JP2007523326A - バイオセンサのための内部標準としての酸化され得る化学種、及び使用方法 - Google Patents

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Abstract

試料中の物質の存在又は量を決定するためのバイオセンサ（１０２）、及びバイオセンサ（１０２）の使用方法を提供する。解析するべきユーザー試料を受容するためのバイオセンサ（１０２）は、分析物との電気化学反応のための混合物を含む。混合物は、酵素、媒介物質及び内部標準としての酸化され得る化学種を含む。

Description

本発明は、広く試料中の物質の存在又は量を決定するためのバイオセンサ、より詳細には、内部標準として酸化され得る化学種を含む新規で改善されたバイオセンサ、及びバイオセンサの使用方法に関する。
体液中の分析物の定量は、ある種の生理学的異常の診断及び管理に非常に重要である。例えば、ある個人においては、乳酸エステル、コレステロール及びビリルビンをモニターしなければならない。特に体液中のグルコースの測定は、糖尿病の個人には非常に重要であって、彼らは治療食中のグルコース摂取を調節する手段として体液中のグルコースレベルを頻繁にチェックしなければならない。本明細書の開示の残りの部分はグルコースの測定に向けられることになるが、この本発明の新規で改善されたセンサ素子及び使用方法を、適切な酵素を選択した上で、他の分析物の測定に用いることができることを理解するべきである。
体液中の分析物濃度を決定する方法は、分析物と分析物に特異的な酵素の間の電気化学反応、及び酵素をその最初の酸化状態に維持する媒介物質に基礎を置くことができる。適当な酸化還元酵素にはオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ及びペルオキシダーゼが含まれる。例えば、グルコースが分析物である場合には、グルコースオキシダーゼ及び酸素との反応が、次の式により表わされる：
Figure 2007523326
式（Ａ）によって表わされる反応の第一段階で、テスト試料中に存在するグルコースが、酵素の酸化されたフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）中心などの酵素（Ｅox）を、その還元型（Ｅred）、例えば（ＦＡＤＨ２）へ変換する。これらの酸化還元中心は、酵素分子内に本質的に電気的に絶縁されているので、従来電極の表面への直接の電子伝達は、受け入れ難いほど高い電池電圧が存在しなければ、測定可能な程度に生ずることはない。このシステムの改善には、電子を（ＦＡＤＨ２）と電極の間で往復させるために、電極と酵素の間の非生理的な酸化還元カップリングを用いることが含まれる。これは次の式によって表示され、通常、媒介物質と呼ばれる酸化還元カプラをＭで表す。
Figure 2007523326
式中、ＧＯ（ＦＡＤ）はグルコースオキシダーゼの酸化型を表わし、ＧＯ（ＦＡＤＨ２）がその還元型を示す。仲介する化学種Ｍox／Ｍredが、還元された酵素から電極まで電子を輸送し、それによって酵素を酸化し、インサイチュで酵素の再生が起こる。
Genshaw らに交付され、現在の譲受人に譲渡された米国特許第５，６２０，５７９号及び米国特許第５，６５３，８６３号が、液体のテスト試料を作用電極（対向電極に電気化学的に接続されており、また表面に分析物に特異的な酵素を含む組成物を保持している）の表面に適用することにより、液体のテスト試料中の分析物の濃度を決定するための、装置及び方法を開示している。媒介物質が、分析物と酵素間の反応に応答して還元される。分析物の濃度を決定する前に酸化電位差を電極間に加えて、媒介物質の少なくとも一部をその酸化型に戻し、それによって分析物測定の正確さを増大させる。この最初に印加される電位差に続いて、作用電極における電気化学ポテンシャルの値を最小にするために回路を切り替えて回路を切るか又は相当程度電流が減少する電位差にする。電極間に第２の電位差を加え、分析物濃度を決定するために液体テスト試料中に発生する電流を測定する。場合によっては、さらに分析物測定の正確さをアルゴリズム的に向上させる。
本発明の重要な特徴は、内部標準として酸化され得る化学種を含む、試料中の物質の存在又は量を決定するための新規で改善されたバイオセンサ及びそのバイオセンサの使用方法を提供することである。
端的に言えば、試料中の物質の存在又は量を決定するためのバイオセンサ及びバイオセンサの使用方法を提供する。解析するべきユーザー試料を受容するバイオセンサは、分析物との電気化学反応のための混合物を含む。その混合物は酵素、媒介物質、及び内部標準としての酸化され得る化学種を含む。
内部標準は、酸化され得る化学種として定義されるが、それは実施態様の１つにおいて、媒介物質と等しいかより高い酸化還元電位を有する可逆的な酸化還元対の還元型としてさらに定義することができる。内部標準は、両方の化学種を酸化させる作動電位差に対して応答電流を付加的に増加させるように作用する。また、グルコースが分析物である時には、次の式が全体の応答電流を表わす。
Ｉ全体 ＝ ｌint-ref ＋ Ｉグルコース
Ｉint-ref ∝（内部標準）、 及び Ｉグルコース ∝（グルコース）；
式中、Ｉint-ref は全体の応答電流の内の内部標準による部分であり、一方Ｉグルコースはグルコース濃度に比例した媒介物質の酸化による部分である。
本発明の特徴に従って、内部標準は、同じ媒介物質化学種、又は媒介物質より高い酸化還元電位を有する酸化され得る化学種のいずれかであってよい。したがって、媒介物質だけを酸化させる低い作動電位差を有するバイオセンサについては、電流Ｉint-refがゼロになる。しかし、両方の化学種を酸化させるより高い作動電位差を有するバイオセンサについては、全体の応答電流は、内部標準による部分及びグルコースによる部分の合計となる。内部標準濃度は一定であるため、センサのキャリブレーション勾配は、グルコースに対するセンサの応答のみに依存し、一方で切片は、加えた内部標準の量に依存することになる。言い換えれば、内部標準は単に切片をずらし、キャリブレーション勾配を変化させない。したがって、内部標準の概念が、グルコースバイオセンサを作製する新しい種々の方法を提供する。
