KR20160000975A - 한우 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 한우를 판별하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 I, 서열번호 4 내지 서열번호 6의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 II, 서열번호 7 내지 서열번호 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 III, 서열번호 10 내지 서열번호 12의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IV, 서열번호 13 내지 서열번호 15의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 V, 서열번호 16 내지 서열번호 18의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VI, 서열번호 19 내지 서열번호 21의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VII, 서열번호 22 내지 서열번호 24의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VIII, 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IX 및 서열번호 27 내지 서열번호 29의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 X로 이루어진 군으로부터 선택되는 한우 판별용 프라이머 세트 및 상기 프라미머 세트를 이용하여 한우와 수입우를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 단일염기다형성(SNP) 부위 에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 중합연쇄반응에 얻어진 산물의 사이즈를 비교하여, 한우와 수입우를 판별할 수 있다. 따라서, 종래 염기서열 분석에 의해 한우와 수입우를 판별하는 방법에 비해 간단하고 경제적인 방법으로 다수의 시료를 분석할 수 있어, 경제적이다.
본 발명에 의하면 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 단일염기다형성(SNP) 부위 에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 중합연쇄반응에 얻어진 산물의 사이즈를 비교하여, 한우와 수입우를 판별할 수 있다. 따라서, 종래 염기서열 분석에 의해 한우와 수입우를 판별하는 방법에 비해 간단하고 경제적인 방법으로 다수의 시료를 분석할 수 있어, 경제적이다.
Description
본 발명은 소의 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 단일염기다형성(SNP) 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 복합 프라이머 세트 그리고 이를 이용하여 한우를 판별하는 방법에 관한 것이다.
한반도 토종소인 한우는 기원전 2000년 전부터 한반도에서 사육되어 왔으며 현재까지도 그 종의 특징이 잘 보전되어 왔다. 이러한 이유로 현재 한우계통은 그 가치를 매우 높게 평가 받고 있으며 다른 종과 혼합되지 않고 혈통이 순수하게 유지되고 있다(Kim and Lee, 2000). 2011년, 약 300만 마리의 소가 한국에서 사육되었으며, 연간 720,000마리의 한우와 131,000 마리의 국내사육 홀스타인종을 포함하여 약 852,000마리가 도축되고 있다. 이를 통해 42.8%의 국내 유통량만을 충족하고 있으며 호수, 미국, 뉴질랜드, 멕시코 그리고 캐나다에서 부족한 양의 소고기를 수입하고 있는 상황이다(Korea Meat Tade Association, 2011; Cheong et al., 2013).
국내 유통되고 있는 수입우의 역사를 살펴보면, 2001년부터 외국산 소의 수입이 시작되었으며 그 결과로 많은 양의 저렴한 소고기가 공급되었다. 대부분 미국과 호주에서 수입이 되었는데 미국 수입우는 이후 2003년 12월 소고기 섭취로 인해 발생한 인간 광우병(Bovine spongiform encephalopathy, BSE)이 확인되면서 수입이 중단되었다. 이로 인해 호주산 소고기가 수입우고기의 대부분을 차지하게 되었는데 호주에서는 광우병의 원인으로 생각되는 육골분사료(meat and bone meal)를 사용하지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나 2008년 8월 한국과 미국정부가 미국산 소의 수입재개에 합의하게 되면서 미국산 소의 수입이 재개되었다(Cheong et al., 2013).
이러한 상황에서 최근 소고기의 원산지를 속이는 문제가 빈번하게 발생하고 있다. 한우의 가격이 매우 높고 수입우의 가격은 상대적으로 저렴하기 때문에 일부 부도덕한 업체에서 수입 소고기를 한우로 표기하여 판매하고 있으며 인간 광우병 감염의 우려 때문에 저렴한 수입우 대신에 고가의 한우를 찾는 소비자들로부터 부당한 이익을 취하고 있다(Cheong et al., 2013).
이러한 문제로 인해 국내 유통되고 있는 소고기 가운데 수입우와 한우를 구별하기 위한 분석시스템의 개발이 요구되고 있다. 호주와 미국, 뉴질랜드 그리고 캐나다에서 사육되고 있는 소의 계통은 30종 이상인데 대부분의 소가 교잡에 의해 생산되고 있다. 이와는 달리 한우는 순종의 계통을 보유하고 있다. 또한 최근 분자생물학적 기술의 발달로 인해 다양한 DNA 마커들이 가축 집단 확인을 위해 사용되고 있다(Cameron et al, 2003; Fajardo et al, 2006; Kim et al., 2010; Sasazaki et al., 2007; Sasazaki et al., 2011; Cheong et al., 2013). 따라서 한우와 수입우의 유전적 특징을 분석하여 두 종간의 유전적 차이를 확인하고 이를 이용하여 두 종을 구별할 수 있는 유전학적 방법을 마련할 필요가 있다.
앤더슨 등은 처음으로 인간의 미토콘드리아 DNA 염기서열을 결정하고 구성을 분석한 결과 16,338 염기쌍으로 이루어진 폐환상 이중분자구조로 12S와 16S 두 종류의 rRNA와 22개 tRNA 그리고 호흡효소에 필요한 산화효소로서 시토크롬 b와 c 복합체 및 ATP 합성효소 등 13개 단백질을 지정하는 유전자로 이루어져 있음을 보고한 이후 소, 닭 등 여러 포유동물과 생물군에서 전체 염기서열이 보고된 바 있다(S. ANDERSON et al., J. Mol. Biol. (1982) 156, 683-717). 그 동안 여러 연구결과에 의하면 미토콘드리아 DNA는 염기치환율이 게놈 DNA 보다 약 5-10배 빠르고 상이한 DNA 분자간에 유전자 재조합현상이 발생하지 않는 모성유전을 하여 그 진화과정이 단순하며 종간 및 동종내에 염기치환에 의한 많은 돌연변이를 보유하고 있다는 사실이 여러 포유동물에서 보고됨에 따라 품종의 기원, 진화과정, 유전적 변이성 추정, 품종간 유전적 유연관계 및 유전적 차이를 구명하는 데 매우 유용한 도구로 이용되어 왔다.
특히 미토콘드리아 DNA는 D-루프(D-loop) 영역이라고 불리는 조절부위(control region)를 가지고 있는데, 이곳에는 두 개의 과변이 부위인 HVR (Hypervariable Region) I 및 II가 약 1 kb의 길이로 존재한다. HVRI 및 II의 염기의 변이는 다른 부위에 비해 5-10배 정도 높은 변이를 보이므로, D-루프(D-loop) 영역의 염기서열 차이를 분석하여 품종 또는 개체간의 염기변이 추정 및 진화와 계통 분류등과 관련된 새로운 유전정보원으로서 그 활용이 시도되고 있다.
