JPH054031B2 - - Google Patents
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- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、血液等の各種体液その他の水性試料
に含まれているコレステロールを分析する、乾式
の一体型多層分析要素の改良に関するものであ
る。 〔従来の技術〕 最近、乾式の分析要素の一形態として、透明支
持体の上に呈色反応試薬と親水性ポリマーバイン
ダーを含む吸水性の試薬層と試料を展開する多孔
性展開層を設けた一体型の多層分析要素が開発さ
れ、その改良も種々行なわれている。この多層分
析要素は試薬を変えることによつて各種の試料を
分析することができ、コレステロールについても
知られている（「クリニカルケミストリ」CLIN.
CHEM.28(5)、1159−1162（1982）、特公昭58−
18628号公報など）。 従来のコレステロール分析用の多層分析要素
は、下記に示すように、透明支持体上にゼラチン
層及び展開層が積層され、そのなかにコレステロ
ールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ
及びペルオキシダーゼの各酵素とロイコ色素等が
添加されていた。そして、ゼラチン層のPHは6.25
に調整されていた（CLIN.CHEM.28(5)、1159−
1162（1982））。 BaSO4 酢酸セルロース オクチルフエノキシポリエトキシエ
タノール （９〜10オキシエチレン単位含
有） 展開層 KH2PO4 コレステロールエステラーゼ コレステロールオキシダーゼ ペルオキシダーゼ トリアリールイミダゾールロイコ色
素 ゼラチン層 ゼラチン（PH6.25） 支持体 透明ポリエチレンテレフタレートフ
イルム 〔発明が解決しようとする問題点〕 従来のコレステロール分析用多層分析要素にお
いては、ロイコ色素が保存中に発色しやすく保存
安定性が悪いという問題点があつた。このロイコ
色素は空気中にさらすとさらに発色しやすくなる
ため、特に開封後は短期間に使用してしまわなけ
ればならなかつた。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らはこのような問題点を解決するべく
鋭意検討を行ない、発色試薬組成物として４−ア
ミノアンチピリン又はその誘導体と２−ヒドロキ
シ−３，５−ジクロルベンゼンスルホン酸の組合
せを用いることによつてこの保存安定性を大巾に
向上させることができることを見出したが、発色
速度が遅いという問題があつた。そこで、さらに
検討を進め、反応PHを7.5から9.0の範囲内にすれ
ば発色速度も従来のロイコ色素に対して孫色ない
程度まで高められることを見出して本発明を完成
するに至つた。 すなわち、本発明は、少なくとも、光透過性水
不透過性支持体、１層以上の親水性層、及び展開
層がこの順に積層されるとともにコレステロール
エステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び
ペルオキシダーゼの各酵素並びに発色試薬組成物
を含有する一体型のコレステロール分析用多層分
析要素において、上記各酵素及び試薬組成物がい
ずれも展開層に含有され、前記発色試薬組成物が
４−アミノアンチピリンおよび４−アミノアンチ
ピリン誘導体からなる群から選択された少なくと
も１種の化合物と２−ヒドロキシ−３，５−ジク
ロロベンゼンスルホン酸の組合せであつてフエロ
シアン化物を含まず、かつ前記組成物の発色反応
が進行する層のPH値が分析操作時に7.5から9.0の
範囲内に維持されることを特徴とする一体型のコ
レステロール分析用多層分析要素に関するもので
ある。 光透過性水不透過性支持体は一般の多層分析要
素に使用されている公知のものを利用すればよ
い。その具体例としては、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフエノールＡのポリカルボネート、
ポリスチレン、セルロースエステル（セルロース
ジアセテート、セルローストリアセテート、セル
ロースアセテートプロピオネート等）などのポリ
マーからなる厚さ約50μｍから約１mm、好ましく
は約80μｍから約300μｍの範囲の透明支持体を用
いることができる。支持体の表面には必要により
前記の諸特許明細書等により公知の下塗層または
接着層を設けて支持体の上に設けられる親水性層
等との接着を強固にすることができる。 親水性層は４−アミノアンチピリン又は４−ア
ミノアンチピリン誘導体と２−ヒドロキシ−３，
５−ジクロロベンゼンスルホン酸が酸化カツプリ
ング反応して発色した色素が蓄積される層であ
り、親水性ポリマーバインダーにより形成され、
親水性ポリマーバインダーのみ又はこれと他の成
分から形成されるものである。親水性層は吸水し
て膨潤し、検出種を受容して蓄積する吸水層、検
出種を媒染固定できる陰電荷又は陽電荷を有する
媒染剤を含みかつ吸水して膨潤する検出層として
機能させることができる。親水性ポリマーバイン
ダーは水吸収時の膨潤率が30℃で約150％から約
2000％、好ましくは約250％から約1500％の範囲
の天然または合成親水性ポリマーである。その例
として、特願昭58−45547、特願昭58−217428等
に開示のゼラチン（酸処理ゼラチン、脱イオンゼ
ラチン等）、ゼラチン誘導体（フタル化ゼラチン、
ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、
アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリア
クリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン等をあげることができる。親水性層
