JP2005521389A - Ｔ細胞受容体様特異性を有し、さらに高親和性の抗体ならびに癌、ウイルス感染、および自己免疫疾患の検出および治療でのその使用 - Google Patents

Abstract

ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満、好ましくは１０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含み、任意選択的に抗体に抱合する同定可能なまたは治療部分をさらに含む単離分子。

Description

本発明は、Ｔ細胞受容体の特異性および高親和性を有する抗体、同定可能部分および／または治療部分とのその抱合体、前記抗体および抱合体の作製方法、前記抗体および抱合体をコードするポリヌクレオチド、ならびに癌、ウイルス感染、および自己免疫疾患の検出および治療における前記抱合体の使用方法に関する。

細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子との複合体中の特異的ペプチドの発現は、癌および自己免疫疾患（１−３）ならびにウイルス感染に関連することが示されている。癌では、ヒト腫瘍細胞がしばしば患者由来の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される抗原を発現するという新規の十分に確立された所見からこれらのペプチドが発見された（１−５）。

さらに、腫瘍に対する免疫応答は腫瘍の後退に不十分であり、腫瘍細胞はこのような免疫攻撃の回避に有効な機構を発達させることができることが証明された（６−９）。したがって、癌ペプチドワクチン、自家癌ワクチン、および癌−樹状細胞ハイブリッドワクチンを含む抗腫瘍免疫応答を増大させるための腫瘍ワクチン接種分野において多数のアプローチが開発されている（７，１０，１１）。

免疫応答の特異性がこれらのクラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体によって制御および指示されるので、正常な細胞には寛大でありながら癌細胞を消滅させるための標的としてこれらの非常に特異的且つ固有の分子細胞表面マーカーを使用することが可能なはずである。ウイルス感染細胞および自己免疫攻撃のための標的を提示する細胞を根絶させるために類似のアプローチに着手することができる。したがって、癌／ウイルス／自己免疫関連ＭＨＣ−ペプチド複合体に対するＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の優れた固有の特異性を模倣する可溶性形態の新規の分子を考察することが非常に望ましい。

１つの有望なアプローチは、ＴＣＲと同一の特異性を有する癌細胞表面で発現するＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する組換え抗体を作製することである。その後、これらの固有の抗体を、放射性同位体、細胞傷害薬、または毒素などの細胞傷害性エフェクター部分で武装することができる。例えば、癌細胞をターゲティングする抗体を、植物および細菌の両方由来の強力な毒素と遺伝的に融合し、それにより、組換え免疫毒素と呼ばれる分子を作製した（１２）。

Ｔ細胞のＭＨＣ拘束性特異性を有する抗体は稀であり、Ｂ細胞は自己ＭＨＣ拘束性を教育されないので従来のハイブリドーマ技術による作製が困難であった（１３〜１６）。抗体ファージディスプレイテクノロジーの利点により、非常に定義されたエピトープに対する固有且つ稀な抗体のための巨大な抗体レパートリーを選択することも可能となる。ウイルスエピトープと複合体形成したマウスクラスＩ ＭＨＣ Ｈ−２Ｋ^ｋに対するＴＣＲ様拘束性抗体のファージディスプレイによる単離能力によってこれが証明された（１７）。明らかに、マウスＭＨＣに指向するこの抗体は、ヒトの治療および診断で役に立たない。今までのところ、このグループによるヒトクラスＩ ＭＨＣに対するＴＣＲ様拘束性抗体を開発する試みは失敗に終わっている。より最近では、ＨＬＡ−Ａ１との複合体における黒色腫抗原ＭＡＧＥ−Ａ１と反応性を示す抗体が単離された；しかし、この抗体の親和性は低く、可溶性抗体としてではなくファージ上の多量体形態で発現した場合のみでこれを使用して抗原提示細胞の表面上で特異的複合体を検出することができる（１８）。

したがって、上記制限のないヒトクラスＩ ＭＨＣに対するＴＣＲ様拘束性抗体の必要性が広く認識されており、これを得ることは非常に有利である。

近年、多数の癌関連、ウイルス、および自己免疫関連ＭＨＣ拘束性ペプチドが単離され、この高度に拘束された優れた特異性のために、これらは免疫療法および免疫診断における新規のアプローチのための望ましい標的である。Ｔ細胞抗原受容体と同一の特異性を有する癌関連、ウイルス、および自己免疫関連ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識することができる抗体は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、および自己免疫関連細胞による抗原提示の研究、このような細胞上でのＭＨＣ−ペプチド複合体の視覚化、ならびに最終的に癌、ウイルス、および自己免疫の免疫療法および免疫診断のための新規のターゲティング薬の開発のための有益な試薬である。

本発明の実施およびこのような固有の優れた特異性を有する例示的分子の作製のために、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスを、黒色腫分化抗原ｇｐ１００由来の共通の抗原Ｔ細胞ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープと複合体形成した可溶性単鎖ＨＬＡ−Ａ２で免疫化した。ファージディスプレイを使用して、ｇｐ１００由来エピトープに対して特徴的なＴＣＲ様結合特異性を示すが、ＴＣＲと異なってナノモル範囲で親和性を示す高親和性組換えｓｃＦｖ抗体を単離した。ＴＣＲ様抗体は、抗原提示細胞表面上に発現した天然のＭＨＣ−ペプチド複合体を認識する。さらに、切断細菌毒素形態の非常に強力な細胞傷害性エフェクター分子に融合する場合、ペプチド依存性様式でＴＣＲ様特異性を有する抗原提示細胞を特異的に死滅させることができた。これらの結果は、最初に、ヒト癌Ｔ細胞エピトープに指向するＴ細胞の抗原特異的ＭＨＣ拘束性特異性を有する高親和性ヒト組換え抗体を単離する能力を証明する。選択されたＴＣＲ様抗体は、腫瘍細胞表面上の特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体、抗原を提示する他の細胞、およびリンパ様組織の発現のモニタリングおよび視覚化ならびに免疫療法用の新規のターゲティング薬ファミリーの開発に有用である。

したがって、本発明の１つの態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満、好ましくは１０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む単離分子を提供する。

下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、単離分子は、抗体に抱合する同定可能な部分をさらに含む。

記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、単離分子は、抗体に抱合する治療部分をさらに含む。

１つの例では、抗体は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する単鎖抗体である。

本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む治療有効量の分子を含み、前記分子は前記抗体に抱合する治療部分をさらに含む薬学的組成物を提供する。好ましくは、薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む。

本発明のさらに別の態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む分子を含み、前記分子は前記抗体に抱合した同定可能部分をさらに含む診断組成物を提供する。

本発明のさらに別の態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む単離分子を提供する。

１つの例では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。特定の例では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号８に記載の核酸配列を有する。

下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、単離分子は、第１のポリヌクレオチドに連結し、治療部分をコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む。

下記の本発明の好ましい実施形態における別の特徴によれば、請求項２４に記載の単離分子は、第１のポリヌクレオチドに連結し、同定可能部分をコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む。

記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、同定可能部分は、結合対のメンバーおよび標識からなる群から選択される。

記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、結合対のメンバーは抗原である。

記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、標識は、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される。

本発明のさらなる態様によれば、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩを発現する細胞を有する遺伝子操作された非ヒト哺乳動物をＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成された可溶性形態のＭＨＣクラスＩ分子で免疫化する工程と、非ヒト哺乳動物の抗体産生細胞からｍＲＮＡ分子を単離する工程と、前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子をディスプレイするファージディスプレイライブラリーを産生する工程と、前記ファージディスプレイライブラリーから少なくとも１つのファージを単離する工程と、少なくとも１つの前記ファージがＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと１０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体をディスプレイすることとを含む、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体の産生方法を提供する。

記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、非ヒト哺乳動物は自己ＭＨＣクラスＩ分子を欠く。

記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＨＬＡ拘束性抗原は腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原である。

記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＨＬＡ拘束性抗原はウイルスＨＬＡ拘束性抗原である。

記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＨＬＡ拘束性抗原は自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原である。

記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、可溶性形態のＭＨＣクラスＩ分子は、機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖アミノ酸配列に直接または間接的に共有結合した機能的ヒトβ−２ミクログロブリンアミノ酸配列を含む単鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドである。

本発明のなおさらなる態様によれば、癌を特徴づける腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む治療有効量の分子を必要とする被験体に投与する工程と、前記分子が抗体に抱合した治療部分をさらに含み、被験体の内因性ＭＨＣクラスＩと適合するＭＨＣクラスＩ分子が選択されることとを含む、癌の治療方法を提供する。

本発明のなおさらなる態様によれば、ウイルス感染に起因するウイルスを特徴付けるウイルスＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む治療有効量の分子を必要とする被験体に投与する工程と、前記分子が抗体に抱合した治療部分をさらに含み、被験体の内因性ＭＨＣクラスＩと適合するＭＨＣクラスＩ分子が選択されることとを含む、ウイルス感染の治療方法を提供する。

本発明のなおさらなる態様によれば、自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む治療有効量の分子を必要とする被験体に投与する工程と、前記分子が抗体に抱合した治療部分をさらに含み、被験体の内因性ＭＨＣクラスＩと適合するＭＨＣクラスＩ分子が選択されることとを含む、自己免疫疾患の治療方法を提供する。

下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８からなる群から選択される。

記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、治療部分は、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、および二重特異性抗体部分からなる群から選択される。

本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体をコードする第１のポリヌクレオチドをインフレームで毒素部分をコードする第２のポリヌクレオチドとライゲーションしてライゲーションされたポリヌクレオチドを得る工程と、ライゲーションした前記ポリヌクレオチドを発現系で発現させて免疫毒素を得る工程とを含む、免疫毒素の作製方法を提供する。

本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体をコードする第１のポリヌクレオチドをインフレームで同定可能な部分をコードする第２のポリヌクレオチドとライゲーションしてライゲーションされたポリヌクレオチドを得る工程と、ライゲーションした前記ポリヌクレオチドを発現系で発現させて免疫標識を得る工程とを含む、免疫標識の作製方法を提供する。

本発明の別の態様によれば、サンプルの細胞をＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体と相互作用させる工程と、相互作用をモニタリングしてＨＬＡ拘束性抗原を提示する抗原提示細胞の存在および／またはレベルを検出する工程とを含む、細胞サンプル中のＨＬＡ拘束性抗原を提示する抗原提示細胞の存在および／またはレベルの検出方法を提供する。

適用に依存して、ＨＬＡ拘束性抗原は、腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原、ウイルスＨＬＡ拘束性抗原、および自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原からなる群から選択される。

本発明は、Ｔ細胞受容体特異性およびその抗原に対する高親和性を有する抗体を提供することならびに免疫療法および免疫診断におけるその使用による現在公知の構成要素の欠点に首尾よく取り組む。

