KR101821552B1

KR101821552B1 - 돼지의 유두수 예측용 ｓｎｐ 마커 및 이를 이용한 다산 개체 예측방법

Info

Publication number: KR101821552B1
Application number: KR1020160098199A
Authority: KR
Inventors: 최봉환; 박종은; 김태헌; 이경태
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2016-08-01
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2018-01-25

Abstract

본 발명은 돼지의 유두수 예측용 ＳＮＰ 마커 및 이를 이용한 다산 개체 예측방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 보다 신속하고 정확하며 경제적인 돼지의 유두수 예측용 ＳＮＰ 마커 조성물 및 이를 이용한 다산 개체 예측방법에 관한 것이다.

Description

돼지의 유두수 예측용 ＳＮＰ 마커 및 이를 이용한 다산 개체 예측방법{SNP marker for prediction of pig's nipple number and method for prediction of highly fertile pig using the same}

본 발명은 돼지의 유두수 예측용 ＳＮＰ 마커 및 이를 이용한 다산 개체 예측방법에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 보다 신속하고 정확하며 경제적인 돼지의 유두수 예측용 ＳＮＰ 마커 및 이를 이용한 다산 개체 예측방법에 관한 것이다.

돼지고기는 전 세계적으로 가장 많이 소비되는 동물성 단백질 공급원으로서, 국내의 경우 식육별 선호도는 돼지고기 59%, 닭고기 21.6%, 쇠고기 18.5%, 기타 0.9%로 돼지고기가 전체 육류 소비량의 절반 이상을 차지하고 있는 것으로 보고되었다(농림수산식품부, 2006). 또한, 2013년도 양돈생산액이 5조로 농림업 총생산액 중에 10.7%를 차지하여 쌀 다음으로 전체 2위를 차지하고 있다.

가축에서 대표적인 번식 형질에는 산자수 (litter size), 임신가능 연령, 임신 기간, 배란율, 배아 생존율, 자궁의 길이, 난소 무게 등이 있으며 개체 번식의 효율성과 자손의 생존에 있어서 매우 중요하다.

최근에는 산자수와 이유두수 개량을 위한 돼지 산자능력 검정사업의 중요성이 재인식되고 있다. 이에 국내는 물론 유럽에서도 산자수가 많은 모돈의 집단을 만들어 그 집단에서 계속적으로 우수계통을 육성하고 있는데, 이를 하이퍼 프로리픽 라인(Hyper-prolific line)이라고 한다. 미국, 영국, 일본 등의 선진국에서도 다산성 계통의 육성을 위하여 중국 재래종인 메이시안(Meishan)종의 유전자를 수입하여 돼지 산자수 개량에 많은 연구가 활발히 진행되고 있지만, 아직은 실효성 있는 결과를 얻지 못하고 있다.

돼지의 유두수는 양돈산업에서 산자수와 관련된 중요한 번식 형질이다. 유두수는 어미돼지가 포유시킬 수 있는 복당 산자수와 밀접한 관계를 가지고 있어 암퇘지의 포유능력을 평가할 수 있는 번식능력과 관련된 중요형질이기 때문에 양돈산업에서 전통적 선발요소로 응용되어져 왔다. 번식돈이 가지고 있는 유두수가 산자수에 비해 적을 시 자돈의 수유의 불균형에 의해 영양결핍 등으로 폐사가능성이 높아져서 양돈의 생산성 저하를 초래한다.

따라서, 돼지의 유두수는 양돈농가 및 종돈회사에게 매우 중요시 하면서도 개량하기 힘든 표현형질이기에 유전자 검사를 통한 조기예측법을 개발할 필요가 있다.

한국등록특허 제0444160호(2004.08.02.)