の乾燥時の厚さは約1μｍから約100μｍ、好まし
くは約3μｍから約50μｍ、特に好ましくは約5μｍ
から約30μｍの範囲であり、また実質的に透明で
あることが好ましい。親水性層には公知の媒染
剤、塩基性ポリマー、酸性ポリマー等を含有させ
ることもできる。 展開層としては特公昭53−21677号公報等に開
示のメンブランフイルタ（ブラツシユポリマー
層）、ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロビー
ズ、珪藻土が親水性ポリマーバインダーに保持さ
れてなる連続微空〓含有多孔性層、特開昭55−
90859号公報に開示のポリマーミクロビーズ、ガ
ラスミクロビーズ等が水で膨潤しないポリマー接
着剤で点接触状に接着されてなる連続微空〓含有
多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）等の非繊
維質等方的多孔性展開層、特開昭55−164356号公
報、特開昭57−66359号公報等に開示の織物展開
層、特願昭59−79158号明細書に開示の編物展開
層、特開昭57−148250号公報に開示の有機ポリマ
ー繊維パルプを含む抄造紙からなる展開層等の繊
維質多孔性展開層等があげられる。 展開層は直接あるいは必要により接着層を介し
て積層される。展開層は酵素、４−アミノアンチ
ピリンあるいはその誘導体及び２−ヒドロキシ−
３，５−ジクロロベンゼンスルホン酸を含有させ
る。 展開層を接着し積層するために接着層を設ける
ことができる。接着層は水で湿潤しているとき、
または水を含んで膨潤しているときに展開層を析
着して一体化できる親水性ポリマーから主として
なる。接着層に用いうる親水性ポリマーとしては
親水性層に用いるのと同じ親水性ポリマーがあげ
られ、これらのうちでゼラチン、ゼラチン誘導
体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の
乾燥層厚は約0.5μｍから約20μｍ、好ましくは約
1μｍから約10μｍの範囲である。接着層には界面
活性剤を含有させることができる。界面活性剤と
してはノニオン性界面活性剤、特にオキシエチレ
ン基またはオキシプロピレン基が８〜15個連なつ
た鎖状構造を含むノニオン性界面活性剤が好まし
い。 接着層は親水性ポリマーと所望により加えられ
る界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で親水
性層の上に塗布して設けることができる。 コレステロールエステラーゼ（E.C.3.1.1.13）
は試料中に含まれているコレステロールエステル
をコレステロールに変える酵素であり、コレステ
ロールオキシダーゼ（E.C.1.1.3.6）はコレステロ
ールを酸化して過酸化水素を生成させる酵素であ
る。ペルオキシダーゼ（E.C.1.11.1.7）はこの過
酸化水素を利用して４−アミノアンチピリンを酸
化し２−ヒドロキシ−３，５−ジクロルベンゼン
スルホン酸とカツプリングさせる酵素である。こ
れらの酵素は市販品を利用できるが、PH7.5から
PH9.0における酵素活性及び安定性のなるべく高
いものが好ましい。しかしながら、これらの酵素
の至適PHは通常はPH６〜７にあるので、本発明の
多層分析要素においては一般に酵素量を従来より
も増量することが好ましい。 発色試薬組成物（カラーインジケーター）には
４−アミノアンチピリン又はその誘導体と２−ヒ
ドロキシ−３，５−ジクロルベンゼンスルホン酸
の組合せを用いる。４−アミノアンチピリン誘導
体は例えば特開昭58−124771、特開昭59−54962
に記載の４−アミノ−２，３−ジメチル−１−
（３−クロロフエニル）−３−ピラゾリン−５−オ
ン、４−アミノ−２，３−ジメチル−１−（２，
４，６−トリクロロフエニル）−３−ピラゾリン
−５−オン、４−アミノ−２−メチル−３−フエ
ニル−１−（２，４，６−トリクロロフエニル）−
３−ピラゾリン−５−オン、（これらの化合物は
フリーのアミン、酸付加塩いずれも用いうる。）
に代表される４−アミノ−３−ピラゾリン−５−
オンの１，２，３−トリ置換体、及び特公昭55−
25840に記載の４−ジメチルアミノ−２，３−ジ
メチル−１−フエニル−３−ピラゾリン−５−オ
ン、１−フエニル−２，３−ジメチル−５−ピラ
ゾリン−４−メチルアミノメタンスルホン酸ナト
リウム等である。２−ヒドロキシ−３，５−ジク
ロルベンゼンスルホン酸はナトリウム塩、カリウ
ム塩などの塩でもよい。 その他の試薬類は試料の種類等に応じて適宜選
択され、例えばノニオン界面活性剤等の蛋白解離
剤、ジメドン等のカブリ防止剤、感度調節剤、PH
を調節する緩衝作用物質等が適宜添加される。ノ
ニオン性界面活性剤としては多価アルコールエス
テルエチレンオキシド付加物（縮合物）、ポリエ
チレングリコールモノエステル、ポリエチレング
リコールジエステル、高級アルコールエチレンオ
キシド付加物（縮合物）、アルキルフエノールエ
チレンオキシド付加物（縮合物）等がある。ノニ
オン性界面活性剤の具体例を以下にあげる。本発
明に用いられるノニオン性界面活性剤はこれらの
化合物に限られないことは言うまでもない。 界面活性剤の化学構造 POE(10)ソルビタンモノオレエート PEG（400）モノステアレート ラウリルアルコールEO10モル縮合物 POE(10)オクチルフエニルエーテル POE(15)オクチルフエニルエーテル POE(12)ノニルフエニルエーテル （註）POE：ポリエチレンオキシド EO：エチレンオキシド （ ）内の数値はエチレンオキシド単位の縮合
数 本発明の多層分析要素は発色反応が行なわれる
層のPHを7.5から9.0好ましくは7.7から8.5の範囲
内にする。このようなPHにするために緩衝作用を
有する化合物、例えばリン酸１ナトリウム、リン
酸１カリウムなどのリン酸塩、そのほか炭酸塩、
