JP2018083814A

JP2018083814A - 毒性部分を備える異常細胞拘束性免疫グロブリン

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Publication number: JP2018083814A
Application number: JP2017232042A
Authority: JP
Inventors: ヨハンルネ，; Renes Johan; ポールステフェリンク，; J Steverink Paulus; ラルフアレクサンダーウィレムセン，; Alexander Willemsen Ralph
Original assignee: Apo T Bv
Current assignee: Apo T Bv
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2018-05-31
Also published as: ZA201405109B; AU2018200442A1; CA2860914A1; AU2013208364A1; AU2018200442B2; SG11201404007WA; US20150056198A1; EP3470434A1; SG10201705698PA; AU2013208364B2; US20150202318A1; WO2013105856A1; US20130183307A1; JP2020097579A; US10946104B2; US20180154013A1; US20210205465A1; JP2015504895A; EP2802356A1

Abstract

【課題】細胞異常、例えば、癌及び自己免疫疾患に関連する疾患の治療のための医薬組成物の提供。【解決手段】異常細胞と優先的に関連する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）−ペプチド複合体と特異的に結合する、少なくとも免疫グロブリン可変領域を含み、前記ペプチドは黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）に由来し、かつ、１つよりも多いＭＡＧＥタンパク質に存在するペプチドであり、前記ＭＨＣがＭＨＣ−１である、毒性部分を備える免疫グロブリン。【選択図】なし

Description

本発明は、生物学的療法の分野に関する。より詳細には、本発明は、毒性部分を備える免疫グロブリンに関する。さらに、より詳細には、本発明は、ヒト抗体に関する。本発明はまた、異常細胞、例えば、癌及び自己免疫疾患に関連する疾患に罹患している宿主の治療における、これらの生物学的療法の使用に関する。

免疫グロブリン−薬物コンジュゲートの開発は、昨今高い関心を受けている薬物開発分野の１つである。ヒト化又はヒト抗体は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）並びに免疫毒素と抗体−放射性核種コンジュゲートに使用するため研究中の最も大きく最も重要なクラスの免疫グロブリンである。これらの抗体は、異常細胞、例えば、癌及び（自己）免疫疾患において、及び感染の間に、曝露されるもので（過剰）発現される結合部位を標的とする。多くのコンジュゲートは、有効性の程度が限定される。例えば、免疫毒素の最大耐量は、健常組織へと向けられる毒性のせいで、比較的低い。用量を低下させることは、毒素又はＡＤＣｓにおける薬物の非特異的な毒性活性にたいし健常細胞を防御する１つの方式である。しかしながら、用量を低下させることは、例えば、腫瘍の部位での効果的な量のコンジュゲートの送達を妨げる。望まれない副反応は、主に、異常細胞により排他的に曝露されず、健常細胞によってもいくらか曝露される、結合部位に対する抗体のターゲティングのせいである。そのため、健常細胞に対する特異性と比べて、異常細胞に対する特異性が不十分であると、所望の有効性が妨げられ、昨今の免疫グロブリン−薬物コンジュゲートの所望の安全性プロフィールを得ることが妨げられる。

現在、臨床にある又は研究中の毒性部分は、多数あり、また多様である［６］。マウス抗体と化学的に連結された第一の毒素の中には、植物由来のタンパク毒素及び細菌性の毒素があり、例えば、サポリン、ジフテリア毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、ゲロニン、リシン（ｒｉｃｉｎ）、リシンＡ鎖、アブリン及びアメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質（ｐｏｋｅｗｅｅｄａｎｔｉｖｉｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ）がある。他の毒素部分を備える免疫グロブリンには、ＤＮＡレベルで毒素と融合される単鎖Ｆｖが含まれる。一例には、シュードモナス外毒素Ａの断片に融合された抗ヒトＣＤ２２抗体のＦｖ部分からなる組換えタンパク質ＢＬ２２であり、これはＢ細胞の悪性疾患、例えば、ヘアリーセル白血病及び非ホジキンリンパ腫を標的とする。毒素とコンジュゲートした免疫グロブリンの他の例は、抗体−放射性核種コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｅ）である。ヒトＣＤ２０は、非ホジキンリンパ腫の治療のための、９０−イットリウムと又は１３１−ヨウ素とコンジュゲートされた、２つのモノクローナル抗体に関する標的として薬物の開発者により選択されてきた。特定の薬物の腫瘍選択性を改善する試みにおいて、マウスのモノクローナル抗体を、化合物、例えば、ドキソルビシン、ビンブラスチン、メトトレキセートとコンジュゲートして、いわゆる抗体−薬物コンジュゲートが提供された。しかしながら、腫瘍細胞特異性が不十分であることから、治療の有用性は未だに限定される。異常細胞で（高度に）過剰発現された腫瘍細胞表面抗原を選択する場合でさえ、健常細胞で、それでもやはり低い発現レベルがあることは、抗体−薬物コンジュゲートの不十分な選択性を生じる。現時点で研究中の細胞傷害性の抗腫瘍薬物は、例えば、マイタンシノイド及びドラスタチンアナログであり、これら双方は細胞内のチューブリンを標的とし、並びにデュオカルマイシン及びカリケアマイシンであり、これらはＤＮＡ構造を標的とする。これらの化合物は、細胞傷害活性が強力であるが、異常細胞に選択的ではない。抗ヒトＣＤ３３モノクローナル抗体とコンジュゲートした抗生物質カリケアマイシンは、承認されて、臨床において使用されたが、しかし、重大な副作用のせいで回収された。細胞異常の治療に向けられる抗体−薬物コンジュゲートにおける潜在的に有益な使用に関して現在研究中の薬物の追加の例は、オゾガマイシン、ヒドラゾン−カリケアマイシン、ベドチン、エムタンシン、メルタンシンである。これらの毒性部分は、腫瘍細胞で発現されるが、健常細胞でもいくらか発現される、細胞表面マーカーをターゲティングする免疫グロブリンとコンジュゲートされる。腫瘍細胞及び健常細胞の双方に存在する細胞表面マーカーを標的とする、免疫グロブリン−薬物コンジュゲートの典型的な例は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＨＥＲ２／ｎｅｕである。このように、すべてのこれらの免疫グロブリン−薬物コンジュゲート開発プログラムは、本来的に、低い最大許容量のせいで、安全性プロフィールが容認できず、結果的に有効性が乏しくなるとのリスクがある。従って、薬物、放射性核種又は毒素を、異常細胞を特異的及び選択的にターゲティングし、健常細胞をターゲティングしない免疫グロブリンとコンジュゲートすることによって、異常細胞への特異性及び選択性が改善され、安全性プロフィールが改善された療法が実現されるであろう。

標的の異常細胞における毒性部分の特異的な及び選択的な送達には、異常細胞と優先的に関連する結合部位に特異的な結合分子が必要とされる。これらの結合分子は、次いで、特異的に及び選択的に毒性部分を異常細胞に及びその中に送達する、毒性部分の担体及びトランスポーターとして使用される。本発明者らは、これらの好ましい特性を含む免疫グロブリン−薬物コンジュゲートを本明細書に開示する。本発明の免疫グロブリン−薬物コンジュゲートにおける免疫グロブリンは、異常細胞と優先的に関連する結合部位に特異的に結合することによる、異常細胞への改善された選択性を伴う、免疫グロブリン結合領域を含む。我々は、本発明の抗体に関する好ましい標的として、異常細胞に関連する細胞内タンパク質を開示する。これらのタンパク質は、異常細胞の表面におけるＭＨＣにより提示されるペプチドとして利用可能である。標的としてＭＨＣ−ペプチド複合体を使用することによって、我々に、腫瘍標的の新しい分野が開かれる、その理由は、これまでは異常細胞の表面に関連する標的が、典型的に予見されてきたからである。標的が異常細胞（腫瘍細胞）に特異的であることが好ましいが、多くのケースで、上方制御された細胞内タンパク質も少なくとも免疫毒素の治療域を改善するために適切である。本発明者らの最も好ましい標的は、ＭＨＣ−１の関連において提示されるＭＡＧＥに由来するペプチドである。特に、１つよりも多いＭＡＧＥタンパク質（マルチＭＡＧＥエピトープ；参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０９１５６４号パンフレットを参照されたい）に存在するＭＡＧＥペプチド。本発明の毒性部分は、好ましくは、薬物化合物、放射性核種又は毒素である。本発明の毒性部分は、非タンパク質性分子又はタンパク質性分子である。本発明の免疫グロブリン−薬物コンジュゲートでは、毒性部分は、好ましくは化学的なコンジュゲーションによりコンジュゲートされる。ＤＮＡレベルでタンパク質性の毒性部分と融合される本発明の免疫グロブリンも好ましい。

本発明の免疫グロブリン−薬物コンジュゲートにおける免疫グロブリンは、標的にされる異常細胞の内側の特異的な及び選択的な毒性効果の局在化に適切であり、健常細胞は本質的に影響を受けないままである。免疫グロブリンは、免疫グロブリン結合ドメインを含み、これは免疫グロブリン可変ドメインと呼ばれ、免疫グロブリン可変領域を含む。免疫グロブリン可変領域の成熟は、標的結合部位に特異的に結合するため適合された可変ドメインを生じる。それ故、免疫グロブリンは、異常細胞を特異的に及び選択的に標的とする能力を伴う、本発明の免疫グロブリン−薬物コンジュゲートを提供するため特に適切である。それらの表面で、異常細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の関係において異常細胞関連抗原ペプチドを提示する。それ故、本発明の免疫グロブリン−薬物コンジュゲートにおける免疫グロブリンに関して、異常細胞関連ＭＨＣ−１ペプチド複合体は、異常細胞における好ましい標的である。さらに、異常細胞関連ＭＨＣ−２ペプチド複合体は、本発明の免疫グロブリン−薬物コンジュゲートにおける免疫グロブリンに関して、例えば、造血性起源の腫瘍における価値ある標的である。それ故、本発明は、異常細胞と優先的に関連するＭＨＣ−ペプチド複合体をターゲティングすることにより異常細胞への改善された特異性及び選択性を伴う、免疫グロブリン−薬物コンジュゲートにおける免疫グロブリンを提供する。この異常細胞への改善された特異性及び選択性には、本発明の免疫グロブリン−薬物コンジュゲートにおける免疫グロブリンによる、意図したものではない健常細胞のターゲティングの低下レベルが付随する。最も好ましくは、健常細胞は、本発明の免疫グロブリン−薬物コンジュゲートにより標的とされない。そのため、第１の実施形態において、本発明は、異常細胞と優先的に関連するＭＨＣ−ペプチド複合体と特異的に結合する、少なくとも免疫グロブリン可変領域を含む、毒性部分を備える免疫グロブリンを提供する。本発明の好ましい免疫グロブリンは、抗体であるが、断片及び／又は誘導体、例えば、Ｆａｂ及び／又はＳｃＦｖも使用することができる。さらに、より好ましい本発明の免疫グロブリンは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）タイプの抗体である。本発明の他の免疫グロブリンは、例えば、Ｖｈ又はＶｈｈを含む重鎖（のみの）抗体及びＩｇＡ、及びそれらの断片、例えば、Ｆａｂ断片、及びＩｇＧのＦａｂ断片である。免疫グロブリンは、免疫グロブリン可変領域を介して、分子における結合部位、例えばエピトープ、と分子間のバックグラウンド相互作用よりも高い結合親和性で結合する。本発明の関係において、バックグラウンド相互作用は、典型的には１０Ｅ−４ＭのＫ_Ｄより低い親和性での相互作用である。抗体の軽鎖における免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖｌ）及び重鎖における免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖｈ）は、典型的には本発明の異常細胞特異的な免疫グロブリン可変領域を含む。そのため、一実施形態において、本発明は、異常細胞と優先的に関連するＭＨＣ−ペプチド複合体と特異的に結合する、少なくとも免疫グロブリン可変領域を含む、毒性部分を備える免疫グロブリンであって、前記免疫グロブリン可変領域がＶｈ（ｈ）である、免疫グロブリンを提供する。そのため、さらに別の実施形態において、本発明はまた、異常細胞と優先的に関連するＭＨＣ−ペプチド複合体と特異的に結合する、少なくとも免疫グロブリン可変領域を含む、毒性部分を備える免疫グロブリンであって、前記免疫グロブリン可変領域がＶｈであり、前記免疫グロブリン可変領域がＶｌをさらに含む、免疫グロブリンを提供する。

前記のとおり、免疫グロブリンＧは、本発明の毒性部分の部位特異的な送達に関して、異常細胞を特異的に及び選択的にターゲティングする療法における使用に、特に適切な結合分子である。本発明の抗体の予期される主な使用はヒトの体に向けられる治療処置レジームであるために、本発明の特定の実施形態では、毒性部分を備える免疫グロブリンは、ヒト起源のアミノ酸配列を有する。そのため、一実施形態において、本発明は、異常細胞と優先的に関連するＭＨＣ−ペプチド複合体と特異的に結合する、少なくとも免疫グロブリン可変領域を含む、毒性部分を備えるヒトＩｇＧであって、前記免疫グロブリン可変領域がＶｈであり、前記免疫グロブリン可変領域がＶｌをさらに含む、ヒトＩｇＧを提供する。勿論、ヒト以外の他の種に由来するアミノ酸配列を包含する前駆体抗体を伴うヒト化抗体も、本発明の一部である。ヒト以外の種に由来する及びヒト抗体に移植された、本発明の免疫グロブリン可変領域（の一部）を含むキメラ抗体も、本発明の一部である。