본 발명의 목적은 돼지의 유두수와 연관관계를 나타내는 돼지의 유두수 예측용 ＳＮＰ 마커 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 SNP 마커를 포함하는 돼지의 총산자수 예측용 마이크로어레이 및 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 ＳＮＰ 마커를 이용한 돼지의 다산 개체 예측방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 돼지의 유두수 예측용 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 유두수 예측용 마이크로어레이가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 유두수 예측용 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, a) 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계; b) 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나 이상의 SNP 마커를 포함하는 DNA를 증폭시키는 단계; 및 c) 상기 증폭된 DNA의 SNP 마커를 판독하는 단계를 포함하는 다산 개체 예측 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 서열번호 1의 SNP 마커 유전자형이 C인 경우; 상기 서열번호 2의 SNP 마커 유전자형이 C인 경우; 상기 서열번호 3의 SNP 마커 유전자형이 G인 경우; 상기 서열번호 4의 SNP 마커 유전자형이 G인 경우; 상기 서열번호 5의 SNP 마커 유전자형이 G인 경우; 상기 서열번호 6의 SNP 마커 유전자형이 G인 경우; 상기 서열번호 7의 SNP 마커 유전자형이 A인 경우; 상기 서열번호 8의 SNP 마커 유전자형이 G인 경우; 및 상기 서열번호 9의 SNP 마커 유전자형이 G인 경우로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 해당하면 다산 개체라고 예측하는 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 예측 방법은 유두수 예측을 위해 피검체로부터 얻은 DNA 시료를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 내지 9로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 유전자 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고, 상기 PCR 반응물을 시퀀싱(sequencing)하여 상기 SNP 마커를 판독할 수 있는 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 SNP 마커들은 유두수와 높은 연관성을 나타내고 있으므로, 본 발명의 SNP 마커 조성물을 활용하면 보다 신속하고 정확하며 경제적인 방법으로 돼지의 유두수 예측이 가능하다.

또한, 본 발명의 조성물은 중요한 번식형질인 돼지의 유두수 및 이에 따른 다산 개체를 조기에 예측할 수 있어 다산 돼지의 생산 관련 형질 개량에 크게 기여할 수 있다.

본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명자들은 돼지 번식돈 1,000두의 혈액으로부터 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, PorcineSNP60 DNA Analysis Kit v2 (Illumina, San Diego, CA, USA)를 이용하여 SNP 유전자형 분석을 실시하였다. 돼지 1,000두에 대하여 SNP 60K chip 분석 및 GWAS 분석을 통한 돼지의 유두수와 연관성이 높은 최적의 SNP 9개를 선발하여 본 발명을 완성하였다.

산자수 등 유전력이 낮은 번식형질은 전통적인 육종방법인 선발 및 교배를 통한 개량보다 표지인자에 근거한 선발(MAS; marker-assisted selection)이나 유전체 선발(GS; genomic selection)이 더 효과적이며, MAS나 GS가 전통적인 육종방법에 비해 유전적 개량량을 30% 이상 제고 가능하다고 알려져 있다. 따라서 본 발명에 의한 SNP 마커 조성물을 이용하여 다산 개체를 선발하면 유전적 개량 효과를 증진할 수 있다.

본 발명에 있어서, "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열상의 단일 염기 다형성 대립인자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 돼지의 유두수와 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서, "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명에 있어서, "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명에 있어서, "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 변이 부위, 즉 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있다면 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 공지의 수단을 이용할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, SNP 마커를 증폭 및 PCR-RFLP 방법을 통해 판독하여 돼지의 유두수를 예측할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 및 PCR-RFLP 방법에 이용되는 제한효소를 의미할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 프로브 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 SNP를 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다. 한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 키트가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 본 발명의 마이크로어레이 이외에 진단 대상으로부터 해당 SNP를 포함하는 DNA를 분리 및 증폭하는데 사용되는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 본 발명의 서열을 참조하여 당업자는 용이하게 설계할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 중합 반응에 필요한 시약, 예컨대 dNTP, 각종의 중합효소 및 발색제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명에 있어서, “다산 개체”는 유두수가 돼지 평균 유두수보다 많은 개체를 의미한다.

본 발명에 있어서, "피검체"란, 유두수를 확인하고자 하는 대상인 돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻어진 시료를 이용하여, 상기 SNP 마커를 분석함으로써 상기 돼지의 유두수를 판단할 수 있다. 상기 시료는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계는 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함하는 의미이다. 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 증폭된 SNP 마커를 판독하는 방법은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization,DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing)방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 예측 방법은 유두수 예측을 위해 피검체로부터 얻은 DNA 시료를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 내지 9로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 유전자 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고, 상기 PCR 반응물을 시퀀싱(sequencing)하여 상기 SNP 마커를 판독할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 예측 방법은 상기 피검체로부터 얻은 SNP를 포함하는 DNA 시료를 상기 마이크로어레이에 혼성화시키는 단계 및 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 예측 방법은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 돼지 대립형질 특이적 혼성화 과정을 포함할 수 있다. 상기 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 즉, 일련번호 1 내지 9의 각 SNP 서열 중의 다형성 부위의 염기가 식별될 수 있도록 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명에 있어서 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프라이머일 수 있는데, 여기서 프라이머(primer)란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

