KR20240054423A - 조작된 nk 세포, 이의 생산방법 및 용도 - Google Patents

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아얄 헨델
님로드 벤 하이
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Abstract

유전자 변형 자연 살해(NK) 세포의 엑스 비보 생산용 조성물 및 방법이 개시된다. 상기 방법은 (a) 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 NK 세포 집단을 얻기 위해 NK 세포 집단에서 목적 유전자의 발현을 하향조절하는 단계; (b) 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단을 얻기 위해 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 NK 세포 집단을 확장시키는 단계; 및 (c) 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단에서 적어도 하나의 막 결합 단백질의 발현을 상향조절하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 막 결합 단백질을 발현하는 자연 살해(NK) 세포의 엑스 비보 생산 방법도 개시되어 있다. 약학 조성물 및 치료 방법도 개시된다.

Description

조작된 NK 세포, 이의 생산 방법 및 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2021년 8월 10일자로 출원된 미국 가출원 번호 63/231,372호의 우선권 및 이익을 주장하며, 이 출원의 내용은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 이의 일부 구체예에서, 조작된 자연 살해(NK) 세포에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 이에 제한되지 않지만, 목적 유전자의 발현이 부족하고 동시에 목적하는 막 결합 단백질을 발현하도록 변형된 NK 세포에 관한 것이다.
NK 세포는 선천성 면역계의 중요한 구성성분을 구성하는 세포독성 림프구이다. 이들 세포는 다양한 기능을 갖고 있으며, 특히 종양 세포, 바이러스에 감염된 세포, 발암성 변형을 겪는 세포 및 기타 생체 내 비정상 세포를 죽이는 기능을 갖고 있다. T 세포와는 달리, 표적 세포의 NK 세포 사멸은 특정 항원과 관련하여 비특이적이며, 오히려 표적 세포에 대한 인식은 활성화 신호와 억제 신호 사이의 균형을 통해 조절된다. 표적 세포의 살해는 일반적으로 퍼포린, 그랜자임 B 및/또는 그래눌리신을 포함한 세포용해 단백질에 의해 매개된다.
NK 세포는 다양한 난치성 혈액암(hematological malignancy) 및 고형 종양 환자의 면역치료를 위한 유망한 도구로서 최근 몇 년간 상당한 주목을 받았지만, NK 세포 기반 면역치료의 완전한 치료 잠재력은 아직 실현되지 않았다. 현재까지 실험 프로토콜의 결과는 대부분 부분 반응(partial response)으로 제한되었으며, 한계 효능은 주로 주입된 NK 세포의 상대적으로 적은 수, 짧은 생체 내 지속성 및/또는 생체 내 기능 저하에 기인한다. 따라서 NK 집단을 효과적으로 확장하고 생체 내에서 입양 주입된 NK 세포의 기능성을 증가시키는 엑스 비보(ex vivo) NK 배양 방법의 개발은 NK 세포 면역요법의 임상적 적용성을 향상시키는 데 필수적이다.
본 발명의 일부 구체예의 일 양태에 따르면, 유전자 변형 자연 살해(NK) 세포의 엑스 비보 생산 방법이 제공되며, 상기 방법은
(a) 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 NK 세포 집단을 얻기 위해 NK 세포 집단에서 목적 유전자의 발현을 하향조절하는 단계;
(b) 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단을 얻기 위해 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 NK 세포 집단을 확장시키는 단계; 및
(c) 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단에서 적어도 하나의 막 결합 단백질의 발현을 상향조절하여 유전자 변형된 NK 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예의 일 양태에 따르면, 적어도 하나의 막 결합 단백질을 발현하는 자연 살해(NK) 세포의 엑스 비보 생산 방법이 제공되며, 상기 방법은
(a) 다음을 포함하는 방법에 의해 NK 세포 집단을 확장시키는 단계:
(i) 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 NK 세포 집단을 배양하되, 조건은 유효량의 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 제공하는 것을 포함하는 단계; 및
(ii) 단계 (i) 이후 5-10일에 유효량의 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 NK 세포 집단에 보충하여 확장된 NK 세포를 생산하는 단계;
엑스 비보 확장된 NK 세포 집단을 얻기 위해, 및
(b) 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단에서 적어도 하나의 막 결합 단백질의 발현을 상향조절하여 적어도 하나의 막 결합 단백질을 발현하는 NK 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예의 일 양태에 따르면, 본 발명의 일부 구체예의 방법에 따라 얻을 수 있는 분리된 NK 세포 집단이 제공된다.
