KR101855664B1

KR101855664B1 - 돼지의 실산자수 예측용 snp 마커 및 이를 이용한 실산자수 예측방법

Info

Publication number: KR101855664B1
Application number: KR1020160149737A
Authority: KR
Inventors: 최봉환; 박종은; 김태헌; 이경태; 조은석
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2016-11-10
Filing date: 2016-11-10
Publication date: 2018-05-09

Abstract

본 발명은 돼지의 실산자수 예측용 SNP 마커 및 이를 이용한 실산자수 예측방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 돼지의 실산자수와 연관관계를 나타내는 SNP 마커, 마이크로어레이, 키트 및 이를 이용한 실산자수 예측방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 SNP들은 산자수와 높은 연관성을 나타내고 있으므로, 본 발명의 SNP 마커를 이용하면 유전자 검사를 통해 돼지의 실산자수를 조기에 예측할 수 있는 이점이 있다. 따라서, 본 발명은 다산의 종돈의 조기선발 및 종의 개량에 활용할 가치가 대단히 높다.

Description

돼지의 실산자수 예측용 SNP 마커 및 이를 이용한 실산자수 예측방법{SNP markers for prediction of pigs alive litter size and methods for prediction of pigs alive litter size using the same}

본 발명은 돼지의 실산자수 예측용 SNP 마커 및 이를 이용한 실산자수 예측방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 돼지의 실산자수와 연관관계를 나타내는 SNP 마커, 이를 포함하는 마이크로어레이, 키트 및 이를 이용한 실산자수 예측방법에 관한 것이다.

2013년도 양돈생산액이 5조로 농림업 총생산액 중에 10.7%를 차지하여 쌀 다음으로 전체 2위를 차지하고 있다. 돼지의 실산자수는 양돈산업에서 MSY(교배모돈당 출하두수)와 관련된 중요한 번식형질이다.

그러나 돼지의 산자수는 다른 형질에 비하여 상대적으로 낮은 유전력과 성의 제한 등 기술적인 한계가 있어서 개량이 쉽지 않다. 산자수는 매우 복잡한 형질로서 배란율, 초기 배아의 생존율, 태아의 생존율, 자궁의 용량과 능력, 젖꼭지 수 등의 형질에 의해서 결정된다.

산자수를 증가시키기 위해서 적합한 영양공급과 암퇘지의 관리, 유전적 요소 등에 노력을 기울이고 있는데 유전학적 선발은 산자수를 증진 시켜 다산능을 가진 암퇘지를 생산하는데 크게 기여하고 있다.

최근에는 산자수와 이유두수 개량을 위한 돼지 산자능력 검정사업의 중요성이 재인식되고 있다. 이에 국내는 물론 유럽에서도 산자수가 많은 모돈의 집단을 만들어 그 집단에서 계속적으로 우수계통을 육성하고 있는데, 이를 하이퍼 프로리픽 라인(Hyper-prolific line)이라고 한다. 미국, 영국, 일본 등의 선진국에서도 다산성 계통의 육성을 위하여 중국 재래종인 메이시안(Meishan)종의 유전자를 수입하여 돼지 산자수 개량에 많은 연구가 활발히 진행되고 있지만, 아직은 실효성 있는 결과를 얻지 못하고 있다.

실산자수는 총산자수(사산, 미라 포함)에서 사산, 미라 등과 같이 죽은 자돈을 제외하고 기형이나 체중이 미달된 자돈을 모두 포함한 자돈들의 총합을 의미한다. 따라서, 돼지의 실산자수가 증가할수록 양돈농가 및 종돈회사에게 매우 중요한 경제적 이익을 가지고 올 수 있고 개량하기 힘든 표현형질이기에 유전자 검사를 통한 조기예측법 개발이 필요하다.

한국등록특허 제0444160호(2004.08.02.)

