KR101403028B1

KR101403028B1 - 증폭된 신호가 발생되는 전기장을 이용한 면역 크로마토그래피 분석 방법

Info

Publication number: KR101403028B1
Application number: KR1020130002596A
Authority: KR
Inventors: 배진현
Original assignee: 배진현
Priority date: 2013-01-09
Filing date: 2013-01-09
Publication date: 2014-06-05

Abstract

본 발명은 (a) 고상 기질(solid substrate)에서 분석물의 제 1 에피토프와 특이적으로 결합하는 제1항체와 표지체를 포함하는 표지체-제1항체 결합체와 분석물을 접촉시켜 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체(complex)를 형성시키는 단계; (b) 상기 고상 기질의 횡 방향(horizontal direction)으로 전기장이 부여된 상태에서 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 전개시키는 단계; 및 (c) 상기 분석물의 제 2 에피토프와 특이적으로 결합하고 상기 고상 기질의 탐지부에 고정화된 제2항체와 상기 전개된 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 접촉시켜 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체를 형성시키는 단계로서, 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체는 상기 전기장에 의해 상기 탐지부 어느 일정 부위에 국소화(localization)되는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 증폭된 신호가 발생되는 면역 크로마토그래피 분석 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 고상 기질의 횡 방향(horizontal direction)으로 전기장을 부여하여 탐지부 어느 일정 부위에 국소화된 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체를 형성시킴으로서 표지체의 신호를 증폭시키는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 면역 크로마토그래피 스트립은 고감도의 면역 크로마토그래피 분석을 할 수 있는 이점이 있다.

Description

증폭된 신호가 발생되는 전기장을 이용한 면역 크로마토그래피 분석 방법{Method for Immunochromatographic Assay Using Electric Field with Generating Amplified Signal}

본 발명은 전기장에 의하여 증폭된 신호가 발생되는 면역 크로마토그래피 분석 방법에 관한 것이다.

면역 크로마토그래피 분석법은 생물학적 물질 또는 화학적 물질이 서로 특이적으로 부착하는 성질을 이용하여 분석 물질을 단시간에 정성 및 정량적으로 검사할 수 있는 방법으로, 이러한 면역 크로마토그래피 분석을 위한 기구로는 분석 스트립 또는 상기 분석 스트립을 하우징 내부에 장착해 조립한 형태의 면역 분석 키트가 일반적으로 사용된다.

특히 샌드위치형 면역 크로마토그래피 분석을 위한 스트립은 분석물(analyte)을 포함하는 유체를 다공성 스트립 한편에 적용하면 모세관 현상에 의해 유체가 흘러가면서 분석 대상물이 표지체를 포함하는 항체(분석물의 제1에피토프(epitope)와 특이적으로 결합함) 및 고정화된 항체(분석물의 제2에피토프와 특이적으로 결합함)와 결합하는 원리를 이용하는 것으로 알려져 있다.

보다 상세하게 면역 크로마토그래피 분석 스트립은 일반적으로 액체 시료가 모세관현상으로 흐를 수 있는 검출층에 항체가 고정되어 있고, 검출층의 업스트림에는 시료 패드와 접합 패드가 구비되어 있으며, 다운스트림 측에 흡수 패드가 연결되어 있다. 상기 시료 패드는 분석물을 포함하는 액체 시료를 흡수하고 균일한 유동을 보장하며, 접합 패드에는 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 표지체가 건조되어 있다. 상기 검출층에는 분석물에 선택적으로 결합하는 고정화된 항체 및 표지체에 고정화된 항체와 결합할 수 있는 물질이 각각 다른 위치에 고정화 되어 각각 탐지부(test site) 및 대조부(control site)를 형성한다. 상기 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 검출층에 고정화된 항체와 표지체에 고정화된 항체는 분석물에 대해 샌드위치 형태로 결합될 수 있도록 구성된다. 상기 흡수패드는 액체시료를 흡수할 수 있는 물질로 구성된다. 이와 같은 면역 크로마토그래피 분석 키트에 있어서 분석물을 포함하는 액체시료를 시료 패드에 떨어뜨리면, 표지체-분석물에 선택성을 가지는 항체와 검출층에 고정화된 항체가 샌드위치 형태로 결합되어 상기 항체가 고정화된 검출층 위치에 육안으로 확인할 수 있는 밴드를 형성하게 된다.