본 발명의 일부 구체예의 일 양태에 따르면, 본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단 및 약학적 활성 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 구체예의 일 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 질병의 치료 방법이 제공되며, 상기 방법은 치료적 유효량의 본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단을 대상체에게 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예의 일 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 질병을 치료하는 데 사용하기 위한 치료적 유효량의 본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단이 제공된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, NK 세포 집단은 제대혈, 말초 혈액, 골수, CD34+ 세포 또는 iPSC로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, NK 세포 집단에는 CD3+ 세포가 결핍되어 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, NK 세포 집단은 CD3-CD56+ 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 하향조절은 유전자 편집 시스템에 의해 달성된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, NK 세포는 배양물 내에 존재한다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 하향조절은 배양 개시로부터 24-72시간에 달성된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 목적 유전자는 그 산물이 NK 세포의 증식 및/또는 생존에 영향을 미치는 유전자를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 목적 유전자는 CISH, TGFβ 수용체 및 CD38로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, NK 세포 집단의 확장은 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 달성되되, 조건은 유효량의 영양소, 혈청, 성장 인자 및 니코틴아미드를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 성장 인자는 IL-15, IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, SCF 및 FLT3으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성장 인자를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 니코틴아미드의 유효량은 1.0 mM 내지 10 mM의 양을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, NK 세포 집단의 확장은 피더(feeder) 세포 또는 피더 층의 존재 하에서 달성된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 피더 세포는 방사선 조사된 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 피더 세포는 T 세포 또는 PBMC를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세포 증식을 허용하는 조건은 CD3 작용제를 더 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, NK 세포 집단의 확장은 14-16일 동안 달성된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 적어도 하나의 막 결합 단백질 발현의 상향조절은 배양 개시로부터 12-14일에 달성된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 적어도 하나의 막 결합 단백질의 발현 상향조절은 mRNA 전기천공에 의해 달성된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 적어도 하나의 막 결합 단백질은 일시적으로 발현된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 적어도 하나의 막 결합 단백질은 항질병 기능 또는 생체 내에서 NK 세포의 생존에 영향을 미치는 단백질을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 적어도 하나의 막 결합 단백질은 IL-15, IL-15R, 수용체 링커 IL-15(RLI) 및 TLR로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 적어도 하나의 막 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 T 세포 수용체(tg-TCR)를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, CAR은 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 적어도 하나의 보조자극 도메인은 CD28, 2B4, CD137/4-1BB, CD134/OX40, Lsk, ICOS 및 DAP10으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, CAR은 적어도 하나의 활성화 도메인을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 활성화 도메인은 CD3ζ 또는 ~FcR-γ를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, CAR은 막관통 도메인 및 힌지 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 막관통 도메인은 CD8, CD28 및 NKG2D로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 힌지 도메인은 CD8 및 CD28로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, CAR은 항체 또는 항원 결합 단편인 항원 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 항원 결합 단편은 Fab 또는 scFv이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, CAR 또는 tg-TCR은 종양 항원, 바이러스 항원, 세균 항원, 진균(fungal) 항원, 원생동물 항원 및 기생충 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 대한 항원 특이성을 갖는다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 종양 항원은 고형 종양과 연관되어 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 종양 항원은 혈액암과 연관되어 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, CAR 또는 tg-TCR은 HER2/Neu, CD38, CD19, CD319/CS1, ROR1, CD20, CD5, CD7, CD22, CD70, CD30, BCMA, CD25, NKG2D 리간드, MICA/MICB, 암배아 항원, 알파태아단백질, CA-125, MUC-1, 표피 종양 항원, 흑색종 관련 항원, 돌연변이 p53, 돌연변이 ras, ERBB2, 엽산 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메조텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 사슬, 람다 사슬, CSPG4, ERBB2, WT-1, EGFRvIII, TRAIL/DR4 및/또는 VEGFR2로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 대한 항원 특이성을 갖는다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 적어도 하나의 막 결합 단백질은 다음의 동시발현을 포함한다:
(i) CAR 또는 tg-TCR, 및
(ii) 생체 내에서 NK 세포의 생존에 영향을 미치는 사이토카인 또는 수용체.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 목적 유전자가 CISH인 경우, 적어도 하나의 막 결합 단백질은 IL-15를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 목적 유전자가 CD38인 경우, 적어도 하나의 막 결합 단백질은 항-CD38 CAR을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 질병은 악성 질병, 바이러스 질병, 세균 질병, 진균(fungal) 질병, 원생동물 질병 및 기생충 질병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 악성 질병은 고형 종양 또는 종양 전이이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 악성 질병은 유방암, 난소암, 방광암, 췌장암, 위암, 폐암, 흑색종, 육종, 신경모세포종, 대장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 식도암, 윤활막세포암, 자궁암, 신경교종 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 악성 질병은 혈액암이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 혈액암은 백혈병, 림프종 또는 다발성 골수종을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 대상체는 인간 대상체이다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및/또는 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료는 본 발명의 구체예를 실행하거나 시험하는 데 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 재료는 아래에 설명되어 있다. 충돌이 발생할 경우 정의를 포함한 특허 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐 반드시 제한하려는 의도는 아니다.
상기 특징 및 추가적인 특징은 첨부 도면과 함께 다음의 상세한 설명으로부터 더 명확하게 이해될 것이다.
도 1A는 NK 세포에서 IL-15 자극 후 CIS의 조절 역할을 보여주는 개략도이다. 출처: Bottino et al., Transl Cancer Res (2016) 5(Suppl 4):S875-S877.
