden spalten, behandelt,
- das Reaktionsprodukt mit Farbreagenzien für reduzierende Koh lenhydrate versetzt und
- die photometrische Bestimmung der Spaltprodukte vornimmt,

wobei man

- daneben die Leerwertbestimmung vornimmt, indem die gewonnene Dextranfraktion ohne vorherige Dextranasebehandlung nach Zu satz des Farbreagenses photometrisch bestimmt und
- die Ermittlung des Dextrangehaltes (%) in der zu bestimmenden Probe über die Beziehung vornimmt, in der ist:
E₄₁₀ = Extinktion der Zuckerprobe minus Extinktion des Leerwertes,
f_e = Eichfaktor, bei dessen Ermittlung steigende Konzentrationen des Dextranstandards der Endo-Dextransbehandlung bis einschließlich photometrischer Bestimmung unterworfen werden und der sich als arithmisches Mittel aus den Quotienten von Konzentration des Dextranstandards (µg/ml) und Extinktion ergibt,
f_v = Verdünnungsfaktor der Chromatographiesäule, der sich ergibt aus dem Quotienten von Elutionsvolumen des Dextrans und dem Volumen der aufgetragenen Probe,
m_z = Masse der Zuckerprobe, Einwage in g bzw. bei Lösungen Zuckergehalt in g/100 ml.

Zur Gelfiltration der Probe werden solche Trennmaterialien eingesetzt, die nicht aus Polysacchariden bestehen. Bevorzugt werden Polyacrylamidgele verwendet.

Als Endo-Dextranase eignet sich bevorzugt Dextranase von Asp. spec. D 100 - ZIMET 43 783, deren Herstellung in dem Ausschließ ungspatent DD-2 51 263 beschrieben ist.

Geeignete Farbreagenzien sind beispielsweise 3,5-Dinitrosalicyl säure, Kaliumhexacyanoferrat (III), Bichinolindicarbonsäure kupfersulfat und bevorzugt 4-Hydroxybenzoesäurehydrazid (PAHBAH).

Die Verfahrensparameter sind:

- Gelfiltration bei pH-Wert 4,5 bis 7, vorzugsweise pH 5 bis 6, Raumtemperatur
- Endo-Dextranasebehandlung der Dextranfraktion bei pH-Werten von 4,5 bis 7, bevorzugt bei pH 5 bis 6, bei Temperaturen von 20°C bis 60°C, vorzugsweise bei 35°C bis 55°C und bei Reak tionszeiten von 5 bis 30 Min., insbesondere 10 bis 20 Min.
- Farbreaktion bei pH < 9, vorzugsweise pH 12 bis 14, 60°C bis 100°C, vorzugsweise 65°C bis 75°C
- photometrische Bestimmung nach erfolgter Farbreaktion bei Raumtemperatur.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind:

1. Die photometrische Bestimmung der Dextranspaltprodukte ist ohne vorherige Abtrennung aus dem Testansatz möglich. Man er hält eine lineare Beziehung zwischen Dextrankonzentration und Extinktion.
2. Die Bestimmungsmethode ist einfach in der Handhabung und schnell sowie weniger störanfällig als die bekannten Methoden.
3. Die verwendeten Farbreagenzien sind wesentlich weniger toxisch als die in den bekannten enzymatischen Verfahren häufig einge setzte Phenol-Schwefelsäure.

Der erfindungsgemäße Test-Kit zur Dextranbestimmung besteht aus folgenden Bestandteilen:

1. Kaliumphosphat-Puffer; 0,1 mol/l; pH 6,0
2. Endo-Dextranase, die innerhalb kurzer Zeit die Dextrane wei testgehend zu niedermolekularen reduzierenden Oligosacchariden spaltet; 1 mg/ml Kaliumphosphat-Puffer (s. oben); 10 Einhei ten/ml
3. Dextran-Standard; 10 mg Dextran 5000/100 ml Kaliumphosphat Puffer
4.1. PAHBAH-Stammlösung; 0,5 mol/l; 1,52 g PAHBAH; gelöst in 20 ml Salzsäure; 0,5 mol/l, woraus der Anwender das PAHBAH-Reagens durch Mischen von 1 Teil PAHBAH-Stammlösung und 9 Teilen Natronlauge (0,5 mol/l) herstellt.
4.2. Bismuth-tartrat, 0,1 mol Bi/l, 3 g BiONO₃·H₂O werden in eine Lösung von 5,6 K-Na-tartrat-4-hydrat in 50 ml Aqua dest. eingetragen und 15 ml NaOH (2 mol/l) hinzugefügt. Man erhitzt im Wasserbad auf 80°C und rührt, bis fast alles BiONO₃ in Lösung gegangen ist. Die ungelösten Anteile werden auf einer G4-Fritte abgesaugt, und das Filtrat mit Aqua dest. auf 100 ml aufgefüllt.
Das vollständige PAHBAH-Reagens erhält man durch Mischen von 200 Teilen der Lösung 4.1. mit 1 Teil der Lösung 4.2.
5. Mischung zur Eichung der Chromatographie-Säule für die Gelfiltration der Probe; 10 mg Dextranblau und 5 mg Methylrot, gelöst in 5 ml Kaliumphosphat-Puffer, wenn keine Fertig-Chromatographie- Säule verwendet wird.
6. Chromatographie-Säule, gefüllt mit Trennmaterial, bevorzugt Polyacrylamidgel, das in Kaliumphosphat-Puffer equilibriert ist.

