JPH01137998A - 分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、水性液体、特に体液中の酵素活性の測定や酵
素標識を利用する免疫学的分析に有用な分析要素に関す
る。

［従来技術］ 血液や尿などの体液に含まれる生体成分、薬物等の分析
は、病態の診断や治療経過の判定に非常に有用であり、
臨床検査の分野で重要な役割を持っている。乾式分析要
素を用いて体液などに含有されている生化学物質を定量
する分析方法が知られている。乾式分析要素では一般に
、被検成分と分析要素内に含まれる試薬との反応の反応
生成物または未反応成分の量を、光学的に、例えば発色
、変色、蛍光、発光等の分光測光により測定し、被検成
分を定量する。乾式分析要素を用いると、簡便、迅速に
、しかも高い精度で液体中の特定成分、例えば生化学的
活性物質の分析ができる。

血清中の各種酵素の活性は診断、治療の上で特に重要で
ある。乾式分析要素は酵素活性測定にも有用で、かよう
な乾式分析要素は八ｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、νｏ１．５５　Ｎｏ、４．　ｐ、５０４＾、　５
０６Ａ（Ａｐｒｉ１１９８３）、　特開昭５５−１２４
４９９号、同５８−１５５１００号。

同６０−４３４００号、同５７−４０６４９号、同５７
−１４４９９６号。

同５７〜２０８９９８号、同５９−３００６３号、同５
９−４２８９７号。

同６０−９５３４９号、同６１−１１００５８号等の記
載により知られている。

乾式分析要素は免疫学的分析にも有用である。

例えば特開昭４９−５３８８８号、特開昭５９−７７３
５６号、特開昭５９−１０２３８８号、米国特許４，４
５９，３５８号等に記載されている。免疫学的分析に利
用される抗原抗体反応は、抗原または抗体が互いに対応
する抗体または抗原のみに特異的に反応し結合する反応
であり、自己免疫疾患の診断、生体内微量物質の検出な
どに広く利用されている。検出感度の比較的高い免疫分
析法として、酵素免疫分析（ＥＩＡ）が知られている。

典型的な方法は特公昭５３−２７７６３号に開示されて
おり、酵素を抗原またはその誘導体に結合させて、酵素
標識抗原をつくり、酵素活性に対する抗原の効果の測定
により、被検液中の抗原を分析する方法である。

特開昭５３−１３１０８９号に記載された乾式分析要素
は、酵素の基質、例えば澱粉に、染料のごとき検出可能
の分光吸収を有する発色団を有する化学基を、予め結合
させた非拡散性基質を含む試薬層と、被検物質すなわち
酵素の作用により生した拡散性の反応生成物を受容する
検出表示層をそなえた多層分析要素である。分析要素の
検出表示層に受容された反応生成物の量に対応して、そ
れの有する染料等の有色化学基が与える吸収の光学濃度
を測定して、被検物質の量が決定される。

しかしこの分析要素では、非拡散性基質に検出可能の分
光吸収を有する発色団を予め結合させているので、未反
応の基質と反応生成物とを光学測定に際し識別できるこ
とが必須である。同公開明細書では、その方法の一つと
して、非拡散性の未反応基質を含む試薬層と、拡散性の
反応生成物を受容する検出表示層の間に、酸化チタン粒
子等を含む光遮断層を設けることを提案している。この
ような配置をもつ分析要素によって定量的な分析をおこ
なうためには、試薬層中に生じた拡散性反応生成物が光
遮断層を経て検出表示層に充分拡散するまでの時間を考
慮せねばならず、迅速な定量を特長とする乾式化学分析
において、明らかな不利益をもたらす。

反応生成物の拡散を速めるなめ、拡散性化合物＝４− の色素部位（検出可能の分光吸収を有する発色団を有す
る化学基の部分）に、カルボキシル基やスルホ基のよう
な拡散性基を２個以上導入する試みがなされている。し
かしこれらの置換基を導入し得る位置は限られており、
またその導入により、分析の感度を支配する色素部位の
分子吸光係数を低下させる。

［解決すべき技術的課題］ 本発明において解決すべき技術的課題は、検出可能な拡
散性化合物を放出する非拡散性基質を利用して、酵素活
性を測定するか酵素標識体の酵素活性測定を利用する乾
式多層化学分析要素において、迅速な分析を可能にし、
高い分析感度と分析精度を得ることにある。

より具体的には、上記原理に基づく分析要素において、
非拡散性基質を含む層と拡散性化合物を受容する層の間
に光遮断層を必要とせず、従って生成した拡散性化合物
の拡散が速められ、被検物質の活性または量に応じて非
拡散性基質がら、検出波長での吸光係数が高く容易に拡
散し得る拡散性化合物が放出されるよう改良された、乾
式分析要素を提供することである。