상기 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호(signal) 감도를 높이기 위한 종래 기술로서 대한민국 등록특허 제 1212935호는 면역 크로마토그래피 상에서 1차 접합체와 항원이 결합하여 이들이 고정화된 제 2 항체와 샌드위치 반응으로 결합된 후, 후속적으로 1차 접합체에 특이적으로 결합하는 제 3 항체를 가지고 있는 2차 접합체가 1차 접합체에 결합하는 면역 크로마토그래피의 신호 증폭 방법을 개시하고 있으나, 3 가지 종류의 항체가 필요한바 고비용이 요구되며, 반응이 복잡해지는 문제가 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 기존의 면역 크로마토그래피 분석에서 분석물을 고감도로 검출하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고상 기질의 횡 방향(horizontal direction)으로 전기장(electric field)이 부여되는 경우 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 전개시켜 탐지부에 고정화된 제2항체와 접촉시키는 경우 형성되는 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체가 상기 탐지부 어느 일정 부위에 국소화(localization)되어 표지체의 신호를 증폭시킨다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 탐지부에 전기장을 부여하는 전기장 부여수단을 포함하는 면역크로마토그래피 스트립을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 전기장에 의하여 증폭된 신호가 발생되는 면역 크로마토그래피 분석 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, (a) 분석하고자 하는 시료를 수용하는 시료층;

(b) 상기 시료에 함유되어 있는 분석물(analyte)과 특이적으로 결합하는 제1항체와 표지체를 포함하는 표지체-제1항체 결합체를 함유하는 표지체-제1항체 결합체층; (c) 상기 시료에 분석물이 존재하는지의 여부를 검출하고, 전기장(electric field)이 부여되는 탐지부, 상기 시료의 이동 여부를 확인하는 대조부를 포함하는 검출층; (d) 상기 탐지부에 전기장을 부여하는 전기장 부여수단; 및 (e) 상기 검출층을 통과한 시료를 흡수하는 흡수층을 포함하는 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.

본 발명자들은 기존의 면역 크로마토그래피 분석에서 분석물을 고감도로 검출하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고상 기질의 횡 방향(horizontal direction)으로 전기장(electric field)이 부여되는 경우 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 전개시켜 탐지부에 고정화된 제2항체와 접촉시키는 경우 형성되는 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체가 상기 탐지부 어느 일정 부위에 국소화(localization)되어 표지체의 신호를 증폭시킨다는 사실을 확인하였다.

본 명세서의 용어 "면역 크로마토그래피 분석"은 면역 반응의 원리(항원-항체 반응)와 크로마토그래피(분석물이 포함된 시료의 이동) 원리를 결합한 방법을 이용한 분석으로, 모세관 현상에 의하여 시료의 흐름이 일정하게 이루어지는 특정 물체(예컨대, 스트립) 상에서 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 시료 내 분석물이 존재 유무를 결정하는 것을 의미한다.

본 발명의 면역크로마토그래피 스트립의 제조에 사용될 수 있는 층은 다공질 재료로서 천연 또는 합성의 재료를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예컨대, 니트로셀룰로오스가 상기 층을 제조하기 위한 재료로 사용될 수 있다.

본 명세서의 용어 "시료층"은 분석물을 포함하는 액체 시료가 처음 흡수되는 부분으로, 검출층으로 사용되는 멤브레인의 한쪽 끝단을 그대로 사용하거나 별도의 부재로 구성될 수 있고, 분석물을 포함하는 시료를 흡수하여 모세관 현상에 의해 분석물을 다운스트림으로 이동시킨다.

본 발명의 분석물은 면역 크로마토그래피 분석을 이용할 수 있는 당업계의 어떠한 분석물도 포함한다. 즉, 상기 분석물은 면역학적 반응인 항원항체 반응에 의하여 제1항체 및 제2항체와 결합하여 샌드위치형 면역 복합체를 형성할 수 있는 어떠한 분석물도 해당된다. 예컨대, 환경호르몬 등을 포함하는 환경오염물질, 바이러스 또는 식중독 균과 같은 질병 인자나 병원 독성 물질, 단백질 및 핵산이 상기 분석물에 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 분석물은 단백질이고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, IgG(Immunoglobulin G)이다.