クエン酸塩などを添加することは好ましい。多層
分析要素に含まれる酵素、発色試薬組成物及びそ
の他の試薬類は点着された水性試料の展開に従つ
て移動していくので、発色反応が行なわれる層は
予め試薬類が添加されていた層に限定されるもの
ではなく、移動先の層も対象になる。一方、発色
反応が行なわれるすべての層がこのような範囲の
PHである必要はなく、例えば親水性層のみがこの
ようなPHで反応が行なわれるように構成されてい
てもよい。 本発明の一体型多層分析要素は、一辺約15mmか
ら約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の
小片に裁断し、特開昭57−63452号公報、特開昭
54−156079号公報、実開昭56−142454号公報、実
開昭58−32350号公報、特表昭58−501144号公表
等に開示のスライド枠等に収めて分析スライドと
して用いるのが、製造、包装、輸送、保存、測定
操作等の全ての観点が好ましい。 測定試料はコレステロールを含有する水性試料
であれば特に制限されるものではなく、例えば全
血、血漿、血清等の血液のほか、その他各種体
液、さらにはコレステロールを製造しあるいは利
用している工場の工程管理用試料などを含む。 本発明の一体型多層分析要素は前述の諸特許明
細書に開示の方法に従い、約5μから約30μ、
好ましくは8μから約15μの水性液体試料を展
開層に点着供給し、必要に応じて約20℃から約45
℃の範囲の実質的に一定の温度でインキユベーシ
ヨンする。そしてその後に、例えば光透過性支持
体側から多層分析要素内の発色を反射測光し、比
色法の原理により液体試料中の測定対象成分を定
量すればよい。 〔作用〕 光透過性水不透過性支持体は、多層分析要素の
支持体として機能するとともに、光透過性である
ことによつて発色を多層分析要素の裏面から光を
照射して測定することを可能にしている。そし
て、水不透過性であることによつて点着された水
性試料の浸透を止める作用をしている。親水性層
は親水性化合物の受け入れ及び浸透を行なわせ、
特に水溶性である発色色素を受け入れ蓄積する層
である。「親水性層」はまた、展開層に点着され
た水性液体試料の水を吸収することにより展開層
の持つている展開作用（メータリング作用）を短
時間のうちに、かつ良化させる機能になつてい
る。この点で、親水性層は「吸水層」の作用をす
る。展開層はそこに点着された水性試料を展開し
て親水性層へ直接あるいは間接的に引き渡す層で
ある。 試料中に混入しているコレステロールエステル
はコレステロールエステラーゼによつて加水分解
されてコレステロールに変わり、コレステロール
はコレステロールオキシダーゼの作用によつて酸
化されて過酸化を生ずる。この過酸化水素はペル
オキシダーゼの作用によつて４−アミノアンチピ
リンを酸化し、２−ヒドロキシ−３，５−ジクロ
ルベンゼンスルホン酸塩とカツプリングさせて発
色させる。この色素が親水性層に蓄積され、これ
を比色定量することによつて試料中の全コレステ
ロール量を求めることができる。 上記各酵素の至適PHは通常６〜７にあるが、４
−アミノアンチピリンと２−ヒドロキシ−３，５
−ジクロルベンゼンスルホン酸塩とのカツプリン
グ反応はアルカリPH域のほうが進行しやすい。そ
こで、PHを7.5から9.0の範囲にすれば酵素反応及
び発色反応の両方が円滑に進行し、これらの試薬
を用いた多層分析要素を実用化しうることを見出
してなされたのが本発明である。 〔実施例〕 実施例１および比較例１ ゼラチン下塗りが施されてある厚さ180μｍの
ポリエチレンテレフタレート（PET）フイルム
上に、ゼラチン26ｇ／m2、ポリオキシエチレンノ
ニルフエニルエーテル（８〜15オキシエチレン単
位含有）0.03ｇ／m2、ビス（ビニルスルホニルメ
チル）エーテル30mg／m2になるよう乾燥後の厚さ
20μｍで塗布乾燥してゼラチン層（吸水層）を形
成した。 次に、この吸水層に30ｇ／m2の割合で水を湿し
水として供給、湿潤させたのちグロー放電で親水
化したポリエチレンテレフタレート（PET）紡
績糸（50デニール）からなるトリコツト編物生地
（平均厚さ250μｍ）を圧着ラミネートして展開層
を設けた。 ついで展開層中で下記の成分被覆量になるよう
にして、編物展開層の上からコレステロール分析
用呈色試薬組成物水溶液を塗布含浸し乾燥してコ
レステロール定量用一体型多層分析要素（10種）
を完成した。 コレステロール分析用呈色試薬組成物の成分被覆
量（１m2当り） メチルセルロース（メトキシ基含有率29％、2w
％水溶液20℃での粘度112cps） 3.0ｇ 二酸化チタン微粒子（ルチル型；粒子サイズ0.25
〜0.40μｍ） 24ｇ オクチルフエノキシポリエトキシエタノール（９
〜10オキシエチレン単位含有） 0.7ｇ コレステロールオキシダーゼ（EC1.1.3.6）
3500IU コレステロールエステラーゼ（EC3.1.1.13）
2000IU ペルオキシダーゼ（EC1.11.1.7） 2900IU ２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベンゼンスル
ホン酸ナトリウム 1.8ｇ ４−アミノアンチピリン 0.3ｇ ジメドン〔CAS Registry No.126−81−８〕
50mg 燐酸二水素ナトリウム 4.0ｇ 5N−水酸化ナトリウム（水溶液） 註 註：5N−水酸化ナトリウム（水溶液）は完成し
た要素に管理血清モニトロール （PH7.4）（米国デイド社製）10μを点着
した後の展開層のPH値が5.0；6.0；6.5；7.0；
7.5；8.0；8.8；9.0；9.5；10.0になる量を添加す
る。 完成した要素を15mm×15mmの正方形チツプに裁
断し、特開昭57−63452に開示のプラスチツクマ
ウントに収めてコレステロール定量用化学分析ス