［技術的課題の解決手段］ 本発明の上記目的は、少なくとも２つの水浸透性層を有
し、水性液体試料中に含まれる酵素または含有量に応し
て酵素担持物質を生成もしくは減少するような被検物質
の定景に適する多層乾式化学分析要素であって、前記少
なくとも２つの水浸透性層の１つは酵素の基質を含む基
質層であり、他の］−）は呈色反応層てあって、前記基
質は分子中の発色団あるいは助色団部位に２座あるいは
３座の、金属と錯体を形成し得る基（塩を形成していて
もよい）を有する色素部を分子中に有する非拡散性物質
であり、酵素活性物質（酵素活性を有する物質の意）の
存在下て反応して、前記色素部を分子中に有する拡散性
物質を生成することがてき、呈色反応層には前記拡散性
物質の色素部と反応して安定な酸化状態の色素錯体を形
成することができる金属イオンまたは金属錯イオンを含
むことを特徴とする多層化学分析要素によって、達成さ
れた。前記金属イオンまたは金属錯イオンは無色の塩ま
たは錯塩として呈色反応層に含まれることが好ましく、
色素錯体の分光吸収は前記非拡散性物質または前記拡散
性物質の色素部のそれより、長波化されていることが望
ましい。

［発明の具体的構成の説明］ 以下、本発明の分析要素の構成と組成を具体的に説明す
る。本発明の実施態様の一例に−）いて断面を第１図に
示す。第１図の多層化学分析要素ては水不浸透性透明支
持体］０の上に、呈色反応層２０、基質Ｎ３０がこの順
に積層されている。

基質層３０には、金属錯体を形成し得る色素部を有して
おり、酵素である被検物質または被検物質の量に応して
生成もしくは減少する酵素担持物質（酵素自身あるいは
酵素結合物質）の作用により、水透過性媒体中を水の存
在下に拡散し得る拡散性化合物を生成し得る非拡散性基
質を含む。この拡散性化合物は、前記非拡散性基質に由
来する、金属錯体を形成し得る基をもつ色素部を有する
。

呈色反応層２０は、極大吸収波長が一時的に短波化した
色素部を有する拡散性化合物を受容し、この拡散性化＝
＜Ｓの色素部と反応して、極大吸収波長が長波化した安
定な錯体を形成させる金属イオンまたは錯イオンを水透
過性媒体中に含む。

基質層と呈色反応層はそれぞれ、親水性結合剤から成る
連続層としてもよい。両者とも親水性結合剤から成る場
合、親水性結合剤は互いに同じであっても異なってもよ
い。被検物質、非拡散性基質、拡散性化合物、復色反応
剤の各々またはその組合せに応じて、適当な親水性結合
剤をそれぞれ選択することができる。

非拡散性基質と復色反応剤は、互いに隔離されているこ
とが好ましい。第２図に示すように、基質層３０と呈色
反応層２０の間に、基質と復色反応剤の接触を防止する
なめの隔離層４０を設けてもよい。第３図は、本発明の
分析要素の好ましい実施態称を示す断面図で、光透過性
水不浸透性支持体１０の上に、呈色反応層２０、接触防
止層４０、基質ｆｆ１３０そして展開層５０をこの順に
積層した構成よりなる。

この図について本発明の分析要素の動作（分析の際の過
程）を説明する。被検物質を含有する試料水性液の一滴
が展開層に付着されると、展開層でほぼ均一に展開され
基質層３０に侵入する。基質中では、試料中に含まれる
酵素である被検物質または被検物質の量に応じて生成も
しくは減少する酵素担持物質の作用により、非拡散性基
質から拡散性化合物が生成し、基質層３０から隔離層４
０を通過して、呈色反応層２０に拡散していく。

反応生成物たる拡散性化合物には、非拡散性基質に由来
する金属錯体を形成し得る色素部位が連結しているので
、呈色反応層２０に到達すると、金属イオンまたは錯イ
オンと反応して速やかに安定な金属錯体を形成する。こ
の反応における波長のシフトは少なくとも３０ｎｍであ
り、好ましいのは５０ｎｍから１５０ｎｍである。色素
に金属錯体を形成し得る色素部位を結合させ、またそれ
を速やかにキレート化する技術の詳細は後述する。前記
した被検物質は、直接非拡散性基質に作用する酵素でも
よいし、また、被検物質と特異的な蛋白質結合反応（典
型的には免疫学的抗原抗体反応）の結果生成もしくは減
少する酵素担持物質、例えば抗原または抗体の酵素標識
物の酵素反応により、間接的に基質に作用するものでも
よい。被検物質と被検物質類縁体との競争的な蛋白質結
合反応の結果として、基質に対する作用が変調しうるよ
うな標識された蛋白質を介在させることも可能である。

