JPS63119695A - 中性脂肪定量用一体型多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、血液など体液中または飲食物中等の中性脂肪
含量を定量分析する乾式分析要素である一体型多層分析
要素に関するものである。

［従来技術］ 水溶液中あ中性脂肪の実質的に乾式の分析要素に関する
血清トリグリセリド量は種々な型の過脂肪結晶、動脈硬
化症等の診断に重要である。中性脂肪を分解してグリセ
ロールとし、グリセロールを酵素的に分解し光学濃度、
電気的に測定する方法が一般的になりつつある。

現在一般に行なわれる方法としては、 （１）グリ七ロールー３−燐酸オキシダーゼを用いる方
法。

（２）グリセロールデヒドロゲナーゼを用いる方法。

（３）グリセロール−３−燐酸デヒドロゲナーゼを用い
る方法、 かある。

三者はいづれも一長一短があり、使用にあたってはＩＲ
が必要である。オキシダーゼ法は、ビリルビン、ヘモグ
ロビン、アスコルビン酸のような還元物質の影響が強く
出ろ。また、グリセロールデヒドロゲナーゼ法は、反応
に長い時間を必要とする。また、デヒドロゲナーゼ系は
、妨害物質に対しては影響は少ないが、（１）ＮＡＤを
ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰをＮＡＤｐＨ）に変える系て
は紫外部に吸収があり、測定装置が高価になる。

（２）可視領域に吸収をもたせるために、テトラゾリウ
ム塩を用いた場合、フローセル等の汚染か問題になり′
ｉＪＬ続フロー法には導入しかたい。そのため、臨床検
査上のルーティンとしてａ　Ｈの血液試料を用いて簡便
に単時間に分析でき自動操作も可能な中性脂肪分析方法
が望まれている。

しかし、醜化型補酵素、電子伝達性化合物、電子受容性
化合物の王者を共存させておくと、日時の経過とともに
反応の感度は著しく悪化する。特に特公昭５３−２１６
７７号公報、特開昭５５−１６４３５６号公報、特開昭
６０−２２２７６９号公報に記載されたような乾式一体
型多層分析要素に上記反応系を組入れるとき、この問題
に直面する。

特開昭４９−１１３９５号公報では、上記三成分のうち
電子伝達性化合物を異なる層に配置することを提案して
いる。また特開昭５９−４４６５８号公報では、電子伝
達剤と色素形成物質とを、互いに実質的に反応しえない
ように疎水性物質を親水性分散媒中に分散する方法を開
示している。

特開昭５９−８８０９６号公報では、上記三成分のうち
電子伝達性化合物と色素形成性前駆物質（電子受容性化
合物で、前記の色素形成物質と同じ）とを互いに実質的
に反応しえないように、前記特開昭４９−１１３９５号
公報におけると同様に別異の層に配置すると１両者を別
々の粒子として同一の層に配置することを提案している
。しかし、このように電子伝達性化合物を他の二要素か
ら分離すると、検出反応の進行は分離された試薬（特に
電子伝達性化合物）の拡散速度で支配されるため、反応
速度、したがって検出感度の低下をまねく。

上記ＮＡＤＨ（またはＮＡＤｐＨ）検出組成物を乾式一
体型多層分析要素（例えば特公昭５３−２１６７７号公
報、特開昭５５−１６４３５６号公報、特開昭６０−２
２２７６９号公報に記・成の自動化学分析用多層分析素
子）の試薬層に適用すると、組成物の染料形成速度は常
温の保存て数週間以内にイ以下になることか見出された
。この原因を究明すると、特開昭５７−１３２０６１号
公報で言及しているような電子受容性化合物の劣化が原
因ではなく、主たる原因は、補酵素ＮＡＤ（またはＮＡ
ＤＰ）の劣化にあることがわかった。緩衝液中の補酵素
の劣化を防ぐ方法として特開閉５９−８２３９８号公報
に開示されたようなキレート化剤とアジ化物を併せて添
加する方法が知られている。しかし、爆発性および毒性
を有するアジ化物を用いなければ効果が挙がらず、安全
上および公害の点から好ましくない。

補酵素ＮＡＤ　（又はＮＡＤＰ）の保存時の劣化を防止
するためには、補酵素を含む試薬層は塗設時を含めて中
性近傍のｐＨ値が好ましいことが知られている。また、
ジアホラーゼはｐＨ約６．０未満は失活することが知ら
れている。一方で、脱水素酵素が関与する反応において
は、アルカリ性ｐＨ値が好ましいことも知られている。