본 발명에 있어서 항체는 항원-항체반응에 의해 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 아니하며, 분석물이 항체인 경우에는 이와 특이적으로 결합하는 물질을 항원으로 할 수 있다. 상기 항원 및 항체는 분석물에 따라 공지의 항원 및 항체를 채용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 제1항체는 분석물의 제1에피토프와 특이적으로 결합하는 항체이다.

본 명세서의 용어 "표지체"는 신호을 발생하는 착색물질로서, 발색제, 형광제, 착색되는 라텍스 입자 및 자성입자 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 표지체는 금 입자이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 금 입자는 5-100 nm, 5-70 nm, 5-50 nm, 5-30 nm, 10-30 nm 또는 15-25 nm의 직경을 갖는다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 금 입자는 폴리머로 표면-코팅된 입자이다. 상기 폴리머는 당업계에서 표지체로서의 금 입자를 둘러싸는데 사용하는 어떠한 폴리머도 포함한다. 예컨대, 상기 폴리머는 폴리스틸렌(polystylene), 덱스트란(dextran), 덱스트란 설페이트(dextran-sulfate), 카복시메틸덱스트란(carboxymethyldextran), PEG(polyethylen glycol), 아민 실란(amine silane), 글루쿠론산(glucuronic acid), 브로모아세틸기(Bromoacetyl), 키토산(chitosan), 구연산(citric acid), 전분(starch), DEAE-전분, 인산 전분(Phosphate-starch), 지질(Lipid), 올렌산(Oleic acid), 2인산(Diphosphate), 폴리아스파르트산(Polyaspartic acid), 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide), 폴리아크릴산(Polyacrylic acid), 폴리디메틸아민(Polydimethylamine), 폴리(말렌산-코-올레핀)[Poly(maleic acid-co-olefin)], 폴리비닐 알콜(Polyvinyl alcohol), 폴리(4-비닐피리딘)[Poly(4-vinylpyridine)] 및 폴리-디알릴디메틸아민(Poly-diallyldimethylamin)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 표지체-제1항체 결합체층은 시료층의 다운스트림에 위치하고, 본 발명의 검출층은 본 발명의 표지체-제1항체 결합체층의 다운스트림에 위치하며, 본 발명의 흡수층은 본 발명의 검출층의 다운스트림에 위치한다. 본 명세서의 용어 "다운스트림"은 시료의 흐름을 기준으로 상대적인 하류를 의미한다. 예컨대, 특정 두 층의 위치는 본 발명의 면역크로마토그래피 스트립의 시료층에 상대적으로 근접한 층이 다른 층보다 업스트림에 위치하고, 시료층에 상대적으로 먼 곳에 위치하는 층이 다운스트림에 위치하게 된다.

본 발명의 표지체-제1항체 결합체층을 제조하기 위한 재료는 시료의 유속을 저해하지 않는 범위에서 PVA(polyvinyl Alcohol)등의 물질을 처리하기에 적합하고 자성입자-제1항체 결합체의 전개를 원활히 하기 위하여 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 표지체-제1항체 결합체층은 20 μm 이상의 포어 크기(pore size)를 갖는 패드이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 패드는 GFC(Glass fiber conjugate) 패드이다.

본 명세서의 용어 전기장(electric field)는 공간상에 전하가 존재할 때, 그 전하에 의해 생기는 공간상 각 지점의 전위의 기울기를 의미한다. 본 발명의 전기장 부여수단은 당업계의 어떠한 전기장을 발생시키는 수단도 포함된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 전기장 부여수단은 탐지부에만 전기장을 부여한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 전기장 부여수단은 전압의 인가 수단이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 전압은 3-20 V로 이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 전압은 3-15 V, 5-15 V, 5-13 V, 7-13 V 또는 7-11 V이다. 상기 전압이 3 V 미만인 경우 전기장이 약하게 부여되어 신호의 증폭효과가 현저히 낮고, 20 V를 초과하는 경우 전기장의 부여에 의해 생성되는 열로 인하여 스트립이 타는 문제가 발생하게 된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 전압의 인가 수단은 상기 탐지부에 접촉된 전도체를 포함한다. 상기 전도체는 전압을 인가하여 전기장을 형성할 수 있는 당업계의 어떠한 전도체도 포함한다. 예컨대, 은, 동, 알루미늄 및 철 등의 금속이 본 발명의 전도체에 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 전도체는 알루미늄이다.