上記の酵素担持物質は、分析要素外の水性媒体中であら
かじめ生成させてもよいし、本発明の多層化学分析要素
の適当な層で生成させてもよい。被検物質から酵素また
は酵素担持体を生成するための反応層を別に設けてもよ
い。この層は、分析要素と一体化されてもよいし、−時
的に接触し得るものでもよい。

非拡散性基質は基質層３０に留まり、酵素反応の結果生
じた拡散性化合物のみが呈色反応層２０に拡散して錯体
を形成する。拡散性化合物の量は非拡散性基質に対する
酵素活性に依存するので、結果として酵素活性に対応し
て錯体が形成されることになり、錯体の相対的生成量を
測定することにより酵素活性を知ることができる。被検
物質が酵素でなく、被検物質がその量に応して生成もし
くは減少する酵素担持物質を生成するか減少させる物質
である場合には、酵素担持物質の酵素活性を知ることが
できるので、被検物質の量を知ることができる。

錯体の量の相対的測定には、色素の吸収波長領域におけ
る透過又は反射による光学的測定が適しているが、目的
や必要精度によっては、目視により判定してもよい。

次に本発明め基質層に含まれる金属と錯体を形成し得る
基（以下、金属キレート化基と言う）を含む色素部を有
する非拡散性基質と呈色反応層に含まれる金属イオンと
のキレート化反応を原理的に説明する。アゾ系色素の発
色機構に関しては、多くの議論がなされている（例えば
Ｊ、Ｆａｂｉａｎ。

Ｈ，Ｈａｒｔｍａｎｎ著　Ｌｉｇｌ＋ｔ　　八ｂｓｏｒ
ｐｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ＯｒｇａｎｉｃＣｏｌｏｒａｎ
ｔｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ刊）。その中
てもっとも有力とされているのが分子内電荷移動型であ
る（例えば１１．Ｉｎｏｕｅ、　Ｂｕｌ　１ｅｔｉｎ　
ｏｆ　Ｃｂｅｍｉｃａｌ１ｌ− ３ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｊｎｐａｎ　４５巻、１０１８
ページ（１９７２年）に記載されている〉。

このモデルによって置換アゾベンゼン類の置換基効果は
ほとんどすべて矛盾なく説明される。っまりＤｏｎｏｒ
の電子供与性が増す程、又へｃｃｅｐｔｏｒの電子吸引
性が増す程、λｍａｘは深色的になるのである。本明細
書で述べている金属イオンとのキレート化による長波化
（深色化）という現象もまさに前述したアゾ色素の発色
機構で説明される。つまり金属によるキレート化とは色
素部の一対以上の電子を金属イオンに付与することに他
ならない。

ンとキレート化しうる基を有していればキレート化によ
り一対以上の電子を金属に付与しうろことく電子受容能
）は−段と増すことになり結果的に＝１２＝ λｍａｘはより深色的になるのである。

本発明に用いられる金属イオンとキレ−１〜化しうる色
素部位は、下記一般式＜１）によって表わされる。

［１１ 一般式（Ｉ）において、２は少なくとも１つの環が５〜
７個の原子から構成される芳香族の炭素環核または複素
環、例えばフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、ピラ
ゾリル基、インドリル基を完成するのに必要な原子群を
表し、Ｚ“は、少なくとも１つの環が５〜７個の原子が
ち構成されている芳香族の芳香環核又は複素環核（例え
ば前記Ｚについて例示された核）であり、この２′は、
アゾ結合に結合する箇所に隣接した位置において、ａ）
キレート化基として働く核の環内に窒素原子を有してい
るかあるいは ｂ）直接的又は間接的に窒素原子が結合している。

２゛としては例えば下記の基を適用することができる。

Ｒは炭素原子１から２０のアルキル基 Ｇは金属キレート化基（一対の電子を金属イオンに付与
し得る任意の基）あるいはその塩（例えばアルカリ金属
塩、第４アンモニウｌ＼塩など）を表す。Ｇは１価の基
であってもよく、あるいはＺに縮合した複素環の一部を
構成する窒素原子であってもよい。後者の場合、２及び
Ｇを形成する原子群は前記Ｚ°核と同一の核を形成する
ことができる。この種の金属キレート色素としては、例
えば特開昭５３−３５５３３号に記載されているが、そ
れらの色素をすべて本発明に利用することができる。