본 발명의 목적은 돼지의 산자수와 연관관계를 나타내는 돼지의 실산자수 예측용 SNP 마커를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 SNP 마커를 포함하는 돼지의 실산자수 예측용 마이크로어레이 및 키트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 SNP 마커를 이용한 실산자수 예측방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지는 돼지의 실산자수 예측용 SNP 마커가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는 돼지의 실산자수 예측용 SNP 마커가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 돼지의 실산자수 예측용 SNP 마커가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어지는 돼지의 실산자수 예측용 SNP 마커가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어지는 돼지의 실산자수 예측용 SNP 마커가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 SNP 마커를 포함하는 마이크로어레이가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 61번째 염기가 A 또는 G인, 상기 서열번호 1의 염기서열의 61번째 염기를 포함하는 5 내지 200 염기의 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커를 포함하는 돼지의 실산자수 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 61번째 염기가 A 또는 G인, 상기 서열번호 2의 염기서열의 61번째 염기를 포함하는 5 내지 200 염기의 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커를 포함하는 돼지의 실산자수 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 61번째 염기가 A 또는 G인, 상기 서열번호 3의 염기서열의 61번째 염기를 포함하는 5 내지 200 염기의 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커를 포함하는 돼지의 실산자수 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 61번째 염기가 A 또는 G인, 상기 서열번호 4의 염기서열의 61번째 염기를 포함하는 5 내지 200 염기의 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커를 포함하는 돼지의 실산자수 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 61번째 염기가 A 또는 G인, 상기 서열번호 5의 염기서열의 61번째 염기를 포함하는 5 내지 200 염기의 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커를 포함하는 돼지의 실산자수 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 SNP 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 실산자수 예측용 키트가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, i) 피검체로부터 핵산을 추출하는 단계; ii) 서열번호 1 내지 5 중 1 이상의 염기변이 부위, 또는 이 부위 염기와 염기쌍을 이루는 상보사슬에서의 염기부위를 포함하는 핵산을 증폭시키는 단계; 및 iii) 상기 염기변이 부위의 염기서열을 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지의 실산자수 예측 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 서열번호 1의 염기변이 유전자형이 A인 경우에 다산 개체라고 예측할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 서열번호 2의 염기변이 유전자형이 A인 경우에 다산 개체라고 예측할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 서열번호 3의 염기변이 유전자형이 A인 경우에 다산 개체라고 예측할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 서열번호 4의 염기변이 유전자형이 G인 경우에 다산 개체라고 예측할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 서열번호 5의 염기변이 유전자형이 G인 경우에 다산 개체라고 예측할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 SNP들은 산자수와 높은 연관성을 나타내고 있으므로, 본 발명의 SNP 마커를 이용하면 유전자 검사를 통해 돼지의 실산자수를 조기에 예측할 수 있는 이점이 있다. 따라서, 본 발명은 다산의 종돈의 조기선발 및 종의 개량에 활용할 가치가 대단히 높다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 60K SNP chip을 이용하여 산자수와 유의적으로 연관이 있는 SNP 마커 5개를 발굴하여 다산 개체의 조기 선발하는데 활용 가능하도록 하였다.

본 발명에 있어서, 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 마이크로어레이가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 프로브 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 SNP를 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다. 한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 SNP 마커를 검출할 수 있는 제제는 본 발명에 따른 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 키트가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 본 발명의 마이크로어레이 이외에 진단 대상으로부터 해당 SNP를 포함하는 DNA를 분리 및 증폭하는데 사용되는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 본 발명의 서열을 참조하여 당업자는 용이하게 설계할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 중합 반응에 필요한 시약, 예컨대 dNTP, 각종의 중합효소 및 발색제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명에 있어, 다산 개체는 실산자수가 돼지 평균 실자산수보다 높은 개체를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 피검체로부터 핵산을 추출하는 단계는 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 핵산이란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA 및 RNA도 포함하는 의미이다. 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 예측 방법은 실산자수 예측을 위해 피검체로부터 얻은 DNA 시료를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 내지 5로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 유전자 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고, 상기 PCR 반응물을 시퀀싱(sequencing)하여 상기 염기변이 부위의 염기서열을 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 예측 방법은 상기 피검체로부터 얻은 SNP를 포함하는 핵산 시료를 상기 마이크로어레이에 혼성화시키는 단계 및 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 예측 방법은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 돼지 대립형질 특이적 혼성화 과정을 포함할 수 있다. 상기 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 즉, 일련번호 1 내지 5의 각 SNP 서열 중의 다형성 부위의 염기가 식별될 수 있도록 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명에 있어서 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프라이머일 수 있는데, 여기서 프라이머(primer)란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

