KR102234213B1

KR102234213B1 - 단일염기다형성 마커를 이용한 동물 개체 식별 방법

Info

Publication number: KR102234213B1
Application number: KR1020190063378A
Authority: KR
Inventors: 배진식; 라시미 프라바 모한티; 김병주; 이민섭
Original assignee: 이원다이애그노믹스(주)
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2021-03-31
Also published as: KR20200102895A; CN111607650A

Abstract

본 발명은 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용한 동물 개체 식별 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단일염기다형성 마커를 이용한 개 개체 식별 방법에 관한 것이다. 본 발명이 제공하는 SNP 마커 및 이들의 조합을 이용하면 검출 대상 개체(개)를 다른 개체(개)로부터 정확하게 구분하여 식별할 수 있어, 개의 개체 식별 및 이력 관리에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

단일염기다형성 마커를 이용한 동물 개체 식별 방법{Animal Identification Method using SNP marker}

본 발명은 단일염기다형성 마커를 이용한 동물 개체 식별 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단일염기다형성 마커를 이용한 개 개체 식별 방법에 관한 것이다.

산업과 경제의 급속한 성장으로 인해 크고 작은 사회적/심리적 문제가 야기되었다. 이러한 스트레스, 불안 및 우울증을 완화하기 위해 애완동물을 사육하는 가정이 증가하며, 애완동물에 대한 보험 등 애완 동물 산업이 빠르게 발전하였다. 그러나 애완동물 산업의 성장은 사회적, 윤리적, 산업적인 문제를 야기하였다.

그 중에서 애완동물의 분실 및 신원 확인은 큰 문제로 인식되고 있다. 소유주의 의사와는 달리 사고로 인해 애완동물을 분실하는 경우, 외모 등 생김새를 통해서 애완동물의 신원을 확인하는 것은 한계가 있다. 그리고 거주지를 잃고 방황하게 되는 애완동물들은 그들의 공격성과 배설물, 일반 쓰레기를 헤집어 놓는 문제 등을 일으켜 사회적으로 문제가 되고 있다. 더욱이 미국의 경우 야외 동물을 포함하여 전국의 650만 마리의 애완동물이 동물보호센터에 집결되고 있으며, 그 중 매년 150만 마리가 안락사를 당하고 있다. 더불어 영국에서도 2011년 애완동물 보험 사기가 4배 증가하여 사회적 문제가 되고 있다.

근본적인 문제는 애완동물 소유에 대한 공식 기록이 부족하다는 것이다.

중국에서는 정부 차원에서 애완동물에 대해서 어떠한 신원정보를 데이터베이스화 할 것인지에 대해 검토 중이며, 어떠한 종류의 정보를 신원정보로 사용하는지에 상관없이 애완동물들에게는 일련번호가 부여되어 위와 같은 애완동물 문제를 해결하기 위한 노력이 있을 것이다.

현재 개발된 방법 중 하나는 피하 마이크로칩 주사(microchip injection)이며 칩에 내장된 일련번호를 통해서 애완동물의 신원을 확인하는 방법이다. 그러나 칩 리더의 사용 및 구매가 용이하기 때문에 이 방법은 범죄자의 대상이 될 수 있다는 우려가 있다. 칩 내의 소유주에 대한 정보는 사기에 쉽게 사용될 수 있으며, 마이크로 칩을 다른 애완동물에게 이식하는 것은 보험 회사가 걱정하는 애완동물 보험 사기의 가능한 다른 경로가 될 수 있다. 뿐만 아니라, 애완동물의 분실이 자의적인 경우 칩은 주인에 의해 애완동물로부터 제거되어, 애완동물로부터 야기되는 여러 사회적인 문제로부터 책임을 지우는데 한계가 있을 것이다.

이러한 마이크로칩의 한계를 최소화하면서, 애완동물을 식별하기 위한 또 다른 방법은 유전적 마커 기반 방법이다. 이 방법은 개체의 유전정보를 사용함으로 해서, 개체와 등록된 기록만 있다면 전생애 동안에 애완동물을 식별하여 주인을 알 수 있다. 유전적 마커를 기반으로 하는 방법은 유전적 다형성, 이형 접합성 및 계통 발생을 방지하기 위해 다양한 유전 표지자가 사용되었다. 상기 마커에는 상염색체 미소부수체 마커(autosomal microsatellites marker), Y 염색체 마커(Y chromosome markers), 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA (mtDNA))와 최근에는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms (SNPs))이 포함된다. 이러한 마커들은 개의 인구와 집단의 변화율을 구별하는데 사용되었다.

현재 다형성 소위성(microsatellites)이 이러한 목적을 위한 선택의 지표이지만, 실용적으로 분석될 수 있는 다형성 소위성 마커를 독립적으로 분리하는 횟수는 제한적이다. 따라서 다형성 소위성 데이터만으로 어떤 종류의 관계를 구별하는 것이 어려울 수 있다.

상기 마커 중 SNP는 게놈에 풍부하고 다형성 소위성 마커와 mtDNA보다 돌연변이율이 낮으며, 일단 발견되면 효율적으로 분석할 수 있다. SNP가 포유류 게놈에서 자주 발생하고 신속하고 대규모이며 경제적인 유전자형 분석(genotyping)에 유용하다는 사실 외에도 생태학, 보전, 인구 및 진화 연구를 위한 효율적인 도구로 사용된다.

많은 고 처리량(high-throughput) SNP 유전자형 분석이 현재 이러한 용도로 사용 가능하다. 그 중에서도 iPLEX-pro 시약과 함께 MassARRAY 시스템은 멀티플렉싱(multiplexing) 및 최소한의 분석 설정 비용을 위한 간단한 플랫폼을 제공한다. 그것은 다른 질량을 가진 대립 유전자 특이적 생성물을 생성하기 위한 단일 확장 프라이머와 다중화된 PCR 반응, 모든 SNP 및 작은 시약 양에 대한 보편적 반응 조건을 따른 단일 종결 믹스(single termination mix)와 함께 균질 반응 형식(homogeneous reaction format)을 이용한다.