ライド（10種）を完成した。各スライドにヘパリ
ン採血したコレステロール濃度の異なるヒト血漿
を10μ点着し37℃６分間インキユベーシヨンし
たのち540nｍの測定光でPET支持体側から反射
光学濃度を測定した。この結果と各人血漿につい
てアラン（C.C.Allain）らの方法に従う溶液分析
で求めたコレステロール濃度を基準にして検量線
を作成した。 次に、モニトロールにEDTA−2Na10mg／
mlの割合で添加した試料液、アスコルビン酸５
mg／dlの割合で添加した試料液、PH4.0に調整し
たモニトロールの各々について設定PHの異なる
各スライドに点着し発色反応させて、反射光学濃
度を測定した後、人血漿で求めた検量線より、質
量変換しモニトロールの値を１とした場合の変
化率を計算した。その結果を第１表に示す。
に含まれているコレステロールを分析する、乾式
の一体型多層分析要素の改良に関するものであ
る。 〔従来の技術〕 最近、乾式の分析要素の一形態として、透明支
持体の上に呈色反応試薬と親水性ポリマーバイン
ダーを含む吸水性の試薬層と試料を展開する多孔
性展開層を設けた一体型の多層分析要素が開発さ
れ、その改良も種々行なわれている。この多層分
析要素は試薬を変えることによつて各種の試料を
分析することができ、コレステロールについても
知られている（「クリニカルケミストリ」CLIN.
CHEM.28(5)、1159−1162（1982）、特公昭58−
18628号公報など）。 従来のコレステロール分析用の多層分析要素
は、下記に示すように、透明支持体上にゼラチン
層及び展開層が積層され、そのなかにコレステロ
ールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ
及びペルオキシダーゼの各酵素とロイコ色素等が
添加されていた。そして、ゼラチン層のPHは6.25
に調整されていた（CLIN.CHEM.28(5)、1159−
1162（1982））。 BaSO4 酢酸セルロース オクチルフエノキシポリエトキシエ
タノール （９〜10オキシエチレン単位含
有） 展開層 KH2PO4 コレステロールエステラーゼ コレステロールオキシダーゼ ペルオキシダーゼ トリアリールイミダゾールロイコ色
素 ゼラチン層 ゼラチン（PH6.25） 支持体 透明ポリエチレンテレフタレートフ
イルム 〔発明が解決しようとする問題点〕 従来のコレステロール分析用多層分析要素にお
いては、ロイコ色素が保存中に発色しやすく保存
安定性が悪いという問題点があつた。このロイコ
色素は空気中にさらすとさらに発色しやすくなる
ため、特に開封後は短期間に使用してしまわなけ
ればならなかつた。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らはこのような問題点を解決するべく
鋭意検討を行ない、発色試薬組成物として４−ア
ミノアンチピリン又はその誘導体と２−ヒドロキ
シ−３，５−ジクロルベンゼンスルホン酸の組合
せを用いることによつてこの保存安定性を大巾に
向上させることができることを見出したが、発色
速度が遅いという問題があつた。そこで、さらに
検討を進め、反応PHを7.5から9.0の範囲内にすれ
ば発色速度も従来のロイコ色素に対して孫色ない
程度まで高められることを見出して本発明を完成
するに至つた。 すなわち、本発明は、少なくとも、光透過性水
不透過性支持体、１層以上の親水性層、及び展開
層がこの順に積層されるとともにコレステロール
エステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び
ペルオキシダーゼの各酵素並びに発色試薬組成物
を含有する一体型のコレステロール分析用多層分
析要素において、上記各酵素及び試薬組成物がい
ずれも展開層に含有され、前記発色試薬組成物が
４−アミノアンチピリンおよび４−アミノアンチ
ピリン誘導体からなる群から選択された少なくと
も１種の化合物と２−ヒドロキシ−３，５−ジク
ロロベンゼンスルホン酸の組合せであつてフエロ
シアン化物を含まず、かつ前記組成物の発色反応
が進行する層のPH値が分析操作時に7.5から9.0の
範囲内に維持されることを特徴とする一体型のコ
レステロール分析用多層分析要素に関するもので
ある。 光透過性水不透過性支持体は一般の多層分析要
素に使用されている公知のものを利用すればよ
い。その具体例としては、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフエノールＡのポリカルボネート、
ポリスチレン、セルロースエステル（セルロース
ジアセテート、セルローストリアセテート、セル
ロースアセテートプロピオネート等）などのポリ
マーからなる厚さ約50μｍから約１mm、好ましく
は約80μｍから約300μｍの範囲の透明支持体を用
いることができる。支持体の表面には必要により
前記の諸特許明細書等により公知の下塗層または
接着層を設けて支持体の上に設けられる親水性層
等との接着を強固にすることができる。 親水性層は４−アミノアンチピリン又は４−ア
ミノアンチピリン誘導体と２−ヒドロキシ−３，
５−ジクロロベンゼンスルホン酸が酸化カツプリ
ング反応して発色した色素が蓄積される層であ
り、親水性ポリマーバインダーにより形成され、
親水性ポリマーバインダーのみ又はこれと他の成
分から形成されるものである。親水性層は吸水し
て膨潤し、検出種を受容して蓄積する吸水層、検
出種を媒染固定できる陰電荷又は陽電荷を有する
媒染剤を含みかつ吸水して膨潤する検出層として
機能させることができる。親水性ポリマーバイン
ダーは水吸収時の膨潤率が30℃で約150％から約
2000％、好ましくは約250％から約1500％の範囲
の天然または合成親水性ポリマーである。その例
として、特願昭58−45547、特願昭58−217428等
に開示のゼラチン（酸処理ゼラチン、脱イオンゼ
