KR20060131836A - 바이오센서에 대한 내부 참조물질로서의 산화성 화학종 및이의 사용방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 샘플 중의 물질의 존재 여부 또는 존재량을 측정하기 위한 바이오센서(102) 및 바이오센서(102)의 사용방법을 제공한다. 사용자의 분석 대상 샘플을 수용하기 위한 바이오센서(102)는 분석 대상물과 전기화학 반응하기 위한 혼합물을 포함한다. 당해 혼합물에는 효소, 매개체, 및 내부 참조물질로서의 산화성 화학종이 포함된다.
바이오센서, 화학종, 내부 참조물질, 효소, 매개체, 페로시아나이드, 페리시아나이드, 전기화학
Description
본 발명은 일반적으로 바이오센서에 관한 것이며, 더욱 특히, 샘플 중의 물질의 존재 여부 또는 존재량을 측정하기 위한, 산화성 화학종을 내부 참조물질(internal reference)로서 포함하는 신규한 개선된 바이오센서 및 이의 사용방법에 관한 것이다.
체액 중의 분석 대상물(analyte)의 정량 측정은 특정한 생리학적 이상의 진단 및 관리에 매우 중요하다. 특정 개체에 대해서는, 예를 들면, 락테이트, 콜레스테롤 및 빌리루빈이 모니터링되어야 한다. 특히, 체액 중의 글루코스량을 자주 점검해야 하는 당뇨병 환자에 있어서, 체액 중의 글루코스 측정은 규정식 중의 글루코스 섭취량을 조절하는 수단으로서 매우 중요하다. 하기의 본원의 기재 사항은 글루코스의 측정에 관한 것이지만, 적절한 효소의 선택에 따라, 본 발명의 신규한 개선된 센서 소자 및 이의 사용방법은 다른 분석 대상물의 측정에 사용할 수 있다 는 점이 이해되어야 한다.
체액 중의 분석 대상물의 농도 측정 방법은 분석 대상물, 분석 대상물 특이적 효소, 및 효소를 이의 최초 산화 상태로 유지시키는 매개체 사이의 전기화학 반응을 근거로 할 수 있다. 적합한 산화환원 효소에는 옥시다아제, 데하이드로게나아제, 카탈라아제 및 퍼옥시다아제가 포함된다. 예를 들면, 글루코스가 분석 대상물인 경우, 글루코스 옥시다아제와 산소의 반응은 다음과 같다.
글루코스 + O2 → 글루코노락톤 + H2O2
반응식 A의 제1 단계에서, 시험 샘플에 존재하는 글루코스는 효소(E산화), 예를 들면, 효소의 산화된 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD: flavin adenine dinucleotide) 중심은 이의 환원 형태(E환원), 예를 들면, FADH2로 전환된다. 이들 산화환원 중심은 효소 분자내에서 필수적으로 전기 절연성이기 때문에, 허용되지 않을 정도로 높은 셀 전압의 부재하에 임의의 측정 가능한 수준으로는, 전자가 통상의 전극 표면으로 직접 전달되지 않는다. 당해 시스템의 개선 사항에는, 전자를 FADH2와 전극 사이에서 운반(shuttle)하기 위한, 전극과 효소 사이의 비생리학적 산화환원 커플링을 사용하는 것이 포함된다. 이는 반응식 B로 나타내며, 여기서, 통상적으로 매개체로서 언급되는 산화환원 커플러(redox coupler)는 M으로 표기한다.
GO(FADH2) + 2M산화 → GO(FAD) + 2M환원 + 2H+
2M환원 → 2M산화 + 2e- (전극에서)
위의 반응식 B에서, GO(FAD)는 글루코스 옥시다아제의 산화 형태를 나타내며, GO(FADH2)는 글루코스 옥시다아제의 환원 형태를 나타낸다. 매개 화학종 M산화/M환 원는 전자를 환원 효소로부터 전극으로 운반하여 효소를 산화시키며, 이에 따라 동일 반응계에서의 이의 재생을 발생시킨다.
게스하우(Genshaw) 등에 의해 발행되고 본 발명의 양수인에게 양도된 미국 특허공보 제5,620,579호 및 제5,653,863호에는, 분석 대상물 특이적 효소를 포함하고 보조 전극(counter electrode)에 전기화학적으로 접속된 조성물을 표면에 포함하는 작업 전극(working electrode)의 표면에 유체 시료 샘플을 가하여, 유체 시험 샘플 중의 분석 대상물의 농도를 측정하는 장치 및 방법이 기재되어 있다. 매개체는 분석 대상물과 효소 사이의 반응에 응답(response)하여 환원된다. 산화 전위는 전극들 사이에 인가되어, 매개체의 적어도 일부를 분석 대상물의 농도 측정 전의 당해 매개체의 산화 상태로 되돌려 놓으며, 이에 따라 분석 대상물 측정의 정확도가 증대된다. 최초로 인가된 전위에 따라, 당해 회로는 개방 회로로 스위칭되거나, 전류가 사실상 감소하여 작업 전극에서의 전기화학적 전위 비율이 최소화되는 전위로 스위칭된다. 제2 전위는, 측정되어 분석 대상물 농도를 결정하는 유체 시 험 샘플에서 발생하는 전극과 전류 사이에 인가된다. 임의로, 분석 대상물 측정의 정확도는 알고리즘적으로 추가로 향상된다.
발명의 요약
본 발명의 중요한 측면은, 샘플 중의 물질의 존재 여부 또는 존재량을 측정하기 위한, 산화성 화학종을 내부 참조물질로서 포함하는 신규한 개선된 바이오센서 및 당해 바이오센서의 사용 방법을 제공하는 것이다.
간단하게, 샘플 중의 물질의 존재 여부 또는 존재량을 측정하기 위한 바이오센서 및 당해 바이오센서의 사용 방법이 제공된다. 분석 대상 사용자 샘플을 받기 위한 바이오센서에는, 분석 대상물과의 전기화학 반응을 위한 혼합물이 포함된다. 당해 혼합물에는 효소, 매개체, 및 내부 참조물질로서의 산화성 화학종이 포함된다.
내부 참조물질은 산화성 화학종으로 정의되며, 한 가지 양태에서, 산화환원 전위가 매개체와 동일하거나 더 높은 가역성 산화환원 쌍의 환원 형태로도 정의될 수 있다. 내부 참조물질은 응답 전류(response current)를 동작 전위(operating potential)에 대해 부가적으로 증가시키는 작용을 하며, 글루코스가 분석 대상물인 경우, 총 응답 전류는 다음과 같다.
I내부 참조물질 ∝ (내부 참조물질) 및 I글루코스 ∝ (글루코스)
위의 반응식 C에서, I내부 참조물질은 내부 참조물질로 인한 총 응답 전류분이며, I글 루코스는 글루코스 농도에 비례하는 매개체의 산화로 인한 총 응답 전류분이다.