상기 프라이머는 단일염기다형성 부위를 포함하여 표적 DNA에 혼성화할 수도 있으며, 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프로브일 수 있다. 본 발명에서 프로브(probe)란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500 (1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯팅 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, 마이크로어레이를 이용한 방법에서 마이크로어레이의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예

돼지에 대한 porcine 60K SNP chip 분석

돼지의 혈액으로부터 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, pigSNP60 v2 Genotyping BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA)를 이용하여 SNP 유전자형 분석을 실시하였다.

< 1일째 Amplification >

○ 재료 및 기구

1. 시약

2. 기구

Centrifuge, Vortex, Illumina Hybridization 오븐

○ 실험방법

1. MSA3 바코드를 붙인 MIDI plate (이후, MSA3 plate 로 표기)에 20ul의 MA1을 분주하였다.

2. 4ul의 DNA를 MSA3 plate에 넣었다.

3. Lab tracking form에 DNA ID 와 옮긴 MSA3 plate의 위치를 적어두었다.

4. 4ul의 0.1N NaOH를 MA1과 DNA가 들어있는 MSA3 plate 각 well에 넣었다.

5. 96well cap mat을 이용하여 MSA3 plate를 덮고, 1600rpm에서 1분 동안 vortex 하였다.

6. 280×g에서 1분간 원심분리 하였다.

7. 실온에서 10분간 반응시켰다.

8. 34ul의 MA2를 샘플이 들어있는 MSA3 plate 각 well 에 넣었다.

9. 38ul의 MSM를 샘플이 들어있는 MSA3 plate 각 well 에 넣었다.

10. Cap mat를 덮고 280×g에서 1분간 원심분리 하였다.

11. 37℃의 Illumina Hybridization 오븐에서 20-24 시간 동안 반응시켰다. (Amplification)

<실험 2일째 Fragment >

○ 재료 및 기구

○ 실험방법

1. 오븐에서 plate를 꺼내어 50×g에서 1분 원심 분리하였다.

2. 25ul의 FMS를 샘플이 들어있는 각 well에 넣었다.

3. cap mat으로 MSA3 plate를 덮고 1600 rpm 1분 vortex 하였다.

4. plate를 꺼내어 50×g에서 1분 원심 분리하였다.

5. 37℃ heat block에서 1시간 동안 반응시켰다.

< 2일째 Precipitation >

○ 재료 및 기구

○ 실험방법

1. Cap mat을 벗기고 25ul의 PM1을 샘플이 들어있는 각 well에 넣었다.

2. Cap mat을 덮고 1600rpm에서 1분간 원심분리 하였다.

3. 37℃에서 5분간 반응시켰다.

4. plate를 꺼내어 50×g에서 1분 원심 분리하였다.

5. Cap mat을 벗기고 155ul의 2-propanol을 샘플이 들어있는 각 well에 넣었다.

6. 새로운 cap mat을 이용하여 plate를 덮고 10번 뒤집어서 혼합한 뒤 4℃에서 30분 동안 보관하였다.

7. 4℃, 3,000rpm에서 20분 동안 원심분리 후 즉시 원심분리기에서 MSA3 plate를 꺼냈다.

8. Cap mat을 즉시 제거하고 빠르게 뒤집어 상층액을 버렸다.

9. 흡수성 패드(키친타올, 킴타올 등)에 10회 정도 가볍게 두드렸다.

10. 뒤집혀진 플레이트 그대로를 튜브렉에 올려놓고 1시간 동안 자연 건조시켰다.

< 2일째 Resuspend >

○ 재료 및 기구

○ 실험방법

1. 23ul 의 RA1을 DNA pellet이 들어있는 각 well에 넣고, 남은 RA1은 XStain HD Bead Chip 용으로 보관하였다(냉동보관).

