DE3587804T2 - Testverfahren. - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Assay eines von einem Paar spezifischer Bindungspartner und Reagenzausrüstungen zur Durchführung dieser Verfahren.
- Es besteht gegenwärtig eine erhebliche Notwendigkeit für schnelle und genaue Verfahren zum Testen biologisch aktiver Substanzen (die in geringen Konzentrationen vorliegen können), insbesondere in Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel oder Urin. Eine breite Vielfalt medizinischer Zustände wie Schwangerschaft, Arzneimittelüberdosierung, metabolische Geburtsdefekte, hormonelle Krankheiten und Diabetes können unter Verwendung derartiger Assaytechniken diagnostiziert werden.
- Viele Assay(Test)verfahren beruhen auf der Bildung eines Komplexes zwischen den zu untersuchenden Spezies (nachfolgend als "Ligand" bezeichnet) und einem anderen Spezies, an das sich der Ligand spezifisch bindet (nachfolgend als "spezifischer Bindungspartner" bezeichnet). Der Umfang der Komplexbildung ist eine Funktion der Menge des vorhandenen Liganden.
- Die Assay des Liganden erfolgt durch Beobachtung des Umfanges der Komplexbildung, zum Beispiel durch Überwachung von chemischen oder biochemischen Markern. Bisher sind verschiedene Verfahren zur Markierung angewandt worden, zum Beispiel unter Verwendung radioisotopischer, fluoreszenter oder biolumineszenter Spezies, der Spin-Markierung oder der Enzym- Markierung.
- Es gibt verschiedene Nachteile bei der Verwendung radioaktiver Marker. Sie sind hinsichtlich der Lagerfähigkeit infolge des spontanen Zerfalls beschränkt, erfordern eine häufige Nacheichung der Ausrüstung, und ihre Verwendung erfordert die Befolgung strenger Sicherheitsbestimmungen und ist Gegenstand einer gesetzlichen Regulierung. Diese Nachteile führen unvermeidlich zu höheren Kosten und zur Notwendigkeit für hohe Standards ausgereifter Ausrüstung, Laborausstattung und Personal.
- Die EP-A-125139 und die EP-A-149339 sind Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ.
- Im Hinblick auf die Nachteile, die mit radioaktiven Markern verbunden sind, stellt die Verwendung von Enzymen potentiell eine außerordentlich wertvolle Markierungstechnik dar.
- Es gibt zwei Kategorien von Assays, bei denen Enzym-Marker angewandt werden, die als "heterogene" bzw. "homogene" bezeichnet werden. Bei der heterogenen Technik bleibt die Aktivität des Enzym-Markers in Richtung auf dessen Substrat konstant, unabhängig davon, ob oder nicht das markierte Reagenz an dessen spezifisches Gegenstück bei der Komplexierungsreaktion gebunden wird. Bei einer solchen Technik ist es daher erforderlich, die Reaktanten in zwei Fraktionen zu trennen vor der Bestimmung des Anteiles des Markers, in entweder die komplexierte oder die unkomplexierte Phase. Bei der homogenen Technik verhält sich der Enzym-Marker unterschiedlich in Abhängigkeit davon, ob das Reagenz an sein spezifisches Gegenstück in der Komplexierungsreaktion gebunden wird oder nicht und ob keine Trennstufe erforderlich ist. Durch Messung der Aktivitätsänderung des Enzym-Markers in Richtung auf dessen Substrat als Ergebnis der Komplexierung kann die Assay des Liganden bestimmt werden.
- Im allgemeinen ist die heterogene Technik empfindlicher (sie hat eine vergleichbare Empfindlichkeit mit Assays unter Verwendung von Radioisotop-Markern), während die homogene Technik einfacher und schneller ist (sie ist in dieser Hinsicht der Radioisotop-Markierung beträchtlich überlegen). Homogene Enzym-markierte Assayverfahren sind für die Automatisierung besonders geeignet. Wegen des Fehlens rechtlicher Einschränkungen, der relativ geringen erforderlichen Betriebskosten sowie Fachkenntnis und der Sicherheit und der Stabilität der Reagenzien sind, sowohl die homogene als auch die heterogene Technik den Assayverfahren unter Verwendung von Radioisotop-Markern beträchtlich überlegen.
- Bisher sind jedoch nur indirekte Verfahren zur Überwachung des Enzym-Markers eingesetzt worden. So ist zum Beispiel das Auftreten des Produktes der Enzym-katalysierten Reaktion spektrofotometrisch gemessen worden (mit Hilfe der Erzeugung eines gefärbten Produktes entweder als Ergebnis der Substratreaktion oder als Ergebnis einer Sekundärreaktion, bei der das Produkt der Substratreaktion mit einem Chromogen reagiert, gegebenenfalls in Anwesenheit eines zweiten Enzyms, wobei die Enzymaktivität durch die Farbänderung der Lösung bestimmt wird), durch Nephelometrie (worin das Produkt eine Trübung der Lösung hervorruf t, wobei der Grad der Trübung auf die Enzymaktivität bezogen wird), durch Fluorimetrie oder Radiometrie (worin das Erscheinen eines fluoreszierenden oder radioaktiven Markers in dem Produkt überwacht wird) oder durch Messen der Veränderung beim pH der Lösung. Alternativ dazu ist der Verbrauch der Reaktanten gemessen worden, zum Beispiel durch Gasanalyse im Falle der Oxidationsreaktionen, bei denen atmosphärischer Sauerstoff ein Reaktionsteilnehmer ist.
- So wurde zum Beispiel in Assays unter Verwendung des Enzym-Markers Glucoseoxidase (GOD) (E.C.1.1.3.4), der die Oxidation von Beta-D-Glucose zu D-Glucono-δ-lacton (mit Wasserstoffperoxid als Nebenprodukt) katalysiert, der Marker überwacht, indem der Reduktion des Wasserstoffperoxids in Gegenwart von Meerrettichperoxidase und einem Chromogen gefolgt wurde nach dem folgenden Reaktionsablauf Glucoseoxidase Peroxidase
- Bei einem solchen indirekten Beobachtungsverfahren fehlt der hohe Grad an Empfindlichkeit und Spezifizität, der für eine moderne Assayarbeit erforderlich sind. Dies ist der Tatsache geschuldet, daß weder die primäre noch die sekundäre Reaktion hundertprozentig quantitativ ist, oder es gibt Ungenauigkeiten bei der Feststellung des Endpunktes. Die Verwendung radioaktiver Marker ergibt die üblichen Probleme von Sicherheit und kurzer Lagerfähigkeit der Reagenzien. Die bei den spektrofotometrischen Verfahren verwendeten Chromogene sind oft carcinogen.
- Es ist eines der Ziele der vorliegenden Erfindung, diese Nachteile bei der Verwendung von Enzym-Markern zu überwinden, und ein empfindliches, spezifisches und bequemes Assayverfahren bereitzustellen, bei dem der Enzym-Marker direkt beobachtet wird.
- Es wurde nun gefunden, daß elektrochemische Techniken angewandt werden können für Enzym-markierte Assayverfahren, um Mittel für die direkte Beobachtung der Aktivität des Enzym- Markers bereitzustellen.
- Somit wird nach einem Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zu Assay eines Liganden in einer Probe bereitgestellt unter Verwendung einer elektrochemischen Vorrichtung mit einer Arbeitselektrode und einer Hilfselektrode, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch Kontaktieren des Probenliganden mit Komponenten, die umfassen:
- (a) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden,
- (b) gewünschtenfalls wenigstens ein weiteres Reagenz, ausgewählt unter Ligand-Analogen und spezifischen Bindungspartnern für den Liganden, wobei die Komponente (a) oder wenigstens eine der Komponenten (a) und (b) mit einem Oxidoreduktase- Enzym markiert sind,
- (c) ein Substrat für das Enzym, und
- (d) eine chemische Spezies, ausgewählt unter Elektronentransfervermittlern und -beschleunigern, die den Transfer der Elektronen von dem Substrat zur Arbeitselektrode über das Enzym, das aus der Oxidation des Substrates resultiert, oder den Transfer der Elektronen von der Arbeitselektrode zu dem Substrat über das Enzym unter Gestattung der Substratreduzierung unterstützt;
- und Bestimmung ob und gewünschtenfalls bis zu welchem Grade der Elektronentransfer gestört ist durch (i) Komplexbildung oder (ii) Ersatz eines beliebigen Enzym-markierten Komplexes, der den Liganden enthält, in Bezug auf irgendeine andere Enzym-markierte Komponente, oder wo ein Enzym-markiertes Ligand- Analoges als Komponente (b) vorhanden ist, Ersatz eines beliebigen Komplexes, der das Ligand-Analoge enthält, in Bezug auf ein nicht-komplexiertes Enzym-markiertes Ligand-Analoges, das Gegenstand der einen oder der anderen nachstehenden Maßgaben ist.
- In dem Vertragsstaat AT besteht die Maßgabe, daß wenn keine Ersatz-Stufe durchgeführt wird, keine Komponente (b) vorhanden ist, und die Komponente (a) eine Nukleinsäure ist, die nicht auf einem festen Träger immobilisiert ist, wobei die Komponente (d) ein Elektronentransferbeschleuniger ist. In den restlichen Vertragsstaaten besteht die Maßgabe, daß wenn keine Komponente (b) vorhanden ist und der Ligand an einer Wand der Vorrichtung immobilisiert ist und die Komponente (c) nach dem Ersatz hinzugegeben wird, dann die Komponente (a) und der Ligand keinen Antikörper bzw. kein Antigen zu jenem Antikörper repräsentiert, und sie gilt für ein Verfahren, das auf Elektronentransferübermittler bei (d) beschränkt ist, wobei der Elektronentransfer durch Ersatz gestört wird.
- Die Assay kann durch Bestimmung der Störung unter Berücksichtigung von Eichdaten vervollständigt werden.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines elektrochemischen Verfahrens zur Assay eines Liganden in einer Probe unter Verwendung einer elektrochemischen Vorrichtung mit einer Arbeitselektrode und einer Hilfselektrode, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch Kontaktieren des Probenliganden mit Komponenten, die umfassen: (a) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden,
- (b) gewünschtenfalls wenigstens ein weiteres Reagenz, ausgewählt unter den Ligand-Analogen und spezifischen Bindungspartnern für den Liganden, wobei die Komponente (a) oder wenigstens eine der Komponenten (a) und (b) mit einem Oxidoreduktase-Enzym markiert ist,
- (c) ein Substrat für das Enzym, und
- (d) einen Elektronentransfervermittler, der den Transfer der Elektronen von dem Substrat zur Arbeitselektrode über das Enzym, das aus der Oxidation des Substrates resultiert, oder den Transfer der Elektronen von der Arbeitselektrode zu dem Substrat über das Enzym unter Gestattung der Substratreduzierung unterstützt,
- und Bestimmung ob und gewünschtenfalls bis zu welchem Grade der Elektronentransfer durch Komplexbildung gestört ist, mit der Maßgabe, daß
- (I) wo keine Komponente (b) vorhanden ist und sowohl die Komponenten (a) als auch (d) an der Arbeitselektrode immobilisiert sind, dann die Komponente (a) und der Ligand keinen Antikörper bzw. kein Antigen für jenen Antikörper repräsentieren;
- (II) wo die Komponente (b) vorhanden ist und die Komponente (a) nicht auf einem festen Träger immobilisiert ist, der Ligand keine Nukleinsäure ist; und
- (III) wo ein Enzym-markiertes Ligand-Analoges als Komponente (b) vorhanden ist und das Ligand-Analoge mit der Komponente (a) vor der Zugabe des Probenliganden komplexiert wird, die Komponente (a) und der Ligand keinen Antikörper bzw. kein Antigen für jenen Antikörper repräsentieren.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines elektrochemischen Verfahrens zur Assay eines Liganden in einer Probe unter Verwendung einer elektrochemischen Vorrichtung mit einer Arbeitselektrode und einer Hilfselektrode, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch Kontaktieren des Probenliganden mit Komponenten, die umfassen:
- (a) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden,
- (b) gewünschtenfalls wenigstens ein weiteres Reagenz, ausgewählt unter den Ligand-Analogen und spezifischen Bindungspartnern für den Liganden, wobei die Komponente (a) oder wenigstens einer der Komponenten (a) und (b) mit einem Oxidoreduktase-Enzym markiert ist,
- (c) ein Substrat für das Enzym,
- (d) einen Elektronentransferbeschleuniger, der den Transfer der Elektronen zwischen dem Enzym und der Arbeitselektrode unterstützt durch Halten des Enzyms in nächster Nähe zur Arbeitselektrode ohne Aufnahme einer Ladung während des Elektronentransfers;
- und Bestimmung ob und gewünschtenfalls bis zu welchem Grade der Elektronentransfer gestört ist durch (i) Komplexbildung oder (ii) Ersatz eines beliebigen Enzym-markierten Komplexes, der den Liganden enthält, in Bezug auf irgendeine andere Enzym-markierte Komponente, oder wo ein Enzym-markiertes Ligand- Analoges als Komponente (b) vorhanden ist, Ersatz eines beliebigen das Ligand-Analoge enthaltenden Komplexes in Bezug auf ein nicht-komplexiertes Enzym-markiertes Ligand-Analoges.