異常細胞は、その健康な正常の対応物から逸脱する細胞と定義される。異常細胞は、例えば、腫瘍細胞、病原体、例えば、ウイルスにより侵襲された細胞、及び自己免疫細胞である。

そのため、一実施形態において、本発明は、上述の実施形態のいずれかに記載の免疫グロブリンであって、ＭＨＣ−ペプチド複合体が、異常細胞に特異的である、免疫グロブリンを提供する。

本発明の分子では、毒性部分は、当分野で知られている任意のリンカー化学物質を介して、場合によって追加のスペーサーを介して、免疫グロブリンに好ましくは化学的に連結されている。本発明によれば、１つ又はいくつかの、好ましくは２つ〜６つの毒性部分分子は、本発明の免疫グロブリン分子に化学的に連結されている。単一の免疫グロブリン分子１つ当たりコンジュゲートした毒性部分分子の数は、境界、例えば、免疫グロブリンにおけるコンジュゲーションに利用可能な部位の数、コンジュゲートの安定性、異常細胞に特異的に結合する免疫グロブリンの能力の保存性、などにより拘束される。勿論、２つ、３つ、などの異なる毒性部分も、とりわけ利用可能な結合部位及び適用されるリンカー化学に依拠して、免疫グロブリンと連結できる。毒性部分の化学的な連結は、免疫グロブリンで作業する場合に、いくつかの利点を有する。この様式では、毒性部分は、免疫グロブリン分子の発現、フォールディング、組立及び分泌に干渉できない。そのため、一実施形態において、本発明は、毒性部分が免疫グロブリンに化学的に連結されている、上述の実施形態のいずれかに記載の免疫グロブリンを提供する。従って、毒性部分が、本発明の免疫グロブリンにペプチド結合を介して、好ましくはペプチドリンカーを介して、共有結合的に結合されるものも、本発明の一部である。毒性部分及び免疫グロブリンは、次いで、ＤＮＡレベルで融合される。そのため、一実施形態において、本発明は、毒性部分が、好ましくは、免疫グロブリンにＤＮＡレベルで、好ましくはリンカー配列を通して、融合されたタンパク質である、上述の実施形態のいずれかに記載の免疫グロブリンを提供する。多くの事例において、４〜１５アミノ酸残基の単純なＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーで十分であろうが、免疫グロブリンと毒性部分の間の柔軟性がより大きいものが望ましい場合は、より長い又はより複雑なリンカーを使用してもよい。好ましいリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎ、（ＧｌｙＳｅｒＴｈｒＳｅｒＧｌｙＳｅｒ）ｎ、ＧｌｙＳｅｒＴｈｒＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＬｙｓＰｒｏＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｕＧｌｙＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＴｙｒＰｒｏＬｅｕＡｌａＰｒｏＶａｌＬｅｕＧｌｕＳｅｒＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙ又は活性を発揮するため、タンパク質フォールディングを許容する柔軟性、望まれないタンパク分解活性に対する安定性及び本発明の免疫グロブリンについての柔軟性を提供する、任意の他のリンカーである。別のグループの好ましいリンカーは、免疫グロブリンのヒンジ領域に基づくリンカーである。これらのリンカーは極めて柔軟性に富み、プロテアーゼに対して抵抗力が大きい傾向がある。ヒンジ領域に基づく最も好ましいリンカーは、ＧｌｕＰｒｏＬｙｓＳｅｒＣｙｓＡｓｐＬｙｓＴｈｒＨｉｓＴｈｒ（ＩｇＧ１におけるＣｈ１及びＣｈ２を連結する）、ＧｌｕＬｅｕＬｙｓＴｈｒＰｒｏＬｅｕＧｌｙＡｓｐＴｈｒＴｈｒＨｉｓＴｈｒ（ＩｇＧ３）、及びＧｌｕＳｅｒＬｙｓＴｙｒＧｌｙＰｒｏＰｒｏ（ＩｇＧ４）である。このように、本発明のコンジュゲートにおいて任意の適用される化学的なリンカーの役割又は本発明の融合された分子において任意の適用されるペプチドリンカーの役割は、本発明の抗体の二重活性（すなわち、免疫グロブリンの異常細胞への特異的な及び選択的な結合、並びに標的にされる異常細胞における少なくとも毒性部分の引き続く送達）を援助することである。そのため、一実施形態において、本発明は、異常細胞に関連する疾患に罹患している宿主の治療のための、上述の実施形態のいずれかに記載の毒性部分を備える免疫グロブリンの使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、異常細胞に関連する疾患に罹患している宿主の治療のための、上述の実施形態のいずれかに記載の毒性部分を備える免疫グロブリンの使用であって、少なくとも毒性部分が、異常細胞に内部移行される使用を提供する。本発明によれば、毒性部分を備える免疫グロブリンは、例えば、癌の治療のために使用される。そのため、好ましい実施形態において、本発明は、癌の治療に使用するための、上述の実施形態のいずれかに記載の毒性部分を備える免疫グロブリンを提供する。

本発明の好ましい毒性部分は、多数ある。本発明の好ましい毒性部分のいくつかの例は、数例を挙げると、本発明の免疫グロブリンに化学的にコンジュゲートされた、薬物、例えば、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、キレート化された放射性の金属イオン、（合成の）抗新生物剤、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎＥ）、放射性ヨウ素、放射性核種、例えば、９０−イットリウム、１３１−ヨウ素である。本発明の好ましい毒性部分はまた、タンパク質性の毒素、例えば、シュードモナス外毒素Ａの断片、スタチン、リシンＡ、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、ウイルス性タンパク質Ｅ４ｏｒｆ４、アポプチン（ａｐｏｐｔｉｎ）及びＮＳ１、並びに非−ウイルス性のタンパク質ＨＡＭＬＥＴ、ＴＲＡＩＬ及びｍｄａ−７である。そのため、本発明の一実施形態において、毒性部分が、毒素、例えば、シュードモナス外毒素Ａの断片、スタチン、キレート化された放射性の金属イオン、放射性ヨウ素、リシンＡ、ゲロニン、サポリン、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、放射性核種、例えば、９０−イットリウム、１３１−ヨウ素、薬物、例えば、ドキソルビシン、タキソール又は誘導体、５−ＦＵ、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、カリケアマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、（合成の）抗新生物剤、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ、アポプチン、パルボウイルス−Ｈ１ＮＳ１タンパク質、Ｅ４ｏｒｆ４、ＴＲＡＩＬ、ｍｄａ−７、ＨＡＭＬＥＴを含む、利用可能な毒性部分のリストから選択される、異常細胞を特異的にターゲティングするための抗体が提供される。

本発明によれば、タンパク質性分子は、少なくとも１鎖のアミノ酸残基を含む分子である。さらに、本発明によれば、タンパク質性分子は、糖、ジスルフィド結合、リン酸化、硫酸化、などを含んでいてもよい。

本発明の抗体が最初に標的の異常細胞に結合するために設計される場合、続いて内部移行し、そして引き続いて毒性部分が、その細胞内（細胞傷害性）の機能（すなわち、アポトーシスを誘導すること）を有し得る。

本発明の抗体を対象に投与するには製剤化される必要がある。典型的には、これらの抗体は非経口的に与えられる。製剤化のためには、注射用水（生理食塩水）だけで十分であり得る。安定性の理由で、さらに複雑な製剤が必要になることがある。本発明では、通常の添加剤と一緒に供給される凍結乾燥組成物及び液体組成物が企図されている。そのため、一実施形態において、本発明は、上述の実施形態のいずれかに記載の毒性部分を備える免疫グロブリンと適切な希釈剤及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

本発明の抗体の投与量は、いわゆる用量漸増実験における動物研究、（細胞ベースの）インビトロ研究及び臨床研究を通じて確立されなければならない。典型的には、用量は、（モルレベルで）今日の抗体投与量と同程度になる。典型的には、そのような投与量は３〜１５ｍｇ／ｋｇ体重、又は用量当たり２５〜１０００ｍｇである。

さらに、特に治療がさらに困難な細胞異常では、本発明の抗体の最初の適用は（少なくとも最初は）おそらく他の治療（標準的ケア）と組み合わせて行われることになる。勿論、本発明はまた、現時点の治療が十分に効率的ではない又は現時点の治療の選択肢が利用可能ではない、異常細胞の出現が付随する悪性疾患の新規の又は最初の治療の使用のための抗体を提供する。そのため、例えば、本発明はまた、本発明の毒性部分を備える免疫グロブリンと従来の細胞増殖抑制剤及び／又は殺腫瘍剤とを含む医薬組成物も提供する。さらに、本発明はまた、癌のアジュバンド治療において使用するための本発明の毒性部分を備える免疫グロブリンを含む医薬組成物を提供する。そのため、発明の一実施形態において、癌のアジュバンド治療において使用するために発明された毒性部分を備える免疫グロブリンが、提供される。加えて、本発明はまた、癌の組合せ化学療法において使用するための本発明の毒性部分を備える免疫グロブリンを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物と組み合わされる化学療法の例は、エトポシド、パクリタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン及びメトトレキセートである。

本発明の医薬組成物は、典型的には、癌の治療において、特に、好ましい本発明の抗体（ＭＨＣと腫瘍特異的抗原ペプチドとの複合体）の標的が腫瘍により提示されるタイプの癌においてその使用を見出すことになる。表１は、例えば、ＭＨＣとＭＡＧＥ−Ａペプチドとの複合体が見つかった腫瘍の一覧表である。本発明の抗体を用いて、これらの標的ＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する腫瘍を同定することは容易である。これはインビトロ又はインビボ（イメージング）で行うことが可能である。

本発明の抗体の結合部位を含む細胞表面分子が、本発明の抗体と一緒に又は少なくとも本発明の抗体の毒性部分と一緒に、標的にされる異常細胞に内部移行されることが好ましい。本発明の特に好ましい実施形態において、標的にされる異常細胞は、前記内部移行の結果として、アポトーシスに進行する。そのため、一実施形態において、本発明は、癌に罹患している宿主の治療のための、上述の実施形態のいずれかに記載の毒性部分を備える免疫グロブリンの使用であって、少なくとも毒性部分が、異常細胞に内部移行される使用を提供する。

勿論、本発明はまた、毒性部分が、本発明の抗体における免疫グロブリンに化学的に連結される場合に、本発明の実施形態のいずれかに記載の抗体の免疫グロブリン部分をコードする核酸分子を含む。そのため、本発明はまた、毒性部分が、免疫グロブリンにＤＮＡレベルで融合された場合に、本発明の実施形態のいずれかに記載の免疫グロブリン及び毒性部分をコードする核酸分子を含む。これらの本発明の分子は、原核生物又は真核生物において産生することが可能である。原核生物のコドン使用頻度は真核生物のコドン使用頻度とは異なることがある。本発明の核酸はこれらの点で適合させることが可能である。また、分泌に必要なエレメント、及びプロモーター、ターミネーター、エンハンサー等を加えてもよい。また、本発明のグロブリンの又は本発明の抗体の単離及び／又は精製に必要及び／又は有用なエレメントを加えてもよい。典型的には、本発明の核酸は、その核酸が産生されることになる宿主に適した発現ベクターの形で提供される。産生プラットフォームの選択は、分子のサイズ、タンパク質フォールディングを巡る予想される問題、グリコシル化を必要とする免疫グロブリン又は抗体にアミノ酸配列が存在するかどうか、単離及び／又は精製を巡る予想される問題、等に依拠することになる。例えば、本発明の免疫グロブリン又はタンパク質性の毒素におけるジスルフィド結合の存在は、典型的には、好ましい産生プラットフォームの選択をガイドすることになる。そのため、典型的には、本発明の核酸は、本発明の免疫グロブリンが、場合によって、融合されたタンパク質性の毒素と共に産生される、産生及び精製プラットフォームに適合される。そのため、本発明は、本発明の免疫グロブリン又は抗体をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。真核生物における安定した発現のためには、本発明の免疫グロブリン又は抗体をコードする核酸は（発現停止されない適切な部位で）宿主細胞ゲノムに組み込まれるのが好ましい。それ故、一実施形態において、本発明は、宿主細胞のゲノムに核酸を組み込むための手段を含むベクターを含む。本発明は、本発明の免疫グロブリンを、場合によって融合されたタンパク質性の毒素と共にコードする核酸分子が、存在し、そのため、免疫グロブリンを、場合によって本発明の融合されたタンパク質性の毒素と共に産生することができる、宿主細胞又は生物をさらに含む。そのため、好ましい実施形態において、本発明は、好ましくは細胞のゲノムに組み込まれる、本発明の核酸分子を含む細胞及び／又は本発明の免疫グロブリンが場合によって融合されたタンパク質性の毒素と共にコードされる核酸分子を含む、本発明のベクターを含む。

本発明はまた、本発明の免疫グロブリンを場合によって融合されたタンパク質性の毒素と共に産生するための方法であって、好ましくは細胞のゲノムに組み込まれる、本発明の免疫グロブリンを場合によって融合されたタンパク質性の毒素と共にコードする核酸分子及び／又は本発明の免疫グロブリンを場合によって融合されたタンパク質性の毒素と共にコードする核酸分子を含む本発明のベクター、を含む本発明の細胞を培養するステップと、免疫グロブリンを場合によって融合されたタンパク質性の毒素と共に発現させるステップと、免疫グロブリンを場合によって融合されたタンパク質性の毒素と共に培養物から分離するステップと、を含む方法を含む。