ラチン等）、ゼラチン誘導体（フタル化ゼラチン、
ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、
アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリア
クリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン等をあげることができる。親水性層
の乾燥時の厚さは約1μｍから約100μｍ、好まし
くは約3μｍから約50μｍ、特に好ましくは約5μｍ
から約30μｍの範囲であり、また実質的に透明で
あることが好ましい。親水性層には公知の媒染
剤、塩基性ポリマー、酸性ポリマー等を含有させ
ることもできる。 展開層としては特公昭53−21677号公報等に開
示のメンブランフイルタ（ブラツシユポリマー
層）、ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロビー
ズ、珪藻土が親水性ポリマーバインダーに保持さ
れてなる連続微空〓含有多孔性層、特開昭55−
90859号公報に開示のポリマーミクロビーズ、ガ
ラスミクロビーズ等が水で膨潤しないポリマー接
着剤で点接触状に接着されてなる連続微空〓含有
多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）等の非繊
維質等方的多孔性展開層、特開昭55−164356号公
報、特開昭57−66359号公報等に開示の織物展開
層、特願昭59−79158号明細書に開示の編物展開
層、特開昭57−148250号公報に開示の有機ポリマ
ー繊維パルプを含む抄造紙からなる展開層等の繊
維質多孔性展開層等があげられる。 展開層は直接あるいは必要により接着層を介し
て積層される。展開層は酵素、４−アミノアンチ
ピリンあるいはその誘導体及び２−ヒドロキシ−
３，５−ジクロロベンゼンスルホン酸を含有させ
る。 展開層を接着し積層するために接着層を設ける
ことができる。接着層は水で湿潤しているとき、
または水を含んで膨潤しているときに展開層を析
着して一体化できる親水性ポリマーから主として
なる。接着層に用いうる親水性ポリマーとしては
親水性層に用いるのと同じ親水性ポリマーがあげ
られ、これらのうちでゼラチン、ゼラチン誘導
体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の
乾燥層厚は約0.5μｍから約20μｍ、好ましくは約
1μｍから約10μｍの範囲である。接着層には界面
活性剤を含有させることができる。界面活性剤と
してはノニオン性界面活性剤、特にオキシエチレ
ン基またはオキシプロピレン基が８〜15個連なつ
た鎖状構造を含むノニオン性界面活性剤が好まし
い。 接着層は親水性ポリマーと所望により加えられ
る界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で親水
性層の上に塗布して設けることができる。 コレステロールエステラーゼ（E.C.3.1.1.13）
は試料中に含まれているコレステロールエステル
をコレステロールに変える酵素であり、コレステ
ロールオキシダーゼ（E.C.1.1.3.6）はコレステロ
ールを酸化して過酸化水素を生成させる酵素であ
る。ペルオキシダーゼ（E.C.1.11.1.7）はこの過
酸化水素を利用して４−アミノアンチピリンを酸
化し２−ヒドロキシ−３，５−ジクロルベンゼン
スルホン酸とカツプリングさせる酵素である。こ
れらの酵素は市販品を利用できるが、PH7.5から
PH9.0における酵素活性及び安定性のなるべく高
いものが好ましい。しかしながら、これらの酵素
の至適PHは通常はPH６〜７にあるので、本発明の
多層分析要素においては一般に酵素量を従来より
も増量することが好ましい。 発色試薬組成物（カラーインジケーター）には
４−アミノアンチピリン又はその誘導体と２−ヒ
ドロキシ−３，５−ジクロルベンゼンスルホン酸
の組合せを用いる。４−アミノアンチピリン誘導
体は例えば特開昭58−124771、特開昭59−54962
に記載の４−アミノ−２，３−ジメチル−１−
（３−クロロフエニル）−３−ピラゾリン−５−オ
ン、４−アミノ−２，３−ジメチル−１−（２，
４，６−トリクロロフエニル）−３−ピラゾリン
−５−オン、４−アミノ−２−メチル−３−フエ
ニル−１−（２，４，６−トリクロロフエニル）−
３−ピラゾリン−５−オン、（これらの化合物は
フリーのアミン、酸付加塩いずれも用いうる。）
に代表される４−アミノ−３−ピラゾリン−５−
オンの１，２，３−トリ置換体、及び特公昭55−
25840に記載の４−ジメチルアミノ−２，３−ジ
メチル−１−フエニル−３−ピラゾリン−５−オ
ン、１−フエニル−２，３−ジメチル−５−ピラ
ゾリン−４−メチルアミノメタンスルホン酸ナト
リウム等である。２−ヒドロキシ−３，５−ジク
ロルベンゼンスルホン酸はナトリウム塩、カリウ
ム塩などの塩でもよい。 その他の試薬類は試料の種類等に応じて適宜選
択され、例えばノニオン界面活性剤等の蛋白解離
剤、ジメドン等のカブリ防止剤、感度調節剤、PH
を調節する緩衝作用物質等が適宜添加される。ノ
ニオン性界面活性剤としては多価アルコールエス
テルエチレンオキシド付加物（縮合物）、ポリエ
チレングリコールモノエステル、ポリエチレング
リコールジエステル、高級アルコールエチレンオ
キシド付加物（縮合物）、アルキルフエノールエ
チレンオキシド付加物（縮合物）等がある。ノニ
オン性界面活性剤の具体例を以下にあげる。本発
明に用いられるノニオン性界面活性剤はこれらの
化合物に限られないことは言うまでもない。 界面活性剤の化学構造 POE(10)ソルビタンモノオレエート PEG（400）モノステアレート ラウリルアルコールEO10モル縮合物 POE(10)オクチルフエニルエーテル POE(15)オクチルフエニルエーテル POE(12)ノニルフエニルエーテル （註）POE：ポリエチレンオキシド EO：エチレンオキシド （ ）内の数値はエチレンオキシド単位の縮合