本発明は、上記の及び他の目的と利点と共に、図面に図解される本発明の好ましい実施態様の次の詳述な記載から、最も良く理解されるであろう。
本発明は、試料中の物質の存在又は量の決定のための電気化学的バイオセンサに関する。バイオセンサは、作用電極及び対向電極を含むセンサ条片を含み、電極のそれぞれは、例えば少なくとも部分的に個別の試薬層で覆われている。作用電極上の試薬層は、例えば、酸化還元反応を通じて分析物と相互作用する酵素を含み、さらに酸化還元対の酸化型である媒介物質を含む。本発明のバイオセンサは、内部標準又は媒介物質の還元型を、作用電極上の試薬層中に含む。内部標準は酸化され得る化学種として定義され、それはさらに実施態様の１つにおいて、媒介物質と等しいかより高い酸化還元電位を有する可逆的な酸化還元対の還元型として定義することができる。一定量の内部標準が試薬層中に与えられる。内部標準又は媒介物質の還元型の追加量を含む本発明のバイオセンサは、内部標準が、キャリブレーション勾配を維持する一方で、熱力学的性質によってキャリブレーション切片を固定するように作用するという点で、改善をもたらす。
多くの化合物が、還元された酵素から電子を受け取り、それを電極に伝達する能力により、媒介物質として役立つ。媒介物質の必要な１つの属性は、センサの使用に先立って、電極表面に存在する条件下で酸化された状態を維持する能力である。重要な媒介物質には、有機金属化合物、有機分子、遷移金属配位錯体の酸化型が含まれる。媒介物質の具体的な例は、フェリシアン化物としても知られているヘキサシアノ鉄酸（III）カリウムである。
以下の明細書及び請求項の中で用いられる用語、バイオセンサとは、適切な試料中の分析物に選択的に応答してそれらの濃度を電気信号に変換する、分析装置又は機器の電気化学センサ条片又はセンサ素子を意味する。バイオセンサは電気信号を直接生成し、単純な機器設計を容易にする。さらに、バイオセンサは、電極上に化学物質の薄層が沈積されたものであって、ほとんど材料を消費しないので、低い材料費という長所がある。
用語「試料」は未知量の関心対象の分析物を含む組成物として定義される。通常は、電気化学的分析のための試料は液体型であり、また好ましくは、試料は水性混合物である。試料は血液、尿又は唾液などの生体試料でよい。試料は、抽出物、稀釈液、ろ液、又は元に戻した沈殿などの生体試料の誘導物でもよい。
用語「分析物」は、存在又は量を測定されるべき試料中の物質として定義される。分析物は、解析中に存在する酸化還元酵素と相互作用し、酸化還元酵素、補酵素、又は酸化還元酵素とその基質の間の相互作用に影響する別の物質のための基質であってよい。
用語「酸化還元酵素」は、基質の酸化又は還元を促進する任意の酵素として定義される。用語酸化還元酵素には、分子状酸素が電子受容体である酸化反応を促進する「オキシダーゼ」；分析物を還元し、分子状酸素が分析物ではない還元反応を促進する「リダクターゼ」；及び分子状酸素が電子受容体でない酸化反応を促進する「デヒドロゲナーゼ」；が含まれる。例えば、Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology， Revised Edition， A.D. Smith， Ed.， New York: Oxford University Press (1997) 161， 476， 477， 及び 560 ページを参照のこと。
用語「酸化還元」反応は、１つの化学種から他の化学種への少なくとも１個の電子の伝達を含む２化学種間の化学反応として定義される。この型の反応をまた「レドックス反応」とも呼ぶ。反応の酸化部分は、化学種のうちの１つによる少なくとも１個の電子の損失を含み、また還元部分は、他の化学種への少なくとも１個の電子の付加を含む。酸化される化学種のイオン電荷は、伝達された電子数と等しい量だけ、より正になる。同様に、還元される化学種のイオン電荷は、伝達された電子数と等しい量だけ、より正でなくなる。
用語「酸化数」は、原子などの化学種の形式的なイオン電荷として定義される。高い酸化数、例えば（III）などはより正であり、また（II）などの低い酸化数はより正でない。中性の化学種はゼロのイオン電荷を持つ。化学種の酸化は、その化学種の酸化数の増加をもたらし、また化学種の還元はその化学種の酸化数の減少をもたらす。
用語「酸化還元対」は、１つの化学物質の異なる酸化数を有する２つの化学種として定義される。より高い酸化数を有する化学種の還元は、より低い酸化数を有する化学種を生成する。あるいは、より低い酸化数を有する化学種の酸化は、より高い酸化数を有する化学種を生成する。
用語「酸化され得る化学種」は、酸化還元対のより低い酸化数を有する化学種として、またしたがって、より高い酸化数を有する化学種へ酸化されることができる化学種として定義される。同様に、用語「還元され得る化学種」は、酸化還元対のより高い酸化数を有する化学種として、またしたがって、より低い酸化数を有する化学種へ還元されることができる化学種として定義される。
用語「有機遷移金属錯体」は、また「ＯＴＭ錯体」とも呼ばれ、遷移金属が少なくとも１つの炭素原子にσ結合（遷移金属にσ結合している炭素原子上の−１の形式的電荷）又はπ結合（遷移金属にπ結合している炭素原子上の０の形式的電荷）により結合している錯体として定義される。例えば、フェロセンは、各々が２つのπ結合及び１つのσ結合によって、鉄中心へ５つの炭素原子を通して結合した２つのシクロペンタジエニル（Ｃｐ）環を有するＯＴＭ錯体である。ＯＴＭ錯体の別の例がフェリシアン化物（III）及びその還元されたフェロシアン化（II）対応物であり、その場合６つのシアノ配位子（６つの配位子各々の−１の形式的電荷）が、シアノ基の炭素原子を通じて鉄中心にσ結合している。