따라서 본 발명의 목적은 미토콘드리아 DNA의 변이를 이용하여 한우와 수입우를 판별하는 데 유용한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 복합 프라이머 세트를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 프라이머 세트를 이용하여 한우와 수입우를 판별하는 방법을 제공하고자 한다.
일태양에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 I, 서열번호 4 내지 서열번호 6의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 II, 서열번호 7 내지 서열번호 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 III, 서열번호 10 내지 서열번호 12의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IV, 서열번호 13 내지 서열번호 15의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 V, 서열번호 16 내지 서열번호 18의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VI, 서열번호 19 내지 서열번호 21의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VII, 서열번호 22 내지 서열번호 24의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VIII, 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IX 및 서열번호 27 내지 서열번호 29의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 X에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 프라이머는 소의 미토콘드리아 DNA의 조절부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 26 및 서열번호 28의 프라이머는 각각 미토콘드리아 DNA의 15953번째, 16113 번째, 16050번째, 169 번째, 16255 번째, 16302번째, 163 번째, 16022번째, 222 번째 및 16185 번째 위치에 있는 단일염기다형성(SNP) 부위와 결합할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 미토콘드리아 DNA의 15953번째, 16113 번째, 16050번째, 169 번째, 16255 번째, 16302번째, 163 번째, 16022번째, 222 번째 및 16185 번째 위치에 있는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열은 각각 G, C, T, G, C, A, G, A, C 및 A 인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 프라이머 세트는 한우와 수입우를 판별할 수 있는 것을 특징으로 하며, 한우와 수입우는 중합효소연쇄반응(PCR) 산물의 사이즈(product size)에 의해 판별되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 I 내지 V 중 둘 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 프라이머 세트 C에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 복합 프라이머 세트 C에 의해 검출되는 PCR 산물의 사이즈는 110 bp, 120 bp, 94 bp, 102 bp, 72 bp, 82 bp, 175 bp, 185 bp, 128 bp 또는 136 bp 인 것을 특징으로 하며, 상기 산물의 사이즈가 120 bp, 102 bp, 82 bp, 185 bp 또는 136 bp 인 경우 한우인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 VI 내지 X 중 둘 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 프라이머 세트 D에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 복합 프라이머 세트 D에 의해 검출되는 PCR 산물의 사이즈는 110 bp, 120 bp, 82 bp, 92 bp, 140 bp, 150 bp, 70 bp, 40 bp 또는 50 bp 인 것을 특징으로 하며, 상기 산물의 사이즈가 120 bp, 92 bp, 70 bp 또는 50 bp 인 경우 한우인 것을 특징으로 하며, 상기 산물의 사이즈가 150 bp 인 경우 수입우인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 한우 또는 수입우에서 게놈(genomic) DNA를 추출하는 1단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 I 내지 X 중 하나 이상을 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 2단계; 및 상기 중합효소연쇄반응(PCR) 산물의 사이즈를 비교하는 3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 한우와 수입우를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 한우 또는 수입우에서 게놈(genomic) DNA를 추출하는 1단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 I 내지 V 중 둘 이상의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 2단계; 및 상기 중합효소연쇄반응(PCR) 산물의 사이즈를 비교하는 3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 한우와 수입우를 판별하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 한우 또는 수입우에서 게놈(genomic) DNA를 추출하는 1단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 VI 내지 X 중 둘 이상의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 2단계; 및 상기 중합효소연쇄반응(PCR) 산물의 사이즈를 비교하는 3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 한우와 수입우를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 소의 미토콘드리아 DNA의 특이적 단일염기다형성을 이용하여 얻어진 PCR(중합연쇄반응) 산물의 사이즈를 비교하여, 한우와 수입우를 판별할 수 있으므로, 종래 염기서열 분석에 의해 한우와 수입우를 판별하는 방법에 비해 간단하고 경제적인 방법으로 다수의 시료를 분석할 수 있다.
도 1은 한우(Bos taurus) 미토콘드리아 DNA의 조절 부위에 대해 특정 하플로그룹을 검출할 수 있는 복합 프라이머 세트 A, B를 디자인한 모식도를 나타낸다.
도 2는 복합 프라이머 세트 A, B를 이용한 PCR 조건을 나타낸다.
도 2는 복합 프라이머 세트 A, B를 이용한 PCR 조건을 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 한우와 수입우를 판별하기 위하여, 유전자 수준의 뉴클레오타이드 변이를 용이하게 판별할 수 있는 유전자 마커를 개발하고자 한우와 수입우의 미토콘드리아 DNA의 조절부위(control region)에 대한 염기서열을 분석하였으며, 한우 품종과 수입우 품종에서 특이적으로 높은 빈도로 나타나는 단일염기다형성(SNP)을 확인할 수 있는 프라이머 세트를 발굴하였고, 이들 단일염기다형성(SNP) 검출 프라이머 세트를 조합하면 수입우와 한우를 매우 높은 정확도로 판별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성 하였다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 I, 서열번호 4 내지 서열번호 6의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 II, 서열번호 7 내지 서열번호 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 III, 서열번호 10 내지 서열번호 12의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IV, 서열번호 13 내지 서열번호 15의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 V, 서열번호 16 내지 서열번호 18의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VI, 서열번호 19 내지 서열번호 21의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VII, 서열번호 22 내지 서열번호 24의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VIII, 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IX 및 서열번호 27 내지 서열번호 29의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 X에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머 세트는 소(bovine)에 적용되며, 가장 바람직하게는 한우와 수입우에 모두 적용된다. 본 발명의 명세서에서 용어 “한우(韓牛, Korean Cattle, Hanwoo)” 는 종래부터 한반도에서 운반용이나 농경용으로 사육해오던 재래종의 역우(役牛)를 말하는 것으로 한국소(Bos taurus)를 의미한다.
본 발명의 명세서에서 용어 “수입우”는 한우를 제외한 외국으로부터 수입된 모든 외래 품종의 소를 의미하며, 수입우 품종의 구체적인 예로는 헤리퍼드(Hereford)종, 홀스타인(Holstein)종, 앵거스(Angus)종, 브라만(Brahman)종, 리무진(Limousin)종, 저지(Jersey)종, 인도 가축우(bos indicus)를 들 수 있다.