数 本発明の多層分析要素は発色反応が行なわれる
層のPHを7.5から9.0好ましくは7.7から8.5の範囲
内にする。このようなPHにするために緩衝作用を
有する化合物、例えばリン酸１ナトリウム、リン
酸１カリウムなどのリン酸塩、そのほか炭酸塩、
クエン酸塩などを添加することは好ましい。多層
分析要素に含まれる酵素、発色試薬組成物及びそ
の他の試薬類は点着された水性試料の展開に従つ
て移動していくので、発色反応が行なわれる層は
予め試薬類が添加されていた層に限定されるもの
ではなく、移動先の層も対象になる。一方、発色
反応が行なわれるすべての層がこのような範囲の
PHである必要はなく、例えば親水性層のみがこの
ようなPHで反応が行なわれるように構成されてい
てもよい。 本発明の一体型多層分析要素は、一辺約15mmか
ら約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の
小片に裁断し、特開昭57−63452号公報、特開昭
54−156079号公報、実開昭56−142454号公報、実
開昭58−32350号公報、特表昭58−501144号公表
等に開示のスライド枠等に収めて分析スライドと
して用いるのが、製造、包装、輸送、保存、測定
操作等の全ての観点が好ましい。 測定試料はコレステロールを含有する水性試料
であれば特に制限されるものではなく、例えば全
血、血漿、血清等の血液のほか、その他各種体
液、さらにはコレステロールを製造しあるいは利
用している工場の工程管理用試料などを含む。 本発明の一体型多層分析要素は前述の諸特許明
細書に開示の方法に従い、約5μから約30μ、
好ましくは8μから約15μの水性液体試料を展
開層に点着供給し、必要に応じて約20℃から約45
℃の範囲の実質的に一定の温度でインキユベーシ
ヨンする。そしてその後に、例えば光透過性支持
体側から多層分析要素内の発色を反射測光し、比
色法の原理により液体試料中の測定対象成分を定
量すればよい。 〔作用〕 光透過性水不透過性支持体は、多層分析要素の
支持体として機能するとともに、光透過性である
ことによつて発色を多層分析要素の裏面から光を
照射して測定することを可能にしている。そし
て、水不透過性であることによつて点着された水
性試料の浸透を止める作用をしている。親水性層
は親水性化合物の受け入れ及び浸透を行なわせ、
特に水溶性である発色色素を受け入れ蓄積する層
である。「親水性層」はまた、展開層に点着され
た水性液体試料の水を吸収することにより展開層
の持つている展開作用（メータリング作用）を短
時間のうちに、かつ良化させる機能になつてい
る。この点で、親水性層は「吸水層」の作用をす
る。展開層はそこに点着された水性試料を展開し
て親水性層へ直接あるいは間接的に引き渡す層で
ある。 試料中に混入しているコレステロールエステル
はコレステロールエステラーゼによつて加水分解
されてコレステロールに変わり、コレステロール
はコレステロールオキシダーゼの作用によつて酸
化されて過酸化を生ずる。この過酸化水素はペル
オキシダーゼの作用によつて４−アミノアンチピ
リンを酸化し、２−ヒドロキシ−３，５−ジクロ
ルベンゼンスルホン酸塩とカツプリングさせて発
色させる。この色素が親水性層に蓄積され、これ
を比色定量することによつて試料中の全コレステ
ロール量を求めることができる。 上記各酵素の至適PHは通常６〜７にあるが、４
−アミノアンチピリンと２−ヒドロキシ−３，５
−ジクロルベンゼンスルホン酸塩とのカツプリン
グ反応はアルカリPH域のほうが進行しやすい。そ
こで、PHを7.5から9.0の範囲にすれば酵素反応及
び発色反応の両方が円滑に進行し、これらの試薬
を用いた多層分析要素を実用化しうることを見出
してなされたのが本発明である。 〔実施例〕 実施例１および比較例１ ゼラチン下塗りが施されてある厚さ180μｍの
ポリエチレンテレフタレート（PET）フイルム
上に、ゼラチン26ｇ／m2、ポリオキシエチレンノ
ニルフエニルエーテル（８〜15オキシエチレン単
位含有）0.03ｇ／m2、ビス（ビニルスルホニルメ
チル）エーテル30mg／m2になるよう乾燥後の厚さ
20μｍで塗布乾燥してゼラチン層（吸水層）を形
成した。 次に、この吸水層に30ｇ／m2の割合で水を湿し
水として供給、湿潤させたのちグロー放電で親水
化したポリエチレンテレフタレート（PET）紡
績糸（50デニール）からなるトリコツト編物生地
（平均厚さ250μｍ）を圧着ラミネートして展開層
を設けた。 ついで展開層中で下記の成分被覆量になるよう
にして、編物展開層の上からコレステロール分析
用呈色試薬組成物水溶液を塗布含浸し乾燥してコ
レステロール定量用一体型多層分析要素（10種）
を完成した。 コレステロール分析用呈色試薬組成物の成分被覆
量（１m2当り） メチルセルロース（メトキシ基含有率29％、2w
％水溶液20℃での粘度112cps） 3.0ｇ 二酸化チタン微粒子（ルチル型；粒子サイズ0.25
〜0.40μｍ） 24ｇ オクチルフエノキシポリエトキシエタノール（９
〜10オキシエチレン単位含有） 0.7ｇ コレステロールオキシダーゼ（EC1.1.3.6）
3500IU コレステロールエステラーゼ（EC3.1.1.13）
2000IU ペルオキシダーゼ（EC1.11.1.7） 2900IU ２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベンゼンスル
ホン酸ナトリウム 1.8ｇ ４−アミノアンチピリン 0.3ｇ ジメドン〔CAS Registry No.126−81−８〕
50mg 燐酸二水素ナトリウム 4.0ｇ 5N−水酸化ナトリウム（水溶液） 註 註：5N−水酸化ナトリウム（水溶液）は完成し