本発明において非拡散性基質に金属キレート化基を有す
る色素部を連結させる方法には、染料業界で広く用いら
れている反応性染料の技術が用いられる。染料業界では
、各種天然繊維に染料化合物を物理的に吸着させる他に
、化学結合を形成させ、より好ましい染料状態を得てい
る。この時用いられる染料が反応性染料てあり、 Ｋ、Ｖｅｎｋａｔａｒｍａｎ編“Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃＤｙｅｓ”第■巻、
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ社刊（１９７２年）にこ
の反応性染料が詳しく述べられている。特に天然高分子
である多糖類、例えばセルロースやでんぷん、蛋白質繊
維である羊毛、絹等の分子と染料分子を結合する「連結
基」は詳しく記載されており、これらの技術を参考にし
て非拡散性基質の合成を行うことができる。保護された
色素部を有する非拡散性基質は、例えば酵素反応により
、低分子化され、基質層から呈色反応層へ親水性媒体中
を拡散する必要があるので、可溶性基、例えばスルホ基
、カルボキシル基、ヒドロキシル基、四級アンモニウム
基を有することが好ましい。このような可溶性基は、連
結基の一部に導入されていても、色素部に導入されてい
てもよい。次に金属キレート化基を有する色素部の具体
例を示す。ここに示すのは一例であり、これらに限定さ
れるものではない。

Ｈ 「 ｌｌ Ｈ３ 本発明に用いられる金属イオンは呈色反応層内に存在し
ていてもよく、あるいは呈色反応層に隣接する層内に存
在していてもよい。本発明においてもっとも有効な金属
イオンは、そのようなイオンを呈色反応層内に混入した
場合、実質的に無色を呈し、酵素反応に対しては不活性
であり拡散してきた色素と容易に反応し、所望の色合を
もつ錯体の色素に配位結合し、安定な酸化状態を有して
おり、かつ熱、力及び化学薬品に対して安定な色素錯体
を形成するようなイオンである。−船釣に例えば銅（Ｉ
Ｉ）、亜鉛（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、白金（ｎ）、
パラジウム（ＩＩ）及びコバルト（Ｉｔ）イオンのよう
な多価金属イオン、あるいはそれらの無色錯体を用いた
場合に、良好な結果を得ることができる。以下に本発明
で用いられる金属キレート化基を有する色素部を有する
非拡散性基質の合成の具体例を示す。

（次ページへ） ＝２０− Ｄ−７を色素部として有する非拡散性基質の合成−〉　
　澱粉−Ｄ７ 上記反応中、化合物１（２−アミノ−４−ヒドロキシ−
６−メチルピリミジン）は入手可能な市販品である。

化合物λの合成： 冷却しながら亜硝酸ナトリウム（１，２ｇ＞を３０＋ｙ
ｆの濃硫酸に添加した。このけんだく液を６０℃に加温
して溶液とし、さらに２０℃に冷却したこの中に化合物
１．（２，３ｇ）を数等分して添加ｉ〜な。次いで得ら
れたけんたく液を３６Ｒ１の冷たい混酸（プロピオン酸
：酢酸−１＝５）に注ぎ急冷した。この方法によって化
合物２の溶液が得られた。

化合物士の合成： 化合物且バ４ｇ）を酢酸２００ｖ１に溶解し酢酸ナトリ
ウムを３０ｇ加えた。この混合物を１５℃に冷却し化合
物２の溶液を１滴ずつ添加した。　添加後（３０分後）
混合物をさらに１０℃で２時間かくはんした。反応混合
物を飽和食塩水５００ａ＋１で希釈し、得られた固体を
ろ取した。冷水で洗い乾燥したところ化合物先が４．６
ｇ得られた。

化合物−５−の合成： 化合物４　（４ｇ）を数等分して、３０ｙＲノ５ＯＣ１
２ニ添加したこのけんたく液に１１１のジメチルホルム
アミドを少しづづ滴下し得られた混合物を一晩がくはん
した。得られた溶液を５００ａ＋１の氷水に注いだ。固
体を濾取し、水洗後、乾燥すると、化合物ｉが３．２ｇ
得られた。

＋ｎ、ｐ：＞２５０” ニトロアミロペクチン体の合成： ピリジン（２４０１１１）に、アミロペクチン（シグマ
社ポテト由来）　１４ｇ、　ｐ−ニトロフェニルイソシ
アネート（２，４５ｇ）を加え１００’Ｃで２０時間撹
拌する。冷却後、アセ１ヘン（１ｐ）を加え、濾取する
。

アセ１〜ン、エタノール（１１）で良く洗浄後、減圧下
で乾燥し、ニトロアミロペクチン体（１５ｙ　）を得た
。元素分析く窒素の含有率）よりグルコース単位で４０
個に１個置換されたことに相当する。