상기 프라이머는 단일염기다형성 부위를 포함하여 표적 DNA에 혼성화할 수도 있으며, 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프로브일 수 있다. 본 발명에서 프로브(probe)란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500 (1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯팅 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, 마이크로어레이를 이용한 방법에서 마이크로어레이의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 산자수와 SNP 유전자형과의 연관성 분석

1-1. 돼지에 대한 porcine 60K SNP chip 분석

돼지의 혈액으로부터 Wizard Genomic DNA 정제 키트(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, CanineSNP60 v2 Genotyping BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA)를 이용하여 SNP 유전자형 분석을 실시하였다.

<1일째 - 증폭>

○ 재료 및 기구

1. 시약

초자 및 시약명	준비량	시약 보관 온도
MA1	1 튜브 (2.3ml/96 샘플)	실온
MA2	1 튜브 (3.9ml/96 샘플)	냉동
MSM	1 튜브 (4.2ml/96 샘플)	냉동
0.1N NaOH	1 튜브 (2.3ml/96 샘플)	냉동 (미리 만들어 분주 후 보관)
96well 0.8ml MIDI 플레이트	1개
96웰 캡 매트(96 well cap mat)	1개

2. 기구

원심분리기, 볼텍스(Vortex), 일루미나 혼성 오븐(Illumina Hybridization oven)

○ 실험방법

1. MSA3 바코드를 붙인 MIDI 플레이트 (이후, MSA3 플레이트로 표기)에 20ul의 MA1을 분주하였다.

2. 4ul의 DNA를 MSA3 플레이트에 넣었다.

3. 랩 트래킹 폼(Lab tracking form)에 DNA ID 와 옮긴 MSA3 플레이트의 위치를 적어두었다.

4. 4ul의 0.1N NaOH를 MA1 과 DNA 가 들어있는 MSA3 플레이트 각 웰 에 넣었다.

5. 96 웰 캡 매트(96 well cap mat)을 이용하여 MSA3 플레이트를 덮고, 1600rpm에서 1분 동안 볼텍스하였다.

6. 280×g에서 1분간 원심분리 하였다.

7. 실온에서 10분간 반응시켰다.

8. 34ul 의 MA2를 샘플이 들어있는 MSA3 플레이트 각 웰에 넣었다.

9. 38ul 의 MSM를 샘플이 들어있는 MSA3 플레이트 각 웰에 넣었다.

10. 캡 매트를 덮고 280×g에서 1분간 원심분리 하였다.

11. 37℃의 일루미나 혼성 오븐에서 20-24 시간 동안 반응시켰다. (증폭)

<실험 2일째 - 단편(Fragment)>

○ 재료 및 기구

초자 및 시약명	준비량	시약 보관 온도
FMS	1튜브 (3ml/96 샘플)	냉동

○ 실험방법

1. 오븐에서 플레이트를 꺼내어 50×g에서 1분 원심 분리하였다.

2. 25ul 의 FMS를 샘플이 들어있는 각 웰(well)에 넣었다.

3. 캡 매트로 MSA3 플레이트를 덮고 1600 rpm 1분 볼텍스하였다.

4. 플레이트를 꺼내어 50×g에서 1분 원심 분리하였다.

5. 37℃ 발열 블록에서 1시간 동안 반응시켰다.

<2일째 - 침전>

○ 재료 및 기구

초자 및 시약명	준비량	시약 보관 온도
PM1	1튜브 (7ml/96 샘플)	냉장
100% 2-프로판올	30ml(96 샘플 당)	실온
96웰 캡 매트	1개

○ 실험방법

1. 캡 매트를 벗기고 25ul 의 PM1을 샘플이 들어있는 각 웰에 넣었다.

2. 캡 매트를 덮고 1600rpm에서 1분간 원심분리 하였다.

3. 37℃에서 5분간 반응시켰다.