た要素に管理血清モニトロール （PH7.4）（米国デイド社製）10μを点着
した後の展開層のPH値が5.0；6.0；6.5；7.0；
7.5；8.0；8.8；9.0；9.5；10.0になる量を添加す
る。 完成した要素を15mm×15mmの正方形チツプに裁
断し、特開昭57−63452に開示のプラスチツクマ
ウントに収めてコレステロール定量用化学分析ス
ライド（10種）を完成した。各スライドにヘパリ
ン採血したコレステロール濃度の異なるヒト血漿
を10μ点着し37℃６分間インキユベーシヨンし
たのち540nｍの測定光でPET支持体側から反射
光学濃度を測定した。この結果と各人血漿につい
てアラン（C.C.Allain）らの方法に従う溶液分析
で求めたコレステロール濃度を基準にして検量線
を作成した。 次に、モニトロールにEDTA−2Na10mg／
mlの割合で添加した試料液、アスコルビン酸５
mg／dlの割合で添加した試料液、PH4.0に調整し
たモニトロールの各々について設定PHの異なる
各スライドに点着し発色反応させて、反射光学濃
度を測定した後、人血漿で求めた検量線より、質
量変換しモニトロールの値を１とした場合の変
化率を計算した。その結果を第１表に示す。
【表】
【表】
なお、PH9.5、PH10のスライドでは光学反射濃
度変化が少く満足な検量線が得られないため目的
とする実験が不可能であつた。 実施例 ２ 展開層の設定PH値を7.8にしたほかは実施例１
と同様にして調製したコレステロール定量用化学
分析スライドを４℃20％相対湿度で８カ月保存し
た。調製直後、28日保存後および８カ月保存後の
分析スライドそれぞれに下記の４種の水性液体試
料を10μ点着し、37℃で６分インクベーシヨン
し、中心波長540nｍの可視光でPET支持体側か
ら反射光学濃度を測定し、相対値を求めたところ
第２表に示す結果がえられた。 水性液体試料 ７％ヒト血清アルブミン水溶液（７％HSA水溶
液） コレステロール含有量 ゼロ モニトロール （米国デイド社製コントロール
血清） コレステロール含有量 約100mg／dl モニトロール （米国デイド社製コントロール
血清） コレステロール含有量 約200mg／dl プレチリツプEL （西独国ベーリンガーマンハ
イム社製コレステロール血清） コレステロール含有量 約360mg／dl
度変化が少く満足な検量線が得られないため目的
とする実験が不可能であつた。 実施例 ２ 展開層の設定PH値を7.8にしたほかは実施例１
と同様にして調製したコレステロール定量用化学
分析スライドを４℃20％相対湿度で８カ月保存し
た。調製直後、28日保存後および８カ月保存後の
分析スライドそれぞれに下記の４種の水性液体試
料を10μ点着し、37℃で６分インクベーシヨン
し、中心波長540nｍの可視光でPET支持体側か
ら反射光学濃度を測定し、相対値を求めたところ
第２表に示す結果がえられた。 水性液体試料 ７％ヒト血清アルブミン水溶液（７％HSA水溶
液） コレステロール含有量 ゼロ モニトロール （米国デイド社製コントロール
血清） コレステロール含有量 約100mg／dl モニトロール （米国デイド社製コントロール
血清） コレステロール含有量 約200mg／dl プレチリツプEL （西独国ベーリンガーマンハ
イム社製コレステロール血清） コレステロール含有量 約360mg／dl
本発明の多層分析要素は保存中のカブリの発生
が少なく保存安定性が良好であり、発色濃度も従
来のロイコ色素とほぼ同程度であるところから検
出感度及び測定精度上の問題もない。特に、８カ
月の保存後においてもカブリの発生が極めて少な
い。
が少なく保存安定性が良好であり、発色濃度も従
来のロイコ色素とほぼ同程度であるところから検
出感度及び測定精度上の問題もない。特に、８カ
月の保存後においてもカブリの発生が極めて少な
い。
Claims (1)
- １ 少なくとも、光透過性水不透過性支持体、親
水性ポリマーバインダーにより形成された１層以
上の親水性層、及び展開層がこの順に積層される
とともにコレステロールエステラーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ及びペルオキシダーゼの各酵
素並びに発色試薬組成物を含有する一体型のコレ
ステロール分析用多層分析要素において、コレス
テロールエステラーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ及び前記発色試薬組成物
がいずれも展開層に含有され、前記発色試薬組成
物が４−アミノアンチピリンおよび４−アミノア
ンチピリン誘導体からなる群から選択された少な
くとも１種の化合物と２−ヒドロキシ−３，５−
ジクロロベンゼンスルホン酸の組合せであつてフ
エロシアン化物を含まず、かつ前記組成物の発色
反応が進行する層のPH値が分析操作時に7.5から
9.0の範囲内に維持されることを特徴とする一体
型のコレステロール分析用多層分析要素。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60150567A JPS6211167A (ja) | 1985-07-09 | 1985-07-09 | コレステロ−ル分析用多層分析要素 |
| US06/883,065 US4826761A (en) | 1985-07-09 | 1986-07-08 | Multilayer analytical element for analysis of cholesterol |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60150567A JPS6211167A (ja) | 1985-07-09 | 1985-07-09 | コレステロ−ル分析用多層分析要素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6211167A JPS6211167A (ja) | 1987-01-20 |
