PL189236B1 - Pasek pomiarowy odczynnikowy oraz sposób pomiaru stężenia glukozy w próbce krwi - Google Patents

Abstract

1. Pasek pomiarowy odczynnikowy wielowarstwowy do pomiaru stezenia glukozy w próbce krwi przykladanej do paska, zawierajacy membrane z obszarem chlonnym oraz od- czynnikiem do oznaczania glukozy, znamienny tym, ze zawiera warstwe dolna (26, 126) z otworem przelotowym (30, 130) przyjmujacym próbke, warstwe membrany (10, 110), majaca strone przykladania próbki zwrócona do warstwy dolnej (26,126) i przeciwnie skierowana strone pomiarowa, oraz wiele rozmieszczo- nych wzdluz niej dyskretnych, chlonnych obszarów oznaczania (6-8, 101-108) rozdzielonych obszarem niechlonnym, przy czym membrana (10, 110) zawiera odczynnik reagujacy z glukoza ze zmiana barwy, skladajacy sie z pierwszego skladnika, oddzialy- wujacego z glukoza z wytworzeniem nadtlenku wodoru, drugiego skladnika, oddzialujacego z nadtlenkiem wodoru ze zmiana swej barwy oraz trzeciego skladnika, stanowiacego inhibitor zmiany barwy drugiego skladnika, oraz pasek zawiera warstwe posrednia (24, 124) pomiedzy warstwa dolna (26, 126) i warstwa membra- ny (10, 110), a takze element dozujacy do rozprowadzenia próbki wzdluz paska, przy czym element dozujacy stanowi kanalik do transportu krwi, uksztaltowany w warstwie posredniej (24, 124) i prowadzacy próbke po powierzchni membrany (10, 110) do chlonnych obszarów oznaczania (6-8, 101-108), zas stezenie inhibitora wzrasta w zadany sposób z odlegloscia od pierwszego konca paska FIG. 2 PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest pasek pomiarowy odczynnikowy oraz sposób pomiaru stężenia glukozy w próbce krwi.

Chodzi tu zwłaszcza o wielowarstwowy pasek odczynnikowy do pomiaru stężenia glukozy w próbce krwi, a zwłaszcza pasek pomiarowy odczynnikowy, który mierzy stężenie bezpośrednio, bez potrzeby korzystania z miernika.

Do pomiaru stężenia pewnych analitów w płynach ustrojowych opracowano wiele różnych urządzeń optycznych.

189 236

Urządzenia te mierzą na przykład stężenie glukozy, cholesterolu, protein, fenyloalaniny lub enzymów we krwi, moczu lub ślinie.

Suche paski odczynnikowe zawierające kompozycje oparte na enzymach stosowane są szeroko w laboratoriach klinicznych, przychodniach lekarskich, szpitalach i domach do badania płynów ustrojowych na zawartość glukozy. Paski odczynnikowe stały się faktycznie codzienną koniecznością dla wielu milionów chorych na cukrzycę. Ponieważ cukrzyca może powodować niebezpieczne anomalie w chemii krwi, może przyczynić się do utraty wzroku, niedomagania nerek i innych poważnych skutków medycznych. Dla zminimalizowania ryzyka tych skutków większość chorych na cukrzycę musi badać się okresowo, a następnie odpowiednio regulować swój poziom glukozy drogą na przykład kontroli diety i ewentualnie zastrzykami insuliny. Niektórzy pacjenci muszą badać swój poziom glukozy we krwi często np. cztery razy dziennie lub więcej.

Jest to szczególnie ważne dla chorych na cukrzycę, którzy muszą kontrolować swoją dietę dla wyregulowania wchłaniania cukru i ewentualnie brać zastrzyki insuliny i którzy muszą być poddawani częstym kontrolom poziomu glukozy we krwi i dysponować szybkimi, niedrogimi i dokładnymi paskami odczynnikowymi do oznaczania glukozy.

Znane są paski odczynnikowe, które zawierają wskaźnik, który zmienia odcień barwy w zależności od stężenia glukozy w płynie ustrojowym, przyłożonym do paska. Jakkolwiek niektóre z tych pasków wykorzystują redukcję chemiczną, to coraz częściej opierają się one na utleniających się barwnikach lub parach barwników. Niektóre paski zawierają enzym, taki jak oksydaza glukozowa, który jest zdolny do utlenienia glukozy do kwasu glukonowego i nadtlenku wodoru. Paski zawierają także utleniający się barwnik i substancję o aktywności nadtlenowej, która jest zdolna do selektywnego katalizowania utleniania utleniającego się barwnika w obecności nadtlenku wodoru. Paski takie są ujawnione na przykład w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5306623.

Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3964871 znany jest jednorazowy pasek wskaźnikowy do bezpośredniego pomiaru substancji, takich jak glukoza, w płynach ustrojowych. Wskaźnik rejestruje stężenie substancji przez włączenie zarówno odczynnika wskaźnikowego, który utlenia się i zmienia barwę, gdy reaguje z substancją, jak i „środka antagonistycznego”, który w pewien sposób zapobiega nagromadzeniu się utlenionego wskaźnika do czasu jego całkowitego zużycia.

Z europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0317070 (patrz także opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5036000) znany jest „cyfrowy” układ do próby ilościowej glukozy i innych analitów. Układ ten dokonuje pomiaru stężenia związku organicznego w płynie ustrojowym najpierw przez utlenienie związku za pomocą enzymu oksydazy, specyficznego dla substratu, z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Układ ten zawiera chromogen, który jest reduktorem nadtlenku wodoru, oraz trwały na powietrzu reduktor nadtlenku wodoru, który ma większy potencjał redukcyjny. Większy potencjał redukcyjny opóźnia wszelką wykrywalną zmianę barwy przez chromogen do czasu całkowitego zużycia nadtlenku wodoru trwałego na powietrzu. Zatem brak jest zmiany barwy, jeżeli poziom mierzonego nadtlenku wodoru jest niższy niż określony poziom odpowiadający stężeniu trwałego na powietrzu reduktora nadtlenku. W wyniku tego układ dokonuje pomiaru ilościowego, niezależnego od intensywności zmiany barwy.

Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4738823, znany jest pasek pomiarowy do oznaczania analitu, który ma podłoże, które jest materiałem chłonnym przeznaczonym do usuwania nadmiaru próbki nałożonej na pasek. Pasek może zawierać także pokrycie, które ma otwór, przez który można wprowadzić próbkę.

Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4810470, znane jest urządzenie do pomiaru stężeń analitów w ciekłych próbkach. Urządzenie zawiera jedną lub więcej chłonnych matryc, pokrytych powłoką lub błoną nieprzepuszczalną dla cieczy. Próbkę umieszcza się na części chłonnej matrycy i dozuje do matrycy drogą chromatograficzną. Przez działanie na zasadzie knota próbka wędruje do obszaru oznaczania, który zawiera odczynnik kontrolny analitu.

Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4994238, znane jest urządzenie do analizy chemicznej, składające się z warstwy absorbenta, wodoodpornej warstwy zapo189 236 rowej i warstwy odczynnikowej o określonej objętości. Próbkę przykłada się do warstwy odczynnikowej przez współliniowe otwory w leżącej na wierzchu warstwie absorbenta i warstwie zaporowej.

Niezależnie od tego, czy próbę prowadzi się w domu, przychodni lekarskiej, klinice lub szpitalu, dokładność i powtarzalność oznaczenia glukozy są nadzwyczaj ważne. W przypadku paska odczynnikowego ze wskazaniem barwy pożądane jest, aby zmiana barwy była wyraźna i niewrażliwa na zmiany składników płynu ustrojowego innych niż glukoza. W przypadku paska odczynnikowego z odczytem wzrokowym szczególnie ważne jest, aby chorzy na cukrzycę, którzy mają osłabiony wzrok, mieli do dyspozycji taki pasek, który daje wyraźną zmianę barwy w zależności od poziomu glukozy, chociaż zmiana barwy, która przejawia się jako zmiana absorbancji przy danej długości fali jest także ważna dla dokładności pasków z odczytem za pomocą miernika.

Ponieważ zmiana barwy jest skutkiem szeregu reakcji chemicznych, to nie dokonuje się ona natychmiast i użytkownik musi odczekać pewien okres czasu, typowo jedną minutę lub mniej, do zajścia reakcji. Jeżeli paski odczytywane są za pomocą miernika, to obwody elektryczne regulatora czasowego mogą dać sygnał zakończenia reakcji. Jednakże jeżeli pasek odczytywany jest wzrokowo, bez użycia miernika, to użytkownik może nie doszacować koniecznego czasu, odczytać pasek przedwcześnie i podać nieprawidłowy wynik. Alternatywnie użytkownik może odczuwać potrzebę nadmiernego oczekiwania przed odczytaniem paska, aby upewnić się, że reakcja jest zakończona, co powoduje niepotrzebną zwłokę i brak satysfakcji użytkownika. Istnieje zatem potrzeba opracowania „chemicznego” regulatora czasowego, to jest elementu na pasku, który zmieni barwę niezależnie od stężenia glukozy w próbce krwi, lecz uczyni to po czasie dostatecznym do zakończenia reakcji zmiany barwy w próbce.