- Die Erfindung betrifft auch eine Ausrüstung zur Durchführung eines Assayverfahrens nach dem ersten Gegenstand der Erfindung, wenn eine Komponente (a) immobilisiert ist, wobei die Ausrüstung umfaßt:
- (i) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden, der auf einem festen Träger immobilisiert ist,
- (ii) ein weiteres Reagenz, ausgewählt unter Ligand-Analogen und spezifischen Bindungspartnern für den Liganden, der mit einem Oxidoreduktase-Enzym markiert ist, und
- (iii) einen Elektronentransfervermittler, der zur Unterstützung des Transfers der Elektronen zwischen dem Enzym und der Arbeitselektrode in Gegenwart des Substrates für das Enzym in der Lage ist.
- Die Erfindung betrifft als weiteren Gegenstand eine Ausrüstung zur Durchführung eines Verfahrens zur Assay nach der Erfindung, wobei ein Elektronentransferbeschleuniger vorhanden ist, und wobei die Ausrüstung umfaßt:
- (i) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden,
- (ii) falls erforderlich wenigstens ein weiteres Reagenz, ausgewählt unter Ligand-Analogen und spezifischen Bindungspartnern für den Liganden, wobei die Komponente (i) oder wenigstens einer der Komponenten (i) und (ii) mit einem Oxidoreduktase-Enzym markiert ist, und
- (iii) einen Elektronentransferbeschleuniger, der zur Unterstützung des Transfers der Elektronen zwischen dem Enzym und der Arbeitselektrode in Gegenwart des Substrates für das Enzym in der Lage ist.
- Der Begriff "Ligand-Analoges", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Spezies, die zur Komplexierung mit dem gleichen spezifischen Bindungspartner wie der zu testende Ligand in der Lage ist und schließt unter anderem eine bekannte Menge der zu testenden Ligandenspezies ein.
- Der Begriff "Enzym-markiert", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Anfügung eines Enzyms (wobei der Begriff sowohl richtige Enzyme als auch Apoenzyme mit einbezieht, die in Gegenwart eines Co-Faktors aktiviert werden können) an wenigstens eines der Reagenzien, die die Komponenten (a) und (b) umfassen. Bevorzugte Enzyme sind die sogenannten Oxidoreduktasen, insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, Flavo- und Chinoproteinenzyme, z. B. Glucoseoxidase, Glucosedehydrogenase oder Methanoldehydrogenase. Als ein Apoenzym kann zum Beispiel Apoglucoseoxidase verwendet werden.
- Das Enzym kann an die Komponenten (a) und (b) nach einem beliebigen bekannten Verfahren angefügt werden durch Kupplung an andere Substanzen, z. B. durch Einbeziehung einer kovalenten oder nicht-kovalenten Bindung unter Verwendung bifunktioneller Reagenzien wie Glutaraldehyd, Per-Iodat, N,N'-o-Phenylen-dimaleimid, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid-ester, Succinsäureanhydrid, ein gemischtes Anhydrid oder ein Carbodiimid. Alternativ dazu kann die Vernetzung oder die Bildung von zum Beispiel einem Avidin/Biotin- oder Protein A/IgG-Komplex eingesetzt werden. Die Stelle der Anfügung ist im allgemeinen räumlich entfernt von der aktiven Stelle des Enzyms, so daß die Enzymaktivität nicht verschlechtert wird. Darüber hinaus sollte die Anfügung des Enzyms die spezifischen Bindungsmerkmale der Komponenten (a) und (b) nicht beeinträchtigen.
- Die chemischen Spezies der Komponenten (d) können zum Beispiel umfassen einen Elektronentransfervermittler, der Elektronen von dem Enzym aufnehmen kann und sie an die Elektrode (während der Substratoxidation) abgeben kann, oder der Elektronen von der Elektrode aufnehmen kann und sie an das Enzym (während der Substratreduktion) abgeben kann. Der Vermittler kann zum Beispiel ausgewählt werden unter den folgenden:
- (i) einem Polyviologen wie zum Beispiel einer Verbindung der Formel
- und Derivaten davon, z. B. Seitenketten-Alkylderivaten, deren Herstellung in Polymer Letters 9, S. 289-295 (1971) beschrieben ist,
- (ii) eine Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht, ausgewählt unter Chloranilen, Fluoranilen und Bromanilen (z. B. o-Chloranil),
- (iii) Ferrocen (bis-n&sup5;-Cyclopentadienyl-Eisen(II)) oder ein Derivat davon [einschließlich von z. B. funktionalisierten Derivaten wie Ferrocen-monocarbonsäure (FMCA), Dimethylaminomethyl-ferrocen, polymere Formen ("Polyferrocene") wie (Ferrocen)&sub4; oder Polyvinyl-ferrocen und "Bortetraferrocen" (B(ferrocen)&sub4;)],
- (iv) Verbindungen biologischen Ursprungs, die eine geeignete Enzymkompatibilität haben, z. B. Vitamin K,
- (v) N,N,N',N'-Tetramethyl-4-phenylendiamin und
- (vi) Derivate von Phenazinmethosulfat oder Phenazinethosulfat.
- Die Vermittler können mit dem Enzym an einer Stelle wechselwirken, die räumlich-entfernt ist von der aktiven Stelle für die Substratreaktion oder nahe daran und die räumlich entfernt ist oder nahe an der Stelle für die Anfügung der Reagenzien (a) und (b). Die Nähe der Stelle der Enzym-Vermittler-Wechselwirkung zu der Stelle der Anfügung der Reagenzien kann zu einer Verhinderung des Elektronentransfers zwischen dem Enzym und dem Vermittler bei der Bildung des Komplexes zwischen dem Liganden oder dem Ligand-Analogen und dem spezifischen Bindungspartner führen, wodurch ein homogenes Assayverfahren ermöglicht wird, wie es unten beschrieben wird.
- Die bevorzugten Elektronentransfervermittler sind Ferrocen und funktionalisierte Derivate davon. Diese Verbindungen sind wünschenswert für diesen Zweck, da sie relativ billig, stabil, nicht-toxisch sind und ein leicht elektrochemisch reversibles System darstellen, das in seinem reduzierten FeII-Zustand nicht empfindlich gegen Oxidation durch Sauerstoff an Luft ist.
- Die Elektronentransfervermittler können eine Funktionalisierung erfordern, um eine zufriedenstellende Wechselwirkung mit der Elektrode und/oder dem Enzym zu gestatten oder um die elektrochemischen oder anderen Eigenschaften des Vermittlers zu verbessern. Zum Beispiel beträgt das Redox-Potential von Ferrocen + 422 mV gegen NHE. Durch Einführung funktioneller Gruppen an das Ringsystem kann diese Zahl zwischen + 300 und + 650 mV variiert werden. Darüber hinaus ist die Wasserlöslichkeit der Carboxy-substituierten Ferrocene größer als die der Elternverbindung (siehe z. B. R.Szentrimay, 1977, Amer. Chem. Soc. Symposium Series, 38, 154).
- Somit kann es zum Beispiel im Falle des Ferrocens erforderlich sein, den Ferrocenkomplex zu modifizieren, indem eine oder beide Cyclopentadienyl-Gruppen mit einer oder mehreren Seitenketten versehen werden, z. B. der Formel
- -CHO, -(CH&sub2;)nCOOH oder -(CH&sub2;)mNR¹R²
- worin n und m beispielsweise 0 bis 6 sein können, und R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen (z. B. Methyl). Zusätzliche funktionelle Gruppen können in die Seitenketten eingeführt werden, normalerweise solche Gruppen, wie sie bei der chemischen Modifizierung von Proteinen verwendet werden, zum Beispiel Quecksilberchlorid, Vorläufer von Nitrenen und Carbenen, Diazo- oder Iodid-Gruppen. Eine ähnliche Funktionalisierung kann wünschenswert sein, wenn andere Vermittler als Ferrocen verwendet werden.
- Alternativ dazu können die chemischen Spezies der Komponente (d) einen Elektronentransferbeschleuniger umfassen (zum Beispiel einen Elektroden-immobilisierten Elektronentransferbeschleuniger), der, anders als die oben beschriebenen Vermittler, keine formelle Ladung während des Elektronentransfers aufnimmt, jedoch den Elektronenfluß durch Beibehalten des Enzyms in unmittelbarer Nähe der Elektrode gestattet. Der Beschleuniger kann zum Beispiel ein Magnesium-Ion sein oder 4,4'-Bipyridyl, wobei das letztere besonders geeignet ist bei Verwendung mit Laccase oder Superoxiddismutase und einer Arbeitselektrode aus Gold.
- Wenn der verwendete Marker ein Apoenzym ist, können die chemischen Spezies der Komponente (d) zum Beispiel einen Elektroden-immobilisierten Co-Faktor des Apoenzyms umfassen (z. B. NAD, NADH, NADP oder FAD, wenn ein Apoenzym einer Oxidoreduktase verwendet wird). Der Co-Faktor wird im allgemeinen mit dem Apoenzym in normaler Weise wechselwirken. Somit kann zum Beispiel der Marker Apoglucoseoxydase sein und die Komponente (d) Elektroden-immobilisiertes Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD).
- Die Wechselwirkung zwischen der Komponente (d) und dem Enzym kann somit die Form einer chemischen Bindung annehmen z. B. auf Wegen, die analog dem Binden des Enzym-Markers an die Komponenten (a) und falls vorhanden (b) wie oben beschrieben sind, oder kann die Form einer nichtchemischen Bindung oder Nicht-Bindungs-Wechselwirkung annehmen.
- Die Arbeitselektrode, von der die elektrochemischen Meßwerte aufgenommen werden, ist vorzugsweise fest und hat eine elektrisch leitfähige Arbeitsoberfläche aus z. B. Kohlenstoff (vorzugsweise Graphit, z. B. pyrolytischer Graphit) oder Metall, z. B. Silber, Gold oder Platin. Wenn die Elektrode aus Kohlenstoff ist, kann sie als vorgeformter Stab oder als eine Elektrodenform vorhanden sein, die aus einer Paste aus Kohlenstoffteilchen hergestellt wird. Die Art der Oberfläche der Elektrode ist üblicherweise wichtig. Falls aus Metall, kann die Oberfläche auf gerauht oder chemisch modifiziert werden, falls aus festem Kohlenstoff, kann die Oberfläche vorher in einem Ofen mit einem Sauerstoffüberschuß wärmebehandelt werden oder elektrochemisch oxidiert werden.