Die Durchführung des Verfahrens unter Verwendung des erfindungs gemäßen Test-Kits wird in dem nachfolgenden Ausführungsbeispiel näher erläutert.

5. Ausführungsbeispiel Eichung der Chromatographie-Säule

Zu diesem Zweck wird 1 ml der Lösung 5 mit einer Pipette aufge tragen und mit Kaliumphosphat-Puffer eluiert. Die Elutionsvolumi na für Dextranblau (entspricht dem Elutionsvolumen für Dextran der Zuckerprobe) und für Methylrot (entspricht dem Elutionsvolu men für Saccharose und andere in der Probe enthaltene störende niedermolekulare Verbindungen) werden bestimmt. Nach dem Auswa schen des Methylrots ist die Säule zur Auftragung der Zuckerlö sung bereit.

Die Eichung der Chromatographie-Säule kann entfallen, wenn Fer tig-Säulen, wie z. B. die Econo-Pac 10 DG Desalting-Column der Fa. Bio Rad, genutzt werden.

Durchführung der Gelfiltration

500 mg der zu untersuchenden Zuckerprobe werden in Kaliumphos phat-Puffer gelöst und auf 10 ml aufgefüllt. Getrübte Lösungen sind vor der weiteren Verarbeitung zu zentrifugieren. Der Nieder schlag wird verworfen.

Eine Fertigsäule des Typs Econo-Pac 10 DG wird nun mit 20 ml Kaliumphosphat-Puffer gespült und das Eluat verworfen. Danach trägt man 2 ml der Probelösung auf. Nach dem Durchlauf der Pro belösung trägt man 0,8 ml Phosphat-Puffer auf und läßt ablaufen. Die Eluate der Probelösung und des Phosphat-Puffers werden ver worfen. Nun werden 3,5 ml Phosphat-Puffer aufgetragen und das dextranhaltige Eluat aufgefangen. Anschließend spült man mit 10 ml Phosphat-Puffer. Die Säule ist danach bereit für die Auf tragung der nächsten Probelösung.

Enzymatischer Dextranabbau

1 ml des dextranhaltigen Eluates wird in ein Reagenzglas pipet tiert und auf 37°C temperiert. Nun gibt man 20 µl der Lösung 2 hinzu und inkubiert bei 37°C 20 Minuten. Der Bestandteil 2 des Test-Kits enthält Endo-Dextranase von Asp. spec. D 100 - Z1MET 43 783; 1 mg/ml Kaliumphosphat-Puffer; 10 Einheiten/ml (1 Einheit katalysiert die Bildung von 1 µmol Isomaltose aus Dextran pro Minute bei 37°C und pH 6 (1. C. JANSON, J. POPATH; Methods in Enzymology 0 [1966] 615).

Eine zweite Probe der Zuckerlösung, die ebenfalls der Gelfiltra tion unterworfen wurde, wird ohne Zusatz von Dextranase inkubiert und dient als Leerwert.

Photometrische Bestimmung der Spaltprodukte

Nach der Inkubation fügt man zu jeder Probe 2,5 ml PAHBAH-Reagens hinzu und erhitzt die Mischungen zur Farbentwicklung 10 Minuten auf 70°C. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur in einem kalten Wasserbad mißt man an einem Spektralphotometer in Küvetten von 1 cm Schichtdicke die Extinktionen bei einer Wellenlänge von 410 nm gegen Kaliumphosphat-Puffer.

Bestimmung des Eichfaktors

Es sind folgende Volumina der angegebenen Lösungen in Reagenzgläsern zu pipettieren:

Diese Ansätze sind, wie oben beschrieben, aber ohne Gelfiltration zu verarbeiten. Als Leerwert wird 1 ml Kaliumphosphat-Puffer eingesetzt.

Berechnung des Dextrangehaltes in der Probe

zu berechnen aus den Eichgeraden, indem die Quotienten aus den Dextrankonzentrationen und den entsprechenden Extinktionen gebildet werden. Es ist der Mittelwert zu bestimmen

Proben mit E₄₁₀ < 0,750 sind nach Verdünnung zu wiederholen.