Pasek pomiarowy odczynnikowy wielowarstwowy do pomiaru stężenia glukozy w próbce krwi przykładanej do paska, zawierający membranę z obszarem chłonnym oraz odczynnikiem do oznaczania glukozy, odznacza się według wynalazku tym, że zawiera warstwę dolną z otworem przelotowym przyjmującym próbkę, warstwę membrany, mającą stronę przykładania próbki zwróconą do warstwy dolnej i przeciwnie skierowaną stronę pomiarową, oraz wiele rozmieszczonych wzdłuż niej dyskretnych, chłonnych obszarów oznaczania rozdzielonych obszarem niechłonnym, przy czym membrana zawiera odczynnik reagujący z glukozą ze zmianą barwy, składający się z pierwszego składnika, oddziaływującego z glukozą z wytworzeniem nadtlenku wodoru, drugiego składnika, oddziałującego z nadtlenkiem wodoru ze zmianą swej barwy oraz trzeciego składnika, stanowiącego inhibitor zmiany barwy drugiego składnika, oraz pasek zawiera warstwę pośrednią pomiędzy warstwą dolną i warstwą membrany, a także element dozujący do rozprowadzenia próbki wzdłuż paska, przy czym element dozujący stanowi kanalik do transportu krwi, ukształtowany w warstwie pośredniej i prowadzący próbkę po powierzchni membrany do chłonnych obszarów oznaczania, zaś stężenie inhibitora wzrasta w zadany sposób z odległością od pierwszego końca paska.

Korzystnie warstwę dolną stanowi arkusz termoplastyczny.

Korzystnie warstwa dolna jest poliestrem.

Korzystnie warstwa dolna zawiera ponadto pewną liczbę otworów przelotowych, współliniowych z obszarami oznaczania.

Korzystnie warstwa dolna wyposażona jest w przezroczystą sekcję usytuowaną w określonej odległości od otworu przyjmującego próbkę, zapewniającą odpowiednią wielkość próbki.

Korzystnie warstwę membrany stanowi anizotropowa porowata membrana mająca pory, które są większe w pobliżu strony membrany przyjmującej próbkę i mniejsze w pobliżu strony pomiarowej membrany.

Korzystnie ma wielkości porów tak dobrane, że czerwone ciałka całej próbki krwi są zatrzymywane w membranie.

Korzystnie membrana utworzona jest z polisulfonu.

Korzystnie kanalik do transportu krwi jest w zasadzie prostokątny.

Korzystnie pierwszy składnik odczynnika zawiera oksydazę glukozową.

Korzystnie drugi składnik odczynnika zawiera peroksydazę i barwnik indykatorowy lub parę barwników, zmieniających barwę podczas utleniania się.

Korzystnie peroksydaza jest peroksydaząz chrzanu.

189 236

Korzystnie barwnik indykatorowy lub para barwników jest [3-metylo-2-benzotiazolinonohydrazono]-N-sulfonylobenzenosulfonianem jednosodowym połączonym z 8-anilino-1-naftaleno-sulfonianem amonowym (MBTHSB-ANS).

Korzystnie trzeci składnik odczynnika stanowi kwas askorbinowy.

Korzystnie odczynnik zawiera ponadto składnik rozdzielający wybrany z grupy obejmującej glikol polietylenowy, polibezwodnik metylowinyloetero/maleinowy glikol polipropylenowy, polikwas styrenosulfonowy, polikwas akrylowy, polialkohol winylowy i polikwas etylenosulfonowy.

Korzystnie warstwa pośrednia jest arkuszem termoplastycznym.

Korzystnie warstwa pośrednia jest poliestrem.

Korzystnie chłonne obszary i niechłonny obszar stanowią odpowiednio nie zgniecione i zgniecione obszary warstwy membrany.

Korzystnie nie zgniecione obszary chłonne mają postać kolumny, każda z podstawą w membranie i przeciwległym do podstawy końcem, który przylega do warstwy dolnej.

Korzystnie nie zgniecione obszary chłonne mają postać kolumny, każda z podstawą w membranie i przeciwległym końcem, który przylega do warstwy górnej.

Korzystnie zawiera warstwę górną, sąsiadującą z górną powierzchnią warstwy membrany i mającą otwory przelotowe, współliniowe z obszarami oznaczania.

Korzystnie warstwa membrany jest przyklejona do warstwy górnej.

Korzystnie warstwa membrany jest przyklejona do warstwy górnej za pomocą kleju tylko w miejscach ograniczonych do niechłonnego obszaru warstwy membrany.

Korzystnie zawiera ponadto warstwę absorbenta, stykającą się z końcem membrany, najbliższym pierwszego końca paska.

Korzystnie zawiera ponadto warstwy absorbenta, stykające się z każdym końcem warstwy membrany.

Korzystnie otwór przelotowy do przyjmowania próbki znajduje się w pobliżu końca paska, odległego od końca pierwszego.

Korzystnie zawiera element regulatora czasowego, zawierający obszar oznaczania, który oprócz odczynnika zawiera także pewną ilość glukozy, powodującą zmianę barwy obszaru w określonym czasie po przyłożeniu próbki do paska.

Sposób pomiaru stężenia glukozy w próbce krwi, w którym przykłada się próbkę do paska pomiarowego odczynnikowego, zawierającego membranę z obszarem chłonnym i odczynnikiem do oznaczania glukozy, charakteryzuje się według wynalazku tym, że stosuje się pasek pomiarowy odczynnikowy składający się z warstwy dolnej z otworem przelotowym przyjmującym próbkę, warstwy membrany, mającej stronę przykładania próbki zwróconą do warstwy dolnej i zawierającej pewną liczbę chłonnych obszarów oznaczania, z których każdy zmienia barwę po zetknięciu się z krwią zawierającą co najmniej określoną ilość glukozy, większą niż ilość glukozy, powodująca zmianę barwy obszarów oznaczania, znajdujących się bliżej pierwszego końca paska i elementu dozującego rozprowadzającego próbkę od otworu przelotowego po określonej ścieżce do każdego z obszarów oznaczania oraz oznacza się stężenie glukozy obserwując zmianę barwy obszaru oznaczania, najbardziej odległego od pierwszego końca paska.

Pasek jest takiego rodzaju, że daje wskazanie wzrokowe stężenia glukozy w próbce krwi przyłożonej do strony paska do przyjmowania próbki. Wskazanie wzrokowe pojawia się po przeciwnej, pomiarowej stronie paska.

Skład chemiczny paska pomiarowego zależy oczywiście od mierzonego analitu/płynu ustrojowego. Paski pomiarowe można przeznaczyć do wykrywania analitów, takich jak glukoza lub inne cukry, alkohol, cholesterol, proteiny, ketony, kwas moczowy, fenyloalanina lub enzymy w płynach ustrojowych, takich jak krew, mocz i ślina oraz woda. Paski pomiarowe odczynnikowe będące przedmiotem wynalazku służą do wykrywania glukozy we krwi. Specjalista z tej dziedziny może łatwo wykorzystać informacje zawarte w tym opisie do wykrywania innych połączeń analit/płyn ustrojowy

Pasek pomiarowy odczynnikowy według niniejszego wynalazku zapewnia stosunkowo proste i szybkie oznaczanie stężenia glukozy w niezmierzonej próbce krwi. Pasek zawiera warstwę dolną z otworem, przez który próbkę można wprowadzić od strony „próbkowej” matrycy, której strona przeciwna jest stroną pomiarową. Matryca jest w ogólności membranną

189 236 i obydwa te określenia stosuje się zamiennie w niniejszym opisie i dołączonych zastrzeżeniach. Odczynnik pomiarowy nakłada się na matrycę i w mniejszym lub większym stopniu, nasyca on pory matrycy. Dla uproszczenia odczynnik na matrycy będzie określony w tym opisie i w zastrzeżeniach jako „powłoka”, uznając, że warstwa odczynnika wnika także w matrycę.

Warstwa pośrednia leży pomiędzy warstwą dolną i matrycą. W jednym z przykładów wykonania wycięcia w warstwie pośredniej są współliniowe z niechłonnymi obszarami membrany prowadząc próbkę do szeregu chłonnych obszarów oznaczania, które rozmieszczone są wzdłuż paska (w opisie tym i dołączonych zastrzeżeniach przez określenie „chłonny” rozumie się absorbujący). Szereg nacięć w warstwie pośredniej otacza obszar dookoła i powyżej obszarów oznaczania wymuszając przepływ próbki do tych obszarów. W innym przykładzie wykonania wydłużona, w zasadzie prostokątna szczelina prowadzi próbkę do kolejnych obszarów chłonnych, które są rozdzielone obszarem niechłonnym.

Ustalona objętość próbki, typowo pełna krew zawierająca czerwone ciałka krwi i glukozę, jest zatem skierowana do „próbkowej” strony membrany w każdym z szeregów obszarów oznaczania. Porowatość matrycy umożliwia przejście płynu od strony próbki do strony pomiarowej, na przykład na zasadzie efektu kapilarnego. Zatem odczynnik pomiarowy może reagować z glukozą we krwi powodując zmianę barwy na stronie pomiarowej membrany lub blisko pomiarowej strony membrany. Ponieważ silnie zabarwione czerwone ciałka krwi mogą utrudniać wykrywanie zmiany barwy, to matryca jest korzystnie anizotropowa, o wielkości porów stopniowanej od porów dużych po stronie próbki matrycy do porów mniejszych po stronie pomiarowej matrycy, w celu wyłapania czerwonych ciałek krwi z dala od strony pomiarowej matrycy. Dla różnych składników paska pomiarowego i regulatora czasowego według wynalazku stosuje się szereg materiałów. Niektóre z tych materiałów znane są z opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5306623 i 5418142.