用語「配位錯体」は、八面体又は平面正方形の形状などの明確な配位構造を有する錯体であると定義される。結合によって定義されるＯＴＭ錯体と異なり、配位錯体はその形状によって定義される。したがって、配位錯体は、（上に述べたフェリシアン化物などの）ＯＴＭ錯体、あるいは窒素、硫黄、酸素、及びリンを含む異種原子のような、炭素以外の非金属原子が遷移金属中心に配位結合している錯体であってもよい。例えば、ルテニウムヘキサアミン、すなわちヘキサアミノルテニウム酸（II）／（III）は、６つのＮＨ３配位子（６つの各配位子上の０の形式電荷）がルテニウム中心に配位結合している、明確な八面体形状を有する配位錯体である。フェリシアン化物もまた、八面体形状を有する配位錯体の例である。有機遷移金属錯体、配位錯体、及び遷移金属結合のより完全な議論を、Collman et al.， Principles and Applications of Organotransition Metal Chemistry (1987)、及び Miessler & Tarr， Inorganic Chemistry (1991) に見出すことができる。
用語「媒介物質」は、酸化されるか又は還元されることができ、及び第１の物質と第２の物質の間で１個以上の電子を伝達することができる物質として定義される。媒介物質は電気化学分析における試薬であって、関心対象の分析物ではない。極めて単純なシステムでは、媒介物質は、適切な基質との接触を通じて酸化還元酵素が還元又は酸化された後に、酸化還元酵素と酸化還元反応を行う。この酸化された又は還元された媒介物質がその後、電極で逆の反応を行い、それの最初の酸化数に再生される。
用語「電気活性有機分子」は、金属を含まず、酸化又は還元反応を行うことができる有機分子として定義される。電気活性有機分子は、酸化還元化学種として及び媒介物質として機能することができる。電気活性有機分子の例には補酵素ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ベンゾキノン及びナフトキノン、Ｎ−オキシド、ニトロソ化合物、ヒドロキシルアミン、オキシン、フラビン、フェナジン、フェノチアジン、インドフェノール及びインダミンが含まれる。
用語「電極」は、電気化学分析のあいだ定常に保たれる導電性物質として定義される。電極材料の例としては、固体の金属、金属ペースト、導電性炭素、導電性炭素ペースト及び導電性ポリマーが挙げられる。
ここで図面を参照し、図１に、参照記号１００によって全体として指定された好ましい実施態様の、本発明の原則に従って配列されたバイオセンサ計器を示す。バイオセンサ計器１００は、本発明の原則に従って配列されたバイオセンサ１０２を含む。バイオセンサ計器１００は、マイクロプロセッサ１０４をプログラム及びユーザーデータを格納するための関連メモリ１０６と共に含む。マイクロプロセッサ１０４からのデジタルデータをデジタル／アナログ（Ｄ／Ａ）変換器１０８に入力する。Ｄ／Ａ変換器１０８はデジタルデータをアナログ信号に変換する。Ｄ／Ａ変換器１０８に接続された増幅器１１０が、アナログ信号を増幅する。増幅器１１０の増幅されたアナログ信号出力を本発明のバイオセンサ１０２に入力する。バイオセンサ１０２は増幅器１１２に接続されている。増幅された検出信号を、増幅されたアナログセンサ信号をデジタル信号へ変換するアナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換器１１４へ入力する。デジタル信号をマイクロプロセッサ１０４に入力する。
血糖モニターのために用いられるほとんどの市販の使い捨てバイオセンサは、酵素及び媒介物質と何らかの接着剤との混合物の沈積／印刷を必要とする。グルコース測定への適用のためには、媒介物質は、酸化還元対の酸化型である。酸化還元対によっては、媒介物質は、フェリシアン化物などの非常に強い酸化剤である場合があり、そのために酵素及び接着剤と混合した後に化学的に官能基を酸化する。続いてインクの混合、貯蔵及び印刷の過程で小量の還元された媒介物質が試薬中の不純物として形成される。したがって試薬インクを混合し印刷する最終結果として、バックグラウンド電流を生じさせる酸化還元対の還元型が生成される。媒介物質のこの還元型の形成、したがってバックグラウンド電流は、バッチごとに異なる可能性がある。フェリシアン化物から生ずるフェロシアン化物のような、この加工過程で生成される媒介物質の還元型を、一般にバックグラウンド信号を最小限にするために、Genshawらへ付与され、現在の譲受人に譲渡された米国特許第５，６２０，５７９号及び米国特許第５，６５３，８６３号中で概説されたアルゴリズムを用いて、酸化することができる。しかしながら、加工過程に依存したバックグラウンド信号（それはキャリブレーション切片に転化する）は、ある範囲の値に広がる可能性がある。これらの広がった切片の値が極端な場合は、広がった切片に適合するように合理的なキャリブレーション切片を割り当てることができないので、分析精度が犠牲になることになる。
本発明の特徴に従って、強い酸化剤の影響を減少させるために、試薬中に一定レベルの媒介物質の還元型を含む媒介物質の等級を用いる。熱力学的に、酵素及び媒介物質のインク混合物中における媒介物質の小量の還元型の存在が、酸化型から還元型への変換に対する駆動力を減少させる。これは、酸化された媒介物質に一定小量の媒介物質の還元型を加えることにより、有利に遂行される。