本発明の一実施形態において、本発明の分子における免疫グロブリン可変ドメインは、１つの結合部位を標的とする。また、本発明によれば、異常細胞の細胞表面に関連する２つの異なる結合部位に特異的に結合する、毒性部分を備える二重特異性免疫グロブリンが提供される。本発明の単一抗体で異常細胞、例えば、腫瘍細胞における、２つの異なる結合部位をターゲティングすることにより、両方の標的が同様に健常細胞にも連帯して提示されるとのリスクが、さらに著しく減少する。２つの異なる標的結合部位への別々の本発明の抗体の親和性は、好ましくは、Ｋ_ｏｎ及びＫ_ｏｆｆが、異なる結合部位の双方への同時の結合に向けて非常に非対称であるように設計される。そのため、本発明の二重特異性抗体の特異性は、異常細胞に関連する２つの異なる結合部位への結合に対する、それらの抗体の特異性を増加させることにより増加する。そのため、本発明の一実施形態において、以前の実施形態のいずれかに記載の抗体は、２つの異なるが補完的である重鎖を含む、ヘテロ二量体の二重特異性免疫グロブリンＧ又は重鎖のみの抗体である。２つの異なるが補完的である重鎖は、次いで、それらの重鎖のそれぞれのＦｃ領域を通して二量体化されてもよい。好ましいペアリング生化学を適用すると、ヘテロ二量体は、ホモ二量体に対抗して優先的に形成される。例えば、２つの異なるが補完的である重鎖は、［Ｒｉｄｇｗａｙら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９６（ｒｅｆ．１４）］に記載のような「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」ＣＨ３ドメインエンジニアリング技術の適用に際しての強制的なペアリングに供される。本発明の好ましい態様において、本発明の二重特異性免疫グロブリンにおける２つの異なる免疫グロブリン可変領域は、異常細胞と優先的に関連するＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的に結合する。

本発明の典型的な好ましい抗体は、本セクション、図５のＢ、及び以下に及び実施例のセクションに提供される例により、概説される抗体により例示される。このように、本発明は、図５のＢの毒性部分を備える免疫グロブリンを提供する。

大きなヒト非免疫抗体Ｆａｂファージライブラリーから単離されたＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ特異的ファージクローンの特異的結合。ビオチン化されたＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａに対して選択された個々の抗体Ｆａｂ発現ファージを、関連ペプチド／ＭＨＣ複合体のみに結合する能力についてＥＬＩＳＡにより分析した。ストレプトアビジン被膜９６ウェルプレートを、可溶性ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ（Ａ２／ＭｕｌｔｉＭａｇｅ）又はＨＬＡ−Ａ０２０１／ＪＣＶ（Ａ２／ＪＣ）ペプチド／ＭＨＣ複合体（１０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートし、そして、洗浄して非結合複合体を取り除き、個々のファージクローンと一緒にインキュベートした。まず、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎでの３回の洗浄により非結合ファージを取り除き、続いて室温で１時間、抗Ｍ１３抗体（１μｇ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）と一緒にインキュベートした。最後に、ウェルをＨＲＰ−標識二次抗体と一緒にインキュベートし、結合ファージを検出した。ファージＡＨ５、ＣＢ１及びＣＧ１は、マルチＭＡＧＥ−Ａペプチドを提示している細胞に特異的に結合する。関連ＨＬＡ−Ａ２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体及びＪＣＶペプチドが負荷された無関係なＨＬＡ−Ａ２０１複合体を使用するＥＬＩＳＡにおいて特異的結合を示したファージＡＨ５、ＣＢ１、ＣＧ１、ＢＤ５及びＢＣ７を、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子においてマルチＭＡＧＥ−Ａペプチドを提示する細胞に結合する能力について分析した。この目的のために、ヒトＢ−ＬＣＬ（ＢＳＭ）に、３７℃で３０分間、マルチＭＡＧＥ−Ａペプチド（１００μｌＰＢＳ中１０μｇ）を負荷し、続いてＦａｂファージＡＨ５、ＣＢ１、ＣＧ１、ＢＤ５及びＢＣ７と一緒にインキュベートし、抗ファージ抗体及び蛍光標識された二次抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した。ＨＬＡ−Ａ２／マルチＭＡＧＥ−Ａ特異的Ｆａｂを発現しているファージは、組織学的起源の異なる腫瘍細胞に結合する。ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａに特異的なファージＡＨ５、ＣＢ１及びＣＧ１、並びにＨＡ−０１０１／ＭＡＧＥ−Ａ１に特異的な陽性対照ファージを用いて、異なる腫瘍細胞株の染色を行った。この目的のために、前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、多発性骨髄腫細胞株ＭＤＮ、黒色腫細胞株ＭＺ２−ＭＥＬ４３及びＧ４３、並びに乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＤ１５７を異なるファージと一緒にインキュベート（４℃で３０分間）し、次いで、結合ファージを抗ファージ抗体及び蛍光標識された二次抗体を用いてフローサイトメトリーにより検出した。ファージＡＨ５はＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体のみに特異的に結合する。ファージＡＨ５の特異性を決定するために、関連の及び無関係なペプチド／ＭＨＣ複合体を用いてＥＬＩＳＡを実施した。マルチＭＡＧＥ−Ａ、ｇｐ１００、ＪＣＶ及びＭＡＧＥ−Ｃ２ペプチドを有するＨＬＡ−Ａ０２０１、並びにＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドを有するＨＬＡ−Ａ１をストレプトアビジン９６ウェルプレート上に被膜し、ファージＡＨ５と一緒にインキュベートした。本発明の好ましい毒性部分を備える免疫グロブリンの例を表示する絵。Ａ．免疫グロブリンＧに組み立てられる１２の免疫グロブリンドメインのトポロジーを表示する絵。Ｂ．本発明の好ましい毒性部分を備える免疫グロブリンの例が提供される。例えば、化学的なリンカーで免疫グロブリンに連結された細胞増殖抑制剤などの単一の毒性部分を備える免疫グロブリン（Ｉ．及びＩＩ．で例示される；免疫グロブリン−毒性部分コンジュゲート）、又はペプチドリンカーで免疫グロブリンに連結された単一の毒性部分を備える免疫グロブリン（ＩＩＩ．で例示される；融合された免疫グロブリン−毒性部分分子）が示される。ＩＶ．では、本発明の毒性部分を備える免疫グロブリンが示され、これは、融合されたタンパク質性の毒性部分を含む１つの免疫グロブリン重鎖を含む、特定の結合部位に特異的な免疫グロブリン可変領域を含む、及び異なる結合部位に特異的な免疫グロブリン可変領域を含む第二の免疫グロブリン重鎖を含むものである。勿論、異なる結合部位に特異的な異なる免疫グロブリン可変領域を含む２つの重鎖を含む及び同じ又は異なるタンパク質性の毒性部分の融合された２つの重鎖をさらに含む、本発明の二重特異性の毒性部分を備える免疫グロブリンも、本発明の一部である。勿論、本発明の一部として、１つよりも多い、及び典型的には、２〜６の毒性部分分子が、免疫グロブリン分子に融合又はコンジュゲートされることが可能である。ヒトＦａｂファージＦ９はＨＬＡ−Ａ２／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ陽性ＣＭＴ６４マウス肺腫瘍細胞に特異的に結合する。ヒトＦａｂクローンＦ９は、ＨＬＡ−Ａ２／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ複合体を安定に発現しているマウス肺腫瘍細胞（ＣＭＴ６４）に結合する能力について分析された。精製されたクローンＦ９のＦａｂ断片（３μｇの総容量）は、ヒトＨＬＡを発現しない、ＨＬＡ−Ａ２／ＹＬＥＹＲＱＶＰＧを発現する、又はＨＬＡ−Ａ２／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶを発現する、０．５×１０^６のＣＭＴ６４細胞と一緒にインキュベートされた。氷上で１時間インキュベートした後、ＣＭＴ６４細胞は、蛍光標識された二次抗体と一緒にインキュベートされ、フローサイトメトリーにより分析された。ＬｌａｍａＶＨＨはヒトＨＬＡ−Ａ２／マルチＭＡＧＥ−Ａ発現しているＣＭＴ６４マウス肺腫瘍細胞に特異的に結合する。Ａ２／ＦＬＷ又はＡ２／ＹＬＥに特異的なＬｌａｍａＶＨＨは、これらのヒトＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体を発現しているＣＭＴ６４細胞との結合能についてフローサイトメトリーにより分析された。精製されたＶＨＨ断片（３μｇの総容量）は、ヒトＨＬＡを発現しない、ＨＬＡ−Ａ２／ＹＬＥＹＲＱＶＰＧを発現する、又はＨＬＡ−Ａ２／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶを発現する、０．５×１０^６のＣＭＴ６４細胞と一緒にインキュベートされた。氷上で１時間インキュベートした後、ＣＭＴ６４細胞は、蛍光標識された二次抗体と一緒にインキュベートされ、フローサイトメトリーにより分析された。

本発明の一態様は、本発明の抗体を提供するための方法に関する。上述のように、この方法は典型的には、所望の本発明の抗体の免疫グロブリン部分をコードする又はタンパク質性の毒性部分に融合された所望の免疫グロブリンをコードする核酸構築物を用意するステップを伴う。前記核酸構築物は、好ましくはプラスミド又は発現ベクターを介して、構築物を発現することができる原核宿主細胞に及び／又は植物細胞に及び／又は真核宿主細胞に導入することが可能である。一実施形態において、免疫グロブリンを提供する又はタンパク質性の毒性部分に融合された免疫グロブリンを提供する、本発明の方法は、前記免疫グロブリン又はタンパク質性の毒性部分に融合された前記免疫グロブリンをコードする核酸（複数可）を宿主細胞に供給し、前記宿主細胞により前記核酸（複数可）を発現させるステップを含む。

上記の実施形態のいずれかに記載の選択された（ヒト）免疫グロブリンＶｈ（ｈ）ドメインをコードする核酸を、ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインをコードする核酸と組み合わせて、ヒト抗体の重鎖をコードする本発明の核酸分子を提供することは、本発明の一部である。本発明のそのような核酸分子のヒト抗体重鎖タンパク質産物は、次いで、ユニバーサルなヒト抗体軽鎖とヘテロ二量体化させてもよい。上記の実施形態のいずれかに記載の（連帯して）選択されたヒト免疫グロブリンＶｌドメイン及びＶｈドメインをコードする核酸を、それぞれ、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常ドメインをコードする核酸と組み合わせて及びヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインをコードする核酸と組み合わせて、ヒト抗体の軽鎖を及び重鎖をコードする本発明の核酸分子を提供することも、本発明の一部である。本発明のさらに別の実施形態において、上記の実施形態のいずれかに記載の選択された免疫グロブリンＶｈドメイン及び／又は選択された免疫グロブリンＶｌドメインの免疫グロブリン可変領域を一緒に形成する、相補性決定領域１、２及び３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）をコードする核酸は、それぞれ、ヒト免疫グロブリンＶｈドメインフレームワーク領域及び／又はヒト免疫グロブリンＶｌドメインフレームワーク領域をコードする核酸と組み合わされて、ヒト抗体の重鎖可変ドメイン（Ｖｈ）をコードする及び／又はヒト抗体の軽鎖可変ドメイン（Ｖｌ）をコードする、本発明の核酸分子を提供する（当分野で「移植」として知られている方法）。本発明の一部として、これらの可変ドメインＶｈ及び／又はＶｌをコードする核酸分子は、次いで、ヒト免疫グロブリン定常ドメインをコードする核酸と組み合わされて、ヒト抗体重鎖をコードする核酸分子を提供する及び／又はヒト抗体軽鎖をコードする核酸分子を提供する。

本発明によれば、免疫グロブリン又はタンパク質性の毒性部分に融合された免疫グロブリンは、例えば、植物細胞、真核細胞又は原核細胞において発現される。適切な発現系の非限定的な例は、タバコ植物、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセスセレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。セルフリーの組換えタンパク質産生プラットフォームも適切である。好ましい宿主細胞は、細菌（例えば、細菌株ＢＬ２１、株ＳＥ１）、又は哺乳動物宿主細胞、より好ましくはヒト宿主細胞である。適切な哺乳動物宿主細胞には、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞、ＰｅｒＣ６細胞又は好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれ、これらの細胞は市販されている。バキュロウイルス又は昆虫細胞発現ベクターを用いて昆虫細胞（例えばＳ２又はＳ９細胞）を使用してもよいが、本発明の免疫グロブリン又は融合された免疫グロブリン−毒性部分分子がグリコシル化を伴うエレメントを含む場合にはこれらの細胞はそれほど適切ではない。本発明による、産生される免疫グロブリン又は融合された免疫グロブリン−毒性部分分子は、宿主細胞から又は、それらが分泌される場合には、宿主細胞の培養培地から抽出する又は単離することが可能である。そのため、一実施形態において、本発明の方法は、前記免疫グロブリン又は前記融合された免疫グロブリン−毒性部分分子をコードする１つ又は複数の核酸（複数可）を宿主細胞に供給し、前記宿主細胞により前記核酸を発現させるステップを含む。別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、２つ以上の異なる免疫グロブリン又は２つ以上の異なる融合された免疫グロブリン−毒性部分分子をコードする１つ又は複数の核酸（複数可）を宿主細胞に供給し、前記宿主細胞により前記核酸を発現させるステップを含む。例えば、一実施形態において、いわゆるユニバーサルな免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸及び２つ以上の異なる免疫グロブリン重鎖をコードする核酸は、すべての異なる重鎖にユニバーサルな軽鎖が複合体化されて提供されて、重鎖のホモ二量体を含む単一特異性免疫グロブリン又は単一特異性の融合された免疫グロブリン−毒性部分分子の単離を可能とし及び／又は重鎖のヘテロ二量体を含む二重特異性免疫グロブリン又は二重特異性の融合された免疫グロブリン−毒性部分分子の単離を可能とする。（哺乳動物）宿主細胞における（哺乳動物）タンパク質の組換え発現のための方法は当分野では周知である。