본 발명의 특성에 따르면, 내부 참조물질은 동일한 매개체 화학종이거나, 산화환원 전위가 매개체보다 큰 산화성 화학종일 수 있다. 따라서, 매개체만을 산화시키고 동작 전위가 낮은 바이오센서에 있어서, 전류 I내부 참조물질은 0일 수 있다. 그러나, 매개체 화학종 및 산화성 화학종 둘 다를 산화시키고 동작 전위가 높은 바이오센서에 있어서, 총 응답 전류는 내부 참조물질로 인한 전류분과 글루코스로 인한 전류분의 합이다. 내부 참조물질 농도는 고정되어 있기 때문에, 센서의 교정 기울기(calibration slope)는 글루코스에 대한 센서 응답에만 의존하며, 절편(intercept)은 내부 참조물질의 부가량에 좌우될 수 있다. 다시 말하면, 내부 참조물질은 절편을 상쇄하기만 하고, 교정 기울기를 변화시키지는 않을 수 있다. 따라서, 내부 참조물질에 관한 개념은 글루코스 바이오센서를 제조하는 새로운 신규한 방법을 제공한다.
위에서 기술한 사항 및 기타의 목적 및 이점을 갖는 본 발명은, 도면으로 예시된 다음과 같은 본 발명의 바람직한 양태의 상세한 설명에 의해 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1A는 본 발명에 따르는 내부 참조물질을 갖는 바이오센서를 포함하는 바이오센서계(biosensor meter)의 계통도이다.
도 1B, 1C 및 1D는 본 발명의 도 1의 바이오센서와 함께 사용하기 위한 동작 방법들을 각각 예시한 것이다.
도 2A, 2B 및 2C는 글루코스 함량 0mg/dL의 전혈 샘플 중에, 본 발명의 도 1의 바이오센서의 내부 참조물질로서 페로시아나이드를 갖는 MLB계 글루코스 바이오센서의 세 가지 순환 전류전압 그래프(cyclic voltammogram)이다.
도 3은 전위를 동작시키는 상이한 전압에서의, 본 발명의 도 1의 바이오센서의 선형 응답을 예시한 그래프이다.
도 4는 인쇄된 10% 페리시아나이드를 보조 전극으로서 갖는 본 발명의 도 1의 바이오센서를 사용하여 나타낸, 전체 전류전압법의 전류(voltammetric current)에 대한 부가된 내부 참조물질의 효과를 예시한 그래프이다.
도 5A 및 5B는 보조 전극으로서 Ag/AgCl을 갖는 본 발명의 도 1의 MLB계 바이오센서의 내부 참조물질의 증가에 따르는 선형 응답 및 증가된 절편을 예시한 그래프이다.
도 6A 및 6B는 10% 페리시아나이드를 보조 전극으로서 갖는 본 발명의 도 1의 MLB계 바이오센서의 내부 참조물질의 증가에 따르는 선형 응답 및 증가된 절편을 예시한 그래프이다.
도 7은 10% 페리시아나이드를 보조 전극으로서 갖는 본 발명의 도 1의 DEX 바이오센서의 내부 참조물질의 증가에 따르는 교정 절편(calibration intercept)의 선형 관계를 예시한 그래프이다.
도 8A 및 8B는 본 발명의 도 1의 바이오센서의 20% 페리시아나이드의 시약 혼합물에 부가된, 0.1% 페로시아나이드를 갖는 시약 잉크 및 대조군 시약 잉크로부터의 잔류하는 페로시아나이드를 유동 주입 분석(FIA: flow-injection-analysis)하여 수득한, 신호 대 참조물질의 비를 예시한 그래프이다.
본 발명은 샘플 중의 물질의 존재 여부 또는 존재량을 측정하기 위한 전기화학 바이오센서에 관한 것이다. 당해 바이오센서에는 작업 전극 및 보조 전극을 포함하는 센서 스트립(sensor strip)이 포함되며, 작업 전극 및 보조 전극은 각각 적어도 부분적으로, 예를 들면, 개별적인 시약층으로 차폐된다. 작업 전극 위의 시약층에는, 예를 들면, 분석 대상물과 산화-환원 반응을 통해 상호작용하는 효소; 및 산화환원 쌍의 산화된 형태인 매개체가 포함된다. 본 발명의 바이오센서에는 작업 전극 위의 시약층 중의 내부 참조물질 또는 환원 형태의 매개체가 포함된다. 내부 참조물질은 산화성 화학종으로 정의되며, 한 가지 양태에서, 산화환원 전위가 매개체와 동일하거나 더 높은 가역성 산화환원 쌍의 환원 형태로 추가로 정의될 수 있다. 고정된 양의 내부 참조물질이 시약층에 제공된다. 내부 참조물질 또는 부가량의 환원 형태의 매개체를 포함하는 본 발명의 바이오센서는, 내부 참조물질이, 교정 기울기를 유지시키면서, 동력학적 특성에 의해 교정 절편을 고정시키는 작용을 하는 것에 대한 개선 사항을 제공한다.
환원된 효소로부터의 전자 수용력 및 전자의 전극으로의 운반력으로 인하여, 다수의 화합물이 매개체로서 유용하다. 매개체에 필요한 성질은, 센서를 사용하기 전에 전극 표면에 존재하는 조건하에 산화 상태에 남아있는 능력이다. 더욱 바람직한 매개체들 중에는, 유기금속성 화합물, 유기 분자, 전이 금속 배위 착체의 산화 형태가 있다. 매개체의 특정한 예에는 페리시아나이드로도 알려진 페로시안화칼륨(III)가 있다
하기의 본원 명세서 및 청구의 범위에서 사용한 바와 같이, "바이오센서"는 적절한 샘플의 분석 대상물에 대해 선택적으로 응답하고 이들의 농도를 전기적 신호로 전환시키는 분석 장치 또는 장비의 전기화학 센서 스트립 또는 센서 소자를 의미한다. 바이오센서는 전기 신호를 직접 발생시켜, 단순한 장비 디자인이 가능하다. 또한, 바이오센서는 재료 비용이 적게 든다는 이점을 제공하는데, 그 이유는 화학물질로 이루어진 박층이 전극 위에 증착되어 재료가 거의 낭비되지 않기 때문이다.
"샘플"은 알려지지 않은 양의 중요한 분석 대상물을 함유하는 조성물로 정의된다. 통상적으로, 전기화학 분석용 샘플은 액체 형태이며, 바람직하게는 샘플은 수성 혼합물이다. 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들면, 혈액, 소변 또는 타액일 수 있다. 샘플은 생물학적 샘플의 유도체, 예를 들면, 추출물, 희석물, 여액 또는 가공 침전물일 수 있다.
"분석 대상물(analyte)"은 샘플 중의 존재 여부 또는 존재량을 측정해야 하는 물질로 정의된다. 분석 대상물은 분석 과정에서 존재하는 산화환원 효소(oxidoreductase)와 상호작용하며, 산화환원 효소, 조효소, 또는 산화환원 효소와 이의 기질 사이의 상호작용을 일으키는 또 다른 물질에 대한 기질일 수 있다.