たとえバックグラウンド信号が生成されても、米国特許第５，６２０，５７９号及び米国特許第５，６５３，８６３号中のアルゴリズムが、バックグラウンドの影響を最小限にして、グルコースセンサの正確さを増大させる。上記の特許が、血液中のグルコースなどの具体的な分析物を測定するために用いられる電流測定センサ中の酸化され得る不純物によるバックグラウンドバイアスを減少させる方法を開示する。そのようなセンサのバックグラウンド電流は、センサを長期間又はストレス（熱、湿気その他）下で貯蔵すれば、還元された媒介物質又はセンサ中に存在する他の還元された不純物（例えばグルタミン酸塩のような酵素安定剤及び還元性等価物を有する界面活性剤など）の存在の増加により、増加することになる。例えば、フェリシアン化物に基づいた電流測定センサ中では、バックグラウンドバイアスは、電極表面近くのフェロシアン化物（フェリシアン化物の還元による）の存在と関連している。この蓄積されたフェロシアン化物は、センサの使用中に生成されるフェロシアン化物（新鮮なフェロシアン化物）とは対照的に、酸化されてフェリシアン化物に戻されて、それが引き起こすバックグラウンドバイアスを減少させ、それによりセンサの保存寿命を延長させる。この目的を達成するために、この方法は電気化学的アプローチを用いる。電気化学的アプローチがアルゴリズムによる修正により増強される場合は、さらにバックグラウンドバイアスが低減される。
開示される方法は、バイオセンサ使用中の標準電位差プロフィールに先行する正電位差パルス（「バーンオフ」パルスと呼ぶ）を最初に与える工程を含む。通常これを、０．１〜０．９ボルト（好ましくは０．３〜０．７ボルト）の正電位差をセンサの作用電極と参照電極の間に１〜１５秒間（好ましくは５〜１０秒間）かけることによって遂行する。バーンオフパルスは、最初のフェロシアン化物（あるいは他の酸化され得る不純物）を酸化させ、その結果センサはクリーンなバックグラウンドで分析を始めることができる。通常は、酸化され得る不純物の一部分だけがバーンオフパルスによって酸化されるので、バックグラウンドは完全にクリーンではない。化学層が作用電極及び対向電極の両方を覆うためにこのようになる。最初のフェロシアン化物はフェリシアン化物由来であるので、化学層に存在する。試料液体を加えて化学層が再水和されると、作用電極の近くのフェロシアン化物は再酸化される。残りのフェロシアン化物は試料液体中へ拡散し、グルコースと混合される。最初のフェロシアン化物のその部分は、再度酸化されると必ずグルコースに影響を与える。最初のフェロシアン化物は、液体テスト試料を加えた後、極めて短時間（数秒間）電極の近くにいる。この理由は、化学物質（酵素及びフェリシアン化物、その他）が、作用電極及び対向電極上に薄層として沈積しているためである。バーンオフ技術はこれを利用する。大部分が電極と直接接触しない液体テスト試料中の分析物の濃度が顕著に還元されることなく、最初のフェロシアン化物のかなりの量をバーンオフすることができるためである。実験が、バーンオフパルスの適切な適用により、ストレスのかかったセンサのバックグラウドバイアスを４０％減少させることができることを実証した。
米国特許第５，６２０，５７９号及び米国特許第５，６５３，８６３号に開示された方法を有利に適用してバックグラウンド信号の影響を最小限にし、好ましい実施態様のグルコースバイオセンサ計器１００の精度を増大させる。上記の特許の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の特徴に従って、追加量の還元型の媒介物質が、熱力学性質によりキャリブレーション切片を固定し、一方でキャリブレーション勾配をそのままに保つように作用する。媒介物質の還元型、例えばフェロシアン化物が、グルコースセンサ中で行う機能に照らして、これを内部標準と呼ぶ。
電気活性有機分子媒介物質の例について、Bloczynskiらに１９９６年５月２８日に交付され、現在の譲受人に譲渡された米国特許第５，５２０，７８６号に記述されている。特に、ＭＬＢ−９２として本明細書に引用する３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンを含む開示された媒介物質（表１の化合物１８）を、本発明の特徴に従うグルコースバイオセンサ１０２を作製するために用いた。上記の特許の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
市販のバイオセンサ計器及びバイオセンサが Bayer社によって、商標Ascensia DEXとして製造され販売されている。Ascensia DEXバイオセンサは、一般に、試薬用にできる限り純粋な形のフェリシアン化物を含む。Ascensia DEXバイオセンサを用いて、フェロシアン化物の適当量を純粋なフェリシアン化物に加えることにより、本発明の特徴に従うグルコースバイオセンサ１０２を作製した。バイオセンサ１０２の内部標準を規定するフェロシアン化物をAscensia DEX試薬インクへ加えることの利点には、勾配を変更せずに切片を増加させ、切片の範囲を固定させ、及び貯蔵中のバイオセンサの長期安定性を増加させるという目先の利益が含まれる。
本発明の特徴に従って、より低い酸化還元電位を有するＭＬＢ−９２媒介物質を用いて、特別な特性を備えたグルコースバイオセンサ１０２を作製した。内部標準のフェロシアン化物の適当量の追加により、新しいバイオセンサシステムは、（１）新しい媒介物質及び内部標準の両方が酸化される４００mV、及び（２）新しい媒介物質だけが酸化されることができる１００mV、の２つの作動電位差で作動させることができる。このアプローチの重要性は２重である。第１に、このように調合された（新しい媒介物質及び内部標準）グルコースバイオセンサ１０２は、高電位差（＋４００mV）で作動することができ、既存の機器のハードウェア要件であるキャリブレーション特性に適合する範囲の電流を生じることができる。第２に、媒介物質の低い酸化還元電位、したがって低い酸化力は、媒介物質の酸化型を事実上還元型に変換しないことになるので、センサに、より低い作動電位差（０〜１００mV）を与えて内部標準の酸化を回避することができる。したがって、低い酸化能力のためにゼロに近い切片を有する可能性がきわめて高い、新しい媒介物質に基づいたキャリブレーション特性の新しい一組により、グルコース測定用のよりよい分析精度が実現されることになる。さらに、それは尿酸及びアセトアミノフェンのような既知の酸化され得る化学種のうちのいくつかの酸化を回避することにより、全血中のマトリックス干渉を減少させることになる。