상기 전도체는 스트립 상에 존재하거나 하우징 내부에 존재하여 상기 탐지부와 접촉 가능하나, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 전도체는 스트립 상에 존재한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 전도체는 탐지부의 좌우 양단에 부착되어 스트립 상에 존재한다.

하기 실시예에서 뒷받침되는 바와 같이, 본 발명의 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체는 하전된 분석물에 의하여 하전되어 있고, 시료의 전개에 의하여 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체 역시 하전 극성에 따라 고상 기질의 횡 방향(horizontal direction)으로 부여되는 전기장에 의하여 상기 탐지부 어느 일정 부위로 편중되어 이동하게 된다. 본 명세서의 용어 "횡 방향(horizontal direction)"은 시료의 흐름 방향을 종 방향(세로 방향)으로 결정한 경우의 가로 방향을 의미한다. 따라서 상기 고상 기질의 탐지부에 고정화된 제2항체와 상기 전개된 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 접촉시켜 형성시키는 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체는 국소화(localization)되므로 표지체의 신호가 증폭되게 된다(도 4b).

본 발명의 검출층의 재료는 항원-항체 간의 충분한 반응시간을 유지시킬 수 있어 액체 시료의 유동성을 확보할 수 있는 것을 선택한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 검출층은 모세관 현상에 따른 시료의 흐름이 180 sec/cm 유속의 유동성을 갖는 멤브레인(membrane)이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 강기 멤브레인은 니트로셀룰로스(Nitrocellulose) 입자가 도포되어 있는 것이다.

본 발명의 검출층은 시료에 분석물이 존재하는지의 여부를 검출하는 탐지부(test site) 및 시료의 이동 여부를 확인하는 대조부(control site)를 포함한다.

본 명세서의 용어 "탐지부"는 분석물 존재 여부를 판독하기 위한 결과를 보여주는 부분을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 탐지부는 상기 분석물의 제2에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화되고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 항체는 IgG 항체이다. 본 명세서의 용어 "제2에피토프"는 상기 제1에피토프와 동일 또는 상이한 항원분자 내에 존재하는 특정 입체분자구조 부위를 의미한다.

본 명세서의 용어 "대조부"는 이동성을 가진 물질들이 탐지부까지 오류없이 도달하여 반응이 제대로 진행되었는지 여부를 확인하기 위한 부분을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 대조부는 시료에 존재하는 특정 성분에 특이적으로 결합하는 고정화된 항체를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 대조부는 IgG 항체를 포함한다.

본 발명의 흡수층은 검출층을 통과한 시료의 잔여물들을 충분히 흡수할 수 있는 당업계의 어떠한 층도 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 고상 기질(solid substrate)에서 분석물의 제 1 에피토프와 특이적으로 결합하는 제1항체와 표지체를 포함하는 표지체-제1항체 결합체와 분석물을 접촉시켜 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체(complex)를 형성시키는 단계; (b) 상기 고상 기질의 횡 방향(horizontal direction)으로 전기장이 부여된 상태에서 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 전개시키는 단계; 및 (c) 상기 분석물의 제 2 에피토프와 특이적으로 결합하고 상기 고상 기질의 탐지부에 고정화된 제2항체와 상기 전개된 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 접촉시켜 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체를 형성시키는 단계로서, 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체는 상기 전기장에 의해 상기 탐지부 어느 일정 부위에 국소화(localization) 되는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 증폭된 신호가 발생되는 면역 크로마토그래피 분석 방법을 제공한다.

본 명세서의 용어 "신호"는 분석물이 시료에 존재하는 경우 본 발명의 표지체에서 발생하는 신호를 의미한다.