도 1B는 NK 세포 조절 체크포인트를 보여주는 개략도이다: IL-15 신호전달은 CIS 조절자를 생산하는 CISH에 의한 음성 피드백 루프를 구동한다. 출처: Riggan et al., Clinical & Translational Immunology(202 1) e1238.
도 2A-C는 CISH 넉아웃(KO) 서열분석 결과를 예시한다. (도 2A-C) 인간 1차 NK 세포를 CISH를 표적으로 하는 4 μM RNP 복합체로 전기천공하였다. 배양 7일 후에 세포의 DNA를 추출하였다. 삽입 삭제(INDEL) 빈도에 대한 TIDE 도구를 통해 Sanger 시퀀싱을 수행하고 분석하였다. (도 2A) "기존 가이드"(CISH 1)는 공개 도메인에서 가져온 gRNA 서열을 지칭한다(Palmer et al, bioRxiv 2020년 9월 25일 참조). (도 2B) Guide 4(CISH2) 및 (도 2C) Guide 10(CISH3)은 발명자들이 개발한 고유한 gRNA이다. 주목할 만한 점은 3종의 gRNA 중 가이드 4와 가이드 10이 높은 편집률(각각 85% 및 82% INDEL 빈도)을 보인 반면 '기존 가이드'는 30% INDEL 빈도를 산출했다는 것이다.
도 3A-B는 NK 세포에서 CISH 유전자의 CRISPR KO가 NK 세포 활성화와 관련된 사이토카인 생산을 상향조절함으로써 효능을 향상시킨다는 것을 보여준다. (도 3A-B) 효능 분석은 세포내 염색을 사용하여 전염증성 사이토카인(INFγ 및 GM-CSF)을 측정하고, 사이토카인 발현은 대조군 NK 세포, 모의(전기) 대조군 또는 Cish 결실된 NK 세포의 공동배양에 대해 표시된다(도 2A-C에 설명된 대로 3종의 상이한 RNA 가이드 사용). 각 유형의 NK 세포는 NK 세포의 CD16 매개 ADCC 세포독성 활성을 향상시키는 항-CD20(Rituximab, RTX) 유무에 관계없이 K562(인간 적백혈병 세포주) 및 Raji(B세포 림프종 세포주)와 공동배양되었다. 모두 단독으로 배양한 NK 세포와 비교한 것이다. 플로우 사이토메트리를 사용하여 CD56+ NK 세포에 게이팅된 사이토카인 발현을 정량화하였다. (도 3A) IFN 발현 및 (도 3B) GM-CSF 발현은 모두 세포내 염색(ICS)에 의해 검출된다.
도 4A-C는 NK 세포에서 CISH 유전자의 CRISPR KO가 세포독성 및 ADCC 기능을 향상시킨다는 것을 보여준다. (도 4A-C) 세포독성 사멸 분석은 생세포 이미징 시스템 IncuCyte S3를 통해 수행되었으며, 이를 통해 NK 활동에 관한 실시간 데이터를 수집할 수 있다. 종양 표적 세포를 CFSE 염료로 표지하고, 배지 내 PI(propidium iodide) 존재 하에서 NK 세포와 20시간 동안 공동배양하였다. 생존 세포는 염색되지 않은 채로 남아 있는 반면, 죽은 세포는 CFSE 형광 염색과 PI의 중첩에 의해 검출되었다. 표적 사멸 세포의 비율은 대조군 NK 세포, 모의(전기) 대조군 세포 및 CISH 결실 NK 세포(도 2A-C에 기술된 바와 같이 3종의 서로 다른 RNA-가이드 사용)의 곡선에 표시되며, 각각은 ADCC 사멸 활성을 향상시키는 Rituximab과 함께 (도 4A) K562 세포주, (도 4B) Raji 세포주 및 (도 4C) Raji 세포주와 공동배양되었다. 주목할 만한 점은 RNA 가이드 4(CISH2)가 시험된 다른 CISH KO에 비해 더 나은 사멸 및 ADCC를 보여주었다는 것이다.
도 5A-D는 IL-15 안정성 및 면역치료 활성의 지속성을 개선하기 위한 IL-15 기반 융합 단백질 구성의 발전을 보여주는 개략도이다. (도 5A-B). IL-15Rβγ 복합체를 발현하는 세포에 트랜스제시(transpresentation)되는 막 결합 복합체 IL-15-IL-15Rα의 신호전달(도 5A) 이후 결합 및 조립(도 5B)의 대표적인 그림(Carroll et al., Rheumatology (2008) 47(9): 1269?1277 및 Wikiwand, Interleukin-15로부터 포함됨). (도 5C) 면역학적 활성을 향상시키는 IL-15-IL-15-IL15Rα 복합체의 설계된 형태(Hu et al. Scientific Reports (2018) 8: 7675로부터 포함됨). (도 5D) 임상 암 치료에서 입증된 바와 같이 IL15Rα와 조합된 IL-15 제제를 대안으로 설계하였다(출처: Waldmann et al., Front. Immunol. (2020) 11:868).