図面の簡単な記述
本発明を、本明細書中で、例示のみを目的として添付の図面を参照して記載する。ここでは詳細な図面を参照して、示した個々の事項は本発明の好ましい実施形態の例示および例示的考察のみを目的とし、最も有用と考えられるものを示すことおよび本発明の原理および概念的局面の説明が容易に理解されるために示すことを強調する。これに関して、本発明の基本的理解に必要とされる以上により詳細に本発明の構造細部を示すことを意図せず、図面と共に示した説明により、どのようにして本発明のいくつかの形態を実際に実施することができるのかが当業者に明らかとなる。
図面において、
図１Ａ−Ｂは組換えｓｃＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体に対するポリクローナルファージＥＬＩＳＡを示す棒グラフを示す。プレートに、以下の実施例に記載の表示のｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体でコートする。最初のライブラリーのポリクローナルファージ集団（Ｌ）または各パニングラウンド後に溶出したファージ（Ｉ−ＩＶ）の結合を示す。図１Ａ−ｐＣＡＮＴＡＢ ｓｃＦｖライブラリー由来のファージ；図１Ｂ−ｓｃＦｖ−ＣＢＤライブラリー由来のファージ。ビオチン化ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体を使用したＥＬＩＳＡによって結合特異性研究を行った。ＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に、ＢＳＡ−ビオチン（１μｇ／ウェル）で一晩コートし、洗浄し、ストレプトアビジン（１μｇ／ウェル）とインキュベートし（室温で１時間）、再度十分に洗浄し、０．５μｇのＭＨＣ／ペプチド複合体とさらにインキュベートした（室温で１時間）。プレートをＰＢＳ／２％ミルクでブロックし（室温で３０分間）、ファージクローン（約１０^９以下のファージ／ウェル、室温で１時間）または０．５〜１μｇの可溶性ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−ＰＥ３８とインキュベートし、その後１０００倍希釈のＨＲＰ抱合／抗Ｍ１３、抗ｍｙｃ抗体、または抗ＰＥ抗体でそれぞれ洗浄した。特異性研究のために使用したＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドは、ｇｐ１００（１５４）：ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号１）；ｇｐ１００（２０９）：ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号２）；ｇｐ１００（２８０）：ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ（配列番号３）；ＭＵＣ１：ＬＬＬＴＶＬＴＶＬ（配列番号４）；ＨＴＬＶ−１（ＴＡＸ）：ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（配列番号５）；ｈＴＥＲＴ（５４０）：ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号６）；ｈＴＥＲＴ（８６５）：ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号７）である。
図２Ａ−ＢはｓｃＨＬＡ−Ａ２／ｇｐ１００複合体へのモノクローナルファージクローンの異なる結合を示す棒グラフを示す。ｇｐ１００由来エピトープと複合体形成した固定化ｓｃＨＬＡ−Ａ２への結合についてモノクローナルファージを試験した。図２Ａ−Ｇ９−２０９Ｍ；図２Ｂ−Ｇ９−２８０Ｖ。上記図１に記載のようにアッセイを行った。
図３Ａは抗体Ｇ１ｓｃＦｖの核酸配列（配列番号８）およびアミノ酸配列（配列番号９）を示す。ＣＤＲを太字で示し、ＶＨおよびＶＬドメインに連結したペプチドリンカーに下線を引いている。
図３Ｂ−Ｃは精製Ｇ１ｓｃＦｖおよびＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ｇ１ ｓｃＦｖ遺伝子を、ＰＣＲによってファージクローンからレスキューし、ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩクローニング部位を介してファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ６にサブクローニングした。Ｍｙｃおよびヘキサヒスチジンタグを、ｓｃＦｖ遺伝子のＣ末端に融合した。以前に記載のように（２９）ＢＬ２１ λＤＥ３細胞中でｓｃＦｖ抗体を発現させ、金属イオンアフィニティクロマトグラフィによってペリプラズム画分から精製した。Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８融合タンパク質の発現のために、ｓｃＦｖ遺伝子をＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてＰＥの転位およびＡＤＰ−リボシル化ドメイン（ＰＥ３８）をコードするプラスミドｐＩＢ−ＮＮにサブクローニングした。ＢＬ２１ λＤＥ３細胞での発現、封入体からの再折りたたみ、およびＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の精製を、以前に記載のように行った（３０）。
図４はＧ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の結合特異性を示す棒グラフである。免疫プレートに、記載のように種々の表示のｓｃＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体でコートし、固定化複合体へのＧ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の結合を、抗ＰＥ抗体を使用して検出した。
図５Ａ−ＢはＴＣＲ様Ｇ１ ｓｃＦｖの結合特性を証明するプロットを示す。５Ａ−精製された可溶性Ｇ１ ｓｃＦｖの滴定ＥＬＩＳＡ。ウェルに以下のｌ実施例に記載のＭＨＣ−ペプチド複合体をコートした。５Ｂ−精製されたＧ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８のＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２０９Ｍ複合体への１２５Ｉ標識Ｇ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の結合を阻害する能力の競合結合分析。組換えｓｃＦｖの見かけ上の結合親和性を、^１２５Ｉ標識トレーサーの結合の５０％阻害に必要な競合物質（可溶性精製Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８）の濃度として決定した。可撓性ＥＬＩＳＡプレートにＢＳＡ−ビオチンをコートし、ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体（１００μｌ中１０μｇ）を以前に記載のように固定した。組換えＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８を、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を使用して［^１２５Ｉ］で標識した。標識タンパク質を、競合物質として漸増濃度の冷Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の存在下でトレーサーとしてウェルに添加し（３〜５×１０^５ＣＰＭ／ウェル）、ＰＢＳ中にて室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで完全に洗浄し、結合放射能をγカウンターで決定した。Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の見かけ上の親和性を、固定ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体への［^１２５Ｉ］標識Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８結合の５０％阻害の達成に必要な競合物質濃度の推定によって決定した。非特異的結合を、２０〜４０倍過剰の非標識Ｆａｂの添加によって決定した。
図６Ａ−ＣはＧ１ ｓｃＦｖのＡＰＣへの結合を証明するプロットを示す。ＲＭＡＳ−ＨＨＤまたはＪＹ細胞を、表示のＨＬＡ−２Ａ拘束性ペプチドと共に負荷した。次いで、ペプチド負荷細胞を、可溶性精製Ｇ１ｓｃＦｖ抗体とインキュベートした。ＦＩＴＣ標識抗Ｍｙｃを使用して結合を検出した。ＰＭＡＳ−ＨＨＤ細胞をＧ９−２０９およびＧ９−２８０ペプチドと共に負荷し、コントロール非負荷細胞である抗ＨＬＡ抗体ｗ６／３２（６Ａ）または抗ＨＬＡ−Ａ２抗体ＢＢ７．２（６Ｂ）と共に染色して、負荷したペプチド表面でＨＬＡ−Ａ２複合体の安定化／発現が証明されたが、ペプチド非負荷細胞では証明されなかった。Ｇ９−２０９またはＧ９−２０８ペプチド負荷細胞をＧ１ ｓｃＦｖで染色し、分染を示す（６Ｃ）。単鎖β２Ｍ−ＨＬＡ−Ａ２遺伝子（２６）またはＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球ＪＹ細胞（１０^６細胞）でトランスフェクトしたＢ細胞株ＲＭＡＳ−ＨＨＤを無血清ＲＰＭＩで２回洗浄し、１００μＭのペプチドを含む培地中にて２６℃または３７℃でそれぞれ一晩インキュベートした。その後、ＡＰＣを３７℃で２〜３時間インキュベートしてＭＨＣ−ペプチド複合体の細胞表面発現を安定化し、その後１００μｌの組換えｓｃＦｖ（１０〜５０μｇ／ｍｌ、６０〜９０分間、４℃）とインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗Ｍｙｃ抗体とインキュベートし（３０〜４５分間、４℃）、最後に洗浄してＦＡＣＳｔａｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。黒色腫細胞に、３７℃で１〜１０μＭのペプチドをパルスし、本明細書中に記載のようにｓｃＦｖで染色した。
図７Ａ−Ｃはペプチド負荷ＡＰＣに対するＧ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の細胞傷害活性を証明するプロットおよび棒グラフである。ＲＭＡＳ−ＨＨＤ（７Ａ）またはＪＹ（７Ｂ）細胞を、表示のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドと共に負荷し、その後漸増濃度のＧ１ ｓｃＦｖーＰＥ３８とインキュベートした。細胞タンパク質への^３Ｈ−ロイシン取り込みによってタンパク質合成を決定した。（７Ｃ）では、過剰（０．１５〜０．２５ｍｇ／ｍｌ）の表示のｓｃＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体をウェルに添加し、その後Ｇ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８（２５〜５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。上記のように、ＲＭＡＳ−ＨＨＤおよびＪＹ ＡＰＣをＧ９−２０９ペプチドおよびコントロールペプチドと共に負荷した。その後、ペプチド負荷細胞を漸増濃度のＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８とインキュベートし、以前に記載のように（３０）細胞タンパク質の^３Ｈ−ロイシン取り込みの測定によってタンパク質合成阻害を決定した。タンパク質合成の５０％阻害に必要なＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８濃度としてＩＣ_５０を決定した。競合アッセイでは、過剰の特異的および非特異的ＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体（３５〜５０μｇ／ウェル）を１５分間ウェルに添加し、その後Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８を添加した。

本発明は、Ｔ細胞受容体の特異性および高親和性を有する抗体、免疫毒素および免疫標識を作製するための同定可能部分および／または治療部分とのその抱合体、前記抗体および抱合体の作製方法、前記抗体および抱合体をコードするポリヌクレオチド、ならびに癌、ウイルス感染、および自己免疫疾患の検出および治療における前記抱合体の使用方法に関する。

本発明の原理および操作は、図面および添付の説明を参照してより深く理解することができる。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は以下の説明に記載されるか実施例で例示される詳細にその適用が制限されないと理解すべきである。本発明は、他の実施形態が可能であるか、種々の方法で実施または実行することができる。また、本明細書中で使用した用語および専門用語は説明を目的とし、制限と見なすべきではないと理解すべきである。

免疫系は、ペプチド／主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を特異的に認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって調節および制御される。

組換えクラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体およびその四量体アレイの適用の出現により、現在、抗原特異的Ｔ細胞の稀な集団を検出および研究することができる（２５，３５，３６）。しかし、抗原（ＭＨＣ−ペプチド）提示の表現型（別の見方では、ＭＨＣ−ペプチド−ＴＣＲ相互作用）の分析が可能な試薬の欠如のために、一般的な免疫学における基本的問題および抗原提示に関する特定の腫瘍免疫学における問題は未解決である。このような試薬を作製する１つの方法は、ＴＣＲ様抗体の作製によるが、ハイブリドーマテクノロジーなどの従来の手段による自己ＭＨＣ拘束性抗体の作製に関する刊行物はほんの僅かしか報告されていない（１３−１６）。これらの過去の困難の主な理由を、ＭＨＣ−ペプチド複合体の分子の性質および解析された構造において見出すことができる。より詳細には、ペプチドはＭＨＣ結合溝内に深く埋もれ、それによりＭＨＣ残基と混ざりあったペプチド残基の広範なモザイクとして現れている。１００〜３００Å^２しか外側に面していないクラスＩＭＨＣ結合ペプチドを直接認識に利用可能であり、抗体認識タンパク質分子は約８００Å^２のそのリガンドと結合する（１７）。したがって、ＴＣＲ様抗体を作製する場合、これらの分子はおそらくペプチドを認識するが、ＭＨＣにも支配されなければならない。

これまで、種々の免疫化ストラテジーを使用してマウスＭＨＣ−ペプチド複合体に対してＴＣＲ様特異性を有する抗体が作製されている（１７）。最近、巨大なヒトＦａｂライブラリーを使用して、ＨＬＡ−Ａ１−ＭＡＧＥ−Ａ１特異的結合抗体が選択された（１８）。ＴＣＲ様特異性を示すが２５０ｎＭの比較的低い親和性を示す１つの特異的クローンであるＧ８が選択された。

本発明の実施により、マウスｓｃＦｖフラグメントの免疫レパートリーからヒトＴ細胞エピトープに指向する高親和性抗体を選択する能力を証明した。

本発明の態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体の産生方法を提供する。本発明のこの態様による方法を、（ｉ）ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩを発現する細胞を有する遺伝子操作された非ヒト哺乳動物をＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成された可溶性形態のＭＨＣクラスＩ分子で免疫化することと、（ｉｉ）非ヒト哺乳動物の抗体産生細胞（脾臓細胞など）からｍＲＮＡ分子を単離することと、（ｉｉｉ）前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子をディスプレイするファージディスプレイライブラリーを産生することと、（ｉｖ）前記ファージディスプレイライブラリーから少なくとも１つのファージを単離することと、少なくとも１つの前記ファージがＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと１０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体をディスプレイすることとによって行う。次いで、本明細書中の以下にさらに記載のように、ファージ単離物の遺伝物質を使用して単鎖抗体または他の抗体形態を調製した。以下にさらに記載のようにファージ単離物の遺伝物質を使用して単鎖抗体または他の抗体形態を調製し、認識可能部分または治療部分に抱合する。好ましくは、非ヒト哺乳動物は、自己ＭＨＣクラスＩ分子を欠く。さらに好ましくは、ＭＨＣＩ分子の可溶性形態は、機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖アミノ酸配列に直接または間接的に共有結合した機能的ヒトβ−２ミクログロブリンアミノ酸配列を含む単鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドである。

したがって、本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む単離分子を提供する。このような抗体は、なおさらに高いＴ細胞受容体特異性を有する。１つの非限定的な例では、抗体は、例えば、配列番号８に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する単鎖抗体である。

一旦本明細書中に記載のＴ細胞受容体特異性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドがクローン化されると、関連産物のスペクトルを得るための多数の方法の１つにおいて改変することができる。