특별히 본 발명은 한우 또는 수입우의 미토콘드리아 DNA의 조절부위(control region)에 있는 염기서열을 대상으로 하는바, 상기 조절부위를 증폭시킬 수 있는 적절한 프라이머를 사용하는 것이 바람직하고, 이렇게 증폭된 상기 PCR 산물은 한우 또는 수입우 미토콘드리아 DNA의 조절부위(control region)가 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 상기 프라이머 세트는 한우와 수입우의 판별에 사용할 수 있는 단일염기다형성(SNP) 변이 위치에서 특정의 염기가 한우 또는 수입우에서 높은 빈도로 나타나는 것에 근거한 것인데, 표 1은 한우와 수입우의 미토콘드리아 DNA의 조절부위인 D-loop에 대한 단일염기다형성 변이가 일어나는 위치와 빈도를 나타낸 것이다.
| Location in D-loop |
Polymerphic event | Frequency | |
| 한우 |
163 | A → G | 2 |
| 222 | C insertion | 54 | |
| 15953 | C → G | 2 | |
| 16050 | C → T | 5 | |
| 16113 | T → C | 3 | |
| 16185 | G → A | 8 | |
| 16255 | T → C | 18 | |
| 16302 | G → A | 10 | |
| 수입우 | 16022 | G → A | 10 |
표 1에 나타난 단일염기다형성을 바탕으로, 한우의 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 염기서열 15792-364 (15792~16338, 1~364) 부위를 분석하여 하플로그룹을 결정하였다. 하플로그룹이란 같은 미토콘드리아 유전자형을 가진 그룹을 의미하는데, 한우 및 수입우의 조절부위 유전자 중에 특정 염기 서열에 변이가 있는 단일염기다형성(SNP)을 활용하여 ANDERSON 등 (S. ANDERSON et al., J. Mol. Biol. (1982) 156, 683-717, H.S. Cheong et al., Meat Science 94 (2013) 355-359)의 방법에 따라 하플로그룹을 결정하였다.
도 1은 한우의 미토콘드리아 DNA 상의 조절부위에 대한 유전자 배열을 나타내는 모식도이고, 여기에 도시된 상기 한우 미토콘드리아 DNA의 15792-364 (15792~16338, 1~364) 부위를 분석하여, 한우 품종과 수입우 품종에서 특이적으로 높은 빈도로 나타나는 단일염기다형성(SNP) 마커를 발굴하였고, 이들 단일염기다형성(SNP) 마커를 조합하여 각각 5개의 프라이머 세트로 이루어진 복합 프라이머 세트 A, B를 제작하였다.
표 2는 하플로그룹과 해당 하플로그룹을 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 검출할 수 있는 복합 프라이머 세트 A를 구성하는 서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 I, 서열번호 4 내지 서열번호 6의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 II, 서열번호 7 내지 서열번호 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 III, 서열번호 10 내지 서열번호 12의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IV 및 서열번호 13 내지 서열번호 15의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 V와 각각의 프라이머 세트에 의해 검출될 수 있는 PCR 산물의 사이즈(product size), 단일염기다형성이 나타나는 위치와 변이의 특징을 나타낸 것이다.
상기 프라이머 세트들에 의해 얻어지는 중합연쇄반응의 산물 사이즈가 다르므로, 이들 다섯 개의 프라이머 세트가 모두 포함된 복합 프라이머 세트 A를 이용하여 한번에 중합연쇄반응을 수행할 수 있다. 상기 복합 프라이머 세트 A는 각각 T, T1, T1A, T3B 및 T3에 해당하는 하플로그룹(haplogroup)을 지정할 수 있도록 설계했으므로, 상기 복합 프라이머 세트 A에 의해 하플로그룹 T, T1, T1A, T3B 및 T3에 해당하는 PCR 산물을 한번에 검출하는 것이 가능하다.
| 하플로 그룹 |
서열번호 | 프라이머명 | 방향 | 염기서열 | 산물 사이즈 |
SNP 변이 |
| T | 서열번호1 | 15953F | forward | TCAACACAGAATTTGCACCCT | 15953번째 C가 G로 변이 | |
| 서열번호2 | 15953C | reverse | TATGTACATTACCCCTTaCG | 110 bp | ||
| 서열번호3 | 15953G | reverse | gactgactccTATGTACATTACCCCTTaCC | 120 bp(T) | ||
| T1 | 서열번호4 | 16113T | forward | CATAGTACATTATGTCAAATTCcTT | 94 bp | 16113 번째 T가 C로 변이 |
| 서열번호5 | 16113C | forward | gactgactCATAGTACATTATGTCAAATTCcTC | 102 bp(T1) | ||
| 서열번호6 | 16113R | reverse | GTTTCACGCGGCATGGTAAT | |||
| T1A | 서열번호7 | 16050F | forward | AGTACATTAAATTATATGCCCCATGC | 16050번째 C가 T로 변이 | |
| 서열번호8 | 16050C | reverse | TTATATGTATTATGTACTGCTATAaAG | 72 bp | ||
| 서열번호9 | 16050T | reverse | gactgactccTTATATGTATTATGTACTGCTATAaAA | 82 bp(T1A) | ||
| T3B | 서열번호10 | 169F | forward | GCCCATGCTCACACATAACTG | 169 번째 A가 G로 변이 | |
| 서열번호11 | 169A | reverse | GACCATTGACTGTAATGTCtAT | 175 bp | ||
| 서열번호12 | 169G | reverse | gactgactccGACCATTGACTGTAATGTCtAC | 185 bp(T3B) | ||
| T3 | 서열번호13 | 16255T | forward | gactgactccGGGGTCGCTATCCAATGcAT | 128 bp | 16255 번째 T가 C로 변이 |
| 서열번호14 | 16255C | forward | gactgactgactgactccGGGGTCGCTATCCAATGcAC | 136 bp(T3) | ||
| 서열번호15 | 16255R | reverse | TGATTAGCCATTAGTCCATCGAG |
서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 I에 의해 110 bp, 120 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 중 PCR 산물의 사이즈가 120 bp에 해당하는 경우, 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 15953번째 C가 G로 변이된 것으로, 한우로 판별할 수 있는 하플로그룹 T에 해당하게 된다.
서열번호 4 내지 서열번호 6의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 II에 의해 94 bp, 102 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 중 PCR 산물의 사이즈가 102 bp에 해당하는 경우, 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 16113번째 T가 C로 변이된 것으로, 한우로 판별할 수 있는 하플로그룹 T1에 해당하게 된다.
서열번호 7 내지 서열번호 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 III에 의해 72 bp, 82 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 중 PCR 산물의 사이즈가 82 bp에 해당하는 경우, 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 16050번째 C가 T로 변이된 것으로, 한우로 판별할 수 있는 하플로그룹 T1A 에 해당하게 된다.