2. MSA3 plate에 foil seal을 올리고 heat-sealer block을 5초 동안 눌러 sealing 하였다.

3. 48℃의 Illumina Hybridization 오븐에서 1시간 동안 반응시켰다.

4. 1800rpm에서 1분간 vortexing 하였다.

5. 280×g, 1분 원심분리 하였다.

<2일째 - Hybridization >

○ 재료 및 기구

○ 실험방법

1. MSA3 plate 는 95℃ heat block에서 20분간 denature 시켰다.

2. 20분 후 MSA3 plate를 heat block에서 꺼낸 후 실온에 30분 동안 두고 식혔다.

3. plate를 식히는 30분이 거의 다 되어갈 무렵 HybChamber에 HybChamber Gaskets을 끼웠다.

4. 400ul 의 PB2를 HybChamber에 있는 8개의 humidifying buffer reservoir에 넣고 HybChamber 두껑을 닫아 실온에 두었다.

5. 실온에서 30분 동안 DNA를 식히고 나면 MSA3 plate를 280×g, 1분 원심분리 하였다.

6. 보관중인 Chips을 하나씩 냉장고에서 가져와 chips 보장을 뜯고 HybChamber insert의 바코드 모양과 chips 의 바코드부분을 맞춰서 놓은 후 멀티채널 피펫을 이용하여 샘플 당 15ul씩 따서 chips의 양쪽 부분으로 샘플을 loading 하였다.

7. 각 chips의 샘플 loading이 끝나는 대로 HybChamber에 넣고 다음 chips 도 같은 방법으로 반복하였다.

8. Chamber가 채워지면 chamber 뚜껑을 닫고 48℃의 Illumina Hybridization 오븐에 넣고 속도 5로 세팅하여 16-24시간 동안 반응하였다.

<3일째 - Washing bead chips >

○ 재료 및 기구

1. 시약

2. 기구

- Multi-sample beadChip Alignment fixture

- Te-Flow Flow-Through chambers(black frames, spacers, glass back plate and clamps)

- Wash Dish

- Wash Rack

○ 실험방법

1. Hyb chamber를 Hybridization 오븐에서 꺼냈다.

2. Hyb chamber의 잠금장치를 열고 chamber 속의 insert 한번에 하나씩을 꺼냈다.

3. 칩에 붙어 있는 Seal을 잡아당겨 칩으로부터 제거하였다.

4. Seal이 제거된 칩은 Wash Rack에 꽂아 WB1 Wash dish에 담구었다.

5. 모든 칩이 WB1에 담기게 되면 Wash Rack을 dish에서 1분 동안 뺏다 넣었다 하는 방법으로 씻어 주고 PB1이 들어 있는 또 다른 Wash Dish에 Wash Rack을 옮겨 1분 동안 이 과정을 반복해 주었다.

6. 다시 PB1 wash dish에 담근 후 Wash Rack을 dish에서 1분 동안 뺏다 넣었다 하는 방법으로 씻어 주고 PB1이 들어 있는 또 다른 Wash Dish에 Wash Rack을 옮겨 1분 동안 이 과정을 반복해 주었다.

7. Washing이 끝나고 나면 BeadChips Alignment fixture에 back frame을 올리고 바코드 방향에 맞추어 칩을 한 장씩 올린 후 하얀색 부분과 분리한 투명한 부분의 스페이스를 Alignment fixture의 윗부분과 아랫부분에 맞춰 끼웠다.

8. 스페이스를 올린 후 칩의 위쪽 부분(바코드가 없는 부분)에 Alignment bar를 올리고 유리판의 끝이 bar에 닫게끔 유리판을 덮은 후 클립을 끼웠다.

(Flow-through chamber assembly 완성)

9. 클립을 끼우고 나면 Alignment bar를 제거하고 Flow-through chamber assembly 양끝의 스페이스 부분을 가위로 잘라준다.

<3일째 - XStain Beadchips >

○ 재료 및 기구

1. 시약

2. 기구

- Water circulator

- Chamber Rack

- Wash dish 2개, staining rack, tube rack

○ 실험방법

1. 챔버렉의 온도가 44℃가 되면 Flow-through chamber assembly를 챔버렉에 끼웠다.

2. 각 chips에 150ul의 RA1을 넣고 30초 동안 반응시켰다. 이 과정을 5번 더 반복하였다.