前記のとおり、本発明の免疫グロブリンは、ペプチド結合以外の結合及び／又は結合相互作用を介して、毒性部分に連結されることが好ましい。タンパク質性分子を連結するための方法（例えば、免疫グロブリンを他のタンパク質性分子又は非タンパク質性分子）は、多数あり、タンパク質連結化学の当業者には周知である。ペプチド結合に基づかないタンパク質連結化学は、共有結合的な相互作用及び／又は非共有結合的な相互作用に基づくことが可能である。毒性部分を本発明の免疫グロブリンに連結するために適用可能な連結化学の典型的な例は、特許出願国際公開第９２／０１６９９号パンフレット、国際公開第９６／３５６９６号パンフレット、国際公開第９８／４５３０４号、国際公開第０３０４０７２２号パンフレットに開示されるＵｎｉｖｅｒｓａｌＬｉｎｋａｇｅＳｙｓｔｅｍの種々の適用である。

後述のとおり、本発明の抗体は、多くの治療的適用及び非治療的適用（例えば診断学的又は科学的適用）においてその使用を見出す。診断目的のための、本発明の抗体又はより好ましくは本発明の抗体の免疫グロブリン部分は、本発明の抗体により標的にされる異常細胞における結合部位を曝露する分子の発現レベルのモニタリングのために特に使用される。この様式で、療法が有効に維持されているかどうか又は代わりに、異常細胞における１つ又は２つの異なる結合部位をターゲティングする本発明の他の抗体を適用すべきかどうかがモニターされる。これは、最初の又は最初２つの標的にされた結合部位（複数可）の発現レベルが、特定の閾値未満であるが、別の又は新しい結合部位が（なおも）、これらの代替の結合部位（複数可）に対して適切な特異的な免疫グロブリン可変領域を含む本発明の抗体に対して新しく標的にされる結合部位として役立つことができる場合に有益である。本発明の抗体は、（循環している）腫瘍細胞の検出のため、及び免疫刺激性分子の標的細胞特異的送達のためにも使用することができる。これらの後者の２つの使用のため、融合された又はコンジュゲートされた毒性部分なしで、本発明の単独の免疫グロブリンを使用することもできる。

標的細胞の生物学的プロセスにおけるモジュレーティング効果をエクスビボ又はインビボで誘導するための方法であって、モジュレーティング効果を誘導するために効果的な量で本発明の抗体に前記細胞を接触させるステップを含む方法が本明細書に提供される。本発明の抗体は、対象（より好ましくはヒト対象）において異常細胞の生物学的プロセスにおけるモジュレーティング効果のために使用されることが好ましい。ヒトにおける治療的適用では、本発明の抗体は、非ヒト起源のアミノ酸配列を含有しないことが勿論好ましい。ヒトアミノ酸配列のみを含有する本発明の抗体がより好ましい。それ故、１つ又は２つの疾患特異的な結合部位を認識すること及び結合すること及び引き続いて細胞の生物学的プロセスにおけるモジュレーティング効果を誘導することができる治療的有効量の本発明の抗体を患者に投与して、前記疾患特異的な結合部位（複数可）を発現していない（正常）細胞の生存能に影響を与えることなく、結合部位（複数可）を発現している異常細胞の根絶を促すことが可能である。健常細胞の衰退又はさらには死を最小限に抑える又はさらには回避しつつ異常細胞を特異的に死滅させると、一般的には本発明の抗体の投与後の患者の治療成績は改善されることになる。

それに応じて、医薬としての本発明の抗体の使用も提供される。別の態様において、本発明は、癌、自己免疫疾患、感染症又は何らかの他の疾患の治療のための医薬の製造のための抗体の使用であって、その症状が、疾患特異的な結合部位を発現している異常細胞のターゲティングに際して、本発明の抗体で低減される疾患の治療のための医薬の製造のための抗体の使用を提供する。例えば、本発明の抗体は、種々の癌（例えば、固形腫瘍、血液系悪性腫瘍（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ））の治療のための医薬の製造のため有利に使用される。

本発明の好ましい抗体の例は、少なくとも、ＭＨＣ−１ＨＬＡ−０２０１とマルチＭＡＧＥ−Ａエピトープの間の複合体に特異的に結合する免疫グロブリン可変領域を含み、例えば、コンジュゲーションに関してＵｎｉｖｅｒｓａｌＬｉｎｋａｇｅＳｙｓｔｅｍのリンカー化学を用いて毒性部分とコンジュゲートされた抗体である。本発明の好ましい抗体の第２の例は、少なくとも、ＭＨＣ−１ＨＬＡ−ＣＷ７とマルチＭＡＧＥ−Ａエピトープの間の複合体に特異的に結合する免疫グロブリン可変領域を含み、例えば、コンジュゲーションに関してＵｎｉｖｅｒｓａｌＬｉｎｋａｇｅＳｙｓｔｅｍのリンカー化学を用いて毒性部分とコンジュゲートされた抗体である。標的にすることが困難な及び／又は到達することが困難な異常細胞は、本発明の二重特異性抗体により、本発明の二重特異性抗体における２つの異なる免疫グロブリン可変領域の少なくとも１つにより「ヒット」されるチャンスが高く、それにより、少なくとも部分的に治療活性が提供される。本発明の好ましい二重特異性抗体の例は、ＭＨＣ−１ＨＬＡ−０２０１とマルチＭＡＧＥ−Ａエピトープの間の複合体に特異的な免疫グロブリン可変領域を含み及びＭＨＣ−１ＨＬＡ−ＣＷ７と第２のマルチＭＡＧＥ−Ａエピトープの間の複合体に特異的な第２の免疫グロブリン可変領域を含み、毒性部分とコンジュゲートされた免疫グロブリンである。

ヒト起源の抗体断片は、ファージにより表示される大きな抗体レパートリーから単離することが可能である。本発明の一態様は、選択された結合部位、例えば、エピトープに特異的なヒト抗体断片の選択のための、ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの使用であり、当分野で知られている。そのようなライブラリーの例は、ヒトＶｈレパートリー、ヒトＶｈ−Ｖｌレパートリー、ヒトＶｈ−Ｃｈ１又はヒト抗体Ｆａｂ断片レパートリーを含むファージライブラリーである。

本発明はＭＨＣと抗原ペプチドとの多くの異なる組合せを企図しているが、最も好ましいのは、ＭＨＣ−１と、異常細胞により排他的に発現され、健常細胞により発現されない、前記ＭＨＣ−１により提示される腫瘍関連抗原由来の抗原ペプチドとの組合せである。ＨＬＡ拘束性のために、ＭＨＣにおけるペプチド提示の規則に基づいて設計可能なＭＨＣ−１−ペプチド複合体及びＭＨＣ−２−ペプチド複合体の組合せは多く存在する。これらの規則には、ＭＨＣに関連して提示することができるペプチドに対するサイズ制限、細胞における抗原のプロセシングのために存在する必要がある制限部位、提示されるペプチド上に存在する必要があるアンカー部位等が含まれる。ＨＬＡクラス又はＭＨＣクラスが異なれば、正確な規則は異なる。ＭＡＧＥ由来ペプチドはＭＨＣ関連での提示に非常に適していることを我々は見出した。ＭＡＧＥ−Ａに配列Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｇ（配列番号３）を有するＭＨＣ−１提示可能抗原ペプチドが同定され、このペプチドは、ほぼすべてのＭＡＧＥ−Ａバリアント（マルチＭＡＧＥペプチド）に存在するものであり、また、白人集団において最も広く認められるＭＨＣ−１対立遺伝子の１つ（すなわち、ＨＬＡ−Ａ０２０１）によって提示されるものである。別のＭＨＣ−１対立遺伝子（すなわち、ＨＬＡ−ＣＷ７）により提示され、多くのＭＡＧＥバリアント（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ６、及び−Ａ１２）に存在する第２のＭＡＧＥペプチドは、Ｅ−Ｇ−Ｄ−Ｃ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｅ−Ｋ（配列番号４）である。ＭＨＣ−１とＭＡＧＥペプチドとのこれら２つの組合せを一緒にすると、白人集団の８０％をカバーするであろう。他のＭＨＣ分子、他のＨＬＡ拘束性及び腫瘍関連抗原に由来する他の抗原ペプチドについても同じアプローチに従うことができる。重要な関連事項は、応答を誘発するために選択される抗原ペプチドがＭＨＣ分子との関連で提示され、その関連でのみ認識されなければならないことである。さらに、抗原ペプチドは十分に腫瘍特異的な抗原に由来していなければならず、ＨＬＡ拘束性は集団のかなりの部分で存在していなければならない。本発明の重要な利点の１つは、標的ＭＨＣ−ペプチド複合体を下方制御する腫瘍を、同じ抗原に基づく異なるＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する少なくとも１つの可変領域を含む第２の免疫グロブリンで治療することができる点である。これが下方制御された場合、第３のものが利用可能になる。ヘテロ接合体では、ＭＨＣ−１上の６つの異なる標的が利用可能になり得る。細胞は免疫系により時折「検査される」必要があるので、すべてのＭＨＣ分子の下方制御を通じた逃避は実現可能な逃避経路とは思われない。ＭＡＧＥが、ペプチドが由来する抗原である場合には、抗原の下方制御を通じた逃避も可能ではない、その理由は、ＭＡＧＥが腫瘍の生存にとって重要であると思われるからである［８］。このように、本発明は、重要な態様において、治療からの腫瘍の逃避を低減又はさらには防止する。そのため、本発明は、好ましい実施形態において、免疫グロブリン可変領域がＭＨＣ−Ｉ−ペプチド複合体に結合することができる本発明の抗体を提供する。さらに好ましい実施形態において、本発明は、免疫グロブリン可変領域が、腫瘍関連抗原に由来する抗原ペプチドを含むＭＨＣ−Ｉ−ペプチド複合体、特に種々のＭＡＧＥ抗原に存在する抗原ペプチドを含むＭＨＣ−Ｉ−ペプチド複合体に結合することができ、毒性部分を備える、免疫グロブリンを提供する。

一実施形態において、本発明は、ＭＨＣ分子を標的として使用し、個体によりＭＨＣ標的の利用能が異なるために、本発明は個体のＨＬＡ組成を決定するためのいわゆるコンパニオン診断も提供する。本発明は好ましくは多かれ少なかれユニバーサル（ＭＡＧＥ）ペプチドを使用するが、本発明は、腫瘍による特定の抗原の発現を判定するための診断も提供する。この様式で、本発明の療法は、特に上述の逃避を防止する状況においても患者（個別の医療、患者の層化）に適合させることが可能である。アジア集団及び黒人集団のＨＬＡ拘束性パターンは白人集団とは異なることが知られている。異なる集団に関して、異なるＭＨＣ−ペプチド複合体が標的にされることが可能である。

本明細書は腫瘍に関するより詳細な開示をするが、本発明の抗体により他の異常細胞も標的にすることが可能であることは理解されなければならない。これらの他の異常細胞は、典型的には、十分な制御なしで増殖する細胞である。これは自己免疫疾患において起こる。これらの細胞は腫瘍抗原の発現を示し始めるのが典型的である。特に、ＭＡＧＥポリペプチドは、関節リウマチにおいて同定された［７］。

文献では、ＭＡＧＥ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ４、−Ａ６、−Ａ１０及び−Ａ１２に存在する単一９アミノ酸（Ａ．Ａ．）ペプチドは、腫瘍細胞上でＨＬＡ−Ａ０２０１により提示され、細胞傷害性Ｔリンパ球により認識されることが可能であることが明らかにされている［１］。配列Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｇ（配列番号３）を有するこの９アミノ酸残基ペプチドは、９位でのアンカー残基を除いてＨＬＡ−Ａ０２０１提示ＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｄ（配列番号５）とほぼ同一である。アンカー残基をバリンに置き換えると、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子への結合能が増強された９アミノ酸残基ペプチドが生じる［１］。ＨＬＡ−０２０１により提示されるＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｖ（配列番号６）ペプチドを認識するヒト及びマウスＴリンパ球は、起源の異なる腫瘍上に提示される元のＭＡＧＥ−ＡＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｇ及びＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｄペプチドも認識する。多様な腫瘍はそれぞれが少なくとも１つのＭＡＧＥ−Ａ遺伝子を発現することができるので、このいわゆるマルチＭＡＧＥ−Ａエピトープのターゲティングには大多数の腫瘍が含まれる。例えば、ヒト前立腺腫瘍細胞株及びヒト異種移植片におけるＭＡＧＥ−Ａ発現が分析され、極めて多様であることが明らかにされたが、試験された個々のサンプルでは少なくとも１種のＭＡＧＥ−Ａ遺伝子が発現していた（表２）、このことは、このマルチＭＡＧＥ−Ａエピトープのターゲティングが、ユニバーサルなＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性治療標的として働くことを確認している。