4. 플레이트를 꺼내어 50×g에서 1분 원심 분리하였다.

5.캡 매트를 벗기고 155ul 의 2-프로판올 샘플이 들어있는 각 웰에 넣었다.

6. 새로운 캡 매트를 이용하여 플레이트를 덮고 10번 뒤집어서 혼합한 뒤 4℃에서 30분 동안 보관하였다.

7. 4℃, 3,000rpm에서 20분 동안 원심분리 후 즉시 원심분리기에서 MSA3 플레이트를 꺼냈다.

8. 캡 매트를 즉시 제거하고 빠르게 뒤집어 상층액을 버렸다.

9. 흡수성 패드(키친타올, 킴타올 등) 에 10회 정도 가볍게 두드렸다.

10. 뒤집혀진 플레이트 그대로를 튜브랙에 올려놓고 1시간 동안 자연 건조시켰다.

< 2일째 재현탁(Resuspend) >

○ 재료 및 기구

초자 및 시약명	준비량	시약 보관 온도
RA1	7ml/96 샘플	냉동

○ 실험방법

1. 23ul 의 RA1을 DNA 펠렛이 들어있는 각 웰에 넣고, 남은 RA1은 X 염색 HD 비드 칩(XStain HD Bead Chip) 용으로 보관하였다(냉동보관).

2. MSA3 플레이트에 호일 밀봉재를 올리고 가열-밀봉재 블록(heat-sealer block)을 5초 동안 눌러 밀봉하였다.

3. 48℃의 일루미나 혼성 오븐에서 1시간 동안 반응시켰다.

4. 1800rpm에서 1분간 볼텍스하였다.

5. 280×g 1분 원심분리 하였다.

<2일째 - 혼성(Hybridization)>

○ 재료 및 기구

초자 및 시약명	준비량	시약 보관 온도
PB2	2튜브(96 샘플)	실온
비드칩	8개 (96 샘플)
혼성챔버	2개 (96 샘플)
혼성챔버 가스킷	2개 (96 샘플)
혼성챔버 인서트(inserts)	8개 (96 샘플)

○ 실험방법

1. MSA3 플레이트는 95℃ 가열블록에서 20분간 변성시켰다.

2. 20분 후 MSA3 플레이트를 가열블록에서 꺼낸 후 실온에 30분 동안 두고 식혔다.

3. 플레이트를 식히는 30분이 거의 다 되어갈 무렵 혼성챔버에 혼성챔버 가스킷을 끼웠다.

4. 400ul 의 PB2를 혼성챔버에 있는 8개의 증발하는 버퍼 저장소 (humidifying buffer reservoir)에 넣고 혼성챔버 뚜껑을 닫아 실온에 두었다.

5. 실온에서 30분 동안 DNA를 식히고 나면 MSA3 플레이트를 280×g 1분 원심분리하였다.

6. 보관중인 칩을 하나씩 냉장고에서 가져와 칩 포장을 뜯고 혼성챔버 인서트(insert)의 바코드 모양과 칩의 바코드부분을 맞춰서 놓은 후 멀티채널 피펫을 이용하여 샘플 당 15ul씩 따서 칩의 양쪽 부분으로 샘플을 로딩하였다.

7. 각 칩의 샘플 로딩이 끝나는 대로 혼성챔버에 넣고 다음 칩도 같은 방법으로 반복하였다.

8. 챔버가 채워지면 챔버 뚜껑을 닫고 48℃의 일루미나 혼성 오븐에 넣고 속도 5로 세팅하여 16-24시간 동안 반응하였다.

<3일째 - 비드칩 세척>

○ 재료 및 기구

1. 시약

시약 명	준비량	시약 보관 온도
WB1	350ml/1-8 비드칩	실온
PB1	350ml/1-8 비드칩	실온

2. 기구

- Multi-sample beadChip Alignment fixture

- Te-흐름 챔버를 통한-흐름(Te-Flow Flow-Through chambers)(검정 프레임(black frames), 스페이서(spacers), 유리 후면 판(glass back plate) 및 클램프(clamps))

- 세척 용기

- 세척랙(Rack)

○ 실험방법

1. 혼성챔버를 혼성 오븐에서 꺼냈다.