１つの例では、同定可能な部分に抱合したＴ細胞受容体特異性を有する抗体（免疫標識）を産生するために、Ｔ細胞受容体特異性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを同定可能な部分をコードする第２のポリヌクレオチドにライゲーションする。このような抱合体または免疫標識を、細胞サンプル中のＨＬＡ拘束性抗原を提示する抗原提示細胞の存在および／またはレベルの検出方法で使用し、癌、ウイルス感染、または自己免疫疾患に使用することができる。本明細書中で使用される、語句「抗原提示細胞」には、ＨＬＡ拘束性抗原を提示することができるその表面上にＭＨＣクラスＩ分子を発現する全ての細胞が含まれる。抗原提示細胞は、癌細胞、免疫系の細胞、またはその表面上にＭＨＣクラスＩ分子を発現する任意の他の細胞であり得る。

したがって、本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体をコードする第１のポリヌクレオチドをインフレームで同定可能な部分をコードする第２のポリヌクレオチドとライゲーションしてライゲーションされたポリヌクレオチドを得る工程と、ライゲーションした前記ポリヌクレオチドを発現系で発現させて免疫標識を得る工程とを含む、免疫標識の作製方法を提供する。

さらに、本発明のさらに別の態様によれば、サンプルの細胞をＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体と相互作用させる工程と、相互作用をモニタリングしてＨＬＡ拘束性抗原を提示する抗原提示細胞の存在および／またはレベルを検出する工程とを含む、細胞サンプル中のＨＬＡ拘束性抗原を提示する抗原提示細胞の存在および／またはレベルの検出方法を提供する。

適用に依存して、ＨＬＡ拘束性抗原は、腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原、ウイルスＨＬＡ拘束性抗原、および自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原（例を以下に記載する）であり得る。

本発明のさらに別の態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含み、前記分子は前記抗体に抱合した同定可能部分をさらに含む診断組成物を提供する。

同定可能部分は、さらなる結合対のメンバーとのその相互作用を介して同定可能な結合対のメンバーおよび直接視覚化される標識であり得る。１つの例では、結合対のメンバーは、対応する標識化抗体によって同定される抗原である。１つの例では、標識は、蛍光タンパク質または比色反応を示す酵素である。

別の例では、Ｔ細胞受容体特異性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドに治療部分をコードする第２のポリヌクレオチドをライゲーションして、治療部分に抱合したＴ細胞受容体特異性を有する抗体を産生する。このような抱合体または免疫毒素を、癌、ウイルス感染、または自己免疫疾患の治療方法で使用することができる。

したがって、本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体をコードする第１のポリヌクレオチドをインフレームで毒素部分をコードする第２のポリヌクレオチドとライゲーションしてライゲーションされたポリヌクレオチドを得る工程と、ライゲーションした前記ポリヌクレオチドを発現系で発現させて免疫毒素を得る工程とを含む、免疫毒素の作製方法を提供する。

免疫毒素を以下の治療プロトコールの任意の１つで使用することができる。

（ｉ）癌を特徴づける腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む有効量の分子を必要とする被験体に投与する工程と、前記分子が抗体に抱合した治療部分をさらに含み、被験体の内因性ＭＨＣクラスＩと適合するＭＨＣクラスＩ分子が選択されることとを含む、癌の治療方法。

（ｉｉ）ウイルス感染に起因するウイルスを特徴付けるウイルスＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む有効量の分子を必要とする被験体に投与する工程と、前記分子が抗体に抱合した治療部分をさらに含み、被験体の内因性ＭＨＣクラスＩと適合するＭＨＣクラスＩ分子が選択されることとを含む、ウイルス感染の治療方法。

（ｉｉｉ）自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む有効量の分子を必要とする被験体に投与する工程と、前記分子が抗体に抱合した治療部分をさらに含み、被験体の内因性ＭＨＣクラスＩと適合するＭＨＣクラスＩ分子が選択されることとを含む、自己免疫疾患の治療方法。

本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む治療有効量の分子を含み、前記分子は前記抗体に抱合する治療部分をさらに含む薬学的組成物を提供する。好ましくは、薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む。

治療部分は、例えば、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、および二重特異性抗体部分（その例を以下に示す）であり得る。

全ての適用では、ＭＨＣクラスＩは、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８であり得る。

以下の節は、本明細書中に記載の本発明のそれぞれの種々の態様についての特定の例および代替物を提供する。本発明を類似の、さらにいくらか異なる方法で実施することができるので、これらの例および代替物は、決して制限と見なすべきではない。しかし、これらの例は、当業者に本発明の種々の変更形態および実施形態をどのようにして実施するのかを教示する。

抗体：本発明を説明するために使用される、用語「抗体」には、インタクトな分子ならびにＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩに特異的且つ高親和性で結合することができるその機能的フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖなど）が含まれる。これらの機能的抗体フラグメントは、以下のように定義される：（ｉ）Ｆａｂ（抗体分子の１価の抗原結合フラグメントを含み、全抗原の酵素パパインでの消化によってインタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部を得ることができるフラグメント）；（ｉｉ）Ｆａｂ’（ペプシンでの全抗体の処理によって得ることができ、その後還元によってインタクトな軽鎖および重鎖の一部が得られる抗体分子のフラグメント）；（ｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２（全抗体を酵素ペプシンで処置しその後還元しないで得ることができる抗体のフラグメント）；Ｆ（ａｂ’）_２は２つのジスルフィド結合によって互いに保持された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である；（ｉｖ）Ｆｖ（２つの鎖として発現した軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される）；および（ｃ）ｓｃＦｖまたは「単鎖抗体」（「ＳＣＡ」）（遺伝的に融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子）。

これらのフラグメントの作製方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。

抗体のタンパク質分解作用による加水分解またはフラグメントをコードするＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉもしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）での発現によって本発明の抗体フラグメントを調製することができる。

従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって抗体フラグメントを得ることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２と呼ばれる５Ｓフラグメントを得るためのペプシンでの抗体の酵素切断によって抗体フラグメントを産生することができる。このフラグメントをチオール還元剤を使用してさらに切断し、任意選択的にジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基のために基をブロッキングして３．５ＳＦａｂ’の１価のフラグメントを得ることができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素切断により、２つの１価のＦａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接得られる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇに付与された米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号ならびにこれらに含まれる引例（特許全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９−１２６，１９５９もまた参照のこと。フラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、１価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素、化学、もしくは遺伝的技術などの他の抗体切断方法もまた使用することができる。

Ｆｖフラグメントは、Ｖ_Ｈ鎖とＶ_Ｌ鎖との結合を含む。Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９−６２，１９７２に記載のように、この結合は非共有結合であり得る。あるいは、グルタルアルデヒドなどの化学物質による分子間ジスルフィド結合または架橋によって可変鎖を連結することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって連結されたＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）を、オリゴヌクレオチドによって連結したＶ_ＨおよびＶ_ＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子の構築によって調製する。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、その後Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に移入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを含む１つのポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖの産生方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ ａｎｄ Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：９７−１０５，１９９１；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８；Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１−７７，１９９３；およびＬａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第４９４６７７８号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。

抗体フラグメントの別の形態は、１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子の構築によってＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）を得ることができる。このような遺伝子を、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡ由来の可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応の使用によって調製する。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ａｎｄ Ｆｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６−１０，１９９１を参照のこと。

非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリンのキメラ分子、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリン由来の模倣配列を含むそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、または抗体の他の抗原結合サブシーケンスなど）である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基を所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置換したヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基に置換する。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体や導入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。

ヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含む［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。

非ヒト抗体のヒト化方法は当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源由来のアミノ酸残基に移入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば導入残基と呼ばれ、典型的には導入可変ドメインから得られる。げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列のヒト抗体の対応する配列への置換によるＷｉｎｔｅｒ ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従ってヒト化を本質的に行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的にインタクト未満のヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列に置換されたキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基に置換されたヒト抗体である。

当該分野で公知の種々の技術（ファージディスプレイライブラリーを含む）を使用してヒト抗体を産生することもできる［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］。ヒトモノクローナル抗体の調製のためのＣｏｌｅ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．の技術も利用可能である（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、トランスジェニック動物（例えば、外因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているマウス）へのヒト免疫グロブリン遺伝子座の移入によってヒトを作製することができる。攻撃誘発時に、遺伝子の再配置、構築、および抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトで認められる非常に類似しているヒト抗体産生が認められている。このアプローチは、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および以下の科学刊行物：Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５−９３（１９９５）に記載されている。

一旦抗体のＣＤＲが同定されると、従来の遺伝子操作技術を使用して、本明細書中に記載の抗体の任意の形態またはフラグメントをコードする発現可能なポリヌクレオチドを考案することができることが認識される。

主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ：ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、マウスおよびヒトでのＨＬＡにおいて集合的にＨ−２と呼ばれる連結した遺伝子座群によってコードされる抗原の複合体である。２つの主要なＭＨＣ抗原クラス（クラスＩおよびクラスＩＩ）は、それぞれ組織型および移植片の適合性の決定で役割を果たす一組の細胞表面糖タンパク質を含む。移植反応では、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は主に外来のクラスＩ糖タンパク質に応答し、ヘルパーＴ細胞は主に外来のクラスＩＩ糖タンパク質に応答する。

主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子は、ほぼ全ての細胞表面で発現される。これらの分子は、αβＴ細胞受容体との相互作用を介した主に内因性に合成されたタンパク質由来のペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞への提示において機能する。クラスＩＭＨＣ分子は、１２ｋＤａ軽鎖β−２ミクログロブリンと非共有結合した４６ｋＤａ重鎖から構成されるヘテロ二量体である。ヒトでは、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８などのいくつかのＭＨＣハプロタイプが存在し、その配列は、ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／のｋａｂｂａｔデータベース（本明細書中で参考として援用される）で見出すことができる。

クラスＩ ＭＨＣ分子に結合するペプチド；ＨＬＡ拘束性抗原：典型的には８〜１０アミノ酸長のクラスＩ ＭＨＣ拘束性ペプチド（本明細書中で交換可能にＨＬＡ拘束性抗原、ＨＬＡ拘束性ペプチド、ＭＨＣ拘束性抗原ともいう）は、ＭＨＣ分子中の対応する結合ポケットと相互作用する２つまたは３つのアンカー残基を介して重鎖α１−α２溝に結合する。β−２ミクログロブリン鎖は、ＭＨＣクラスＩ細胞内輸送、ペプチド結合、および高次構造の安定性において重要な役割を果たす。ほとんどのクラスＩ分子について、ＭＨＣクラスＩ重鎖、ペプチド（自己または抗原）、およびβ−２ミクログロブリンからなるヘテロ二量体の形成は、生合成の成熟および細胞表面発現に必要である。

クラスＩ ＭＨＣ分子へのペプチドの結合における研究により、潜在的に免疫原性のウイルス、腫瘍、および自己抗原由来のペプチドのディスプレイで機能的な特異的ＭＨＣモチーフを定義することができ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）からの特異的応答を誘発することができる。

本明細書中で使用される、用語「ペプチド」は、天然のペプチド（分解産物または合成ペプチドのいずれか）、さらに、例えば、ペプチドをより安定にする一方で体内ではより高い免疫原性を示す改変を有し得るペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドなどのペプチド模倣物をいう。このような改変には、環状化、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾（ＣＨ_２−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｓ、ＣＨ_２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｏ、ＣＨ_２−ＣＨ_２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨが含まれるが、これらに限定されない）、骨格修飾、および残基修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣物の調製方法は当該分野で周知であり、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２、Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）（本明細書中に完全に記載されているように参考として援用される）に記載されている。これに関するさらなる詳細を以下に示す。

本明細書中および以下の特許請求の範囲で使用される、用語「アミノ酸」は、２０種の天然に存在するアミノ酸（これらのアミノ酸はしばしばｉｎ ｖｉｖｏで翻訳後に修飾される（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン、およびホスホトレオニンが含まれる）；ならびに他の例外的なアミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチンが含まれるが、これらに限定されない）を含むと理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ型およびＬ型アミノ酸が含まれる。本発明で使用可能なアミノ酸のさらなる詳細およびＭＨＣ−Ｉ ＨＬＡ−Ａ２認識可能なペプチド抗原で有用な非天然アミノ酸の例を、以下に記載する。

蓄積された実験データに基づいて、現在、タンパク質のどのペプチドがＭＨＣクラスＩに結合するかを予想することが可能である。ＨＬＡ−Ａ２ ＭＨＣクラスＩは、現時点では、他のＨＬＡハプロタイプよりも良好に特徴付けられており、さらに予想および／または散発的データは、全ての他のハプロタイプで利用可能である。

ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドに関して、９量体ペプチド中以下の位置を仮定する：
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｐ７−Ｐ８−Ｐ９。

