DE4100727C2

DE4100727C2 - Analytisches Verfahren für Enzymelektrodensensoren

Info

Publication number: DE4100727C2
Application number: DE19914100727
Authority: DE
Inventors: Karl-Dittmar Dr Klein
Original assignee: KLEIN KARL DITTMAR DR
Current assignee: KLEIN KARL DITTMAR DR
Priority date: 1991-01-09
Filing date: 1991-01-09
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2011-01-10
Also published as: DE4100727A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf analytische Verfahren unter Verwendung von Enzym elektrodensensoren, die auch als elektrochemische Biosensoren bezeichnet werden.

Enzymelektrodensensoren werden zunehmend für Analysen in der Medizin und der Biotechnologie eingesetzt. Hierbei sind von Vorteil die hohe Spezifität Enzym-kata lysierter Reaktionen und die hohe Empfindlichkeit von Elektrodenmessungen bei ge ringem technischen Aufwand (siehe z. B. die Monographie "Biosensors", Fundamentals and Applications, herausgegeben von A.P.F. Turner, I. Karube und G.S. Wilson, Ox ford University Press, 1987).

Es werden die Konzentrationen zahlreicher Stoffe wie Glucose, Harnstoff, Alkohol, Lactat usw. in physiologischen bzw. biotechnologischen Flüssigkeiten gemessen. Diese Stoffe sind elektrochemisch inaktiv, d. h. sie lassen sich mit Hilfe von Elektrodenreak tionen nicht direkt nachweisen. Ein derartiger Stoff kann aber in Folge einer geeigneten chemischen Reaktion elektrochemisch aktive Substanzen erzeugen oder verbrauchen. Eine derartige chemische Reaktion ist besonders geeignet, wenn für sie ein passendes Enzym zur Verfügung steht. Die Anwesenheit des Enzyms erniedrigt die Ak tivierungsenergie der Reaktion, so daß sie im allgemeinen sehr schnell abläuft. Das En zym wirkt außerdem zweifach spezifisch: Es selektiert aus einem Gemisch von Sub straten nur eines (den Analyten) und katalysiert nur die eine (erwünschte) chemische Reaktion, die die an einer Elektrode nachweisbaren Substanzen erzeugt oder ver braucht. Aus diesem Zusammenwirken von Enzym und Elektrode ergibt sich, daß beide eng benachbart sein müssen. Es ist deshalb günstig, das Enzym in Elektroden nähe zu immobilisieren.

Die elektrochemisch aktiven Substanzen der Enzym-katalysierten Reaktion können Elektronen an die Elektrode abgeben bzw. von der Elektrode aufnehmen. Um sie nachzuweisen, wird z. B. im ersteren Fall von außen ein positives elektrisches Potential an die Elektrode gelegt, so daß die Elektronen kontinuierlich von der Elektrode abge zogen werden. Die Stärke des sich einstellenden, äußeren elektrischen Stromes ist dann ein Maß für die Geschwindigkeit der Enzym-katalysierten Reaktion. Unter der Voraus setzung, daß die Konzentration des Analyten diese Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt, ist die Stärke des äußeren Stromes ein Maß für die Konzentration des Ana lyten. Dieses Meßverfahren heißt amperometrisches und entspricht dem Stand der Technik.

Der zusätzliche Einbau eines Redoxsystems an die Enzymelektrode kann für das am perometrische Verfahren vorteilhaft sein. Das Redoxsystem kann als sogenannter Elek tronenakzeptor oder Mediator den Ladungstransfer vom Enzym bzw. von der elektro chemisch aktiven Substanz zur Elektrode beschleunigen (Zeitschrift "Clinica Chimica Acta", Jahrgang 57 (1974), Seiten 283-289, P. Schläpfer, W. Mindt, Ph. Racine). Das Redoxsystem Dimethylferrocen beim amperometrischen Verfahren wird in der Zeitschrift "Analytical Chemistry", Jahrgang 56 (1984), Heft 4, Seiten 667-671, A.E.G. Cass, G. Davis, G.D. Francis, H.A.O. Hill, W.J. Aston, I.J. Higgins, E.V. Plot kin, L.D.L. Scott, A.P.F. Turner, beschrieben.

Bei der Analytkonzentration Null wird im allgemeinen bereits ein äußerer Strom ge messen, der von interferierenden Substanzen herrührt. Diese Substanzen sind ebenfalls elektrochemisch aktiv, und zwar im allgemeinen unabhängig von der Enzym-katalysier ten Reaktion. Man korrigiert die resultierende Verfälschung der Meßergebnisse, indem man den Wert der Stromstärke bei der Analytkonzentration Null jeweils von den Strommeßwerten subtrahiert. In den meisten Fällen gelangen die interferierenden Sub stanzen jedoch zusammen mit dem Analyten in die zu untersuchende Probe. Ihr ver fälschender Einfluß auf das Meßergebnis kann dann ohne weitere Analyseverfahren nicht eliminiert oder korrigiert werden.