이 기술은 유전자좌 특이적(locus-specific) PCR 반응을 사용하고, 유전자좌 특이적인 프라이머 연장 반응을 일으킨다. 여기서 oligonucleotide primer는 genotyped 된 다형성 부위의 바로 상류(upstream)에 결합(annealing)된다. iPLEX-pro 분석에서 primer와 증폭된 표적 DNA는 대량 변형된 디디옥시뉴클레오티드 터미네이터(dideoxynucleotide terminator)와 함께 배양된다. 프라이머 확장은 변이체 부위의 서열에 따라 수행되며, 단일 상보적인 질량-변형된 염기이다. MALDI-TOF 질량 분석법(MALDI-TOF mass spectrometry)을 사용하여 확장된 프라이머의 질량을 자동으로 계산한다. 프라이머의 질량은 다형성 부위에 존재하는 서열 및 대립 유전자를 나타낸다. MassARRAY 소프트웨어 TyperAnalyzer는 관찰된 프라이머의 질량을 각 반응에 대한 유전자형으로 자동 번역한다.

이외에도 TaqMan SNP Genotyping 방법의 OpenArray 시스템도 많이 이용된다.

이에, 본 발명자는 애완동물 중 특정 개를 다른 개들로부터 정확하게 구분하여 식별할 수 있는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, 이하 'SNP'라 함) 마커를 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 개체를 식별하여 정확하게 구분할 수 있는 SNP 마커들 및 이의 조합의 유용성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 구성된 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 제공하는 것이다:

(a) 개 게놈 데이터 세트에서 혈연 관계를 가지는 개체 및 코호트 크기가 10미만인 품종의 개체의 데이터를 삭제하여 개체 식별용 게놈 데이터 세트를 제조하는 단계;

(b) 상기 개체 식별용 게놈 데이터 세트에서 이대립인자(biallelic)이며, 개 품종 별 대립 유전자 빈도가 40~60%이고, minor allele frequency의 표준편차가 0.25 미만인 SNP를 선별하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 선별된 SNP에서 인접한 SNP의 거리가 1Mbp 이하인 SNP 또는 5' 방향 및 3' 방향으로 각각 90bp 이내에 반복 서열을 가지는 SNP를 제외시키는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 선별된 SNP를 포함하는 200bp 이내에 변이가 없는 SNP를 선별하는 단계; 및

(e) 상기 선별된 SNP를 11개 내지 25개로 조합하여 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 구성하는 단계.

본 발명의 다른 목적은 상기 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 개 개체 식별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 개 개체 식별용 조성물을 포함하는 개 개체 식별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커 세트를 포함하는 개 개체 식별을 위한 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 개체를 식별하고자 하는 개로부터 핵산을 분리하는 단계; 및 (b) 서열번호 1 내지 25로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오티드에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인하는 단계를 포함하는 개 개체 식별 방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 구성된 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 제공한다:

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 개 개체 식별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 개 개체 식별용 조성물을 포함하는 개 개체 식별용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 SNP 마커 세트를 포함하는 개 개체 식별을 위한 검출방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 개체를 식별하고자 하는 개로부터 핵산을 분리하는 단계; 및 (b) 서열번호 1 내지 25로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인하는 단계를 포함하는 개 개체 식별 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 구성된 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 제공한다:

본 발명은 개 개체를 구분하여 식별할 수 있는 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 제공하며, 상기 개 개체 식별용 SNP 마커 세트는 상기 (a) 내지 (e) 단계를 통해서 선별이 되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 (a) 단계에서는 현재까지 보고된 개 게놈 데이터 또는 향후 추가로 보고될 개 게놈 데이터 등 발명을 실시하는 시점에서 공개되어 있는 개 게놈 데이터를 수집한 후, 혈연 관계를 갖는 개체 및 품종별 코호트 크기가 10 미만인 품종의 개체의 게놈 데이터를 삭제하는 단계이다.

상기 (a) 단계를 통해 이후의 단계에서 동일 품종 내 개체간 또는 품종간 식별력이 낮은 SNP가 선별이 되는 것을 1차적으로 방지할 수 있다.

상기 (a) 단계에서의 개 게놈 데이터는 공지된 데이터베이스를 통해서 입수할 수 있으며, 상기 공지된 데이터베이스의 비제한적인 예시로 NHGRI Dog genome project, DOGSD, Dog SNP CanFam 등을 들 수 있다.

본 발명의 상기 (a) 단계에서는 대립 유전자 빈도(Allele frequency)가 높은 SNP 마커를 우선 선별함으로써 마커 조합에 따른 genotype 경우의 수를 최대화할 수 있는 마커를 선별하는 단계이다.

상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 제조된 개 게놈 데이터로부터 SNP 마커를 1차적으로 선별하는 단계로서, 이대립인자(biallelic)이며, 개 품종 별 대립 유전자 빈도가 40~60%이고, 소수 대립 유전자 빈도(minor allele frequency)의 표준편차가 0.25 미만인 SNP를 선별하는 단계이다.

바람직하게는, 상기 (b) 단계는 50%에 가까운 대립 유전자 빈도를 나타내는 SNP를 선별함으로써 SNP 조합에 따른 경우의 수를 최대화할 수 있는 SNP를 선별하기 위한 단계이다. 바람직하게는 SNP가 이대립인자(biallelic)이며, 개 품종 별 대립 유전자 빈도가 40~60%이고, 품종별 빈도를 구하였을 때, 소수 대립 유전자 빈도(minor allele frequency)의 표준편차가 0.25 미만인 SNP를 선별한다.

상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 1차적으로 선별된 SNP 마커로부터 인접한 SNP와의 거리가 1Mbp 이하인 SNP 또는 선별된 SNP를 기준으로 5'-말단 및 3'-말단 방향으로 90bp 이내에 반복 서열을 갖는 SNP를 제외시키는 단계이다.