2. 혼성챔버의 잠금 장치를 열고 챔버 속의 인서트 한 번에 하나씩을 꺼냈다.

3. 칩에 붙어 있는 씰(Seal)을 잡아당겨 칩으로부터 제거하였다.

4. 씰이 제거된 칩은 세척랙에 꽂아 WB1 세척 용기에 담구었다.

5. 모든 칩이 WB1 에 담기게 되면 세척랙을 용기에서 1분 동안 뺏다 넣었다 하는 방법으로 씻어 주고 PB1이 들어 있는 또 다른 세척 용기에 세척랙을 옮겨 1분 동안 이 과정을 반복해 주었다.

6. 다시 PB1 세척 용기에 담근 후 세척랙을 용기에서 1분 동안 뺏다 넣었다 하는 방법으로 씻어 주고 PB1 이 들어 있는 또 다른 세척 용기에 세척랙을 옮겨 1분 동안 이 과정을 반복해 주었다.

7. 세척이 끝나고 나면 비드 칩 정렬 기구에 후면 프레임을 올리고 바코드 방향에 맞추어 칩을 한 장씩 올린 후 하얀색 부분과 분리한 투명한 부분의 스페이스를 정렬기구의 윗부분과 아랫부분에 맞춰 끼웠다.

8. 스페이스를 올린 후 칩의 위쪽 부분(바코드가 없는 부분)에 정렬 바(bar)를 올리고 유리판의 끝이 바에 닿게 끔 유리판을 덮은 후 클립을 끼웠다.

(챔버 어셈블리를 통한-흐름 완성)

9. 클립을 끼우고 나면 정렬 바를 제거하고 챔버 어셈블리-흐름 양끝의 스페이스 부분을 가위로 잘라주었다.

<3일째 - X염색 비드칩 >

○ 재료 및 기구

1. 시약

초자 및 시약명	준비량	시약 보관 온도
RA1	10ml/8 비드칩	냉동
XC1	2튜브 /8 비드칩	냉동
XC2	2튜브 /8 비드칩	냉동
TEM	2튜브 /8 비드칩	냉동
XC3	2튜브 /8 비드칩	실온
LTM	2튜브 /8 비드칩	냉동
ATM	2튜브 /8 비드칩	냉동
PB1	310ml/1-8비드칩	실온
XC4	310ml/1-8비드칩	냉동
95% 포름아미드/1mM EDTA	10ml/8 비드칩
EtOH

2. 기구

- 물 순환기(Water circulator)

- 챔버랙(Chamber Rack)

- 세척 용기 2개, 염색랙, 튜브랙

○ 실험방법

1. 챔버랙의 온도가 44℃가 되면 챔버 어셈블리를 통한-흐름 챔버랙에 끼웠다.

2. 각 칩에 150ul의 RA1을 넣고 30초 동안 반응시킨다. 이 과정을 5번 더 반복하였다.

3. 450ul의 XC1을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

4. 450ul의 XC2을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

5. 200ul의 TEM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

6. 450ul의 95% 포름아미드/1mM EDTA 을 각 칩에 넣고 1분 동안 반응시킨 후 한번 더 넣어주었다.

7. 5분 동안 반응시켰다.

8. LTM 튜브의 라벨에 적혀 있는 온도를 확인하고 그 온도대로 챔버랙의 온도를 바꾸어 주었다.

9. 450ul의 XC3을 각 칩에 넣고 1분 동안 반응시킨 후 다시 한번 넣어준 후 8번의 온도에 도달할 때까지 기다렸다.

10. 250ul의 LTM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

11. 450ul 의 XC3를 넣고 1분 후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시켰다.

12. 250ul의 ATM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

13. 450ul 의 XC3를 넣고 1분 후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시켰다.

14. 250ul의 LTM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

15. 450ul 의 XC3를 넣고 1분 후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시켰다.

16. 250ul의 ATM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

17. 450ul 의 XC3를 넣고 1분 후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시켰다.

18. 250ul의 LTM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시켰다.