Odczynnik pomiarowy zawiera składnik do przekształcenia glukozy w nadtlenek wodoru, taki jak oksydaza glukozowa, jeden lub więcej składników do wykrywania nadtlenku wodoru wytworzonego z glukozy obecnej w próbce oraz inhibitor. Składnikami do wykrywania nadtlenku wodoru mogą być peroksydaza, korzystnie peroksydaza z chrzanu, razem z „indykatorem”, który zmienia barwę podczas reakcji. Indykator może być utleniającym się barwnikiem lub parą barwników. Peroksydaza katalizuje utlenianie indykatora w obecności nadtlenku wodoru. Elementem końcowym odczynnika jest inhibitor, który opóźnia utlenianie indykatora ze zmianą barwy.

Pasek na swojej długości podzielony jest na segmenty w taki sposób, że przyległe segmenty membrany mają różne stężenia inhibitora. Każdy odcinek ma chłonny obszar oznaczania, który zmienia barwę tylko wtedy, gdy obecna jest dostateczna ilość glukozy najpierw do spowodowania zużycia całego inhibitora, a następnie do utlenienia indykatora, a zatem do spowodowania charakterystycznej zmiany barwy. Zatem zmiana barwy w poszczególnym obszarze świadczy o progowym stężeniu glukozy w oryginalnej próbce krwi. Wzdłuż paska, w określonym kierunku, każdy kolejny segment ma stopniowo rosnące stężenie inhibitora, odpowiadające stopniowemu wzrostowi progowego stężenia glukozy. Stężenie indykatora jest takie samo dla wszystkich segmentów. W zasadzie możliwe są także inne zmieniające się stany równowagi inhibitor/indykator.

Jeżeli segmenty mają stężenia inhibitora w zakresie odpowiednim dla szczególnej badanej próbki, to przyległe obszary oznaczania reagują z glukozą w taki sposób, że jeden obszar jest zabarwiony, natomiast obszar przyległy nie jest zabarwiony. Wynik ten wskazuje, że stężenie glukozy w próbce jest co najmniej równe progowemu stężeniu wymaganemu do zmiany barwy jednego obszaru, lecz nie jest tak duże jak stężenie wymagane do zmiany barwy w obszarze przyległym.

Do kontrolowania glukozy we krwi ewentualna powłoka segmentu regulatora czasowego składa się z elementów paska indykatora - porowatej matrycy z powleczonym na niej odczynnikiem pomiarowym - i dodatkowo glukozy. W stanie suchym odczynnik nie jest chemicznie aktywowany przez glukozę, lecz gdy do paska zostaje przyłożona próbka, to powłoka regulatora czasowego zwilża się i glukoza w powłoce, po określonym czasie, powoduje zmianę barwy indykatora. Glukoza zawarta jest w regulatorze czasowym korzystnie w dużym nadmiarze, w stosunku do ilości wymaganej, w celu przezwyciężenia inhibitora. W tym przypadku wymagany

189 236 czas jest dłuższy lub krótszy w zależności od tego, czy jest mniej czy więcej inhibitora. Zmiany barwy w pasku i w regulatorze czasowym można obserwować albo bezpośrednio wzrokiem, albo za pomocą przyrządu optycznego, który wykrywa zmiany współczynnika odbicia.

Przedmiot wynalazku jest objaśniony bliżej w przykładzie wykonania na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia matrycę pomiarowego paska odczynnikowego z bezpośrednim odczytem, według wynalazku, w widoku perspektywicznym, fig. 2 - wycięcie dna strony próbki pomiarowego paska odczynnikowego według wynalazku, w widoku z góry, fig. 3 - częściowo wycięty, powiększony fragment wnętrza paska pomiarowego przedstawionego na fig. 2, w widoku perspektywicznym, fig. 4 - pasek przedstawiony na fig. 2 w przekroju poprzecznym wzdłuż linii 4-4, fig. 5 - pasek przedstawiony na fig. 2 w widoku od dołu, fig. 6 -stronę pomiarową paska kontrolnego przedstawionego na fig. 5 w widoku z góry, fig. 7 - pasek przedstawiony na fig. 6, po nałożeniu na niego próbki, fig. 8 - wycięcie paska pomiarowego przedstawionego na fig. 2 w innym przykładzie wykonania, w widoku perspektywicznym, fig. 9 - pasek pomiarowy przedstawiony na fig. 8 w widoku od dołu, fig. 10 - pasek pomiarowy przedstawiony na fig. 8 w widoku z góry, fig. 11 - pasek przedstawiony na fig. 10 w przekroju poprzecznym wzdłuż linii 11-11.

Przedmiotem wynalazku jest pasek pomiarowy odczynnikowy z bezpośrednim odczytem do pomiaru stężenia glukozy w płynie ustrojowym organizmu takim jak krew. Elementem kluczowym takiego paska pomiarowego jest porowata matryca, która zawiera w sobie odczynnik pomiarowy, który reaguje zmianą barwy na glukozę zawartą w próbce krwi, przyłożonej do paska.

Matryca może być kompozycją jednorodną lub może być powleczonym podłożem albo może być izotropowa lub anizotropowa. Ma ona stronę „próbki”, do której przykłada się próbkę, oraz stronę pomiarową, na której obserwuje się zmianę barwy. Korzystnie matryca jest anizotropową membraną, a zwłaszcza anizotropową membraną o szerokim zakresie wielkości porów. Membrana może mieć na przykład gradient wielkości porów od około 0,1 mikrometra do około 150 mikrometrów. Po stronie porów dużych ich wielkość wynosi korzystnie od około 30 mikrometrów do około 40 mikrometrów. Po stronie membrany, po której pory są najmniejsze, objętość pustych przestrzeni jest stosunkowo mała, a materiał membrany jest w ogólności dość zwarty w warstwie, która typowo może stanowić do 20% grubości membrany. W warstwie tej wielkość porów wynosi korzystnie od około 0,1 do około 0,8 mikrometra, przy nominalnej wielkości porów wynoszącej korzystnie około 0,3 mikrometra. Gdy po stronie próbki przykłada się krew, to w miarę wnikania w membranę napotyka ona coraz mniejsze pory. Substancje stałe, takie jak czerwone ciałka krwi, dochodzą do takiego położenia w membranie, w którym nie mogąjuż dalej wnikać. Część próbki, wciąż zawierającej glukozę, przenika przez stronę pomiarową membrany. Anizotropowa struktura membrany i ewentualnie zastosowanie składnika rozdzielającego (omawianego niżej) umożliwia stosunkowo szybkie przepływy przez membranę, nawet jeżeli ma miejsce filtracja substancji stałych.

W miarę jak próbka krwi przechodzi przez matrycę reakcja z odczynnikiem powoduje tworzenie się lub rozkład barwnika pochłaniającego światło w pustych przestrzeniach, w pobliżu strony pomiarowej membrany, a zatem wpływa w sposób istotny na współczynnik odbicia od matrycy.

Przykładami odpowiednich materiałów matrycy są polisulfony i poliamidy (nylon), przy czym można stosować także inne polimery o porównywalnych właściwościach. Polimery można modyfikować przez wprowadzenie innych grup funkcyjnych, które zapewniają naładowane struktury, tak że powierzchnie matrycy mogą być obojętne, naładowane dodatnio lub ujemnie.

Korzystny sposób wytwarzania materiału porowatego, tworzącego matrycę, polega na odlewaniu polimeru bez rdzenia wspierającego. Taką matrycą jest na przykład anizotropowa membrana sulfonowa, dostępna w firmie Memtec, Inc., Timonium, MD. Stosowana jest zwykle matryca o grubości mniejszej niż 200 mikrometrów, przy czym korzystna grubość wynosi od 115 do 155 mikrometrów. Grubość od 130 do 140 mikrometrów zalecana jest zwłaszcza wtedy, gdy matryca wykonana jest z nylonu lub anizotropowego sulfonu.

Membranę można potraktować odczynnikiem pomiarowym przez zanurzenie jej w mieszaninie składników nasycając ją w ten sposób. Korzystnie przynajmniej niektóre składniki

189 236 wprowadza się do membrany po kolei. Nadmiar odczynnika można usunąć za pomocą środka mechanicznego, na przykład noża pneumatycznego, listewki zgarniającej lub pręcika szklanego. Następnie membranę suszy się. Odczynnik ma skłonność do skupiania się w pobliżu strony membrany o małych porach (strona pomiarowa).

Odczynnik pomiarowy zawiera składnik przekształcający glukozę w nadtlenek wodoru, składnik do wykrywania nadtlenku wodoru oraz składnik hamujący, który wykrywa nadtlenek wodoru. Odczynnik może także zawierać ewentualnie składnik rozdzielający, który powoduje, że substancje stałe, takie jak czerwone ciałka krwi, zostają uwięzione w matrycy, i usuwa skutecznie substancje stałe z krwi. Jak opisano niżej i w przykładach mogą być obecne także dodatkowe składniki.