しかし、これらの相反するｐＨ条件を同時に満たす乾式
分析要素又は一体型多層分析要素は従来提案されていな
い。

［発明の要旨］ 本発明の目的は微量の検体を用い、中性脂肪を迅速かつ
正確に測定する方法である。

本発明は酸化型ニコチンアチミド補酵素、ＡＴＰ、テト
ラゾリウム塩、グリセロールキナーゼ、グリ七ロールー
３−燐酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼを含むグリセ
ロール検出用呈色試薬組成物を含有するグリセロール検
出用呈色試薬層（以下、単に呈色試薬ということがある
）と織物または編物からなる展ＩＭ層にリポプロテイン
リパーゼ、アルカリ性ｐＨＨ衝剤またはアルカリ剤を配
置することで保存性を向上し、少量検体を迅速かつ正確
に測定することが可能な一体型乾式分析要素である。

［発明の詳細な記述］ 本発明は基本的には少なくとも呈色試薬層、展開層があ
ればよいか、 反射層、多孔質展開層、光遮蔽層、濾過層、検出層（ｒ
ｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ　１ａｙｅｒ）　、吸水層、支
持体、下塗層および業界公知のその他の層を含む多重層
であってもよい。かような分析要素には米国特許第３９
９２１５８号および同４０４２３３５号各明細書に開示
のものがある。

支持体を用いる場合、実用的に好ましい構成は、 （１）支持体上に呈色試薬層を兼ねる展開層を有するも
の （２）支持体上に吸水層、その上に呈色試薬層を兼ねる
展開層を有するもの （３）支持体上に試薬層と展開層を有するもの（４）支
持体上に吸水層、呈色試薬層、展開層をこの順に有する
もの （５）支持体上に呈色試薬層、反射層または濾過層、展
開層をこの順に有するもの （６）支持体上に吸水層、呈色試薬層、鑓過層、展開層
をこの順に有するもの などである。

本発明の乾式分析要素において少なくとも一層のグリセ
ロール検出用呈色試薬層に、酸化型ニコチンアミド補酵
素が含まれる。酸化型ニコチンアミド補酵素とは、具体
的には、ＮＡＤ＋　　にコチンアミド・アデニンジヌク
レオチド酸化型）またはＮＡＤＰ＋　にコチンアミド・
アデニンジヌクレオチド・ホスフェート酸化型）を意味
する。

本発明の乾式分析要素において少なくとも一層の試薬層
に含まれるグリセロール検出試薬組成物には、電子伝達
性化合物を含む。本発明において電子伝達性化合物とは
、被検物質の反応により生成した還元型ニコチンアミド
補酵素（電子供与体）から電子を受は取って、後述する
電子受容性染料形成性化合物を還元する機渣を有する化
合物を意味する。上記電子伝達性化合物の具体例として
は、５−メチルツェナジニウム・メチルスルフェートあ
るいはｌ−メト、キシ−５−メチルツェナジニウム・メ
チルスルフェート等のＮ−メチルフェナジン・メトサル
フェート類およびジアホラーゼ（ジヒドロリボアミドレ
ダクターゼ、Ｅ　Ｃ１，６゜４、：１１．）等を挙げる
ことができる。

本発明の乾式分析要素に用いられる呈色試薬組成物には
、さらに電子受容性染料形成性化合物が含まれる。電子
受容性染料形成性化合物は、上記電子伝達性化合物によ
り還元され、長波長田域において検出可能な化合物（染
料）を形成する物質である。本発明の乾式分析要素にお
いて、電子受容性染料形成性化合物は、テトラゾリウム
塩な川いることが好ましい。テトラゾリウム塩の具体例
としては、 ３．３’　−（３，３’−ジメトキシ−４゜４′−ビフ
ェニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロフェニル−２Ｈ−
テトラゾリウムクロイドコ（＝ＮＢＴ）。

３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニ
ル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド
（＝ＩＮＴ）。

３−　（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２Ｈ−
テトラゾリウムプロマイト（＝ＭＴＴ）。

３．３’　−（４，４°−ビフェニレン）−ビス（２，
５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド： ３．３′−（３，３’−ジメトキシ−４，４゛−ビフェ
ニレン）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾ
リウムクロライド；および３．３’　−（３，３’−ジ
メトキシ−４，４′−ビフエニレン）−ビス［２，５−
ビス（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムク
ロライドを挙げることができる。