19. 450ul 의 XC3를 넣고 1분후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시켰다.

20. 이 과정이 끝나면 즉시 챔버를 통한-흐름(Flow-through chamber)에서 챔버랙을 분리하고 실온의 실험 테이블로 옮긴 후 평평하게 꺼내어 놓았다.

21. 310 ml 의 PB1을 세척용기에 넣고 염색용 랙을 용기 안에 담가 놓았다.

22. 기구를 이용하여 챔버 랙의 클립을 벗기고 유리 블록을 들어서 제거한 후에 칩의 비드 부분이 건들리지 않게 양끝에 붙어 있는 스페이스를 제거하였다.

23. 칩에 붙였던 부착물을 모두 제거 하고 나면 PB1에 담겨있는 염색용 랙에 꽃아 PB1에 담가두었다. 같은 방법으로 모든 칩을 처리하였다.

24. 천천히 염색용 랙을 10번 정도 위 아래로 움직여서 칩을 담금질한 후 5분 동안 담가두었다.

25. 다른 세척용 용기에 XC4 310ml을 채운 후 24번과 같은 방법으로 10회 동안 담금질한 후 5분 동안 담가두었다.

26. 5분 후 세척용 용기에서 염색용 랙을 꺼낸 후 튜브랙에 다음 그림과 같은 방법으로 올려놓았다.

27. 집게를 이용하여 칩을 랙에서 조심스럽게 꺼내어 튜브랙 위에 올려놓았다.

28. 칩을 올려놓은 튜브랙을 조심스럽게 진공 건조기에 넣고 508mmHG (0.68 bar)의 진공 상태로 55-55분 동안 말려주었다.

29. 칩이 건조된 것이 확인되면 에탄올에 적신 킴와이프를 이용하여 칩의 가장자리 부분을 잘 닫아 주었다. 이때 비드 부분은 건드리지 않게 주의하였다.

30. 비드 칩은 실험 완료 후 72시간 이내에 스캐너를 이용하여 이미지화를 시키도록 하였다.

결과

돼지 1000두에 대하여 SNP 60K chip 분석을 통해 돼지의 실산자수에 대하여 예측 가능한 SNP 5개를 선발하였으며, 이들에 대한 정보는 [표 8]에서 보는 바와 같다. 실산자수 연관되어진 SNP의 유전자형별 평균값은 [표 9]와 같다. 앞으로 이러한 유전자형 분석은 돼지의 실산자수를 조기예측할 수 있는 DNA marker로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

표 8은 돼지의 실산자수 조기예측 가능한 SNP 마커의 염기서열 정보에 대한 것이고, 표 9는 돼지의 유전자형별 실산자수의 평균 및 표준오차를 나타낸다. ( ) 개체수를 나타낸다.

번호	단일염기다형 이름	염색체	염기서열변이영역	실산자수 많은 유전자형
1	M1GA0020415	15	TGTTCCGTAAATAATAGAGGAAGAGCAAGTGGCTTTACTTACCTAGGTGATCCGGAGAGG[A/G]GTCMCAGGAGCCAACCACTTTGGGATGATATGAGTTGCAAAATGTAAATGTTCTGCTGTT(서열번호 1)	A
2	ALGA0086940	15	CATAAAAAGTAAAAATTGAGGTCAGGGAGGTAGCTCACACTTAGAATAATTTCAGGGAAC[A/G]GCCCAACAAGTCTAAAACATTATACATGACTTCTGTCCAACTTTATGTGCTCCAGGACAT(서열번호 2)	A
3	ASGA0092725	12	TGTACACAGTTTTTCCTAGTCTCTGCCCTGCTTTCTGCAAGGTAAGCGTCAGAAAAGCAA[A/G]ACCTTATCTCAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(서열번호 3)	A
4	ALGA0086908	15	TGCTCTCTGCTCAGCCAGCTCTCTCTAAGGATGGTAAGTTCATAACCTCCATTAAAAGCT[A/G]TAGCATTTGTGTACTAGCTGAGGTAGTGCCCGGTGCTATAACATAGTAGAAATAAAAATT(서열번호 4)	G
5	ALGA0098882	18	TTTCAGATCTTCCGTGAAATCCAGCAAAGAAAGCTCCAGTTAACGCTGGGAGGATTGCAG[A/G]TGAGAAGAAACACGACAGTGTTACAGTTGCAGTTAGAACGAAGGTTCTCCGCTGACTGAA(서열번호 5)	G