Do korzystnych składników do przekształcania glukozy w nadtlenek wodoru należy oksydaza glukozowa, enzym, który uzyskuje się zwykle z Aspergillus niger lub Penicillium. Oksydaza glukozowa reaguje z glukozą i tlenem wytwarzając glukonolakton i nadtlenek wodoru. Optymalne stężenie oksydazy glukozowej zależy od składu układu indykatorowego. Jeżeli na przykład układem indykatorowym jest MBTHSB-ANS (opisany niżej), to odpowiednia jest oksydaza glukozowa o stężeniu w przedziale od około 500 do 10000 jednostek/ml, korzystnie od około 700 do 2000 jednostek/ml, a zwłaszcza około 1000 jednostek/ml. Wyższe stężenia oksydazy glukozowej powodują przyspieszenie reakcji, natomiast niższe stężenia - jej spowolnienie.

Tak wytworzony nadtlenek wodoru reaguje ze składnikiem do wykrywania nadtlenku wodoru, zawierającym peroksydazę, która katalizuje selektywnie reakcję pomiędzy nadtlenkiem wodoru i indykatorem. Peroksydaza zużywa nadtlenek wodoru jako utleniacz, który jest zdolny do usuwania atomów wodoru z różnych substancji. Odpowiednia peroksydaza może zawierać ferryprotoporfirynę, czerwoną heminę uzyskiwaną z roślin. Nadają się tu także peroksydazy otrzymywane z organizmów zwierzęcych, na przykład z gruczołu tarczycowego zwierząt. Jako składnik komponentu do wykrywania nadtlenku wodoru szczególnie korzystna jest peroksydaza z chrzanu (HRPO).

Nadtlenek wodoru, zwłaszcza katalizowany przez peroksydazę, reaguje pośrednio lub bezpośrednio tworząc lub rozkładając barwnik indykatora, który pochłania światło o określonej długości fali. Korzystnie barwnik indykatora pochłania silnie przy długości fali różniącej się od długości fali, przy której silnie pochłania odczynnik pomiarowy. Utleniona postać indykatora może być barwnym, słabo zabarwionym lub bezbarwnym produktem, końcowym, który świadczy o zmianie barwy pomiarowej strony matrycy, to jest odczynnik pomiarowy może wskazywać obecność glukozy w próbce przez blednący, zabarwiony obszar lub, alternatywnie, przez bezbarwny obszar nabierający barwy.

Do indykatorów użytecznych dla wynalazku należą chlorowodorek 3-metylo-2-benzotiazolinonohydrazonu (MBTH) w połączeniu z kwasem 3-dwumetyloaminobenzoesowym (DMAB), MBTH w połączeniu z kwasem 3,5-dwuchloro-2-hydroksybenzenosulfonowym (DCHSB), 4-aminoantypiren (4-AAP) i kwas 5-okso-1-(p-sulfofenylo)-2-pirazolino-3-karboksylowy (OPSP), 4-AAP i N-(m-tolilo)-dwuetanoloamina (NDA), kwas 2,2'-dwuiazyno-dwu-(3-etylobenzo-tiazolino)sulfonowy, 4-AAP i 4-metoksynaftol, czerwień pirogalolowa (PGR), czerwień bromo-pirogalolowa (BPR), zieleń kwasowa 25 (AG) lub [3-metylo-2-benzotiazolinonohydrazono]-N-sulfonylo-benzenosulfonian jednosodowy (MBTHSB) w połączeniu z 8-anilino-l-naftalenosulfonianem amonowym, przy czym korzystny jest MBTHSB.

Składnik hamujący opóźnia reakcję pomiędzy nadtlenkiem wodoru i indykatorem, na przykład przez redukcję nadtlenku wodoru lub redukcję utlenionego indykatora. W zasadzie istnieje kilka różnych sposobów działania inhibitora. Po pierwsze, inhibitor mógłby konkurować z indykatorem, a przez to zwalniać szybkość, przy której ma miejsce zmiana barwy w indykatorze. Po drugie, inhibitor mógłby nie być konkurencyjny, tak że w zasadzie cały inhibitor zużywa się przed każdą zasadniczą zmianą barwy w indykatorze. Możliwe są także inne mechanizmy działania inhibitora, przy czym korzystnie jest, jeżeli inhibitory według wynalazku nie są konkurencyjne.

Do szeregu korzystnych inhibitorów należy kwas 2,3,4-trójhydroksybenzoesowy, galusan propylu, kwas 3,4-dwuhydroksycynamonowy, 3,4-dwuhydroksybenzaldehyd, kwas galusowy, 5,6-dwuaminouracyl, kwas askorbinowy oraz kwas izoaskorbinowy, a zwłaszcza kwas

189 236 askorbinowy, który jednakże utlenia się w roztworze i musi być stabilizowany dla umożliwienia wprowadzenia odczynnika. Korzystnymi stabilizatorami są pierwszorzędowe alkohole, takie jak alkohol etylowy, metylowy i propylowy. Szczególnie korzystne są stężone roztwory alkoholu etylowego, to jest o stężeniu 50% lub więcej.

Chociaż membrana anizotropowa, to jest korzystna matryca, odfiltrowuje czerwone ciałka krwi i utrzymuje je z dala od strony pomiarowej membrany, to odczynnik pomiarowy może ewentualnie zawierać także składnik rozdzielający. Składnik rozdzielający powinien być zdolny do wytwarzania stosunkowo klarownego, bezbarwnego płynu z płynu zawierającego czerwone ciałka krwi, na przykład pełnej krwi, przez zatrzymanie czerwonych ciałek krwi w matrycy. Składniki rozdzielające do stosowania w niniejszym wynalazku obejmują przykadowo, glikol polietylenowy, polibezwodnik (metylowinyloeteromaleinowy), glikol polipropylenowy, kwas polistyrenosulfonowy, kwas poliakrylowy, polialkohol winylowy oraz kwas poliwinylosulfonowy przy pH od około 4,0 do 8,0. Takie składniki rozdzielające zawarte są w matrycy w ilościach, które zmieniają się w zależności od ich ładunku i ciężaru cząsteczkowego, innych składników pogrążonych w matrycy, pH matrycy i wielkości porów oraz resztkowej wilgotności matrycy po wysuszeniu. Takie parametry dają się łatwo oznaczyć przez specjalistę. Jeżeli na przykład jako składnik rozdzielający stosowany jest glikol polipropylenowy (na przykład PPG-410 firmy BASF, Wyandotte, MI), to korzystnie znajduje się on w ilości około 2-30% masowych (kg/m³), a zwłaszcza od 8 do 10% masowych. Przy stężeniu masowym około 2-30% można także stosować inne składniki rozdzielające. Polimeryczne składniki rozdzielające mogą być wprowadzone na matrycę lub zanurzone w matrycy albo odlewane w membranie w czasie jej wytwarzania.

Niektóre sole rozpuszczalne w wodzie także mają wpływ na rozdzielanie krwi. Do soli odpowiednich do rozdzielania składników krwi należą cytryniany, mrówczany i siarczany, jak również niektóre kwasy, takie jak aminokwasy, kwas cytrynowy, kwas fitowy i kwas jabłkowy. Korzyść wprowadzania składnika rozdzielającego polega na tym, że przy usuwaniu substancji stałych, takich jak czerwone ciałka krwi, występuje mniejsza barwa tła w badanym miejscu,, zaciemniająca zmianę barwy wytwarzaną przez odczynnik pomiarowy.

Dla zwiększenia intensywności barwy i możliwości odczytywania pasków odczynnikowych, jak również do zachowania jednorodności i zwartości matrycy można wprowadzić do niej także i inne składniki. Do wspomagania oddzielenia barwnika w matrycy odczynnik pomiarowy może zawierać na przykład sole i/lub bufory. Takie bufory mogą zawierać na przykład cytrynian, obecny w roztworze w stężeniu od około 0,01 M do około 1,0 M, korzystnie około 0,1 M, przy czym można stosować także i inne bufory.

Można także stosować związki, które nadają matrycy właściwości hydrofilowe, lub związki, które działają jako stabilizatory, takie jak zhydrolizowane proteiny. Do takich związków należą, np. albumina osocza krwi bydlęcej, polipeptydy i niskocząsteczkowa proteina dostępna pod nazwą Crotein SPA (CRODa, Inc. New York, N.Y.). Związki te stosuje się w stężeniach od około 1 mg/ml do około 100 25 mg/ml). W przypadku związku Crotein korzystne stężenie wynosi 30 mg/ml.

Do powłoki matrycy można wprowadzić także inne stabilizatory i środki konserwujące. Stosować można na przykład kwas etylenodwuaminoczterooctowy (EDTA), kwas dwuetylenotrójaminopięciooctowy (DTPA) oraz związki podobne przy stężeniu na przykład od około 0,01 mg/ml do około 10 mg/ml. Jednym z celów stosowania środków konserwujących jest wspomaganie stabilizacji inhibitora.

Niektóre indykatory (na przykład BPR) mają niepożądaną skłonność do migracji w matrycy. Przy stosowaniu takiego indykatora, dla zapobieżenia migracji, wprowadza się środek parujący jony. Do takich szczególnie użytecznych środków, dzięki ich zdolności ułatwiania sparowania jonów pomiędzy indykatorem i innymi składnikami matrycy, należą na przykład pochodne glikolu polietylenowego, dostępne pod nazwą Polyquart (H) (Henkel, Inc., Ambler, Pa).

Gdy obecność analitu w postaci glukozy wskazywana jest przez tworzenie się zabarwienia (na przykład MBTHSB-ANS), to dodaje się środki powierzchniowo-czynne w celu rozjaśnienia barwy i zwiększenia kontrastu z bezbarwnym otoczeniem.