なお、上記耐化型ニコチンアミド補酵素、電子伝達性化
合物および電子受容性染料形成性化合物を含む反応系の
詳細については、 Ａ、　Ｌ、　Ｂａｂｓｏｎ等によるクリニカ・キミカ・
アクタ［ＣＬＩＮＩＣＡ　Ｃ旧ＭｆＣＡ　ＡＣＴＡＩ　
ｌ　２巻（１９６５）２１０−２１５頁： １１、　Ｊ、　Ｇａｙ等によるクリニカル・ケミストリ
ー［ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＣＩＩＥＭＩＳＴＲＹ］　Ｖｏ
ｌ、１４．　Ｎｏ、　８　、１９６８．７４０−７５３
頁；および、 Ｒ，Ｄ、　Ｃａｐｐｓ　ＩＩ等によるクリニカル・ケミ
ストリー、Ｖｏｌ、１２．　Ｎｏ、　７　、　１９６６
、４０６−４１３頁：等の文献に記載されている。

本発明の乾式分析要素において少なくとも一層の呈色試
薬層には、グリセロールキナーゼ（ＥＣ２，７，１，３
０）はバクテリア由来、Ｃａｎｄｉｄａ　Ｂｃｏｄｅｒ
ｍａ由来、臓器由来のものか用いることかでき、５００
〜１万Ｕ　／　ｍ″の範囲で用いるのか好ましい。

グリセロールキナーゼの反応に必要なマグネシウムイオ
ンは塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等が用いるこ
とができ、マグネシウムイオン換算で５０〜６００ｍｇ
イオン／ｒｎ’の範囲で用いることができる。

ＡＴＰは０．３〜５ｇ／ｒｒｆの範囲で用いるのが好ま
しい。グリセロール−３−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ　
Ｃ１，１，９９，５）は臓器由来、５ｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ｆａｅａｌｉｓ、、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕ＋＊　ａｒａｂｉｎｏｓｕｍ由来等が用いる
ことができ１千〜３万Ｕ／ｍ’で用いるのかよい。補酵
素として用いるＮＡＤ”あるいはＮＡＤＰ”は５０ｍｇ
／ｍ’〜２．Ｏｇ／ｒｒｒ′の範囲て使用するのか好ま
しい。電子伝達性化合物は５−メチルツェナジニウムメ
チルスルフェートのような化学合成物とジアホラーゼの
ような天然物のいづれも用いることか可能である。５−
メチルツェナジニウムメチルスルフェートは２００　ｍ
　ｇ　／ゴ〜１．Ｏｇ−ｒｎ’で用いるのが好ましく、
ジアホラーゼ　（Ｅ　Ｃ１，６，４，３）は臓器由来Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｌｈｃｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ、　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　Ｋｌｕｙｖｅｒｉ山来
等のものか由来てき５００〜２万Ｕ／ｒｒｆて用いるの
か好ましい。テトラゾリウム塩は５０　ｍ　ｇ　／　ｒ
ｒｒ’〜１．０ｇ／ｒｎ”で用いるのか好ましい。

検出試薬は第一検出試薬層、第二検出試薬層のように分
けて塗布してもよい。

特にＮＡＤゝとテトラゾリウム塩を同一塗布液で溶解し
た場合にカブリか生じ易いので二つの塗布液に分けて二
層に塗布すると調液時のカブリか低減されて、多層分析
要素のバッククラランドの着色光学濃度が低下するとい
う好ましい効果かある。

本発明の乾式分析要素に用いることがてきる光透過性・
水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリス
チレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテ
ート、セルローストリアセテート、セルロースアセテー
トプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０
ｐｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０鉢ｍから約３００
７ｚｍの範囲のフィルム、もしくはシート状の透明支持
体を挙げることかてきる。

本発明の吸水層、呈色試薬層、濾過層、光遮蔽層または
光反射層に用いられる親水性ポリマーは、一般には、水
吸収時の膨潤率が３０°Ｃで約１．５〜２０、好ましく
は約２．５〜１５の範囲の天然または合成親水性ポリマ
ーである。そのような親水性ポリマーの例としては、ゼ
ラチン（例、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、
脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化
ゼラチン等）、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリ
ビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等を挙げるこ
とかできる。さらに必要に応じて、界面活性剤（カチオ
ン性、両性または非イオン性の界面活性剤）を含有させ
ることもできる。

光遮蔽層は、皮膜形成源を有する親水性ポリマーをバイ
ンダーとして、光反射性微粒子か分散されている水浸透
性の層であることか好ましい。光反射性微粒子は、試薬
層（または吸水層）に生じた検出可ス距な変化（色変化
、発色等）を光透過性を有する支持体側から反射測光す
る際に、展開層に点着供給された水性液体の色、特に試
料か全血である場合のヘモグロビンの赤色等を遮蔽する
とともに光反射層または背景層としても機能する。