한 염색체에 위치하는 2개의 SNPs간 거리가 아주 멀다면, 감수분열 과정에서 교차(Crossover)가 빈번히 발생하는데 이때 재조합은 단일염기수준이 아니라 큰 블록의 단위로 일어나게 되며 이렇게 함께 유전되는 단위를 Haplotype이라 한다. 재조합의 일어남으로써 서로 다른 조합의 haplotype이 독립적으로 발생하게 되는데 이처럼 독립적으로 가능한 조합이 모두 발생하는 경우 두 SNPs는 linkage equilibrium(LE, 연관평형) 상태에 있다고 한다. 그러나 SNPs간의 거리가 매우 가깝다면 2개의 SNPs는 서로 연관되어 다음 세대에 같이 전달되게 되어, 이러한 SNP들은 개체 선별을 위한 마커로서 적합하지 않을 수 있다. 따라서, 상기 (c) 단계를 통해서 이러한 부적합한 마커가 선별되는 것을 배제할 수 있다.

또한, 특정 SNP 주변에 반복 서열이 존재할 경우 향후 플랭킹 시퀀스(flanking sequence)가 타겟 서열에 바인딩할 때 부정적인 영향이 있을 수 있다. 따라서, 상기 (c) 단계를 통해서 이와 같은 가능성이 존재하는 SNP가 선별되는 것을 배제할 수 있다.

상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 선별된 SNP 마커를 기준으로 200bp 이내에 변이가 없는 SNP 마커를 선별함으로써, 향후 플랭킹 시퀀스(flanking sequence)가 타겟 서열에 바인딩할 때 미칠 수 있는 부정적인 영향을 최소화할 수 있는 SNP 마커를 선별하는 단계이다.

한편, 본 발명에서 (b) 단계 내지 (d) 단계는 순서에 따라 또는 동시에 수행될 수 있으며, 순서에 따르는 경우 (b), (c), (d) 순서에 따라서 또는 순서를 변경하여 수행될 수도 있다. 본 발명에서의 SNP 마커의 선별은 하기 선정 기준 및 제외 기준에 따라 수행된 것일 수 있다.

<선정 기준>

이대립인자(biallelic) 일 것;

개 품종 별 대립 유전자 빈도가 40~60%일 것;

품종별 빈도의 minor allele frequency의 표준편차가 0.25 미만일 것;

SNP를 기준으로 200bp 이내에 변이가 없을 것;

<제외 기준>

두 개의 인접한 SNP의 거리가 1Mbp 이하인 경우;

5' 방향 및 3' 방향으로 각각 90bp 이내에 반복 서열을 가지는 경우.

상기 (e) 단계는 상기 (a) 내지 (d) 단계에서 선별된 SNP 마커들 중에서 개 개체 식별을 위한 최적의 마커 세트를 조합하는 단계이다.

본 발명의 상기 (e) 단계에서 마커 세트에 포함이 되는 SNP 마커의 개수는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 개 개체를 모두 구분하여 식별할 수 있는 경우의 수가 형성되도록 구성하는 것이 바람직하다. 이론적으로는, 상기 (b) 단계에서 이대립인자의 품종 별 대립 유전자 빈도가 50%에 근접한 SNP 마커를 선별했기 때문에 n개의 마커로 이루어진 세트로는 3ⁿ 개의 경우의 수 조합이 가능하다.

다만, 개 개체를 식별할 때 SNP 마커 이외에 개의 혈액형(개의 혈액형은 현재까지 13종이 알려져 있음), 품종, 외형상 특징, 체중, 성별 및 나이 등도 함께 고려가 될 수 있기 때문에, 이들 식별 요소들을 추가로 고려하여 개 개체 식별용 SNP 마커 세트에 포함되는 SNP 마커의 개수를 적절히 조절할 수 있다. 특히, 혈액형, 품종, 외형상 특징, 체중, 성별, 나이 등의 특징을 고려할 때, 유전적 차이에 의한 식별은 95%이상인 경우 개체 식별이 가능하다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 (a) 내지 (d) 단계를 통해서 선별된 마커들 중 11종 이상을 조합하여 마커 세트를 구성하였을 때 개 개체간 식별능이 95% 이상임을 확인하였고, 마커 23종 이상을 조합하여 마커 세트를 구성하였을 때에는 개체간 식별능이 100%에 가까운 것을 확인했다.

따라서, 바람직하게는 상기 (e) 단계에서 SNP 마커 세트에 포함되는 SNP 마커는 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상 또는 25개 이상일 수 있다.

마커 세트에 포함이 되는 SNP 마커의 개수가 증가될수록 개체 식별을 위한 경우의 수가 증가되어 그 정확도가 향상될 수 있으나, 일정한 개수를 초과할 때부터는 마커의 증가에 따른 정확도 향상에 한계가 있고 분석 비용 및 분석 시간이 점차 증거하여 경제적인 측면에서 바람직하지 않을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 (a) 내지 (d) 단계에서 선별된 마커들 중 25종을 선별하여 구성된 SNP 마커 세트가 100%의 개체 식별력을 나타내었기 때문에 본 발명의 상기 SNP 마커 세트에는 11종 내지 25종의 SNP 마커, 더 바람직하게는 13종 내지 25종의 SNP 마커, 가장 바람직하게는 25종의 SNP 마커가 포함이 될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “SNP, 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 동일종의 개체들 사이 또는 한 개체(individual)의 쌍염색체 사이에 다른 경우 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예:AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(A 또는 G)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단(population) 내에서, SNP는 소수 대립 유전자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 단일염기는 폴리뉴클레오티드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있으며, SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 “SNP 마커”는 “SNP”와 혼용되어 명명될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “마커(marker)”는 바이오 마커를 의미하며 본 발명에서는 특히 개 개체를 식별할 수 있는 표지로서의 의미를 갖는다.

본 발명은 또한 상기 (a) 내지 (e) 단계에 의하여 선별된 서열번호 1 내지 25로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드에서 11번째 염기를 포함하는 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 제공한다.