189 236

W praktyce niniejszego wynalazku można stosować również rozpuszczalniki organiczne i wprowadzić je do kompozycji odczynnika pomiarowego matrycy, pod warunkiem oczywiście, że są one zgodne z kompozycjami matrycy i odczynnika pomiarowego. Do potencjalnie użytecznych rozpuszczalników organicznych należy chloroform, aceton, alkohole, chlorek metylenu, eter dwuetylowy i eter naftowy, acetonitryle oraz ich mieszaniny. W praktyce niniejszego wynalazku szczególnie korzystnie stosuje się 70% etanol w wodzie.

Odczynnik pomiarowy, który stanowi powłokę lub wprowadzony jest do matrycy, nie jest jednorodny na powierzchni paska pomiarowego. Odwrotnie, odczynnik nałożony jest na matrycę w postaci szeregu równoległych pasów lub „segmentów”, które rozciągają się wzdłuż wąskiej strony paska. Kompozycja w przyległych segmentach ma stopniowo zwiększające się stężenie inhibitora. Każdy segment ma chłonny obszar oznaczania. W takich obszarach odczynnik pomiarowy reaguje z jakąkolwiek glukozą zawartą we krwi powodując zmianę barwy, pod warunkiem, że stężenie glukozy jest dostatecznie wysokie do przezwyciężenia poziomu inhibitora w tym obszarze oznaczania. Zatem każdy następny obszar oznaczania wymaga stopniowo coraz większego stężenia glukozy w próbce do spowodowania zmiany barwy tego obszaru.

Jeden z obszarów oznaczania służy ewentualnie jako regulator czasowy do wskazywania dostatecznego upływu czasu dla odczynnika do przereagowania z glukozą w każdym obszarze oznaczania. Segment regulatora czasowego matrycy jest powleczony lub impregnowany kompozycją, która składa się z odczynnika pomiarowego i dodatkowo glukozy. Jako, że przeznaczeniem odczynnika pomiarowego jest zmiana barwy w reakcji na obecność glukozy, to połączenie ich bez powodowania zmiany barwy wymaga pewnej ostrożności. Poza ilością wymaganą do pełnienia funkcji czasowej konieczna jest pewna ilość inhibitora do skompensowania tego efektu. Szybkość, z jaką suszony jest segment regulacji czasowej, po umieszczeniu roztworu zawierającego glukozę, jest regulowana. W praktyce najpierw pokrywa się membranę roztworem zawierającym bufory, stabilizatory i enzymy, a następnie taką powłokę suszy się z utworzeniem pierwszej warstwy. Następnie nakłada się drugą warstwę złożoną z roztworu zawierającego indykator, inhibitor i glukozę. Parametry, takie jak szybkość przesuwu wstęgi, temperatura pieca i prędkość przepływu powietrza, jak również ilość nałożonego roztworu powlekającego ustala się wcześniej i nastawia odpowiednio stężenia inhibitora i ewentualnie glukozy. Zamiast nakładania drugiej powłoki bezpośrednio, istnieje alternatywa, chociaż mniej korzystna, wykonywania powłoki na oddzielnej wstędze, a następnie umieszczenia jej na warstwie pierwszej.

Gdy próbkę krwi przykłada się do paska, uwodnienie kompozycji segmentu regulatora czasowego pozwala na postępowanie reakcji z tworzeniem się barwy. Czas, jaki konieczny jest do zmiany barwy segmentu regulatora czasowego, określa się wtedy za pomocą temperatury oraz charakterystyki odczynnika pomiarowego, a zwłaszcza stężenia inhibitora, ilości glukozy oraz szybkości uwadniania i dyfuzji tlenu.

Czas zmiany barwy regulatora czasowego można wyregulować jako zależny od stężenia glukozy w próbce krwi albo, alternatywnie, jako niezależny od tego stężenia. Przez wprowadzenie nadmiaru glukozy do regulatora czasowego, czas jest w zasadzie niezależny od stężenia glukozy w próbce. Przez wprowadzenie mniejszej ilości glukozy do regulatora czasowego, czas można uzależnić od ilości glukozy w próbce, to jest regulator czasowy zmieni barwę szybciej, jeżeli stężenie glukozy w próbce jest większe.

Korzystnie stężenie glukozy w regulatorze czasowym jest większe niż 1500 mg/dl, co czyni regulator czasowy w zasadzie niezależnym od stężenia glukozy w próbce krwi w przedziale stężeń od około 40 do 400 mg/dl. Kompozycja segmentu regulatora czasowego zawiera nadmiar składnika (takiego jak oksydaza glukozy), który przekształca glukozę w nadtlenek wodoru, oraz glukozy. Kompozycja regulatora czasowego powinna zawierać wtedy co najmniej tyle lub więcej inhibitora niż zawiera go segment, który ma najwyższe stężenie inhibitora (co odpowiada najwyższemu odczytowi glukozy).

Regulator czasowy pełni także ważną funkcję kontroli jakości przez wskazanie, że pasek pomiarowy został uszkodzony pod działaniem wilgoci. Pasek pomiarowy musi pozostać suchy aż do czasu jego użycia, ponieważ składniki, które przekształcają glukozę w nadtlenek wodoru (w ogólności enzymy) mają skłonność do rozkładu pod działaniem wilgoci. Zatem,

189 236 jeżeli pasek jest wcześniej wystawiony na działanie wilgoci, to będzie narażony na uszkodzenie. Uszkodzenie paska pomiarowego nie jest jednak widoczne dla użytkownika, który może używać taki pasek i otrzymywać błędne wyniki. Jeżeli jednak pasek zawiera segment regulatora czasowego, to wystawienie na działanie wilgoci powoduje zmianę barwy regulatora czasowego, która alarmuje użytkownika, że pasek został uszkodzony i nie należy go używać.

Oprócz matrycy zawierającej odczynnik, pasek według wynalazku zawiera dolną warstwę podporową matrycy. Dolna warstwa jest korzystnie arkuszem termoplastycznym, zwłaszcza poliestrowym, zazwyczaj o grubości 0,05-0,2 mm, i ma otwór, przez który próbka krwi może być przyłożona do odpowiedniej strony matrycy. Od tego otworu próbka krwi rozprowadzana jest wzdłuż matrycy. Jeżeli dolna warstwa jest w ogólności nieprzezroczysta, to wtedy w odpowiedniej odległości od otworu do wprowadzania próbki można umieścić jedną lub więcej przezroczystych sekcji okienkowych, a pojawienie się próbki w okienku/okienkach potwierdza, że do paska została przyłożona odpowiednia próbka krwi.

Rozprowadzanie krwi z otworu do wprowadzania próbki do obszarów oznaczania odbywa się z udziałem warstwy pośredniej, która leży pomiędzy warstwą dolną i membraną i jest ewentualnie przyklejona do obydwu z nich. Warstwa pośrednia jest korzystnie arkuszem termoplastycznym, zwłaszcza poliestrowym, o grubości zwykle około 0,05 - 0,2 mm. Zgodnie z jednym z przykładów wykonania wycięcia w warstwie pośredniej prowadzą próbkę wzdłuż paska po ścieżkach niechłonnych na membranie i kierują próbkę do każdego z obszarów oznaczania. Nacięcia w warstwie pośredniej są współliniowe z obszarami oznaczania, tak że każdy obszar oznaczania jest w zasadzie otoczony ściankami warstwy pośredniej. W innym przykładzie wykonania wynalazku warstwa pośrednia ma wydłużoną, w zasadzie prostokątną szczelinę, która prowadzi próbkę krwi po powierzchni membrany do obszarów oznaczania. Szerokość szczeliny wynosi zazwyczaj od około 0,5 do 3 mm.

Korzystną strukturę ścieżek niechłonnych na membranie wytwarza się przez opadnięcie porowatej struktury membrany. Można tego dokonać przez ogrzewanie albo bezpośrednio albo za pomocą lasera lub ultradźwięków, a zwłaszcza przez nacisk. Korzystnym sposobem jest jednak zgniatanie. Zatem membranę zgniata się, aby stała się niechłonna (lecz wciąż hydrofitowa), we wszystkich miejscach z wyjątkiem obszarów oznaczania. W jednym z przykładów wykonania membranę zgniata się pomiędzy dwiema płaskimi płytami, z gniazdami zapobiegającymi zgniataniu się obszarów oznaczania, przy czym korzystne są naciski co najmniej 80.000 kPa. Płyty można ewentualnie ogrzać do temperatury co najmniej około 110°C. Korzystne naciski i temperatury zależą oczywiście od mechanizmu zgniatania i czasu przebywania pod naciskiem, jak również od parametrów membrany. Wartości optymalne można określić drogą rutynowych doświadczeń. Rozwiązanie, w którym membranę zgniata się w taki sposób, daje obszary oznaczania, które rozciągają się w kierunku warstwy dolnej, i stosowane jest ono z ponacinaną warstwą pośrednią, jak omówiono niżej.