번호	실산자수
1	ASGA0092725	AA(598)	GA(206)	GG(16)
1	Mean ± SE	12.17±0.127	11.94±0.238	10.69±0.850
2	ASGA0087349	AA(17)	AG(205)	GG(596)
2	Mean ± SE	10.82±0.810	11.93±0.240	12.19±0.126
3	ALGA0054690	AA(113)	AG(419)	GG(282)
3	Mean ± SE	12.54±0.290	11.98±0.158	12.06±0.192
4	ALGA0086081	N/A	AG(20)	GG(798)
4	Mean ± SE	-	12.2±0.702)	12.09±0.11

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> SNP markers for prediction of pigs alive litter size and methods for prediction of pigs alive litter size using the same <130> NPF30117 <160> 5 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 tgttccgtaa ataatagagg aagagcaagt ggctttactt acctaggtga tccggagagg 60 agtcmcagga gccaaccact ttgggatgat atgagttgca aaatgtaaat gttctgctgt 120 t 121 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 2 cataaaaagt aaaaattgag gtcagggagg tagctcacac ttagaataat ttcagggaac 60 agcccaacaa gtctaaaaca ttatacatga cttctgtcca actttatgtg ctccaggaca 120 t 121 <210> 3 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 3 tgtacacagt ttttcctagt ctctgccctg ctttctgcaa ggtaagcgtc agaaaagcaa 60 aaccttatct cagnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 n 121 <210> 4 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 4 tgctctctgc tcagccagct ctctctaagg atggtaagtt cataacctcc attaaaagct 60 gtagcatttg tgtactagct gaggtagtgc ccggtgctat aacatagtag aaataaaaat 120 t 121 <210> 5 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 5 tttcagatct tccgtgaaat ccagcaaaga aagctccagt taacgctggg aggattgcag 60 gtgagaagaa acacgacagt gttacagttg cagttagaac gaaggttctc cgctgactga 120 a 121

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열의 61번째 염기가 A 또는 G인, 상기 서열번호 1의 염기서열의 61번째 염기를 포함하는 5 내지 200 염기의 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 61번째 염기가 A 또는 G인, 상기 서열번호 2의 염기서열의 61번째 염기를 포함하는 5 내지 200 염기의 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 61번째 염기가 A 또는 G인, 상기 서열번호 3의 염기서열의 61번째 염기를 포함하는 5 내지 200 염기의 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 61번째 염기가 A 또는 G인, 상기 서열번호 4의 염기서열의 61번째 염기를 포함하는 5 내지 200 염기의 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 61번째 염기가 A 또는 G인, 상기 서열번호 5의 염기서열의 61번째 염기를 포함하는 5 내지 200 염기의 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 실산자수 예측용 조성물.
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제1항에 기재된 조성물을 포함하는 돼지의 실산자수 예측용 마이크로어레이.
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제1항에 기재된 조성물을 포함하는 돼지의 실산자수 예측용 키트.
i) 피검체로부터 핵산을 추출하는 단계;
ii) 제1항에 기재된 조성물을 이용하여, 핵산을 증폭시키는 단계; 및
iii) SNP 부위의 염기서열을 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지의 실산자수 예측 방법.
제13항에 있어서,
상기 서열번호 1의 SNP 부위의 유전자형이 A인 경우에 다산 개체라고 예측하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 서열번호 2의 SNP 부위의 유전자형이 A인 경우에 다산 개체라고 예측하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 서열번호 3의 SNP 부위의 유전자형이 A인 경우에 다산 개체라고 예측하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 서열번호 4의 SNP 부위의 유전자형이 G인 경우에 다산 개체라고 예측하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 서열번호 5의 SNP 부위의 유전자형이 G인 경우에 다산 개체라고 예측하는 방법.