3. 450ul의 XC1을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

4. 450ul의 XC2을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

5. 200ul의 TEM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

6. 450ul의 95% formamide/1mM EDTA을 각 칩에 넣고 1분 동안 반응시킨 후 한 번 더 넣어주었다.

7. 5분 동안 반응시켰다.

8. LTM tube의 라벨에 적혀 있는 온도를 확인하고 그 온도대로 챔버렉의 온도를 바꾸어 주었다.

9. 450ul의 XC3을 각 칩에 넣고 1분 동안 반응 시킨 후 다시 한번 넣어준 후 8번의 온도에 도달할 때까지 기다렸다.

10. 250ul의 LTM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

11. 450ul의 XC3를 넣고 1분 후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시켰다.

12. 250ul의 ATM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

13. 450ul의 XC3를 넣고 1분 후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시켰다.

14. 250ul의 LTM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시킨다.

15. 450ul의 XC3를 넣고 1분 후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시켰다.

16. 250ul의 ATM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

17. 450ul의 XC3를 넣고 1분 후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시켰다.

18. 250ul의 LTM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

19. 450ul의 XC3를 넣고 1분 후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시켰다.

20. 이 과정이 끝나면 즉시 Flow-through chamber에서 chamber Rack을 분리하고 실온의 실험 테이블로 옮긴 후 평평하게 꺼내어 놓았다.

21. 310 ml의 PB1을 세척용기에 넣고 염색용 rack을 용기 안에 담가 놓았다.

22. 기구를 이용하여 chamber rack의 클립을 벗기고 유리 블록을 들어서 제거한 후에 chips의 bead 부분이 건들리지 않게 양끝에 붙어 있는 스페이스를 제거하였다.

23. 칩에 붙였던 부착물을 모두 제거하고 나면 PB1에 담겨있는 스테이닝렉에 꽃아 PB1에 담가두었다. 같은 방법으로 모든 chips을 처리하였다.

24. 천천히 염색용 랙을 10번 정도 위아래로 움직여서 칩을 담금질한 후 5분 동안 담가두었다.

25. 다른 세척용 용기에 XC4 310ml을 채운 후 24번과 같은 방법으로 10회 동안 담금질한 후 5분 동안 담가두었다.

26. 5분 후 세척용 용기에서 염색용 랙을 꺼낸 후 튜브렉에 다음 그림과 같은 방법으로 올려놓았다.

27. 집게를 이용하여 chips을 랙에서 조심스럽게 꺼내어 튜브렉 위에 올려놓았다.

28. Chips을 올려놓은 튜브렉을 조심스럽게 진공 건조기에 넣고 508mmHG (0.68 bar)의 진공 상태로 55-55분 동안 말려주었다.

29. Chips이 건조된 것이 확인되면 에탄올에 적신 킴와이프를 이용하여 chip 의 가장자리 부분을 잘 닫아 주었다. 이때 bead 부분은 건드리지 않게 주의하였다.

30. Beadchips은 실험 완료 후 72시간 이내에 Scanner를 이용하여 이미지화를 시키도록 하였다.

돼지 유두수와 유의적으로 연관성이 있는 9개 마커 선발방법

돼지(암퇘지) 1,000두에 대한 유두수와 연관된 9개의 SNP 마커는 최초 61,177개(60K SNP 칩)의 SNP 마커에 대하여 PLINK 통계분석 프로그램을 이용한 유의성 검사를 통해 선발하였다. 최초 유전자형이 결정된 61,177개 마커 중에서 하디-와인버그 법칙을 통하여 3,302개의 SNP 마커가 탈락되었다(HWE test: p<=0.001). 그 다음 유전자형 결정에서 빠진 3,000개의 SNP 마커가 탈락되었다(GENO>0.1). 그 다음 소수 유전자형빈도 분석을 통해 16,398개의 SNP 마커가 탈락되었다(MAF<0.05). 결국, 61,177개의 SNP 마커 중에서 38,477의 온전한 SNP 마커를 통해 유두수 14-15개의 변화를 통계분석으로 유의성이 있다고 판단되어진 상위수준의 9개 SNP 마커를 선발하였다.