"산화환원 효소(oxidoreductase)"는 기질의 산화 또는 환원을 용이하게 하는 임의의 효소로 정의된다. 산화환원 효소에는, 분자 산소가 전자 수용체인 산화 반응을 용이하게 하는 옥시다아제(oxidase); 분석 대상물이 환원되고 분자 산소가 분석 대상물이 아닌 환원 반응을 용이하게 하는 리덕타아제(reductases); 및 분자 산소가 전자 수용체가 아닌 산화 반응을 용이하게 하는 데하이드로게나아제(dehydrogenase)가 포함된다. 예를 들면, 문헌[참조: Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology , Revised Edition, A.D. Smith, Ed., New York: Oxford University Press (1997) pp. 161, 476, 477, and 560]을 참조한다.
"산화 환원 반응(oxidation-reduction reaction)"은 하나 이상의 전자를 하나의 화학종으로부터 또 다른 화학종으로 전달하는 것을 포함하는, 두 가지 화학종 사이의 화학 반응으로 정의된다. 이러한 유형의 반응은 "redox" 반응이라고도 한다. 당해 반응의 산화 단계는 화학종들 중의 하나에 의해 하나 이상의 전자가 손실되는 것을 포함하며, 환원 단계는 나머지 화학종에 의해 하나 이상의 전자가 부가되는 것을 포함한다. 산화되는 화학종의 이온 전하는 전달되는 전자의 개수와 동일한 양으로 더욱 양성(positive)으로 된다. 마찬가지로, 환원되는 화학종의 이온 전하는 전달되는 전자의 개수와 동일한 양으로 덜 양성으로 된다.
"산화수"는 화학종, 예를 들면, 원자의 형식 이온 전하로 정의된다. (III)과 같이 산화수가 높으면 더욱 양성이고, (II)와 같이 산화수가 낮으면 덜 양성이다. 중성 화학종은 이온 전하가 0이다. 화학종의 산화에 의해 화학종의 산화수가 증가하며, 화학종의 환원에 의해 화학종의 산화수가 감소한다.
"산화환원 쌍(redox pair)"은 정의된다. 산화수가 상이한 화학 물질로 이루어진 두 가지 화학종으로 정의된다. 산화수가 더 높은 화학종의 환원에 의해 산화수가 더 낮은 화학종이 생성된다. 또한, 산화수가 더 낮은 화학종의 산화에 의해 산화수가 더 높은 화학종이 생성된다.
"산화성 화학종(oxidizable species)"은 산화수가 더 낮기 때문에 산화수가 더 높은 화학종으로 산화될 수 있는 산화환원 쌍의 화학종으로 정의된다. 마찬가지로, "환원성 화학종(reducible species)"은 산화수가 더 높기 때문에 산화수가 더 낮은 화학종으로 환원될 수 있는 산화환원 쌍의 화학종으로 정의된다.
OTM 착체(organotransition metal complex)라고도 하는 "유기전이 금속 착체"는 전이 금속이 시그마 결합(전이 금속에 시그마 결합된 탄소 원자의 형식 전하: -1) 또는 파이 결합(전이 금속에 파이 결합된 탄소 원자의 형식 전하: 0)을 통해 하나 이상의 탄소에 결합되어 있는 착체로 정의된다. 예를 들면, 페로센은, 이의 5개의 탄소 원자를 통해, 2개의 파이 결합 및 1개의 시그마 결합에 의해 철 중심에 각각 결합된 사이클로펜타디에닐(Cp) 환을 2개 포함하는 OTM 착체이다. OTM 착체의 또 다른 예는 페리시아나이드(III) 및 이의 환원된 페로시아나이드(II) 데응물(counterpart)이며, 6개의 시아노 리간드(6개의 리간드 각각의 형식 전하: -1)는 시아노 그룹의 탄소 원자를 통해 철 중심에 시그마 결합된다.
"배위 착물"은 잘 규정된 배위 기하구조, 예를 들면, 8면체 또는 4면체 평면 기하구조를 갖는 착물로 정의된다. 결합에 의해 정의되는 OTM 착체와는 달리, 배위 착체는 이의 기하구조에 의해 정의된다. 따라서, 배위 착체는 OTM 착체(예를 들면, 위에서 언급한 페리시아나이드)이거나, 탄소 이외의 비금속 원소, 예를 들면, 질소, 황, 산소 및 인을 포함하는 헤테로원소가 전이 금속 중심에 일시적으로(datively) 결합되어 있는 착체일 수 있다. 예를 들면, 루테늄 헥사아민 또는 헥사아미노루테네이트(hexaaminoruthenate)(II)/(III)은 잘 규정된 8면체 기하구조를 갖는 배위 착체이며, 여기서, 6개의 NH3 리간드(6개 리간드 각각의 형식 전하: 0) 루테늄 중심에 여격으로 결합되어 있다. 또한, 페리시아나이드는 8면체 기하구조를 갖는 배위 착물의 예이다. 유기전이 금속 착체, 배위 착체 및 전이 금속 결합에 관한 더욱 완전한 논의는 문헌[참조: Collman et al., Principles and Applications of Organotransition Metal Chemistry (1987) and Miessler & Tarr, Inorganic Chemistry (1991)]에서 찾을 수 있다.
"매개체(mediator)"는 산화 또는 환원될 수 있으며 제1 물질 및 제2 물질 사이에 하나 이상의 전자를 전달할 수 있는 물질로 정의된다. 매개체는 전기화학 분석의 시약이며, 중요한 분석 대상은 아니다. 단순화된 시스템에서, 매개체는, 적절한 물질과의 접촉을 통해서 산화환원 효소가 환원 또는 산화된 후에, 산화환원 효소와 산화환원 반응한다. 이어서, 산화 또는 환원된 매개체는 전극에서 반대 반응(opposite reaction)하여 이의 본래 산화수로 복귀된다.
"전기활성 유기 분자"는 금속을 함유하지 않으며 산화 또는 환원 반응할 수 있는 유기 분자로 정의된다. 전기활성 유기 분자는 산화환원 화학종 및 매개체로서 거동할 수 있다. 전기활성 유기 분자의 예에는 조효소 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ: pyrroloquinoline quinone), 벤조퀴논 및 나프토퀴논, N-옥사이드, 니트로소 화합물, 하이드록실아민, 옥심, 플라빈, 페나진, 페노티아진, 인도페놀 및 인다민이 포함된다.
"전극"은 전기화학 분석 동안 고정되어 있는 전기 절연 물질로 정의된다. 전극 물질의 예에는 고형 금속, 금속 페이스트, 전도성 탄소, 전도성 탄소 페이스트 및 전도성 중합체가 포함된다.