Dla dokładnych pomiarów objętość krwi doprowadzonej do powierzchni oznaczania powinna korzystnie być powtarzalna. Jeżeli nacięcia otaczają całkowicie obszary oznaczania, to zakładając szczelność dla płynu pomiędzy warstwą pośrednią i zarówno warstwą dolną, jak i zgniecioną membrana, każdy obszar oznaczania jest związany z zamkniętą cylindryczną przestrzenią, której ścianki utworzone są przez warstwę pośrednią i której końce utworzone są przez membranę i warstwy dolne. Jednakże kanalik rozprowadzania próbki krwi biegnie wzdłuż paska i doprowadza próbkę do każdego obszaru oznaczania. Korzystnie jest, gdy warstwa dolna ma otwory odpowietrzające współliniowe z obszarami oznaczania dla ułatwienia jednorodnego wypełnienia kanalików i obszarów oznaczania. Wysoka precyzja wymaga, aby kanalik rozprowadzający doprowadzał stalą objętość próbki do każdego obszaru oznaczania, lecz potem nie doprowadzać już więcej próbki przynajmniej w ramach czasowych pomiaru - około 1 lub 2 minut, począwszy od około 90 sekund po przyłożeniu próbki krwi. Ponieważ objętość początkowa próbki jest zmienna, to na każdym końcu membrany znajduje się korzystnie warstwa absorbenta do wchłonięcia nadmiaru próbki z końców kanalika rozprowadzającego. Warstwy absorbenta na końcach kanalika również wspomagają wsysanie próbki na długości paska. Korzystne warstwy absorbenta utworzone są z włóknin, dobrze znanym specjalistom.

189 236

Według innego przykładu wykonania wynalazku membrana i warstwa wierzchnia jest prasowana pomiędzy walcami. Warstwa wierzchnia ma otwory dopasowane do obszarów oznaczania i obszary te rozciągają się bez zgniecenia aż do tych otworów W takim rozwiązaniu nie jest potrzebna żadna szczelina, a zgniatania dokonuje się za pomocą walców, z przyłożeniem siły co najmniej około 4450 N. Należy mieć na uwadze, że obszary oznaczania według tego przykładu wykonania rozciągają się w kierunku przeciwnym niż w przykładzie opisanym wyżej. Ponieważ próbka jest ciągnięta do górnej warstwy, otwartej na zewnątrz, to w warstwie dolnej nie stosuje się żadnych otworów odpowietrzających. W przykładzie tym stosuje się warstwę pośrednią, która ma prostokątną szczelinę do prowadzenia próbki do obszarów oznaczania. Ponieważ w tym ukształtowaniu wynalazku otwór dla próbki umieszczony jest blisko końca paska, który ma „wysokoglukozowe” obszary oznaczania, to stosowana jest tylko pojedyncza warstwa absorbenta, blisko przeciwległego końca paska.

Zmiana barwy spowodowana przez glukozę w badanej próbce pojawia się po stronie pomiarowej membrany. W przykładzie wykonania, w którym obszary oznaczania rozciągają się do warstwy dolnej, dogodnie jest nakładać na stronę pomiarową membrany górną warstwę, która ma otwory współliniowe z obszarami oznaczania. Dzięki otworom widoczne są zmiany barwy oraz możliwe jest dojście tlenu do miejsc reakcji. Gdy obszary oznaczania rozciągają się w kierunku przeciwnym, to otwory w górnej warstwie wyznaczają obszary oznaczania podczas procesu zgniatania, jak opisano wyżej. W obydwu przypadkach warstwa górna jest korzystnie arkuszem, zwłaszcza poliestrowym, o grubości zazwyczaj około 0,05-0,2 mm. Warstwa górna może być połączona z membraną, na przykład za pomocą kleju, przy czym warstwa kleju jest ograniczona korzystnie tylko dó obszarów niechłonnych membrany, jeśli zakłócałby on reakcje pomiaru glukozy. Jednakże jeżeli klej nie zakłóca reakcji, to sposób jego nałożenia jest mniej decydujący.

Ponieważ obszary oznaczania, gdy zawierają korzystny odczynnik, ulegają powolnej zmianie barwy przy wystawieniu na działanie światła lub tlenu, oraz ponieważ ewentualny regulator czasowy jest wrażliwy na działanie wilgoci, to paski pomiarowe pakuje się korzystnie w nieprzezroczyste, nie przepuszczające wody i tlenu zamknięcie, takie jak szczelne owinięcie foliowe. Jeżeli paski pakowane są indywidualnie, to w czasie użycia mogą pozostawać w owinięciu zdartym od góry.

Na fig. 1 przedstawiono matrycę 10 według niniejszego wynalazku do pomiaru ilości glukozy w krwi. Jakkolwiek pokazana w położeniu zgięcia, to matryca 10 jest elastyczna i przy stosowaniu w ogólności płaska. Matryca ma stronę 12 próbki, do której przykłada się próbkę krwi oraz stronę pomiarową 14, na której lub blisko której zmiana barwy wskazuje na obecność glukozy. Zmiana barwy dokonuje się na skutek oddziaływania glukozy z odczynnikiem wsączonym w pory 16. Do pomiaru stężenia glukozy we krwi wielkości porów są korzystnie większe w pobliżu strony 12 próbki matrycy i zmniejszają się w miarę zbliżania się do strony pomiarowej 14 matrycy.

Gradient wielkości porów służy do wyłapywania czerwonych ciałek krwi blisko strony 12 próbki matrycy, tak że ich barwa nie zakłóca obserwowania zmiany barwy, która wskazuje na obecność glukozy. Schematycznie pokazane są trzy równoległe segmenty a, b i c, przy czym każdy następny segment zawiera więcej inhibitora niż segment poprzedni. W korzystnym przykładzie wykonania, po nałożeniu odczynnika na membranę w równoległych segmentach, jak przedstawiono na fig. 1, membranę zgniata się we wszystkich miejscach z wyjątkiem obszarów oznaczania, w których ma miejsce reakcja glukoza-odczynnik. Jedno z rozwiązań wzoru chłonnych obszarów oznaczania - pojedynczy obszar w każdym z równoległych segmentów - i niechłonnych obszarów zgniecionych przedstawiono w widoku z góry na fig. 2, a ich powiększony fragment w widoku perspektywicznym na fig. 3.

Na fig. 2 przedstawiono stronę 12 próbki membrany 10 w widoku od dołu, w częściowym wycięciu oraz warstwy absorbenta, 20 i 22, z nałożoną warstwą pośrednią 24 i warstwą dolną 26. Membrana 10 i warstwy absorbenta, 20 i 22, korzystnie opierają się na warstwie górnej, nie pokazanej. Warstwy absorbenta, 20 i 22, korzystnie znajdują się przy końcach membrany (poza liniami kreskowymi A i B) pochłaniając nadmiar objętości próbki krwi, jaka jest konieczna do pomiaru. Objętość ta musi być dostatecznie duża do doprowadzenia próbki do każdego z obszarów oznaczania i, jeżeli jest obecny, również do obszaru regulatora czaso14

189 236 wego. W ogólności pasek, który ma mniej obszarów oznaczania nie wymaga tak dużej próbki, lecz obejmuje mniejszy zakres wartości glukozy i ewentualnie daje mniejszą dokładność. Na fig. 2 przedstawiono 9 obszarów chłonnych, reprezentujących 8 obszarów oznaczania (ponumerowanych od 1 do 8) oraz regulator czasowy T, który zapewnia odpowiedni przedział i dokładność, nie wymagając niemożliwej do przyjęcia dużej objętości próbki. Warstwa pośrednia 24 ma nacięcie 28, które jest współliniowe z otworem 30 do próbki w warstwie dolnej 26. Próbkę wprowadza się przez otwór 30 i kieruje poprzez działanie kapilarne wzdłuż centralnego kanaliku 32 warstwy pośredniej 24 do każdego obszaru oznaczania i obszaru regulatora czasowego, przy czym nadmiar próbki jest pochłaniany w warstwie absorbenta 20 i 22. Ukazanie się próbki w ewentualnych przezroczystych okienkach 34 i 35 potwierdza, że dostateczna ilość próbki została dostarczona do pomiaru. Warstwa pośrednia 24 tworzy korzystnie uszczelnienie ze stroną 12 próbki membrany, tak, że próbka nie może na przykład płynąć bezpośrednio pomiędzy przyległymi obszarami oznaczania.

Na fig. 3 przedstawiono powiększony fragment, w widoku perspektywicznym, części 3 obszarów oznaczania 6, 7 i 8, widocznych przez warstwę dolną 26 i oddzielonych palcami od warstwy pośredniej 24. Ewentualna warstwa klejowa 24a łączy warstwę pośrednią 24 z warstwą dolną 26 i membraną 10. Otwory wentylacyjne 40 w warstwie 26 ułatwiają przepływ próbki do paska. Otwory, takie jak 38, w warstwie wierzchniej 36 znajdują się w jednej linii z chłonnymi obszarami, umożliwiając widoczność każdej zmiany barwy w obszarze chłonnym oraz wpuszczanie tlenu koniecznego do reakcji zmiany barwy. Ewentualna warstwa klejowa 36a łączy wierzchnią warstwę 36 ze stroną pomiarową membrany 10.

Na fig. 4 przedstawiono warstwę górną 36 w przekroju poprzecznym wzdłuż linii 4-4 na fig. 2, dodatkowo do warstw pokazanych na fig. 2. Otwory odpowietrzające w warstwie dolnej 26, takie jak otwory 40, są współliniowe z obszarami oznaczania i regulacji czasowej i ułatwiają wypełnienie przez próbkę przestrzeni otaczającej każdy z tych obszarów. Wypełniane przestrzenie związane są przez membranę 10, warstwę pośrednią 24 i warstwę dolną 26. Należy mieć na uwadze, że kolumnowy obszar oznaczania 3 rozciąga się w kierunku warstwy dolnej 26, a minimalny odstęp pomiędzy obszarem oznaczania i warstwą dolną wynosi typowo tylko około 12 mikrometrów Dla jasności pokazany odstęp jest większy niż wynikałoby to ze skali.