서열번호 10 내지 서열번호 12의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IV에 의해 175 bp, 185 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 중 PCR 산물의 사이즈가 185 bp에 해당하는 경우, 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 169 번째 A가 G로 변이된 것으로, 한우로 판별할 수 있는 하플로그룹 T3B에 해당하게 된다.
서열번호 13 내지 서열번호 15의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 V에 의해 128 bp, 136 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 중 PCR 산물의 사이즈가 136 bp에 해당하는 경우, 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 16255 번째 T가 C로 변이된 것으로, 한우로 판별할 수 있는 하플로그룹 T3에 해당하게 된다.
상기 각각의 프라이머 세트는 전방향(forward) 프라이머 1개, 후방향(reverse) 프라이머 2개 또는 전방향 프라이머 2개, 후방향 프라이머 1개로 구성되어 있으며, 이들 전방향 또는 후방향 프라이머의 3' 말단에 하플로그룹(haplogroup) 특이적인 단일염기다형성 좌위와 상보적인 서열을 위치시켜 서로 다른 크기의 PCR 산물이 증폭되도록 제작하였다. 또한, 각각의 프라이머 세트를 구성하는 전방향 또는 후방향 프라이머의 3' 말단의 마지막 염기서열에서부터 세번째에 있는 염기서열(소문자로 표시)을 주형가닥의 서열과 비특이적인 서열로 제작함으로써, 프라이머의 비특이적인 결합에 의한 오류를 최소화하였다.
또한, 각각의 프라이머 세트를 구성하는 전방향(forward), 후방향(reverse) 프라이머 중 하나의 프라이머에는 비특이적인 염기서열 꼬리(서열번호 3: gactgactcc, 서열번호 5:gactgact, 서열번호 9: gactgactcc, 서열번호 12: gactgactcc, 서열번호 14: gactgactgactgactcc)를 붙여주어 대립인자에 따른 PCR 산물의 길이를 서로 제작하여, 복합 프라이머 세트 A로 제작할 수 있다(표 2 참조).
표 3은 하플로그룹과 해당 하플로그룹을 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 검출할 수 있는 복합 프라이머 세트 B를 구성하는 서열번호 16 내지 서열번호 18의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VI, 서열번호 19 내지 서열번호 21의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VII, 서열번호 22 내지 서열번호 24의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VIII, 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IX 및 서열번호 27 내지 서열번호 29의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 X와 각각의 프라이머 세트에 의해 검출될 수 있는 PCR 산물의 사이즈(product size), 단일염기다형성이 나타나는 위치와 변이의 특징을 나타낸 것이다.
상기 프라이머 세트들에 의해 얻어지는 중합연쇄반응의 산물 사이즈가 다르므로, 이들 다섯 개의 프라이머 세트가 모두 포함된 복합 프라이머 세트 B를 이용하여 한번에 중합연쇄반응을 수행할 수 있다. 상기 복합 프라이머 세트 B는 각각 T4, T5, T1A, I, T3A 및 T2에 해당하는 하플로그룹(haplogroup)을 지정할 수 있도록 설계했으므로, 상기 복합 프라이머 세트 B에 의해, 하플로그룹 T4, T5, T1A, I, T3A 및 T2에 해당하는 PCR 산물을 한번에 검출하는 것이 가능하다.
| 하플로 그룹 |
서열번호 | 프라이머명 | 방향 | 염기서열 | 산물 사이즈 |
SNP 변이 |
| T4 | 서열번호16 | 16302G | forward | GGGCCATCTCATCTAAAcCG | 110 bp | 16302 번째 G가 A로 변이 |
| 서열번호17 | 16302A | forward | gactgactccGGGCCATCTCATCTAAAcCA | 120 bp(T4) | ||
| 서열번호18 | 16302R | reverse | ACCAAATGTATGACAGCACAGT | |||
| T5 | 서열번호19 | 163F | forward | CCCTGACCCGGAGCATCTAT | 163 번째 A가 G로 변이 | |
| 서열번호20 | 163A | reverse | TGACTGTAATGTCCATGCTcAT | 82 bp | ||
| 서열번호21 | 163G | reverse | gactgactccTGACTGTAATGTCCATGCTcAC | 92 bp(T5) | ||
| I | 서열번호22 | 16022F | forward | CCACTAGCTAACATAACACG | 16022 번째 G가 A로 변이 | |
| 서열번호23 | 16022G | reverse | CTTGCTTATATGCATGGtGC | 140 bp | ||
| 서열번호24 | 16022A | reverse | gactgactccCTTGCTTATATGCATGGtGT | 150 bp(I) | ||
| T3A | 서열번호25 | 222F | forward | ACAGTCAATGGTCACAGGACA | 222 번째 C가 삽입 | |
| 서열번호26 | 222R | reverse | gactgactccGGAAATTTTTATGAAGGGGaGG | 70 bp(T3A) | ||
| T2 | 서열번호27 | 16185G | forward | ATGCCGCGTGAAACaAG | 40 bp | 16185 번째 G가 A로 변이 |
| 서열번호28 | 16185A | forward | gactgactccATGCCGCGTGAAACaAA | 50 bp(T2) | ||
| 서열번호29 | 16185R | reverse | GGATCCCTGCCTAGCGGG |
서열번호 16 내지 서열번호 18의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VI에 의해 110 bp, 120 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 중 PCR 산물의 사이즈가 120 bp에 해당하는 경우, 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 16302 번째 G가 A로 변이된 것으로, 한우로 판별할 수 있는 하플로그룹 T4에 해당하게 된다.
서열번호 19 내지 서열번호 21의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VII에 의해 82 bp, 92 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 중 PCR 산물의 사이즈가 92 bp에 해당하는 경우, 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 163 번째 A가 G로 변이된 것으로, 한우로 판별할 수 있는 하플로그룹 T5에 해당하게 된다.
서열번호 22 내지 서열번호 24의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VIII에 의해 140 bp, 150 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 중 PCR 산물의 사이즈가 150 bp에 해당하는 경우, 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 16022 번째 G가 A로 변이된 것으로, 수입우로 판별할 수 있는 하플로그룹 I에 해당하게 된다.
서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IX에 의해 70 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있다. PCR 산물의 사이즈가 70 bp에 해당하는 경우, 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 222 번째 C가 삽입 된 것으로, 한우로 판별할 수 있는 하플로그룹 T3A에 해당하게 된다.
서열번호 27 내지 서열번호 29의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 X에 의해 40 bp, 50 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 중 PCR 산물의 사이즈가 50 bp에 해당하는 경우, 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 16185 번째 G가 A로 변이된 것으로, 한우로 판별할 수 있는 하플로그룹 T2에 해당하게 된다.