光反射性を有する微粒子の例としては、二酸化チタン微
粒子、硫酸バリウム微粒子か好ましい。

本発明において、必要に応じ展開層中にも上記のごとき
光遮蔽性微粒子を含有させてもよい。

吸水層、光遮蔽層、濾過層、試薬層等の層の上には、展
開層を接着し積層するための接着層を設けてもよい。接
着層は水で湿潤しているとき、または水を含んて膨潤し
たときに展開層を接着することができるような親水性ポ
リマーからなることか好ましい。接着層に用いることが
てきる親水性ポリマーの例としては、吸水層に用いられ
ると同様な親水性ポリマーか挙げられる。これらのうち
ではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等
が好ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約０．５ｐｍ〜
約２０ルｍ、好ましくは約１ルｍ〜約１０ルｍの範囲で
ある。なお、接着層は検出層上以外にも、他の居間の接
着力を向上させるため所望の層上に設けてもよい。接着
層は親水性ポリマーと、必要によって加えられる界面活
性剤等を含む水溶液を公知の方法で、試薬層等の上に塗
布する方法などにより設けることができる。

展開層とは、その表面に点着供給された液体試料を、そ
の中に含有している成分を実質的に偏在させることなく
、横（水平）方向に単位面積当りほぼ一定量の割合で広
げる作用を有するものである。

展開層のマトリックスを構成する材料としては、試薬類
の保持性の点で、織物生地および編物生地に代表される
繊維質層を用いることが特に好ましい。

本発明の乾式分析要素に用いることができる織物生地ま
たは編物生地は水洗等の脱脂処理により少なくとも糸製
造時、織物製造時あるいは編物編成時に供給または付着
した油脂類を実質的に除去した編物またはｍ物生地が好
ましい。

上記織物または編物生地を一体型多層分析要素の展開層
として用いる場合には、さらにその織物または編物生地
に特開昭５７−６６３５９号公報に開示の物理的活性化
処理（好ましくはグロー放゛屯処理またはコロナ放電処
理等）を生地の少なくとも片面に施すか、あるいは特開
昭５５−１６４３５６号、４．′！開開閉７−６６３５
９号公報等に開示の親水性ポリマー含浸処理等の親木化
処理またはこれらの処理工程を逐次実施することにより
織物または編物を親水化し、下側（支持体に近い側）の
層との接着力を強化することかてきる。

織物または編物生地からなる一体型多層分析要素の展開
層を前述した吸水層または接着層に接着、積層するには
、特開昭５５−１６４３５６号および特開昭５７−６６
３５９号各公報等辺開示の方法に従って作成することか
てきる。すなわち、吸水層または接着層の塗布後未乾燥
のうちに、または乾燥後の層に水（または界面活性剤を
少量含む水）を実質的に均一に供給して層を膨潤させ、
ついてａ物または編物生地を湿潤または膨潤している層
の上に実質的に均一に軽く圧力をかけながら接着、積層
し一体化する。

展開層の他に試薬層、吸水層、反射層、接着層等にも界
面活性剤を含有させることができる。その例としてノニ
オン性界面活性剤がある。ノニオン性界面活性剤の具体
例としては、ｐ−オクチルフェノキシポリエトキシエタ
ノール、ｐ−ノニルフェノキシポリエトキシエタノール
、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレート、ｐ−ノニルフェノキ
シポリグリシドール、オクチルグルコシド等がある。ノ
ニオン性界面活性剤を展開層に含有させることにより水
性液体試料の展開作用（メータリング作用）がより良好
になる。ノニオン性界面活性剤を試薬層または吸水層に
含有させることにより分析操作時に水性液体試料中の水
が試薬層または吸水層に実質的に一様に吸収され易くな
り、また展開層との液体接触が迅速にかつ実質的に一様
になる。

アナライトである中性脂肪はポリマーバインダーの均一
な塗布層を通過し難いので、多孔性展開層に検出用試薬
成分の一部、特に加水分解酵素であるリポプロテインリ
パーゼを含有させることが好ましい。展開層に含有させ
るリポプロティンリパーゼ（Ｅ　Ｃ３，１，１３４）は
臓器由来Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ等が用いられ２５０〜
１万Ｕ／ｒｎ’で用いられることが好ましい。