勿論、いくつかの他のマルチＭＡＧＥ又はマルチ標的エピトープを設計してもよい。原理的には、本発明では、異常細胞においてアポトーシスを誘導するために、ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩの双方の異なるＨＬＡ拘束性を有し、毒性部分に連結された免疫グロブリンの標的となる、腫瘍特異的抗原由来のＭＨＣ提示エピトープの組合せが企図されている。本発明の抗体により標的にされることが可能なＭＨＣ−ＭＡＧＥペプチド組合せの例は、ペプチドＩＭＰＫＡＧＬＬＩ（ＭＡＧＥ−Ａ３）［配列番号８］及びＨＬＡ−ＤＰ４又はペプチド２４３−ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ−２５８（ＭＡＧＥ−Ａ３）［配列番号９］及びＨＬＡ−ＤＱ６である。ＨＬＡと抗原ペプチドとの腫瘍特異的な複合体の他の非限定的な例は、黒色腫、乳癌、ＳＣＬＣ、肉腫、ＮＳＣＬＣ、結腸癌腫（ｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）に関連する異常細胞で発現される、ＨＬＡＡ１−ＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドＥＡＤＰＴＧＨＳＹ［配列番号１０］、ＨＬＡＡ３−ＭＡＧＥ−Ａ１ＳＬＦＲＡＶＩＴＫ［配列番号１１］、ＨＬＡＡ２４−ＭＡＧＥ−Ａ１ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ［配列番号１２］、ＨＬＡＡ２８−ＭＡＧＥ−Ａ１ＥＶＹＤＧＲＥＨＳＡ［配列番号１３］、ＨＬＡＢ３７−ＭＡＧＥ−Ａ１／Ａ２／Ａ３／Ａ６ＲＥＰＶＴＫＡＥＭＬ［配列番号１４］である（Ｒｅｎｋｖｉｓｔ、Ｎ．ら、ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００１）Ｖ５０：３−１５（ｒｅｆ．１３））。さらなる例は以下のものであり、ＨＬＡＢ５３−ＭＡＧＥ−Ａ１ＤＰＡＲＹＥＦＬＷ［配列番号１５］、ＨＬＡＣｗ２−ＭＡＧＥ−Ａ１ＳＡＦＰＴＴＩＮＦ［配列番号１６］、ＨＬＡＣｗ３−ＭＡＧＥ−Ａ１ＳＡＹＧＥＰＲＫＬ［配列番号１７］、ＨＬＡＣｗ１６−ＭＡＧＥ−Ａ１ＳＡＹＧＥＰＲＫＬ［配列番号１８］、ＨＬＡＡ２−ＭＡＧＥＡ２ＫＭＶＥＬＶＨＦＬ［配列番号１９］、ＨＬＡＡ２−ＭＡＧＥ−Ａ２ＹＬＱＬＶＦＧＩＥＶ［配列番号２０］、ＨＬＡＡ２４−ＭＡＧＥ−Ａ２ＥＹＬＱＬＶＦＧＩ［配列番号２１］、ＨＬＡ−Ａ１−ＭＡＧＥ−Ａ３ＥＡＤＰＩＧＨＬＹ［配列番号２２］、ＨＬＡＡ２−ＭＡＧＥ−Ａ３ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ［配列番号２３］、ＨＬＡＢ４４−ＭＡＧＥ−Ａ３ＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹ［配列番号２４］、ＨＬＡＢ５２−ＭＡＧＥ−Ａ３ＷＱＹＦＦＰＶＩＦ［配列番号２５］、ＨＬＡＡ２−ＭＡＧＥ−Ａ４ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ［配列番号２６］、ＨＬＡＡ３４−ＭＡＧＥ−Ａ６ＭＶＫＩＳＧＧＰＲ［配列番号２７］、ＨＬＡＡ２−ＭＡＧＥ−Ａ１０ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ［配列番号２８］、ＨＬＡＣｗ７−ＭＡＧＥ−Ａ１２ＶＲＩＧＨＬＹＩＬ［配列番号２９］、ＨＬＡＣｗ１６−ＢＡＧＥＡＡＲＡＶＦＬＡＬ［配列番号３０］、これらは、例えば、黒色腫、膀胱癌腫、ＮＳＣＬＣ、肉腫により発現される、ＨＬＡＡ２−ＤＡＭ−６／−１０ＦＬＷＧＰＲＡＹＡ［配列番号３１］、これは、例えば、皮膚腫瘍、肺癌腫、卵巣癌腫、乳房癌腫により発現される、ＨＬＡＣｗ６−ＧＡＧＥ−１／−２／−８ＹＲＰＲＰＲＲＹ［配列番号３２］、ＨＬＡＡ２９−ＧＡＧＥ−３／−４／−５／−６／−７ＢＹＹＷＰＲＰＲＲＹ［配列番号３３］、これら双方は、例えば、黒色腫、白血病細胞、膀胱癌腫により発現される、ＨＬＡＢ１３−ＮＡ８８−ＡＭＴＱＧＱＨＦＬＱＫＶ［配列番号３４］、これは黒色腫により発現される、ＨＬＡＡ２−ＮＹ−ＥＳＯ−１ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ［配列番号３５］、ＨＬＡＡ２−ＮＹ−ＥＳＯ−１ａＳＬＬＭＷＩＴＱＣ［配列番号３６］、ＨＬＡＡ２−ＮＹ−ＥＳＯ−１ａＱＬＳＬＬＭＷＩＴ［配列番号３７］、ＨＬＡＡ３１−ＮＹ−ＥＳＯ−１ａＡＳＧＰＧＧＧＡＰＲ［配列番号３８］、後者４つは、例えば、黒色腫、肉腫、Ｂ−リンパ腫、前立腺癌腫、卵巣癌腫、膀胱癌腫により発現される。

本発明は、以下に提供される非限定的な実施例によりさらに例示される。

［使用される略語］
Ａ．Ａ．、アミノ酸；Ａｂ、抗体；β２−Ｍ、ＣＤＲ、相補性決定領域；ＣＨＯ、チャイニーズハムスター卵巣；ＣＴ、癌精巣抗原；ＣＴＬ、細胞傷害性Ｔ−リンパ球；Ｅ４ｏｒｆ４、アデノウイルス早期領域４オープンリーディングフレーム；ＥＢＶ、エプスタインバーウイルス；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着検定法；ＨＡＭＬＥＴ、腫瘍細胞に致死的なヒトα−ラクトアルブミン（ｈｕｍａｎ α−ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎｍａｄｅｌｅｔｈａｌｔｏｔｕｍｏｒｃｅｌｌ）；ＨＥＫ、ヒト胚性腎臓；ＨＬＡ、ヒト白血球抗原；Ｉｇ、免疫グロブリン；ｉ．ｖ．、静脈内；ｋＤａ、キロダルトン；ＭＡＧＥ、黒色腫関連抗原；Ｍｄａ−７、黒色腫分化関連遺伝子−７；ＭＨＣ、主要組織適合複合体；ＭＨＣ−ｐ、ＭＨＣ−ペプチド；ＮＳ１、パルボウイルス−Ｈ１由来非構造タンパク質１；ＰＢＳＭ、ＰＢＳ含有２％無脂肪ドライミルク；ＴＣＲ、Ｔ−細胞レセプター；ＶＨ、Ｖｈ又はＶＨ、免疫グロブリン可変重ドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｖａｒｉａｂｌｅｈｅａｖｙｄｏｍａｉｎ）のアミノ酸配列；Ｖｌ、免疫グロブリン可変軽ドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｖａｒｉａｂｌｅｌｉｇｈｔｄｏｍａｉｎ）のアミノ酸配列；ＴＲＡＩＬ、腫瘍壊死因子関連アポトーシス−誘導リガンド。

実施例１
少なくとも免疫グロブリン可変領域であって、異常細胞と優先的に関連するＭＨＣ−ペプチド複合体に又は異常細胞と優先的に関連する異常細胞表面マーカーに特異的に結合する免疫グロブリン可変領域を含み、例えば、図５のＢ概説されるような、ドメイントポロジーを有する、本発明の免疫グロブリンの非網羅的な例は、以下のものである：
以下のものに特異的に結合する免疫グロブリン可変領域を含む本発明の抗体
ａ．前立腺癌の治療のため、ＨＬＡ−Ａ２により提示される、ＰＳＡの１４６−ＫＬＱＣＶＤＬＨＶ−１５４［配列番号７４］、１４１−ＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶ−１５０［配列番号７５］、１５４−ＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶ−１６３［配列番号７６］、１５４−ＹＩＳＮＤＶＣＡＱＶ−１６３［配列番号７７］及び／又はＨＬＡ−Ａ３により提示される、ＰＳＡの１６２−ＱＶＨＰＱＫＶＴＫ−１７０［配列番号７８］、及び／又はＨＬＡ−Ａ２４により提示される、ＰＳＡの１５２−ＣＹＡＳＧＷＧＳＩ−１６０［配列番号７９］、２４８−ＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩ−２５７［配列番号８０］、及び／又はＨＬＡ−Ａ２により提示される、ＰＳＭＡの４−ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ−１２［配列番号８１］、７１１−ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ−７１９［配列番号８２］、２７−ＶＬＡＧＧＦＦＬＬ−３５［配列番号８３］、及び／又はＨＬＡ−Ａ２４により提示される、ＰＳＭＡの１７８−ＮＹＡＲＴＥＤＦＦ−１８６［配列番号８４］、２２７−ＬＹＳＤＰＡＤＹＦ−２３５［配列番号８５］、６２４−ＴＹＳＶＳＦＤＳＬ−６３２［配列番号８６］、及び／又はＨＬＡ−Ａ２により提示される、ＰＡＰの２９９−ＡＬＤＶＹＮＧＬＬ−３０７［配列番号８７］及び／又はＨＬＡ−Ａ２４により提示される、ＰＡＰの２１３−ＬＹＣＥＳＶＨＮＦ−２２１［配列番号８８］及び／又はＭＨＣ−２により提示される、ＰＡＰの１９９−ＧＱＤＬＦＧＩＷＳＫＶＹＤＰＬ−２１３［配列番号８９］、２２８−ＴＥＤＴＭＴＫＬＲＥＬＳＥＬＳ−２４２［配列番号９０］及び／又はＨＬＡ−Ａ２により提示される、ＰＳＣＡの１４−ＡＬＱＰＧＴＡＬＬ−２２［配列番号９１］、１０５−ＡＩＬＡＬＬＰＡＬ−１１３［配列番号９２］、７−ＡＬＬＭＡＧＬＡＬ−１５［配列番号９３］、２１−ＬＬＣＹＳＣＫＡＱＶ−３０［配列番号９４］及び／又はＤＲＢ１^＊０４０４により提示される、カリクレイン４の１５５−ＬＬＡＮＧＲＭＰＴＶＬＱＣＶＮ−１６９［配列番号９５］及び／又はＤＲＢ１^＊０７０１により提示される、カリクレイン４の１６０−ＲＭＰＴＶＬＱＣＶＮＶＳＶＶＳ−１７４［配列番号９６］及び／又はＤＰＢ１^＊０４０１により提示される、カリクレイン４の１２５−ＳＶＳＥＳＤＴＩＲＳＩＳＩＡＳ−１３９［配列番号９７］から選択されるＴ−細胞エピトープを含む複合体；
ｂ．ＥＢＶ感染細胞のクリアランスのため、ＭＨＣＩと複合体化される、ＥＢＶ核抗原３からのＨＬＡＢ８拘束性エピトープ、ＦＬＲＧＲＡＹＧＬ［配列番号９８］；
ｃ．これらのＭＨＣ−ペプチド複合体（表１を参照されたい）を発現している腫瘍細胞が付随する癌の治療のため、ＭＨＣ１ＨＬＡ−Ａ０２０１により提示される、ＭＡＧＥ−ＡペプチドＹＬＥＹＲＱＶＰＧ；
ｄ．これらのＭＨＣ−ペプチド複合体（表１を参照されたい）を発現している腫瘍細胞が付随する癌の治療のため、ＭＨＣ−１ＨＬＡ−ＣＷ７により提示される、ＭＡＧＥ−ＡペプチドＥＧＤＣＡＰＥＥＫ；
ｅ．前立腺癌の治療のため、ＨＬＡ−Ａ２とＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＤ８＋Ｔ−細胞エピトープ、例えば、九量体ペプチドＦＬＦＬＬＦＦＷＬ［配列番号９９］（前立腺酸性ホスファターゼ由来（ＰＡＰ，同様に前立腺特異的な酸性ホスファターゼ（ＰＳＡＰ）））、ＴＬＭＳＡＭＴＮＬ［配列番号１００］（ＰＡＰ由来）、ＡＬＤＶＹＮＧＬＬ［配列番号１０１］（ＰＡＰ由来）、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ＣＴＬエピトープＩＬＬＷＱＰＩＰＶ［配列番号１０２］（ＰＡＰ−３由来）、前立腺の六回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）との複合体、又はＨＬＡ−Ａ２．１とＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ＣＴＬエピトープＬＬＬＧＴＩＨＡＬ［配列番号１０３］（ＳＴＥＡＰ−３由来）、ムチンに由来するエピトープ（ＭＵＣ−１及びＭＵＣ−２）、ＭＵＣ−１−３２ｍｅｒ（ＣＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡ［配列番号１０４］）、ＧｌｏｂｏＨ、Ｌｅｗｉｓ^ｙ、Ｔｎ（ｃ）、ＴＦ（ｃ）クラスター、ＧＭ２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、カリクレイン４、プロステインに由来するエピトープとの複合体、又はＨＬＡ−Ａ２．１とＢＡ４６、ＰＴＨ−ｒＰ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、及びＭＡＧＥ−Ａ８に由来するＨＬＡ−Ａ２．１拘束性エピトープとの複合体；
ｆ．異常細胞（例えば、乳癌における）のターゲティングのため又は結腸直腸癌の治療のため、異常細胞特異的変更型ＭＵＣ−１における異常細胞特異的エピトープをＭＨＣと複合体化したもの、又は異常細胞特異的変更型ＭＵＣ−１における異常細胞特異的エピトープ；
ｇ．多形性脳腫瘍グリオブラストーマの治療のため、異常細胞特異的上皮細胞成長因子レセプター変異型ｖＩＩＩの異常細胞特異的エピトープをＭＨＣと複合体化したもの、又は上皮細胞成長因子レセプター変異型ｖＩＩＩの異常細胞特異的エピトープ；
ｈ．Ｈｅｒ−２及び／又はＨｅｒ−１過剰発現に関連する悪性腫瘍の治療のため、ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕのＴ−細胞エピトープペプチド３６９〜３７６とＭＨＣとの複合体；
ｉ．多発性骨髄腫の治療のため、ＣＤ４４−ｖ６、ＣＤ４４−ｖ９、ＣＤ４４−ｖ１０として知られる異常細胞特異的表面マーカーＣＤ４４スプライスバリアントのエピトープをＭＨＣと複合体化したもの、又は異常細胞特異的ＣＤ４４スプライスバリアントの異常細胞特異的エピトープ；