Um die Zeit für eine Meßprozedur zu verkürzen, wird häufig ein abgewandeltes am perometrisches Verfahren angewendet. Bei diesem Verfahren wird nur die Steilheit des anfänglichen Stromanstiegs ausgewertet, der nach dem Eintauchen des Enzymelektro densensors in die zu untersuchende Probe auftritt. Vor jeder derartigen singulären Messung muß die Enzymelektrode in einer Lösung mit der Analytkonzentration Null ins Gleichgewicht gekommen sein. Dieses Verfahren hat ebenfalls den Mangel, daß der verfälschende Einfluß interferierender Substanzen, die zusammen mit dem Analyten auftreten, ohne weitere Analyseverfahren nicht eliminiert oder korrigiert werden kann. Darüber hinaus ist das Verfahren aus praktischen Gründen nicht anwendbar, wenn die zeitliche Änderung der Analytkonzentration gemessen werden soll; Beispiele dazu: In- vivo-Überwachung der Glucosekonzentration bei Diabetikern, Prozeßsteuerung von Bioreaktoren.

Ein anderes abgewandeltes amperometrisches Meßverfahren mit Enzymelektroden, das in der Offenlegungsschrift DE 38 05 773 A1 beschrieben ist, dient ebenfalls der Verkürzung der Zeit für eine Meßprozedur. Bei diesem Verfahren wird eine gewisse Zeit vor dem Einprägen des Arbeitspotentials ein Potential beträchtlich höher als das Arbeitspotential angelegt, wodurch der Meßstrom beim Arbeitspotential seinen sta tionären Wert schneller erreicht. Dieses Verfahren hat ebenfalls den Mangel, daß der verfälschende Einfluß interferierender Substanzen, die zusammen mit dem Analyten auftreten, ohne weitere Analyseverfahren nicht eliminiert oder korrigiert werden kann.

Für in-vivo-Anwendungen hat das amperometrische Verfahren mit Enzymelektro densensoren zwei weitere Nachteile:

1. Die Enzymelektrode und die stets erforderliche Gegenelektrode sind ständig mit elektrischen Potentialen beaufschlagt, an denen körpereigene Substanzen durch elektrochemische Oxidation oder Reduktion zu giftigen Substanzen umgewandelt werden können.
2. Der zwischen den Elektroden im Elektrolyten ständig fließende elektrische Strom ist ein Volumenstrom, d. h. Stromrandgebiete existieren auch außerhalb des Sen sors. Dies provoziert möglicherweise die beobachtete, relativ schnelle und starke Abwehrreaktion des Körpers, die in einer Einkapselung des Sensors besteht.

Das technische Problem, das der Erfindung zugrunde liegt, ist es, ein diskontinuierli ches, elektrochemisches, analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe unter Verwendung eines Sensors vom Typ Enzymelek trode zu finden, bei dem

- der verfälschende Einfluß von interferierenden Substanzen auf das Meßergebnis wesentlich verringert ist,
- an die Elektroden nur kurzzeitig von außen elektrische Potentiale angelegt werden bzw. nur kurzzeitig ein äußerer elektrischer Strom fließt,
- wiederholte Messungen in derselben Probe möglich sind, ohne daß der Enzym elektrodensensor zwischen den Einzelmessungen die Probe regelmäßig verlassen muß,
- das jeweilige Meßergebnis nach kurzer Zeit zur Verfügung steht.

Die Lösung des technischen Problems und damit der Gegenstand der Erfindung ist das im folgenden beschriebene potentiometrische Relaxationsmeßverfahren:

An einer im elektrochemischen Gleichgewicht (es fließt dabei kein äußerer elektrischer Strom, und die inneren elektrischen Austauschströme kompensieren sich paarweise) befindlichen Enzymelektrode wird durch Einprägen eines in Zeitdauer und Höhe de finierten elektrischen Potentialimpulses ein kurzzeitiger, äußerer elektrischer Stromim puls hervorgerufen, der mit einem gewissen "Druck" bzw. "Sog" Elektronen in die Elektrode hinein- bzw. aus ihr heraustransportiert. Die Elektrode geht dadurch in einen Nichtgleichgewichtszustand über. Nach Beendigung dieser Störeinprägung kehrt das Elektrodenpotential selbständig zum Gleichgewichtswert zurück, wobei die Ge schwindigkeit davon abhängt, wie schnell die Umgebung der Elektrode die überschüs sigen Elektronen aufnimmt bzw. die fehlenden Elektronen nachliefert. Die elektro chemisch aktiven Substanzen einer Enzym-katalysierten Reaktion können diese Geschwindigkeit mit beeinflussen. Insgesamt besteht der Potentialzeitverlauf nach der Störeinprägung bis zur Wiedereinstellung des elektrochemischen Gleichgewichts an der Elektrode aus einer Summe von Exponentialverläufen mit verschiedenen Zeitkon stanten, wobei jeder einzelne Exponentialverlauf einem elektrochemischen Prozeß ent spricht. Das erfindungsgemäße analytische Verfahren besteht darin, zu einem geeigneten Zeitpunkt oder Zeitintervall nach Beendigung der Störeinprägung aus dem Wert der Änderungsgeschwindigkeit des potentiometrisch gemessenen Potentialzeit verlaufs den mit dem Analyten korrelierten elektrochemischen Prozeß quantitativ zu erfassen. Durch die Art und Weise der Störeinprägung sowie durch die Wahl des geeigneten Zeitpunktes oder Zeitintervalls der Messung kann der Einfluß interferieren der Substanzen weitgehend reduziert werden.