상기 각각의 프라이머 세트는 전방향(forward) 프라이머 1개, 후방향(reverse) 프라이머 2개 또는 전방향 프라이머 2개, 후방향 프라이머 1개, 또는 전방향 프라이머와 후방향 프라이머 각각 1개로 구성되어 있으며, 이들 전?향 또는 후방향 프라이머의 3' 말단에 하플로그룹(haplogroup) 특이적인 단일염기다형성 좌위와 상보적인 서열을 위치시켜 서로 다른 크기의 PCR 산물이 증폭되도록 제작하였다. 또한, 각각의 프라이머 세트를 구성하는 전방향 또는 후방향 프라이머의 3' 말단의 마지막 염기서열에서부터 세번째에 있는 염기서열(소문자로 표시)을 주형가닥의 서열과 비특이적인 서열로 제작함으로써, 프라이머의 비특이적인 결합에 의한 오류를 최소화하였다.
또한, 각각의 프라이머 세트를 구성하는 전방향(forward), 후방향(reverse) 프라이머 중 하나의 프라이머에는 비특이적인 염기서열 꼬리(서열번호 17: gactgactcc, 서열번호 21: gactgactcc, 서열번호 23: gactgactcc, 서열번호 26: gactgactcc, 서열번호 28: gactgactcc)를 붙여주어 대립인자에 따른 PCR 산물의 길이를 서로 다르게 제작하여, 복합 프라이머 세트 B로 제작할 수 있다(표 3 참조).
본 발명에서, 상기 프라미어 세트는 소의 미토콘드리아 DNA의 조절부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는데, 상기 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 26 및 서열번호 28의 프라이머는 각각 미토콘드리아 DNA의 15953번째, 16113 번째, 16050번째, 169 번째, 16255 번째, 16302번째, 163 번째, 16022번째, 222 번째 및 16185 번째 위치에 있는 단일염기다형성(SNP) 부위와 결합할 수 있다.
상기 미토콘드리아 DNA의 15953번째, 16113 번째, 16050번째, 169 번째, 16255 번째, 16302번째, 163 번째, 16022번째, 222 번째 및 16185 번째 위치에 있는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열은 각각 G, C, T, G, C, A, G, A, C 및 A 인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 프라이머 세트는 한우와 수입우를 판별할 수 있는 것을 특징으로 하며, 상기 한우와 수입우는 중합효소연쇄반응(PCR) 산물의 사이즈(product size)에 의해 판별되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 I 내지 V 중 둘 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 프라이머 세트 C에 관한 것이다.
상기 복합 프라이머 세트 C를 이용하여 중합연쇄반응(PCR)을 수행하면, 110 bp, 120 bp, 94 bp, 102 bp, 72 bp, 82 bp, 175 bp, 185 bp, 128 bp 또는 136 bp에 해당하는 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 때 얻어진 PCR 산물의 사이즈가 120 bp, 102 bp, 82 bp, 185 bp 또는 136 bp 인 경우 각각 하플로그룹 T, T1, T1A, T3B 또는 T3에 해당하는 경우로 한우로 판별될 수 있다. 본 발명에서 하플로그룹에 해당하는 PCR 산물이 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 보다 바람직하게는 4개 이상, 가장 바람직하게는 5개 이상이 검출되는 경우 한우로 판별한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 VI 내지 X 중 둘 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 프라이머 세트 D에 관한 것이다.
상기 복합 프라이머 세트 D를 이용하여 중합연쇄반응을 수행하면, 110 bp, 120 bp, 82 bp, 92 bp, 140 bp, 150 bp, 70 bp, 40 bp 또는 50 bp 에 해당하는 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 때 얻어진 PCR 산물의 사이즈가 120 bp, 92 bp, 70 bp 또는 50 bp 인 경우, 각각 4개의 하플로그룹 T4, T5, T3 또는 T2에 해당하는 경우로 한우로 판별될 수 있다. 본 발명에서 하플로그룹에 해당하는 PCR 산물이 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 가장 바람직하게는 4개 이상이 검출되는 경우 한우로 판별한다. 한편, 이들 하플로그룹이 검출되지 않고, 150 bp의 PCR 산물이 검출되는 경우 하플로그룹 I에 해당하는 경우로 수입우로 판별할 수 있다.
본 발명은 한우 또는 수입우에서 게놈(genomic) DNA를 추출하는 1단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 I 내지 V 중 둘 이상의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 2단계; 및 상기 중합효소연쇄반응(PCR) 산물의 사이즈를 비교하는 3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 한우와 수입우를 판별하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 한우 또는 수입우에서 게놈(genomic) DNA를 추출하는 1단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 VI 내지 X 중 둘 이상의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 2단계; 및 상기 중합효소연쇄반응(PCR) 산물의 사이즈를 비교하는 3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 한우와 수입우를 판별하는 방법에 관한 것이다.
한우 또는 수입우의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 것은 추출된 DNA 시료를 분석하여 상기 한우 또는 수입우의 미토콘드리아 DNA 상에 존재하는 변이를 판별하기 위한 것이기 때문에, 한우 또는 수입우의 어느 부분에서 DNA를 추출하든지 또는 어떠한 방법으로 추출되는지는 특별히 제한되지 않는다. 그 중에서도 이렇게 추출된 DNA 시료는 한우 또는 수입우의 미토콘드리아 DNA의 조절부위(control region)를 포함하는 것이 바람직하다.
그리고, 이렇게 추출한 DNA를 PCR로 증폭하는 것 또한 검사 대상이 되는 부위의 검사 표본을 늘이기 위한 것으로, 증폭산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 게놈(
genomic
)
DNA
분리
한우의 미토콘드리아 DNA 특이 서열변이를 확인하기 위하여 한우(Bos Taurus)와 수입우(Bos indicus) 각 30여 마리로부터 QIAamp DNA mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 혈액 또는 모근세포로부터 게놈(genomic) DNA를 추출하였다.