Ｐ２およびＰ２の位置は、ＭＨＣ分子への結合に関与する主な残基であるアンカー残基を含む。Ｐ２位およびＰ９位で結合するアミノ酸残基は、親水性脂肪族非電荷天然アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、好ましくはＶａｌおよびＬｅｕ）または非天然親水性脂肪族非電荷アミノ酸（例えば、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、α−アミノ酪酸）である。Ｐ１位およびＰ３位は、ＭＨＣ分子への結合に関与するか補助するアミノ酸残基を含むことも公知であるが、これらの位置は、天然または非天然のアミノ酸を含むことができる。他の位置は、典型的には、結合に関与しないアミノ酸残基によって結合され、むしろこれらの残基は免疫細胞に提示される。ＭＨＣ分子へのペプチドの結合に関するさらなる詳細を、Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ．，Ｂｅｄｎａｒｅｋ，Ｍ．Ａ．，Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｒａｎｋｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＨＬＡ−Ａ２ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，１６３−１７５，１９９４（とくに、表Ｖを参照のこと）に見出すことができる。したがって、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブインターフェースからアプローチ可能なＨＬＡペプチド結合推定ソフトウェアを使用してＨＬＡ−Ａ２．１結合ペプチドをスコアリングすることができる。このソフトウェアは、ペプチド中の全アミノ酸の寄与によるＭＨＣ ＨＬＡ−Ａ２．１への結合可能性についての分析タンパク質中の全ての可能なペプチドの蓄積データおよびスコアに基づく。理論的結合スコアは、ＨＬＡ−Ａ２．１−ペプチド複合体の計算された半減期を示す。

Ｐ２およびＰ９での親水性脂肪族天然アミノ酸を、合成アミノ酸（好ましくは、Ｎｌｅｕ、Ｎｖａｌ、および／またはα−アミノ酪酸）に置換することができる。Ｐ９を、一般式−ＨＮ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ（式中、ｎ＝３〜５）の脂肪族アミノ酸ならびにその分岐誘導体（

（式中、Ｒは、例えば、任意の１つまたは複数のｎ炭素に存在するメチル、エチル、またはプロピルである）などが含まれるが、これらに限定されない）に置換することもできる。

アミノ末端残基（Ｐ１位）を、正電荷の脂肪族カルボン酸（Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ（式中、ｎ＝２〜４）およびＨ_２Ｎ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ（式中、ｎ＝２〜３）などであるが、これらに限定されない）ならびにヒドロキシリジン、Ｎ−メチルリジン、またはオルニチン（Ｏｒｎ）に置換することができる。さらに、アミノ末端残基を、拡大した芳香族残基（Ｈ_２Ｎ−（Ｃ_６Ｈ_６）−ＣＨ_２−ＣＯＯＨ、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｈ_２Ｎ−Ｆ（ＮＨ）−ＮＨ−（Ｃ_６Ｈ_６）−ＣＨ_２−ＣＯＯＨ、ｐ−グアニジノフェニルアラニン、またはピリジノアラニン（Ｐａ１）などであるが、これらに限定されない）に置換することができる。これらの後者の残基は、ＭＨＣ−１ Ｎ末端結合ポケットでチロシン残基のＯＨ⁻部分と水素結合を形成すると同時に芳香族−芳香族相互作用を得ることができる。

Ｐ４−Ｐ８位でのアミノ酸残基の誘導により、これらの残基（Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、ＣｙｓまたはＯｒｎなど）は、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ_２などの側鎖を有するはずであり、アルキル、アリール、アルカノイル、またはアロイルにより得る。さらに、これらの位置でのＯＨ基もまた、リン酸化および／またはグリコシル化によって誘導することができる。これらの誘導は、いくつかの場合、Ｔ細胞受容体への結合を増強することが示されている。

第２のアンカーアミノ酸がＰ１０位に存在するより長い誘導体は、Ｐ９にほとんどのＬ型アミノ酸を含み得る。いくつかの場合、Ｃ末端の酸が第２のアンカー残基として作用するより短い誘導体もまた適用可能である。

環状アミノ酸誘導体は、Ｐ４位〜Ｐ８位、好ましくはＰ６位およびＰ７位で結合することができる。例えば、鎖中の種々の位置でのＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）の組み込みによるアミド結合（−ＣＯ−ＮＨ結合または−ＮＨ−ＣＯ結合）の形成によって環状化することができる。式Ｈ−Ｎ（（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＯＨ）−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＣＯＯＨまたはＨ−Ｎ（（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＯＨ）−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＮＨ_２（ｎ＝１〜４、さらに、Ｒはアミノ酸の任意の天然または非天然側鎖である）の修飾アミノ酸の組み込みによって、骨格−骨格環状化を得ることもできる。

２つのＣｙｓ残基の組み込みによるＳ−Ｓ結合形成を介した環状化も可能である。例えば、ＣｙｓまたはホモＣｙｓの組み込みおよび例えばブロモアセチル化Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、またはＤａｐとのその遊離ＳＨ基の反応による式−（−ＣＨ_２−）_ｎ−Ｓ−ＣＨ_２−Ｃ−（式中、ｎ＝１または２）の相互作用結合の形成によって側鎖環状化にさらなる側鎖を得ることができる。

ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を、Ｎメチル化結合（−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ_２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは、任意のアルキル（例えば、メチル））、カルバ結合（−ＣＨ_２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ_２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子上に天然に存在する「通常の」側鎖である）に置換することができる。

これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った任意の結合で起こり、これは数個（２〜３個）同時に起こり得る。好ましくは、全ての場合で必要ではないが、これらの修飾はアンカーアミノ酸を排除すべきである。

天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ）を、ＴＩＣ、ナフチルアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成非天然酸に置換することができる。

腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原：以下の表で引用された引例は、ヒトＭＨＣクラスＩ、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来の腫瘍ＨＬＡ拘束性ペプチド、または種々の癌と結合したタンパク質マーカーを提供する。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のさらなる腫瘍ＨＬＡ拘束性ペプチドは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ／で見出すことができる。

ウイルスＨＬＡ拘束性抗原：以下の表で引用した引例は、種々の癌に関連するウイルス抗原由来のヒトＭＨＣクラスＩウイルスＨＬＡ拘束性ペプチドの例を提供する。

自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原：ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ／は、自己免疫抗原従来のヒトＭＨＣクラスＩ自己免疫ＨＬＡ拘束性ペプチドの例を提供する。

可溶性ＭＨＣクラスＩ分子：可溶性であり、且つ大量に産生することができる組換えＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ複合体は、例えば、引例２３、２４、および４１〜５３ならびにさらに米国特許出願第０９／５３４９６６号およびＰＣＴ／ＩＬ０１／００２６０号（ＷＯ０１／７２７６８号として公開）（そのすべてが本明細書中に参考として援用される）に記載されている。可溶性ＭＨＣクラスＩ分子を利用可能であるか、例えば、ＰＣＴ／ＩＬ０１／００２６０号の教示にしたがって任意のＭＨＣハプロタイプ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８など）（その配列は公知であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／のｋａｂｂａｔデータベース（サイトの内容は本明細書中で参考として援用される）で見出すことができる）を産生することができる。以下にさらに詳述するように、このような可溶性ＭＨＣクラスＩ分子を、適切なＨＬＡ拘束性抗原と共に負荷し、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩを発現する細胞を有する非ヒト哺乳動物のワクチン接種に使用することができる。

ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩを発現する細胞を有する非ヒト哺乳動物：ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩを発現し、且つ自己主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩを欠く細胞を有する非ヒト哺乳動物を、以下を使用して産生することができる：（ｉ）本明細書中で参考として援用され、且つヒトＭＨＣハプロタイプ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８など）に関するｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／のｋａｂｂａｔデータベースで提供される配列情報、（ｉｉ）例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）に記載の従来の構築物調製技術、および（ｉｉｉ）例えば、米国特許第５４８７９９２号、同第５４６４７６４号、同第５３８７７４２号、同第５３６０７３５号、同第５３４７０７５号、同第５２９８４２２号、同第５２８８８４６号、同第５２２１７７８号、同第５１７５３８５号、同第５１７５３８４号、同第５１７５３８３号、同第４７３６８６６号、国際公開ＷＯ９４／２３０４９号、ＷＯ９３／１４２００号、ＷＯ９４／０６９０８号、およびＷＯ９４／２８１２３号、ならびにＢｕｒｋｅ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２５１−２７０，１９９１；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２，１９８９；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０（１１）２６９３−２６９８，１９９２；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２（８）：１２９９−１３０２，１９９３；Ｄｕｆｆ ａｎｄ Ｌｉｎｃｏｌｎ，“Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＡＰＰ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ”，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，１９９５；Ｈｕｘｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，９：７４２−７５０ １９９１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２６１，１９９３；Ｌａｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５：２２−２９，１９９３；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｃｈｏｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：１０５７８−８２；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２８１−３０１，１９９１；Ｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５８−２６１，１９９３；Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１９０４−１９０７，１９９３（その全てが本明細書中で参考として援用される）に記載の従来の遺伝子ノックイン／ノックアウト技術。ヒトＨＬＡ−Ａ２．１、Ｈ２Ｄｂ、およびＨＨＤ ＭＨＣクラスＩ分子を発現し、且つマウスＭＨＣクラスＩを欠くマウスの調製を記載したＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２０４３−２０５１，１９９７で発表されたＰａｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．の論文が特に興味深い。

同定可能部分：いくつかの態様では、本発明は、抗体と同定可能部分との抱合体を使用する。この目的を達成するために、１つの例では、免疫標識をコードさせるために抗体および同定可能部分をそれぞれコードする第１および第２のポリヌクレオチドをインフレームでライゲーションする。以下の表は、同定可能部分の配列の例を提供する。

治療部分：いくつかの態様では、本発明は、抗体と治療部分との抱合体を使用する。この目的を達成するために、１つの例では、免疫毒素をコードさせるために抗体および治療部分をそれぞれコードする第１および第２のポリヌクレオチドをインフレームでライゲーションする。以下の表は、治療部分の配列の例を提供する。

化学的抱合体：ペプチドを含む異なる分子型を抱合または融合（結合）するための多数の方法が当該分野で公知である。本発明にしたがってこれらの方法を使用して、治療部分または同定可能部分などの抗体の別の部分を結合させることにより、免疫毒素または免疫標識を得ることができる。

２つの単離ペプチドを、当業者に公知の任意の抱合方法を使用して抱合または融合することができる。３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−スクシンイミジル３−（ピリジルジチオ）プロピオネート（「ＳＤＰＤ」）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−３４１５）とも呼ばれる）、グルタルアルデヒド抱合手順、またはカルボジイミド抱合手順を使用して、ペプチドを目的の抗体に抱合することができる。

ＳＰＤＰ抱合：当業者に公知の任意のＳＰＤＰ抱合を使用することができる。例えば、１つの例示的実施形態では、下記のＣｕｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．の修飾（１９８５、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１２：２０７−２２４）を使用する。

同定可能部分または治療部分などのペプチド（１．７ｍｇ／ｍｌ）を、１０倍過剰のＳＰＤＰ（５０ｍＭのエタノール溶液）と混合し、抗体を２５倍過剰のＳＰＤＰの２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（０．１０Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ７．２）と混合し、各反応物を例えば、室温で３時間インキュベートした。次いで、反応物を、ＰＢＳに対して透析する。

ペプチドを、例えば、５０ｍＭ ＤＴＴにて室温で１時間還元する。還元ペプチドを、５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ６．５）を使用したＧ−２５カラム（５％までのサンプル／カラム体積）での平衡化によって脱塩する。還元ペプチドを、１：１０の抗体：ペプチドのモル比でＳＰＤＰ−抗体と合わせ、４℃で一晩インキュベートしてペプチド−抗体抱合体を形成させる。

グルタルアルデヒド抱合体：グルタルアルデヒドを使用した当業者に公知の方法によって、ペプチド（例えば、同定可能部分または治療部分）を抗体と抱合することができる。例えば、１つの例示的実施形態では、下記のＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎによる抱合方法（１９９６、“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”）を使用する。

抗体およびペプチド（１．１ｍｇ／ｍｌ）を１０倍過剰の０．０５％グルタルアルデヒドの０．１Ｍリン酸塩溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ６．８）と混合し、室温で２時間反応させた。０．０１Ｍのリジンを添加して、過剰部位をブロックすることができる。反応後、ＰＢＳ（１０％ｖ／ｖサンプル／カラム体積）で平衡化したＧ−２５カラムを使用して、過剰なグルタルアルデヒドを除去した。