본 발명에서, 상기 SNP 마커 세트는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드의 11번째 염기를 포함하는 5개 이상의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드의 11번째 염기를 포함하는 5개 내지 100개의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 더 바람직하게는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드의 11번째 염기를 포함하는 10개 내지 100개의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

또는, 상기 SNP 마커 세트를 구성하는 각각의 SNP 마커는 하기 표 1에 기재된 SNP 마커이며, 이들 정보에 기재된 개 게놈 상의 위치 및 그 주변의 서열에 대해서는 당업자가 용이하게 개 게놈 데이터베이스를 통해서 이해될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드 각각의 11번째 염기 서열 조합을 통하여 특정 개체를 95% 이상 식별할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 상기 11종 이상이란, 예를 들어 11종, 12종, 13종, 14종, 15종, 16종, 17종, 18종, 19종, 20종, 21종, 22종, 23종, 24종 또는 25종일 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 22종 이상의 폴리뉴클레오티드 각각의 11번째 염기 서열 조합을 통하여 특정 개체를 약 100%로 식별할 수 있음을 확인하였고, 상기 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드 각각의 11번째 염기 서열 조합을 통하여 특정 개체를 100%로 식별할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 바람직하게는 상기 SNP 마커는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 22종 이상의 폴리뉴클레오티드의 11번째 염기를 포함하는 5개 내지 100개의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명에서 상기 22종 이상이란, 예를 들어 22종, 23종, 24종 또는 25종일 수 있다.

가장 바람직하게는 상기 SNP 마커는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드 각각의 11번째 염기를 포함하는 5개 내지 100개의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명은 상기 서열번호 1 내지 25의 각 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중가닥의 gDNA(genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 폴리뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열에서 SNP 위치의 염기도 본 발명의 SNP 마커가 될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, “실질적인 동일성”은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

본 발명에서, 용어 "대립유전자(allele)"는 한 쌍의 상동염색체(homologous chromosome)의 좌위(locus)에 서로 대립(짝)을 이루어 위치하는 염기 서열로서 서로 다른 대립유전자는 때때로 서로 다른 특성(형질)을 나타낼 수도 있다.

본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 “염기”와 동일한 의미로 사용되며, 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).

본 명세서에서, 용어 "(숫자)(A, T, G 또는 C)"는 어느 한 유전자 서열의 (숫자)번째 염기가 (A, T, G 또는 C)인 것을 의미하며, 예를 들면 "282C"는 282번째 염기가 C인 것을 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "(숫자)(A, T, G 또는 C)>(A, T, G 또는 C)"는 상동 염색체의 각 일배체형의 특정 대립유전자 서열에서 (숫자)번째 염기가 한쪽은 부등호 왼쪽의 (A, T, G 또는 C)이고 다른 한쪽은 부등호 오른쪽의 (A, T, G 또는 C)인 이형접합 유전적 변이를 의미하며, 예를 들면 "282C>T"는 상동 염색체의 각 일배체형의 특정 대립유전자 서열에서 282번째 염기가 한쪽은 C이고 다른 한쪽은 T인 이형접합 유전적 변이를 의미한다. 이때, 부등호는 이러한 유전적 변이의 발생 빈도 우열을 의미한다.

또한, 본 명세서에서 SNP를 나타내는 [X/Y]의 경우 염기 X가 염기 Y로 점돌연변이된 SNP임을 의미한다

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 25로 표시되는 각 폴리뉴클레오티드의 11번째 염기에서의 SNP 조합은 식별 대상 개체에서 모두 다르게 나타나 개체 식별용 SNP 마커로서의 유용성 및 재현성이 확인되었다.

본 발명은 또한 상기 개 개체 식별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 개 개체 식별용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “증폭”은 어떤 세포에서 특정한 형질발현을 활발히 하기 위하여 그 형질을 지배하는 유전자 또는 유전자군을 포함하는 염색체부분이 특이적으로 복제를 반복해서 그 수를 증가시키는 것을 말한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “SNP 마커를 검출할 수 있는 제제”는 상기 SNP 마커 조성물에 포함된 SNP 마커에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 SNP를 검출하여 증폭시킬 수 있는 제제를 의미한다.

이의 비제한적인 예로, 상기 제제는 상기 SNP 마커가 포함된 다형성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브(probe) 또는 상기 SNP 마커 부위를 특징적으로 검출하거나, SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출하여 증폭할 수 있는 프라이머(primer) 또는 프라이머 세트일 수 있다.

본 발명에서 상기 “프라이머”는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

또한 상기 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

이때, 상기 프라이머의 서열은 PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형하여 사용할 수 있다.

구체적인 예로, 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.

구체적인 예로, 상기 프라이머의 서열은 SNP 마커에 대한 특이성 및 결합력이 향상될 수 있도록 변형 가능하며, 동일한 SNP 마커에 대하여 서로 다른 염기 서열을 갖는 복수 개의 프라이머를 사용할 수 있다. 더욱 구체적인 예로, 각 프라이머의 길이는 이의 말단에 반복되는 염기를 첨가하여 조절할 수 있으며, 그 염기의 종류는 A, T, G, C 또는 이들의 조합일 수 있으나, 반복되는 서열을 갖는 한, 염기의 종류는 제한이 없다.

본 발명은 또한 상기 개 개체 식별용 조성물을 포함하는 개 개체 식별용 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 키트는 본 발명에서 제공하는 SNP 마커를 검출하여 확인함으로써 개 개체를 구분하여 식별할 수 있다.