アミノアミロペクチン体の合成： 水（５２０ｚ１）に上記のニトロアミロペクチン体（１
３１？）　、ハイドロサルファイトナ１ヘリウム（３，
ｈ）を加え、７０〜７５℃で一時間撹拌す。冷却後エタ
ノール（５００ｚＮ　）をゆっくり加える。デカントに
より析出する塊を分離し、この塊をエタノール−水（１
：１）溶液で良く洗浄する。乾燥し、アミノアミロペク
チン（５，３６ｇ）を得た。

Ｄ−７を色素部として有する非拡散性基質の合成；Ｄ　
Ｍ　Ａ　Ｃ（１６ｚｆ）　、水（１１１）の混合溶媒に
アミノアミロペクチン（８２０ｚｇ）を加え良く撹拌す
る。

この溶液に化合物Σ（２００旬）のＤ　Ｍ　Ａ　Ｃ（２
ｚ１）溶液を加えると黄色物質が析出する。濾取し、メ
タノール／クロロホルムで十分に洗浄する。乾燥して、
キレート化基を有するアミロペクチン体３００肩ｇを得
た。

本発明の分析要素において基質層は、分析要素の最上層
であってもよいし、最上層と呈色反応層の間にある層で
もよい。基質層が層状の連続相に非拡散性基質を含むも
のである場合、基質層は塗布により形成することができ
る。この場合、基質自身が高分子であるので、結合剤を
用いずに溶液を塗布して基質層を形成することもできる
。

また１種又は２種以上の親水性ポリマー溶液中に基質を
溶解又は分散した液を、塗布、乾燥する方法を用いるこ
とができる。基質層の塗布に用いうる親水性高分子とし
ては例えば、ゼラチンおよびその誘導体（例えばフタル
化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメ
チルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース）、アガ
ロース、アルギン酸ナトリウム、ポリアクリルアミド、
ポリメタアクリルアミド、アクリルアミドまなはメタア
クリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合体、ポ
リヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウ
ム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体、
マレイン酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体等があ
げられる。

これらのうちから、試料液や被検物質の特性、反応系、
塗布特性などを考慮して適当なものを選択する。

基質層にはその他に塗布性能、拡散性化合物の拡散性、
反応性、保存性などの諸性能の向上を目的として、酵素
の活性化剤、補酵素、界面活性剤、ｐＨ調節用試薬、微
粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるいは無機物から
なる各種添加剤を加えることができる。

基質層は、多孔質層であってもよい。多孔質層は繊維質
であってもよいし、非繊維質でもよい。

天然繊維から成る布、合成または半合成繊維から成る布
、不織布、紙、酢酸セルロース等がら成るメンブランフ
ィルタ−１無機物または有機物粒子の結合体等のいずれ
でもよい。例えば特開昭５５−１６４３５６号、同６０
−２２２７６９号等に記載された繊維質層のほか、特開
昭４９−５３８８８号、特開昭５８−７０１６３号、同
６１−４９５９号、特願昭６０−２５６４０８号、同６
０−２７９８５９号、同６０−２７９８６０号、同６０
−２７９８６１号等に記載されたような多孔性層も好適
である。多孔質層は、供給される液体の量にほぼ比例し
た面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する液
体展開層（以下、展開層ということもある）であっても
よいし、それ以外でもよい。

例えば紙、布、高分子から成る多孔質膜などに、基質を
予め含浸または塗布した後、支持体上に設けた他の水浸
透性層、例えば呈色反応層の上に、特開昭５５−１６４
３５６号のような方法て接着させるのも有用な方法であ
る。基質を予め含浸、塗布等により含有させた多孔性層
を、支持体」−に設けた他の多孔質層、例えば呈色反応
層の上に、例えば特開昭６１−４．９５９号等のような
方法で接着させる方法も適用てきる。別の方法として、
多孔性層を他の水浸透性Ｍ（例えば呈色反応層）の上に
前記のような方法で接着させた後、基質を含む組成物を
多孔性層に塗布してもよい。

多孔性層への含浸または塗布には公知の方法を利用でき
る。塗布には例えばデイツプ塗布、ドクター塗布、ホッ
パー塗布、カーテン塗布等を適宜選択して用いる。

基質層の厚さは特に制限はないが、塗布層として設ける
場合には１μｍ〜５０μｍ程度、好ましくは２μｍ〜３
０μｍの範囲が適当である。ラミネートによる積層など
塗布以外の方法による場合、厚さは数＋７１　ｒｒｌか
ら数百μｍの範囲で大きく変化し得る。