Na fig. 5 przedstawiono pasek według wynalazku w widoku od dołu, z próbki 30 otworem i wskazaniem użytkownikowi miejsca wprowadzenia próbki przez ten otwór. Gdy próbka jest widoczna przez przezroczyste okienka 34 i 35, to jest to znakiem potwierdzenia, że do paska została przyłożona odpowiednia próbka krwi.

Na fig. 6 przedstawiono górną warstwę 36 w widoku z góry paska, który tak skalibrowano, aby powiązać obszary oznaczania ze stężeniem glukozy.

Na fig. 7 przedstawiono pasek z fig. 6 po umieszczeniu próbki krwi w otworze 30 (fig. 2), rozprowadzeniu jej wzdłuż kanalika centralnego 32 i przereagowaniu próbki z odczynnikiem w obszarach oznaczania. Ponieważ dolny obszar oznaczania ma najmniej inhibitora, to zmieni on barwę jako pierwszy. Następnie zmienia barwę obszar drugi, a potem trzeci. Górne okręgi nie zmieniły barwy, ponieważ w próbce było za mało glukozy. Ponieważ upłynęło dostatecznie wiele czasu dla zmiany barwy obszary 42 regulatora czasowego, to pasek może już być odczytywany. Zatem wynik przedstawiony na fig. 7 wskazuje, że stężenie glukozy wynosi co najmniej 120 mg/dl, lecz mniej niż 150 mg/dl. Odczytu można dokonać w każdym czasie po zmianie barwy obszaru 42 regulatora czasowego. Należy mieć na uwadze, że na fig. 7 barwa na skutek reakcji z glukozą zmienia się od białej do kolorowej. Układ mógłby pracować alternatywnie z barwnikiem indykatorowym, który jest rozkładany przez utlenianie indukowane glukozą, z odpowiednią zmianą barwy od białej do kolorowej.

Na fig. 8 przedstawiono inny przykład wykonania paska według wynalazku, w postaci wycięcia w widoku perspektywicznym. Warstwa dolna 126 ma otwór 130 do wprowadzenia próbki krwi. Inaczej niż w rozwiązaniu przedstawionym na fig. 2, gdzie otwór 30 jest usytuowany blisko środka (koniec do końca) paska, otwór 130 korzystnie usytuowany jest blisko końca paska, który ma obszary oznaczania do wskazania glukozy o wysokim stężeniu, jak również ewentualnie regulator czasowy. Usytuowanie otworu próbki w tym końcu daje dwie korzyści. Po pierwsze, czas potrzebny do pomiaru glukozy skraca się na skutek skróconego czasu dla osiągnięcia przez krew obszarów oznaczania o „wysokiej zawartości”

189 236 glukozy (co wymaga najdłuższej reakcji). Po drugie, zmniejsza się zmienność regulatora czasowego, ponieważ próbka jest w zasadzie przykładana bezpośrednio do regulatora czasowego, co eliminuje zmienność czasu dojścia próbki do regulatora czasowego. Warstwa pośrednia 124 ma wydłużoną szczelinę 132, która biegnie wzdłuż paska od wycięcia, które w ogólności odpowiada otworowi do 130 wprowadzania próbki i jest z nim współliniowe. Szczelina kanalizuje próbkę krwi wzdłuż paska, po membranie 110, w kierunku warstwy absorbenta 120. W miarę przechodzenia próbki po membranie 110, jej część odkłada się w regulatorze czasowym T' i w każdym z ośmiu obszarów oznaczania (ponumerowanych od 101 do 108). Regulator czasowy i obszary oznaczania, każdy jest widoczny przez odpowiadające im otwory w warstwie górnej 136, które są z nimi współliniowe. Ukazanie się kiwi w przezroczystym okienku 135 potwierdza, że dostarczono do pomiaru odpowiednią ilość krwi.

Na fig. 9 przedstawiono pasek z fig. 8 w widoku od dołu, na którym opuszczono rysunek (jak pokazano na fig. 5), który wskazuje użytkownikowi wprowadzenie próbki przez otwór 130 w warstwie dolnej (i współliniowy otwór 128 w warstwie pośredniej).

Na fig. 10 przedstawiono warstwę górną 136 w widoku od góry, który pokazuje grafika regulatora czasowego, jak również kalibrowanie obszarów oznaczania.

Na fig. 11 przedstawiono górną warstwę 136, membranę 110, warstwę pośrednią 124 i warstwę dolną 126 z fig. 10 w przekroju poprzecznym wzdłuż linii 11-11. Strzałka wskazuje kierunek wprowadzenia próbki do otworu 130 w warstwie dolnej 126 i współliniowego otworu 128 w warstwie pośredniej 124. Należy nadmienić, że kolumnowy obszar regulatora czasowego T' rozciąga się w kierunku do góry, a zwłaszcza w kierunku odpowiedniego otworu 138, który jest współliniowy z regulatorem czasowym T' i jest jednym z dziewięciu otworów w warstwie górnej 136, które są współliniowe z odpowiednim regulatorem czasowym i obszarami oznaczania.

Dla lepszego zrozumienia niniejszego wynalazku przedstawiono następujące przykłady wykonania ilustrujące wynalazek.

Przykład I - indykatorBPR

Przygotowano następujący roztwór:

Woda destylowana	83,5 g
Sól sodowa EDTA 1% wagowy	23,8 g
Kwas akonitowy	6,0 g
NaOH stały	2,3 g
Crotein SPA	4,2 g
Imidazol	0,6 g
Mannit	3,10 g
Surfactol Ql, 5% wagowo	3,0 g
pH nastawione na 4,80
Alkohol etylowy	40,0 g
PPG-410	28,0 g
Roztwór enzymu:
Kwas akonitowy 0,2 M	27,0 g
Oksydaza glukozowa	165000 lednostek
HRPO	340000 jednostek

Membranę Memtec BTSH 55 pokryto tym roztworem przez zanurzenie, a nadmiar roztworu zgarnięto pręcikiem szklanym. Pokrytą membranę wysuszono w suszarce flotacyjnej w temperaturze 82°C przy umiarkowanym przepływie powietrza, tak że wstęga była w zasadzie sucha po 20 sekundach. Następnie wstęgę przepuszczono przez preparat do drugiego powlekania, opisany niżej. Przygotowano następujące roztwory:

Roztwór podstawowy:

askorbinianu (inhibitora)		Rozcieńczało
Woda destylowana	190 g	370 g
Sól sodowa EDTA, 1%	55 g	107 g
BPR	0,36 g	0,7lg
PolyQuart® H	6g	H,8 g
PPG-410	14,2 g	27,8 g

189 236

Kwas askorbinowy	1,37 g	-
Alkohol etylowy	243 g	477 g
Roztwór regulatora czasowego:
Rozcieńczalnik (według powyższego wzoru)	120 g
Kwas askorbinowy		0,885 g
Roztwór glukozy*		17,25 g

* Roztwór glukozy jest 16,0 g/dl roztworem glukozy w wodzie, pozostawionym do swobodnej rotacji na 24 godziny, przechowywanym w zamrażarce.

Przygotowano następujące rozcieńczenia roztworu podstawowego:

0,0405:1, 0,108:1, 0,236:1, 0,369:1, 0,569:1, 1,260:1. Taki stopniowy wzrost stężenia inhibitora odpowiada stopniowemu wzrostowi stężeń glukozy, jakie przekazują obszary oznaczania. Roztwory te, wraz z roztworem regulatora czasowego, wykorzystano do powlekania „bok do boku” obciążonej enzymem strony membrany o dużych porach, uzyskując osadzenie w przybliżeniu 1,2 x 10⁴ ml na milimetr kwadratowy membrany. Membranę nawilżano w przybliżeniu w ciągu piętnastu sekund przed poddaniem suszeniu w takich samych warunkach, jak opisano dla etapu pokrywania enzymem. Wyniki wskazują, że regulator czasowy reagował w ciągu około 70 sekund, przy czym około 95% wyników przypadało pomiędzy 64 i 79 sekund.

Przykład II- Indykator MBTHSB-ANS
Woda do HPLC	1500 ml
Kwas cytrynowy	g
Cytrynian sodowy	20,88 g
Mannit	15 g
Sól dwusodowa EDTA	L26g
Gantrez S95	6,75 g
Crotein SPA	36 g
Oksydaza glukozowa	L69 megąjednostek
HRPO	megajednossek
Carbopol 910*	75 ml
Cytrynian dwusodowy**	225 ml

* 11% roztwór w acetonitrylu **0,1 M, pH 5,0

Membranę Memtec BTS 35 powlekano w korytku, tak że powierzchnia z dużymi porami stykała się z roztworem powlekającym. Nadmiar roztworu usuwano za pomocą pręcika szklanego, jak uprzednio. Następnie membranę suszono i przepuszczano przez roztwór, jak w przykładzie I.