カルボジイミド抱合体：カルボジイミドなどの脱水剤を使用した当業者に公知の方法によってペプチドを抗体と抱合することができる。４−ジメチルアミノピリジンの存在下でカルボジイミドを使用することが最も好ましい。当業者に周知のように、カルボジイミド抱合を使用して、ペプチドのカルボキシル基と抗体の水酸基（エステル結合が形成される）、抗体のアミノ基（アミド結合が形成される）、または抗体のスルフヒドリル基（チオエステル結合が形成される）との間に共有結合を形成することができる。

同様に、カルボジイミド結合を使用して、抗体の炭素基とペプチドの水酸基、アミノ基、またはスルフヒドリル基との間に類似の共有結合を形成することができる。一般に、Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｒｉｏｎ’ｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．３４９−５０＆３７２−７４（３ｄ ｅｄ．），１９８５を参照のこと。例示として、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどのカルボジイミドを使用した共有結合を介してペプチドを抗体に抱合するが、これに制限されない。一般に、Ｂ．Ｎｅｉｓｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９７８，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１７：５２２）；Ａ．Ｈａｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４４７５）；Ｅ．Ｐ．Ｂｏｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：２３９４）、およびＬ．Ｊ．Ｍａｔｈｉａｓ（１９７９、Ｓｙｔｈｅｓｉｓ ５６１）による抱合方法を参照のこと。

本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴は、制限を意図しない以下の実施例の実験によって当業者に自明である。さらに、上記の本発明および以下の特許請求の範囲に記載の各々の種々の実施形態および態様は、以下の実施例の実験により支持される。

実施例
ここでは、上記説明と共に以下の実施例を参照して、非限定的様式で本発明を例示する。

一般に、本明細書中で使用した用語および本発明で使用した実験手順には、分子、生化学、微生物学、および組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４；Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、１９８９；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｗａｔｓｏｎら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら編、“Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１２９６５９号、および同第５２７２０５７号に記載の方法；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編、１９９４；“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”、Ｆｒｅｓｈｍｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ． Ｙ．、１９９４；第３版，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編、１９９４；Ｓｔｉｔｅｓら編、“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、第８版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ、１９９４；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ編、“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０を参照のこと；利用可能な免疫アッセイは、特許および化学論文に広く記載されており、例えば、米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号、および同第５２８１５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、１９８４；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編、１９８５；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編、１９８４；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編、１９８６；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、１９８４および“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、第１〜１３７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、１９９０；Ｍａｒｓｈａｋら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ”、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６（その全てが本明細書中に完全に記載されているかのように参照として援用される）を参照のこと。他の一般的引例を、本明細書中に記載する。引例中の手順は当該分野で周知であると考えられ、読者の都合のために記載する。引例中に含まれる全ての情報は、本明細書中で参考として援用される。

（材料と実験方法）ビオチン化ｓｃＭＨＣ／ペプチド複合体の産生：以前に記載のように（２３、２４、米国特許出願０９／５３４９６６号およびＰＣＴ／ＩＬ０１／００２６０号（ＷＯ０１／７２７６８として公開））、Ｅ．ｃｏｌｉ中に産生した封入体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの再折りたたみによって単鎖ＭＨＣ／ペプチド複合体を産生した。以前に記載のように（２５）、ＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を使用してビオチン化を行った。

マウスの免疫化：以前に記載のように（１７）、組換えＨＬＡ−Ａ２．１／Ｄ^ｂ−β２ミクログロブリン短鎖にトランスジェニックなＤ^ｂ−／−Ｘβ２ミクログロブリン（β２ｍ）ヌルマウス（ＨＨＤマウス）（２６）を、ＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２０９複合体に共有結合したツベルクリン（ＰＰＤ）の精製タンパク質由来ペプチドを含む乳濁液で免疫化した。簡単に述べれば、マウスを、２０〜３０μｇ／マウスの抗原性混合物を含むフロイント不完全アジュバントで最初に皮下に免疫化し、その後３〜５ヶ月間２週間間隔で皮下に免疫化した。最後の免疫化から２週間後に脾臓を採取した。

ビオチン化複合体に対するファージ−抗体のライブラリー構築および選択：記載のように（２７）免疫化マウスから全ＲＮＡを単離し、抗体ｓｃＦｖライブラリーを室温のＰＣＲによってｍＲＮＡから構築した。ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてｓｃＦｖレパートリーをｐＣＡＮＴＡＢ５ＥまたはｐＣＣ−ＣＢＤファージミドベクターにクローン化した（２８）。両ライブラリーの複雑度は、１×１０^８独立クローンであった。パニングのために、ビオチン化ｓｃＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２０９Ｍ複合体（２０μｇ）をストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（２×１０^８）とインキュベートし、洗浄し、１０^１１ｃｆｕのライブラリーとインキュベートした（室温で１時間）。第２ラウンドから開始し、過剰量（５μｇ）のｓｃＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２８０Ｖ複合体の存在下でパニングを行った。２％ＭＰＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ２０で１０〜１２回ビーズを十分に洗浄した。室温で５分間の１ｍｌのトリエチルアミン（１００ｍＭ、ｐＨ１２）の使用によって結合したファージを溶出し、その後０．１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和した。記載のように（２８）、溶出ファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞の指数関数的成長において拡大し、その後Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージで重感染させた。

可溶性組換えｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ−Ｐ３８融合タンパク質の発現および精製：ＰＣＲによってＧ１ ｓｃＦｖ遺伝子をファージクローンからレスキューし、ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩクローニング部位の使用によってファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ６にサブクローン化した。ＭｙｃおよびヘキサヒスチジンタグをｓｃＦｖ遺伝子のＣ末端に融合した。以前に記載のように（２９）ｓｃＦｖ抗体をＢＬ２１λＤＥ３細胞で発現させ、金属イオンアフィニティクロマトグラフィによってペリプラズム画分から精製した。Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８融合タンパク質の発現のために、ｓｃＦｖ遺伝子をＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてＰＥの転座およびＡＤＰ−リボシル化ドメイン（ＰＥ３８）をコードするプラスミドｐＩＢ−ＮＮにサブクローン化した。封入体から再折りたたみされたＢＬ２１λＤＥ３細胞の発現およびＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の精製を以前に記載のように行った（３０）。

ファージクローンおよび精製ｓｖＦｖまたはｓｃＦｖ−ＰＥ３８を使用したＥＬＩＳＡ：ビオチン化ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体を使用したＥＬＩＳＡによって結合特異性研究を行った。簡単に述べれば、ＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に、ＢＳＡ−ビオチン（１μｇ／ウェル）を一晩コートし、洗浄し、ストレプトアビジン（１μｇ／ウェル）とインキュベートし（室温で１時間）、再度十分に洗浄し、さらに０．５μｇのＭＨＣ／ペプチド複合体とインキュベートした（室温で１時間）。プレートをＰＢＳ／２％ミルクでブロックし（室温で３０分間）、ファージクローン（約１０^９ファージ／ウェル、室温で１時間）または０．５〜１μｇの可溶性ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−ＰＥ３８とインキュベートし、その後１０００倍希釈のＨＲＰ抱合／抗Ｍ１３、抗ｍｙｃ抗体、または抗ＰＥ抗体でそれぞれ洗浄した。特異性研究のために使用したＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドは、ｇｐ１００（１５４）：ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号１）；ｇｐ１００（２０９）：ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号２）；ｇｐ１００（２８０）：ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ（配列番号３）；ＭＵＣ１：ＬＬＬＴＶＬＴＶＬ（配列番号４）；ＨＴＬＶ−１（ＴＡＸ）：ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（配列番号５）；ｈＴＥＲＴ（５４０）：ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号６）；ｈＴＥＲＴ（８６５）：ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号７）である。

フローサイトメトリー：単鎖β２Ｍ−ＨＬＡ−Ａ２遺伝子（２６）でトランスフェクトしたＢ細胞株ＲＡＭＳ−ＨＨＤまたはＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球ＪＹ細胞（１０^６細胞）を、無血清ＲＰＭＩで２回洗浄し、１００μＭのペプチドを含む培地中で２６℃または３７℃でそれぞれ一晩インキュベートした。その後、ＡＰＣを３７℃で２〜３時間インキュベートしてＭＨＣ−ペプチド複合体の細胞表面発現を安定化し、その後１００μｌの組換えｓｃＦｖ（１０〜５０μｇ／ｍｌ、６０〜９０分間、４℃）とインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗Ｍｙｃ抗体とインキュベートし（４℃で３０〜４５分間）、最後に洗浄し、ＦＡＣＳｔａｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。

競合結合アッセイ：可撓性ＥＬＩＳＡプレートにＢＳＡ−ビオチンをコートし、ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体（１００μｌ中１０μｇ）をそれに固定した。組換えＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８を、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｍｔｅｒ試薬を使用して［^１２５Ｉ］で標識した。標識タンパク質を、競合物質として漸増濃度の冷Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の存在下でトレーサーとしてウェルに添加し（３〜５×１０^５ＣＰＭ／ウェル）、ＰＢＳ中にて室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで完全に洗浄し、結合放射能をγカウンターで決定した。Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の見かけ上の親和性を、固定ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体への［^１２５Ｉ］標識Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８結合の５０％阻害の達成に必要な競合物質濃度の推定によって決定した。非特異的結合を、２０〜４０倍過剰の非標識Ｆａｂの添加によって決定した。

細胞傷害性アッセイ：前に記載のように、ＰＭＡＳ−ＨＨＤまたはＪＹ ＡＰＣを、Ｇ９−２０９ペプチドおよびコントロールペプチドと共に負荷した。次いで、以前に記載のように（３０）、ペプチド負荷細胞を漸増濃度のＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８とインキュベートし、細胞タンパク質への^３Ｈ−ロイシンの取り込みの測定によってタンパク質合成阻害を決定した。タンパク質合成を５０％阻害するために必要なＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の濃度としてＩＣ_５０を決定した。競合アッセイでは、過剰量の特異的および非特異的ＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体（３５〜５０μｇ／ウェル）をウェルに１５分間添加し、その後Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８を添加した。

（実験結果）黒色腫ｇｐ１００由来のペプチドＧ９−２０９Ｍとの組換え単鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の作製：ｇｐ１００は、ほとんどの黒色腫細胞で発現する６６１個のアミノ酸からなるメラノサイト系統特異的膜糖タンパク質である（１９−２２）。このタンパク質は、黒色腫患者から単離された多数のＨＬＡ−Ａ２拘束性黒色腫反応性腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によって認識される（１９−２２）。ｇｐ１００においていくつかのＴ細胞ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープが同定されている；これらはＴ細胞の特異性を変化させることなく免疫原性を増大させるためにＭＨＣアンカーの位置が改良されている（３１）。Ｇ９−２０９Ｍ（ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号２））ペプチドは、３つの主要な免疫原性エピトープの１つである（１９−２２）。以前に記載されている（２３、２４、米国特許出願第０９／５３４９６６号およびＰＣＴ／ＩＬ０１／００２６０号（ＷＯ０１／７２７６８号として公開））Ｅ．ｃｏｌｉで発現する単鎖ＭＨＣ（ｓｃＭＨＣ）構築物の使用によって、Ｇ９−２０９Ｍペプチドを与える組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を作製した。Ｇ９−２０９Ｍまたは他のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドの存在下での封入体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの再折りたたみおよびその後のイオン交換クロマトグラフィを使用した精製プロトコールによってｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体を産生した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル濾過クロマトグラフィでの分析によって決定したところ、再折りたたみｇｐ１００由来のおよびコントロールｓｃＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体は、非常に純度が高く且つ均一な単量体であった。Ｇ９−２０９Ｍ含有ｓｃＨＬＡ−Ａ２複合体は、特異的ＣＴＬ株およびクローンを刺激し、四量体形態のＧ９−２０９Ｍ特異的Ｔ細胞を染色する能力によって機能的であることが以前に示されている（２３、２４）。