本発明の抗体による、感染した異常細胞の特異的及び選択的なターゲティングに適切な標的結合部位は、ＭＨＣ分子と複合体化される病原体由来抗原ペプチドである。ヒト乳頭腫ウイルスのＥ６及びＥ７タンパク質のＴ−細胞エピトープと示されるＨＬＡ分子とが複合体化される例は、以下に提供される。ＨＬＡ分子と病原体由来Ｔ−細胞エピトープとが複合体化される組合せによって、本発明の抗体に対する、感染した異常細胞における特異的な標的が提供される。感染した異常細胞の例は、ＭＨＣとの関連で、例えば、Ｅ６又はＥ７タンパク質に由来するＴ−細胞エピトープを提示している、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）に感染した頚部におけるケラチノサイトである。適切な標的ＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープの例は、ＨＬＡＡ１に結合する、ペプチドＦＱＤＰＱＥＲＰＲ［配列番号３９］、ＴＴＬＥＱＱＹＮＫ［配列番号４０］、ＩＳＥＹＲＨＹＣＹＳ［配列番号４１］及びＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫ［配列番号４２］、ＨＬＡＡ２に結合する、ＫＩＳＥＹＲＨＹＣ［配列番号４３］及びＹＣＹＳＩＹＧＴＴＬ［配列番号４４］、ＨＬＡＡ３に結合する、ＬＬＲＲＥＶＹＤＦ［配列番号４５］及びＩＶＹＲＤＧＮＰＹ［配列番号４６］、ＨＬＡＡ１１に結合する、ＴＴＬＥＱＱＹＮＫ［配列番号４７］、ＨＬＡＡ２４に結合する、ＣＹＳＬＹＧＴＴＬ［配列番号４８］、ＫＬＰＱＬＣＴＥＬ［配列番号４９］、ＨＹＣＹＳＬＹＧＴ［配列番号５０］、ＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹ［配列番号５１］、ＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ［配列番号５２］及びＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣ［配列番号５３］、ＨＬＡＡ^＊０２０１に結合する、２９−ＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ−３８［配列番号５４］である。例えば、ＨＬＡＡ^＊０２０１に結合する、８６−ＴＬＧＩＶＣＰＩ−９３［配列番号５５］、８２−ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ−９０［配列番号５６］、８５−ＧＴＬＧＩＶＣＰＩ−９３［配列番号５７］及び８６−ＴＬＧＩＶＣＰＩＣ−９４［配列番号５８］、ＨＬＡＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１又はＡ２４に結合する、ＨＰＶ１８Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ及びＨＰＶ１８Ｅ７Ｔ−細胞エピトープなどのＨＰＶ１６Ｅ７Ｔ−細胞エピトープは、等しく適用可能である。ＨＰＶ感染細胞に関連するＴ−細胞エピトープのさらなる追加の例は、ＨＬＡＤＲに結合する、ＨＰＶＥ７由来ペプチド１−ＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＤ−１２［配列番号５９］、４８−ＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤ−６２［配列番号６０］及び６２−ＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤ−７５［配列番号６１］、ＨＬＡＡ^＊２０１に結合する、７−ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ−１５［配列番号６２］、１１−ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ−２０［配列番号６３］、１１−ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ−１９［配列番号６４］及び１２−ＭＬＤＬＱＰＥＴＴ−２０［配列番号６５］、ＨＬＡＢ１８に結合する、１６−ＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹ−２５［配列番号６６］、４４−ＱＡＥＰＤＲＡＨＹ−５２［配列番号６７］及び４６−ＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶ−５５［配列番号６８］、ＨＬＡＤＱ２に結合する、３５−ＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡ−５０［配列番号６９］、ＨＬＡＤＲ３に結合する、４３−ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ−７７［配列番号７０］、ＨＬＡＤＲ１５に結合する、５０−ＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤ−６２［配列番号７１］、ＨＬＡＤＲ１７に結合する、５８−ＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣ−６８［配列番号７２］及びＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１に結合する、６１−ＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥ−８０［配列番号７３］である。

本発明の抗体による、異常細胞の特異的及び選択的なターゲティングに適切な結合部位を選択するための良好な供給元は、Ｔ−細胞規定の腫瘍抗原及びＴ−細胞エピトープに結合するＨＬＡをリストするペプチドデータベース［９−１２；ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅｄａｔａｂａｓｅ／Ｔｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓ．ｈｔｍ］である。このデータベースは、腫瘍細胞にユニークな又は腫瘍細胞により過剰発現される、示されるＨＬＡのクラスを含むＭＨＣ分子と複合体化される抗原ペプチドの組合せを提供する。

実施例２：ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａに特異的なヒト抗体断片の選択
ＨＬＡ−Ａ０２０１提示マルチＭＡＧＥ−ＡエピトープＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｖ［配列番号６］及びＦＬＷＧＰＲＡＬＶ［配列番号２３］に特異的な免疫グロブリン可変領域を含むヒト抗体断片を得るために、以前ｄｅＨａａｒｄら（２）により記載された手順に従ってヒトＦａｂファージディスプレイライブラリーが構築され、１）ビオチン化されたＭＨＣ／ｐ複合体を用いる本質的にＣｈａｍｅｓら（３）により記載されたような、又は２）関連抗原を発現している細胞における、選択のために使用された。

２．１：ビオチン化されたＭＨＣ−ペプチド複合体を用いる、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＹＬＥＹＲＱＶＰＶに特異的なヒト抗体断片の選択：
ヒトＦａｂファージ（１０^１３コロニー形成単位）はまず２％脱脂粉乳を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＭ）中室温で１時間プレインキュベートされた。並行して、２００μｌのストレプトアビジン被膜ビーズ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）（商標））はＰＢＳＭ中１時間平衡化された。それに続くラウンドでは、１００μｌのビーズが使用された。パンＭＨＣバインダーを枯渇させるため、それぞれの選択ラウンドでは、無関係なペプチドを含有するビオチン化ＭＨＣクラスＩ−ペプチド（ＭＨＣ−ｐ）複合体（Ｓａｎｑｕｉｎ、オランダ）２００ｎＭがファージに添加され、回転下３０分間インキュベートされた。平衡化されたビーズが添加され、その混合物は回転下１５分間インキュベートされた。ビーズは磁力を用いてチューブの側面に引き付けられた。枯渇されたファージ画分に、それに続いて減少する量のビオチン化ＭＨＣ−ｐ複合体（第１ラウンドでは２００ｎＭ、第２及び第３ラウンドでは２０ｎＭ）が添加され、連続回転させながら室温で１時間インキュベートされた。同時に、パンＭＨＣクラスＩ結合可溶性Ｆａｂ（Ｄ３）がファージＭＨＣ−ｐ複合体混合物に添加された（それぞれ１〜３ラウンドで５０、１０及び５μｇ）。平衡化されたストレプトアビジン被膜ビーズが添加され、その混合物は回転下１５分間インキュベートされた。ファージは磁力により選択された。非結合ファージは、ＰＢＳＭを用いた５回洗浄ステップ、０．１％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳを用いた５ステップ及びＰＢＳを用いた５ステップにより取り除かれた。ファージは、５００μｌの新たに調製されたトリエチルアミン（１００ｍＭ）と一緒に１０分間インキュベートすることによりビーズから溶出された。溶液のｐＨは、５００μｌの１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）の添加により中和された。溶出されたファージは、３７℃で３０分間、対数増殖する大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞（０．５のＯＤ_{６００ｎｍ}）と一緒にインキュベートされた。細菌は２×ＴＹＡＧプレート上で一晩増殖させた。次の日、コロニーは採取され、５０ｍｌの２×ＴＹＡＧにおいて１０μｌの接種材料が使用された。細胞は０．５のＯＤ_{６００ｎｍ}まで増殖させ、５ｍｌのこの懸濁液にＭ１３ｋ０７ヘルパーファージ（５×１０^１１コロニー形成単位）を感染させた。３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞は遠心分離され、２５ｍｌの２×ＴＹＡＫに再懸濁され、３０℃で一晩増殖させた。ファージは既に記載されたとおりに培養上清から回収され、次のラウンドのパニングのために使用された。３回の選択ラウンド後、２６１倍の濃縮が得られ、分析された２８２クローンのうち４６がＨＬＡ−Ａ２−マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体に特異的であることが明らかにされた（図１）。ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体及びＪＣウイルス由来ペプチドとのＨＬＡ−Ａ０２０１複合体を使用するＥＬＩＳＡを用いて、選択されたＦａｂの特異性が決定された。

２．２：細胞を用いる、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶに特異的なヒトＦａｂの選択。
ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶに特異的に結合するＦａｂ−ファージの選択は、マウスＣＭＴ６４肺腫瘍細胞を用いて実施された。ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（Ａ２／ＦＬＷ）複合体を安定に発現しているＣＭＴ６４細胞を得るために、ＣＭＴ６４細胞は、単鎖ペプチド−□２Ｍ−ＨＬＡ−Ａ０２０１重鎖構築物［配列番号１０５］をコードするベクターを有するレトロウイルスで感染させた。ヒトＦａｂファージ（１０^１３コロニー形成単位）はまず２％ＦＣＳを含有するＰＢＳ（ＰＢＳＦ）中室温で１時間プレインキュベートされた。並行して、１．０×１０^６のＣＭＴ６４−Ａ２／ＦＬＷ細胞は、ＰＢＳＦ中で１時間平衡化された。ファージは、最初に、ＨＬＡ−Ａ０２１０／ＹＬＥＹＲＱＶＰＧを発現している１０×１０^６のＣＭＴ６４細胞で１時間インキュベートされて、非特異的に結合しているファージが枯渇させられた。非結合画分は、次いで、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ発現ＣＭＴ６４細胞でインキュベートされた（１時間、４℃）。多数回の洗浄操作後、結合したファージは、５００μｌの新たに調製されたトリエチルアミン（１００ｍＭ）を添加することにより溶出された。溶液のｐＨは、５００μｌの１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）の添加により中和された。溶出されたファージは、３７℃で３０分間、対数増殖する大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞（０．５のＯＤ_{６００ｎｍ}）と一緒にインキュベートされた。細菌は２×ＴＹＡＧプレート上で一晩増殖させた。次の日、コロニーは採取された。４回の選択ラウンド後、個々のクローンは、選択され、結合の特異性について試験した。

２．３：ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａエピトープに特異的なヒトＦａｂは抗原陽性細胞に結合する。

マルチＭＡＧＥ−Ａ；Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｖ
Ｆａｂファージは、マルチＭＡＧＥ−ＡペプチドＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｖが負荷されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬに結合する能力について分析された。Ｂ−ＬＣＬ株ＢＳＭ（０．５×１０^６）は、３０分間、３７℃で、マルチＭＡＧＥ−Ａペプチド（１００μｌのＰＢＳ中に１０μｇ）を負荷され、続いてＦａｂファージＡＨ５、ＣＢ１、ＣＧ１、ＢＤ５及びＢＣ７と一緒にインキュベートされ、フローサイトメトリーにより分析された。図２に示されるように、ＦａｂＡＨ５、ＣＢ１及びＣＧ１はペプチド負荷細胞のみに特異的に結合するが、ＦａｂＢＤ５及びＢＣ７は、マルチＭＡＧＥ−Ａペプチドが負荷されていないＢＳＭに対して非特異的結合を示した。ＡＨ５、ＣＢ１及びＣＧ１による非ペプチド負荷細胞への結合は観察されなかった。