도 6A-F는 유전자 작제물 301.A(도 6A)와 301.B(도 6C), 및 막 결합된 RLI-301.A(도 6B) 및 301.B(도 6D)의 폴리펩타이드 산물의 도식적 표현을 예시한다. 막 결합 N72D-RLI GDA-301A(도 6E) 및 N72D-RLI GDA-301B(도 6F)의 전장 서열이 표시된다. 도 6E-F의 경우, 파란색은 스시 도메인의 서열을 나타내고, 진한 파란색은 엑손 3의 개시 서열을 나타내며, 녹색은 리더 펩타이드의 서열을 나타내고, 진한 녹색은 링커 서열의 서열을 나타내며, 빨간색은 세포외 도메인의 서열을 나타내고, 주황색은 막관통 도메인의 서열을 나타내며, 노란색은 세포질 도메인의 서열을 나타낸다.
도 7은 막 결합된 IL-15 mRNA 발현이 CD107a NK 세포 탈과립 마커를 사용하여 시험한 바와 같이 효능을 증가시킨다는 것을 예시한다. CD107a의 발현 증가는 대조군 NK 세포, 모의(전기) 대조군, 또는 mRNA IL-15 301.A(IL-15.1A) 또는 301.B(IL-15.1B)로 전기천공된 세포의 6시간 배양 후 플로우 사이토메트리 분석에 의해 결정되었다. 각 유형의 NK 세포를 단독으로 배양하거나 K562 세포주 또는 Raji(리툭시맙 유무에 관계없이)와 공동배양하였다.
도 8A-C는 전염증성 사이토카인의 상승으로 예시된 바와 같이 막 결합 IL-15가 NK 세포의 효능을 향상시킨다는 것을 예시한다. 대조군, IL 15.1A 또는 IL-15.1B mRNA 전기천공 세포를 6시간 동안 공동배양한 후 사이토카인의 세포내 염색을 수행하였다. IFN(도 8A), GM-CSF(도 8B) 및 TNFα(도 8C)의 발현이 표시되며 모두 플로우 사이토메트리 분석으로 검출된다. 참고로, IL15. 1A 및 IL15.1B 둘 다 전염증성 사이토카인 INFg, TNFa 및 GM-CSF의 발현 증가를 보여주었으며, 이는 mbIL-15.1b에 비해 유리하다.
도 9A-C는 막 결합 IL-15가 NK 세포에서 세포독성 기능 및 ADCC 사멸을 증가시킨다는 것을 예시한다. IL15.1A 또는 IL-15.1B mRNA 전기천공 NK 세포의 향상된 사멸 활성을 시험하였다. (도 9A-B) 세포독성 사멸 분석은 생존 세포 이미징 시스템 IncuCyte S3를 통해 수행되었다. 종양 표적 세포를 CFSE 염료로 표지하고, 배지 중 PI의 존재 하에 20시간 동안 NK 세포와 공동배양하였다. 생존 세포는 염색되지 않은 채로 남아 있는 반면, 죽은 세포는 CFSE 형광 염색과 PI의 중첩에 의해 검출되었다. 표적 사멸 세포의 비율은 대조군 NK 세포, 모의(전기) 대조군 세포, IL15.1A 또는 IL15.1B NK 세포 및 가용성 IL-15 사이토카인으로 처리된 대조군 NK 세포(분석의 양성 대조군)의 곡선에 표시된다. IL-15 투여 후 활성화를 겪는 세포의 최대 능력을 측정할 수 있다. 각 유형의 NK 세포를 (도 9A) K562 세포주와 24시간 동안 공동배양하고, (도 9B) B 세포 림프종(BL-2) 세포주를 리툭시맙과 함께 48시간 동안 공동배양하였다. 대안으로, RPMI-8226 골수종 세포주와 공동배양된 상이한 NK 세포의 세포독성 활성을 검출하기 위해 플로우 사이토메트리 분석에 의한 사멸 분석을 수행하였다(도 9C).
도 10은 NK CD38 동족 살해(fratricide) 문제 및 CRISPR 해결책을 예시한다.
도 11A-H는 CD38 KO NK 세포가 다라투무맙의 존재 하에서 동족 살해에 저항성을 갖는다는 것을 예시한다. (도 11A-B) - 플로우 사이토메트리 게이트 전략. (도 11C-E) 각각 NK, 모의(Mock) 및 KO 세포에서의 CD38 발현. (도 11F) NK 동족 살해 개요. (도 11G-H) DARA(다라투무맙) 유무에 관계없이 NK(도 11G) 및 CD38 KO NK(도 11H)의 동족 살해 플로우 사이토메트리 분석.
도 12A-B는 항-CD38 NK CAR의 유전자 작제물 및 단백질 구조(도 12A) 및 항-CD38 CAR의 전장 서열(도 12B)을 예시한다. 도 12B의 경우 빨간색은 힌지 도메인의 서열을 나타내고, 파란색은 막관통 도메인의 서열을 나타내며, 갈색은 세포질 도메인의 서열을 나타낸다.