本発明の特徴に従って、グルコースセンサ１０２への内部標準の別の適用は、十分に大量の内部標準をバイオセンサシステムに加えて、高い電流応答を生成させることである。工程間に回路の切断がある２工程アルゴリズム（Bayer特許第５，６２０，５７９号及び第５，６５３，８６３号）を用いて、第１の電位差工程は、４００mVに設定されて、ほとんどが内部標準の信号による電流を生じ、第２の工程は、低電位差（０〜１００mV）に設定されて、グルコース濃度のみと関係する電流信号を生成する。全血ヘマトクリットと事実上独立なはずである第１の信号の、低電位差における第２の信号に対する比は、ヘマトクリット効果による解析バイアスに対する補正に用いることができる。
本発明の特徴に従って、内部標準は、酸化され得る化学種として定義され、それは実施態様の１つにおいて、媒介物質と等しいかより高い酸化還元電位を有する可逆的な酸化還元対の還元型としてさらに定義される。内部標準という概念及びそれの使用は、分析化学の分野では極めて一般的である。しかしながら、内部標準をバイオセンサに用いる例は、既存の特許や文献には示唆されていない。上に記述した３つのシナリオすべての中で、内部標準は、両方の化学種を酸化させる作動電位差及び分析物としてはグルコースの場合に対して、応答電流を加算的に増加させるように作用し；全体の応答電流は、次のように表わされる：
Ｉ全体＝Ｉint-ref ＋Ｉグルコース
Ｉint-ref ∝（内部標準） 及び Ｉグルコース ∝（グルコース）；
式中Ｉint-refは、全応答電流の内の内部標準による部分であり、一方Ｉグルコースは、グルコース濃度に比例する媒介物質の酸化による。
本発明の特徴に従って、内部標準は、媒介物質と同じ化学種又は媒介物質より高い酸化還元電位を有する酸化され得る化学種のいずれかでよい。したがって、媒介物質だけを酸化する低い作動電位差を有するバイオセンサに対しては、Ｉint-ref がゼロになる。しかしながら、両方の化学種を酸化する、より高い作動電位差を有するバイオセンサについては、全応答電流が、内部標準による部分及びグルコースによる部分の合計になることになる。内部標準濃度が固定されているので、センサのキャリブレーション勾配はグルコースに対するセンサ応答のみに依存し、一方で切片は加えた内部標準の量に依存することになる。言い換えれば、内部標準は切片のみをずらし、キャリブレーション勾配を変化させないであろう。このように、内部標準の概念は、グルコースバイオセンサを作製するための新規で異なる方法を提供する。
ここで図１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄを参照して、本発明のグルコースバイオセンサ１０２のための、内部標準の使用に基づいた少なくとも３つのモードの動作が存在する。定電位差的に、３つの動作モードを図１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄに表わす。図示された各動作モードは、第１のバーンオフパルス、それに続く第２の待ち時間又は回路の切断、及び最後の第３の読み取りパルスを含み、各パルス又は期間は選択された持続時間、例えば１０秒を有する。基礎的で最も即時の操作では、フェロシアン化物が、フェリシアン化物中に全フェリシアン化物の０．１〜１％の濃度で保持され、本発明のグルコースバイオセンサ１０２に内部標準を提供する。これは図１Ｂに、第１及び第３の期間の両方の電位差が同じ電圧、例えば４００mV、である場合について表示されている。内部標準を規定するフェロシアン化物の僅かな割合の保持を、フェリシアン化物の適切な精製工程により、又はフェロシアン化物の適当量を純粋なフェリシアン化物に加えることにより、遂行することができる。これらの保持過程の結果は、特別な等級のフェリシアン化物として、望ましい量のフェロシアン化物をフェリシアン化物中に故意に維持することである。これは、通常フェリシアン化物の０．０５％以下のオーダーのフェロシアン化物を不純物として含むＤＥＸ試薬用のような、フェリシアン化物のできるだけ純粋な形を有するという一般常識と対照的である。最も望ましい量は、ＤＥＸセンサ用の最終調合物における０．１％のフェロシアン化物であり、それによってＤＥＸセンサについて、キャリブレーション勾配が維持される一方で、キャリブレーション切片が狭い範囲に固定されることになる。
図１Ｃに動作の第２モードを示す。この場合は、望ましい量のフェロシアン化物（内部標準）を、酵素及び内部標準より低い酸化還元電位を有する媒介物質の試薬に加える。バイオセンサ１０２は、既存の機器及び新しいハードウェア要件を備えた機器用に、高電位差及び低電位差（例えばＡｇ／ＡｇＣｌに対する４００mV 及び１００mV）で作動することが予想される。このバイオセンサは、既存の機器１００用には図１Ｂに示される電位差プログラムで、及び新しい機器１００用には図１Ｃで、作動することができる。媒介物質及び内部標準の組合せの例としては、ＭＬＢ−９２とフェロシアン化物の系、ならびにルテニウムヘキサアミンとフェロシアン化物の系が挙げられる。２つの酸化還元電位の分離が十分に大きいので、低電圧で作動された時には、一般には内部標準化学種の酸化は無い。