도면을 참조하면, 도 1에는 본 발명의 기재사항에 따라 배열된 바람직한 양태의 바이오센서계(100)가 예시되어 있다. 바이오센서계(100)는 본 발명의 기재사항에 따라 배열된 바이오센서(102)를 포함한다. 바이오센서계(100)는 프로그램 및 사용자 데이터 저장을 위한 연관된 메모리(106)를 갖는 마이크로프로세서(104)를 포함한다. 마이크로프로세서(104)로부터의 디지털 데이터는 디지털 →아날로그(digital-to-analog(D/A)) 변환기(108)에 전달된다. D/A 변환기(108)는 디지털 데이터를 아날로그 신호로 변환시킨다. D/A 변환기(108)에 연결된 증폭기(110)는 아날로그 신호를 증폭시킨다. 증폭기(110)로부터의 증폭된 아날로그 출력 신호는 본 발명의 바이오센서(102)로 전달된다. 바이오센서(102)는 증폭기(112)에 연결된다. 탐지된 증폭 신호는 증폭된 아날로그 센서 신호를 디지털 신호로 변환시키는 아날로그 →디지털(A/D) 변환기(114)로 전달된다. 디지털 신호는 마이크로프로세서(104)로 전달된다.
가장 널리 시판중인 혈액 글루코스 모니터링용 1회용 바이오센서는 효소와 매개체의 혼합물을 몇 가지 결합제와 함께 증착/인쇄하는 것이 요구된다. 글르쿠스 측정을 적용하기 위해, 매개체는 산화환원 쌍의 산화된 형태이다. 산화환원 쌍에 따라, 매개체는 매우 강한 산화제, 예를 들면, 페리시아나이드일 수 있으며, 이에 따라, 효소 및 결합제와 혼합한 후에 관능성 그룹을 화학적으로 산화시킨다. 후속적으로, 소량의 환원된 매개체는 잉크 혼합, 저장 및 인쇄의 공정에서 시약 중의 불순물로서 형성된다. 따라서, 시약 잉크의 혼합 및 인쇄 결과 환원 형태의 산화환원 쌍이 생성되며, 바탕 전류(background current)가 발생한다. 환원 형태의 매개체 및 이에 따르는 바탕 전류의 생성은 배치(batch)로부터 배치로 가변적일 수 있다. 이와 같은 프로세스-생성된 환원 형태의 매개체, 예를 들면, 페리시아나이드로부터의 페로시아나이드는 일반적으로 산화되어, 게스하우(Genshaw) 등에 의해 발행되고 본 발명의 양수인에게 양도된 미국 특허공보 제5,620,579호 및 제5,653,863호에 기재된 알고리즘을 사용하여 바탕 신호를 최소화시킬 수 있다. 그러나, 교정 절편으로 변형된 프로세스-의존성 바탕 신호는 절편 값의 범위에서 유포될 수 있다. 이들 절편의 발산 값(diverged value)의 외항(extreme)에서, 타당한 교정 절편이 발산 값에 순응하게 될 수 없기 때문에, 분석 정확도가 떨어질 것이다.
본 발명의 특성에 따르면, 특정량의 환원 형태의 매개체를 시약에 함유한 매개체의 등급은 강산화제의 효과를 감소시키기 위해 사용된다. 열역학적으로, 효소와 매개체의 잉크 혼합물 중에 환원 형태의 매개체가 소량 존재함으로써, 산화 형태로부터 환원 형태로 변환시키는 구동력이 감소한다. 이는, 환원 형태의 매개체 산화된 매개체에 정해진 소량으로 가함으로써 유리하게 달성된다.
바탕 신호가 발생하지만, 미국 특허공보 제5,620,579호 및 제5,653,863호에 기재되어 있는 알고리즘은 바탕 신호를 최소화시키는 역할을 하여 글루코스 센서의 정확도를 증가시킨다. 상기한 특허공보에는, 특정 분석 대상물, 예를 들면, 혈중 글루코스의 측정에 사용되는 젼류 측정 센서(amperometric sensor)에서의 산화성 불순물로 인한 바탕 바이어스(background bias)를 감소시키는 방법이 기재되어 있다. 환원된 매개체; 또는 센서에 존재하는 다른 환원된 불순물(효소 안정제, 예를 들면, 글루타메이트); 및 환원 등가물을 갖는 표면활성제의 존재량이 증가하여, 장기간에 걸쳐 또는 응력(열, 수분 등)하에 저장되는 경우, 당해 센서의 바탕 전류는 증가할 것이다. 예를 들면, 페리시아나이드계 전류 측정 센서에서, 바탕 바이어스는 전극 표면 근방의 페로시아나이드(페리시아나이드의 환원에 의해 생성됨)의 존재에 관련된다. 이와 같은 축적된 페로시아나이드는, 센서의 사용 동안 제조된 페로시아나이드(새로운 페로시아나이드)와는 반대로, 페리시아나이드로 다시 산화되어, 발생하는 바탕 바이어스를 환원시키며, 이에 따라 센서의 저장 수명이 증가한다. 당해 목적을 달성하기 위해, 당해 방법은 전기화학적으로 접근한다. 전기화학적 접근이 알고리즘적 보정으로 확대되는 경우, 바탕 바이어스는 추가로 환원된다.
기재된 방법은, 바이오센서의 사용 동안 정상 전위(normal potential) 프로파일을 우선시하는 양전위 펄스("번 오프 펄스(burn-off pulse)")를 우선 가하는 것을 포함한다. 통상적으로, 이는 0.1 내지 0.9V(바람직하게는 0.3 내지 0.7V)의 양전위를 센서의 작업 전극과 사이에 1 내지 15초(바람직하게는 5 내지 10초) 동안 가하여 달성된다. 번 오프 펄스는 초기 페로시아나이드 (또는 다른 산화성 불순물)를 산화시켜, 센서는 깨끗한 바탕(background)으로 시험을 개시할 수 있다. 통상적으로, 일부의 산화성 불순물만이 번 오프 펄스에 의해 산화되기 때문에, 바탕은 완전하게 깨끗하지는 않다. 화학적 층이 작업 전극 및 보조 전극 둘 다를 차폐하고 있기 때문인 경우이다. 페로시아나이드는 페리시아나이드로부터 생성된 것이기 때문에, 최초의 페로시아나이드는 화학적 층에 존재한다. 샘플 유체를 가하고 화학적 층이 재수화되는 경우, 작업 전극 근방의 페로시아나이드는 재산화된다. 나머지 페로시아나이드는 샘플 유체 속으로 확산되어 글루코스와 혼합된다. 최초의 페로시아나이드 일부는 글루코스에 영향을 주지 않으면서 재산화된다. 시험용 샘플 유체를 가한 후에, 최초의 페로시아나이드는 단시간(수 초) 동안 전극 가까이에 존재한다. 그 이유는, 화학 물질(효소 및 페리시아나이드 등)이 작업 전극 및 보조 전극 위에 박막으로 증착되기 때문이다. 대부분이 전극과 직접 접촉하지 않는 시험용 유체 샘플 중의 분석 대상물 농도가 현저하게 감소하지 않고도 최초의 페로시아나이드를 충분한 양으로 번 오프할 수 있기 때문에, 번 오프 기술이 유리하다. 번 오프 펄스를 적절하게 가하면, 응력이 가해진 센서의 바탕 바이어스가 40% 감소한다는 것이 실험적으로 입증되었다.