本発明の分析要素の呈色反応層としては、親水性ポリマ
ーを結合剤とする実質的に均一の層のほか、例えば特開
昭５８−７０１６３号、特開昭６１、−４９５９号、特
願昭６０−２５６４０８号、同６０−２７９８５９号、
同６０−２７９８６０号、同６０−２７９８６１号等に
記載されたような多孔性層も利用てきる。親水性ポリマ
ーとして例えば、ゼラチンおよびその誘導体（例えばフ
タル化ゼラヂン）、セルロース誘導体（例えばヒドロキ
シエチルセルロース）、アガロース、アルギン酸ナトリ
ウム、アクリルアミド重合体、メタアクリルアミド重合
体、アクリルアミドまたはメタアクリルアミドと各種ビ
ニル性モノマーとの共重合体、ポリヒドロキシエチルメ
タクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドン、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸と各種
ビニル性モノマーとの共重合体、マレイン酸と各種ビニ
ル性モノマーとの共重合体等が利用できる。

多孔性層に復色反応剤を含浸または塗布するには公知の
方法を利用できる。塗布には例えばデイツプ塗布、ドク
ター塗布、ホッパー塗布、カーテン塗布等を利用できる
。

呈色反応層には親水性バインダーのほか、塗布特性、拡
散性化合物の拡散性、反応性、保存安定性などの諸性能
の向上を目的として、界面活性剤、ｐ　Ｈ調節用試薬、
微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるいは無機物か
らなる各種添加剤を加えることができる。呈色反応層に
含有させることができるＭ街剤の例としては、炭酸塩、
ホウ酸塩、燐酸塩やＢｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ誌　第５
巻　第２号、４６７ページより４７７ページ（１９６６
年）に記載されているグツＦ（Ｇｏｏｃｌ）のＭ街剤な
どを挙げることができる。

抗原または抗体の酵素標識体を用いる場合、標識のため
に種々の酵素を選ぶことができる。充分高い酵素活性が
得られること、酵素の安定性、酵素活性への結合の影響
等を考慮して、酵素が選択される。特表昭５６−５００
９０１号明細書の第１表および第２表に記載されたもの
から選ぶことができる。代表的なものは、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、
α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、
セルラーゼ、デキストラナーゼ等である。

抗原または抗体に酵素を結合させる方法および本発明に
用いることかできる酵素標識抗原については、石川来泊
ら、［酵素免疫測定法（第２版）Ｊ（１９８２年）、　
河合忠編：［臨床検査技術全書４免疫血清検査」（医学
書院、１９７７年発行）、９７−１０２頁、Ｂ　ｉ　ｏ
ｃｈｅｍ　、　Ｂ　１ｏｐｌ＋ｙｓ、　Ｒｅｓ　、　Ｃ
ｏｍｍｕｎ、　、７４．５３８（１９７７）、Ｃｌ１ｎ
ｉｃａ　Ｃｈｉ＋ｎ１ｃａ　ＡｃＬａ　、８３，１６１
（１９７８）等の記載が参照できる。標識抗原および抗
体の具体例として　α−アミラーセ結合ヒト免疫グロブ
リン（ＩｇＧ）、ＡＬＰ結合ＩｇＧ、セルラーゼ標識α
−フェ１へプロティン等がある。

本発明の分析要素が酵素免疫測定法に利用される際、好
ましいのは次のような実施態様である。

例えば、リガンドを含有していることが期待される検体
と、リガン１く又はその誘導体と酵素との結合物（標識
リガンド）、及びリガンドに対する抗体を、あらかじめ
水性媒体中て反応させる。その後、本発明の分析要素に
前記反応液を滴下する方法がある。この時、抗体に結６
／非結合の標識リガンドを分離する操作を含んでもよい
。分離操作は例えば　石川来泊ら、酵素免疫測定法（医
学書院、１９８２年）に記載されている。

また他の例として、リガンドを含有していることが期待
される検体と、リガンドに対する抗体又はその誘導体と
酵素との結合物（標識抗体）を、あらかじめ水性媒体中
て反応させ、その後本発明の分析要素に前記反応液を滴
下する方法がある。

この時、リガンドか結合／非結合の標識抗体を分離する
操作を含んでもよい、また別の例としては前記標識リガ
ンドが、リガンドまたはその誘導体と、酵素の付活剤、
阻害剤または補酵素との結合物であってもよい。

さらに好ましい例として、前記標識リガンドおよびリガ
ンドに対する抗体、または標識抗体のすべてまたは一部
が、本発明の分析要素の適当な層に含有されていてもよ
い。また、本発明の分析要素の上に分析の実施の際に、
これらを含有する新たな層を設けてもよい。

本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る９要素は多孔性層、試薬層のほか、支持体、展開層
、検出層、光遮蔽層、接着層、ろ過層、吸水層、下塗り
層その他の層を含む多重層の構成を有してもよい。かよ
うな分析要素として、米国特許第３．９９２，１５８号
、同４，０４２．３３５号および特開昭５５−１６４３
５６号各明細書上聞示されたものがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合、木発明の乾式
分析要素の実用的に採りうる構成は（１）支持体上に呈
色反応層、その上に基質を含む展開層を有するもの。