図１Ｄに、動作の第３モードを示す。この場合はより高い、しかし望ましい濃度のフェロシアン化物を、酵素及び内部標準より低い酸化還元電位を有する媒介物質の試薬混合物に加える。内部標準の量は、好ましくはキャリブレーション範囲のフルスケールの約５０％〜７５％に等価な電流を発生させることになろう。作動アルゴリズムにおいて、第１の電位差工程は、媒介物質及び内部標準の両方を酸化させるように設定され（４００mV）、読み取りパルス用の第２の電位差工程は、媒介物質のみを酸化させるように設定される（０〜１００mV）。図１Ｄの第１の電位差工程における電流は、電極の直ぐそばに存在し、事実上ヘマトクリット効果を有さないはずの内部標準に関係する。第２の工程からの電流の第１工程からの電流に対する比率は、ヘマトクリット効果による解析バイアスに対する補正を提供することになる。
媒介物質システムに内部標準を加えて既存の問題を克服するか又はセンサ性能を向上させる本発明のバイオセンサ１０２に従う方法の実現可能性を示す実験を行った。
ここで図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃを参照して、本発明のバイオセンサ１０２の作動を図示する３つのサイクリックボルタモグラムを示す。３つの図示されたサイクリックボルタモグラムは、０mg/dL グルコースの全血試料中に内部標準としてフェロシアン化物を有する、ＭＬＢに基づいたグルコースバイオセンサ１０２に対するものである。
図２Ａは、作用電極対フェリシアン化物対向電極を示し、図２Ｂは、作用電極対銀(Ａｇ)及び塩化銀(ＡｇＣｌ）、即ちＡｇ／ＡｇＣｌ対向電極を示し、また図２Ｃは、作用電極対ＭＬＢ−９２対向電極を示す。３つのボルタモグラムプロットすべてについて、１及び２と記した各ピークは、媒介物質ＭＬＢred（ＭＬＢの還元型）及び内部標準フェロシアン化物の酸化をそれぞれ表わす。ＭＬＢredに対する酸化ピークは、対向電極上の酸化還元対がフェリシアン化物からＡｇ／ＡｇＣｌへ、ＭＬＢ−９２へと変化すると、電位差スケールに沿ってシフトする。しかし、媒介物質ＭＬＢ−９２の内部標準フェロシアン化物に対する相対的位置は、図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃの３つのボルタモグラムプロットすべてにおいて同一であることが分かる。
図３を参照し、図３に示すのは、異なる電圧の作動電位差における本発明のバイオセンサ１０２の線形応答を示す図である。バイオセンサ１０２を（１）４００mVの電位差及び（２）１５０mVの電位差、で作動させる。図３は、内部標準として２０mMフェロシアン化物を有するＭＬＢ−９２媒介物質に基づくバイオセンサ１０２の直線的な用量応答を示す。例１及び例２と符号を付けたそれぞれの線は、Ａｇ／ＡｇＣｌ対向電極に対する４００mV及び１５０mVの作動電位差からのものである。図３に示すように、バイオセンサ１０２は、電位差４００mV及び１５０mVでの作動に対して実質的に同一の勾配を、しかし異なる切片を与える。この結果は、内部標準が、作動電位差により選択的に、酸化されるか又は回避されることができることを実証している。このように、１つのバイオセンサ１０２が異なる２つの計器のために役立つことができる。
内部標準としてのフェロシアン化物の増加に伴う切片の増加を系統的に示しており、一方で勾配は実質的に変化なく保持されているバイオセンサ１０２の例を準備した。３つの作用電極試薬を次の処方によって調製した。これら３つの試薬を２つのセンサフォーマット：（１）対向電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ、（２）対向電極として１０％印刷フェリシアン化物、上へ押さえつけて沈積させた。
Figure 2007523326
図４は、対向電極として１０％印刷フェリシアン化物を有する本発明のバイオセンサ１０２を用いた、加えた内部標準の全ボルタンメトリック電流への影響を示す。図４は、内部標準としてフェロシアン化物を有するセンサの、０mg/Lグルコースの全血試料中におけるサイクリックボルタモグラムを表示する。Ａ、Ｂ及びＣと記したボルタモグラムはそれぞれ、すべて１０％印刷フェリシアン化物の対向電極による処方１、２及び３によるものである。
対向電極として１０％印刷フェリシアン化物を備えたセンサを用いた、加えた内部標準の全ボルタンメトリック電流への影響を図４に示す。主な酸化／還元ピークは、ここでは１０％フェリシアン化物に対しては、媒介物質ＭＬＢによる−０．３８ボルトの位置に中心が存在する。約０〜５０mVの酸化ピークはフェロシアン化物の内部標準による。内部標準フェロシアン化物に対する酸化ピークが、０mMから４mM、８mMへの内部標準濃度の増加により増加する一方で、媒介物質に対する酸化ピークは実質的に不変である。ここで内部標準の概念が、ＭＬＢredの主な酸化ピークが内部標準の存在に影響されないという事実によって、さらに説明される。
図５Ａ及び５Ｂを参照して、対向電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを有する本発明のＭＬＢに基づくバイオセンサ１０２の、線形応答及び増加する内部標準と共に増加する切片を図示する図を示す。図５Ａは、例１、例２及び例３とそれぞれラベルされた０、４、及び８mMフェロシアン化物を有するＭＬＢに基づくバイオセンサ１０２の直線的用量応答を図示する。図５Ｂは、切片及び勾配を、本発明のバイオセンサ１０２の作用電極試薬中に加えたフェロシアン化物の関数として示す。３つのセンサはすべて対向電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを用いた。
さらに図６Ａ及び６Ｂを参照して、対向電極として１０％フェリシアン化物を有する本発明のＭＬＢに基づくバイオセンサ１０２の、線形応答及び増加する内部標準と共に増加する切片を示す図を示す。図６Ａは、例１、例２及び例３とそれぞれ記された０、４、及び８mMフェロシアン化物を有するＭＬＢに基づくバイオセンサ１０２の直線的用量応答を図示する。図６Ｂは、切片及び勾配を、本発明のバイオセンサ１０２の作用電極試薬中に加えたフェロシアン化物の関数として図示する。３つのセンサはすべて対向電極として１０％印刷フェリシアン化物を用いた。