본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체(complex)를 형성시키는 단계

본 발명에 따르면, 우선 고상 기질(solid substrate)에서 본 발명의 표지체-제1항체 결합체와 분석물을 접촉시킨다. 상기 표지체-제1항체 결합체의 제1항체는 분석물의 제1에피토프와 특이적으로 결합하는 항체이므로, 결과적으로 상기 접촉에 의하여 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 형성시킬 수 있다.

단계 (b): 상기 고상 기질의 횡 방향으로 전기장이 부여된 상태에서 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 전개시키는 단계

단계 (a) 실시 이후, 상기 고상 기질의 횡 방향으로 전기장이 부여된 상태에서 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 전개시킨다. 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체는 하전된 분석물에 의하여 하전되어 있고, 고상 기질의 횡 방향(horizontal direction)으로 부여되는 전기장에 의하여 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체가 전개되는 과정에서 하전된 극성에 따라 상기 탐지부 어느 일정 부위로 편중되어 이동하게 된다.

단계 (c): 제2항체와 전개된 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 접촉시켜 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체를 형성시키는 단계

단계 (b) 실시 이후, 상기 고상 기질의 탐지부에 고정화된 제2항체와 상기 전개된 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 접촉시킨다. 상기 제2항체는 분석물의 제 2 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체이므로, 결과적으로 상기 접촉에 의하여 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체를 형성시킬 수 있다.

또한, 단계 (b)에서 설명한 바와 같이, 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체는 고상 기질의 횡 방향(horizontal direction)으로 부여되는 전기장에 의하여 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체가 전개되는 과정에서 하전된 극성에 따라 상기 탐지부 어느 일정 부위로 편중되어 이동하므로, 상기 탐지부 어느 일정 부위에 고정화된 제2항체와 집중적으로 접촉하게 되고, 결과적으로 상기 탐지부 어느 일정 부위에 국소화된 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체를 형성시킬 수 있는바, 일정한 양의 표지체가 더 좁은 범위에 집중되므로 표지체의 신호가 증폭된다(도 4b).

본 발명의 증폭된 신호가 발생되는 면역 크로마토그래피 분석 방법은 본 발명의 면역크로마토그래피 스트립에서 사용되는 표지체, 제1항체, 고상에 고정화된 제2항체 및 전기장 등을 공통으로 하기 때문에, 상기 방법과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 전기장이 부여되는 탐지부를 포함하는 면역크로마토그래피 스트립 및 전기장에 의하여 증폭된 신호가 발생되는 면역 크로마토그래피 분석 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 고상 기질의 횡 방향(horizontal direction)으로 전기장을 부여하여 탐지부 어느 일정 부위에 국소화된 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체를 형성시킴으로서 표지체의 신호를 증폭시키는 효과가 있다.

(c) 본 발명의 면역 크로마토그래피 스트립은 고감도의 면역 크로마토그래피 분석을 할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 면역 크로마토그래피 스트립의 개략적 구조의 평면도를 나타낸다.
도 2는 자기장의 부여를 위하여 면역 크로마토그래피 스트립의 검출층으로 사용되는 멤브레인 부분(탐지부를 포함)에 접촉된 전도체를 나타낸다.
도 3은 면역 크로마토그래피 스트립의 탐지선에 나타난 신호를 나타낸다. 도 3의 우측 스트립은 대조구로 탐지선이 일정한 농도로 생성되는 것을 확인하였다. 반면, 도 3의 좌측 스트립은 실험구로 표지체-제1항체 접합체가 한쪽으로 편중되어 대조구보다 신호가 증폭됨을 나타낸다.
도 3은 면역 크로마토그래피 스트립의 탐지선에 나타난 신호를 나타낸다. 도 3의 우측 스트립은 대조구로 탐지선이 일정한 농도로 생성되는 것을 확인하였다. 반면, 도 3의 좌측 스트립은 실험구로 표지체-제1항체 접합체가 한쪽으로 편중되어 대조구보다 신호가 증폭됨을 나타낸다.
도 4는 면역 크로마토그래피 스트립 상에서 표지체의 전개 경로를 나타낸다. 도 4a는 대조구에서의 전개 경로이며, 도 4b는 자기장의 부여에 따른 전개 경로를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.