구체적인 예로, 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 PCR 키트일 수 있다. 예를들어, PCR 키트는, 상기 SNP 마커에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 개체를 식별하고자 하는 개로부터 핵산을 분리하는 단계; 및 (b) 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 SNP 마커에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인하는 단계를 포함하는 개 개체 식별 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 핵산은 식별 대상이 되는 개로부터 수득된 시료로부터 분리될 수 있으며, 예를 들어 개의 혈액, 표피, 소변, 분변, 피모, 타액, 구강세포, 근육 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 시료로부터 분리될 수 있다. 상기 시료에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법 또는 상업적으로 판매되는DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 이에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명, 즉 SNP 부위의 염기를 확인하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 대립 유전자 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립 유전자 특이적 증폭 방법(allele-specific amplification), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법 (oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis), 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism), 대립형-특이 PCR, 매스 어레이법(mass array)에 의한 분석을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 질량의 변화를 측정하여 SNP 지노타이핑(genotyping) 분석을 할 수 있는 매스 어레이법에 의한 분석에 의해 수행될 수 있으며, 이 분석은 마커가 인지할 수 있는 유전자 변이 부분에서 서로 다른 단일 염기가 연장됨에 따라 질량의 변화가 생기면서 유전자 변이가 있는지 없는지를 판별하게 된다. 매스 어레이법에 의한 분석은 PCR로 SNP 사이트의 DNA 서열을 증폭 한 다음 단일 증폭 프라이머를 사용하여 PCR 산물을 증폭시켜 프라이머가 한베이스 만 확장되도록 한다. 확장된 생성물을 TOF (time of flight)로 분석하고, 염기의 분자량 차이에 따라 SNP를 분류하고, SNP 사이트의 대립 유전자 빈도를 계산하여 분석을 수행한다.

디데옥시뉴클레오티드는 분자량이 상이하며, 이는 질량분광계를 이용하는 단일-염기 신장 방법의 기본 원리가 되며, 신장된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 질량을 근거로 하여 SNP 지노타이핑 분석은 예를 들어 매트릭스-보조 레이저 흡수/이온화 비행 시간 질량 분광계 (MALDI-TOF, matrix assisted laser desorption ionization-time of flight)를 통해 수행될 수 있다.

MALDI-TOF 에 의한 미니서열분석 또는 마이크로서열분석은 통상의 기술자가 용이하게 이해하고, 이를 적절하게 변형하여 실시할 수 있으며, 예를 들어, MALDI-TOF 기법은 일부 변형하여 Sequenom사의 Mass Array Technology 또는 Agena bioscience사의 MassARRAY 시스템 등을 이용할 수 있다.

바람직하게는 상기 (b) 단계에서는 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 SNP 마커에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인함으로써 개 개체 식별할 수 있다. 상기 22종 이상이란, 예를 들어 22종, 23종, 24종 또는 25종일 수 있다.

가장 바람직하게는, 상기 (b) 단계에서는 서열번호 1 내지 25의 폴리뉴클레오티드 각각에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인함으로써 개 개체를 식별할 수 있다.

본 발명의 상기 개 개체 식별 방법은 상기 (b) 단계 이후에 개의 품종, 혈액형, 외형상 특징, 체중, 성별 및 나이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 정보를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 개의 품종은 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 비글(Beagle), 워터도그(Water dog), 말티즈(Maltese), 포메리안(Pomerian), 푸들(Poddle), 요크셔테리어(Yorkshireterrier), 시츄(Sichuan), 닥스훈트(Dachshund) 및 이들의 교잡종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에서의 상기 개 개체 식별 결과는 당업계에 공지된 통상의 리포트 수단, 형식 및/또는 방법에 의해서 의뢰인에게 전달될 수 있으며, 예를 들어, 식별 결과는 전화, 편지, 이메일, 웹페이지 공개 등의 수단에 의해서 검사결과를 전달할 수 있다.

검사 결과는 필요에 따라서 식별 정도에 대한 수치화를 제공하거나, 식별 결과만을 제공할 수 있으며, 검사 결과에 접속될 수 있는 URL 주소 또는 바코드 (2차원 바코드 포함)의 형태도 포함될 수 있다. 아울러, 검사결과에는 개에 대한 정보 뿐만 아니라, 견주에 대한 정보도 아울러 포함될 수 있다

본 발명이 제공하는 SNP 마커 및 이들의 조합을 이용하면 검출 대상 개체(개)를 다른 개체(개)로부터 정확하게 구분하여 식별할 수 있어, 개의 개체 식별 및 이력 관리에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 마커 세트를 이용하여 식별하는 과정에 대한 하나의 예를 워크 플로우(Work flow) 형식으로 나타낸 것이다.
도 2는 6 마리의 개 세포주를 포함한 18 마리의 개 샘플에서 본 발명에 따른 마커를 선별한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 샘플(18x2)의 유전자형 데이터(genotype data)를 나타낸 결과이다.
도 4는 25 개의 SNP 마커의 쌍으로 정렬(Pairwise-Alignment)에 대한 박스 플롯(box-plot) 결과이다.
도 5는 25 개의 SNP 마커 중에서 1개 내지 15개를 임의로 제거하여 조합을 하였을 때에 동일한 ID의 개를 식별할 수 있는 비율을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실험예

마커의 선별

개들의 게놈 정보는 2017년과 2018년에 발행된 NHGRI Dog Genome 프로젝트에서 다운로드 받았는데 2017년의 약 1355 개의 개 게놈 데이터와 2018년의 722 개의 개 게놈 데이터로 구성되었다. 약 127 개의 개 게놈 데이터를 iDOG (DOGSD)에서 다운로드 받았다. 참조 게놈은 CanFam 3.1.199에서 사용되었으며 개 품종 정보는 Dogbreedchart (http://www.dogbreedchart.com/)에서 수집되었다. 일반 명칭은 NHGRI Dog Genome 프로젝트와 Dogbreedchart 사이에서 추출되었다. 계통 별 정보는 계통 별 SNP를 사용하여 추정되었는데, 현재 품종 당 이용 가능한 표본 크기가 상대적으로 작기 때문에 전체 표식 선정 과정에 근친 교배 효과를 피할 수 있었다. 추후에 코호트 크기가 10 미만인 품종은 제거하여 ~ 66 품종만 남기었다. 결과적으로 품종 별 대립 유전자 빈도 (40 % ~ 60 %)와 표준 편차 (SD <0.25)에 근거하여 후보 마커를 선별하였다. 다른 선별 기준은 5'- 및 3 '말단 모두에서 100 뉴클레오타이드 근처의 말단에서 1-10bp 길이를 갖는 단 한 번의 반복을 허용하였다. 마커는 임의의 두 마커 사이의 거리를 기반으로 하여 1Mbps 이상으로 무작위로 선택하였다. 선택된 후보 마커에게서 플러스 및 마이너스 100bp 내에서 변이는 발견되지 않았다. 마지막으로, 이대립인자성(biallelic) 마커만 선택되었다. 모든 선별 단계 후에 총 25 개의 마커가 테스트를 위해 선택되었다.