次いで、ＡＨ５、ＣＢ１及びＣＧ１を提示しているファージ、並びにＨＬＡ−Ａ０１０１／ＭＡＧＥ−Ａ１特異的ＦａｂファージＧ８（４）を用いて、組織学的起源の異なる腫瘍細胞株が染色された。この目的のために、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）、多発性骨髄腫細胞（ＭＤＮ）、黒色腫細胞（ＭＺ２−ＭＥＬ４３及びＧ４３）及び乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ１５７）は染色されフローサイトメトリーにより分析された（図３）。ＦａｂＡＨ５は多発性骨髄腫細胞ＭＤＮに特異的に結合したが、ＨＬＡ−Ａ０２０１陰性黒色腫及び乳癌細胞には結合しなかった。ＣＢ１とＣＧ１の両方は黒色腫細胞株Ｇ４３上で非特異的結合を示した。陽性対照ＦａｂＧ８は試験されたすべての細胞株への結合を示した。

マルチＭＡＧＥ−Ａ；Ｆ−Ｌ−Ｗ−Ｇ−Ｐ−Ｒ−Ａ−Ｌ−Ｖ
ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶで選択されたＦａｂクローンＦ９の細胞結合能を決定するため、可溶性Ｆａｂ断片が、ＴＧ−１細菌の誘導により作製された。ｐＣｅｓ−Ｆ９を含有するＴＧ−１は、ＯＤ＝０，８まで増殖させた、そしてＦａｂ産生は、１ｍＭＩＰＴＧの添加により誘導された。１３時間の誘導後、細菌のペリプラスム分画は、単離され、一晩透析された。次の日、可溶性ＦａｂＦ９断片は、ＩＭＡＣにより精製された。

精製されたＦａｂＦ９は、０．５×１０^６のＨＬＡ−Ａ０２１０／ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶのいずれかを発現しているＣＭＴ６４細胞、又はヒトＨＬＡを発現していないＣＭＴ６４細胞に添加された。図６に示されるように、ＦａｂクローンＦ９は、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ発現ＣＭＴ６４細胞に特異的に結合するが、ヒトＨＬＡを発現しない又は無関係なＨＬＡ−Ａ０２０１／ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ分子を発現するＣＭＴ６４細胞にはしない。

２．４：ＦａｂＡＨ５はＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体のみに結合する。
複数のペプチド／ＭＨＣ複合体を使用するＥＬＩＳＡによってＦａｂ−ＡＨ５の特異性が確認された。この目的のために、ペプチド、マルチＭＡＧＥ−Ａ、ｇｐ１００、ＪＣＶ及びＭＡＧＥ−Ｃ２を提示するＨＬＡ−Ａ０２０１複合体、並びにＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１複合体は９６ウェルプレート上に固定され、ＦａｂＡＨ５及び対照ＦａｂＧ８を表示するファージと一緒にインキュベートされた。図４に示されるように、ＡＨ５はＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａのみに結合し、無関係な複合体ＨＬＡ−Ａ０２０１／ｇｐ１００、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＪＣＶ及びＨＬＡ−Ａ０１０１／ＭＡＧＥ−Ａ１には結合しない。陽性対照ＦａｂＧ８はその関連標的ＨＬＡ−Ａ０１０１／ＭＡＧＥ−Ａ１のみに結合する。

ＨＬＡ−Ａ０２０１−マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体結合性ＦａｂＡＨ５をコードする核酸は、ヒト抗体Ｃｈ２−Ｃｈ３ドメインをコードする核酸と組み合わされて、選択されたＣｌ−Ｖｌコード核酸を包含するヒト抗体軽鎖をコードする及び選択されたＣｈ−Ｖｈコード核酸を包含するヒト抗体重鎖をコードする、核酸分子が提供される。これらの所望の免疫グロブリンをコードする核酸分子は、プラスミドを介して又は発現ベクターを介して、真核生物の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞に導入される。免疫グロブリンの発現後、それは細胞培養物から単離され、精製される。次いで、選択された毒性部分は、例えば、ＵｎｉｖｅｒｓａｌＬｉｎｋａｇｅＳｙｓｔｅｍリンカー化学を用いて、免疫グロブリンに連結される。

実施例３．毒性部分を備える免疫グロブリンの細胞結合及び内部移行。
本発明の抗体の結合能は、フローサイトメトリーにより分析される。例えば、ＨＬＡ−Ａ０２０１及びマルチＭＡＧＥ−Ａペプチドの複合体に特異的な免疫グロブリン可変領域を含む抗体が、分析される。ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ陽性腫瘍細胞（Ｄａｊｕ、ＭＤＮ及びｍｅｌ６２４）及びＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ陰性細胞（ＢＳＭ、Ｇ４３及び２９３）は、氷上で精製抗体とインキュベートされ、蛍光ラベルした抗体の添加により検出される。抗体により結合された細胞は、フローサイトメトリーにより、定量され、視覚化される。抗体の内部移行は、共焦点顕微鏡法により分析される。この目的のために、細胞は、抗体と一緒にインキュベートされ、氷上で３０分間維持されて、結合させたが、内部移行されない。次に、抗体に特異的な蛍光ラベルした抗体が、添加される。内部移行を誘導するために、細胞は、３７℃に移され、５、１０及び１５分後、１％ＰＦＡで固定される。

実施例４：多様な腫瘍細胞における本発明の抗体によるアポトーシス誘導。
４．１：毒性部分を備える免疫グロブリンによる多様な腫瘍細胞の死滅。
本発明の抗体は、免疫グロブリン可変領域への結合部位を含む抗原を発現することが知られている、多様な腫瘍細胞と一緒にインキュベートすることによりアポトーシスを誘導するための能力について分析される。例えば、ＨＬＡ−Ａ０２０１及びマルチＭＡＧＥ−Ａペプチド、ＡＨ５−ＢＴＸの複合体に特異的な免疫グロブリン可変領域ＶＨを含む抗体は、ＢＴＸペプチド及びドキソルビシンを含有している合成ＨＰＭＡポリマーと結合され（本発明者らが国際公開第２００９１３１４３５号パンフレットに記載したとおり）、分析される。この目的のために、ドキソルビシンと結合される本発明の抗体は、ＨＬＡ−Ａ０２０１とＭＡＧＥ−Ａ遺伝子の両方を発現することが知られている多様な腫瘍細胞と一緒にインキュベートすることによりアポトーシスを誘導する能力について分析される。細胞株、Ｄａｊｕ、Ｍｅｌ６２４（黒色腫）、ＰＣ３４６Ｃ（前立腺癌）及びＭＤＮ（多発性骨髄腫）並びにＭＡＧＥ−Ａ陰性細胞（９１１及びＨＥＫ２９３Ｔ）は、本発明の抗体の異なる濃度と一緒にインキュベートされる（ＤＭＥＭ培地中、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、グルタミン及び非必須アミノ酸が補充されている）。数時間後、細胞は、組織培養プレートからの細胞の剥離及び膜小疱形成などのアポトーシスの古典的徴候について目視で検査される。さらに、細胞は、活性カスパーゼ−３について染色されて、アポトーシスが示される。本発明の抗体が、ＤａｊｕＭｅｌ６２４、ＰＣ３４６Ｃ及びＭＤＮ細胞においてアポトーシスを誘導することが期待される。本発明の抗体で処置されない細胞、並びにＨＬＡ−Ａ０２０１（ＨＥＫ２９３Ｔ）及びＭＡＧＥ−Ａ遺伝子（９１１及びＨＥＫ２９３Ｔ）を発現しない細胞は影響を受けない。

ＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドを提示する、ＨＬＡ−Ａ０１の複合体に特異性を有するＶｈ及びＶｌドメイン（ｓｃＦｖ）を含む、別の抗体も、分析された。ｓｃＦｖ−ＢＴＸ構築物は、ドキソルビシンを含有するＨＰＭＡポリマーと結合され、ＭＡＧＥ−Ａ１陽性及びＭＡＧＥ−Ａ１陰性の細胞と一緒にインキュベートされた。アポトーシスは、活性カスパーゼ３についての染色により示される。

４．２：活性カスパーゼ３の検出。
アポトーシスに対する古典的な細胞内の顕著な特徴は活性カスパーゼ−３の存在である。本発明の抗体が活性カスパーゼ３を誘導するかどうかを決定するために、Ｄａｊｕ、Ｍｅｌ６２４及びＭＤＮ細胞は、種々の濃度の本発明の抗体と一緒にインキュベートされる。４及び１３時間後、ＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（蛍光性のカスパーゼ−３／７インヒビター）が、添加され、陽染性の細胞は、蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリーにより視覚化される。カスパーゼ−３活性は、本発明の抗体に特異的な標的結合部位を提供する抗原（の断片）と一緒に、抗原陽性細胞において示されるが、抗原陰性細胞において示されない。

４．３腫瘍を有するマウスの毒性部分を備える免疫グロブリンでの処置。
触知可能な皮下の移植可能なヒト腫瘍（Ｄａｊｕ又はＭＤＮ）を有するヌードマウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ、一群当たり８匹）は、異なる用量の毒性部分を備える免疫グロブリンを注射される。対照として、マウスは、標準の化学療法で処置される又はＰＢＳでの注射を受ける。適量の毒性部分を備える免疫グロブリンを受けるマウスは、異常細胞が本発明の抗体への標的結合部位を曝露する場合に、化学療法又はＰＢＳを受けるマウスよりも有意に長く生存する。

実施例５：ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ及びＨＬＡ−Ａ０２０１／ＹＬＥＹＲＱＶＰＧに特異性を有するｌｌａｍａＶＨＨの選択。
ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（Ａ２／ＦＬＷ）及びＨＬＡ−Ａ０２０１／ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ（Ａ２／ＹＬＥ）に特異性を有するＬｌａｍａＶＨＨ断片の選択が、これらのＨＬＡ／ペプチド複合体を安定に発現しているＣＭＴ６４細胞において実施された。ＬｌａｍａＶＨＨファージ（１０^１１コロニー形成単位）はまず２％ＦＣＳを含有するＰＢＳ（ＰＢＳＦ）中室温で１時間プレインキュベートされた。並行して、１．０×１０^６のＣＭＴ６４−Ａ２／ＦＬＷ及び１．０×１０^６のＣＭＴ６４Ａ２／ＹＬＥ細胞は、ＰＢＳＦ中で１時間平衡化された。非特異的結合するファージを枯渇させるため、Ａ２／ＦＬＷ又はＡ２／ＹＬＥのいずれかを発現している１０×１０^６のＣＭＴ６４細胞は、ｌｌａｍａＶＨＨと１時間インキュベートされた。非結合画分は、次いで、Ａ２／ＦＬＷ又はＡ２／ＹＬＥ発現ＣＭＴ６４細胞でインキュベートされた（１時間、４℃）。多数回の洗浄操作後、結合したファージは、５００μｌの新たに調製されたトリ−エチルアミン（１００ｍＭ）を添加することにより溶出された。溶液のｐＨは、５００μｌの１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）の添加により中和された。溶出されたファージは、３７℃で３０分間、対数増殖する大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞（０．５のＯＤ_{６００ｎｍ}）と一緒にインキュベートされた。細菌は２×ＴＹＡＧプレート上で一晩増殖させた。次の日、コロニーは採取された。４回の選択ラウンド後、個々のクローンは、選択され、結合の特異性について試験された。

５．２：ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａエピトープに特異的なＬｌａｍａＶＨＨは抗原陽性細胞に結合する。
Ａ２／ＦＬＷ及びＡ２／ＹＬＥで選択されたＶＨＨの細胞結合能を決定するため、可溶性ＶＨＨ断片が、ＴＧ−１細菌の誘導により作製された。ｐＨｅｎ−ＶＨＨを含有するＴＧ−１は、ＯＤ＝０，８まで増殖させ、そしてＦａｂ産生は、１ｍＭＩＰＴＧの添加により誘導された。１３時間の誘導後、細菌のペリプラスム分画は、単離され、一晩透析された。次の日、可溶性ＶＨＨ断片は、ＩＭＡＣにより精製された。

ＨＬＡ−Ａ０２１０／ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶのいずれかを発現しているＣＭＴ６４細胞（０．５×１０^６）、又はヒトＨＬＡを発現していないＣＭＴ６４細胞は、１時間、４℃で、精製されたＶＨＨ断片と一緒にインキュベートされた。図７に示されるように、Ａ２／ＦＬＷ特異的ＶＨＨは、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ発現ＣＭＴ６４細胞に結合するが、ヒトＨＬＡを発現しない又は無関係なＨＬＡ−Ａ０２０１／ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ分子を発現するＣＭＴ６４細胞には結合しない。Ａ２／ＹＬＥ特異的ＶＨＨは、ＨＬＡ−Ａ２／ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ発現ＣＭＴ６４細胞のみに結合し、Ａ２／ＦＬＷ陽性ＣＭＴ６４細胞及びヒトＨＬＡを発現しないＣＭＴ６４細胞には結合しない。