- Zusätzlich zu der Arbeitselektrode, von der die elektrochemischen Meßwerte abgenommen werden, kann die Vorrichtung eine Hilfs(Gegen-)elektrode umfassen und gegebenenfalls eine Referenzelektrode, wobei die Elektroden in Verbindung mit einem Potentiostaten und einem empfindlichen Strom-Meßgerät verwendet werden. Die Vorrichtung enthält vorzugsweise ein wäßriges Assaymedium, bestehend unter anderem aus pH-Puffer. Es können Einrichtungen vorgesehen sein zur Inkubierung des Assaymediums bei einer gewünschten Temperatur. Eine geeignete elektrochemische Vorrichtung ist im senkrechten Schnitt in Fig. 1 (a) der dazugehörigen Zeichnungen erläutert. Die Arbeitselektrode 1 besteht aus einem länglichen Kern 2 aus Stahl, an der Spitze mit einer Arbeitsoberfläche 3 aus pyrolytischem Graphit, und sie hat einen Überzug 4 aus Epoxidharz. Die Hilfs(Gegen-)elektrode 5 besteht aus Platin. Eine Kalomel- Referenzelektrode 6 ist gezeigt, verbunden mit der Zelle über eine Lugginsche Kapillare 7. Die Zelle und die Referenzelektrode sind durch einen Wassermantel 8 umschlossen.
- Zur Messung des elektrochemischen Merkmals der Komponenten kann eine Vielzahl elektrochemischer Methoden angewandt werden, die zwei der drei Parameter Potential (E), Strom (i) und Zeit (t) auswerten. Zum Beispiel kann die elektrochemische Messung erfolgen unter Verwendung der Differenzimpuls-Voltammetrie, der zyklischen Voltammetrie oder der Rechteckwellen- Voltammetrie. Wenn die zyklische Voltammetrie verwendet wird, kann ein Stromkreis, wie zum Beispiel der schematisch in Fig. 1 (b) der dazugehörigen Zeichnungen gezeigte, angewandt werden. In dieser Figur stellt C die Hilfs(Gegen-)elektrode dar, W ist die Arbeitselektrode und R die Referenzelektrode. Dieser Stromkreis kann üblicherweise in Verbindung mit einer Vorrichtung des in Fig. 1 (a) gezeigten Typs verwendet werden, wobei der elektrochemische Strom i unter Einsatz eines Potentiostaten gemessen wird.
- In homogenen Assaysystemen kann die Bildung des Komplexes zwischen dem Liganden und dem spezifischen Bindungspartner oder im Falle der Vergleichsassay zwischen dem Ligandenanlogen und dem spezifischen Bindungspartner eine Änderung hervorrufen in der Fähigkeit der Elektronen, z. B. von dem Enzym zur Elektrode zu fließen und umgekehrt. Dies kann zum Beispiel das Ergebnis sein von:
- 1. Verhinderung, daß das Substrat die aktive Stelle des Enzyms bei Bildung des Komplexes erreicht oder das Produkt sie verläßt;
- 2. der Änderung der Angleichung des Enzyms durch die Bildung des Komplexes, so daß das Enzym nicht in der Lage ist, sein Substrat zu oxidieren oder zu reduzieren, ungeachtet dessen, daß das Substrat die aktive Stelle des Enzyms einnimmt;
- 3. Änderung der Angleichung des Enzyms durch die Bildung des Komplexes, so daß die freie Passage der Elektronen zwischen dem Enzym und dem Vermittler gehemmt wird ungeachtet ihrer engen Nähe zueinander; oder
- 4. Blockierung des Austauschs zwischen dem Enzym und dem Vermittler durch die Bildung des Komplexes, wodurch der Elektronentransfer verhindert wird.
- In einer typischen homogenen Assay stört daher die Bildung des Komplexes eine elektrochemische Charakterisierung der Komponenten der Lösung. Zur Bestimmung eines vollständigen Voltammogramms ist die Messung des elektrochemischen Merkmals nicht erforderlich; es kann zum Beispiel für ein entsprechend ausgewähltes ausgewogenes Potential ausreichend sein, Meßwerte des Stromes an diesem Punkt zu nehmen. Der Grad der Störung kann dann in Bezug gebracht werden zu der Menge des in der Probe vorhandenen Liganden über Eichdaten, die mit einem ähnlichen System unter Verwendung bekannter Mengen des Liganden erhalten wurden.
- Obgleich die Reihenfolge der Einführung der Probe und der Komponente(n) in die Vorrichtung nicht kritisch ist, wird vorgezogen, daß ein Komplex nach Einführung der letzten der Probenkomponente(n) gebildet wird, jedoch nicht davor. Es ist allerdings auch möglich, für jene als Komplex vorzuliegen, bevor die letzte dieser Komponenten wieder hinzugegeben wird, wobei in einem solchen Falle die Endkomponente komplexiert wird, indem eine Komponente des Komplexes ersetzt wird. Es kann erforderlich sein, diese Komponenten für einen gewissen Zeitraum zu inkubieren, um die Komplexierungsreaktion zur Erreichung des Gleichgewichtes zu ermöglichen, bevor die Komponenten (c) und (d) hinzugegeben werden. Die Zugabe der Komponenten (c) und (d) sollte die Komplexierungsreaktion nicht bewirken, jedoch müssen diese Komponenten vorhanden sein, bevor die Messungen an der Arbeitselektrode vorgenommen werden können.
- In einem erfindungsgemäßen Verfahren unter Anwendung der sogenannten "Sandwich"-Technik wird ein mehrwertiger Ligand mit einem Festphasen-Bindungspartner unlöslich gemacht und mit einem spezifischen Bindungspartner in Komponente (a), die einen Enzym-Marker trägt, reagiert. Die nachfolgende Zugabe der Komponenten (c) und (d) gestattet die elektrochemische Überwachung der Aktivität des Markers. In Abhängigkeit von der Reihenfolge der komplexierenden Reaktionen sind nach der vorliegenden Erfindung die Vorwärts-, schnelle Vorwärts-, Umkehr- und Simultan-Variation möglich. Der Festphasen-Bindungspartner kann nach einer beliebigen der vielen üblichen Techniken zur Immobilisierung von Reagenzien auf festen Trägern hergestellt werden.
- In einem Verfahren der Erfindung, bei der die Zeit (t) als Parameter benutzt wird, kann die Geschwindigkeit der Störung des elektrochemischen Merkmals als Ergebnis der Komplexbildung bestimmt werden. Zweckmäßig wird die Anfangsgeschwindigkeit der Störung gemessen. Ein solches Verfahren ist zum Beispiel anwendbar bei einer homogenen Konkurrenzassay, bei der der Ligand und das markierte Ligand-Analoge mit dem spezifischen Bindungspartner für die Komplexierung konkurrieren. Somit ist die Anfangsgeschwindigkeit der Störung auf die Konzentration des vorhandenen Liganden bezogen, und aus einer Eichkurve der Anfangsgeschwindigkeit der Störung gegen die Konzentration des vorhandenen Liganden kann die Liganden-Assay leicht bestimmt werden.
- Das Verfahren zur Assay, das eine Bestimmung der Geschwindigkeit der Störung zum Inhalt hat, ist auch auf nichtkonkurrierende homogene Assays anwendbar, wo das markierte Liganden-analoge abwesend ist, und ein ausreichend markierter spezifischer Bindungspartner angewandt wird, um den gesamten eingeführten Liganden komplexieren zu können.
- Sowohl bei den homogenen als auch bei den heterogenen Assays kann zum Beispiel der absolute elektrochemische Strom, der nach einer Standardinkubierungsperiode erzeugt wird, die Leichtigkeit und Empfindlichkeit der Assay verstärken.
- In einer typischen heterogenen Assay ruft die Bildung des Komplexes keine (oder nur eine geringe) Störung in einem elektrochemischen Merkmal der Komponenten hervor. In dem Falle wird es im allgemeinen erforderlich sein, künftig eine Störung durch kontrollierte äußere Einflüsse zu erzeugen oder zu verstärken. Die künstliche Erzeugung oder Verstärkung einer Störung kann auch bei homogenen Assays wünschenswert sein. Wenn gesteuerte äußere Einflüsse bei einem heterogenen Verfahren angewandt werden, so wird dies nach einer Trennung der komplexierten und nicht-komplexierten Phasen erfolgen. Obgleich die Größe des äußeren Einflusses einigen Einfluß haben kann auf die hervorgerufene Veränderung und daher mit irgend einem dieser Einflüsse übereinstimmen muß, der bei den Eichversuchen angewandt wird, besteht der Gedanke darin, daß eine beliebige Veränderung, die in der Störung hervorgerufen wird, eine Funktion des Ligand/spezifischer Bindungspartner-Komplexes bleibt.
- Die künstliche Erzeugung oder Verstärkung der Störung wird vorzugsweise durchgeführt mittels Ersetzen des Komplexes in Bezug auf die ungebundene Enzym-markierte Komponente, zum Beispiel, indem die Komponente (a) in eine unsolubilisierte Form, gekoppelt (z. B. in üblicher Weise) an einen festen Träger, überführt wird, mit nachfolgender elektrochemischer Messung entweder des freien oder des gebundenen Enzym-Markers.
- Alternativ dazu kann der Komplex weiterhin mit einer Spezies komplexiert werden, die spezifisch an den Komplex anbindet, gekoppelt an einen festen Träger, mit nachfolgendem Ersatz des Trägers und der angekoppelten Moleküle. In extremen Fällen kann der Ersatz in der vollständigen Entfernung des Komplexes von der Vorrichtung bestehen, im allgemeinen wird der Komplex jedoch innerhalb der Vorrichtung ersetzt.
- Der feste Träger kann magnetisch oder magnetisierbar sein, um den Ersatz oder die Trennung zu erleichtern. Somit können zum Beispiel magnetische Träger (z. B. in Form von Partikeln oder Kügelchen) aus ferromagnetischen oder paramagnetischen Materialien bestehen, wie Metallen (z. B. Eisen, Nickel oder Kobalt), Metallegierungen (z. B. magnetische Legierungen von Aluminium, Nickel, Kobalt und Kupfer), Metalloxiden (z. B. Fe&sub3;O&sub4;, γ-Fe&sub2;O&sub3;, CrO&sub2;, CoO, NiO oder Mn&sub2;O&sub3;, Magnetoplumbite oder feste Lösungen (z. B. feste Lösungen von Magnetit mit Eisen(III)-oxid). Das bevorzugte Material für magnetische Träger ist Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;) oder Haematit (γ-Fe&sub2;O&sub3;). Die Teilchen können nicht-kolloidal oder kolloidal sein (z. B. von der Art, die in unserer ebenfalls anhängigen britischen Patentanmeldung Nr. 8500092 beschrieben ist).
- Der Ersatz des festen Trägers kann zum Beispiel durch Drängen des Trägers in die Nähe der Elektroden bewirkt werden. Im Falle von magnetischen Trägern (z. B. Partikeln) können in geeigneter Weise die Methoden angewandt werden, die in unserer ebenfalls anhängigen britischen Patentanmeldung Nr. 8417538 beschrieben sind. Somit kann zum Beispiel eine magnetische Elektrode (z. B. bestehend aus einem Permanentmagneten oder einem Elektromagneten) verwendet werden, oder es kann eine nichtmagnetische Elektrode verwendet werden, in welchem Falle die Partikel in die Nähe der Elektrode durch Einwirkung eines äußeren Magnetfeldes gedrängt und dort gehalten werden.
- Die Komponente (a) kann direkt auf dem magnetischen Träger immobilisiert werden, oder sie kann über eine oder mehrere andere "Spacer"-Moleküle immobilisiert werden, einschließlich der Partner in spezifischen Bindungs-Wechselwirkungen. Die Immobilisierung der Reagenzien kann im allgemeinen durch übliche Techniken erreicht werden, zum Beispiel durch Adsorption, kovalente Bindung oder Vernetzung oder eine Kombination dieser Techniken, z. B. Adsorption einer chemischen Verbindung mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen gefolgt von einer kovalenten Bindung oder Vernetzung dieses Reagenz. Alternativ dazu können im wesentlichen nicht-chemische Mittel angewandt werden. Geeignete Immobilisierungtechniken sind aus dem Stand der Techniken bekannt.
- Zu anderen Verfahren zur künstlichen Erzeugung oder Verstärkung der Störung gehören zum Beispiel die Entfernung von überschüssigem unkomplexiertem markiertem Reagenz, z. B. durch Abzug aus der Vorrichtung oder durch Kupplung an einen geeigneten festen Träger und Entfernung des festen Trägers aus der Vorrichtung.
- Alle die oben für homogene Assays (einschließlich direkter, Konkurrenz, Sandwich- und Ersatztechnik und Verfahren, in denen die Geschwindigkeit der Störung im Gegensatz zur absoluten Störung gemessen wird) beschriebenen Variationen sind gleichermaßen auf heterogene Assays anwendbar.
- Es wird eingeschätzt, daß bei der heterogenen Technik eine Trennstufe erforderlich ist, um die komplexierten und unkomplexierten Phasen, die nach der Komplexierungsreaktion vorhanden sind, zu trennen. Diese Trennstufe kann zum Beispiel unter Verwendung einer Magnettrennung erfolgen, um eine Festphasen-immobilisierte komplexierte Phase zu entfernen. Bei den heterogenen Assays nach der Erfindung, wo es wünschenswert ist, künstlich eine Störung zu erzeugen oder zu verstärken, ist es bequem, die Trennstufe unter Verwendung der Magnettrennung von Partikeln, die die immobilisierten Komponenten tragen, vorzunehmen und nachfolgend die Teilchen magnetisch zu ersetzen (dadurch eine Störung erzeugend oder verstärkend), wenn die elektrochemischen Merkmale der Komponenten gemessen werden.
- Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind im allgemeinen einfacher als die bekannten Verfahren, da sie die direkte Überwachung des Enzym-Markers gestatten, und sie können die Notwendigkeit zur Trennung von unkomplexierten und komplexierten Phasen vor der Assaystufe eliminieren.
- Wenn Elektroden-immobilisierte Komponenten angewandt werden, wird die Technik weiterhin dahingehend vereinfacht, daß die Notwendigkeit für eine separate Zugabe der Komponenten zu der elektrochemischen Vorrichtung eliminiert wird. Zusätzlich kann die direkte Wechselwirkung zwischen der Elektrode und dem Elektroden-immobilisierten Spezies zu einer Verbesserung bei der Empfindlichkeit der Störungsmessungen führen.
- Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung sind daher Verfahren zur Assay eines Liganden in einer Probe, wie vorher definiert, vorgesehen, bei denen eine oder mehrere der Komponenten (a), (b) und (d) auf der Arbeitselektrode immobilisiert sind. Die immobilisierte(n) Komponente(n) kann/können an der Arbeitsoberfläche der Elektrode gebunden sein oder an einen Teil der Elektrode, der nicht die Arbeitsoberfläche darstellt.
- Die immobilisierte Komponente (a) oder (b) kann zum Beispiel ein immobilisierter spezifischer Bindungspartner sein (z. B. ein Einfang-Antikörper zur Verwendung in einer Sandwich-Immunoassay). Wenn die Komponente (a) oder (b) an einer Elektrode immobilisiert wird, können für die Immobilisierung übliche Techniken angewandt werden. Es ist allerdings wichtig, daß die Immobilisierung nicht nachteilig die spezifischen Bindungseigenschaften der Komponente beeinträchtigt. Wenn die Elektroden-immobilisierte Komponente (d) angewandt wird, kann dies ein immobilisierter Elektronentransfervermittler, Elektronentransferbeschleuniger oder Co-Faktor sein. Somit kann zum Beispiel ein Polyviologen kovalent an eine Metallelektrode gebunden werden. Das große Polyviologen-Molekül ragt aus der Elektrodenoberfläche heraus, und dies erleichtert vermutlich die Wechselwirkung mit dem Enzym. Alternativ dazu kann Chloranil und/oder Fluoranil überall in einer Elektrode, bestehend aus teilchenförmigen Kohlenstoff, eingelagert sein. Als weitere Alternative kann ein Co-Faktor eines Apoenzyms auf einer Kohlenstoffelektrode immobilisiert werden, zum Beispiel durch direkte Bindung oder durch Modifizierung des Co-Faktors und/oder der Elektrode. Zum Beispiel wird ein Verfahren zur Kupplung von Flavin-Co-Faktoren an Kohlenstoffelektroden durch eine Reaktion vom Wittig-Typ in Biotechnology and Bioengineering Symposium Nr. 8 (1978) 483-487 beschrieben.
- Gewünschtenfalls können mehr als eine der Komponenten (a), (b) und (d) auf der Arbeitselektrode immobilisiert werden. In diesem Falle kann jede Komponente direkt an die Elektrode gebunden werden, oder eine Komponente kann über eine andere Komponente gebunden werden. Zum Beispiel kann die Komponente (a) oder (b) über die Komponente (d) gebunden werden, wie in dem Falle, wo ein Enzym-markierter spezifischer Bindungspartner entweder über den Enzym- oder den Nicht-Enzym- Teil an einen Elektroden-immobilisierten Elektronentransfervermittler gebunden wird.
- Ein bevorzugtes System besteht aus einer Elektrode, z. B. einer Kohlenstoffelektrode (zum Beispiel aus pyrolytischem Graphit), die eine immobilisierte Schicht von Ferrocen oder einen Ferrocenderivat trägt (z. B. 1,1'-Ferrocen-dicarbonsäure, 1,1'-Dimethylferrocen (DMF) oder Polyvinylferrocen, das ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 16000 hat), das mit dem Enzym in der markierten Komponente auf Bindungs- oder Nichtbindungsweise wechselwirken kann. Der Kohlenstoffelektrodenkern kann ein ganzes Stück oder eine steife Paste aus Partikeln sein. Normalerweise liegt er als weiche Oberfläche für das Ferrocen oder das Ferrocenderivat vor, das auf eine Vielzahl von Wegen daran angeheftet werden kann, zum Beispiel: (a) für monomeres Ferrocen oder ein monomeres Ferrocen-Derivat durch Abscheidung aus einer Lösung in einer leicht verdampfbaren Flüssigkeit, z. B. einem organischen Lösungsmittel wie Toluol;
- (b) für ein polymeres Ferrocen-Derivat, z. B. Polyvinyl-Ferrocen mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 16000 (für ein Syntheseverfahren siehe J. Polymer Sci. 1976, 14, 2433), Abscheidung aus einem leicht verdampfbaren organischen Lösungsmittel für das Polymere, wie Chloroform;
- (c) für ein polymerisierbares Monomeres vom Ferrocen-Typ durch elektrochemisch induzierte Polymerisation in situ, z. B. durch Lösen von Vinylferrocen in einem organischen Elektrolyten, der tertiäres Butylammoniumperchlorat in einer Konzentration von etwa 1 M enthält, und Abscheidung bei einem Potential von -700 mV, um eine Ablagerung von Vinylferrocen-Radikalen als Polymeres in situ hervorzurufen; oder
- (d) durch kovalente Modifikation der Kohlenstoffelektrode z. B. durch Carbodiimid-Vernetzung des Ferrocens oder Ferrocen- Derivates auf dem Kohlenstoff.
- Falls gewünscht, kann die Elektroden-immobilisierte Komponente an einen Teil der Elektrode gebunden werden, der nicht die Arbeitsoberfläche ist. Die Elektrode kann unter diesen Umständen so aufgebaut sein, daß gesichert ist, daß die immobilisierte Komponente ausreichend dicht an der Arbeitsoberfläche bleibt, um die Assay effektiv durchführen zu können. Eine solche Elektrode wird im senkrechten Schnitt in Fig. 2(a) der dazugehörigen Zeichnungen erläutert. Sie ist besonders geeignet für "Sandwich"-Immunoassays, in denen die immobilisierte Komponente ein nichtmarkierter spezifischer Bindungspartner ist (z. B. ein Einfang-Antikörper). Die Elektrode in Fig. 2(a) umfaßt eine nach oben gerichtete Graphit-Arbeitsoberfläche 1 am Boden einer Zelle, wobei die Wand von dieser durch einen aus dem Körper der Elektrode vorstehenden Teil 2 aus Polystyrol gebildet wird. Auf dieser Wand ist es, wo ein geeigneter spezifischer Bindungspartner immobilisiert sein kann (z. B. durch Adsorption). Die elektrische Verbindung ist über einen isolierten Draht 3 vorgesehen, der am Boden der Arbeitsoberfläche durch Silber-beladenes Epoxidharz 4 gesichert ist, wobei die Anordnung in Epoxidharz 5 eingebettet und mit Polypropylen 6 versiegelt ist.
- Es wird eingeschätzt, daß wenn die Komponente (a) elektroden-immobilisiert ist, es nicht möglich ist, künstlich eine Störung durch Ersatz des erhaltenen Komplexes zu erzeugen oder zu verstärken. Allerdings kann eine Störung noch künstlich erzeugt oder hervorgerufen werden zum Beispiel durch Komplexieren einer beliebigen unkomplexierten Enzym-markierten Komponente, die in Lösung bleibt, mit einer Spezies, die spezifisch diese Komponente komplexiert, gekoppelt an einen festen Träger, mit nachfolgendem Ersatz des Trägers und der angekoppelten Moleküle.
- Nach einem weiteren Gegenstand betrifft die vorliegende Erfindung Ausrüstungen von Reagenzien und Vorrichtungen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Assays. Geeignete Ausrüstungen können aus einer elektrochemischen Vorrichtung bestehen, die eine Arbeitselektrode, eine Hilfselektrode und gegebenenfalls eine Referenzelektrode enthalten sowie ein wäßriges Assaymedium mit geeigneten vorhandenen Komponenten (entweder in Lösung oder immobilisiert auf der Arbeitselektrode). Andere Komponenten (z. B. weitere Reagenzien usw.) und die zu untersuchende Probe können bequem über eine in der Vorrichtung vorgesehene Eintrittsöffnung eingebracht werden.
- Die Vorrichtung kann automatisiert sein, so daß die Komponenten in einer vorher bestimmten Abfolge hinzugegeben werden, und die Inkubationstemperatur wird gesteuert. Vorteilhaft kann die Vorrichtung vorgeeicht sein und mit einer Skala versehen, wodurch die Störungen bei der elektrochemischen Eigenschaft der Komponente direkt als Menge des Liganden in der Probe abgelesen werden können. Beispiele von Liganden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet werden können, sind in Tabelle I unten aufgeführt zusammen mit einem Hinweis auf einen geeigneten spezifischen Bindungspartner für jeden Fall.
- Ligand spezifischer Bindungspartner
- Antigen spezifischer Antikörper
- Antikörper Antigen
- Hormon Hormon-Rezeptor
- Hormon-Rezeptor Hormon
- Polynucleotidstrang komplementärer Polynucleotidstrang
- Avidin Biotin
- Biotin Avidin
- Protein A Immunglobulin
- Immunglobulin Protein A
- Enzym Enzym-Co-Faktor (Substrat)
- Enzym-Co-Faktor (Substrat) Enzym
- Lectine spezifisches Carbohydrat
- spezifisches Carbohydrat von Lectinen Lectine
- Das erfindungsgemäße Verfahren hat eine sehr breite Anwendbarkeit, jedoch kann es insbesondere zum Test verwendet werden für: Hormone, einschließlich Peptidhormone (z. B. Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Insulin und Prolactin) oder Nicht-Peptidhormone (z. B. Steroidhormone wie Cortisol, Estradiol, Progesteron und Testosteron und Thyroidhormone wie Thyroxin (T4) und Triiod-thyronin), Proteine (z. B. Human-Choriongonadotropin (HCG), carcinoembryontisches Antigen (CEA) und Alphafetoprotein (AFP)), Arzneimittel (z. B. Digoxin), Zucker, Toxine oder Vitamine.
- Die Erfindung wird im einzelnen nachfolgend unter Bezug auf einen Antikörper oder ein Antigen als Liganden beschrieben. Allerdings ist die Erfindung nicht auf Assays von Antikörpern oder Antigenen beschränkt.
- Es wird davon ausgegangen, daß der Begriff "Antikörper", wie er hier verwendet wird, in seinem Umfang einschließt
- a) eine beliebige der verschiedenen Klassen oder Unterklassen von Immunglobulin, z. B. IgG, IgM, abgeleitet von einem beliebigen der üblicherweise dazu verwendeten Tiere, z. B. Schaf, Kaninchen, Ziegen oder Mäuse,
- b) monoklonale Antikörper
- c) intakte Moleküle oder "Fragmente" von Antikörpern, monoklonal oder polyklonal, wobei die Fragmente, die die Bindungsregion des Antikörpers enthalten, z. B. Fragmente ohne den Fc-Abschnitt (z. B. Fab, Fab', F(ab')&sub2;) sind oder die sogenannten "Halbmolekül"fragmente, erhalten durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen, die die Schwere Kette-Komponenten in dem intakten Antikörper verbinden.
- Das Verfahren zur Herstellung von Fragmenten von Antikörpern ist aus dem Stand der Technik gut bekannt und wird hier nicht beschrieben.
- Der hier verwendete Begriff "Antigen" wird so verstanden, daß er sowohl permanent antigene Spezies einschließt (zum Beispiel Proteine, Bakterien, Bakterienfragmente, Zellen, Zellfragmente und Viren) sowie Haptene, die unter bestimmten Bedingungen antigen gemacht werden können.
- Verfahren zur Markierung eines Antikörpers mit einem Enzym sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Ishakawa, Journal of Immunoassay 4 (1983) 209-327 und werden hier im Detail nicht erörtert. Zum Beispiel ist die Herstellung eines Konjugates aus Glucoseoxidase mit dem Antikörper für Human-AFP von Maiolini R., et al. (J. Immunol. Methods 8, 223-234 (1975)) beschrieben. Ein weiteres Verfahren zur Markierung von Antikörpern mit Glucoseoxidase ist in "Protides of the Biological Fluids" Proc. 24th Colloquium Brugge (Peeters, H., Hrsg.) 1976, S. 778-784 beschrieben.
- Der markierte Antikörper kann vor der Verwendung gereinigt werden nach Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel ist die Verwendung von Sephadex G-200 zur Reinigung von Glucoseoxidase-markiertem IgG in J. Immunol. Methods, siehe oben, beschrieben.
- Verfahren zur Markierung eines Antigens sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt. Ein Überblick über diese Verfahren kann in Clinica Chimica Acta 81, S. 1-40 (1977) auf Seite 4 gefunden werden. Verfahren zur Reinigung des markierten Antigens sind ebenso bekannt, und dazu gehören zum Beispiel die Dialyse, die Dichtegradienten-Ultrazentrifugierung, die Gelfiltration über Sephadex G-25 oder G-200 und die Ionenaustauschchromatografie über DEAE-Sephadex.
- Das Anfügen des Markers an den Antikörper oder das Antigen kann über beliebige Abschnitte der molekularen Strukturen des Enzyms und des Antikörpers oder Antigens erfolgen, solange die katalytische Aktivität des ersteren und die immunologische Aktivität des letzteren beibehalten wird.
- Die Anfügung von Antikörpern oder Antigenen und der Enzym-markierten Versionen dieser Reagenzien an die Arbeitselektrode kann bewirkt werden durch übliche Verfahren zur Immobilisierung von Antikörpern, Antigenen oder Enzymen auf festen Trägern. In ähnlicher Weise können, wo es gewünscht ist, künstlich eine Störung durch Ersatz von Reagenzien auf festen (gegebenenfalls magnetischen) Trägern zu erzeugen oder zu verstärken, oder eine Trennung in heterogenen Assaytechniken unter Verwendung fester (gegebenenfalls magnetischer) Träger zu bewirken, übliche Verfahren zur Immobilisierung dieser Reagenzien angewandt werden. Die Immobilisierung kann über das Antigen/den Antikörper oder, falls vorhanden, den Enzymteil des Reagenz erfolgen.
- Das markierte Reagenz kann, falls gewünscht, auf der Elektrode über die Komponente (d) immobilisiert werden. Alternativ dazu kann das markierte Reagenz, falls gewünscht, auf der Elektrode getrennt von einer immobilisierten Komponente (d) immobilisiert werden.
- Die Komponente (d) kann zum Beispiel über den Marker oder den Reagenzteil des markierten Reagenz konjugiert werden. Die Komponente (d), die mit dem Marker wechselwirkt, kann Elektroden-immobilisiert werden oder in Lösung, und sie kann im ersteren Fall auf der Elektrode vor oder nach der Konjugierung mit dem markierten Reagenz immobilisiert werden.
- Der Einschluß der Komponente (d) in die molekulare Struktur eines Antikörpers kann, wo erforderlich, erreicht werden zum Beispiel im Falle von Ferrocen durch eines der folgenden Verfahren:
- (i) Bereitstellung des Ferrocens mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen, die zu Bindungswechselwirkungen mit der Molekülstruktur des Antikörpers in der Lage sind;
- (ii) Verwendung von Vernetzungsgruppen;
- (iii) Verwendung des Avidin-Biotin-Bindungssystems (d. h. Avidin-tragender Antikörper, der mit Biotin-tragenden Ferrocenmolekülen bindet, oder Biotin-tragender Antikörper, der mit Avidin-tragendem Ferrocen bindet);
- (iv) Verwendung eines Antikörpers, der mit einem Reagenz (z. B. Fluoreszein-isothiocyanat (FITC)) konjugiert ist, das mit einem zweiten Antikörper bindet, das zum Reagenz (z. B. Anti- FITC-Antikörper) angehoben wurde, an das Ferrocen gekoppelt wird;
- (v) Verwendung eines zweiten mit Ferrocen markierten Antikörpers, wobei der zweite Antikörper zum ersten Antikörper angehoben wurde.
- Ähnliche Verfahren können gewünschtenfalls für den Einschluß von Ferrocen in ein Antigenmolekül angewandt werden. Geeignete Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden im Detail hier nicht erörtert. So ist zum Beispiel der Einschluß von Ferrocen in bestimmte Steroide beschrieben in Journal of Organometallic Chemistry, 160 (1978), S. 223-230.
- Somit können zum Beispiel Antigene oder Antikörper durch Konkurrenz- oder direkte, homogene oder heterogene Verfahren nach der Erfindung getestet werden. Diese Verfahren sind im allgemeinen analog den 'aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, bei denen der Enzym-Marker indirekt überwacht wird. Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird allerdings die Aktivität des Enzyms durch Messung des gewünschten elektrochemischen Merkmals an der Arbeitselektrode unter Einbeziehung der Eichdaten überwacht.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet viele Vorteile gegenüber bekannten Assayverfahren, die mit Enzymen arbeiten. Ohne an theoretischen Betrachtungen gebunden sein zu wollen, glauben wir, daß unter anderem jedes der folgenden neuen Merkmale des vorliegenden Assayverfahrens zu diesen Vorteilen beitragen kann:
- 1. Die Verwendung einer chemischen Spezies, die in der Lage ist, den Transfer der Elektronen sowohl zu als auch von einer Elektrode nach Eignung zu stützen;
- 2. die Messung einer Störung im Transfer der Elektronen infolge der Komplexbildung;
- 3. die Messung einer Störung im Transfer der Elektronen infolge gesteuerter äußerer Einflüsse;
- 4. die Messung eines Elektronentransfervermittlers, um den Transfer der Elektronen zu unterstützen;
- 5. die Verwendung eines Elektroden-immobilisierten Elektronentransferbeschleunigers, um den Transfer der Elektronen zu unterstützen;
- 6. die Verwendung eines Elektroden-immobilisierten Co-Faktors eines Apoenzymmarkers, um den Transfer der Elektronen zu unterstützen;
- 7. die Messung einer Geschwindigkeit der Störung im Transfer der Elektronen;
- 8. ein beliebiges der obigen Merkmale, wenn es auf Assays angewandt wird, worin eines oder mehrere der Reagenzien auf der Arbeitselektrode immobilisiert sind, und spezieller, wenn es auf Assays eines Antigen-Liganden angewandt wird, ein beliebiges der obigen Merkmale, worin ein Antikörper auf der Arbeitselektrode immobilisiert ist; und
- 9. ein beliebiges der obigen Merkmale, wenn es bei Immunoassays von Antigenen oder Antikörpern angewandt wird.
- Die Erfindung schließt unter anderem nur zur Erläuterung die folgenden Ausführungsformen ein (es wird eingeschätzt, daß während die folgenden Ausführungsformen Assays erläutern, bei denen Elektronen von einem Substrat zu der Elektrode über das Enzym fließen, analoge Ausführungsformen ebenfalls nach der Erfindung erreicht werden können, bei denen Elektronen von der Elektrode zu dem Substrat über das Enzym fließen, wodurch eine Reduktion des Substrates erreicht wird): 1. Direkte homogene Antikörper-Assay:
- s = Enzymsubstrat; p = Enzymprodukt
- e = Elektronen; M = Vermittler
- = Antigen = Antikörper
- = Elektrode
- Die elektrochemische Aktivität von Antigen-markierter Glucoseoxidase (Ag-GOD) wurde elektrochemisch überwacht. Die Zugabe des Antikörpers (Ab) zu dem System führt zur Bildung des Ab-Ag-GOD-Komplexes. Dies hemmt die Aktivität des Ag-GOD teilweise oder vollständig, wodurch die elektrochemischen Merkmale der Vorrichtung gestört werden, wobei der Betrag der Störung ein Maß für die Konzentration von Ab ist. Konkurrierende homogene Antigen-Assay
- Antigen (Ag) kann konkurrierend getestet werden durch Zugabe der Ag-Probe zu dem Ag-GOD-Reagenz und anschließender Zugabe einer bekannten Konzentration von Ab, wobei die Konkurrenz zwischen dem Ag-EOD und Ag für das Ab dazu führt, daß einiges Ag-GOD bei der Ab-Bindung gehemmt wird, wodurch das elektrochemische Signal gestört wird. 3. Konkurrierende heterogene Antigen-Assay
- = Antikörper auf Festphase
- Das Proben-Ag wurde in die elektrochemische Vorrichtung gegeben, die AG-GOD enthielt, ohne das elektrochemische Signal zu verändern. An die Festphase angefügtes Ab wurde zugegeben, das mit Ag und Ag-GOD konkurriert. Die Entfernung der Festphase entfernte einiges ah Ag-GOD aus der Vorrichtung, wodurch das elektrochemische Signal gestört wurde. 4. Direkte homogene Antigen-Assay
- Die elektrochemische Aktivität des Enzym-markierten Antikörpers (Ab-GOD) wurde überwacht. Die Zugabe der Ag-Probe hemmt das GOD, wodurch das elektrochemische Signal gestört wird. Die Assay kann unter Verwendung eines markierten Antikörpers in Lösung oder immobilisiert auf der Elektrode durchgeführt werden. 5. Konkurrierende homogene Antikörper-Assay
- Das elektrochemische Verhalten von Ab-GOD wurde überwacht, anschließend wurde das Proben-Ab hinzugegeben. Die Zugabe einer bekannten Menge an Ag erfolgte, wobei Ab und Ab-GOD um Ag konkurrierten. Wenn einiges Ab an Ab-GOD bindet, wird das elektrochemische Signal gestört. 6. Konkurrierende heterogene Antikörper-Assay
- Die elektrochemische Aktivität von Ab-GOD wurde überwacht, anschließend das Proben-Ab hinzugegeben. Die Zugabe eines bekannten Volumens von Ag erfolgte, gefolgt von Ab oder der Festphase. Die Entfernung von Ab auf der Festphase entfernte einiges des Ab-GOD aus dem System, wodurch das elektrochemische Signal gestört wurde. Die folgenden nicht einschränkenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung weiter.
- In dieser Assay wird das freie Enzym-modifizierte Antigen nach Konkurrenz zwischen modifiziertem und unmodifiziertem Antigen für eine feste Anzahl Antikörper-Bindungsstellen gemessen.
- Trockenes Methanol wurde hergestellt durch Destillieren von Methanol über Magnesium, und es wurde über aktiviertem Molekularsieb 3 Å gelagert. Das Molekularsieb kann bei 250 bis 300ºC aktiviert werden. Das trockene Methanol wurde mit HCl-Gas gesättigt.
- Thyroxin (1 g) wurde in Methanol/HCl gelöst, zu dem das Molekularsieb hinzugegeben wurde, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen. Der Ester fiel mit einer Ausbeute von über 90% aus. Nach Filtration wurde das Produkt mit Aceton gewaschen und in einem Vakuum-Exsikkator bis zur Verwendung gelagert.
- 300 mg Methylthyroxinat-Hydrochlorid und 500 mg Succinsäureanhydrid wurden in 9 ml THF/DMF (50/50 v/v) gelöst, zu dem 0,6 ml Triethylamin hinzugegeben wurden. Nach Reaktion über 30 Minuten wurde das Produkt mit einem Überschuß an destilliertem Wasser ausgefällt und aus der Lösung abfiltriert. Das Produkt wurde in Aceton gelöst, filtriert und anschließend mit Hexan ausgefällt.
- THF = Tetrahydrofuran; DMF = Dimethylformamid
- Trockenes THF (4 ml) wurde auf -5ºC abgekühlt, und das Produkt 2 (10 mg) wurde unter Rühren hinzugegeben. Triethylamin (15 ul) und Isobutylchloroformiat (13 ul) wurden zugegeben, das Gemisch trocken und bei -5ºC unter Rühren für 30 Minuten gehalten. Anschließend ließ man das Reaktionsgemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührte weitere 60 Minuten. Glucoseoxidase (110 mg) wurde in 50 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung aufgelöst. Die THF-Lösung wurde tropfenweise unter Rühren zu der Glucoseoxidaselösung hinzugegeben. Die Endlösung wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend wurden 5 ml 1 M Glycinlösung zugegeben und die Lösung für eine weitere Stunde gerührt. Die Lösung wurde anschließend zentrifugiert, um alle festen Bestandteile zu entfernen, Flavin (FAD) wurde hinzugegeben und die Lösung gegen Wasser und 20 mMol Tris/HCl mit pH 7,5, das 0,1 M NaCl enthielt, dialysiert. Die Lösung wurde anschließend auf ein geeignetes Volumen aufkonzentriert, filtriert und einer Gelfiltrationssäule (S-200) zugeführt unter Verwendung des gleichen Puffers.
- Der Anti-Thyroxin-Antikörper war ein übliches polyklonales Antiserum, erhalten durch Immunisierung des Schafes mit Thyroxin, konjugiert an ein Protein mit hohem Molekulargewicht. Zu 10 ml des Antiserums wurden 1,8 mg Natriumsulfat gegeben und das Gemisch für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerollt. Nach Zentrifugierung (1600 g für 30 Minuten bei Raumtemperatur) wurde das Überstehende verworfen und der Niederschlag in 10 ml Wasser wiederaufgelöst und die obige Verfahrensweise wiederholt. Der Antikörper wurde anschließend über eine Gelfiltrationssäule (G-25) gereinigt, die vor-äquilibriert war mit 10 mMol Tris/HCl-Puffer, pH 7,4.
- Thyroxin (Natriumsalz) wurde erhalten von Sigma London Chemical Company, England. Standardlösungen wurden hergestellt durch Auflösen des Thyroxins in Natriumhydroxid (0,1 M), anschließendes Verdünnen mit Tris-HCl-Puffer (10 mMol, pH 7,4) auf die gewünschte Konzentration.
- Es wurde eine zyklische Voltammetrie in einer elektrochemischen 3-Elektrodenzelle durchgeführt unter Verwendung einer pyrolytischen Graphit-Arbeitselektrode. Die Vorrichtung war die gleiche, wie in den Fig. 1(a) und 1(b) der dazugehörigen Zeichnungen gezeigt.
- Die Elektrochemie des Glucoseoxidase-markierten Thyroxins (T4-GOD) an einer pyrolytischen Graphitelektrode wurde in Gegenwart und in Abwesenheit von Anti-T4-Antikörper untersucht, wobei Ferrocen-monocarbonsäure (FMCA) als Elektronentransfervermittler wirkte. Ansteigende Konzentrationen von T4- GOD in Tris-HCl-Puffer (50 mMol; pH 7,5) wurden für 30 Minuten in Gegenwart oder Abwesenheit des Antikörpers bei 20ºC inkubiert. Nach 30 Minuten wurden ß-D-Glucose (die Endkonzentration war 100 mMol) und FMCA (die Endkonzentration war 10 Mmol) hinzugegeben, und es wurde ein zyklisches Voltammogramm zwischen 0 und +500 mV angefertigt (Abtastgeschwindigkeit 2 mV/s). Der bei einem Potential von +300 mV aufgezeichnete Strom wurde gemessen, dies korrespondierte mit einem Peak beim Strom im zyklischen Voltammogramm von FMCA - siehe Fig. 3. Alle Stromwerte wurden für den unkatalytischen Hintergrund- (ladungs)strom korrigiert. Die Kurve A zeigt das zyklische Voltammogramm von Glucoseoxidase + FMCA + Glucose; die Kurve B zeigt das zyklische Voltammogramm von FMCA + Glucose; die Kurve C zeigt das zyklische Voltammogramm von T4-GOD (102,5 ng T4 ml&supmin;¹) + FMCA + Glucose + Puffer; und die Kurve D zeigt das zyklische Voltammogramm von T4-GOD (102,5 ng T4 ml&supmin;¹) + FMCA + Glucose + Puffer + Anti-T4-Antikörper.
- In den Versuchsablauf kamen vervielfältigte Proben, in denen 10 ul Thyroxinstandard zu 10 ul des Thyroxin-Glucoseoxidase-Analogen (2,3 · 10&supmin;&sup5; M) gegeben und vermischt wurden in der elektrochemischen Zelle, nachdem 100 ul des Anti-Thyroxin- Antikörpers hinzugegeben worden war. Nach dem Vermischen wurden die Reagenzien für 20 Minuten bei 37ºC inkubiert, 50 ul des Elektronentransfervermittlers (Ferrocen-monocarbonsäure 6,0 mMol in 10 mMol Tris/HCl-Puffer, pH 7,4), 50 ul des Enzymsubstrates (β-D-Glucose (molar), enthaltend 100 mMol Magnesiumchlorid) und 280 ul des Puffers (10 mMol Tris/HCl, pH 7,4) wurden hinzugegeben. Nachdem die Reagenzien in ein thermisches Gleichgewicht gekommen waren, wurde ein zyklisches Voltammogramm von 0 bis +450 mV gegen eine Standard-Kalomelelektrode aufgenommen (spannungsgeregelte Geschwindigkeit = 5 mV pro Sekunde). Der Peak-Strom wurde gemessen und das elektrochemische Signal berechnet.
- Das elektrochemische Signal ist definiert als
- Signal = i-i&sub0;/i&sub0;
- worin i = der elektrochemische Peak-Strom für die Probe ist; i&sub0; = der elektrochemische Peak-Strom für den Null-Standard ist.
- Ein Beispiel für das elektrochemische Signal gegen die Thyroxin-Konzentrationskurve ist in Fig. 4 aufgeführt. Das elektrochemische Signal (in willkürlichen Einheiten) ist auf der senkrechten Achse aufgetragen, während die Thyroxinkonzentration in Nanogramm pro Milliliter auf der horizontalen Achse aufgetragen ist.
- Monoklonale Antikörper wurden aus Bauchflüssigkeit der Maus mittels des Verfahrens erhalten, das von Milstein und Kohler in Nature 256, 495-497 (1975) beschrieben wurde. Antikörper aus individuellen Hybridoma-Zellinien wurden gescreent, um die zu identifizieren, die Antikörper gegen diskrete antigenische Determinanten bildeten. Die mit den höchsten Affinitäten gegenüber hCG wurden für die Verwendung in der Assay ausgewählt.
- Zu 6 mg Antikörper A (in 2 ml Natriumphosphatpuffer, 100 mMol, pH 7,4) wurden 200 ul β-Mercaptoethylamin (100 mMol) und Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz (10 Mmol) in Wasser hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei 37ºC für 90 Minuten inkubiert und der Antikörper über eine Gelfiltrationsäule (TSK 3000 SW) entsalzen, die in Phosphatpuffer voräquilibriert worden war.
- 14 mg Glucoseoxidase wurden in 1,3 ml Phosphatpuffer gelöst, zu dem 20 ul einer 15 mg Lösung von Succinimidyl-4-(N- maleimidmethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) in Dioxan während des Rührens zugegeben wurde. 20 ul Aliquote von SMCC wurden in 5-Minuten-Intervallen bis zu einer Gesamtmenge von 180 ul SMCC in Dioxan hinzugegeben, und nachdem die Reaktion bei 30ºC zwei Stunden gelaufen war, wurde die Lösung über eine Gelfiltrationsäule (G-25) entsalzen, die in Phosphatpuffer (100 mMol, pH 7,0, enthaltend 100 mMol EDTA) voräquilibriert worden war.
- Äquimolare Anteile von Enzym und Antikörper wurden vermischt und bei 4ºC unter Argon für 68 Stunden gerollt. Das Enzym/Antikörper-Konjugat wurde anschließend durch Gelfiltration gereinigt, wobei man ein Produkt erhielt, das 1 Enzymmolekül pro Antikörpermolekül enthielt. Die Fraktionen, die sowohl eine hohe Enzym- als auch immunologische Wirksamkeit zeigten, wurden zurückgehalten und in der Assay verwendet.
- Ein zweiter monoklonaler Antikörper für hCG (Antikörper B), spezifisch für eine unterschiedliche antigene Determinante, wurde an FITC konjugiert.
- Die Konjugation von FITC an den monoklonalen Antikörper wurde erreicht durch Umsetzung von 200 ug Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) von Sigma London Chemical Co., England, mit 5 mg Antikörper in 1,4 ml Natriumhydrogencarbonatpuffer, 0,2 Mol, pH 9,0, für 18 Stunden bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde durch Gelfiltration über Sephadex G-50 superfein gereinigt, wobei ein Produkt anfiel, das durchschnittlich 6 Moleküle FITC pro Antikörpermolekül einschloß.
- Anti-FITC war ein übliches polyklonales Antiserum, das durch Immunisierung des Schafes mit FITC, konjugiert an Schlüsselloch-Schnecken-Haemocyanin (keyhole limpet haemocyanin), erhalten wurde. Die magnetisierbaren Celluloseteilchen waren ein Komposit aus Cellulose, das etwa 50% schwarzes Eisen(III)oxid (Fe&sub3;O&sub4;) enthielt mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 3 Mikrometer (siehe Forrest und Rattle, "Magnetic Particle Radioimmunoassay" in Immunoassays for Clinical Chemistry, S. 147-162, Hrsg. Hunter and Corrie, Churchill Livingstone, Edinburgh (1983). Anti-FITC-Antiserum wurde kovalent an die magnetisierbare Cellulose gekoppelt, gefolgt von einer Bromcyan-Aktivierung der Cellulose nach dem Verfahren von Axen et al., Nature 214, 1302-1304 (1967). Das Antiserum wurde in einem Verhältnis von 2 ml Antiserum zu 1 g magnetisierbare Festphase gekoppelt.
- Anti-FITC magnetisierbare Festphase wurde auf 10 mg pro ml verdünnt in Tris-HCl-Puffer (10 mMol pro Liter, pH 7,4).
- Eine gefriergetrocknete Präparation von hCG, geeicht gegen die erste internationale Bezugspräparation (75/537) wurde von Biodata SpA, Mailand, Italien, erhalten. Diese Probe wurde in Puffer (Tris-HCl, 10 mMol, pH 7,4) auf die gewünschte Konzentration verdünnt.
- Die elektrochemische Vorrichtung war die gleiche Ausrüstung wie die in Beispiel 1.
- Zur Messung von hCG wurde eine immunometrische Immunoassay unter Verwendung von Glucoseoxidase-modifiziertem monoklonalem anti-hCG-Antikörper verwendet.
- In den Untersuchungsgang kamen vervielfältigte Proben, in denen 50 ul des hCG-Standards vermischt waren mit 50 ul Antikörper A (9,4 ug Protein pro ml) und 50 ul Antikörper B (6 ug Protein pro ml). Nach dem Vermischen wurden die Proben bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, 100 ul der Anti-FITC magnetisierbaren Festphase wurde hinzugegeben und nach starkem Mischen wurde für 5 Minuten ebenfalls bei Raumtemperatur inkubiert. Das Anlegen eines äußeren Magnetfeldes erlaubte die Trennung von gebundenen und freien Komponenten, wobei die Festphase zurückblieb und das Überstehende verworfen wurde. Nach zwei Wäschen mit 250 ul destilliertem Wasser wurde die Festphase resuspendiert in Puffer (100 ul 10 mMol Tris/HCl, pH 7,4) und in die elektrochemische Zelle gegeben, die einen Elektronentranfervermittler (40 ul Ferrocen-monocarbonsäure (FMCA) 6,7 mMol in 10 mMol Tris/HCl, pH 7,4), Enzymsubstrat (40 ul einer molaren Glucoselösung, die 100 mMol Magnesiumchlorid enthielt) und 170 ul Tris/HCl-Puffer (10 mMol, pH 7,4) enthielt. Das Anlegen eines äußeren Magnetfeldes an die Arbeitselektrode durch Kontaktieren derselben mit einem Permanentmagneten führt dazu, daß die magnetische Festphase an der Elektrodenoberfläche konzentriert wurde. Als die Festphase an der Arbeitselektrodenoberfläche konzentriert war und das thermische Gleichgewicht erreicht hatte (Temperatur T = 37 ± 1ºC), wurde der elektrochemische Strom infolge der Aktivität der gebundenen Glucoseoxidase gemessen, indem ein zyklisches Voltammogramm von +120 mV bis + 420 mV gegen eine Standard- Kalomelelektrode aufgestellt wurde (spannungsgeregelte Geschwindigkeit = 2 mV pro Sekunde).
- Ein Diagramm des elektrochemischen Signals gegen die hCG-Konzentration ist in Fig. 5 gegeben. Das elektrochemische Signal ist definiert als
- Signal = Peakstrom für Probe-Peak FMCA Hintergrundstrom/Peakstrom für Null-Peak FMCA Hintergrundstrom
- Das elektrochemische Signal (in willkürlichen Einheiten) wurde auf der senkrechten Achse aufgetragen, während die hCG-Konzentration (in internationalen Einheiten pro Milliliter) auf der horizontalen Achse aufgetragen wurde.
- Das Verfahren war das gleiche wie das im Beispiel 2.
- Das angewandte Verfahren war das gleiche wie das in Beispiel 2.
- Für das Verfahren siehe Beispiel 2.
- Das Verfahren war das gleiche wie das in Beispiel 2.
- Die elektrochemische Vorrichtung war die gleiche wie die im Beispiel 1.
- Eine immunometrische Immunoassay unter Verwendung von Glucoseoxidase-modifiziertem monoklonalem Anti-hCG-Antikörper wurde für die Messung von hCG eingesetzt.
- In den Untersuchungsgang kamen vervielfältigte Proben, in denen 50 ul hCG-Standard mit 50 ul Antikörper A (10 ug Protein pro ml) und 50 ul Antikörper B (6 ug Protein pro ml) vermischt waren. Nach dem Vermischen wurden die Proben bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. 100 ul anti-FITC wurde hinzugegeben, und nach starkem Rühren wurde ebenfalls bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Die Anwendung eines äußeren Magnetfeldes gestattete die Trennung von gebundenen und freien Komponenten, wobei die Festphase zurückblieb und das Überstehende verworfen wurde. Die zurückgehaltene Festphase wurde dreimal mit 200 ul 10 mMol Tris/HCl-Puffer, pH 7,4, der 0,9% w/v Natriumchlorid enthielt, gewaschen, bevor die Re-Suspendierung in 100 ul 10 mMol Tris/HCl-Puffer, pH 7,4, erfolgte. Die Festphase wurde in die elektrochemische Zelle übertragen, die den Elektronentransfervermittler (40 ul Dimethylaminomethylferrocen 0,6 mMol in 10 mMol Tris/HCl, pH 7,4), Enzymsubstrat (40 ul molare Glucose, die 100 mMol Magnesiumchlorid enthielt) und 170 ul Tris/HCl-Puffer (10 mMol, pH 7,4) enthielt. Die Anwendung eines äußeren Magnetfeldes an die Arbeitselektrode durch Kontakt derselben mit einem Permanentmagneten führte dazu, daß die magnetische Festphase an der Elektrodenoberfläche konzentriert wurde. Als die Festphase an der Elektrodenoberfläche konzentriert worden war und das thermische Gleichgewicht erreicht hatte (Assaytemperatur = 37 ± 1ºC), wurde der elektrochemische Strom infolge der Aktivität der gebundenen Glucoseoxidase gemessen, indem ein zyklisches Voltammogramm von 0 bis +500 mV gegen eine Standard-Kalomelelektrode aufgenommen wurde (spannungsgeregelte Geschwindigkeit = 5 mV pro Sekunde).
- Ein Diagramm des elektrochemischen Signals gegen die hCG-Konzentration ist in Fig. 6 gezeigt. Das elektrochemische Signal ist definiert als
- Signal = i-i&sub0;/i&sub0;
- worin i = Peakstrom für Probe-Peakstrom des Vermittlers i&sub0; = Peakstrom für Nullprobe-Peakstrom des Vermittlers.
- Das elektrochemische Signal (in willkürlichen Einheiten) ist auf der senkrechten Achse aufgetragen, während die hCG-Konzentration (in Internationalen Einheiten pro Milliliter) auf der horizontalen Achse aufgetragen ist.
- Es wurde nach den Verfahren gearbeitet, das in Beispiel 2 beschrieben wurde (Antikörper A).
- Eine modifizierte Elektrode des Typs, der in Fig. 2 a gezeigt ist, wurde wie folgt konstruiert:
- Ein isolierter Draht wurde an eine Scheibe aus pyrolytischem Graphit mit Silber-beladenem Epoxidharz von 4 mm Durchmesser angebracht. Die Scheibe wurde anschließend auf dem Boden eines Mikrotitrationsnapfes aus Polystyrol (Nunc Intermed) mit Epoxidharz fixiert. Ein Abschnitt eines Polypropylenrohres wurde an den Boden der Polystyrolwand angebracht, um als Griff zu dienen.
- Ein zweiter monoklonaler Antikörper (Antikörper B in Beispiel 2) wurde auf der Wand der modifizierten Arbeitselektrode in folgender Weise immobilisiert:
- Der Antikörper B wurde in Tris/HCl-Puffer (10 mM, pH 7,4) auf eine Konzentration von 33,9 ug pro ml verdünnt; 330 ul dieser Lösung wurden in den Elektrodennapf gegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur gelassen, damit der Antikörper an der Elektrodenwand adsorbiert werden konnte. Die Elektrode wurde anschließend zehnmal mit Tris/HCl-Puffer gewaschen und anschließend mit 330 ul einer Lösung von Ovalbumin (5 mg pro ml in 10 mMol Tris/HCl, pH 7,4, der 0,1% v/v Nonidet P40-Detergenz enthielt) für eine Stunde, um irgendwelche freie Stellen für die Proteinadsorption an den Elektrodenwänden zu blockieren. Nach weiteren Wäschen in Tris/HCl-Puffer (10 mMol, pH 7,4) wurde die Elektrodenoberfläche mit einer Aufschlämmung aus Aluminiumoxid/Wasser (Aluminiumoxidteilchen mit 0,3 um Durchmesser) vor der Verwendung poliert.
- Für Einzelheiten siehe Beispiel 2.
- Bei diesen Messungen wurde ein Zwei-Elektrodensystem eingesetzt, wobei die zuvor beschriebene Arbeitselektrode in Verbindung mit einer Platin-Gegenelektrode verwendet wurde. Die Anordnung ist in Fig. 2 b der dazugehörigen Zeichnungen erläutert. Die Arbeitselektrode W, die die Zelle bildet, die das Assaymedium enthält, ist mit dem positiven Ende eines spannungsgeregelten Generators 1 verbunden (das negative Ende ist geerdet); die Platin-Gegenelektrode C ist mit dem positiven Ende eines empfindlichen Strommessers 2 verbunden, wobei das andere Ende davon ebenfalls geerdet ist.
- Zur Messung von hCG wurde eine immunometrische Immunoassay unter Verwendung von Glucoseoxidase-modifiziertem monoklonalem anti-hCG-Antikörper verwendet.
- 100 ul des hCG-Standards und 100 ul des Antikörpers A wurden in den Napf der Arbeitselektrode gegeben. Nach dem Vermischen wurde die Probe bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Reagenzien wurden aus dem Arbeitselektrodennapf ausgegossen, und die Elektrode wurde dreimal mit 350 ul Tris/HCl (10 mMol, pH 7,4, enthaltend 0,9% w/v Natriumchlorid) gewaschen. Nach dem Polieren der Graphitoberfläche mit einer Aluminiumoxid-Aufschlämmung wurden 160 ul Puffer (10 mMol Tris/HCl, pH 7,4), 20 ul Elektronentransfervermittler (0,6 mMol Dimethylaminomethylferrocen in Tris/HCl (10 mMol, pH 7,4) und 20 ul Substrat (molare Glucoselösung, die 100 mMol Magnesiumchlorid enthielt) in den Elektrodennapf gegeben und mit Argon entgast. Es wurde ein zyklisches Voltammogramm von 0 bis +650 mV erstellt (spannungsgeregelte Geschwindigkeit = 5 mV pro Sekunde), und es wurden die Peakströme berechnet.
- Nach jeder Messung wurde der Elektrodennapf mit Tris/HCl-Puffer (10 mMol, pH 7,4) gewaschen, und die 350 ul 2 M Magnesiumchlorid wurden in die Zelle gegeben. Nach 2 Minuten wurde der Elektrodennapf geleert und mit Puffer gespült, um ihn für eine weitere Verwendung vorzubereiten.
- Fig. 7 stellt die Ergebnisse einer solchen hCG-Assay dar. Das elektrochemische Signal ist definiert als
- Signal = i-i&sub0;/i&sub0;
- worin i = Peakstrom der Probe-Peakstrom des Vermittlers i&sub0; = Nullstrom der Probe-Peakstrom des Vermittlers ist.
- Das elektrochemische Signal (willkürliche Einheiten) ist auf der senkrechten Achse aufgetragen, während die hCG-Konzentration (in Internationalen Einheiten pro ml) entlang der horizontalen Achse aufgetragen ist.
- Siehe Beispiel 2.
- Ein zweiter monoklonaler Antikörper (Antikörper B in Beispiel 2) wurde auf der Arbeitsoberfläche einer pyrolytischen Graphit-Arbeitselektrode immobilisiert nach dem Verfahren von Bourdillon et al. (Journal of the American Chemical Society 102 (1980) 4231-4235) und Cass et al. (Analytical Chemistry 56 (1984) 667-671). Nach dem Polieren mit einer Aufschlämmung aus Aluminiumoxid/Wasser (Teilchendurchmesser = 0,3 um) wurde die Elektrode elektrochemisch oxidiert bei +2,2 V gegen eine Standard-Kalomelelektrode (S.C.E.) in einer 10%igen Salpetersäure, die 2,5% w/v Kaliumdichromat enthielt, für 10 Sekunden und anschließend in 0,63 ml einer Lösung aus 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid-p-methyltoluolsulfonat (Sigma London Chemical Co., England) (0,15 molar in 0,1 molarem Acetatpuffer, pH 4,5) für 80 Minuten bei 20ºC gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die Elektrode in Acetatpuffer (0,1 molar, pH 9,5), der 0,49 mg pro ml Antikörper B enthielt, für 90 Minuten bei 20ºC eingeweicht. Die Elektrode wurde mit Wasser gewaschen und anschließend in eine Lösung von Ovalbumin (5 mg pro ml in 10 mMol Tris/HCl-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,1% v/v Nonidet P40-Detergenz) für 90 Minuten bei 20ºC gebracht, um etwa verbliebene Protein-Bindungsstellen zu blockieren. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die Elektrode in Tris/HCl-Puffer (10 mMol, pH 7,4) bei 4ºC bis zur Verwendung gelagert.
- Siehe Beispiel 2.
- Siehe Beispiel 2.
- Es wurde mit einer immunometrischen Immunoassay unter Verwendung von Glucoseoxidase-modifiziertem monoklonalem antihCG-Antikörper gearbeitet.
- Der Ladungsstrom der Elektrode wurde in Puffer (10 mMol Tris/HCl, pH 7,4) bestimmt, indem ein zyklisches Voltammogramm von 0 bis +480 mV gegen S.C.E. aufgenommen wurde (spannungsgeregelte Geschwindigkeit = 5 mV pro Sekunde; T = 37 ± 1ºC). 25 ul des hCG-Standards und 25 ul des Antikörpers A wurden vermischt, und die Elektrode, auf der der Einfang-Antikörper immobilisiert war, der Antikörper B, wurde dazugegeben. Die Elektrode wurde für 15 Minuten bei 20ºC inkubiert. Anschließend wurde die Elektrode mit Wasser, mit Puffer (10 mMol Tris/HCl, pH 7,4, enthaltend 0,9% w/v Natriumchlorid) und dann mit Wasser gewaschen, bevor die Zugabe zu der elektrochemischen Zelle erfolgte, die 400 ul Puffer (10 mMol Tris/HCl, pH 7,4) 50 ul Elektronentransfervermittler (0,3 mMol Dimethylaminomethylferrocen in 10 mMol Tris/HCl-Puffer, pH 7,4) und 50 ul Substratlösung (molare Glucose, die 100 mMol Magnesiumchlorid enthielt), enthielt. Nachdem die Elektrode in das thermische Gleichgewicht gekommen war (T = 37 ± 1ºC), wurde ein zyklisches Voltammogramm zwischen 0 und +480 mV gegen S.C.E. berechnet, wobei der Elektrodenladungsstrom von diesem Wert abgezogen wurde. Die Elektrode wurde mit Wasser gewaschen und anschließend in 2 molarer Magnesiumchloridlösung für 2 Minuten eingeweicht, um die Antikörper/Antigenbindung zu brechen. Nach nochmaligem Waschen mit Wasser war die Elektrode fertig für die nochmalige Verwendung.
- Fig. 8 stellt die Ergebnisse einer solchen Assay dar. Das elektrochemische Signal (in Mikroampere) ist auf der senkrechten Achse aufgetragen, während die hCG-Konzentration (in Internationalen Milli-Einheiten pro ml) auf der horizontalen Achse aufgetragen ist.
Claims (11)
1. Elektrochemisches Verfahren zur Assay eines Liganden in
einer Probe unter Verwendung einer elektrochemischen
Vorrichtung mit einer Arbeitselektrode und einer Hilfselektrode,
wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch Kontaktieren des
Probenliganden mit Komponenten, die umfassen
(a) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden,
(b) gewünschtenfalls wenigstens ein weiteres Reagenz,
ausgewählt unter Ligand-Analogen und spezifischen Bindungspartnern
für den Liganden, wobei die Komponente (a) oder wenigstens
eine der Komponenten (a) und (b) mit einem Oxidoreduktase-
Enzym markiert ist,
(c) ein Substrat für das Enzym, und
(d) einen Elektronentransfervermittler, der den Transfer der
Elektronen von dem Substrat zur Arbeitselektrode über das
Enzym, das aus der Oxidation des Substrates resultiert, oder
den Transfer der Elektronen von der Arbeitselektrode zu dem
Substrat über das Enzym unter Gestattung der
Substratreduzierung unterstützt;
und Bestimmung ob und gewünschtenfalls bis zu welchem Grade
der Elektronentransfer gestört ist durch Ersatz eines
beliebigen Enzym-markierten Komplexes, der den Liganden enthält, in
Bezug auf irgendeine andere Enzym-markierte Komponente, oder
wo ein Enzym-markiertes Ligand-Analoges als Komponente (b)
vorhanden ist, Ersatz eines beliebigen Komplexes, der das
Ligand-Analoge enthält, in Bezug auf ein nicht-komplexiertes
Enzym-markiertes Ligand-Analoges;
mit der Maßgabe, daß wenn keine Komponente (b) vorhanden ist
und der Ligand an einer Wand der Vorrichtung immobilisiert ist
und die Komponente (c) nach dem Ersatz hinzugegeben wird, dann
die Komponente (a) und der Ligand keinen Antikörper bzw. kein
Antigen zu jenem Antikörper repräsentiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, das umfaßt das Kontaktieren des
Probenliganden mit Komponenten, die umfassen:
(a) einen spezifischen Bindungspartner zu dem Liganden, der
auf einem festen Träger immobilisiert ist,
(b) ein weiteres Reagenz, ausgewählt unter den Ligand-Analogen
und spezifischen Bindungspartnern zu dem Liganden, der mit
einem Oxidoreduktase-Enzym markiert ist,
(c) ein Substrat für das Enzym, und
(d) einen Elektronentransfervermittler, der den Transfer der
Elektronen von dem Substrat zu der Arbeitselektrode über das
Enzym, das aus der Oxidation des Substrates resultiert, oder
den Transfer der Elektronen von der Arbeitselektrode zu dem
Substrat über das Enzym unter Gestattung der
Substratreduzierung unterstützt;
und Bestimmung ob und gewünschtenfalls bis zu welchem Grade
der Elektronentransfer gestört ist durch Ersatz des festen
Trägers in Bezug auf die ungebundene Enzym-markierte
Komponente.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Komponente (a)
auf einem festen Träger immobilisiert ist, ausgewählt unter
der Arbeitselektrode und den magnetischen Teilchen oder
Festphasenkügelchen.
4. Elektrochemisches Verfahren zur Assay eines Liganden in
einer Probe unter Verwendung einer elektrochemischen
Vorrichtung mit einer Arbeitselektrode und einer Hilfselektrode,
wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch Kontaktieren des
Probenliganden mit Komponenten, die umfassen:
(a) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden,
(b) gewünschtenfalls wenigstens ein weiteres Reagenz,
ausgewählt unter den Ligand-Analogen und spezifischen
Bindungspartnern für den Liganden, wobei die Komponente (a) oder
wenigstens eine der Komponenten (a) und (b) mit einem
Oxidoreduktase-Enzym markiert ist,
(c) ein Substrat für das Enzym, und
(d) einen Elektronentransfervermittler, der den Transfer der
Elektronen von dem Substrat zur Arbeitselektrode über das
Enzym, das aus der Oxidation des Substrates resultiert, oder
den Transfer der Elektronen von der Arbeitselektrode zu dem
Substrat über das Enzym unter Gestattung der
Substratreduzierung unterstützt,
und Bestimmung ob und gewünschtenfalls bis zu welchem Grade
der Elektronentransfer durch Komplexbildung gestört ist,
mit der Maßgabe, daß
(I) wo keine Komponente (b) vorhanden ist und sowohl die
Komponenten (a) als auch (d) an der Arbeitselektrode
immobilisiert sind, dann die Komponente (a) und der Ligand keinen
Antikörper bzw. kein Antigen für jenen Antikörper
repräsentieren;
(II) wo die Komponente (b) vorhanden ist und die Komponente
(a) nicht auf einem festen Träger immobilisiert ist, der
Ligand keine Nukleinsäure ist; und
(III) wo ein Enzym-markiertes Ligand-Analoges als Komponente
(b) vorhanden ist und das Ligand-Analoge mit der Komponente
(a) vor der Zugabe des Probenliganden komplexiert wird, die
Komponente (a) und der Ligand keinen Antikörper bzw. kein
Antigen für jenen Antikörper repräsentieren.
5. Verfahren zur Assay nach einem der Ansprüche I bis 4, worin
die Komponente (d) ein Elektronentransfervermittler ist,
ausgewählt unter Ferrocen und Derivaten davon.
6. Elektrochemisches Verfahren zur Assay eines Liganden in
einer Probe unter Verwendung einer elektrochemischen
Vorrichtung mit einer Arbeitselektrode und einer Hilfselektrode,
wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch Kontaktieren des
Probenliganden mit Komponenten, die umfassen:
(a) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden,
(b) gewünschtenfalls wenigstens ein weiteres Reagenz,
ausgewählt unter den Ligand-Analogen und spezifischen
Bindungspartnern für den Liganden, wobei die Komponente (a) oder
wenigstens
einer der Komponenten (a) und (b) mit einem
Oxidoreduktase-Enzym markiert ist,
(c) ein Substrat für das Enzym,
(d) einen Elektronentransferbeschleuniger, der den Transfer
der Elektronen zwischen dem Enzym und der Arbeitselektrode
unterstützt durch Halten des Enzyms in nächster Nähe zur
Arbeitselektrode ohne Aufnahme einer Ladung während des
Elektronentransfers;
und Bestimmung ob und gewünschtenfalls bis zu welchem Grade
der Elektronentransfer gestört ist durch (i) Komplexbildung
oder (ii) Ersatz eines beliebigen Enzym-markierten Komplexes,
der den Liganden enthält, in Bezug auf irgendeine andere
Enzym-markierte Komponente, oder wo ein Enzym-markiertes Ligand-
Analoges als Komponente (b) vorhanden ist, Ersatz eines
beliebigen das Ligand-Analoge enthaltenden Komplexes in Bezug auf
ein nicht-komplexiertes Enzym-markiertes Ligand-Analoges.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Komponente (d)
ausgewählt ist unter Mg²&spplus; und 4,4'-Bipyridyl.
8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin
die Störung bei dem Transfer der Elektronen bestimmt wird aus
einer Störung beim Spitzenstrom, der unter Anwendung eines
vorgewählten Potentials über die Komponenten beobachtet wird.
9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin
der Ligand, die Komponente (a) und, falls vorhanden, die
Komponente (b) ausgewählt werden unter Antigenen und Antikörpern.
10. Ausrüstung zur Durchführung eines Assay-Verfahrens nach
Anspruch 2, das umfaßt:
(i) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden, der
auf einem festen Träger immobilisiert ist,
(ii) ein weiteres Reagenz, ausgewählt unter Ligand-Analogen
und spezifischen Bindungspartnern für den Liganden, der mit
einem Oxidoreduktase-Enzym markiert ist, und
(iii) einen Elektronentransfervermittler, der zur
Unterstützung des Transfers der Elektronen zwischen dem Enzym und der
Arbeitselektrode in Gegenwart des Substrates für das Enzym in
der Lage ist.
11. Ausrüstung zur Durchführung eines Assay-Verfahrens nach
Anspruch 6, die umfaßt
(i) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden,
(ii) falls erforderlich wenigstens ein weiteres Reagenz,
ausgewählt unter Ligand-Analogen und spezifischen
Bindungspartnern für den Liganden, wobei die Komponente (i) oder
wenigstens einer der Komponenten (i) und (ii) mit einem
Oxidoreduktase-Enzym markiert ist, und
(iii) einen Elektronentransferbeschleuniger, der zur
Unterstützung des Transfers der Elektronen zwischen dem Enzym und
der Arbeitselektrode in Gegenwart des Substrates für das Enzym
in der Lage ist.
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