Das potentiometrische Relaxationsmeßverfahren wird erfindungsgemäß realisiert, in dem man zu einem geeigneten Zeitpunkt oder in einem geeigneten Zeitintervall nach Beendigung der Störeinprägung den Wert der Potentialänderungsgeschwindigkeit po tentiometrisch mißt und ihn in Beziehung setzt zur Analytkonzentration der unter suchten Kalibrierlösung. Aus mehreren derartigen Messungen bei verschiedenen Ana lytkonzentrationen gewinnt man die Kalibrierkurve des Enzymelektrodensensors.

Anstelle des o.a. Wertes der Potentialänderungsgeschwindigkeit zu einem geeigneten Zeitpunkt oder Zeitintervall nach Beendigung der Störeinprägung kann erfindungs gemäß alternativ der Wert des Integrals des o.a. Potentialzeitverlaufs während eines geeigneten Zeitintervalls nach Beendigung der Störeinprägung benutzt werden. Auf diese Weise läßt sich ein einfacher Aufbau mit Operationsverstärkern bewerkstelligen.

Der verfälschende Einfluß interferierender Substanzen kann weiter verringert werden, wenn statt einer einzigen Art von Störeinprägung dem Anspruch 2 entsprechend eine Folge Potentialimpulse unterschiedlicher Höhen, Polaritäten und Zeitdauer angewen det und die Ergebnisse der einzelnen, gemäß Anspruch 1 durchgeführten, potenti ometrischen Relaxationsmessungen rechnerisch kombiniert werden.

Die Messung des Potentials der Enzymelektrode geschieht erfindungsgemäß potenti ometrisch, d. h. in bezug auf eine Referenzelektrode und praktisch ohne äußeren Stromfluß, und zwar mit Hilfe von Feldeffekttransistoren sehr großer Eingangsim pedanz.

Erfindungsgemäß kann der zusätzliche Einbau eines Redoxsystems an die Enzymelek trode vorteilhaft sein. Das Redoxsystem wirkt in gewissem Maße stabilisierend auf das Elektrodenpotential und kann als sogenannter Elektronenakzeptor oder Mediator den Ladungstransfer vom Enzym bzw. von der elektrochemisch aktiven Substanz zur Elek trode beschleunigen. Diesem Vorteil bei in-vitro-Anwendungen steht bei in-vivo-An wendungen der Nachteil entgegen, daß derartige Redoxsysteme giftig sind. Erfin dungsgemäß kann das potentiometrische Relaxationsmeßverfahren sowohl mit als auch ohne zusätzliches Redoxsystem angewendet werden.

Die Fig. 1 zeigt beispielsweise eine Ausführungsform des Meßaufbaus unter Verwen dung von Operationsverstärkern. Die Zahlen haben folgende Bedeutung:

Bezugszeichenliste

1 Meßzelle
2 Arbeitselektrode (Enzymelektrode)
3 Referenzelektrode
4 Gegenelektrode
5 Impedanzwandler
6 Sollspannungsgeber
7 Potentiostat
8 Verstärker
9 Integrator
10 Zeitengeber
11 Schalter für den Spannungsimpuls
12 Schalter für die Integration
13 Schalter zum Rücksetzen des Integrators
14 Bewertungswiderstände
15 Ladekondensator
16 Masseanschluß
17 Ausgang Elektrodenpotential
18 Ausgang Integrator

Die mit der Erfindung nach Anspruch 1, 2 und 3 erzielten Vorteile bestehen insbeson dere darin, daß

- der verfälschende Einfluß von interferierenden Substanzen auf das Meßergebnis wesentlich verringert wird,
- an die Elektroden nur kurzzeitig von außen elektrische Potentiale angelegt werden bzw. nur kurzzeitig ein äußerer elektrischer Strom fließt,
- wiederholte Messungen in derselben Probe möglich sind, ohne daß der Enzym elektrodensensor zwischen den Einzelmessungen die Probe regelmäßig verlassen muß,
- das jeweilige Meßergebnis nach kürzer Zeit zur Verfügung steht.