<
실시예
2> 조절부위 서열분석 및
하플로그룹
(
haplogroup
) 결정
하플로그룹이란 같은 미토콘드리아 유전자형을 가진 그룹을 의미하는데, 한우의 조절부위 유전자 중에 특정 염기 서열에 변이가 있는 단일염기다형성(SNP)을 활용하여 ANDERSON 등(S. ANDERSON et al., J. Mol. Biol. (1982) 156, 683-717, H.S. Cheong et al., Meat Science 94 (2013) 355-359)의 방법에 따라 한우 미토콘드리아 DNA의 조절부위의 염기서열 15792-364 (15792~16338, 1~364) 부위를 분석하여 하플로그룹을 결정하였다. 상기 하플로그룹의 명칭과 해당 염기서열의 변이 위치와 특징을 표 4에 나타내었다.
| 하플로그룹 | 단일염기다형성(SNP) 변이 | 하플로그룹 | 단일염기다형성(SNP) 변이 |
| T | 15953번째 C가 G로 변이 | T4 | 16302 번째 G가 A로 변이 |
| T1 | 16113 번째 T가 C로 변이 | T5 | 163 번째 A가 G로 변이 |
| T1A | 16050번째 C가 T로 변이 | I | 16022 번째 G가 A로 변이 |
| T3B | 169 번째 A가 G로 변이 | T3A | 222 번째 C가 삽입 |
| T3 | 16255 번째 T가 C로 변이 | T2 | 16185 번째 G가 A로 변이 |
<
실시예
3> 복합
프라이머
세트 A 제조
도 1은 한우의 미토콘드리아 DNA 상의 조절부위(control region)에 대한 유전자 배열을 나타내는 모식도이고, 여기에 도시된 상기 한우 미토콘드리아 DNA의 15792-364 (15792~16338, 1~364) 부위를 분석하여, 실시예 2에서 결정된 해당 하플로그룹을 검출할 수 복합 프라이머 세트 A, B를 제작하였으며, 해당 하플로그룹을 결정지을 수 있는 단일염기다형성(SNP) 마커에 특이적인 프라이머를 도 1과 같이 디자인하였다(빨간색 볼딕체로 기울임체로 표시된 프라이머: 하플로그룹을 결정지을 수 있는 단일염기다형성(SNP) 마커에 특이적인 프라이머)
서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 프라이머 세트 I, 서열번호 4 내지 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 세트 II, 서열번호 7 내지 서열번호 9로 이루어진 프라이머 세트 III, 서열번호 10 내지 서열번호 12로 이루어진 프라이머 세트 IV 및 서열번호 13 내지 서열번호 15로 이루어진 프라이머 세트 V를 포함하는 복합 프라이머 세트 A를 표 5에 나타내었다.
상기 프라이머 세트는 전방향(forward) 프라이머 1개, 후방향(reverse) 프라이머 2개 또는 전방향 프라이머 2개, 후방향 프라이머 1개로 구성되어 있다. 이들 프라이머 세트를 구성하는 전?향 또는 후방향 프라이머의 3' 말단에 하플로그룹(haplogroup) 특이적인 단일염기다형성 좌위와 상보적인 서열을 위치시켜 서로 다른 크기의 PCR 산물이 증폭되도록 제작하였다. 또한, 각각의 프라이머 세트를 구성하는 전방향 또는 후방향 프라이머의 3' 말단의 마지막 염기서열에서부터 세번째에 있는 염기서열(소문자 염기서열로 표시)을 주형가닥의 서열과 비특이적인 서열로 제작함으로써, 프라이머의 비특이적인 결합에 의한 오류를 최소화하였다.
또한, 각각의 프라이머 세트를 구성하는 전방향(forward), 후방향(reverse) 프라이머 중 하나의 프라이머에는 비특이적인 염기서열 꼬리(서열번호 3: gactgactcc, 서열번호 5:gactgact, 서열번호 9: gactgactcc, 서열번호 12: gactgactcc, 서열번호 14: gactgactgactgactcc)를 붙여주어 대립인자에 따른 PCR 산물의 길이를 서로 제작하였다(표 5 참조).
상기와 같이 제작된 복합 프라이머 세트 A의 경우, T, T1, T1A, T3B 또는 T3의 하플로그룹을 지정할 수 있도록 프라이머를 디자인하였다.
| 하플로그룹 | 서열번호 | 프라이머 세트 A | 방향 | 염기서열 | 산물사이즈 |
| T | 서열번호1 | 15953F | forward | TCAACACAGAATTTGCACCCT | |
| 서열번호2 | 15953C | reverse | TATGTACATTACCCCTTaCG | 110 bp | |
| 서열번호3 | 15953G | reverse | gactgactccTATGTACATTACCCCTTaCC | 120 bp(T) | |
| T1 | 서열번호4 | 16113T | forward | CATAGTACATTATGTCAAATTCcTT | 94 bp |
| 서열번호5 | 16113C | Forward | gactgactCATAGTACATTATGTCAAATTCcTC | 102 bp(T1) | |
| 서열번호6 | 16113R | reverse | GTTTCACGCGGCATGGTAAT | ||
| T1A | 서열번호7 | 16050F | forward | AGTACATTAAATTATATGCCCCATGC | |
| 서열번호8 | 16050C | reverse | TTATATGTATTATGTACTGCTATAaAG | 72 bp | |
| 서열번호9 | 16050T | reverse | gactgactccTTATATGTATTATGTACTGCTATAaAA | 82 bp(T1A) | |
| T3B | 서열번호10 | 169F | forward | GCCCATGCTCACACATAACTG | |
| 서열번호11 | 169A | reverse | GACCATTGACTGTAATGTCtAT | 175 bp | |
| 서열번호12 | 169G | reverse | gactgactccGACCATTGACTGTAATGTCtAC | 185 bp(T3B) | |
| T3 | 서열번호13 | 16255T | forward | gactgactccGGGGTCGCTATCCAATGcAT | 128 bp |
| 서열번호14 | 16255C | forward | gactgactgactgactccGGGGTCGCTATCCAATGcAC | 136 bp(T3) | |
| 서열번호15 | 16255R | reverse | TGATTAGCCATTAGTCCATCGAG |
<
실시예
4> 복합
프라이머
세트 B 제조
서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 프라이머 세트 VI, 서열번호 19 내지 서열번호 21로 이루어진 프라이머 세트 VII, 서열번호 22 내지 서열번호 24로 이루어진 프라이머 세트 VIII, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 프라이머 세트 IX 및 서열번호 27 내지 서열번호 29로 이루어진 프라이머 세트 X를 포함하는 복합 프라이머 세트 B를 표 6에 나타내었다.
상기 복합 프라이머 세트 B를 각각의 프라이머 세트는 전방향(forward) 프라이머 1개, 후방향(reverse) 프라이머 2개 또는 전방향 프라이머 2개, 후방향 프라이머 1개 또는 전방향 프라이머와 후방향 프라이머 각각 1개로 구성되어 있다. 이들 프라이머 세트를 구성하는 전?향 또는 후방향 프라이머의 3' 말단에 하플로그룹(haplogroup) 특이적인 단일염기다형성 좌위와 상보적인 서열을 위치시켜 서로 다른 크기의 PCR 산물이 증폭되도록 제작하였다. 또한, 각각의 프라이머 세트를 구성하는 전방향 또는 후방향 프라이머의 3' 말단의 마지막 염기서열에서부터 세번째에 있는 염기서열(소문자 염기서열로 표시)을 주형가닥의 서열과 비특이적인 서열로 제작함으로써, 프라이머의 비특이적인 결합에 의한 오류를 최소화하였다.