유리하게는, 미국 특허공보 제5,620,579호 및 제5,653,863호의 기재되어 있는 방법을 적용하여, 바탕 신호가 바람직한 양태의 글루코스 바이오센서계(100)의 정확도를 증가시키는 효과는 최소화시킨다. 위에서 언급한 특허공보의 내용이 본원에 참조로 혼입된다.
본 발명의 특성에 따르면, 부가량의 환원 형태의 매개체는 교정 기울기를 유지시키면서 동력학적 특성에 의해 교정 절편을 고정시키는 역할을 한다. 글루코스 센서에서 작동하는 환원 형태의 매개체, 예를 들면, 페로시아나이드에 따라, 이는 내부 참조물질라고 하기도 한다.
전기활성 유기 분자 매개체의 예가, 1996년 5월 28일에 블로크즌스키(Bloczynski) 등에 의해 발행되고 본 발명의 양수인에게 양도된 미국 특허공보 제5,520,786호에 기재되어 있다. 특히, 3-페닐이미노-3H-페노티아진을 포함하며 본원에서 MLB-92라고도 하는 L기재된 매개체(표 1의 화합물 18)는 본 발명의 특성에 따르는 글루코스 바이오센서(102)의 제조에 사용되었다. 위에서 언급한 특허공보의 내용이 본원에 참조로 혼입된다.
시판중인 바이오센서계 및 바이오센서는 바이엘 코포레이션(Bayer Corporation)에서 상표명 아센시아 DEX(Ascensia DEX)로 제조하여 판매하고 있다. 일반적으로, 아센시아 DEX 바이오센서는 되도록 순수한 형태의 페리시아나이드를 시약용으로 포함한다. 아센시아 DEX 바이오센서는 페로시아나이드 적정량을 순수 페리시아나이드에 가하여 본 발명의 특성에 따르는 글루코스 바이오센서(102)를 제조하는 데 사용되고 있다. 바이오센서(102)의 내부 참조물질을 규정짓는 페로시아나이드를 아센시아 DEX 시약 잉크에 가하는 것의 이점에는, 기울기의 변화없이 절편이 증가하고, 절편 범위가 고정되며, 저장 동안 바이오센서의 장기간 안정성이 증가한다는 즉각적인 이점이 포함된다.
본 발명의 특성에 따르면, 산화환원 전위가 낮은 MLB-92 매개체가 특별한 성질을 갖는 글루코스 바이오센서(102)의 제조에 사용되었다. 내부 참조물질, 페로시아나이드를 적정량 가하면서, 신규한 바이오센서 시스템이 두 가지 동작 전위, 즉 400mV(이 경우, 신규한 매개체 및 내부 참조물질 둘 다가 산화된다)(1) 및 100mV(이 경우, 매개체만 산화된다)(2)에서 작동하도록 할 수 있다. 이러한 접근 법의 의의는 두 가지이다. 첫 번째로, 이와 같이 조성된 글루코스 바이오센서(102)(신규한 매개체 및 내부 참조물질)는 높은 전위(+ 400mV)에서 작동하여, 존재하는 장비의 하드웨어 요구사항의 교정 특성에 부합하는 범위내에서 전류가 발생할 수 있다. 두 번째로, 더 낮은 산화환원 전위 및 이에 따르는 더 낮은 매개체의 산화력에 의해 산화된 형태가 환원 형태의 매개체로 변환될 가능성은 사실상 없기 때문에, 더 낮은 동작 전위(0 내지 100mV)를 센서에 가하여 내부 참조물질의 산화를 막을 수 있다. 따라서, 산화력이 낮기 때문에 절편이 거의 0일 수 있는, 신규한 매개체를 기본으로 하는 새로운 형태의 교정 특성에 의해, 글루코스를 보다 양호하게 분석적으로 정확하게 측정할 수 있다. 또한, 요산 및 아세트아미노펜과 같은 몇 가지 알려진 산화성 화학종의 산화를 방지함으로써, 전혈 중의 매트릭스 간섭이 감소한다.
본 발명의 특성에 따르면, 글루코스 센서(102)에 대한 내부 참조물질의 또 다른 용도는, 바이오센서 시스템에 내부 참조물질을 상당히 다량으로 가하여 고전류 응답을 생성시키는 것이다. 사이에 개방 회로를 갖는 이중 단계 알고리즘을 사용하여[참조: 바이엘 특허공보 제5,620,579호 및 제5,653,863호], 제1 전위 단계는 400mV로 설정되어 대부분 내부 참조물질 신호로 인한 전류가 생성되며, 제2 단계는 낮은 전위(0 내지 100mV)로 설정되어 글루코스 농도에 대한 전류 신호만이 생성된다. 낮은 전위에서의 제1 신호(당해 신호는 전혈 적혈구 용적률(hematocrit)에 대해 사실상 독립적이여야 함) 대 제2 신호의 비는, 적혈구 용적률 효과(hematocrit effect)로 인한 분석학적 바이어스에 대해 보정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 특성에 따르면, 내부 참조물질은 산화성 화학종으로 정의되며, 한 가지 양태에서, 산화환원 전위가 매개체와 동일하거나 더 높은 가역성 산화환원 쌍의 환원 형태로도 정의될 수 있다. 내부 참조물질의 개념 및 용도는 분석 화학 분야에서 매우 일반적이다. 그러나, 내부 참조물질을 바이오센서용으로 사용하는 예는 특허 및 문헌에서 현재 논의되지 않고 있다. 위에서 언급된 세 가지 용도에서, 내부 참조물질은 두 가지 화학종을 산화시키는 동작 전위에 대한 응답 전류를 부가적으로 증가시키는 작용을 하며, 분석 대상물로서 글루코스를 갖는 경우, 총 응답 전류는 다음과 같다.
반응식 C
I전체 = I내부 참조물질 + I글루코스
I내부 참조물질 ∝ (내부 참조물질) 및 I글루코스 ∝ (글루코스)
위의 반응식 C에서, I내부 참조물질은 내부 참조물질로 인한 총 응답 전류분이며, I글 루코스는 글루코스 농도에 비례하는 매개체의 산화로 인한 총 응답 전류분이다.
본 발명의 특성에 따르면, 내부 참조물질은 동일한 매개체 화학종이거나, 산화환원 전위가 매개체보다 큰 산화성 화학종일 수 있다. 따라서, 매개체만을 산화시키고 동작 전위가 낮은 바이오센서에 있어서, 전류 I내부 참조물질은 0일 수 있다. 그러나, 매개체 화학종 및 산화성 화학종 둘 다를 산화시키고 동작 전위가 높은 바이오센서에 있어서, 총 응답 전류는 내부 참조물질로 인한 전류분과 글루코스로 인한 전류분의 합이다. 내부 참조물질 농도는 고정되어 있기 때문에, 센서의 교정 기울기는 글루코스에 대한 센서 응답에만 의존하며, 절편은 내부 참조물질의 부가량에 좌우될 수 있다. 다시 말하면, 내부 참조물질은 절편을 상쇄하기만 하고, 교정 기울기를 변화시키지는 않을 수 있다 따라서, 내부 참조물질에 관한 개념은 글루코스 바이오센서를 제조하는 새로운 신규한 방법을 제공한다.