Przygotowano następujące roztwory:
Roztwór A (indykator)		Roztwór B (środek zwilżający)
Etanol 70% (objętościowo):	2819 ml	Maphos®60A	4l g
MBTHSB	2,98 g	70% etanol (objętościowo)	^^5 ml
(NH4)ANS	25,83 g
Roztwór B	205 ml
2% DTPA	51,25 ml
Roztwór C		Roztwór D
(podstawowy roztwór askorbinianu)	(r^g^ukitor czasowy))
Woda	115 ml	Woda	53 ml
Kwas askorbinowy	4,88 g	Kwas askorbinowy	^7^5 g
Etanol	2βΊ ml	ΕΟηιοΙ	123 ml
		Doprowadzenie do objętości 175 ml za pomocą 70% etanolu Roztwór glukozy 40,5 ml

Dla każdego roztworu inhibitora objętość roztworu A wynosi 263 ml. Dla różnych obszarów oznaczania stosunek 70% etanol : roztwór C zmieniał się od 58,9 do 0,200, tak że ob189 236 jętość 70% etanolu + roztwór C dodana do roztworu A wynosiła 87,5 ml dla wszystkich roztworów inhibitora. Zmieniło to efektywnie tylko stężenie inhibitora w każdym roztworze. Roztwory o rosnących stopniowo stężeniach inhibitora oraz roztwór regulatora czasowego (roztwór D) wprowadzano „bokiem do boku” na stronę membrany o dużych porach. Szybkość osadzania nastawiano tak, aby uzyskać ~8 x 10'⁵ ml inhibitora na milimetr kwadratowy membrany. Membranę wysuszono, jak opisano wyżej, z tym wyjątkiem, że opóźnienie pomiędzy powlekaniem i suszeniem wynosiło około 1,6 minuty. Wyniki wskazywały, że regulator czasowy reagował w ciągu około 60 sekund z małym wpływem hematokrytu z krwi o stężeniu od 30 do 55% albo z glukozą o stężeniu od 78 do 420 mg/dl.

FIG. 2

189 236

FIG.4

189 236

FIG. 5

FIG. 6

FIG. 7

189 236

189 236

FIG. 10

®·400 300® &240 180°® 'ΓΜ>

-&150

120® θ’ 80 °® m^/dL

FIG. 11

189 236

FIG.1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (28)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Pasek pomiarowy odczynnikowy wielowarstwowy do pomiaru stężenia glukozy w próbce krwi przykładanej do paska, zawierający membranę z obszarem chłonnym oraz odczynnikiem do oznaczania glukozy, znamienny tym, że zawiera warstwę dolną (26, 126) z otworem przelotowym (30,130) przyjmującym próbkę, warstwę membrany (10, 110), mającą stronę przykładania próbki zwróconą do warstwy dolnej (26, 126) i przeciwnie skierowaną stronę pomiarową, oraz wiele rozmieszczonych wzdłuż niej dyskretnych, chłonnych obszarów oznaczania (6-8, 101-108) rozdzielonych obszarem niechłonnym, przy czym membrana (10, 110) zawiera odczynnik reagujący z glukozą ze zmianą barwy, składający się z pierwszego składnika, oddziaływującego z glukozą z wytworzeniem nadtlenku wodoru, drugiego składnika, oddziałującego z nadtlenkiem wodoru ze zmianą swej barwy oraz trzeciego składnika, stanowiącego inhibitor zmiany barwy drugiego składnika, oraz pasek zawiera warstwę pośrednią (24, 124) pomiędzy warstwą dolną (26, 126) i warstwą membrany (10, 110), a także element dozujący do rozprowadzenia próbki wzdłuż paska, przy czym element dozujący stanowi kanalik do transportu krwi, ukształtowany w warstwie pośredniej (24, 124) i prowadzący próbkę po powierzchni membrany (10, 110) do chłonnych obszarów oznaczania (6-8, 101-108), zaś stężenie inhibitora wzrasta w zadany sposób z odległością od pierwszego końca paska.
2. 2. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że warstwę dolną (26, 126) stanowi arkusz termoplastyczny.
3. 3. Pasek według zastrz. 2, znamienny tym, że warstwa dolna (26,126) jest poliestrem.
4. 4. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że warstwa dolna (26,126) zawiera ponadto pewną liczbę otworów przelotowych (30, 130), współliniowych z obszarami oznaczania (6-8,101-108).
5. 5. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że warstwa dolna (26, 126) wyposażona jest w przezroczystą sekcję usytuowaną w określonej odległości od otworu przyjmującego próbkę, zapewniającą odpowiednią wielkość próbki.
6. 6. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że warstwę membrany (10, 110) stanowi anizotropowa porowata membrana mająca pory (16), które są większe w pobliżu strony membrany przyjmującej próbkę i mniejsze w pobliżu strony pomiarowej membrany.
7. 7. Pasek według zastrz. 6, znamienny tym, że ma wielkości porów (16) tak dobrane, że czerwone ciałka całej próbki krwi są zatrzymywane w membranie (10, 110).
8. 8. Pasek według zastrz. 6, znamienny tym, że membrana (10, 110) utworzona jest z polisulfonu.
9. 9. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że kanalik do transportu krwi jest w zasadzie prostokątny.
10. 10. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszy składnik odczynnika zawiera oksydazę glukozową.
11. 11. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że drugi składnik odczynnika zawiera peroksydazę i barwnik indykatorowy lub parę barwników, zmieniających barwę podczas utleniania się.
12. 12. Pasek według zastrz. 11, znamienny tym, że peroksydazajest peroksydazą z chrzanu.
13. 13. Pasek według zastrz. 11, znamienny tym, że barwnik indykatorowy lub para barwników jest [3-metylo-2-benzotiazolinonohydrazono]-N-sulfonylobenzenosulfonianem jednosodowym połączonym z 8-anilino-1-naftaleno- sulfonianem amonowym (MBTHSB-ANS).
14. 14. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że trzeci składnik odczynnika stanowi kwas askorbinowy.
15. 15. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że odczynnik zawiera ponadto składnik rozdzielający wybrany z grupy obejmującej glikol polietylenowy, polibezwodnik metylowiny189 236 loetero/maleinowy, glikol polipropylenowy, polikwas styrenosulfonowy, polikwas akrylowy, polialkohol winylowy i polikwas etylenosulfonowy.
16. 16. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że warstwa pośrednia (24, 124) jest arkuszem termoplastycznym.
17. 17. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że warstwa pośrednia (24, 124) jest poliestrem.
18. 18. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że chłonne obszary i niechłonny obszar stanowią odpowiednio nie zgniecione i zgniecione obszary warstwy membrany (10, 110).
19. 19. Pasek według zastrz. 18, znamienny tym, że nie zgniecione obszary chłonne mają postać kolumny, każda z podstawą w membranie (10,110) i przeciwległym do podstawy końcem, który przylega do warstwy dolnej (26,126).
20. 20. Pasek według zastrz. 18, znamienny tym, że nie zgniecione obszary chłonne mają postać kolumny, każda z podstawą w membranie (10, 110) i przeciwległym końcem, który przylega do warstwy górnej (136).
21. 21. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera warstwę górną (36, 136), sąsiadującą z gómą powierzchnią warstwy membrany (10, 110) i mającą otwory przelotowe (38,138), współliniowe z obszarami oznaczania (6-8, 101-108).
22. 22. Pasek według zastrz. 21, znamienny tym, że warstwa membrany (10,110) jest przyklejona do warstwy górnej (36,136).
23. 23. Pasek według zastrz. 22, znamienny tym, że warstwa membrany (10, 110) jest przyklejona do warstwy górnej (36, 136) za pomocą kleju tylko w miejscach ograniczonych do niechłonnego obszaru warstwy membrany (10, 110).
24. 24. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto warstwę absorbenta (20, 22), stykającą się z końcem membrany (10, 110), najbliższym pierwszego końca paska.
25. 25. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto warstwy absorbenta (20, 22), stykające się z każdym końcem warstwy membrany (10, 110).
26. 26. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że otwór przelotowy (130) do przyjmowania próbki znajduje się w pobliżu końca paska, odległego od końca pierwszego.
27. 27. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera element regulatora czasowego (T, T'), zawierający obszar (42) oznaczania, który oprócz odczynnika zawiera także pewną ilość glukozy, powodującą zmianę barwy obszaru (42) w określonym czasie po przyłożeniu próbki do paska.
28. 28. Sposób pomiaru stężenia glukozy w próbce krwi, w którym przykłada się próbkę do paska pomiarowego odczynnikowego, zawierającego membranę z obszarem chłonnym i odczynnikiem do oznaczania glukozy, znamienny tym, że stosuje się pasek pomiarowy odczynnikowy składający się z warstwy dolnej (26,126) z otworem przelotowym (30, 130) przyjmującym próbkę, warstwy membrany (10, 110), mającej stronę przykładania próbki zwróconą do warstwy dolnej (26, 126), i zawierającej pewną liczbę chłonnych obszarów oznaczania (6-8, 101-108), z których każdy zmienia barwę po zetknięciu się z krwią zawierającą co najmniej określoną ilość glukozy, większą niż ilość glukozy, powodująca zmianę barwy obszarów oznaczania, znajdujących się bliżej pierwszego końca paska i elementu dozującego rozprowadzającego próbkę od otworu przelotowego (30, 130) po określonej ścieżce do każdego z obszarów oznaczania (6-8, 101-108), oraz oznacza się stężenie glukozy obserwując zmianę barwy obszaru oznaczania, najbardziej odległego od pierwszego końca paska.