본 발명에서 선정된 25종의 마커를 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표에서 [X/Y]는 염기 X가 염기 Y로 점돌연변이된 SNP임을 의미한다.

상기 각 SNP 마커의 구체적인 서열정보는 다음과 같다:

(서열번호 1) AGGTCTCACT[A/G]TCAGTTGGGA

(서열번호 2) GTTGTGGGAA[A/G]GCTCTTGTTT

(서열번호 3) CAACTGGCCC[A/T]TTGTGCAGAC

(서열번호 4) TAAGACACTT[C/T]TGTGTGTGAA

(서열번호 5) TGACGGGTTG[C/T]ACAAGGAAGC

(서열번호 6) GTTTTAACCA[C/T]CATCTTCAGG

(서열번호 7) CTTGTTAGCT[A/G]TCCTTATCAC

(서열번호 8) CCCCTCGCCC[A/G]GTACCCCAGG

(서열번호 9) CACAGTGCTC[C/T]TAAGATGCTG

(서열번호 10) TTAATAGCAA[C/T]CACACATACT

(서열번호 11) CTCTGCCACC[A/G]TTGGCCTGGA

(서열번호 12) GGGCCCTGAC[C/T]GCTCTAGTCC

(서열번호 13) GAGGATAGGG[A/G]TTATGCAAAT

(서열번호 14) CCACTTGCTC[A/G]GAGGCGGAAT

(서열번호 15) GATATTTGGG[G/T]TAGTGGAACA

(서열번호 16) GAAATGAGGA[C/T]GGTTTGAGAA

(서열번호 17) CATCAGAAAA[A/C]ACAAGTGAAG

(서열번호 18) TGGTCCCGCC[A/G]TCATCTATTT

(서열번호 19) AATGCTCAAC[A/G]GTAAAACCCA

(서열번호 20) GTCACTCTGT[G/T]AGCCTATCAA

(서열번호 21) TATTGTCACA[C/T]AGAGGTAGTG

(서열번호 22) AGATACATTC[C/T]ATTCACTCAG

(서열번호 23) AGGGAGTACA[A/G]AGTACCTTGG

(서열번호 24) CAGACATATC[C/T]TGGGTGAGAA

(서열번호 25) TGGATAAGAG[A/G]CTACAGGTAG

분석 디자인

30-plex iPLEX pro genotyping을 위한 정방향(forward), 역방향(reverse) 및 연장(extension) primer는 AgenaCx Assay Design Suite를 사용하여 디자인되었다. 고급 매개 변수에서, Amplicon PCR 프라이머 포텐셜(potential), Extend primer 포텐셜(potential) 및 거짓 프라이밍(False priming) 및 헤어핀/이량체 연장(Hairpin/dimer extension) 모두에 대한 다중 평가 포텐셜(Multiplex evaluation potential)은 0.9의 컷오프(cut-off)로 설정되었다. 최적의 용융 온도는 60 ℃로 선택되었고, 질량 범위는 3000-10,000Da로 선택되었으며, 분석물의 최소 질량 차이는 10Da 이 나도록 선택되었다. 실험 검증에서, 프라이머는 적용 범위(coverage) 및 콜-레이트(call-rate)에 기초하여 제거되었다. 마지막으로 높은 적용 범위와 낮은 콜-레이트를 기준으로 단일 25-plex 분석법을 최종 선택하였다.

개의 DNA 준비

면봉을 이용하여 개의 구강에서 샘플을 채취하고, 이로부터 QIAamp DNA Mini 키트를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 gDNA를 추출하였다. 2μl 당 적어도 10ng /웰이 필요하였다. 각각의 샘플에 대해 적어도 5 ng/μL의 희석 배수를 만들었다. 유효성 검정 실험을 위해 18 개의 샘플을 중복하여 사용하였으며 이들 중 표1에 나타낸 1~6번은 세포주이며, 7~12번은 개의 구강에서 채취한 샘플이다(표 2).

프라이머 풀링(Primer pooling), PCR, SAP 처리 & 연장

25-플렉스 PCR 증폭을 위해, 25개의 정방향 및 25개의 역방향 프라이머를 100μM의 비축물(stock)에서 모았다. 다중 PCR 증폭은 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 그 후, SAP 처리를 수행하였다. 25-플렉스 연장 반응의 경우, 처음 25 개의 연장 프라이머를 100μM의 비축물에서 모았다. iPLEX Pro 연장 칵테일 믹스는 RNAse free water 0.62μl, iPLEX buffer plus 0.2μl, iPLEX termination mix 0.2μl, iPLEX 프로-효소(iPLEX pro-enzyme) 0.04μl 및 1.88μl 연장 프라이머 믹스(extend primer mix)를 첨가하여 사전 준비하였다. 제조사 프로토콜에 따라 열 순환기 프로그래밍(thermal cycler programming)을 사용하였다.

데이터 분석

TyperAnalyzer 소프트웨어는 일단 칩이 활성화되면 유전자형 영역 보고서를 제공한다. 이는 또한 분석 요약 및 샘플 요약을 제공한다.

Mass Array

고 처리량(high-throughput)으로 SNP를 분석하기 위하여, Complete iPLEX pro genotyping mass array (10 X 96 CPM)분석을 수행하였다. 본 발명에 사용된 Complete iPLEX pro genotyping mass array는 한번에 mass array를 한 장에서 최대 2장까지 동시에 실험할 수 있으므로, 192개의 시료를 25 개의 SNP를 동시에 분석하는 것이 가능하다.