도 1B, 1C 및 1D를 참조하면, 본 발명의 글루코스 바이오센서(102)용으로 내부 참조물질을 사용한다는 것을 기본으로 하는적어도 세 가지 동작 모드이 존재한다. 정전위적으로, 동작 모드들 중의 세 가지가 도 1B, 1C 및 1D이다. 예시된 동작 모드에는 각각 번 오프 펄스(burnoff pluse)(1), 이어지는 대기 기간 또는 개방 회로(2) 및 리드 펄스(read pulse)(3)가 포함되며, 각각의 펄스 또는 기간은 선택된 기간, 예를 들면, 10초를 갖는다. 기본적이고 가장 즉각적인 동작에서, 페로시아나이드는 전체 페리시아나이드의 0.1 내지 1%로 되는 농도로 페리시아나이드 중에 보유되며, 페리시아나이드는 본 발명의 글루코스 바이오센서(102)용의 내부 참조물질을 제공한다. 이는 도 1B에 도시되어 있으며, 여기서 제1 기간 및 제3 기간의 전위 둘 다가 동일한 전압, 예를 들면, 400mV이다. 내부 참조물질을 규정하는 페로시아나이드가 적은 백분률로 존재하는 것은, 페리시아나이드의 적절한 정제 공정에 의해 또는 페로시아나이드를 순수한 페리시아나이드에 적정량 가하여 달성될 수 있다. 이들 보유 공정의 결과는, 특별한 등급으로서의 페리시아나이드로서의 페리시아나이드 중에 페로시아나이드를 목적하는 양으로 주의하여 유지시키는 것이다. 이는, 페로시아나이드에 대해 페리시아나이드를 되도록 순수한 형태로 갖는 통상의 알려진 바와는 대조적이며, 예를 들면, DEX 시약, 일반적으로 페로시아나이드는 페리시아나이드의 0.05% 이하가 불순물이다. 가장 바람직한 양은 DEX 센서용의 최종 조성물 중의 0.1% 페로시아나이드이며, 이에 따라 DEX 센서에 대한 교정 기울기를 유지하면서 교정 절편이 더욱 좁은 범위로 고정될 수 있다.
도 1C은 제2 동작 모드를 나타낸 도면이며, 페로시아나이드(내부 참조물질)를, 산화환원 전위가 내부 참조물질보다 낮은 매개체와 효소의 시약 혼합물에 목적하는 양으로 가한다. 기존 장비 및 신규한 하드웨어 요구사항을 갖는 장비에 대해, 바이오센서(102)는 고전위 및 저전위(예를 들면, Ag/AgCl에 대해 400mV 및 100mV)에서 동작할 것으로 예상된다. 당해 바이오센서는 기존 장비(100)에 대한 전위 프로그램(도 1B) 및 신규한 장비(100)에 대한 전위 프로그램(도 1C)에서 동작할 수 있다. 매개체 및 내부 참조물질 조합의 예에는 MLB-92 및 페로시아나이드 뿐만 아니라 루테늄 헥사아민 및 페로시아나이드의 시스템이 포함된다. 두 가지 산화환원 전위는 충분히 분리되어, 저전압에서 동작하는 경우, 일반적으로는 내부 참조물질 화학종의 산화가 발생하지 않는다.
도 1D는 세 번째 동작 모드를 나타낸 도면이며, 농도가 더 높은 목적하는 농도의 페로시아나이드를, 산화환원 전위가 내부 참조물질보다 낮은 매개체와 효소의 시약 혼합물에 목적하는 양으로 가한다. 바람직하게는, 내부 참조물질의 양은 교정 범위 중의 전체 눈금(full scale)의 약 50 내지 75%에 상응하는 전류를 생성시킬 수 있다. 동작 알고리즘에서, 제1 전위 단계는 매개체와 내부 참조물질 둘 다를 산화시키도록 설정되며(400mV), 리드 펄스를 위한 제2 전위 단계는 매개체만을 산화시킨다(0 내지 100mV). 도 1D의 제1 전위의 전류는 내부 참조물질에 가장 적절할 것이며, 내부 참조물질은 전극의 바로 뒤에 존재하며 적혈구 용적률 효과가 사실상 부재해야 한다. 제1 단계의 전류에 대한 제2 단계의 전류의 비는, 적혈구 용적률 효과로 인한 분석학적 바이어스에 대한 보정을 제공할 것이다.
실험을 수행하여, 내부 참조물질을 매개체 시스템에 가하여, 존재하는 문제들을 해결하거나 본 발명의 바이오센서(102)에 따르는 센서 성능을 향상시키는 방법의 실행 가능성을 보여줬다.
도 2A, 2B 및 2C에는, 본 발명의 바이오센서(102)의 동작을 예시하는 세 가지 순환 전류전압 그래프가 도시되어 있다. 예시된 세 가지 순환 전류전압 그래프는, 글루코스 0mg/dL의 전혈 샘플 중에 페로시아나이드를 내부 참조물질로서 갖는 MLB계 글루코스 바이오센서(102)에 대한 것이다.
도 2A는 작업 전극 대 페리시아나이드 보조 전극을 예시하고, 도 2B는 작업 전극 대 은(Ag) 및 염화은(AgCl) 또는 Ag/AgCl 보조 전극을 예시하며, 도 2C는 작업 전극 대 MLB-92 보조 전극을 예시한다. 피크(1)과 피크(2)는 매개체 MLB환원(환원 형태의 MLB)의 산화를 나타낸 것이며, 내부 참조물질 페로시아나이드는 각각 세 가지 전류전압 그래프 모두에 대한 것이다. 보조 전극 위의 산화환원 쌍이 페리시아나이드로부터 Ag/AgCl로 MLB-92로 변함에 따라, MLB환원에 대한 산화 피크는 전위 눈금을 따라 이동한다. 그러나, 내부 참조물질 페로시아나이드에 대한 매개체 MLB-92의 상대 위치는 도 2A, 2B 및 2C의 전류전압 그래프에서 동일한 것을 알 수 있다.
도 3을 참조하면, 도 3은 전위를 동작시키는 상이한 전압에서의 본 발명의 바이오센서(102)의 선형 응답을 예시한다. 바이오센서(102)는 400mV의 전위(1) 및 150mV의 전위(2)에서 동작한다. 도 3은 20mM 페로시아나이드를 내부 참조물질로서 갖는 MLB-92 매개체를 기본으로 하는 바이오센서(102)의 선형 응답을 예시한다. 실시예 1과 실시예 2로 라벨링한 라인은 Ag/AgCl 보조 전극에 대한 동작 전위 400mV 및 150mV로부터 도시된 것이다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 바이오센서(102)는 거의 동일한 기울기를 제공하지만, 전위 400mV 및 150mV에서의 동작에 대한 절편은 상이하다. 이러한 결과는 내부 참조물질이 선택적으로 산화되거나 동작 전위에 의해 방지될 수 있다는 점을 입증한다. 따라서, 하나의 바이오센서(102)는 2개의 상이한 계측기(meter)를 제공할 수 있다.