Das erfindungsgemäße potentiometrische Relaxationsmeßverfahren soll im folgenden an dem Ausführungsbeispiel Messung der Glucosekonzentration einer Probe mit Hilfe einer Enzymelektrode erläutert werden. Das Enzym Glucoseoxidase katalysiert die fol gende Reaktion:

Das erfindungsgemäße potentiometrische Relaxationsmeßverfahren funktioniert sowohl mit Elektronenzufuhr als auch mit Elektronenentzug als Störeinprägung.

Ein Beispiel für die Elektronenzufuhr als Störeinprägung zeigt die Fig. 2. Die Stör einprägung hatte die Dauer von jeweils 0,25 Sekunden und den Potentialwert -0,5 Volt (bezogen auf eine Ag/AgCl-Referenzelektrode). Die Relaxation verläuft um so langsamer, je höher die Glucosekonzentration der Probe ist. Das wird folgendermaßen erklärt: Die überschüssigen Elektronen (e⁻) der Elektrode werden über die Reaktion

O₂+4 H⁺+4e⁻→2H₂O

abgebaut. Diese Reaktion verläuft um so langsamer, je mehr Sauerstoff (O₂) von der vorher genannten Reaktion verbraucht wird, was wiederum von der Glucosekonzen tration abhängt.

Beispielsweise erzeugt die interferierende Substanz Ascorbinsäure bei dem dem Stand der Technik entsprechenden amperometrischen Glucose-Verfahren einen etwa 10fach höheren Meßwert als Glucose selbst (bei jeweils gleicher Konzentration in der Probe), weil bei diesem Verfahren kontinuierlich anodisch oxidiert wird und Ascorbinsäure sehr leicht oxidierbar ist. Bei dem hier dargestellten Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird kurzzeitig kathodisch reduziert, so daß die Interferenz durch Elek tronenabgabe der Ascorbinsäure sehr gering ist.

Ein Beispiel für den Elektronenentzug als Störeinprägung zeigt die Fig. 3. Die En zymelektrode enthielt zusätzlich das Redoxsystem Dimethylferrocen. Die Störein prägung hatte die Dauer von jeweils 1 Sekunde und den Potentialwert +0,2 Volt (bezogen auf eine Ag/AgCl-Referenzelektrode). Die Relaxation verläuft um so schneller, je höher die Glucosekonzentration der Probe ist. Das wird folgendermaßen erklärt: Entsprechend der Stärke der Enzym-katalysierten Reaktion wird am Enzym Wasserstoff produziert, der gemäß der Formel

2H→2H⁺+2e⁻

Elektronen an die Elektrode liefern kann. Den Transport der Elektronen zur Elektrode besorgt im vorliegenden Beispiel vorwiegend der Mediator. Der Einfluß der Sauerstoffkonzentration ist deshalb gering.

Claims

1. Analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analy ten in einer Probe unter Verwendung eines Sensors vom Typ der Enzymelektrode, wobei der Analyt infolge seiner Reaktion mit dem auf dem Sensor vorhandenen Enzym elektrochemisch aktive Substanzen er zeugt oder verbraucht, die durch den Sensor nachweisbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß

a) einer im elektrochemischen Gleichgewicht befindlichen Enzymelek trode mit Hilfe einer potentiostatischen Anordnung ein in Zeit dauer und Höhe definierter elektrischer Potentialimpuls eingeprägt wird, der einen äußeren, kathodischen oder anodischen, elektri schen Stromimpuls erzeugt,
b) man nach Beendigung der in a) genannten Störeinprägung das elek trische Potential der Enzymelektrode selbständig und ungestört zum Wert des elektrochemischen Gleichgewichts zurückkehren läßt,
c) der potentiometrisch gemessene Wert der Potentialänderungsge schwindigkeit des in b) beschriebenen Potentialzeitverlaufs der Enzymelektrode zu einem geeigneten Zeitpunkt oder in einem ge eigneten Zeitintervall nach Beendigung der in a) genannten Störeinprägung ein Maß für die Konzentration des Analyten ist oder
d) der Wert des Integrals des in b) beschriebenen Potenti alzeitverlaufs über ein geeignetes Zeitintervall nach Beendigung der in a) genannten Störeinprägung ein Maß für die Konzentration des Analyten ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verringerung des verfälschenden Einflusses interferierender Substanzen als Störeinprägung eine Folge Potentialimpulse unter schiedlicher Höhen, Polaritäten und Zeitdauern angewendet und die Ergebnisse der einzelnen, gemäß Anspruch 1 durchgeführten, poten tiometrischen Relaxationsmessungen rechnerisch kombiniert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymelektrode vorteilhaft zusätzlich ein Redoxsystem enthält.