분석을 위해서 먼저 핵산 샘플을 준비하였다. 이를 위하여 시료로부터 DNA를 분리하여 원하는 부위를 multiplex PCR 로 증폭한 뒤, SAP 처리 후 기존에 남아있는 PCR 성분인 증폭반응에 이용될 수 있는 dNTP를 제거하고, extension primer 를 넣어주어 extension 반응을 유도하여 변이 위치에 1개의 base가 연장되도록 반응하여 시료를 준비하였다. 준비된 시료가 준비된 플레이트를 Mass Array 기기에 넣고, complete iPLEX pro genotyping massarray chip 을 기기에 넣어주고 제공된 기기 작동 절차에 따라 각 웰(well) 안에 포함된 extension 된 primer 의 mass를 측정하여 각 추출된 DNA 의 genotype을 판별하였다.

품질 관리

샘플 콜레이트(call rate)가 96 % -100 %인 경우 즉, 25 건의 콜(call) 중에서 하나의 노-콜(no-call)이 있을 경우 샘플은 품질 관리를 통과한 것으로 간주되었다. 샘플 콜레이트가 96 % 미만, 즉 2 번 이상의 노-콜(no-call) 샘플은 품질 제어에 실패한 것으로 간주되었다. 이 경우 샘플의 재처리가 필요하였다.

실시예 1: 후보 마커 선별

도 1과 같이, 후보 마커를 선별하였고 이때 도 2와 같이 다른 개의 샘플을 식별하였다. 6개의 세포주를 포함한 총 18개의 개 샘플을 모집하였다. 후보 마커는 6 마리의 개 세포주를 포함한 18 마리의 개 샘플에서 테스트되었고, 이 중 14 개의 샘플, 3 개의 샘플 및 1 개의 샘플은 각각 100 %, 97.22 % 및 89 %의 적용 범위를 가지는 것을 확인하였다(표 3).

마찬가지로 12 개의 표본, 5 개의 표본 및 1 개의 표본은 각각 100 %, 96 % 및 92 % 콜레이트를 가지는 것을 확인하였다(표 4).

유전자 일련번호 20의 분석의 경우 "37_18379068" 중 36개의 샘플(18개의 샘플은 중복)에서 4 번의 노-콜을 보여주었던 것처럼, 25개의 모든 assays는 0에서 한번의 노-콜로 양호한 것으로 판명되었다(표 3). 실험에 사용한 개 샘플의 특성 정보는 상기 표 2에 나타내었다. 약 12 개의 개 구강 내 면봉 샘플과 6 개의 개 세포주 샘플을 본 실험에 사용하였다. 더불어 36 샘플(18 샘플 중복)의 유전자형 데이터를 도 3에 나타내었다. 이때 노란색 상자는 노-콜을 나타낸다.

일련번호	샘플 이름	콜레이트(CallRate)
1	AG07455	100%
2	AG07455	100%
3	AG08158	100%
4	AG08158	100%
5	AG08249	100%
6	AG08249	100%
7	AG08455	96%
8	AG08455	100%
9	GM11473	100%
10	GM11473	100%
11	GM11474	100%
12	GM11474	100%
13	SW001_Maltese	100%
14	SW001_Maltese	100%
15	SW002_Pomerianmix	100%
16	SW002_Pomerianmix	100%
17	SW003_Browntoypoddle	100%
18	SW003_Browntoypoddle	100%
19	SW004_Yorkshireterrier	100%
20	SW004_Yorkshireterrier	96%
21	SW005_Sichuan	100%
22	SW005_Sichuan	100%
23	SW006_Pomerian	100%
24	SW006_Pomerian	96%
25	SW008_Sichuan	100%
26	SW008_Sichuan	100%
27	SW009_Mix	92%
28	SW009_Mix	100%
29	SW010_Dachshund	100%
30	SW010_Dachshund	100%
31	SW011_Toypoddle	100%
32	SW011_Toypoddle	100%
33	SW012_Mix	96%
34	SW012_Mix	100%
35	SW013_Mix	96%
36	SW013_Mix	100%

실시예 2: 재현성 검증

재현성을 확인하기 위해, 18개의 샘플을 중복하여 사용하였고, 2개의 상이한 실험 플레이트를 상이한 시간에 제조하였다. 샘플의 콜레이트를 표 5에 나타내었다. 그 결과 표 5와 같이, 본 발명에 따른 마커는 높은 재현성을 보여주는 것을 확인하였다.

일련 번호	샘플이름	품종	콜 레이트(%)
일련 번호	샘플이름	품종	1st	2nd	3rd	4th	Mean
1	AG07455	비글(Beagle)	100	100	100	100	100
2	AG08158	비글(Beagle)	100	100	100	100	100
3	AG08249	비글(Beagle)	100	100	100	100	100
4	AG08455	비글(Beagle)	96	100	100	100	99
5	GM11473	포르투갈 워터 도그(Portuguese Water dog)	100	100	100	100	100
6	GM11474	포르투갈 워터 도그(Portuguese Water dog)	100	100	100	100	100
7	SW001	말티즈(Maltese)	100	100	100	100	100
8	SW002	포메리안 믹스(Pomerian mix)	100	100	100	100	100
9	SW003	갈색 토이 푸들(Brown toy poddle)	100	100	100	100	100
10	SW004	요크셔 테리어(Yorkshire terrier)	100	96	100	100	99
11	SW005	시츄(Sichuan)	100	100	100	100	100
12	SW006	포메라니안(Pomerian)	100	96	100	100	99
13	SW008	시츄(Sichuan)	100	100	100	100	100
14	SW009	믹스(Mix)	92	100	100	88	95
15	SW010	닥스훈트(Dachshund)	100	100	100	100	100
16	SW011	토이 푸들(Toy poddle)	100	100	100	100	100
17	SW012	믹스(Mix)	96	100	100	100	99
18	SW013	믹스(Mix)	96	100	96	100	98
Mean			98.9	99.6	99.8	99.3	99.2

실시예 3: 쌍으로 정렬(Pairwise-Alignment)

가장 좋은 매치(match)를 찾기 위해, 25 개의 마커들 사이에서 쌍으로 정렬(pairwise alignment)을 수행하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. (DUP:중복(Duplicates), PO: 친자(Parent-Offspring), FS:완전한 형제자매(Full-Sibling), 2nd:2번째 친족관계(2nd Kinship)).