도 13은 결합된 유전자 편집 기술을 보여주는 개략도이다.
도 14는 DARA(다라투무맙)의 유무 하에서 다중 세포주에 대한 비- 및 조작된-NK 세포의 플로우 사이토메트리 사멸 분석을 예시한다.
도 15는 항-HER2 CAR 유전자 작제물의 개략도이다.
도 16A-D는 항-HER2 CAR을 발현하도록 조작된 다양한 작제물을 보여주는 개략도이다.
도 17은 세포 상의 외관을 입증하는 작제물의 도식적 요약이다.
도 18A-G는 NK 세포에 대한 CAR 발현을 결정하기 위한 샌드위치 플로우 사이토메트리 방법을 예시한다. (도 18A) 특정 항-Her2 항체에 의해 검출된, 항-HER2 CAR을 발현하고 Her2 단백질에 결합하는 NK의 개략도. (도 18B-G) 전기천공된 세포에서만 발현되는 항-HER2 CAR의 구체적인 결정을 나타내는 플로우 사이토메트리 플롯. 염색을 위한 게이트 전략은 생존 세포에 대한 크기 게이팅을 사용하여 수행한 후(도 18B), 도 17에 따라, 대조군 NK 세포(도 18C), 전기(모의) 대조군(도 18D) 및 CAR-B(도 18E), CAR-C(도 18F) 및 CAR-D로 전기천공된 NK에 대한 항-Her2 항체를 통한 염색을 수행하였다(도 18G).
도 19는 TGFb 신호전달을 통해 매개되는 억제 피드백 루프가 강조된 NK 세포 조절 체크포인트의 예시이다. 출처: Riggan et al., Clinical & Translational Immunology(2021) e1238.
도 20은 NKp30 표면 발현을 예시한다.
도 21은 CISH KO NK 및 CISH KO/mb-IL-15 NK에서의 세포독성 효능을 예시한다.
도 22는 CISH KO NK 및 CISH KO/mb-IL-15 NK에서의 세포독성 효능을 예시한다.
도 23은 CISH KO NK 및 CISH KO/mb-IL-15 NK에서의 세포독성 효능을 예시한다.
도 24는 CISH KO NK 및 CISH KO/mb-IL-15 NK에서의 사멸율 및 효능을 예시한다.
도 25는 CD122 및 NKG2A 표면 발현 CISH KO/mb-IL-15 NK를 도시한다.
도 26은 TIGIT 및 LAG3 표면 발현 CISH KO/mb-IL-15 NK를 도시한다.
도 27은 CD38 KO 및 CD38 KO/CD38 CAR(GDA601) CD38 표면 발현의 흐름 분석을 도시한 것이다.
도 28은 CISH 가이드 KO 전략 및 일반적인 CISH KO/mb-IL-15 전기천공 작업흐름을 예시한다.
도 29는 mb-IL-15 표적 세포 사멸(K562) 및 비표적 사멸(PBMC)을 도시한다.
도 30은 CD38 KO 및 CD38 KO/CD38 CAR 효능 분석을 도시한다.
도 31은 CD38 KO 및 CD38 KO/CD38 CAR 효능 분석을 도시한다.
도 32는 CD38 KO 및 CD38 KO/CD38 CAR 사멸 및 동족 살해 분석을 도시한다.
본 발명은 이의 일부 구체예에서 조작된 자연 살해(NK) 세포에 관한 것이며, 보다 상세하게는, 이에 제한되지 않지만, 목적 유전자의 발현이 부족하고 동시에 목적하는 막 결합 단백질을 발현하도록 변형된 NK 세포에 관한 것이다.
본 발명의 원리와 작동은 도면과 첨부된 설명을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 구체예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 하기 설명에 제시되거나 실시예에 의해 예시된 세부사항에 대한 적용이 반드시 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 구체예가 가능하거나 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 어법 및 용어는 설명을 위한 것이며 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다.
본 발명을 실무에 적용하면서, 본 발명자들은 NK 세포가 목적하는 특정 질병 세포를 표적으로 하도록 맞춤화될 수 있으면서 동시에 효율적인 면역요법을 위한 향상된 특성을 가질 수 있음을 설명하였다.
하기 및 하기 실시예 섹션에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 포함하는 배양 조건 하에서 NK 세포 집단을 엑스 비보 확장하여 개선된 특성을 갖는 NK 세포를 생산하였다(아래, 일반 자료 및 실험 절차 섹션 참조). NK 세포의 기능성, 생존 및/또는 증식을 더욱 향상시키기 위해 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템을 사용하여 세포를 확장하기 전에 유전자 변형하여 산물이 NK 세포의 기능성, 생존 또는 증식을 부정적으로 조절하는 유전자의 발현을 하향조절하였다(예를 들어, CISH와 같은 체크포인트, CD38 또는 TGFβ 수용체 2의 경우 각각 실시예 1, 3 및 5 참조). 또한, NK 세포의 항질병 기능 또는 생존율을 향상시키기 위해, 확장된 NK 세포는 mRNA 전기천공법으로 수용체 링커 IL-15(RLI, 실시예 2 참조) 또는 Toll 유사 수용체 4(TLR4, 실시예 6 참조)와 같은 막 결합 단백질, 또는 항-CD38 CAR(실시예 3 참조) 또는 항-HER2 CAR(실시예 4 참조)과 같은 키메라 항원 수용체(CAR)를 일시적으로 발현하도록 변형되었다.