展開層に含有されるアルカリ性緩衝剤またはアルカリ剤
としては、２−アミノ−２メチル−１゜３−プロパンジ
オール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジ
オール、ジェタノールアミン、エタノールアミン、２−
アミノ−２メチル−１−プロパンジオール、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン、トリメデルアミン等が
挙げられる。このほかに用いうる緩衝剤としては、日本
化学会編「化学便覧　基礎編」　（東京、丸首■、１９
６６年発行）　１３１２−１：１２０頁　Ｒ，Ｍ、Ｃ，
Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａ１編ｒ　Ｄａｔａ　ｆｏｒ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｊ第２版（
Ｏｘｆｏｒｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐ
ｒｅｓｓ、１９６９年発行）４７６−　５０８頁、ｒ　
Ｂｉｏｃｈｅ＋＊１ｓｔｒｙＪ　５．４６７頁以降（１
９６６年）　、　　ｒ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　Ｊ　　！コ）４−：１００−
３１０頁（１９８０）等に記載のｐ）（緩衝剤系かある
。

多孔性展開層には水性液体試料を多孔性展開層において
展開しすぎないように制御する目的で、親水性ポリマー
および／または界面活性剤を含有させることが好ましい
。

用いうる親水性ポリマーの例としてポリビニルピロリド
ン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリ
アクリル酸、親水性セルロール誘導体等などがある。親
水性セルロース誘導体は炭素原子数１〜３の低級アルキ
ル基、または炭素原子数１から４のヒドロキシ基ご換低
級アルキル基により水酸基の一部または全部かエーテル
化されたセルロースエーテル類である。セルロースエー
テルの例として水溶性であるメチルセルロース、エチル
セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒトロキシ
グロピルメチルセルロース、ヒトロキシフチルメチルセ
ルロースが挙げられる。これらのなかで好ましい親水性
ポリマーはポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコー
ル、および水溶性セルロースエーテル類か好ましい。親
水性ポリマーは２種以上を併用することかできる。親水
性ポリマーの多孔性展開層に３ける含有量は多孔性展開
層ｌゴ当り約０．５ｇ〜約１５ｇ、好ましくは約０．７
ｇ〜約１０ｇの範囲である。

界面活性剤としてはノニオン性、カチオン性、アニオン
性、または両性の界面活性剤の中から適宜に選択して用
いることかできる。これらのうちては、一般的にはノニ
オン性界面活性剤か好ましい。ノニオン性界面活性剤は
多価アルコールエステルエチレンオキシト付加物（縮合
物）、ポリエチレングリコールモノエステル、ポリエチ
レングリコールジエステル、高級アルコールエチレンオ
キシド付加′ｊ３１Ｊ（縮合物）、アルキルフェノール
エチレンオキシド付加物（縮合Ｔｈ）および高級脂肪酸
等がある。これらのノニオン性界面活性剤は２種以上を
組合せて用いることかできる。ノニオン性界面活性剤を
親水性セルロース誘導体とＭ１合せて用いる場合にはｔ
ＩＬＢ値１０値上０以上か好ましい。

多孔性展開層におけるノニオン性界面活性剤の含有量は
１ｒｒｒ’当り約０６１〜約３ｇ、好ましくは約０．２
〜〜約２ｇの範囲である。

多層分析要素にはこれら以外にも層を設けることかでき
る。支持体と試薬層の間には吸水層を設けることがてき
る。吸水層は水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを主
成分とする層であって、吸水層の界面に到達または浸透
した水性液体試料の水を吸収てきる層であり、全血試料
を用いる場合には水性液体成分である結晶の試薬層への
浸透を促進する作用を有する。吸水層に用いられる親水
性ポリマーは前述の試薬層に用いるもののなかから選択
すればよい。一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘導体
、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールを用いる
のか好ましく、これらのうちてはゼラチン（脱イオンゼ
ラチン）が最も好ましい。

吸水層の乾燥時の厚さは約３Ｂｍ〜約１００ルｍ、好ま
しくは約５ｕＬｍ〜約３０１Ｌｍの範囲、被覆量では約
３ｇ／ｒｒｆ〜約１００ｇ／ゴ、好ましくは約５ｇ／ｒ
ｒｆ〜約３０ｇ／ｍ″の範囲である。吸水層には後述す
るｐＨ緩衝剤、公知の塩基性ポリマー等を含有させて使
用時（分析操作実施時）のｐＨを調節することができる
。

展開層と試薬層の間にはまた光遮蔽層（または光反射層
）を設けることもできる。光遮蔽層は吸水層に用いられ
るのと同様な親水性ポリマーバインダーまたは架橋され
た親水性ポリマーバインダーに二酸化チタン、硫酸バリ
ウム等の光反射性微粒子を分散含有させることによって
試薬層側から入射してきた光を反射する層であり、これ
によって展開層中の血液等の水性液体試料の色を遮蔽し
て安定なパックグラウンドを与える層である。この光遮
蔽層には一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘導体、ポ
リアクリルアミド、ポリビニルアルコール等を用いるの
が好ましく、これらのうちてはゼラチン（特に脱イオン
ゼラチン）か最も好ましい。光遮蔽層に用いられる親水
性ポリマーは公知の架橋剤（硬化剤）を用いて適宜に架
橋硬化された反射層とすることができる。光遮蔽層の乾
燥時の厚さは約５ｐｍ〜約５０ｇｍ、好ましくは約７ｇ
ｍ〜約３０１Ｌｍの範囲、被覆量では約５ｇｍ’〜約５
０ｇｒｎ’、好ましくは約７ｇ／ｒｒｆ〜約３０ｇ／ゴ
の範囲である。