抗体ｓｃＦｖファージライブラリーの構築およびＴＣＲ様特異性を有するＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２０９Ｍ複合体に結合するファージの選択：免疫化のためにＰＰＤを精製複合体に結合させ、組換えＨＬＡ−Ａ２．１／Ｄ^ｂ−β２ミクログロブリン短鎖にトランスジェニックなＤ^ｂ−／−Ｘβ２ミクログロブリン（β２ｍ）ヌルマウス（ＨＨＤマウス）（２６）を、これで免疫化した。これらのマウスは、古典的ＨＬＡ遺伝子導入にマウスクラスＩ Ｈ−２を選択的破壊が組み合わされている。したがって、古典的ＨＬＡトランスジェニックと異なり、これらのマウスはインタクトなウイルスなどの多エピトープタンパク質とのＨＬＡ−Ａ２．１拘束性応答しか示さなかった。さらに、これらのマウスはＢ細胞免疫原としてＨＬＡ−Ａ２に広範な耐性を示すはずであり、それによりＨＬＡ−Ａ２（特異的腫瘍関連ペプチド）と複合体形成した場合にＭＨＣ拘束性エピトープに指向する抗体応答の発生を優先することができるので、ＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体での免疫化のための有用なツールであると推測される。反応性の高いＴ細胞免疫原であるので、ＰＰＤを抱合に使用した（１７）。

免疫化マウスから総脾臓ｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写した。縮重プライマーの特定の組を使用して、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変ドメインに対応するｃＤＮＡセグメントをＰＣＲ増幅した（２７）。ＶＨおよびＶＬのＰＣＲプールを、ＰＣＲ重複伸長反応によってｓｃＦｖレパートリーに構築し、その後インフレームでのセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）との融合タンパク質としてｓｃＦｖを発現するｐＣＡＮＴＡＢ５ＥファージミドベクターまたはファージミドベクターｐＣＣ−Ｇａｌ６（Ｆｖ）にクローン化した（２８）。得られたライブラリーを、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞に形質導入し、ヘルパーファージでのレスキュー後に小ファージ被覆タンパク質ｐＩＩＩとの融合物として発現させた。両ベクター型を使用したライブラリーの複雑度は、１×１０^８独立クローンからなった。

ライブラリーを３〜４回サイクルのパニングに供し、結合ファージを溶離し、Ｅ．ｃｏｌｉで再増幅させた。選択効率を増大させるために、ビオチン化ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体を使用した。以前に記載のように（２５）、部位特異的ビオチン化のためのＢｉｒＡ配列タグを、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子のＣ末端で操作した。いくつかの選択ストラテジーを使用し、第２ラウンドのパニングから開始する負の欠失工程を使用したパニングプロトコールからなる最も首尾のよいストラテジーによって、特異的結合物質が単離された。特異的ＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２０９Ｍビオチン化複合体を、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ上に固定し、ライブラリーを異なるｇｐ１００由来エピトープ（Ｇ９−２８０Ｖペプチド）をディスプレイする大過剰のＨＬＡ−Ａ２複合体の存在下で固定化複合体とインキュベートした。このストラテジーを使用した場合、Ｇ９−２０９Ｍ特異的ファージは磁力によって捕捉されたストレプトアビジン−ビオチン固定化複合体に結合し、複合体中のＧ９−２０９Ｍペプチドに特異的ではないｐａｎ−ＭＨＣ結合物質は溶液中の非特異的複合体に結合し、それにより特異的ファージから分離および除去することができる。以下の表１に示すように、３〜４ラウンドのパニング後に固定化複合体に結合するファージの連続的且つ顕著な富化が認められ、そのうちの２つを負の枯渇ストラテジーを使用して行った。

ＢＳＡ−ビオチン−ストレプトアビジン被覆免疫プレートに固定したビオチン化組換えｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体に対するファージ特異性を決定するために、ポリクローナルファージＥＬＩＳＡを行った。ＢＳＡ−ビオチン−ストレプトアビジンスペーサーは、プラスチックへの直接結合によって歪曲され得る複合体の提示を修正することができる。パニングの第２ラウンド後にファージは既に分析されるが、より劇的には、第３ラウンド後、特異的Ｇ９−２０９Ｍ含有ＨＬＡ−Ａ２複合体にのみ指向する固有の特性パターンを示した（図１Ａ〜Ｂ）。ｇｐ１００由来のエピトープ、Ｇ９−２８０Ｖ、またはテロメラーゼ由来エピトープ６５４をディスプレイするコントロールＨＬＡ−Ａ２複合体を使用した場合、結合は認められなかった。

各モノクローナルファージクローンを、最終ラウンドのパニング由来のファージ集団から単離し（第４ラウンド後にさらなる富化は認められなかった）、ファージＥＬＩＳＡによって特異性を再スクリーニングした（図２Ａ〜Ｂ）。試験した９３クローンのうち、８５個（９１％）のクローンが、ＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２０９Ｍ複合体と反応した（図２Ａ）。８５個の反応性クローンうちの７７個（９０％）が特異的ＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２０９Ｍ複合体と特異的に反応したが、コントロールＧ９−２８０Ｖ含有複合体とは反応しなかった（図２Ｂ）。ほんの少しのクローン（５／９３、５％）のみがペプチド特異性を示さなかった（図２Ｂ）。したがって、パニング手順により、ＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２０９Ｍ複合体に対してＴＣＲ様特異性を有するファージ抗体を首尾よく富化することができた。多切断制限酵素消化によるフィンガープリント分析により、５０個の陽性ＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２０９Ｍ特異的クローンが類似の消化パターンを有し、全てが類似することを示すことが明らかとなった（データ示さず）。２つのライブラリーを使用して、類似の結果が得られた。これらを同一の遺伝物質（ｍＲＮＡの同一プール）から構築したので、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ ｓｃＦｖライブラリー由来のファージクローンのみをさらに特徴付けた。

１０クローン由来のＶＨおよびＶＬ可変ドメインのＤＮＡ配列決定により、全てが同一であることが明らかとなり（データ示さず）、これらのクローンは全て１つの産生抗体ＶＨ／ＶＬ組み合わせ事象に由来することが示唆された。

ＴＣＲ様特性を有する可溶性組換えｓｃＦｖ抗体の特徴づけ：ＤＮＡ配列決定により、抗体ＶＨ配列がマウス重鎖サブグループＩＩＩ（Ｄ）に属し、ＶＬ配列がマウスκ軽鎖群ＩＶに属する（Ｋａｂｂａｔによる）ことが明らかとなった。ヌクレオチド配列（配列番号８）および推定アミノ酸配列（配列番号９）を図３Ａに示す。選択されたｓｃＦｖ抗体（Ｇ１と呼ばれる）の結合特異性および生物学的特性をさらに特徴付けるために、以下の２つの発現系を使用した；第１に、ｓｃＦｖをｍｙｃおよびヘキサヒスチジンタグをｓｃＦｖ遺伝子のＣ末端に融合したファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ６にサブクローン化した。第２に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの切断形態（ＰＥ３８）にｓｃＦｖ遺伝子を融合してｓｃＦｖ−免疫毒素を作製するＴ７プロモーター駆動発現系であった（１２）。ＰＥのこの切断形態は、全ＰＥの転座およびＡＤＰリボシル化ドメインを含むが、切断毒素のＮ末端に融合したｓｃＦｖフラグメントと置換した細胞結合ドメインを欠く。分泌によってＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（λＤＥ３）細胞中にＧ１ｓｃＦｖを産生させ、Ｃ末端に融合したヘキサヒスチジンタグを使用した金属アフィニティクロマトグラフィによってペリプラズム画分から精製した（図３Ｂ）。ＢＬ２１細胞中にＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８を発現させ、ＩＰＴＧでの誘導時に細胞内封入体として大量の組換えタンパク質が蓄積された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｇ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８を発現する培養物由来の封入体が９０％を越える組換えタンパク質を含むことが示された。確立された再生プロトコールを使用して、酸化還元シャフリング再折りたたみ緩衝液中の可溶化封入体からＧ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の再折りたたみを行い、その後Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＭｏｎｏＱカラムでのイオン交換クロマトグラフィおよびその後のサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ、推定サイズ６３ｋＤａの高度に精製されたＧ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８融合タンパク質を得た（図３Ｃ）。Ｇ１ｓｃＦｖおよびＧ１ｓｃＦｖ−免疫毒素の分子プロフィールを、サイズ排除クロマトグラフィによって分析し、推定分子量がそれぞれ２６ｋＤａおよび６３ｋＤａの単量体形態の単一のタンパク質ピークを示した（データ示さず）。再折りたたみＧ１ｓｃＦｖ−免疫毒素の収率は約２％であるので、８０〜９０％の組換えタンパク質を含む封入体由来の１００ｍｇのタンパク質の再折りたたみから２ｍｇの高純度のタンパク質を日常的に得ることができる。この収率は、類似の発現系および再折りたたみ系を使用して十分に発現および産生された以前に報告されたｓｃＦｖ−免疫毒素と類似する（３０）。１リットルの細菌培養物からのＧ１ｓｃＦｖの収率は３ｍｇであった。

プラスチックへの直接結合によって歪曲され得る複合体の正確な折りたたみを確実にするために、ＢＳＡ−ビオチン−ストレプトアビジンによってウェルに固定したビオチン化ＭＨＣ−ペプチド複合体に対するＥＬＩＳＡアッセイによって可溶性精製Ｇ１ｓｃＦｖ抗体およびＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８融合タンパク質の結合特異性を決定した。結合複合体の正確な折りたたみおよび結合アッセイ中のその安定性を、正確に折りたたまれた場合およびペプチドを含む場合のみにＨＬＡ複合体に結合する高次構造の特異的モノクローナル抗体ｗ６／３２とのその反応能力によって決定した（データ示さず）。可溶性精製Ｇ１ｓｃＦｖまたはＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８タンパク質を使用した場合、ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞特異性の特質に相当する非常に特異的な認識パターンが明らかになった（図４）。Ｇ９−２０９Ｍ含有ＨＬＡ−Ａ２複合体に結合するように選択されたＧ１ｓｃＦｖは、特異的複合体のみと反応し、Ｇ９−２８０をディスプレイする複合体およびＧ９−１５４ｇｐ１００由来のＭＨＣ−ペプチド複合体やＨＬＡ−Ａ２拘束性テロメラーゼ由来エピトープ５４０および８６５を含む他のコントロール複合体（３２）、ＭＵＣ１由来のペプチド（３３）、またはＨＴＬＶ−１由来ＴＡＸペプチド（３４）と反応しなかった（図４）。これらのアッセイでは、抗ＰＥ３８抗体を使用して結合を検出した。抗Ｍｙｃタグ抗体を使用して検出を行う非融合Ｇ１ｓｃＦｖ抗体を使用した場合に類似の結果が得られた（データ示さず）。したがって、この抗原特異的ｓｃＦｖフラグメントは、ＴＣＲ様分子の結合特性および優れた特異性を示す。Ｇ１ｓｃＦｖまたはＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８は、ペプチドのみや空のＨＬＡ−Ａ２分子を認識せず（ペプチドの非存在下では不安定であるので産生が困難である）、ストレプトアビジンや他のタンパク質抗原も認識しなかった（データ示さず）。

次に、漸増量のＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８を添加したＢＳＡ−ビオチン−ストレプトアビジン被覆プレートにビオチン化複合体が結合する飽和ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＴＣＲ様可溶性精製Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の結合特性を決定した。特異的ｇｐ１００由来ＨＬＡ−Ａ２／Ｇ２０９Ｍ複合体へのＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の結合は、用量依存性且つ飽和可能であった（図５Ａ）。５０％結合シグナルの予想により、この抗体が高親和性を有する（ナノモル範囲の結合親和性を有する）ことが明らかとなった。ＴＣＲ様ｓｃＦｖフラグメントのその同族ＭＨＣ−ペプチド複合体への見かけ上の結合親和性を決定するために、^１２５Ｉ標識Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の結合を漸増濃度の非標識タンパク質と競合させる競合結合アッセイを行った。これらの結合アッセイにより、５ｎＭの低ナノモル範囲での見かけ上の結合親和性が明らかとなった（図５Ｂ）。重要には、これらの結果は、免疫化ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスのファージディスプレイされた抗体レパートリーからのＴＣＲ様特異性を有する高親和性ｓｃＦｖ抗体の単離における以前の成功を強調するものである。