또한, 각각의 프라이머 세트를 구성하는 전방향(forward), 후방향(reverse) 프라이머 중 하나의 프라이머에는 비특이적인 염기서열 꼬리(서열번호 17: gactgactcc, 서열번호 21: gactgactcc, 서열번호 23: gactgactcc, 서열번호 26: gactgactcc, 서열번호 28: gactgactcc)를 붙여주어 대립인자에 따른 PCR 산물의 길이를 서로 다르게 제작하여, 복합 프라이머 세트 B로 제작하였다.(표 6 참조).
상기와 같이 제작된 복합 프라이머 세트 B의 경우, T4, T5, I, T3A 또는 T2의 하플로그룹을 지정할 수 있도록 설계했다.
| 하플로그룹 |
서열번호 | 프라이머 세트 B | 방향 | 염기서열 | 산물사이즈 |
| T4 | 서열번호16 | 16302G | forward | GGGCCATCTCATCTAAAcCG | 110 bp |
| 서열번호17 | 16302A | forward | gactgactccGGGCCATCTCATCTAAAcCA | 120 bp(T4) | |
| 서열번호18 | 16302R | reverse | ACCAAATGTATGACAGCACAGT | ||
| T5 | 서열번호19 | 163F | forward | CCCTGACCCGGAGCATCTAT | |
| 서열번호20 | 163A | reverse | TGACTGTAATGTCCATGCTcAT | 82 bp | |
| 서열번호21 | 163G | reverse | gactgactccTGACTGTAATGTCCATGCTcAC | 92 bp(T5) | |
| I | 서열번호22 | 16022F | forward | CCACTAGCTAACATAACACG | |
| 서열번호23 | 16022G | reverse | CTTGCTTATATGCATGGtGC | 140 bp | |
| 서열번호24 | 16022A | reverse | gactgactccCTTGCTTATATGCATGGtGT | 150 bp(I) | |
| T3A | 서열번호25 | 222F | forward | ACAGTCAATGGTCACAGGACA | |
| 서열번호26 | 222R | reverse | gactgactccGGAAATTTTTATGAAGGGGaGG | 70 bp(T3A) | |
| T2 | 서열번호27 | 16185G | forward | ATGCCGCGTGAAACaAG | 40 bp |
| 서열번호28 | 16185A | forward | gactgactccATGCCGCGTGAAACaAA | 50 bp(T2) | |
| 서열번호29 | 16185R | reverse | GGATCCCTGCCTAGCGGG |
<
실시예
5> 복합
프라이머
세트 A, B를 이용한
중합연쇄반응
(
PCR
) 수행
실시예 3, 4에서 디자인한 복합 프라이머 세트 A, B 와 실시예 1에서 얻은 게놈 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 한우와 수입우를 판별할 수 있었다. 본 중합연쇄반응에 사용된 반응조건은 도 2에 나타내었다.
PCR은 주형 DNA 10-100 ng, 전방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머(서열번호 1 내지 서열번호 15) 각각 5 μM, 각각의 dNTP 100μM, 1.5 mM MgCl2, 1 x 반응 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 Mm KCl) 및 Taq DNA 중합효소 (AmpliTaq Gold 중합효소, Applied Biosystems, Foster City, CA, 미국) 1 U를 포함하는 총 20 ㎕의 반응물을 이용하여, 주형 DNA를 우선 95℃에서 15분 동안 변성한 다음, 94℃ 10초간 변성, 52℃ 10초간 어닐링 및 72℃ 5초간 어닐링을 32 사이클을 수행한 후, 마지막으로 72℃ 3분간 최종 연장하였다.
다음으로, 주형 DNA 10-100 ng, 전방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머(서열번호 16 내지 서열번호 29) 각각 5 μM, 각각의 dNTP 100μM, 1.5 mM MgCl2, 1 x 반응 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 Mm KCl) 및 Taq DNA 중합효소 (AmpliTaq Gold 중합효소, Applied Biosystems, Foster City, CA, 미국) 1 U를 포함하는 총 20 ㎕의 반응물을 이용하여, 주형 DNA를 우선 95℃에서 15분 동안 변성한 다음, 94℃ 10초간 변성, 52℃ 10초간 어닐링 및 72℃ 5초간 어닐링을 32 사이클을 수행한 후, 마지막으로 72℃ 3분간 최종 연장하였다.
상기의 PCR 산물을 3％ 아가로스 젤 상에서 증폭산물을 확인한 결과, 한우의 경우, 복합 프라이머 세트 A를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 하플로그룹 T, T1, T1A, T3B 또는 T3에 해당하는 120 bp, 102 bp, 82 bp, 185 bp 또는 136 bp 크기의 PCR 산물이 검출되었다. 복합 프라이머 세트 B를 이용하여 PCR을 수행한 결과 한우의 경우, 하플로그룹 T4, T5, T3 또는 T2에 해당하는 120 bp, 92 bp, 70 bp 또는 50 bp 크기의 PCR 산물이 검출되었다. 반면, 수입우의 경우 이들 하플로그룹이 검출되지 않고, 150 bp에 해당하는 하플로그룹 I가 검출되었다. 이로부터 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 한우와 수입우의 판별이 가능함을 알 수 있었다.
<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation
<120> Primer set for discrimination of Hanwoo and Methods
discrimination of thereby
<130> KPA140313KR
<160> 29
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARTIFICIAL PRIMER
<400> 1
tcaacacaga atttgcaccc t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARTIFICIAL PRIMER
<400> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARTIFICIAL PRIMER
<400> 3
gactgactcc tatgtacatt accccttacc 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARTIFICIAL PRIMER
<400> 4
catagtacat tatgtcaaat tcctt 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial primer
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<212> DNA
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<223> artificial primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<220>
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ttatatgtat tatgtactgc tataaag 27
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<212> DNA
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<220>
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gactgactcc ttatatgtat tatgtactgc tataaaa 37
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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gactgactcc ggggtcgcta tccaatgcat 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial primer
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gactgactga ctgactccgg ggtcgctatc caatgcac 38
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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tgattagcca ttagtccatc gag 23
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<220>
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gggccatctc atctaaaccg 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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gactgactcc gggccatctc atctaaacca 30
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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accaaatgta tgacagcaca gt 22
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<220>
<223> artificial primer
<400> 19
ccctgacccg gagcatctat 20
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tgactgtaat gtccatgctc at 22
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<223> artificial primer
<400> 21
gactgactcc tgactgtaat gtccatgctc ac 32
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ccactagcta acataacacg 20
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<223> artificial primer
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cttgcttata tgcatggtgc 20
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<212> DNA
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<223> artificial primer
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gactgactcc cttgcttata tgcatggtgt 30
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acagtcaatg gtcacaggac a 21
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<220>
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gactgactcc ggaaattttt atgaagggga gg 32
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<212> DNA
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atgccgcgtg aaacaag 17
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gactgactcc atgccgcgtg aaacaaa 27
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<212> DNA
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<220>
<223> artificial primer
<400> 29
ggatccctgc ctagcggg 18
Claims (16)
- 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 한우 판별용 프라이머 세트.