光遮蔽層の上には展開層を強固に接着一体化する目的て
ゼエラチンに代表される吸水層に用いられるのと同様な
親水性ポリマーからなる公知の接着層を設けることがで
きる。接着層の乾燥時の厚さは約０．５ｐｍ〜約５４ｍ
の範囲である。

本発明の軟式分析要素は、一体型多層分析要素とした場
合には、−通約１５　ｍ　ｍから約３０　ｍ　ｍの正方
形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特開昭
５７−６３４５２号、特開昭５４−１５６０７９号、実
開昭５６−１４２４５４号、実開昭５８−３２３５０号
および特開昭５８−５０１１４４号各公報等等間示のス
ライド枠等に納めて分析スライドとして用いるのが製造
、包装、輸送、保存および測定操作等の全ての観点で好
ましい。

本発明の乾式分析要素は、約５牌文から約３０ＪＬｌ、
好ましくは約８ル見から約１５μ文の水性液体試料を展
開層に点着供吸し、必要に応じて約２０℃から約４５℃
の範囲の実質的に一定の温度でインクベーションする。

その後、一方の側から（一体型多層分析要素においては
光透過性支持体側から）乾式分析要素内の色変化１発色
等の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理により液
体試料中の測定対象成分を分析する。

以下に本発明の実施例および比較例を示す。

［実施例１］ ゼラチン下塗りの施された厚さ１８０７ｚｍの無色透明
ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム上に下
記被覆量になるように中性脂肪検出用呈色試薬層を水溶
液を用いて塗布し、乾燥して設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　２２ｇ／ｒｒｒ’ノニル
フェノキシ ポリエトキシエタノール （平均１５オキシエチレン含有）ｌｏｏｍｇ／ｍ’ＡＴ
Ｐ　　　　　　　　　　　　１．９ｇ／ｒｎ’Ｊｉ＆酸
マグネシウム　　　　　１．６ｇ／ゴＮＡＤ　　　　　
　　　　　　　３６０ｙｒｇ／ＩＴＴｌコ、３’−（３
，：ｌ’−ジメトキシ−４，／ｌ’ｌビーェニレン）−
ビス［２−（ｐ−ニトロフェニル）　−２１１−テトラ
ゾリウム］ジクロリド　　　　　　　７２０　ｍｇ／ゴ
ジアホラーゼ （ＥＣ１，６，４，３）　　　　　　　７７００　Ｕ／
ゴクリセロールキナーゼ （Ｅ（？　２．７．１．３０）　　　　　　２５００　
Ｕ／ｒｒｒ’グリセロール−３−燐酸 デヒドロゲナーゼ （ＥＣ１，１，９９，５）　　　　　１５０００　Ｕ／
ｒｎ’呈色試薬層の上に下記の被Ｔｎ量になるようにし
て光遮蔽層を水分散液を用いて塗布し乾燥した。

アルカリ処理ゼラチン　　　３．２ｇ／ｍ″ルチル型二
酸化チタン　　　　２８ｇ／ｒｎ’ノニルフェノキシ ポリエトキシエタノール （平均１５オキシエチレン含有）１００ｍｇ／ｌｎ’次
に光遮蔽層の上に下記の被覆量になるようにして接着層
を水溶液を用いて塗布し乾燥して設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　２．７ｇ／ｒｒｒ’ノニル
フェノキシ ポリエトキシエタノール （平均１５オキシエチレン含有）２００ｍｇ／ゴ次に接
着層の上に３０ｇ／ｍ’の割合で水を湿し水として供給
し、湿潤させたのち、グロー放電処理で親水化したポリ
エチレンテレフタレート紡績糸（太さ５０デニール）か
らなるニット編物生地（乎均厚さ２５０ルｍ）を圧着ラ
ミネートして展開層を設けた。