（２）支持体上に検出層、呈色反応層、基質を含む展開
層をこの順に有するもの。

（３）支持体上に検出層、光反射層、呈色反応層、基質
を含む展開層をこの順に有するもの。

（４）支持体上に呈色反応層、基質層、展開層をこの順
に有するもの。

（５）支持体上に検出層、呈色反応層、基質層、展開層
をこの順に有するもの。

（６）支持体上に検出層、光反射層、呈色反応層、基質
層、展開層をこの順に有するもの。

呈色反応層は複数の層から成ってもよい。支持体と、呈
色反応層または検出層との間には吸水層を設けてもよい
。」−記（４）ないしく６）において基質層と展開層の
間に光反射層を設けてもよい。

基質層と展開層または呈色反応層との間にはろ過層を設
けてもよい。光反射層と展開層の間などにも、ろ過層を
設けてもよい。

検出層とは一般に、被検成分の存在下で生成した色素等
が拡散し、光透過性支持体を通して光学的に検出され得
る層で、親水性ポリマーにより構成することがてきる。

媒染剤、例えばアニオン性色素に対してカチオン性ポリ
マーを、含んでもよい。吸水層は一般に、被検成分の存
在下で生成する色素が実質的に拡散しないような層を言
い、膨潤しやすい親水性ポリマーにより構成することが
できる。

光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいものは
ポリエチレンプレフタレートである。親水性層を強固に
接着させるため通常、下塗り層を設けるか、親水化処理
を施す。

多孔性層を展開層として利用する場合、液体計量作用を
有する層であることが好ましい。液体計量作用とは、そ
の表面に点着供給された液体試料を、その中に含有して
いる成分を実質的に偏在させることなく、面の方向に単
位面積当りほぼ一定量の割合で広げる作用である。

展開層その他の多孔性層を構成する材料とじては、濾紙
、不織布、織物生地（例えば平織生地）、編物生地（例
えば、トリコット編）、ガラス繊維濾紙等を用いること
ができる。展開層としては、織物、編物等が好ましい。

織物等は特開昭５７−６６３５９号に記載されたような
グロー放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、
展開速度等を調節するため、特開昭６０−２２２７７０
号、特願昭６１−１２２８７５号、６１−１２２８７６
号、６１−１４３７５４号に記載したような親水性高分
子あるいは界面活性剤を含有してもよい。

多孔性層を接着し積層するための接着層を呈色反応層、
光反射層、濾過層、吸水層等の層の上に設けてもよい。

接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着することが
できるような親水性ポリマー、例えばゼラチン、ゼラチ
ン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からなることが
好ましい。

光反射層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能な変化
（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反
射測光する際に、展開層に点着供給された被検液の色、
特に試料が全血である場台のヘモグロビンの赤色等を遮
蔽するとともに、背景層としても機能する。光反射層は
、親水性ポリマーをバインダーとして、酸化チタン、硫
酸バリウム等の光反射性微粒子が分散された水浸透性の
層であることが好ましい。バインダーとしてはゼラチン
、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。

分析要素には、光反射層を設ける代わりに、またはそれ
と同時に、展開層、基質層、呈色反応層、検出層等の少
なくとも１つに、酸化チタン等の光反射粒子を含有させ
てもよい。

［参考例コ （１）呈色試験素子の作製 ゼラチン下塗りしである１８０μ肩のポリエチレンテレ
フタレート無色透明平滑フィルム上に、下記の組成［Ａ
］の溶液を乾燥後の厚さが３μ肩となるように塗布し、
乾燥したく呈色反応層１）。

［Ａ］　　ゼラチン　　　　　　　　１０ｇ蒸留水　　
　　　　　　１９０１１ ノニルフエノキシ ポリエトキシエタノール　０．２ｍｙ （オキシエチレン　４０単位） 硫酸ニッケル　　　　　　　３９ その上に下記の組成［Ｂ］の溶液を乾燥後の厚さが１０
μ屑となるように塗布し、乾燥した（呈色反応層２）。

［Ｂ］　　ゼラチン　　　　　　　　１０ｇ蒸留水　　
　　　　　　１８０ｚＺ 媒染剤（Ｉ＞　　　　　　　１０ｙ ノニルフエノキシ ポリエトキジエタノール　０．２ｍｇ （オキシエチレン　４０単位） 媒染剤（Ｉ）の化学構造 上記呈色反応層２の上に、５％ゼラチン水溶液を乾燥後
の厚さが２μ肩となるように塗布し、乾燥した（タイミ
ング層）。