［参考文献］
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［配列の識別］
配列番号１．アミノ酸配列ＶｈＡＨ５
QLQLQESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQAPGKEREGVAV ISYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGS YYVPDYWGQGTLVTVSSGST SGS
配列番号３．アミノ酸配列ＭＡＧＥ−ＡにおけるＭＨＣ−１ＨＬＡ−Ａ０２０１提示可能ペプチド
YLEYRQVPG
配列番号４．アミノ酸配列ＭＡＧＥ−ＡにおけるＭＨＣ−１ＨＬＡ−ＣＷ７提示可能ペプチド
EGDCAPEEK
配列番号５．アミノ酸配列ＭＡＧＥ−Ａ１におけるＭＨＣ−１ＨＬＡ−Ａ０２０１提示可能ペプチド
YLEYRQVPD
配列番号６．アミノ酸配列ＨＬＡ−Ａ０２０１への結合能が増強された、ＭＡＧＥ−Ａ１におけるＭＨＣ−１ＨＬＡ−Ａ０２０１提示可能ペプチド
YLEYRQVPV
配列番号７．アミノ酸配列Ｖｈ結合ドメイン１１Ｈ
EVQLVQSGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMSWIRQAPGKGLEWLSY ISSDGSTIYY ADSVKGRFTV SRDNAKNSLS LQMNSLRADD TAVYYCAVSP RGYYYYGLDLWGQGTTVTVS S
配列番号８、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドエピトープのアミノ酸配列
IMPKAGLLI
配列番号９、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドエピトープのアミノ酸配列
KKLLTQHFVQENYLEY
配列番号１０、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
EADPTGHSY
配列番号１１、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
SLFRAVITK
配列番号１２、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
NYKHCFPEI
配列番号１３、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
EVYDGREHSA
配列番号１４、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
REPVTKAEML
配列番号１５、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
DPARYEFLW
配列番号１６ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
SAFPTTINF
配列番号１７、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
SAYGEPRKL
配列番号１８、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
SAYGEPRKL
配列番号１９、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
KMVELVHFL
配列番号２０、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
YLQLVFGIEV
配列番号２１、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
EYLQLVFGI
配列番号２２、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
EADPIGHLY
配列番号２３、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
FLWGPRALV
配列番号２４、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
MEVDPIGHLY
配列番号２５、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
WQYFFPVIF
配列番号２６、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
GVYDGREHTV
配列番号２７、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
MVKISGGPR
配列番号２８、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
GLYDGMEHL
配列番号２９、ＨＬＡに結合するＭＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
VRIGHLYIL
配列番号３０、ＨＬＡに結合するＢＡＧＥペプチドエピトープのアミノ酸配列
AARAVFLAL
配列番号３１、ＨＬＡに結合するＤＡＭ−６及びＤＡＭ−１０ペプチドエピトープのアミノ酸配列
FLWGPRAYA
配列番号３２、ＨＬＡに結合するＧＡＧＥ−１／−２／−８ペプチドエピトープのアミノ酸配列
YRPRPRRY
配列番号３３、ＨＬＡに結合するＧＡＧＥ−３／−４／−５／−６／−７Ｂペプチドエピトープのアミノ酸配列
YYWPRPRRY
配列番号３４、ＨＬＡに結合するＮＡ８８−Ａペプチドエピトープのアミノ酸配列
MTQGQHFLQKV
配列番号３５、ＨＬＡに結合するＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドエピトープのアミノ酸配列
SLLMWITQCFL
配列番号３６、ＨＬＡに結合するＮＹ−ＥＳＯ−１ａペプチドエピトープのアミノ酸配列
SLLMWITQC
配列番号３７、ＨＬＡに結合するＮＹ−ＥＳＯ−１ａペプチドエピトープのアミノ酸配列
QLSLLMWIT
配列番号３８、ＨＬＡに結合するＮＹ−ＥＳＯ−１ａペプチドエピトープのアミノ酸配列
ASGPGGGAPR
配列番号３９、ＨＬＡＡ１に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
FQDPQERPR
配列番号４０、ＨＬＡＡ１に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
TTLEQQYNK
配列番号４１、ＨＬＡＡ１に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
ISEYRHYCYS
配列番号４２、ＨＬＡＡ１に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
GTTLEQQYNK
配列番号４３、ＨＬＡＡ２に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
KISEYRHYC
配列番号４４、ＨＬＡＡ２に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
YCYSIYGTTL
配列番号４５、ＨＬＡＡ３に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
LLRREVYDF
配列番号４６、ＨＬＡＡ３に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
IVYRDGNPY
配列番号４７、ＨＬＡＡ１１に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
TTLEQQYNK
配列番号４８、ＨＬＡＡ２４に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
CYSLYGTTL
配列番号４９、ＨＬＡＡ２４に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
KLPQLCTEL
配列番号５０、ＨＬＡＡ２４に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
HYCYSLYGT
配列番号５１、ＨＬＡＡ２４に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
LYGTTLEQQY
配列番号５２、ＨＬＡＡ２４に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
EVYDFAFRDL
配列番号５３、ＨＬＡＡ２４に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
VYDFAFRDLC
配列番号５４、ＨＬＡＡ^＊０２０１に結合するＨＰＶ１６Ｅ６Ｔ−細胞エピトープ
29-TIHDIILECV-38
配列番号５５、ＨＬＡＡ^＊０２０１に結合するＨＰＶ１６Ｅ７Ｔ−細胞エピトープ
86-TLGIVCPI-93
配列番号５６、ＨＬＡＡ^＊０２０１に結合するＨＰＶ１６Ｅ７Ｔ−細胞エピトープ
82-LLMGTLGIV-90
配列番号５７、ＨＬＡＡ^＊０２０１に結合するＨＰＶ１６Ｅ７Ｔ−細胞エピトープ
85-GTLGIVCPI-93
配列番号５８、ＨＬＡＡ^＊０２０１に結合するＨＰＶ１６Ｅ７Ｔ−細胞エピトープ
86-TLGIVCPIC-94
配列番号５９、ＨＬＡＤＲに結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
1-MHGDTPTLHEYD-12
配列番号６０、ＨＬＡＤＲに結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
48-DRAHYNIVTFCCKCD-62
配列番号６１、ＨＬＡＤＲに結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
62-DSTLRLCVQSTHVD-75
配列番号６２、ＨＬＡＡ^＊２０１に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
7-TLHEYMLDL-15
配列番号６３、ＨＬＡＡ^＊２０１に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
11-YMLDLQPETT-20
配列番号６４、ＨＬＡＡ^＊２０１に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
11-YMLDLQPET-19
配列番号６５、ＨＬＡＡ＊２０１に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
12-MLDLQPETT-20
配列番号６６、ＨＬＡＢ１８に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
16-QPETTDLYCY-25
配列番号６７、ＨＬＡＢ１８に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
44-QAEPDRAHY-52
配列番号６８、ＨＬＡＢ１８に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
46-EPDRAHYNIV-55
配列番号６９、ＨＬＡＤＱ２に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
35-EDEIDGPAGQAEPDRA-50
配列番号７０、ＨＬＡＤＲ３に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
43-GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR-77
配列番号７１、ＨＬＡＤＲ１５に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
50-AHYNIVTFCCKCD-62
配列番号７２、ＨＬＡＤＲ１７に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
58-CCKCDSTLRLC-68
配列番号７３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９０１に結合するＨＰＶＥ７Ｔ−細胞エピトープ
61-CDSTLRLCVQSTHVDIRTLE-80
配列番号７４、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＳＡＴ−細胞エピトープ
146-KLQCVDLHV-154
配列番号７５、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＳＡＴ−細胞エピトープ
141-FLTPKKLQCV-150
配列番号７６、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＳＡＴ−細胞エピトープ
154-VISNDVCAQV-163
配列番号７７、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＳＡＴ−細胞エピトープ
154-YISNDVCAQV-163
配列番号７８、ＨＬＡ−Ａ３に結合するＰＳＡＴ−細胞エピトープ
162-QVHPQKVTK-170
配列番号７９、ＨＬＡ−Ａ２４に結合するＰＳＡＴ−細胞エピトープ
152-CYASGWGSI-160
配列番号８０、ＨＬＡ−Ａ２４に結合するＰＳＡＴ−細胞エピトープ
248-HYRKWIKDTI-257
配列番号８１、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＳＭＡＴ−細胞エピトープ
4-LLHETDSAV-12
配列番号８２、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＳＭＡＴ−細胞エピトープ
711-ALFDIESKV-719
配列番号８３、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＳＭＡＴ−細胞エピトープ
27-VLAGGFFLL-35
配列番号８４、ＨＬＡ−Ａ２４に結合するＰＳＭＡＴ−細胞エピトープ
178-NYARTEDFF-186
配列番号８５、ＨＬＡ−Ａ２４に結合するＰＳＭＡＴ−細胞エピトープ
227-LYSDPADYF-235
配列番号８６、ＨＬＡ−Ａ２４に結合するＰＳＭＡＴ−細胞エピトープ
624-TYSVSFDSL-632
配列番号８７、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＡＰＴ−細胞エピトープ
299-ALDVYNGLL-307
配列番号８８、ＨＬＡ−Ａ２４に結合するＰＡＰＴ−細胞エピトープ
213-LYCESVHNF-221
配列番号８９、ＭＨＣ−２に結合するＰＡＰＴ−細胞エピトープ
199-GQDLFGIWSKVYDPL-213
配列番号９０、ＭＨＣ−２に結合するＰＡＰＴ−細胞エピトープ
228-TEDTMTKLRELSELS-242
配列番号９１、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＳＣＡＴ−細胞エピトープ
14-ALQPGTALL-22
配列番号９２、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＳＣＡＴ−細胞エピトープ
105-AILALLPAL-113
配列番号９３、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＳＣＡＴ−細胞エピトープ
7-ALLMAGLAL-15
配列番号９４、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＳＣＡＴ−細胞エピトープ
21-LLCYSCKAQV-30
配列番号９５、ＤＲＢ１^＊０４０４に結合するカリクレイン４Ｔ−細胞エピトープ
155-LLANGRMPTVLQCVN-169
配列番号９６、ＤＲＢ１^＊０７０１に結合するカリクレイン４Ｔ−細胞エピトープ
160-RMPTVLQCVNVSVVS-174
配列番号９７、ＤＰＢ１^＊０４０１に結合するカリクレイン４Ｔ−細胞エピトープ
125-SVSESDTIRSISIAS-139
配列番号９８、ＭＨＣＩＨＬＡＢ８に結合するＥＢＶ核抗原３Ｔ−細胞エピトープ
FLRGRAYGL
配列番号９９、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＡＰのＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＤ８^＋Ｔ−細胞エピトープ
FLFLLFFWL
配列番号１００、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＡＰのＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＤ８^＋Ｔ−細胞エピトープ
TLMSAMTNL
配列番号１０１、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＰＡＰのＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＤ８^＋Ｔ−細胞エピトープ
ALDVYNGLL
配列番号１０２、ＨＬＡＡ２．１に結合するＰＡＰ−３のヒトＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ＣＴＬエピトープ
ILLWQPIPV
配列番号１０３、ＨＬＡ−Ａ２．１に結合するＳＴＥＡＰ−３のＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ＣＴＬエピトープ
LLLGTIHAL
配列番号１０４、ＨＬＡ−Ａ２．１に結合するＭＵＣ−１及びＭＵＣ−２のＨＬＡ−Ａ２．１−拘束性ＣＴＬエピトープ
CHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPA
配列番号１０５、単鎖ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ構築物。
MAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAFLWGPRALVGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSESHTVQRMYGCDVGSDWRFLRG
YHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDSPKAHVTHHPRSKGEVTLRCWALGFYPADITLTWQLNGEELTQDMELVETRPAGDGTFQKWASVVVPLGKEQNYTCRVYHEGLPEPLTLRWEPPPSTDSYMVIVAVLGVLGAMAIIGAVVAFVMKRRRNTGGGDYALAPGSQSSEMSLRDCKA

Claims

異常細胞と優先的に関連するＭＨＣ−ペプチド複合体と特異的に結合する、少なくとも免疫グロブリン可変領域を含む、毒性部分を備える免疫グロブリン。
前記免疫グロブリン可変領域がＶｈ又はＶｈｈである、請求項１に記載の免疫グロブリン。
前記免疫グロブリン可変領域がＶｌをさらに含む、請求項２に記載の免疫グロブリン。
ヒトＩｇＧである、請求項３に記載の免疫グロブリン。
ＭＨＣ−ペプチド複合体が、好ましくは、ＭＡＧＥ由来、好ましくはＭＡＧＥ−Ａ由来のペプチドを通して、異常細胞に特異的である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
毒性部分が免疫グロブリンに化学的に連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
毒性部分が、免疫グロブリンにＤＮＡレベルで、好ましくはリンカー配列を通して、融合された、融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
請求項１〜７のいずれか一項に記載の毒性部分を備える免疫グロブリンと、適切な希釈剤及び／又は賦形剤と、を含む医薬組成物。
異常細胞に関連する疾患に罹患している宿主の治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の毒性部分を備える免疫グロブリンの使用。
異常細胞に関連する疾患に罹患している宿主の治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の毒性部分を備える免疫グロブリンの使用であって、毒性部分が異常細胞に内部移行される使用。
癌の治療に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の毒性部分を備える免疫グロブリン。
癌に罹患している宿主の治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の毒性部分を備える免疫グロブリンの使用であって、少なくとも毒性部分が異常細胞に内部移行される使用。
図５のＢに記載の毒性部分を備える免疫グロブリン。