用量応答実験では、図５Ａ及び５ＢのＡｇ／ＡｇＣｌ対向電極を備えたセンサシリーズ、及び、図６Ａ及び６Ｂの１０％フェリシアン化物対向電極を備えたセンサシリーズの両方が、線形応答及び増加する内部標準と共に増加した切片を示す。実用的な目的のためには、図５Ａ及び５Ｂの３つのセンサの勾配は不変であるが、一方、切片は、加えたフェロシアン化物と共に直線的に増加している。切片の、加えたフェロシアン化物との同一の直線関係及び平らな勾配の傾向が、図６Ａ及び６Ｂに示されるように、対向電極として％印刷フェリシアン化物を有するセンサシリーズで繰り返されている。
フェロシアン化物のＤＥＸ試薬インクへの添加が、本発明のバイオセンサ１０２に従って勾配を変更することなくキャリブレーション切片の変更することの実験を実行した。
図７は、本発明のＤＥＸ型バイオセンサ１０２の、キャリブレーション切片と増加する内部標準との直線関係を図示する。図７でＢＣ７と名付けたセット構成の５つの異なる処方を、ＤＥＸセンサのための標準ＤＥＸ試薬に混合した０、０．０２、０．０４、０．０６、及び０．０８％のフェロシアン化物で作製した。これらの５つのＢＣ７構成のセンサに対する回帰勾配及び切片を図７に示す。実験的な問題による０．０６％フェロシアン化物を有するセンサを除いて、他の４つのセンサの切片は、内部標準として加えたフェロシアン化物量に関して良好な線形関数を与える。他方で、５つのセンサの勾配はすべて平らな直線内にあり、内部標準の添加が本発明のＤＥＸ型バイオセンサ１０２の勾配を変更しないことを示す。
図８Ａ及び８Ｂは、対照試薬インクからの、及び２０％フェリシアン化物の試薬混合物に加えられた０．１％のフェロシアン化物を有する本発明のバイオセンサ１０２の試薬インクからの、残存フェロシアン化物のフローインジェクション分析（ＦＩＡ）の結果得られる信号対標準比を図示する。ＤＥＸ試薬インクに内部標準フェロシアン化物を加えることの微妙な効果の１つは、媒介物質フェリシアン化物をフェロシアン化物へ変換する駆動力を減少させることである。このようにして、フェリシアン化物がＤＥＸセンサ中の残存電流の源になる。この微妙な効果を示す１つの方法が、内部標準を有する試薬インクの残存電流（バックグラウンド電流）の増加を、対照の試薬インクと共に、長時間にわたってモニターすることである。両方の試薬インクを数週間にわたり冷蔵（２〜８℃）保存した。図８が、両方の試薬インクから得られた残存フェロシアン化物のＦＩＡの結果を示す。図８から、信号対標準比（Ｓ／Ｒ）は、ＦＩＡにおける、標準として加えたフェロシアン化物と比較した、試薬インクからのフェロシアン化物の相対量を表わす。したがって、ＦＩＡ分析から得られたＳ／Ｒの値が高いほど、試薬インク中のフェロシアン化物が多い。図８Ａから、Ｓ／Ｒ値が６週間にわたり、対照のインク及び加えたフェロシアン化物を有する試薬インクの両方について増加することが分かる。しかし、加えたフェロシアン化物を有する試薬インクの曲線は、対照の曲線と比較して６週間にわたる残余電流の増加が遅い。図８Ｂには、対照インク及び加えたフェロシアン化物を有する試薬インクから得られたＳ／Ｒ応答曲線を、比較のために一緒に合わせてある。一次近似（両方の二次多項式の二次の項の係数は非常に小さいので）をすると、６週間にわたる冷蔵中の残存電流の増加率は、加えたフェロシアン化物を有する試薬インクの曲線の方が約３０％（［０．０９１８−０．０６３８］／０．０９１８＝３０％）対照曲線よりも小さい。このようにして図８Ａと８Ｂから、試薬インク中でのフェリシアン化物のフェロシアン化物への変換速度が、本発明のバイオセンサ１０２に従ってＤＥＸ試薬インクへ内部標準フェロシアン化物を加えることによって、相当程度減少することが理解できる。
本発明を、図面に示されている本発明の実施態様の詳細を参照して記述したが、これらの詳細は、添付した特許請求の範囲で権利請求する本発明の範囲を制限することを意図したものではない。
本発明による内部標準を有するバイオセンサを含むバイオセンサ計器のブロック線図表示である。 本発明の図１のバイオセンサを使用するための作動方法を示す図である。 本発明の図１のバイオセンサを使用するための作動方法を示す図である。 本発明の図１のバイオセンサを使用するための作動方法を示す図である。 ０mg/mlグルコースの全血試料中における、本発明の図１のバイオセンサである、内部標準としてフェロシアン化物を有するＭＬＢに基づくグルコースバイオセンサのサイクリックボルタモグラムを示す図である。 ０mg/mlグルコースの全血試料中における、本発明の図１のバイオセンサである、内部標準としてフェロシアン化物を有するＭＬＢに基づくグルコースバイオセンサのサイクリックボルタモグラムを示す図である。 ０mg/mlグルコースの全血試料中における、本発明の図１のバイオセンサである、内部標準としてフェロシアン化物を有するＭＬＢに基づくグルコースバイオセンサのサイクリックボルタモグラムを示す図である。 異なる電圧の作動電位差での本発明の図１のバイオセンサの線形応答を示す図である。 対向電極として１０％の印刷されたフェリシアン化物を有する本発明の図１のバイオセンサを用いた全体のボルタンメトリック電流に対する、加えた内部標準の影響を示す図である。 対向電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを有する本発明の図１のＭＬＢに基づくバイオセンサの、線形応答及び増加する内部標準と共に増加した切片を示す図である。 