실시예 1: 표지체-제1항체 결합체의 합성

표지체-제1항체 결합체의 합성

금 나노입자 콜로이드용액(10 nm, BBInternational, 캐나다) 1 mL에 0.1 mL의 0.1 M 붕산완충액(Borate buffer, pH 8.5)을 넣고, 1 mg/mL의 IgG 항체(I2011, Sigma, 미국) 10 μL를 넣어 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응 후 연결자로서 1 (w/v)％의 BSA(Bovine serum albumin, Sigma, 미국)를 PBS(Phosphate buffered saline, Gibco, 미국)에 녹인 용액을 0.1 mL 첨가하여 15분 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 반응 후, 10000 rpm, 섭씨 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 10 mM의 PBS에 1 mg/mL 농도로 녹인 BSA 용액 1 mL에 분산시켰다. 상기의 원심분리 및 분산 공정을 1회 추가 반복 후 다시 원심분리하여 최종적으로 1 mL의 PBS에 분산시켜 접합체를 제조하였다.

실시예 2: 면역 크로마토그래피의 제조

면역 크로마토그래피의 제조방법

플라스틱 패드(Millipore社, 독일)에 검출층으로 사용되는 니트로셀룰로스멤브레인(180 sec Nitrocellulose, Millipore社, 독일)과 흡수 패드(Millipore社, 독일)를 붙인 후, 디스펜서(Dispenser) 시스템(MDS)을 사용하여 PBS에 녹인 염소 항-마우스(Goat anti-mouse) IgG 항체(I2011, Sigma, 미국) 1 mg/mL 용액을 6 cm/sec 속도로 각각 실험구 및 대조구의 멤브레인에 선을 그어 탐지선(test site)을 형성하였다. 상기 멤브레인을 건조시킨 후, 절단기에 넣어 3 mm 간격으로 절단하였다.

실험구에는 멤브레인의 좌우 양단에 전도체로 시중에서 판매되는 알루미늄 호일을 부착하였다(도 2).

시료 패드(C068, Millipore社, 독일) 는 0.5％ 트윈(Tween) 20, 5％ 수크로스, 5％ 덱스트란, 0.05％ 아지드화나트륨(sodium azide) 수용액에 담지 후 건조하여 10×3 mm 정도로 절단하였다.

멤브레인 및 흡수패드가 조립된 상기 플라스틱패드에 접합 패드 및 시료 패드를 조립하였다.

표지체-제1항체 결합체 패드의 제조방법

표지체-제1항체 결합체 패드는 GFC(Millipore社, 독일)를 5×3 mm로 절단하여 상기 제조된 표지체-제1항체 결합체를 6 μL씩 각각 도포하여 건조하였다.

실시예 3: 전기적 특성에 의한 표지체의 신호 증폭 효과

표지체로 사용한 직경이 20 nm인 금 나노입자를 사용한 표지체-제1항체 결합체의 전기적 특성에 따른 신호증폭 효과를 살펴보았다. 상기 면역 크로마토그래피 센서에 항원으로서 IgG(Sigma, 미국)를 임의의 농도로 녹인 PBS를 로딩하여 신호를 측정하였다. 도 2과 같이 제작한 멤브레인 양단에 9 V의 전압을 인가한 경우, 도 3의 우측 스트립에서 보이는 바와 같이 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체가 한쪽으로 편중되어 신호가 증폭되는 결과를 보였다. 반면, 전압을 인가하지 않은 경우는 상기 복합체가 분산되어 도 3의 우측 스트립과 같은 결과를 보였다.

이미지 소프트웨어 NIS-element(Nikon Corporation)을 이용하여 상기 감도를 분석한 결과는 하기 표 1과 같다. 상기 소프트웨어를 이용하여 측정한 결과는 수치가 높을수록 명도가 높음을 의미한다. 실험구의 경우 선의 색상이 진해지면서 어두워져 상기 소프트웨어를 이용하여 측정한 결과 수치가 낮은 값을 나타내었고, 대조구의 경우 선의 색상이 연해지면서 밝아지게 되는바 결과 수치가 높은 값을 나타내었다. 따라서 실험구의 경우 평균 감도를 기준으로 신호가 1.48배 증폭되었음을 알 수 있었다.