종합해 보면, 본 발명의 엑스 비보 생산된 NK 세포는 생체 내에서 높은 생존율과 높은 기능성(예를 들어 높은 세포독성)을 모두 가지며, 목적하는 임의의 질병 세포(예를 들어, 고형 종양 또는 전이 세포, 혈액 종양 세포, 바이러스 감염된 세포 등)를 표적화하도록 조작된 많은 수를 포함하는 용액을 제공한다. 더욱이, 본 발명의 엑스 비보 생산된 NK 세포는 선택된 임의의 약물, 예를 들어 다라투무맙(DARA)과 같은 항-CD38 항체와 함께 투여되도록 조작될 수 있으며, 그렇지 않으면 NK 세포를 사멸시킬 수 있다.
본 개시내용의 NK 세포 분획
본 개시내용은 유핵 세포 집단을 포함하는 NK 세포 분획을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단은 적어도 약 1.0 x 106, 또는 적어도 약 5.0 x 106, 또는 적어도 약 1.0 x 107, 또는 적어도 약 5.0 x 107, 또는 적어도 약 1.0 x 108, 또는 적어도 약 5.0 x 108, 또는 적어도 약 1.0 x 109, 또는 적어도 약 5.0 x 109, 또는 적어도 약 1.0 x 1010, 또는 적어도 약 5.0 x 1010, 또는 적어도 약 1.0 x 1011, 또는 적어도 약 5.0 x 1011, 또는 적어도 약 1.0 x 1012, 또는 적어도 약 5.0 x 1012의 유핵 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단은 적어도 약 1 x 106의 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단은 적어도 약 17.5 x 108의 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 유핵 세포의 집단은 적어도 약 35 x 108을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단은 적어도 약 2.5 x 109의 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단은 적어도 약 5 x 109의 세포를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 생존 가능하다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 70%가 생존 가능하다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%이 CD56+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 70%는 CD56+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 80% 내지 약 99%, 또는 약 85% 내지 약 95%, 또는 약 90 내지 약 95%는 CD56+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 90 내지 약 95%는 CD56+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 이하, 또는 약 0.2% 이하, 또는 약 0.3% 이하, 또는 약 0.4% 이하, 또는 약 0.5% 이하, 또는 약 0.6% 이하 또는 약 0.7% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.9% 이하, 또는 약 1.0% 이하는 CD3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 0.5% 이하는 CD3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 0.1%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.2%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.3%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.4%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.6%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.7%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.8%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.9%, 또는 약 0.01% 내지 약 1.0%는 CD3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 0.01% 내지 약 0.5%는 CD3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.2% 내지 약 0.3%는 CD3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.2% 내지 약 0.3%는 CD3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%는 CD56+/CD3-이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 70%는 CD56+/CD3-이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 99%는 CD56+/CD3-이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 80% 내지 약 99%, 또는 약 85% 내지 약 95%, 또는 약 90 내지 약 95%는 CD56+/CD3-이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 90 내지 약 95%는 CD56+/CD3-이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 이하, 또는 약 0.2% 이하, 또는 약 0.3% 이하, 또는 약 0.4% 이하, 또는 약 0.5% 이하, 또는 약 0.6% 이하 또는 약 0.7% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.9% 이하, 또는 약 1.0% 이하는 CD56-/CD3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 0.5% 이하는 CD56-/CD3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 0.1%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.2%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.3%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.4%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.6%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.7%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.8%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.9%, 또는 약 0.01% 내지 약 1.0%는 CD56-/CD3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.01% 내지 0.5%는 CD56-/CD3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.2% 내지 약 0.3%는 CD56-/CD3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.2% 내지 약 0.3%는 CD56-/CD3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 5% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하는 CD19+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 10% 이하는 CD19+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.7% 이하는 CD19+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 내지 약 5%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 0.01% 내지 약 15%, 또는 약 0.01% 내지 약 20%, 또는 약 0.01% 내지 약 25%는 CD19+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 10%는 CD19+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 0.7%는 CD19+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 내지 약 5%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 0.1% 내지 약 15%, 또는 약 0.1% 내지 약 20%, 또는 약 0.1% 내지 약 25%는 CD19+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 내지 약 10%는 CD19+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 내지 약 0.7%는 CD19+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 5% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하는 CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 10% 이하는 CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약0.05% 이하는 CD14+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 5%, 또는 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 약 0.01% 내지 약 15%, 또는 약 0.01% 내지 약 20%, 또는 약 0.01% 내지 약 25%는 CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 10%는 CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.01% 내지 약 0.05%는 CD14+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 내지 약 5%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 0.1% 내지 약 15%, 또는 약 0.1% 내지 약 20%, 또는 약 0.1% 내지 약 25%는 CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 내지 약 10%는 CD14+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 내지 약 0.05%는 CD14+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.57% 이하는 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 1% 이하는 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 2% 이하는 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 40% 이하는 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 2.5% 이하, 또는 약 5% 이하, 또는 약 10% 이하, 또는 약 15% 이하, 또는 약 20% 이하, 또는 약 30% 이하, 또는 약 35% 이하, 또는 약 40% 이하, 또는 약 50% 이하는 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 10% 이하는 LAG3+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.5% 내지 약 40%는 LAG3+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 10%는 CD122+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 15%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%는 CD122+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 15% 이하는 NKG2A+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 10% 이하는 NKG2A+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 5% 이하, 또는 약 2.5% 이하, 또는 1% 이하는 NKG2A+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.5% 이하는 NKG2A+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 60% 이하는 NKG2A+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 50% 이하는 NKG2A+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 45% 이하, 또는 약 35% 이하, 또는 25% 이하는 NKG2A+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 10% 이하는 NKG2A+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 80% 이하는 NKG2A+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 75% 이하는 NKG2A+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 70% 이하, 또는 약 65% 이하는 NKG2A+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 40% 이하는 TIGIT+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 30% 이하, 또는 약 35% 이하는 TIGIT+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 20% 이하는 TIGIT+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 15% 이하, 또는 약 10% 이하, 또는 약 5% 이하, 또는 약 2.5% 이하, 또는 약 1% 이하는 TIGIT+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 90%는 NKp30+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 50%는 NKp30+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 45%는 NKp30+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 15%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 2.5%는 NKp30+이다.
일부 구체예에서, 유핵 세포 집단 내 세포는 막 결합 수용체 또는 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 막 결합 수용체 또는 단백질은 수용체 링커 IL-15(mb-IL-15), IL-15, IL-15R 또는 TLR 중 하나 이상이다.
일부 구체예에서, 유핵 세포 집단 내 세포는 막 결합 수용체 또는 단백질과 상향조절, 하향조절 또는 넉아웃된 목적 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 막 결합 수용체 또는 단백질은 수용체 링커 IL-15(mb-IL-15) 중 하나 이상이고 목적 유전자는 CISH이다. 일부 구체예에서, 목적 유전자는 CISH이고 넉아웃된다. 일부 구체예에서, 유핵 세포 집단 내 세포는 mb-IL-15를 포함하되, mb-IL-15로 구성된 세포의 약 50% 이하는 CISH를 발현한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포 집단 내 세포는 mb-IL-15를 포함하되, mb-IL-15로 구성된 세포의 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 또는 약 25% 이하는 CISH를 발현한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포 집단의 세포는 mb-IL-15를 포함하되, mb-IL-15로 구성된 세포의 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 또는 약 2.5% 이하는 CISH를 발현한다.
따라서, 비제한적인 예에서, 본 개시내용은 유핵 세포 집단을 포함하는 NK 세포 분획을 제공하되, 집단은 적어도 1.0 x 106의 유핵 세포를 포함하고, 집단 내 세포의 적어도 약 70%는 생존 가능하며, 수용체 링커 IL-15를 발현하고, 여기서
집단 내 세포의 적어도 약 70%는 CD56+이고;
집단 내 세포의 약 0.5% 이하는 CD3+이며;
집단 내 세포의 약 10% 이하는 CD19+이고;
집단 내 세포의 약 10% 이하는 CD14+이며;
집단 내 세포의 약 40% 이하는 LAG3+이고;
집단 내 세포의 적어도 약 50%은 CD122+이며;
집단 내 세포의 약 60% 이하는 NKG2A+이고;
집단 내 세포의 약 20% 이하는 TIGIT+이고; 및
집단 내 세포의 적어도 50%는 NKp30+이다.
일부 구체예에서, 수용체 링커 IL-15는 SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 28로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 수용체 링커 IL-15를 발현하는 세포 중 약 25% 이하는 또한 CISH를 발현한다. 일부 구체예에서, 수용체 링커 IL-15를 발현하는 세포의 약 20% 이하, 또는 약 15% 이하, 또는 약 10% 이하, 또는 약 5% 이하, 또는 약 2.5% 이하, 또는 약 1% 이하 또는 약 0.5% 이하, 또는 약 0.01% 이하는 또한 CISH를 발현한다.
일부 구체예에서, 수용체 링커 IL-15를 발현하는 세포의 약 50% 이하는 또한 CISH를 발현한다. 일부 구체예에서, 수용체 링커 IL을 발현하는 세포의 약 45% 이하, 또는 약 40% 이하, 또는 약 35% 이하, 또는 약 30% 이하, 또는 약 28% 이하는 또한 CISH를 발현한다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 15% 이하는 CD38+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 10% 이하는 CD38+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 5% 이하, 약 2.5% 이하, 또는 1% 이하는 CD38+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.5% 이하는 CD38+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 0.1% 이하는 CD38+이다.