바이오센서(102)의 예는 시스템적으로 제조되었으며, 기울기가 거의 변하지 않으면서, 내부 참조물질로서의 페로시아나이드가 증가함에 따라 절편이 증가함을 보여준다. 이들 3개 시약은, 보조 전극으로서의 Ag/AgCl(1) 및 보조 전극으로서의 10% 인쇄된 페리시아나이드(2)로, 두 가지 센서 위에 핀 증착(pin-depositing)된다.
도 4는 인쇄된 10% 페리시아나이드를 보조 전극으로서 갖는 본 발명의 바이오센서(102)를 사용하여 나타낸, 전체 전류전압법의 전류에 대한 부가된 내부 참조물질의 효과를 예시한다. 도 4는 글루코스 0mg/L를 갖는 전혈 샘플 중에 내부 참조물질로서 페로시아나이드를 갖는 센서의 순환 전류전압 그래프를 제공한다. A, B 및 C로 라벨링한 전류전압 그래프는 각각 인쇄된 10% 페리시아나이드를 보조 전극으로서 갖는 조성물 1, 2 및 3에 관한 것이다.
전체 전류전압법의 전류에 대한 부가된 내부 참조물질의 효과를, 인쇄된 10% 페리시아나이드를 보조 전극으로서 갖는 센서를 사용하여 도 4에 나타냈다. 주요 산화/환원 피크의 중심은 10% 페리시아나이드에 대하여 약 -0.38V이며, 이는 매개체 MLB로 인한 것이다. 약 0 내지 50mV에서의 산화 피크는 페로시아나이드의 내부 참조물질로 인한 것이다. 내부 참조물질 농도가 0mM에서부터 4 내지 8mM로 증가함에 따라 내부 참조물질 페로시아나이드에 대한 산화 피크가 증가하는 한편, 매개체에 대한 산화 피크는 거의 변하지 않는다. 본원에서, 내부 참조물질의 개념은 MLB환원의 주요 산화 피크가 내부 참조물질의 존재에 영향을 받지 않는다는 사실에 의해 추가로 설명된다.
도 5A 및 5B는 보조 전극으로서 Ag/AgCl을 갖는 본 발명의 MLB계 바이오센서(102)의 내부 참조물질의 증가에 따르는 선형 응답 및 증가된 절편을 예시한다. 도 5A는 0mM, 4mM 및 8mM 페로시아나이드를 갖는 MLB계 바이오센서(102)의 선형 용량 응답(linear dose response)을 예시한 것이며, 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3으로 각각 라벨링되어 있다. 도 5B는 절편 및 기울기를 본 발명의 바이오센서(102)의 작업 전극 시약에 부가된 페로시아나이드의 함수로서 예시한다. 이들 3개 센서에는 모두 보조 전극으로서 Ag/AgCl이 사용되었다.
또한, 도 6A 및 6B는 10% 페리시아나이드를 보조 전극으로서 갖는 본 발명의 MLB계 바이오센서(102)의 내부 참조물질의 증가에 따르는 선형 응답 및 증가된 절편을 예시한다. 도 6A는 0mM, 4mM 및 8mM 페로시아나이드를 갖는 MLB계 바이오센서(102)의 선형 용량 응답을 예시한 것이며, 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3으로 각각 라벨링되어 있다. 도 6B는 절편 및 기울기를 본 발명의 바이오센서(102)의 작업 전극 시약에 부가된 페로시아나이드의 함수로서 예시한다. 이들 3개 센서에는 모두 보조 전극으로서 10% 인쇄된 페리시아나이드가 사용되었다.
용량 응답 실험에서, Ag/AgCl 보조 전극을 갖는 센서(도 5A 및 5B) 및 10% 페리시아나이드 보조 전극을 갖는 센서(도 6A 및 6B)는 둘 다 내부 참조물질의 증가에 따르는 선형 응답 및 증가된 절편을 보여준다. 실제 목적을 위해, 도 5A 및 5B의 3개 센서의 기울기는 변하지 않으며, 절편은 부가된 페로시아나이드에 대해 선형으로 증가한다. 절편과 부가된 페로시아나이드의 선형 관계 및 평평한 기울기 경향성은, 10% 인쇄된 페리시아나이드를 보조 전극으로서 갖는 일련의 센서에서 동일하게 반복된다(도 6A 및 6B).
실험을 수행하여, 본 발명의 바이오센서(102)에 따라, 페로시아나이드를 DEX 시약 잉크에 가하고, 기울기의 변화 없이 교정 절편을 변형시킴을 보여주었다.
도 7은 10% 페리시아나이드를 보조 전극으로서 갖는 본 발명의 DEX형 바이오센서(102)의 내부 참조물질의 증가에 따르는 교정 절편의 선형 관계를 예시한다. 도 7에 BC7로 라벨링된 형태의 5개의 상이한 조성물은 DEX 센서용의 표준 DEX 시약에 혼합된 0%, 0.02%, 0.04%, 0.06% 및 0.08% 페로시아나이드로 제조하였다. BC7 형태의 이들 5개 센서에 대한 회귀 곡선 기울기(regression slope) 및 절편을 도 7에 나타내었다. 실험상의 문제로 인하여 0.06% 페로시아나이드를 갖는 센서를 제외하고, 나머지 4개 센서의 절편은 페로시아나이드를 내부 참조물질로서 일정량 가하는 것에 대한 양호한 선형 함수를 제공한다. 다른 한편으로, 5개 센서의 기울기는 평평한 라인이며, 이는 내부 참조물질을 가함으로써 본 발명의 DEX형 바이오센서(102)의 기울기가 변하지 않는다는 것을 보여준다.