| JPH054031B2 true JPH054031B2 (ja) | 1993-01-19 |
Family
ID=15499705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60150567A Granted JPS6211167A (ja) | 1985-07-09 | 1985-07-09 | コレステロ−ル分析用多層分析要素 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4826761A (ja) |
| JP (1) | JPS6211167A (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5171688A (en) * | 1988-08-30 | 1992-12-15 | Cholestech Corporation | Self-corrected assay device |
| US5213964A (en) * | 1990-07-16 | 1993-05-25 | Cholestech Corporation | High-density lipoprotein solid-base precipitation assay method |
| US5213965A (en) * | 1990-07-16 | 1993-05-25 | Cholestech Corporation | Solid-phase precipitation assay device |
| JP3010086B2 (ja) * | 1991-08-02 | 2000-02-14 | 大阪瓦斯株式会社 | コジェネレーション発電装置 |
| RU94044169A (ru) * | 1994-12-16 | 1996-10-20 | И.А. Кочетов | Многослойный аналитический элемент |
| US6753159B1 (en) | 1998-08-06 | 2004-06-22 | Jin Po Lee | Uric acid assay device with stabilized uricase reagent composition |
| CA2306554A1 (en) * | 1998-08-06 | 2000-02-17 | Jin Po Lee | Uric acid assay device with stabilized uricase reagent composition |
| WO2002040707A1 (fr) * | 2000-11-14 | 2002-05-23 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Procede de mesure des lipides et reactif associe |
| DE60207196T2 (de) * | 2002-04-09 | 2006-07-20 | Cholestech Corp., Hayward | Verfahren und Vorrichtung zur Quantifizierung von Lipoprotein-Cholesterol hoher Dichte |
| US7824879B2 (en) * | 2007-01-09 | 2010-11-02 | Cholestech Corporation | Device and method for measuring LDL-associated cholesterol |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3992158A (en) * | 1973-08-16 | 1976-11-16 | Eastman Kodak Company | Integral analytical element |
| US3983005A (en) * | 1974-03-25 | 1976-09-28 | Eastman Kodak Company | Integral element for the analysis of cholesterol |
| US4089747A (en) * | 1976-08-09 | 1978-05-16 | Eastman Kodak Company | Compositions for the detection of hydrogen peroxide |
| US4414326A (en) * | 1978-04-24 | 1983-11-08 | Goldberg Jack M | Diagnostic agents |
| US4291121A (en) * | 1979-04-13 | 1981-09-22 | Miles Laboratories, Inc. | Bilirubin-resistant determination of uric acid and cholesterol |
-
1985
- 1985-07-09 JP JP60150567A patent/JPS6211167A/ja active Granted
-
1986
- 1986-07-08 US US06/883,065 patent/US4826761A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6211167A (ja) | 1987-01-20 |
| US4826761A (en) | 1989-05-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |