JPH032566A

JPH032566A - 免疫測定法

Info

Publication number: JPH032566A
Application number: JP13677489A
Authority: JP
Inventors: Junji Masai; 正井　純次; Takaaki Munebayashi; 孝明宗林; Shunzo Kondo; 近藤　俊三
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1989-05-30
Filing date: 1989-05-30
Publication date: 1991-01-08
Anticipated expiration: 2013-04-28
Also published as: JP2745683B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫測定のうち、極
めて感度の高い測定法に属するものであシ、極微量の検
体から特定の抗体又は抗原乞検出可能とする免疫測定法
に関するものである。

〔従来の技術〕

従来、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が種々の疾病
の早期検出法や極微量の物質検出法として各種開発され
ている。これは疾病の原因であるウィルスやポリペプチ
ド等の抗原が生体内に侵入した際に生体内にて生成され
る抗体が、ウィルスやポリペプチド等の抗原又は生成さ
れた抗体を検出しようとするものである。該目的のため
の従来技術として、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノ
アッセイ、フォトイムノアッセイ、螢光イムノアッセイ
、磁気イムノアッセイがある。これらの方法は、それぞ
れ、アイソトープ、酵素、微粒子散乱体、螢光、磁性体
微粒子を、抗原又は抗体に標識し、前記標識体と特異的
に反応する抗体又は抗原の定量を行うものである。例え
ば、フォトイムノアッセイとし２て、ラテックス等の不
溶性担体粒子に担持させた抗原又は抗体と抗原又は抗体
あるいはその混合物と乞液体媒体中で反応させ、その反
応の進行に伴う反応混合物の透過率の減少（すなわち吸
光度の増加）からその抗原抗体反応の速度を測定し、さ
らにその速度から被検体中の抗原又は抗体の濃度ビ定量
する方法が知られている（特公昭３ｇ−／／タフ！ｉ号
公報）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、かかる従来技術においては、種々の制約、例え
ばラジオイムノアッセイでのアイソトープの半減期に関
連する廃棄物処理問題、酵素イムノアッセイ、フォトイ
ムノアッセイ及び螢光イムノアッセイでの検出感度の問
題、磁気イムノアッセイでの測定環境の問題等が存在し
、さらに、従来技術における検出法では極小量の抗原あ
るいは抗体乞検出することは極めて困難なことがある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記問題点暑解決すべく鋭意検討した結
果、前記諸方法の検出感度と同程度又はそれ以上の検出
感度を有する新しい免疫測定法２生みだした。

即ち、本発明の要旨は、（ａ）　　少なくともその表面に導電性層を有する基板
上に、抗原又は抗体を担持する工程（１〕）該基板上の抗原又は抗体が担持されていない部
分を、該抗原又は抗体に不活性な物質で被覆する工程（ｃ）　　該基板上に担持された抗原又は抗体と試料中
の抗体又は抗原を反応させる工程（ｄ）　　抗原・抗体反応物に導電性微粒子を担持する
工程（ｅ）　　該基板にバイアス電圧馨加えて、該基板の導
電性層に流れるトンネル電流を測定する工程から成ることを特徴とする免疫測定法に存する。

つま９、その表面に導電性微粒子する基板上の抗原・抗
体反応物に担持された導電性微粒子を、トンネル効果を
利用した測定機器、例えば、走査型トンネル顕微鏡（Ｓ
ｃａｎｎｉｎｇ　ＴｕｎｎｅｌｉｎｇＭｉ　ｃｒｏｓｃ
ｏｐｅ　、以下、ＳＴＭと略す）等ぞ用いて測定する免
疫測定法であυ、本発明によれば抗原抗体反応で生じた
複合体に標識した導電性微粒子を例えば、ＳＴＭで測定
検出することにより、極微小かつ極微量の未知の抗原又
は抗体乞測定検出することができる。例えばＳＴＭのよ
うな測定機器の高感度及び高空間分解能特性乞利用する
ので、特に従来の検出法では測定の極めて困難であった
極小量の抗原あるいは抗体を検出すること乞可能として
いる。

以下、本発明の詳細な説明する。

はじめに、ＳＴＭによる導電性粒子標識体の測定検出の
説明をする。第７図において、／はＳＴＭ等の探針で、
λの基板に吸着した抗原抗体複合体３、左に標識させた
導電性微粒子乙Ｚ測定検出する。特定の又は未知の抗原
又は抗体の有無又は存在量の定量化処理は、第１図に示
すようにｇの導電性粒子標識体のある基鈑乞二次元（ｘ
、ｙ）的に７のＳＴＭ装置等で走査測定し、導電性粒子
標識体の形状乞凹凸像として画像表示した後行われる。

ＳＴＭ等の装置で走査測定する環境はＳＴＭの原理上、
真空中、ガス中、液中、大気中のいずれでも可能である
。

測定用ＳＴＭ等の機器の構成及び操作の簡易性の点では
、大気中での測定が好ましい。

本発明方法において、基板としては、それ自体導電性（
電気伝導度／　ｘ　／　ＯＳ／ａｍ〜乙、２Ｘ１０５Ｓ
　／　ｃｍ　）のもので表面の平面性に優れているもの
、例えば、高配向焼結グラフアイ）　（Ｈ４ｇｈｌｙＯ
ｒｉｅＭｔｅｄ、＋　Ｒｙｒｏｃｌｙｔｉｃ　Ｇｒａｐ
ｈｉｔｅ；　Ｈ○ＰＧ　）Ｋｉｓｈグラファイト又はシ
リコンウェハー等、あるいは表面あらさが、基板上の抗
原抗体複合体に標識する導電性微粒子の（望ましくは）
平均粒径の半分以下程度であるもの、例えば、金薄板、
黒鉛、或いは電子顕微鏡用の銅製試料メジ−等が用いら
れ、それ自体導電性でないもの（例えば、雲母シート、
方解石薄板等）のときは、その表面に導電性層を設ける
。例えば、導電性物質として、金パラジウム、白金パラ
ジウム又はカーボンあるいはそれらの組み合わせ乞用い
、層形成方法として、例えば、真空蒸着法ビ用いる。こ
の層の厚みは、望ましくは蒸着層の表面あらさが、基板
上の抗原抗体複合体に標識する導電性微粒子の平均粒径
の半分以下程度である様になる厚みである。

上記基板」二で検出の対象となる抗原又は抗体に関して
は、抗体はタンパク質で構成されており、抗原抗体反応
として生体内で生成されるいわゆる抗体そのもの又はそ
の抗体の一部であり、一方、抗原は、例えば、タンパク
質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂質、花粉、
ウィルス等、種々の物が挙げられる。上記基板のような
不溶性担体に抗体又は抗原を担持させる方法は、すでに
多くの方法が提案されている。物理的に吸着させる方法
と、化学的に共有結合させる方法があり、化学的に結合
させるには、例えば、担体をグルタルアルデヒドで処理
して、抗体又は抗原に結合さ終る。担持量は、用いる抗
原及び抗体の分子量により異なるが、／×１０’。

〜／Ｘ１０１７分子／ｄ程度が好ましい。

抗原又は抗体乞担持させた後の基板の未結合部位に対し
ては、免疫反応的に不活性な物質が被覆され、ウシ血清
アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）のほかに、血清成分
、ゼラチン、ポリにより被覆２行う。

本発明の対象となる試料の種類としては、血液、血清、
血しよう、尿、糞便、汗、唾液等の体液、食品等から目
的物質を抽出した抽出液、細胞等の切片が該当する。反
応方法としては、基板と」二記の免疫反応物質を直接反
応させるか、或いは、抽出した液を反応させる。細胞等
の切片を用いる場合は基板に試料を直接固定化するのが
望ましい。

上記の基板上の免疫反応物質に担持される導電性微粒子
の電気伝導度は通常／×１０３Ｓ／Ｃｆｎ〜乙、、２Ｘ
／θ５Ｓ／温、好ましくは、’４．＆　Ｘ　／　Ｑ’Ｓ
／ぼ〜６．λ×１０５Ｓ／儂であり、導電性微粒子とし
ては、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド等の金属コ
ロイド粒子等のほか、フェリチン等の金属原子を含むタ
ンパク質、アルミナ、フェライト等の金属酸化物粒子、
導電性有機高分子等も好ましい。導電性微粒子の粒径は
、通常／　ｙＩＨｌ−／　００　ｎｍであシ、好ましく
は、５ｎｍ〜！；ｔ）ｎｍである。担持方法は、物理的
に吸着させる方法と、化学的に共有結合させる方法があ
シ、化学的に結合させるには、例えば、担体乞クルクル
アルデヒドで処理して、抗体又は抗原に結合させる。

本発明においては、第一図に示すように、ＳＴＭ等の探
針／で、基板−に担持させた抗原抗体複合体３、Ｓ及び
導電性微粒子乙と導電性探針／の間にバイアス電圧を印
加することによシトンネル現象を発生ぜしめ、トンネル
電流を生じさせるが、８７Ｍ装置において、電気信号の
測定条件に関しては、望ましくは、バイアス電圧（ＶＢ
）及びトンネル電流（ＩＴ）が導電性微粒子標識体を含
む試料基板全体で、θ、　００　／　Ｖ、（、ＶＢく３
■程度、及び、θ、ｏｏ／ｎＡ（ＩＴ　（、ｚ　ｎＡ程
度であり、画像形成方法としてのＳＴＭの走査モードと
しては、通常、定電流モード、弱サーボ電流イメージモ
ードが好ましく、その他、例えば、コンスタントハイド
モードも考えられる。導電性探針としては、例えば、タ
ングステノ、白金、白金−イリジウム等の導電性の良い
金属探針等が好ましく、その他、例えば、カボンファイ
バよりなる探針、或いは、白金又は白金−パラジウム或
いはカーボン等の導電性金属薄膜で被覆されたガラス片
先端或いは電極又はダイヤモンド針も有用なものとして
掲げられる。

未知の抗原又は抗体の有無又は存在量の定量化は、第２
図に示すようにどの導電性微粒子標識体のある基板を二
次元的に７のＳＴＭ等の装置で走査測定し、導電性微粒
子標識体の形状乞凹凸像として画像化することで、抗原
又は抗体＝　９１〇− の有無が判定でき、定量化に関しては、導電性微粒子標
識体の凹凸像の個数を計数し、予め濃度既知の試料によ
シ作裂した抗原又は抗体の検量線ン用いて行うことでで
きる。

〔実施例〕

実施例４．２例、第３図と第り図のブロック図で説明す
る。

実施例／ヒトイムノグロブリン（以下、工ｇＧと略す；抗原）と
ウザギ抗ヒ）ＩｇＧ（抗体）による抗原抗体反応検出（
免疫検査）モデル系第３図に示す−の導電性基板（電気伝導度ｑ、ｓ−ｘ　
１０５Ｓ／ｃｘｓ金薄板）　ｗ　／　ｒｎｙ　／　ｍｅ
のヒトｘｇａｙ含むリン酸緩衝生理食塩水（１０１ηＭ
　ＩＪン酸緩衝液、ｌ！；０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ
７，ｌＩ−；以下、Ｐ’ＢＳと略す）中で１時間、摂氏
３７度の条件で浸しておき、３′で示すヒ）ＩｇＧＹ導
電性基飯表面−に付着させる。その後、基板面上の過剰
のＩｇＧ’、ｒＰＢＳで洗い流す。

上記基板の抗原未吸着表面部は、ＢＳＡ／％を含むＰＢ
Ｓに７時間、摂氏３７度で浸すことにより、グ′で示ｊ
ＢｓＡでブロックされる。その後、基板ンｏ、ｏ左％の
Ｔｗｅｅｎ　、２θ乞ふくむＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと
略す）で３度洗う。

前述の工程で作製された抗体検出用の基板は７％のＢＳ
Ａ’＆含むＰＢＳＴ中のＳ′で示すウサギ抗ヒト■ｇＧ
で抗原抗体反応処理される。摂氏３７度で、７時間イン
キュペイジョンした後、過剰の抗体は、ＰＢＳＴで洗う
ことによシ、除去される。

先に述べた工程で作製された基板の抗原抗体複合体’（
７ＳＴＭによシ、効率よく検出するために、６′で示す
導電性の金コロイド標識プロティ／Ａ（を気伝導度ｙ、
ｓ　Ｘ　／　ｏ５Ｓ／ｃｒｎ％　平均粒度１５ｎｍ）を
、２０ｍＭトリス、ノｓ　ｏｍＨ塩化ナトリウム、Ｏ１
７％ＢＳＡ、Ｏ，／％Ｔｗ６６ｎ　、２０　。

θ、θユ％アジ化ナトナトリウムなる溶液中で、基板上
の抗原抗体複合体と反応させる。摂氏グ［ｆ、約／−２
時間、インキュベイトした後、不要な、非特異的に吸着
した金コロイドはＰＢＳＴで洗浄することによシ除去す
る。

掛かる工程によシ作製されたヒ）ＩｇＧ（抗原）とウサ
ギ抗ヒ）ＩｇＧ（抗体）による抗原抗体反応検出（免疫
検査）モデル系試料は、第２図に示′ｆ７のＳＴＭ測定
機器（バイアス電圧０．０２　！；　Ｖ、トンネル電流
ｏ、ｓｍｋ）と試料ｇの構成で測定検出される。

実施例ユＢ型肝炎ウィルス表面抗原の検出第７図に示すコの導電性基板（電気伝導度／×／θ３Ｓ
／ｃｒｒＬ、ＨＯＰＧグラファイト）ハマず始めに１．
２％の３−アミノプロビルトリエトキンシランン含むア
セトン溶液で、Ω時間インキュベイトされた後、アセト
ンと純水で、順次、洗浄される。その後、２％のグルク
ルアルデヒドを含むＰＢＳで、室温で３時間インキュベ
イトされ、２３０ｍＭのリン酸緩衝液（以下ＰＢと略す
）で洗われる。この前処理後、基板は、で、室温下７５
時間インキュベイトされ、基板上の過剰の抗体は２　！
；　０　（ｎＭのＰＢで、洗い流されろ。上記基板の未
反応表面部は、３％のウサギ血清を含むＰＢＳに２時間
、室温で浸すことによシ、１０で示すウサギ血清でブロ
ックされる。その後、基板’ＹＰＢＳＴで３度洗う。

前述の工程で作製された抗原検出用の基板はＩＩで示す
ＨＢ　ｓ　Ａｇ　Ｙ含む検体で抗原抗体反応処理される
。摂氏３７度で、７時間インキュベイジョンした後、Ｐ
ＢＳＴで洗う。この基板は更に、７．２で示す二次抗体
としてウサギの抗−ＨＢ　ｓ　Ａｇ　Ｉ　ｇＧを含む溶
液で、摂氏３７度にて、Ω時間インキュベイジョンされ
る。過剰の二次抗体は、ＰＢＳＴで洗うことにより、除
去される。

前述の工程で作製された基板上の抗体−抗原抗体複合体
’＆ＳＴＭによシ効車よく検出するために、／３で示す
導電性の金コロイド標識ブｏｆ　イｙＡ　（Ｎ％伝導度
＜’ｊ−Ｘ１０５Ｓ／（１）平均粒径／　ｋ　ｎｍ　）
　Ｖ、２０　ｍＭ　）リス、／！；ＯｍＭ塩化ナトリウ
ム、θ、／％ＢＳＡ、、０．／％Ｔｗｅ６０２０．０．
０：２％アジ化ナトリウムからなる溶液中で、基板上の
抗原抗体複合体と反応さぜる。

摂氏グ度で、約７２時間、インキュベイトした後、不要
な、非特異的に吸着した金コロイドは、ＰＢＳＴで洗浄
することによシ除去する。

掛かる工程によυ作製されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原
の検出（免疫検査）試料は、第一図に示ｊ７のＳＴＭ測
定機器（バイアス電圧θ、θ２ＳＶ、）ンネル電圧０．
Ｓ、ｎＡと試料ｇの構成で測定検出される。

〔発明の効果〕

以上詳述したように本発明によれば、基板上に、検体液
中にある抗原あるいは抗体を吸着することで、検体液中
に分散する極めて希薄な抗原あるいは抗体を検出するこ
とができる（＠線検出）。更に、ＳＴＭ等の高空間分解
能を利用するので基板上の極小量の抗原あるいは抗体を
検出することができる（高分解能検出）。濃縮検出と高
分解能検出の相乗効果によシ従来のいがなるイムノアッ
セイ法より簡便に、安全に、安価に、効率良く、極めて
高感度にイムノアッセイを行える。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の／実箔例乞示すブロック図、富コ図
は、第１図の実施例の動作説明のための装置のブロック
図、第３図は、第１図における試料を作製する工程の第
１例を示す図、第９図は、第１図における試料乞作製す
る工程の第−例乞示す図である。図中、／はＳＴＭ装置等の探針の最先端の拡大模式図、
ユは導電性基板、３は抗原、ダは試料、左は抗体、乙は
導電性微粒子、７はＳＴＭ等の装置、ｇは導電性粒子標
識体のある基板を示し、図３で３′はヒ）ＩｇＧ、４”
はウサギ抗ヒ）ＴｇＧ、　　乙′は導電性の金コロイド
標識プロティンＡ２示す。図９で、ワはウサギの抗Ｂ型
肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｆ（ａｂ’）２．１０はウ
サギ血清、／／はＨＢｓＡｇ、／ｕはウサギの抗ＨＢｓ
Ａｇ　ＩｇＧ％　　／　３は導電性の金コロイド標識プ
ロティンＡである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）（ａ）少なくともその表面に導電性層を有する基
板上に抗原又は抗体を担持する工程（ｂ）該基板上の抗原又は抗体が担持されていない部分
を、該抗原又は抗体に不活性な物質で被覆する工程（ｃ）該基板上に担持された抗原又は抗体と試料中の抗
体又は抗原を反応させる工程（ｄ）抗原・抗体反応物に導電性微粒子を担持する工程（ｅ）該基板にバイアス電圧を加えて該基板の導電性層
に流れるトンネル電流を測定する工程から成ることを特徴とする免疫測定法。