도 4의 박스-플롯(box-plot)은 ~ 97.16 % 인 쌍둥이(twins) 또는 반복 샘플 사이의 동일성을 나타낸다. 패밀리 내 동일성(identity)은 ~ 100 %이다. 더불어 하기 수학식 1을 사용하여 쌍으로 정렬을 계산하였다(G: Genotype, i:i차 마커, n:총 마커 사이즈).

[수학식 1]

실시예 4: SNP 마커의 조합 및 노콜의 영향

무작위 선택 마커를 연속적으로 제거하여 얻은 동일한 개들의 백분율을 도 5에 나타내었다. 이는 실험적 오류(no-call)가 2k 개의 분류 능력에 미치는 영향을 보여준다.

도 5의 결과를 참고할 때, 상기 본원발명에서 선별된 25종의 마커들 중에서 선택된 11종 이상의 마커 조합을 통하여 특정 개체를 96% 이상 식별할 수 있어 그 유용성을 확인할 수 있었다. 특히, 25종의 마커들 중에서 선택된 22종 이상의 마커 조합을 이용할 경우 거의 100%에 가까운 개체 식별률(identification(%))을 얻을 수 있었다.

본 발명이 제공하는 SNP 마커 및 이들의 조합을 이용하면 검출 대상 개체(개)를 다른 개체(개)로부터 정확하게 구분하여 식별할 수 있어, 개의 개체 식별 및 이력 관리에 매우 유용하게 활용될 수 있어 관련 산업분야에서의 이용가능성이 매우 높다.

<110> EONEDIAGNOMICS CO., LTD <120> Animal Identification Method using SNP marker <130> NP19-0024P <150> KR 1020190021454 <151> 2019-02-22 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs9003200 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 1 aggtctcact ntcagttggg a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs24505456 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 2 gttgtgggaa ngctcttgtt t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs24453667 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or T <400> 3 caactggccc nttgtgcaga c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs22165472 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 4 taagacactt ntgtgtgtga a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs22185491 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 5 tgacgggttg nacaaggaag c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs24729939 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 6 gttttaacca ncatcttcag g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs22310159 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 7 cttgttagct ntccttatca c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs22271681 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 8 cccctcgccc ngtaccccag g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs22372131 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 9 cacagtgctc ntaagatgct g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs22582704 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 10 ttaatagcaa ncacacatac t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs22548316 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 11 ctctgccacc nttggcctgg a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs22979359 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 12 gggccctgac ngctctagtc c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23039720 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 13 gaggataggg nttatgcaaa t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs9222833 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 14 ccacttgctc ngaggcggaa t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs8605818 <220> <221> allele <222> (11) <223> G or T <400> 15 gatatttggg ntagtggaac a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23263269 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 16 gaaatgagga nggtttgaga a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23289625 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or C <400> 17 catcagaaaa nacaagtgaa g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs9161359 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 18 tggtcccgcc ntcatctatt t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23486614 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 19 aatgctcaac ngtaaaaccc a 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23679340 <220> <221> allele <222> (11) <223> G or T <400> 20 gtcactctgt nagcctatca a 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23705227 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 21 tattgtcaca nagaggtagt g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23917433 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 22 agatacattc nattcactca g 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs23967349 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 23 agggagtaca nagtaccttg g 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs8912435 <220> <221> allele <222> (11) <223> C or T <400> 24 cagacatatc ntgggtgaga a 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCBI dbSNP rs24026956 <220> <221> allele <222> (11) <223> A or G <400> 25 tggataagag nctacaggta g 21

Claims

서열번호 1 내지 25로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 폴리뉴클레오티드에서 11번째 염기를 포함하는 5개 이상의 연속적인 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 개 개체 식별용 SNP 마커 세트.
삭제
하기 표에 기재된 SNP를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 개 개체 식별용 SNP 마커 세트:
제1항 또는 제3항의 개 개체 식별용 SNP 마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 개 개체 식별용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 상기 SNP 마커에 특이적으로 결합하거나 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭가능하도록 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 개 개체 식별용 조성물.
제4항의 조성물을 포함하는 개 개체 식별용 키트.
(a) 개체를 식별하고자 하는 개로부터 핵산을 분리하는 단계; 및
(b) 서열번호 1 내지 25로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 11종 이상의 SNP 마커에서 11번째 염기 서열을 상기 분리된 핵산에서 확인하는 단계를 포함하는 개 개체 식별 방법.
제7항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 핵산은 개의 혈액, 표피, 소변, 분변, 피모, 타액, 구강세포, 근육 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 분리하는 것을 특징으로 하는 개 개체 식별 방법.
제7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드에서 11번째 염기 서열을 결정하는 방법은 형광 인 시투 혼성화(FISH), DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA), RNase 보호 분석, 닷트 블롯 분석, 변성 구배젤 전기영동(DGGE), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질을 이용하는 방법, 대립 유전자 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립 유전자 특이적 증폭 방법(allele-specific amplification), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법 (oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis), 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism), 대립형-특이 PCR법 및 메스 어레이법 (mass array) 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 개 개체 식별 방법.
제7항에 있어서, 상기 (b) 단계 이후에 개의 품종, 혈액형, 외형상 특징, 체중, 성별 및 나이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 정보를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 개 개체 식별 방법.
제7항에 있어서, 상기 개의 품종은 비글(Beagle), 워터도그(Water dog), 말티즈(Maltese), 포메리안(Pomerian), 푸들(Poddle), 요크셔테리어(Yorkshireterrier), 시츄(Sichuan), 닥스훈트(Dachshund) 및 이들의 교잡종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 개 개체 식별 방법.