	대조구	실험구
평균 감도	100.93	68.32
최소 감도	96	63.33
최대 감도	106.66	73.33

결론

본 발명은 표지체 및 특정 항체를 결합하여 제작한 표지체-제1항체 결합체를 이용한 면역 크로마토그래피 분석에서 전도체를 이용하여 표지체에서 발생하는 신호를 증폭시켜 기존의 면역 크로마토그래피를 통한 진단방법보다 고감도의 진단을 할 수 있다는 것을 확인하였다.

대조구의 경우, 도 3의 우측 스트립과 같이 한 줄의 탐지선이 일정한 농도로 생성되는 것을 확인하였다.

반면, 실험구의 경우 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 스트립의 멤브레인 양단에 전도체를 부착하여 9 V의 전압을 인가한 결과, 도 3의 좌측 스트립에서 볼 수 있는 바와 같이 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체가 국소화되어 대조구보다 신호가 증폭되어 신호의 감도가 높아진 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명의 방법에서 사용된 전압이 면역 크로마토그래피 진단의 민감도를 높이는데 중요한 역할을 하여, 본 발명의 방법에 의해 기존의 면역 크로마토그래피 분석보다 더욱 높은 민감도의 분석이 가능함을 알 수 있었다.

따라서 이러한 고감도의 면역 크로마토그래피 진단방법은 높은 민감도가 요구되어지는 각종 질병의 진단 및 임신 등의 현상을 탐지하는데 유용할 것이라 생각된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음을 포함하는 면역크로마토그래피 스트립:
(a) 분석하고자 하는 시료를 수용하는 시료층;
(b) 상기 시료에 함유되어 있는 분석물(analyte)과 특이적으로 결합하는 제1항체와 표지체를 포함하는 표지체-제1항체 결합체를 함유하는 표지체-제1항체 결합체층;
(c) 상기 시료에 분석물이 존재하는지의 여부를 검출하고, 전기장(electric field)이 부여되는 탐지부, 상기 시료의 이동 여부를 확인하는 대조부를 포함하는 검출층;
(d) 상기 탐지부에 전기장을 부여하는 전기장 부여수단; 및
(e) 상기 검출층을 통과한 시료를 흡수하는 흡수층.
제 1 항에 있어서, 상기 제1항체는 분석물의 제1에피토프와 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
제 1 항에 있어서, 상기 표지체는 금 입자인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
제 1 항에 있어서, 상기 전기장 부여수단은 전압의 인가 수단인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
제 4 항에 있어서, 상기 전압은 3-20 V 인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
제 4 항에 있어서, 상기 전압의 인가 수단은 상기 탐지부에 접촉된 전도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
제 1 항에 있어서, 상기 탐지부는 상기 분석물의 제2에피토프와 특이적으로 결합하는 고정화된 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
다음의 단계를 포함하는 증폭된 신호가 발생되는 면역 크로마토그래피 분석 방법:
(a) 고상 기질(solid substrate)에서 분석물의 제 1 에피토프와 특이적으로 결합하는 제1항체와 표지체를 포함하는 표지체-제1항체 결합체와 분석물을 접촉시켜 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체(complex)를 형성시키는 단계;
(b) 상기 고상 기질의 횡 방향(horizontal direction)으로 전기장이 부여된 상태에서 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 전개시키는 단계; 및
(c) 상기 분석물의 제 2 에피토프와 특이적으로 결합하고 상기 고상 기질의 탐지부에 고정화된 제2항체와 상기 전개된 표지체-제1항체 결합체/분석물 복합체를 접촉시켜 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체를 형성시키는 단계로서, 상기 표지체-제1항체 결합체/분석물/제2항체 복합체는 상기 전기장에 의해 상기 탐지부 어느 일정 부위에 국소화(localization)되는 것을 특징으로 하는 단계.
제 8 항에 있어서, 상기 표지체는 금 입자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 전기장은 전압의 인가에 의하여 부여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 전압은 3-20 V로 인가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 전압은 상기 탐지부에 접촉된 전도체를 통하여 인가되는 것을 특징으로 하는 방법.