ｇｐ１００由来エピトープをディスプレイするＡＰＣへのＧ１ｓｃＦｖの結合：単離された溶解性Ｇ１ｓｃＦｖが細胞表面上で発現するようにその組換え可溶性形態だけでなく天然の形態でも特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合することができることを証明するために、２つのＡＰＣ系を使用した。１つは、単鎖形態（２６）（ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｄｂ−β２ｍ単鎖）中のヒトＨＬＡ−Ａ２遺伝子でトランスフェクトしたマウスＴＡＰ２欠損ＲＭＡ−Ｓ細胞（ＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞）からなる。ｇｐ１００由来ペプチドおよびコントロールペプチドをＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞に負荷し、選択されたＧ１ｓｃＦｖ抗体のペプチド負荷細胞に結合する能力をＦＡＣＳによってモニターした（図６Ａ〜Ｃ）。ＴＡＰ２変異ＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞のペプチド誘導ＭＨＣ安定化を、高次構造抗ＨＬＡ抗体ｗ６／３２および高ＨＬＡ−Ａ２ ＭＡｂ ＢＢ７．２のペプチド負荷および非負荷細胞との反応性の分析によって決定した（図６ＡおよびＢ）。Ｇ９−２０９Ｍ含有ＨＬＡ−Ａ２複合体を認識したＧ１ｓｃＦｖは、Ｇ９−２０９Ｍペプチドを負荷したＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞のみと反応し、Ｇ９−２８０ペプチドを負荷した細胞（図６Ｃ）やペプチドを負荷していないコントロール細胞と反応しなかった。Ｇ１ｓｃＦｖは、特異性分析のために使用したＴＡＸ、ＭＵＣ１、またはテロメラーゼ由来ペプチドなどの他のＨＬＡ−Ａ２拘束性コントロールペプチドで負荷した細胞に結合しなかった（図４を参照のこと）。

ＡＰＣの第２の型（すなわち、ＨＬＡ−Ａ２を発現するＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球ＪＹ細胞）も使用した；これらの細胞を、ｇｐ１００由来ペプチドまたはコントロールペプチドとインキュベートした。これらはＴＡＰ＋であり、その結果として、外因的に供給したペプチドのディスプレイはペプチド交換によって容易になる。このストラテジーを使用して、Ｇ１ｓｃＦｖ抗体との類似の結合特異性が認められた（データ示さず）。これらの結果は、ｓｃＦｖ抗体は細胞表面上でｉｎ ｓｉｔｕにてその対応する天然のＨＬＡ−Ａ２複合体を特異的に認識することができることを証明する。

ＡＰＣに対するＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の細胞傷害活性：Ｇ１ｓｃＦｖ抗体が抗原提示細胞のＴ細胞様特異的排除のためのターゲティング部分として作用する能力を決定するために、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの非常に強力な切断形態をｓｃＦｖ遺伝子のＣ末端に融合したＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８分子を構築し、ペプチド負荷ＡＰＣを死滅させるその能力を試験した。ＲＭＡＳ−ＨＨＤまたはＪＹ細胞に、ｇｐ１００由来のエピトープＧ９−２０９ＭおよびＧ９−２８０Ｖならびに他のコントロールＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドを負荷した。抗ＨＬＡ−Ａ２抗体を使用したＦＡＣＳ分析により、Ｇ９−２０９Ｍ、Ｇ９−２８０Ｖ、および他のコントロールペプチドを負荷した細胞を有するＨＬＡ−Ａ２分子の類似の発現パターンが明らかとなった（図６Ｂ）。図７Ａに示すように、Ｇ９−２０９ペプチドを負荷したＲＭＡＳ−ＨＨＤ細胞のみでＩＣ_５０が１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＧ１ｓｃＦｖ−Ｐ３８による細胞傷害性が認められた。ｇｐ１００由来Ｇ９−２８０Ｖエピトープまたは他のコントロールＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドを負荷したＲＭＡＳ−ＨＨＤ細胞やペプチド負荷していない細胞で細胞傷害活性は認められなかった。抗ヒトルイスＹｓｃＦｖ抗体をＰＥ３８に融合させた無関係の免疫毒素（Ｂ３（Ｆｖ）−ＰＥ３８）を使用してもＧ９−２０９Ｍ負荷ＲＭＡＳ−ＨＨＤ細胞は死滅しなかった（図７Ａ）。正常なＴＡＰを発現するＥＢＶ形質転換ＪＹ細胞では、外因的に供給したペプチドのディスプレイは、ペプチド交換によって容易になる。このストラテジーを使用して、Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８がＧ９−２０９Ｍペプチドを負荷した細胞のみを死滅させる類似の特異的活性が認められた（図７Ｂ）。Ｇ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８によって結合を競合して細胞傷害性を阻害させるために、過剰な特異的およびコントロールの可溶性ｓｃＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体が溶液中に存在する競合実験において特異性についてのさらなる証拠を証明した。過剰な可溶性Ｇ９−２０９Ｍ含有ＨＬＡ−Ａ２ではＧ９−２０９Ｍ負荷ＪＹ細胞に対してＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８と競合して細胞傷害活性を阻害するが、Ｇ９−２８０Ｖ／ＨＬＡ−Ａ２複合体では認められないこのアッセイ型の例を図７Ｃに示す。これらの結果は、Ｇ１ｓｃＦｖ抗体の優れた固有の特異性およびヒト腫瘍Ｔ細胞エピトープに指向するＴ細胞の抗原（ペプチド）特異的ＭＨＣ拘束性特異性を有する細胞傷害性エフェクター細胞を送達するターゲティング部分として作用するその能力をさらに証明する。

（結果の考察）この実施例では、マウスｓｃＦｖフラグメントの免疫レパートリーから癌抗原（黒色腫関連抗原ｇｐ１００）由来のヒトＴ細胞エピトープに指向する高親和性抗体（本明細書中ではＧ１ｓｃＦｖという）を選択する能力を証明した。

Ｇ１ｓｃＦｖは、非常に特異的且つ特別な結合パターンを示す；これは、ペプチド特異的様式でＨＬＡ−Ａ２複合体に結合することができる。したがって、これは、Ｔ細胞抗原受容体様特異性を有する組換え抗体である。本来の低親和性ＴＣＲと対照的に、この分子は抗体の高親和性結合特性を示しながらＴＣＲ特異性を保持する。

この実施例は、ファージディスプレイアプローチ能力および異なる抗体の巨大レパートリー由来の特に優れた特異性を選択するその能力を顕著に証明する。

このようなペプチド特異的結合物質が稀であり、それにより単離が困難であると考えられるという事実にもかかわらず、高親和性ＴＣＲ様抗体を選択する能力は、以下の検討材料に起因し得る。

１つは、ファージディスプレイで使用される種々の選択ストラテジーの能力と組み合わせたトランスジェニック動物の免疫化を含む免疫化および選択様式である。新規の外来ペプチドが複合体上に存在しない限り、ＨＬＡ複合体に通常耐性を示すので、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスなどのＨＬＡトランスジェニックマウスの使用は有利であると考えられる。ＴＣＲ様抗体分子を単離する能力は、ＨＬＡ−Ａ２に耐性を示すリンパ球が本明細書中に示す実施例ではＨＬＡ−Ａ２上に提示された黒色腫ｇｐ１００由来ペプチドによって寄与される新規のピトープにそのとき曝露される状況を示し得る。過剰な非特異的複合体を含む溶液を組み合わせたパニング手順は、選択プロセスに有意に寄与し、稀な抗体クローン（１０^８個のうちの１個）が単離される。

別の重要な問題は、選択プロセスで使用した抗原の状態に関する。抗原の高次構造は、特に組換え形態で産生される場合、できるだけ「天然」でなければならない。引例２３および２４ならびに米国特許出願０９／５３４９６６号およびＰＣＴ／ＩＬ０１／００２６０号（ＷＯ０１／７２７６８号として公開）に記載のように、種々のペプチドと複合体形成した単鎖ＭＨＣ分子のＥ．ｃｏｌｉで産生された封入体からのｉｎ ｖｉｔｒｏ再折りたたみにより大量の正確に折りたたまれた機能的タンパク質が得られることが見出された。約１０^８クローンの比較的小さなライブラリーから例示的抗体Ｇ１ｓｃＦｖが単離され、さらにナノモル範囲での親和性で非常に特異的であるという事実は、免疫化に使用したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにより実際にＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２０９複合体に対する高親和性抗体が開発されることを強く示す。たった１つの抗ＨＬＡ−Ａ２／Ｇ９−２０９抗体が単離されたという所見は、たった１つのこのような特異性を示すか、このような応答をＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスは容易に作製および寛容することができないので、免疫応答時に他の特異性が得られないことを反映し得る。ファージディスプレイを使用して、インフルエンザ血球凝集素ペプチドＨａ_{２５５−２６２}との複合体形成においてクラスＩマウスＨ−２Ｋ^ｋ分子に指向する組換えＴＣＲ様抗体が単離されたマウスＭＨＣ−ペプチド系について類似の結果が過去に報告されたという事実は非常に驚くべき事実である（１７）。本明細書中に示した結果と同様に、試験した５０個のクローンのうち、７個のクローンがＨ−２Ｋ^ｋ／Ｈａ_{２５５−２６２}複合体のみと特異的に反応するが、他のＨ−２Ｋ^ｋ／ペプチド複合体とは反応しなかった。興味深いことに、これらの特異的クローンのＤＮＡ配列を決定したところ、同一であることが見出された（１７）。しかし、これらの抗Ｈ−２Ｋ^ｋ／Ｈａ_{２５５−２６２}複合体抗体を使用して抗原提示をモニターすることやヒト起源の抗原提示細胞を死滅させることはできない。

Ｔ細胞抗原受容体様特異性を有する抗体が稀であるという事実にもかかわらず、癌、ウイルス感染、および自己免疫疾患などの種々の病状に関連する種々のＭＨＣ−ペプチド複合体に対してＴＣＲ様特異性を有する組換え抗体を単離するためにファージディスプレイアプローチを適用することができる。

ＴＣＲ様特異性を有する組換え抗体は、腫瘍免疫学の２つの主要な領域におけるさらなる研究のための新規の有益なツールを示す。第１に、現在これらの抗体を使用して、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学の標準的な方法によって特異的Ｔ細胞エピトープまたはＭＨＣ−ペプチド複合体の存在を検出して直接視覚化することができる。これらは、腫瘍細胞、転移、抗原提示細胞、およびリンパ系細胞の表面上の特異的腫瘍関連ＭＨＣ−ペプチド複合体の発現の決定による癌における抗原提示の研究および分析に非常に有用なはずである。さらに、このような抗体を使用して、腫瘍細胞抽出物を負荷したペプチドまたはＡＰＣを使用したワクチン接種プロトコールまたは樹状細胞−腫瘍細胞ハイブリッドワクチン接種前、接種中、および接種後の抗原提示細胞上のＭＨＣ−ペプチド複合体発現の変化の決定によって免疫療法ベースのアプローチを分析することができる（７〜１１）。したがって、抗原提示の間にどこでどのようにして一定の事象が起こるのかということに関する問題に初めて直接取り組むことができ、抗原提示細胞上のＴ細胞エピトープの発現を視覚化および定量することができる。

第２に、非常に特異的且つ固有のヒト腫瘍抗原に指向するこのような極めて優れた特異性を有する抗体は、種々の抗体ベースの免疫療法アプローチのためのターゲティング部分として使用するための新規の機会を提供する。これには、組換え免疫毒素を構築するため（１２）、サイトカイン分子との融合（３７）、または二重特異性抗体療法（３８）のためのこのような抗体の使用が含まれる。これらの適用に関する未解決の問題は、標的細胞の表面上の低密度の特異的エピトープに関する。マウスＨ−２Ｋ^ｋ／インフルエンザ血球凝集素ペプチド複合体および類似の抗原提示系を使用して、ＴＣＲ様免疫毒素分子を使用して有効に死滅させるために、一定密度の数千個の特定のＭＨＣ−ペプチド複合体がＡＰＣの選択的消滅に必要であることが以前に証明されている（３９）。本明細書中に記載の結果は、Ｔ細胞様免疫毒素の類似の細胞傷害能力を達成するこれらの所見を支持する。これらのＴＣＲ様抗体分子のターゲティング能力を改良するために、以下の２つの抗体操作アプローチを使用することができる：（ｉ）そのＴＣＲ様の優れた特異性を変化させることのない親和性変異ストラテジーによる親抗体の親和性の増加（４０）および（ｉｉ）２価にすることによるこれらの１価の組換え分子の抗原結合力の増加（３８）。これらのストラテジーの組み合わせにより第２世代（免疫療法アプローチのために有益なツールであり、腫瘍細胞およびヒト免疫系の相互作用の研究のための革新的な研究ツールとして役立つ改良分子）が得られる。

明確にするために個別の実施形態の文脈に記載の本発明の一定の特徴を１つの実施形態と組み合わせることにより得ることもできることが認識される。逆に、簡潔にするために１つの実施形態の文脈に記載の本発明の種々の特徴を個別または任意の適切なサブコンビネーションで得ることもできる。