서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 I, 서열번호 4 내지 서열번호 6의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 II, 서열번호 7 내지 서열번호 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 III, 서열번호 10 내지 서열번호 12의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IV, 서열번호 13 내지 서열번호 15의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 V, 서열번호 16 내지 서열번호 18의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VI, 서열번호 19 내지 서열번호 21의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VII, 서열번호 22 내지 서열번호 24의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VIII, 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IX 및 서열번호 27 내지 서열번호 29의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 X. - 제1항 있어서,
상기 프라이머는 소의 미토콘드리아 DNA의 조절부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트. - 제1항에 있어서,
상기 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 26 및 서열번호 28의 프라이머는 각각 미토콘드리아 DNA의 15953번째, 16113 번째, 16050번째, 169 번째, 16255 번째, 16302번째, 163 번째, 16022번째, 222 번째 및 16185 번째 위치에 있는 단일염기다형성(SNP) 부위와 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트. - 제3항에 있어서,
상기 미토콘드리아 DNA의 15953번째, 16113 번째, 16050번째, 169 번째, 16255 번째, 16302번째, 163 번째, 16022번째, 222 번째 및 16185 번째 위치에 있는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기서열은 각각 G, C, T, G, C, A, G, A, C 및 A 인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트. - 제1항에 있어서,
상기 한우와 수입우는 중합효소연쇄반응(PCR) 산물의 사이즈(product size)에 의해 판별되는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트. - 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 프라이머 세트를 포함하는 복합 프라이머 세트.
서열번호 1 내지 서열번호 3의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 I, 서열번호 4 내지 서열번호 6의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 II, 서열번호 7 내지 서열번호 9의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 III, 서열번호 10 내지 서열번호 12의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IV 및 서열번호 13 내지 서열번호 15의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 V. - 제6항에 있어서,
상기 프라이머 세트에 의해 검출되는 PCR 산물의 사이즈는 110 bp, 120 bp, 94 bp, 102 bp, 72 bp, 82 bp, 175 bp, 185 bp, 128 bp 또는 136 bp 인 것을 특징으로 하는 복합 프라이머 세트. - 제7항에 있어서,
상기 산물의 사이즈가 120 bp, 102 bp, 82 bp, 185 bp 또는 136 bp 인 경우 한우인 것을 특징으로 하는 복합 프라이머 세트. - 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 프라이머 세트를 포함하는 복합 프라이머 세트.
서열번호 16 내지 서열번호 18의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VI, 서열번호 19 내지 서열번호 21의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VII, 서열번호 22 내지 서열번호 24의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 VIII, 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 IX 및 서열번호 27 내지 서열번호 29의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 X. - 제9항에 있어서,
상기 프라이머 세트에 의해 검출되는 PCR 산물의 사이즈는 110 bp, 120 bp, 82 bp, 92 bp, 140 bp, 150 bp, 70 bp, 40 bp 또는 50 bp 인 것을 특징으로 하는 복합 프라이머 세트. - 제10항에 있어서,
상기 산물의 사이즈가 120 bp, 92 bp, 70 bp 또는 50 bp 인 경우 한우인 것을 특징으로 하는 복합 프라이머 세트. - 제10항에 있어서,
상기 산물의 사이즈가 150 bp 인 경우 수입우인 것을 특징으로 하는 복합 프라이머 세트. - 한우 또는 수입우에서 게놈(genomic) DNA를 추출하는 1단계;
상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제6항의 복합 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 2단계; 및
상기 중합효소연쇄반응(PCR) 산물의 사이즈를 비교하는 3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 한우와 수입우를 판별하는 방법. - 제13항에 있어서,
상기 복합 프라이머 세트는 다섯 개의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 판별하는 방법. - 한우 또는 수입우에서 게놈(genomic) DNA를 추출하는 1단계;
상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제9항의 복합 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 2단계; 및
상기 중합효소연쇄반응(PCR) 산물의 사이즈를 비교하는 3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 한우와 수입우를 판별하는 방법. - 제15항에 있어서,
상기 복합 프라이머 세트는 다섯 개의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 판별하는 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020140078343A KR20160000975A (ko) | 2014-06-25 | 2014-06-25 | 한우 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 한우를 판별하는 방법 |
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|---|---|---|---|
| KR1020140078343A KR20160000975A (ko) | 2014-06-25 | 2014-06-25 | 한우 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 한우를 판별하는 방법 |
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Family Applications (1)
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| KR1020140078343A KR20160000975A (ko) | 2014-06-25 | 2014-06-25 | 한우 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 한우를 판별하는 방법 |
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|---|---|
| KR (1) | KR20160000975A (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190041798A (ko) * | 2017-10-13 | 2019-04-23 | 대한민국(농촌진흥청장) | 소의 성 및 품종 판별용 조성물, 및 이를 이용한 판별방법 |
| KR20200064641A (ko) | 2018-11-29 | 2020-06-08 | 영남대학교 산학협력단 | 단일염기다형성 마커를 포함하는 소 품종 식별용 조성물 및 이의 용도 |
| CN113444815A (zh) * | 2021-08-31 | 2021-09-28 | 湖南大学 | 一种进境牛肉品系鉴定试剂盒及方法 |
-
2014
- 2014-06-25 KR KR1020140078343A patent/KR20160000975A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190041798A (ko) * | 2017-10-13 | 2019-04-23 | 대한민국(농촌진흥청장) | 소의 성 및 품종 판별용 조성물, 및 이를 이용한 판별방법 |
| KR20200064641A (ko) | 2018-11-29 | 2020-06-08 | 영남대학교 산학협력단 | 단일염기다형성 마커를 포함하는 소 품종 식별용 조성물 및 이의 용도 |
| CN113444815A (zh) * | 2021-08-31 | 2021-09-28 | 湖南大学 | 一种进境牛肉品系鉴定试剂盒及方法 |
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