결과

돼지 1000두에 대하여 SNP 60K chip 분석을 통해 돼지의 유두수에 대하여 예측 가능한 SNP 9개를 선발하였으며, 이들에 대한 정보는 [표 1]에서 보는 바와 같다. 본 발명에 의한 돼지의 유두수를 조기 예측할 수 있는 DNA 마커로서 활용될 수 있어 다산 개체 선발에 유용할 것으로 판단된다. 표 1은 돼지의 유두수를 조기예측 가능한 SNP의 염기서열 정보에 관한 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> SNP marker for prediction of pig's nipple number and method for prediction of highly fertile pig using the same <130> NPF29298 <160> 9 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 tgcatggcca ggctctgtcc ttaagaacca aagaccctgc ggccttagag tatgctggtg 60 atagacaggc attagctcat gtgatgcctc caaacttggt gagggaggta gtatccttat 120 c 121 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 2 aaacagaaac acagagacag agtttggggc aaagtggaaa agaatagctt cattgctttg 60 acgggcaaaa gaggccacag caggctaatg ccctaaagac tgtgtgctcc tttgggagca 120 a 121 <210> 3 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 3 atattttgtt ctattttgtc ttttccatgt gtaaatcttg agtgttcttt tgcattagat 60 ataaatattt gtgaatttca tgcaagtgat tttatgcaca tgcatttgac tggctctatc 120 t 121 <210> 4 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 4 gcacccagtg ctgagtgggg accaacactc atccatgtct cctgcctcct agtgcagcac 60 attattcctr ttgctgtgct cccagagagg ccctggatgc cctgggcaga ggagctgtga 120 c 121 <210> 5 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 5 ggttaaaata ttggagaaag taaagcgtca tgattcatga aagtaactgc atctgtaagc 60 aaactgaaga atttggcccc ctgaggagct ccaaagatgt tcgcagaatg aatttgaaga 120 t 121 <210> 6 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 6 tttcccctgc accatgacgg caactcctaa atgttgcttt ttataataaa cttcatcctc 60 agaaacactg atgattaata tctttttttt ctttatcatt atattcattt ctatgtcwgt 120 a 121 <210> 7 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 7 aaccttctgt ggaataagat gtgatcacag agggatgtaa gtctgccagg taatgtttaa 60 aaagagctca ttagggactt cccgtcatgc ctcagcaaaa actgaatctg actagtttcg 120 a 121 <210> 8 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 8 aatctttccc tagttaagag gaacttgagt tgggttgctg ttggttactt ttcaaaaagg 60 aagtactggc gttcccacac cgggagtcga acccgggccg cctgggtgaa aaccaggaat 120 c 121 <210> 9 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 9 aagcaggcaa attttattat gaacacatag tttgctactt aactatcctt aagaccccgg 60 atgcttccag ttctcagcag gagggctcca gaggaggcga gatgaagggc gcggagggcg 120 t 121

Claims

서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 염기를 포함하는 8-121개의 연속하는 염기서열로 이루어지지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
를 포함하는 돼지의 유두수 예측용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 기재된 조성물을 포함하는 돼지의 유두수 예측용 마이크로어레이.
제1항 또는 제2항에 기재된 조성물을 포함하는 돼지의 유두수 예측용 키트.
a) 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계;
b) 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나 이상의 SNP 마커를 포함하는 DNA를 증폭시키는 단계; 및
c) 상기 증폭된 DNA의 SNP 마커를 판독하는 단계를 포함하는 돼지의 다산 개체 예측 방법.
제5항에 있어서,
상기 서열번호 1의 SNP 마커 유전자형이 C인 경우;
상기 서열번호 2의 SNP 마커 유전자형이 C인 경우;
상기 서열번호 3의 SNP 마커 유전자형이 G인 경우;
상기 서열번호 4의 SNP 마커 유전자형이 G인 경우;
상기 서열번호 5의 SNP 마커 유전자형이 G인 경우;
상기 서열번호 6의 SNP 마커 유전자형이 G인 경우; 및
상기 서열번호 7의 SNP 마커 유전자형이 A인 경우;
로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 해당하면 다산 개체라고 예측하는, 돼지의 다산 개체 예측 방법.
제5항에 있어서,
피검체로부터 얻은 DNA 시료를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 내지 7의 SNP를 포함하는 유전자 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고, 상기 PCR 반응물을 시퀀싱(sequencing)하여 상기 SNP 마커를 판독하는, 돼지의 다산 개체 예측 방법.