Beispiel für die Berechnung des Dextrangehaltes unter Verwendung einer konventionellen Chromatographie-Säule

1 Zuckerprobe (Saccharose, die mit 0,06% Dextran 70 vermischt wurde)

Bestimmung des Eichfaktors

Bestimmung der Zuckerprobe

Extinktion E₄₁₀ = 0,437
Extinktion E₄₁₀ (Leerwert) = 0,135

Beispiel für die Berechnung des Dextrangehaltes unter Verwendung einer Econo-Pac 10 DG-Säule

1 Zuckerprobe (Saccharose p. a., die mit 0,05% Dextran 70 vermischt wurde. Zusätzlich wurden 10% Glucose als Störkomponente hinzugefügt.)

Bestimmung des Eichfaktors

Bestimmung der Zuckerprobe

Extinktion E₄₁₀ = 0,537
Extinktion E₄₁₀ (Leerwert) = 0,122

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des Dextrangehaltes in Zucker, in zuckerhaltigen Lösungen, Säften und Sirupen, bei dem man

- aus der zu bestimmenden Probe durch Gelfiltration die Dex tranfraktion abtrennt,
- die abgetrennte Dextranfraktion mit Endo-Dextranasen, die innerhalb kurzer Zeit die Dextrane weitestgehend zu nieder molekularen reduzierenden Oligosacchariden spalten, behan delt,
- das Reaktionsprodukt mit Farbreagenzien für reduzierende Kohlenhydrate versetzt und
- die photometrische Bestimmung der Spaltprodukte vornimmt,

wobei man

- daneben die Leerwertbestimmung vornimmt, indem die gewonnene Dextranfraktion ohne vorherige Dextranasebehandlung nach Zu satz des Farbreagens photometrisch bestimmt und
- die Ermittlung des Dextrangehaltes (%) in der zu bestimmenden Probe über die Beziehung vornimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

- die zur Gelfiltration verwendeten Trennmaterialien Polyacrylamidgele sind,
- als Endo-Dextranase Dextranase von Asp. spec. D 100 - ZIMET 43 783 verwendet wird,
- geeignete Farbreagenzien 3,5-Dinitrosalicylsäure, Kalium hexacyanoferrat III, Bichinolindicarbonsäure-Kupfersulfat und bevorzugt 4-Hydroxybenzoesäurehydrazid (PAHBAH) sind.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß

- die Gelfiltration bei Raumtemperatur und bei pH-Werten zwischen 4,5 und 7, vorzugsweise bei pH 5 bis 6,
- die Endo-Dextranasebehandlung der Dextranfraktion bei pH-Werten von 4,5 bis 7, bevorzugt bei pH 5 bis 6, und bei Temperaturen von 20°C bis 60°C, bevorzugt bei 35°C bis 55°C, innerhalb von 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise 10 bis 20 Minuten,
- die Farbreaktion bei pH < 9, vorzugsweise bei pH 12 bis 14, und bei 60°C bis 100°C, vorzugsweise bei 65°C bis 75°C,
- die photometrische Bestimmung nach erfolgter Farbreaktion bei Raumtemperatur durchgeführt werden.

4. Test-Kit zur Dextranbestimmung, gekennzeichnet durch die Be standteile:

1. Kaliumphosphat-Puffer; 0,1 mol/l; pH 6,0
2. Endo-Dextranase, die innerhalb kurzer Zeit die Dextrane zu überwiegend niedermolekularen reduzierenden Oligosacchariden spaltet; 1 mg/ml Kaliumphosphat-Puffer (s. oben); 10 Einheiten/ml
3. Dextran-Standard; 10 mg Dextran 5000/100 ml Kaliumphosphat-Puffer
4.1. PAHBAH-Stammlösung; 0,5 mol/l; 1,52 g PAHBAH; gelöst in 20 ml Salzsäure; 0,5 mol/l, woraus der Anwender das PAHBAH-Reagens durch Mischen von 1 Teil PAHBAH- Stammlösung und 9 Teilen Natronlauge (0,5 mol/l) herstellt.
4.2. Bismuth-tartrat; 0,1 mol Bi/l, 3 g BiONO₃·H₂O werden in eine Lösung von 5,6 g K-Na tartrat 4-hydrat in 50 ml Aqua dest. eingetragen und 15 ml NaOH (2 mol/l) hinzugefügt. Man erhitzt im Wasserbad auf 80°C und rührt, bis fast alles BiONO₃ in Lösung gegangen ist. Die ungelösten Anteile werden auf einer G4-Fritte abgesaugt und das Filtrat mit Aqua dest. auf 100 ml aufgefüllt.
Das vollständige PAHBAH-Reagens erhält man durch Mischen von 200 Teilen des PAHBAH-Reagens (4.1.) mit 1 Teil der Lösung 4.2.

5. Mischung zur Eichung der Chromatographie-Säule für die Gelfiltration der Probe; 10 mg Dextranblau und 5 mg Methylrot gelöst in 5 ml Kaliumphosphat-Puffer, wenn keine Fertig-Säule wie z. B. die Econo-Pac 10 DG verwendet wird.

6. Chromatographie-Säule, gefüllt mit Trennmaterial, bevorzugt Polyacrylamidgel, das in Kaliumphosphat-Puffer equilibriert ist.