本発明を特定の実施形態と共に記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれるこのような全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。全ての刊行物、特許、特許出願、および本明細書中に記載したＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号によって識別される配列は、その全体が、それぞれの刊行物、特許、特許出願、および配列があたかも特別または個別に本明細書中で参考として援用されるように示されるような範囲に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願における任意の引例の引用または識別により、このような引例が先行技術として本発明で利用可能であることを承認すべきではない。

組換えｓｃＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体に対するポリクローナルファージＥＬＩＳＡを示す棒グラフを示す。 組換えｓｃＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体に対するポリクローナルファージＥＬＩＳＡを示す棒グラフを示す。 ｓｃＨＬＡ−Ａ２／ｇｐ１００複合体へのモノクローナルファージクローンの異なる結合を示す棒グラフを示す。 ｓｃＨＬＡ−Ａ２／ｇｐ１００複合体へのモノクローナルファージクローンの異なる結合を示す棒グラフを示す。 抗体Ｇ１ｓｃＦｖの核酸配列（配列番号８）およびアミノ酸配列（配列番号９）を示す。 抗体Ｇ１ｓｃＦｖの核酸配列（配列番号８）およびアミノ酸配列（配列番号９）を示す。 精製Ｇ１ｓｃＦｖおよびＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 精製Ｇ１ｓｃＦｖおよびＧ１ｓｃＦｖ−ＰＥ３８のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 Ｇ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の結合特異性を示す棒グラフである。 ＴＣＲ様Ｇ１ ｓｃＦｖの結合特性を証明するプロットを示す。 ＴＣＲ様Ｇ１ ｓｃＦｖの結合特性を証明するプロットを示す。 Ｇ１ ｓｃＦｖのＡＰＣへの結合を証明するプロットを示す。 Ｇ１ ｓｃＦｖのＡＰＣへの結合を証明するプロットを示す。 Ｇ１ ｓｃＦｖのＡＰＣへの結合を証明するプロットを示す。 ペプチド負荷ＡＰＣに対するＧ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の細胞傷害活性を証明するプロットおよび棒グラフである。 ペプチド負荷ＡＰＣに対するＧ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の細胞傷害活性を証明するプロットおよび棒グラフである。 ペプチド負荷ＡＰＣに対するＧ１ ｓｃＦｖ−ＰＥ３８の細胞傷害活性を証明するプロットおよび棒グラフである。

配列番号１はＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドｇｐ１００（１５４）の配列である。
配列番号２はＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドｇｐ１００（２０９）の配列である。
配列番号３はＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドｇｐ１００（２８０）の配列である。
配列番号４はＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドＭＵＣ１の配列である。
配列番号５はＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドＨＴＬＶ−１（ＴＡＸ）の配列である。
配列番号６はＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドｈＴＥｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（５４０）の配列である。
配列番号７はＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドｈＴＥｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（８６５）の配列である。
配列番号８はＧ１一本鎖Ｆｖ組換え抗体ＤＮＡの配列である。
配列番号９はＧ１一本鎖Ｆｖ組換え抗体タンパク質の配列である。
配列番号１０はインフルエンザ由来のＨＬＡ拘束性ペプチドの配列である。
配列番号１１はＢ型肝炎由来のＨＬＡ拘束性ペプチドの配列である。

【配列表】

Claims (64)

1. ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む単離分子。
2. 前記ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８からなる群から選択される請求項１記載の単離分子。
3. 前記抗体に抱合する同定可能な部分をさらに含む請求項１記載の単離分子。
4. 前記同定可能部分は、結合対のメンバーおよび標識からなる群から選択される請求項３記載の単離分子。
5. 前記結合対の前記メンバーが抗原である請求項３記載の単離分子。
6. 前記標識は、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される請求項３記載の単離分子。
7. 前記抗体に抱合する治療部分をさらに含む請求項１記載の単離分子。
8. 前記治療部分は、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、および二重特異性抗体部分からなる群から選択される請求項７記載の単離分子。
9. 前記ＨＬＡ拘束性抗原が腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原である請求項１記載の単離分子。
10. 前記ＨＬＡ拘束性抗原がウイルスＨＬＡ拘束性抗原である請求項１記載の単離分子。
11. 前記ＨＬＡ拘束性抗原が自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原である請求項１記載の単離分子。
12. ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む治療有効量の分子を含む薬学的組成物であって、前記分子は前記抗体に抱合する治療部分をさらに含む薬学的組成物。
13. 薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む請求項１２記載の薬学的組成物。
14. 前記ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８からなる群から選択される請求項１２記載の薬学的組成物。
15. 前記治療部分は、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、および二重特異性抗体部分からなる群から選択される請求項１２記載の薬学的組成物。
16. 前記ＨＬＡ拘束性抗原が腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原である請求項１２記載の薬学的組成物。
17. 前記ＨＬＡ拘束性抗原がウイルスＨＬＡ拘束性抗原である請求項１２記載の薬学的組成物。
18. 前記ＨＬＡ拘束性抗原が自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原である請求項１２記載の薬学的組成物。
19. ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む分子を含む診断組成物であって、前記分子は前記抗体に抱合した同定可能部分をさらに含む診断組成物。
20. 前記ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８からなる群から選択される請求項１９記載の診断組成物。
21. 前記同定可能部分は、結合対のメンバーおよび標識からなる群から選択される請求項１９記載の診断組成物。
22. 前記結合対の前記メンバーが抗原である請求項１９記載の診断組成物。
23. 前記標識は、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される請求項１９記載の診断組成物。
24. 前記ＨＬＡ拘束性抗原が腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原である請求項１９記載の診断組成物。
25. 前記ＨＬＡ拘束性抗原がウイルスＨＬＡ拘束性抗原である請求項１９記載の診断組成物。
26. 前記ＨＬＡ拘束性抗原が自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原である請求項１９記載の診断組成物。
27. ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む単離分子。
28. 前記ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８からなる群から選択される請求項２７記載の単離分子。
29. 前記第１のポリヌクレオチドに連結し、同定可能部分をコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む請求項２７記載の単離分子。
30. 前記同定可能部分は、結合対のメンバーおよび標識からなる群から選択される請求項２９記載の単離分子。
31. 前記結合対の前記メンバーが抗原である請求項２９記載の単離分子。
32. 前記標識は、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される請求項２９記載の単離分子。
33. 前記第１のポリヌクレオチドに連結し、治療部分をコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む請求項２７記載の単離分子。
34. 前記治療部分は、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、および二重特異性抗体部分からなる群から選択される請求項３３記載の単離分子。
35. 前記ＨＬＡ拘束性抗原が腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原である請求項２７記載の単離分子。
36. 前記ＨＬＡ拘束性抗原がウイルスＨＬＡ拘束性抗原である請求項２７記載の単離分子。
37. 前記ＨＬＡ拘束性抗原が自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原である請求項２７記載の単離分子。
38. 以下の工程を含む、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体の産生方法：
    前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩを発現する細胞を有する遺伝子操作された非ヒト哺乳動物を前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成された可溶性形態のＭＨＣクラスＩ分子で免疫化する工程と、
    前記非ヒト哺乳動物の抗体産生細胞からｍＲＮＡ分子を単離する工程と、
    前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子をディスプレイするファージディスプレイライブラリーを産生する工程と、
    前記ファージディスプレイライブラリーから少なくとも１つのファージを単離する工程であって、前記少なくとも１つのファージが前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと１０ナノモル未満の前記結合親和性で特異的に結合することができる前記抗体をディスプレイする工程。
39. 前記非ヒト哺乳動物が自己ＭＨＣクラスＩ分子を欠く請求項３８記載の方法。
40. 前記ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８からなる群から選択される請求項３８記載の方法。
41. 前記ＨＬＡ拘束性抗原が腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原である請求項３８記載の方法。
42. 前記ＨＬＡ拘束性抗原がウイルスＨＬＡ拘束性抗原である請求項３８記載の方法。
43. 前記ＨＬＡ拘束性抗原が自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原である請求項３８記載の方法。
44. 前記可溶性形態のＭＨＣクラスＩ分子が、機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖アミノ酸配列に直接または間接的に共有結合した機能的ヒトβ−２ミクログロブリンアミノ酸配列を含む単鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドである請求項３８記載の方法。
45. 癌の治療方法であって、前記癌を特徴付ける腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む治療有効量の分子を必要とする被験体に投与する工程と、前記分子が前記抗体に抱合した治療部分をさらに含み、被験体の内因性ＭＨＣクラスＩと適合する前記ＭＨＣクラスＩ分子が選択されることとを含む、癌の治療方法。
46. 前記ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８からなる群から選択される請求項４５記載の方法。
47. 前記治療部分は、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、および二重特異性抗体部分からなる群から選択される請求項４５記載の方法。
48. ウイルス感染の治療方法であって、前記ウイルス感染に起因するウイルスを特徴付けるウイルスＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む治療有効量の分子を必要とする被験体に投与する工程と、前記分子が抗体に抱合した治療部分をさらに含み、被験体の内因性ＭＨＣクラスＩと適合する前記ＭＨＣクラスＩ分子が選択されることとを含む、ウイルス感染の治療方法。
49. 前記ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８からなる群から選択される請求項４８記載の方法。
50. 前記治療部分は、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、および二重特異性抗体部分からなる群から選択される請求項４８記載の方法。
51. 自己免疫疾患の治療方法であって、自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体を含む治療有効量の分子を必要とする被験体に投与する工程と、前記分子が前記抗体に抱合した治療部分をさらに含み、被験体の内因性ＭＨＣクラスＩと適合する前記ＭＨＣクラスＩ分子が選択されることとを含む、自己免疫疾患の治療方法。
52. 前記ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５、およびＨＬＡ−Ｃｗ８からなる群から選択される請求項５１記載の方法。
53. 前記治療部分は、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、および二重特異性抗体部分からなる群から選択される請求項５１記載の方法。
54. 免疫毒素の作製方法であって、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体をコードする第１のポリヌクレオチドをインフレームで毒素部分をコードする第２のポリヌクレオチドとライゲーションしてライゲーションされたポリヌクレオチドを得る工程と、ライゲーションした前記ポリヌクレオチドを発現系で発現させて前記免疫毒素を得る工程とを含む、免疫毒素の作製方法。
55. 前記ＨＬＡ拘束性抗原は、腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原、ウイルスＨＬＡ拘束性抗原、および自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原からなる群から選択される請求項５４記載の方法。
56. 免疫標識の作製方法であって、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体をコードする第１のポリヌクレオチドをインフレームで同定可能な部分をコードする第２のポリヌクレオチドとライゲーションしてライゲーションされたポリヌクレオチドを得る工程と、ライゲーションした前記ポリヌクレオチドを発現系で発現させて前記免疫標識を得る工程とを含む、免疫標識の作製方法。
57. 前記ＨＬＡ拘束性抗原は、腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原、ウイルスＨＬＡ拘束性抗原、および自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原からなる群から選択される請求項５６記載の方法。
58. 免疫標識の作製方法であって、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体をコードする第１のポリヌクレオチドをインフレームで同定可能な部分をコードする第２のポリヌクレオチドとライゲーションしてライゲーションされたポリヌクレオチドを得る工程と、ライゲーションした前記ポリヌクレオチドを発現系で発現させて前記免疫標識を得る工程とを含む、免疫標識の作製方法。
59. 前記ＨＬＡ拘束性抗原は、腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原、ウイルスＨＬＡ拘束性抗原、および自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原からなる群から選択される請求項５４記載の方法。
60. 以下の工程を含む、細胞サンプル中のＨＬＡ拘束性抗原を提示する抗原提示細胞の存在および／またはレベルの検出方法：
    前記サンプルの細胞をＨＬＡ拘束性抗原と複合体形成されたヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩと２０ナノモル未満の結合親和性で特異的に結合することができる抗体と相互作用させる工程と、
    前記相互作用をモニタリングして前記ＨＬＡ拘束性抗原を提示する前記抗原提示細胞の存在および／またはレベルを検出する工程。
61. 前記ＨＬＡ拘束性抗原は、腫瘍ＨＬＡ拘束性抗原、ウイルスＨＬＡ拘束性抗原、および自己免疫ＨＬＡ拘束性抗原からなる群から選択される請求項６０記載の方法。
62. 配列番号８に記載のポリヌクレオチドを含む単離核酸。
63. 配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む単離タンパク質。
64. 配列番号９に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸。

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