呈色反応層とタイミング層を約３０ｇ／ｚ２の水で湿ら
せた後、ポリエチレンテレフタレート紡績糸（３６ゲー
ジ）からなるトリコット編物を圧着し乾燥させて展開層
としな。こうして作製した呈色試験フィルムを１５Ｘ１
５ｍｍに裁断し、直径１０ｍｍの窓を有する２　４　Ｘ
　２８ｍｍのプラスチック製フレームに装着して、呈色
試験素子を作製した。

（２）呈色試験 合成例の化合物４−の０　、５　ｍｇ７ｍｌ水溶液１０
μｐを、上記呈色試験素子の展開層の上に滴下した。

富士ドライケム１０００　（富士写真フィルム株式会社
製）アナライザーを用いて、温度３７℃における波長５
５０　ｎｍの反射光学濃度の変化を観察した。

結果は第４図の通りであった。合成例の化合物生は呈色
試験素子内でキレート化されて、吸収波長が長波にシフ
トすることがわかる。

［実施例］ 参考例と同様にしてポリエチレンテレフタレートフィル
ム上に、呈色反応層１と２、タイミング層を塗布した。

試薬層とタイミング層を約３０ｇｈ２の水で湿らせた後
、ポリエチレンテレフタレート紡績糸（３６ゲージ）か
らなるトリコット編物を圧着し乾燥させて展開層とした
。

上記展開層に下記組成［Ｃ］を有する塗布液を１２０　
ｍ（１／ｚ２の割合で塗布し、乾燥した。

［Ｃ］　　合成例の化合物色　　　　　　３ｇノニルフ
ェノキシ ポリエトキシエタノール＊　　０．２科（オキシエチレ
ン単位　１０） 蒸留水　　　　　　　　　１００ｘＺ こうして作製した呈色試験フィルムを１５×１５ｍｍに
裁断し、直径１０ｍｍの窓を有する２４×２８＋ｎｍの
プラスチック製フレームに装着して、アミラーゼ活性測
定用乾式分析要素（１）を完成した。

比較のため、上記組成［Ａ］がら硫酸ニッケルを省いた
分析要素く２）も作製した。

上記分析要素にヒト唾液アミラーゼ（シグマ社製）をそ
れぞれ０，２５０，５００．１０００単位／ｘｌ含有す
るＭ街溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＮ　５０ｍＭ、ｐＨ７）を
各Ｌｏμｄ点着し、富士写真フィルム（株）製「富士ド
ライタム１００ＯＪアナライザの光学系を用いて温度３
７℃で１２分反応後の波長５５０　ｎｍでの反射光学濃
度を測定した。得られた結果を第１表に示す。第１表か
ら明らかなように、本発明のアミラーゼ活性分析要素は
２５０〜１０００単位／ｄの範囲のアミラーゼ活性に対
し良好な呈色（復色）を示すことがわかる。

第１表

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図は分析要素の断面図である。 第４図は、呈色試験素子の光学濃度変化を示すグラフで
ある。 出願人　　富士写真フィルム株式会社 第１図 第２図 第４図 へ 旧 一 第３図 ＴＩＩ″ＩＥ　［ｍ　ｉ　ｒ１コ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも２つの水浸透性層を有し、水性液体中
   の特定成分の分析に適する多層乾式化学分析要素であっ
   て、 前記少なくとも２つの水浸透性層の１つは酵素の基質を
   含む基質層であり、他の１つは呈色反応層であつて、 前記基質は分子中の発色団あるいは助色団部位に２座あ
   るいは３座の金属と錯体を形成し得る基を有する色素部
   を有する非拡散性物質であり、酵素活性物質の存在下で
   反応して、前記色素部を分子中に有する拡散性物質を生
   成することができ、呈色反応層には前記拡散性物質と反
   応して安定な酸化状態の色素錯体を形成することができ
   る金属イオンまたは金属錯イオンを含むこと を特徴とする分析要素。
2. （２）呈色反応層に前記拡散性物質と反応して安定な酸
   化状態の色素錯体を形成することができる実質的に無色
   の金属塩または金属錯塩を含むことを特徴とする特許請
   求の範囲（１）の分析要素。
3. （３）前記呈色反応層で形成される前記色素錯体は分光
   吸収が前記非拡散性物質の色素部または前記拡散性物質
   の色素部より長波にあることを特徴とする特許請求の範
   囲（１）の分析要素。
4. （４）前記基質が被検物質の酵素活性により前記拡散性
   物質を生成する特許請求の範囲（１）の分析要素。
5. （５）前記基質が被検物質の量に応じ生成または減少す
   る酵素担持物質の酵素活性により前記拡散性物質を生成
   する特許請求の範囲（１）の分析要素。