この上に下記の組成のアルカリ剤含有エタノール分散液
を１ｍ″当り２００　ｍ　ｌの割合て塗布し乾帰し中性
脂肪定量分析用一体型多層分析要素を完成した。

エタノール　　　　　　　　　　５００ｍ又ポリビニル
ピロリドン （平均分子量３６万）　　　　　　２０ｇ／ゴノニルフ
ェノキシ ポリエトキシエタノール （平均４０オキシエチレン含有）　　　５ｇ／ｒｎ’２
−アミノー１−メチル− １，３−プロパンジオール　　　９ｇ／ゴ上記液に、リ
ポプロテインリパーゼ１１４００Ｕを水５　ｍ　ｌに溶
解した液を分散して塗布液とした。

次にアルカリ′！ｆＪＩＩ賀含有分散液のエタノールの
かわりに同量の水を用いたアルカリ剤含有水溶液を用い
た他は実施例１と同様にして比較分析要素（１）を作成
した。

接着層に実施例１で展開層に塗布含浸させた量とほぼ同
量の２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオー
ル（被ｆｆｆ量３．６ｇ／ｒｎ’）とリポプロテインリ
パーゼ（被ｆｎｆｆｉ４５００　Ｕ／ｒｒ？）を含有さ
せ、展開層から上記二成分を除いたほかは実施例１と同
様にして比較分析要素（２）を作成した。

上記の実施例１の分析要素と、比較分析要素（１）、（
２）とを強制経時劣化させたのちの分析性源の試験を行
なった。なお、この強制経時劣化は、それぞれ−２５℃
または＋４５℃で、シリカゲル乾燥剤で乾燥させた暗黒
所で６日間分析要素を保存することにより行なった。

試験結果を第１表に示す。

以下全白 第１表から明らかなように、本発明の中性脂肪定量用一
体型多層分析要素は屹燥暗黒所中４５°Ｃで６日間の経
時劣化促進試験において、乾燥暗黒項中氷点下２５°Ｃ
での安定保存条件下で保存した分析要素と実質的に同等
の性渣を保持している。

すなわち経時安定性か極めて優れている。

次に、分析要素を１．５ｍｍＸ１．５ｍｍの正方形チッ
プに裁断し、特開昭５７−６３４５２号公報に開示のプ
ラスチックマウントに収めて中性脂肪定量用化学分析ス
ライド及び比較用中性脂肪定量用化学分析スライド（１
）、（２）を作成した。

本発明の化学分析スライドを乾燥状態で一２５°Ｃと４
５°Ｃに一週間放置した後、中性脂肪濃度の異なるヘパ
リン採血したヒト全血を１０川交点着し、３７℃で６分
間インキュベーションした後、中心波長６４０ｎｍの測
定光てＰＥＴ支持体側から反射光学濃度を測定した。

前記全血を遠心分離後血漿を別にグリセロール−３＝燐
酸オキシダーゼ法で中性脂肪濃度を決定し、検量線を作
成し比較例と比較した。結果な第２表に示す。中性脂肪
濃度０に対しては７％ヒトアルブミン溶液を点着して光
学濃度を測定した。

第２表 中性脂肪濃度　　　反射光学濃度 （ＩＩｇ／ｄ文） ０　　　　　０．１７８ ６２　　　　　０．３０６ １６７　　　　　０．５４５ ２３８　　　　　０．６２５ ３８３　　　　　０．８２９ ５２７　　　　　１．０４９ 中性脂肪濃度と反射光学濃度値との対応は下表の通って
、検量線の勾配は大きく、測定精度か高いことか明らか
になった。

次いて、本発明および比較例の中性脂肪定量用化学分析
スライドについて、それぞれビリルビンによる誤差とヘ
モグロビンによる誤差を調べた。

（１）ビリルビンによる誤差 ビリルビン含有量検定値３０　ｍ　ｇ　／　ｄ文のコン
トロール血清（ＯＭＥＧＡ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｃｏ
ｎｔｒｏｌ　Ｓｅｒｕｍ−Ｅｌｅｖａｔｅｄ　Ｂ１１１
ｒｕｂｉｎ）と中性脂肪含有量検定値６９０　ｍ　ｇ　
／　ｄ　ｌの血清と生理食塩水を用いて第３表に記載の
体積比て混合してビリルビン含有試料液三種を調製した
。これらの試料液を用いて、上述のプロセスと同様にし
て要素の反射光学濃度を測定したところ、第３表の通り
であった。

第３表 試料液崩、　　　　　　　　１　　２　　３血清　　　
　　　　　　　　０．５　　　０．５　　０．５コント
ロール血清　　　　０　　　０．２　　０．５生理食塩
水　　　　　　　０．５　　０．３　　０中性脂肪（ア
ナライト）　　３４５　　　：１４５　　３４５ビリル
ビン（妨害成分）　　０　　　６．０　　、Ｉｓ反射光
学Ｃ度値　　　　　０．８１２　０．８＋、ＯＯ，８１
７中性脂肪含有量３４５ｍｇ／ｄｉ（正常値の上限の約
２倍）のレベルにおいて、ビリルビン不合から１５ｍｇ
／ｄｆＬ（正常値の上限の約１５倍に相当する異常に高
いビリルビン含有量）にいたる範囲で、ビリルリビンに
よる誤差が実質的になしく誤差±０．６２％以内に中性
脂肪含有量を定量分析てきることか明らかになった。

（２）ヘモグロビンによる誤差 ヘモグロビン含有量検定値１０００　ｍ　ｇ　／　ｄ　
１のコントロール血清と中性脂肪含有量検定値６９０　
ｍ　ｇ　／　ｄ　ｌの血清と生理食塩水を用いて第１表
に記載の体積比で混合してヘモグロン含有試料液三種を
調製した。これらの試料液を用いて、上述のプロセスと
同様にして要素の反射光学濃度を測定したところ、第４
表の通ってあった。

以下全白 第４表 試料液崩、　　　　　　　４　　５　　６血清　　　　
　　　　　　０．５　　０．５　　０．５コントロール
血清　　　０　　　０．２　　０．５生理食塩水　　　
　　　０．５　　０．３　　０中性脂肪（アナライト）
　　３４５　　３４５　　３４５ビリルビン（妨害成分
）０　　　２００　　５００反射光学濃度値　　　　０
．８２０　０．８１４　０．８１７本発明の分析要素を
用いることにより、中性脂肪含有量３４５　ｍ　ｇ　／
　ｄ文（正常値の上限の約２倍）のレベルにおいて、ヘ
モグロビン不合から５００ｍｇ／ｄｆＬ（溶血全血、溶
血血漿または溶血血清に相当する異常に高いヘモグロビ
ン含有量）にいたる範囲で、ヘモグロビンによる誤差か
実質的になしく誤差−０，７３％以内）に中性脂肪含有
量を定量分析できることか明らかになった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水不透過性支持体と前記支持体の片面に設けた親水
   性高分子からなるグリセロール検出用呈色試薬層と前記
   呈色試薬層を直接または中間層を介在して被覆する多孔
   性展開層を有し、前記展開層に少なくともリポプロテイ
   ンリパーゼ、および液体試料適用時のｐＨ値を８．０〜
   １０．０の範囲に維持しうるｐＨ緩衝剤またはアルカリ
   剤を含有することを特徴とする中性脂肪定量用一体型多
   層分析要素 ２、前記展開層が織物または編物からなる特許請求の範
   囲第１項記載の一体型多層分析要素。 ３、前記グリセロール検出用呈色試薬層が、少なくとも
   グリセロールキナーゼ、グリセロール−３−燐酸デヒド
   ロゲナーゼ、電子伝達性化合物、ＮＡＤ、ＡＴＰ、テト
   ラゾリウム塩およびマグネシウムイオンを含み、層塗布
   用水溶液のｐＨが６．０〜７．５の範囲である水溶液を
   塗布して設けられた層である特許請求の範囲第１項また
   は第２項に記載の一体型多層分析要素。 ４、水不透過性支持体の上にグリセロール検出出用呈色
   試薬組成物と親水性ポリマーバインダーを含有し、ｐＨ
   値６．０〜７．５の範囲を有する水溶液を塗布し乾燥し
   てグリセロール検出用呈色試薬層を設け、次いで、前記
   呈色試薬層の上に直接または中間に介在する層を設けた
   後に前記中間に介在する層の上に多孔性展開層を設け、
   しかる後に、少なくともリポプロテインリパーゼおよび
   液体試料適用時ｐＨ値を８．０〜１０．０に維持しうる
   ｐＨ緩衝剤またはアルカリ剤を、前記呈色試薬層の親水
   性ポリマーバイダーを実質的に膨潤させず、かつ前記展
   開層を実質的に溶解させない有機溶媒に分散または溶解
   させて含有する液を前記展開層に塗布し乾燥させること
   を特徴とする中性脂肪定量用一体型多層分析要素の製造
   方法。 ５、前記展開層が織物または編物からなる特許請求の範
   囲第４項に記載の製造方法。 ６、前記グリセロール検出用呈色試薬組成物が、グリセ
   ロールキナーゼ、グリセロール３−燐酸−デヒドロゲナ
   ーゼ、電子伝達性化合物、ＮＡＤ、ＡＴＰ、テトラゾリ
   ウム塩およびマグネシウムイオンを含む組成物である特
   許請求の範囲第４項または第５項に記載の製造方法。