도 8A 및 8B는 본 발명의 바이오센서(102)의 20% 페리시아나이드의 시약 혼합물에 부가된, 0.1% 페로시아나이드를 갖는 시약 잉크 및 대조군 시약 잉크로부터의 잔류하는 페로시아나이드를 유동 주입 분석(FIA)하여 수득한, 신호 대 참조물질의 비를 예시한다. DEX 시약 잉크에 대한 부가된 내부 참조물질 페로시아나이드의 민감한 효과들 중의 하나는, 매개체 페리시아나이드가 페로시아나이드로 변환되는 구동력이 감소한다는 점이다. 따라서, 페리시아나이드는 DEX 센서에 잔류 전류의 공급원이 된다. 이러한 민감한 효과를 보여주는 한 가지 방법은 내부 참조물질을 갖는 시약 잉크 및 대조군 시약 잉크의 잔류 전류(바탕 전류)를 장시간 모니터링하는 것이다. 두 가지 시약 잉크는 둘 다 수 주에 걸쳐 냉장고(2 내지 8℃)에 보관하였다. 도 8은 두 가지 시약 잉크로부터의 잔류하는 페로시아나이드의 FIA의 결과를 보여준다. 도 8로부터, 신호 대 참조물질(S/R)의 비는, FIA의 참조물질로서의 부가된 페로시아나이드에 비교한, 시약 잉크로부터의 페로시아나이드의 상대량을 나타낸다. 따라서, FIA 분석 결과 S/R 값이 클수록, 시약 잉크 중에 페로시아나이드가 다량 함유된 것이다. 도 8A로부터, 부가된 페로시아나이드를 갖는 시약 잉크 및 대조군 잉크 둘 다에 대해 S/R 값이 6주에 걸쳐 증가함을 알 수 있다. 그러나, 부가된 페로시아나이드를 갖는 시약 잉크 곡선은 대조군 곡선에 비해, 6주에 걸쳐 잔류 전류가 천천히 증가하였다. 부가된 페로시아나이드를 갖는 시약 잉크와 대조군 잉크의 S/R 응답 곡선을 도 8B에 함께 도시하여 비교하였다. (2차 근사 다항식(second order polynomial)의 2차 항에 대한 계수가 매우 작기 때문에) 1차 근사(first order approximation)에 있어서 6주에 걸친 냉동 저장에서 증가하는 잔류 전류의 비는, 부가된 페로시아나이드를 갖는 시약 잉크 곡선이 대조군 잉크 곡선에 비해 약 30% ([0.0918 - 0.0638]/0.0918 = 30%) 적다. 따라서, 도 8A 및 8B로부터, 내부 참조물질 페로시아나이드를 본 발명의 바이오센서(102)에 따르는 DEX 시약 잉크에 가함으로써, 시약 잉크 중에서 페리시아나이드로부터 페로시아나이드로 변환되는 속도가 상당히 감소한다는 것이 이해될 수 있다.
본 발명은 도면에 따르는 본 발명의 상세한 양태를 참조하여 기술되어 있지만, 이들 상세 설명은 청구의 범위에 청구된 바와 같은 본 발명의 범주를 한정시키지 않는다.
Claims (20)
- 효소, 매개체, 및 내부 참조물질(internal reference)로서의 산화성 화학종을 포함하는 혼합물로서, 분석 대상물과의 전기화학 반응을 위한 혼합물을 포함하는, 시험 샘플 중의 분석 대상물 농도를 측정하기 위한 바이오센서.
- 제1항에 있어서, 내부 참조물질이, 산화환원 전위가 매개체와 동일하거나 더 높은, 가역성 산화환원 쌍의 환원 형태로 정의되는, 바이오센서.
- 제1항에 있어서, 매개체가 3-페닐이미노-3H-페노티아진을 포함하는, 바이오센서.
- 제3항에 있어서, 내부 참조물질이 페로시아나이드를 포함하는, 바이오센서.
- 제4항에 있어서, 내부 참조물질을 규정하는 페로시아나이드와 매개체가 제1 전압 전위(voltage potential)에서 산화되고 제2 전압 전위에서는 매개체만이 산화되며, 제2 전압 전위가 제1 전압 전위보다 낮은, 바이오센서.
- 제5항에 있어서, 제1 전압 전위가 약 400mV이고 제2 전압 전위가 약 100mV 인, 바이오센서.
- 제1항에 있어서, 매개체가 페리시아나이드를 포함하는, 바이오센서.
- 제7항에 있어서, 내부 참조물질이 페로시아나이드를 포함하는, 바이오센서.
- 제1항에 있어서, 매개체가 루테늄 헥사아민을 포함하는, 바이오센서.
- 제9항에 있어서, 내부 참조물질이 페로시아나이드를 포함하는, 바이오센서.
- 제10항에 있어서, 효소가 글루코스 옥시다아제를 포함하는, 바이오센서.
- 제1 전압 전위를 제1 주기에서 인가하는 단계,설정된 대기 기간을 제공하는 단계 및제2 전압 전위를 대기 기간에 이어서 최종 주기에서 인가하는 단계를 포함하며, 여기서, 제1 전압 전위와 제2 전압 전위는 매개체만을 산화시키거나 매개체와 내부 참조물질 둘 다를 산화시키도록 선택적으로 제공되는,효소, 매개체, 및 내부 참조물질로서의 산화성 화학종의 혼합물을 포함하는 바이오센서의 사용방법.
- 제12항에 있어서, 제1 전압 전위를 제1 주기에서 인가하는 단계가, 선택된 높은 제1 전압 전위를 제1 주기에서 인가하여 매개체와 내부 참조물질을 산화시키는 단계를 포함하는, 바이오센서의 사용방법.
- 제12항에 있어서, 제1 전압 전위를 제1 주기에서 인가하는 단계가, 선택된 낮은 제1 전압 전위를 제1 주기에서 인가하여 매개체만을 산화시키는 단계를 포함하는, 바이오센서의 사용방법.
- 제12항에 있어서, 제2 전압 전위를 대기 기간에 이어서 최종 주기에서 인가하는 단계가, 선택된 제2 전압 전위를 인가하여 매개체와 내부 참조물질을 산화시키는 단계를 포함하는, 바이오센서의 사용방법.
- 제12항에 있어서, 제2 전압 전위를 대기 기간에 이어서 최종 주기에서 인가하는 단계가, 선택된 제2 전압 전위를 인가하여 매개체만을 산화시키는 단계를 포함하는, 바이오센서의 사용방법.
- 제12항에 있어서, 제1 전압 전위를 인가하는 단계와 제2 전압 전위를 인가하는 단계가, 선택된 전압 전위를 100 내지 400mV 범위에서 인가하는 단계를 포함하는, 바이오센서의 사용방법.
- 제12항에 있어서, 제1 전압 전위를 인가하는 단계와 제2 전압 전위를 인가하는 단계가, 선택된 제1 전압 전위를 제1 주기에서 인가하여 매개체와 내부 참조물질 둘 다를 산화시키는 단계 및 선택된 제2 전압 전위를 인가하여 매개체만을 산화시키는 단계를 포함하는, 바이오센서의 사용방법.
- 제12항에 있어서, 바이오센서가 3-페닐이미노-3H-페노티아진 및 루테늄 헥사아민 중의 하나를 포함하는 매개체를 포함하고; 내부 참조물질이 페로시아나이드를 포함하며; 제1 전압 전위를 인가하는 단계와 제2 전압 전위를 인가하는 단계가, 선택된 제1 전압 전위 및 제2 전압 전위를 인가하여 매개체만을 산화시키는 단계를 포함하는, 바이오센서의 사용방법.
- 제12항에 있어서, 제1 전압 전위를 인가하는 단계와 제2 전압 전위를 인가하는 단계가, 선택된 제1 전압 전위 및 제2 전압 전위를 인가하여 매개체와 내부 참조물질 둘 다를 산화시키는 단계를 포함하고; 내부 참조물질이 교정 절편(calibration intercept)을 좁은 범위내에 효과적으로 고정시키고, 내부 참조물질이 바이오센서의 교정 기울기(calibration slope)를 효과적으로 유지시키는, 바이오센서의 사용방법.
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