対向電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを有する本発明の図１のＭＬＢに基づくバイオセンサの、線形応答及び増加する内部標準と共に増加した切片を示す図である。 対向電極として１０％フェリシアン化物を有する本発明の図１のＭＬＢに基づくバイオセンサの線形応答、及び増加する内部標準につれて増加した切片を示す図である。 対向電極として１０％フェリシアン化物を有する本発明の図１のＭＬＢに基づくバイオセンサの線形応答、及び増加する内部標準につれて増加した切片を示す図である。 対向電極として１０％フェリシアン化物を有する本発明の図１のＤＥＸバイオセンサの、キャリブレーション切片と増加する内部標準との直線関係を示す図である。 対照試薬インクからの、及び２０％フェリシアン化物の試薬混合物に加えられた０．１％フェロシアン化物を有する本発明の図１のバイオセンサの試薬インクからの、残余のフェロシアン化物のフローインジェクション分析（ＦＩＡ）から得られた、信号対標準比を示す図である。 対照試薬インクからの、及び２０％フェリシアン化物の試薬混合物に加えられた０．１％フェロシアン化物を有する本発明の図１のバイオセンサの試薬インクからの、残余のフェロシアン化物のフローインジェクション分析（ＦＩＡ）から得られた、信号対標準比を示す図である。

Claims (20)

  1. テスト試料中の分析物濃度を決定するためのバイオセンサであって：
    分析物との電気化学反応のための酵素を含む混合物、
    媒介物質、及び、
    内部標準としての酸化され得る化学種、
    を含むバイオセンサ。
  2. 前記内部標準が、前記媒介物質と等しいか又はより高い酸化還元電位を有する可逆的な酸化還元対の還元型として定義される、請求項１記載のバイオセンサ。
  3. 前記媒介物質が、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンを含む、請求項１記載のバイオセンサ。
  4. 前記内部標準がフェロシアン化物を含む、請求項３記載のバイオセンサ。
  5. 前記内部標準を規定する前記フェロシアン化物及び前記媒介物質が第１の電位差で酸化され、前記媒介物質のみが第２の電位差で酸化され；前記第２の電位差は前記第１の電位差より小さい、請求項４記載のバイオセンサ。
  6. 前記第１の電位差が約４００mV であり、前記第２の電位差が約１００mV である、請求項５記載のバイオセンサ。
  7. 前記媒介物質がフェリシアン化物を含む、請求項１記載のバイオセンサ。
  8. 前記内部標準がフェロシアン化物を含む、請求項７記載のバイオセンサ。
  9. 前記媒介物質がルテニウムヘキサアミンを含む、請求項１記載のバイオセンサ。
  10. 前記内部標準がフェロシアン化物を含む、請求項９記載のバイオセンサ。
  11. 前記酵素がグルコースオキシダーゼを含む、請求項１０記載のバイオセンサ。
  12. 酵素、媒介物質及び内部標準としての酸化され得る化学種の混合物を含むバイオセンサの使用方法であって：
    最初の期間に第１の電位差を与える工程；
    設定された遅延期間を提供する工程；
    前記遅延期間に続く最後の期間に第２の電位差を与える工程；
    を含み、前記第１の電位差及び前記第２の電位差は、前記媒介物質のみ又は前記媒介物質及び前記内部標準の両方を酸化させるために選択的に与えられる、バイオセンサの使用方法。
  13. 最初の期間に第１の電位差を与える工程が、前記媒介物質及び前記内部標準を酸化するために、選択された高い第１の電位差を最初の期間に与える工程を含む、請求項１２記載の方法。
  14. 最初の期間に第１の電位差を与える工程が、前記媒介物質のみを酸化するために選択された低い第１の電位差を最初の期間に与える工程を含む、請求項１２記載の方法。
  15. 前記遅延期間に続く最後の期間に第２の電位差を与える工程が、前記媒介物質及び前記内部標準を酸化するために選択された第２の電位差を与える工程を含む、請求項１２記載の方法。
  16. 前記遅延期間に続く最後の期間に第２の電位差を与える工程が、前記媒介物質のみを酸化するために選択された第２の電位差を与える工程を含む、請求項１２記載の方法。
  17. 前記第１の電位差を与える工程及び前記第２の電位差を与える工程が、１００mV〜４００mVの範囲の選択された電位差を与える工程を含む、請求項１２記載の方法。
  18. 前記第１の電位差を与える工程及び前記第２の電位差を与える工程が、前記媒介物質及び前記内部標準の両方を酸化させるために選択された第１の電位差を最初の期間に与える工程；及び前記媒介物質のみを酸化するために選択された第２の電位差を与える工程を含む、請求項１２記載の方法。
  19. バイオセンサが、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン及びルテニウムヘキサアミンの１つを含む媒介物質を含み；及び内部標準がフェロシアン化物を含み；及び前記第１の電位差を与える工程及び前記第２の電位差を与える工程が、前記媒介物質のみを酸化させるために選択された第１及び第２の電位差を与える工程を含む、請求項１２記載の方法。
  20. 前記第１の電位差を与える工程及び前記第２の電位差を与える工程が、前記媒介物質及び前記内部標準の両方を酸化するために選択された第１及び第２の電位差を与える工程を含み；前記内部標準が、キャリブレーション切片を狭い範囲に効果的に固定し、また前記内部標準がバイオセンサに対するキャリブレーション勾配を効果的に維持する、請求項１２記載の方法。
JP2006552278A 2004-02-06 2005-02-04 バイオセンサのための内部標準としての酸化され得る化学種、及び使用方法 Withdrawn JP2007523326A (ja)

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