일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 30% 이하는 CD38+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 25% 이하는 CD38+이다. 일부 양태에서, 유핵 세포 집단 내 세포의 약 20% 이하, 또는 약 17% 이하는 CD38+이다.
일부 구체예에서, 유핵 세포 집단 내 세포는 항-CD-38 키메라 항원 수용체를 포함한다. 일부 구체예에서, 유핵 세포 집단 내 세포는 항-CD-38 키메라 항원 수용체를 포함하고 CD-38 넉아웃을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-CD-38 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포 중 약 10% 이하는 또한 CD38+를 발현한다. 일부 구체예에서, 항-CD-38 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포의 약 5% 이하, 2.5% 이하, 1% 이하, 0.05% 이하, 또는 0.01% 이하는 또한 CD38+를 발현한다.
일부 구체예에서, CAR은 항-CD38 Fab 또는 scFv를 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 CD28 또는 CD8 힌지 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 CD28, CD8 또는 NKG2D 막관통 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 CD28, 4-1BB, 2B4, CD3zetaR, OX40, Lsk, ICOS, DAP10 및 IgE 수용체 Ig 보조자극 도메인의 Fc 단편 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 CD3ζ, FcR-γ 및 Fc-엡실론-R 활성화 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 신호 펩타이드 또는 리더 펩타이드를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 항-CD-38 CAR은 SEQ ID NO: 31 및 SEQ ID NO: 32로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 집단 내 세포의 적어도 약 70%는 생존 가능하고 하나 이상의 막 결합 수용체 및 하나 이상의 CAR 수용체를 발현한다.
일부 구체예에서, 유핵 세포 집단 내 세포는 케모카인 수용체 또는 돌연변이 케모카인 수용체를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 케모카인 수용체는 CXCR4 또는 돌연변이체 CXCR4이다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 CXCR4는 CXCR4R334X 돌연변이체이다. 일부 구체예에서, 돌연변이체 CXCR4는 SEQ ID NO: 69이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기술된 임의의 NK 세포 분획 및 DMSO를 포함하는 동결보존된 NK 세포 분획을 제공한다. 일부 양태에서, DMSO의 농도는 약 1% v/v, 약 2% v/v, 약 3% v/v, 약 4% v/v, 또는 약 5% v/v, 약 6% v/v, 또는 약 7% v/v, 또는 약 8% v/v, 또는 약 9% v/v, 또는 약 10% v/v, 또는 약 11% v/v, 또는 약 12 % v/v, 또는 약 13% v/v, 또는 약 14% v/v, 또는 약 15% v/v일 수 있다. 일부 양태에서, DMSO의 농도는 약 10% v/v일 수 있다.
일부 양태에서, 동결보존된 NK 세포 분획은 적어도 약 1개월, 또는 적어도 약 2개월, 또는 적어도 약 3개월, 또는 적어도 약 4개월, 또는 적어도 약 5개월, 또는 적어도 약 6개월, 또는 적어도 약 7개월, 또는 적어도 약 9개월, 또는 적어도 약 10개월 동안 안정할 수 있다. 일부 양태에서, 동결보존된 NK 세포 분획은 약 -80℃에서 적어도 약 1개월, 또는 적어도 약 2개월, 또는 적어도 약 3개월, 또는 적어도 약 4개월, 또는 적어도 약 5개월, 또는 적어도 약 6개월, 또는 적어도 약 7개월, 또는 적어도 약 9개월, 또는 적어도 약 10개월 동안 안정할 수 있다.
본 개시내용의 효능 분석
본 개시내용은 1차 효능 분석을 제공하되, 분석은 다음을 포함한다:
a) 본 개시내용의 NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 인큐베이션하되, 복수의 표적 세포는 적어도 하나의 증식 염색으로 염색되는 단계;
b) 복수의 표적 세포에서 세포 사멸 비율을 결정하는 단계.
1차 효능 분석의 일부 양태에서, 단계 (a)의 인큐베이션 조건은 적어도 하나의 항암 치료 단클론 항체를 더 포함할 수 있다.
1차 효능 분석의 일부 양태에서 표적 세포는 K562 세포일 수 있다.
1차 효능 분석의 일부 양태에서, 표적 세포는 Raji(CCL-86) 세포일 수 있다. 1차 효능 분석의 일부 양태에서, 표적 세포는 Raji(CCL-86) 세포일 수 있고, 단계 (a)의 인큐베이션 조건은 리툭시맙을 더 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 리툭시맙은 약 1 ㎍/ml의 농도로 존재할 수 있다.
1차 효능 분석의 일부 양태에서, 표적 세포는 RPMI 세포일 수 있다. 1차 효능 분석의 일부 양태에서, 표적 세포는 RPMI 세포일 수 있다. 단계 (a)의 인큐베이션 조건은 다라투무맙을 더 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 다라투무맙은 약 1 ㎍/ml의 농도로 존재할 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 1차 효능 분석의 단계 (b)에서 복수의 표적 세포에서 세포 사멸 비율을 결정하는 것은 세포 사멸 비율을 결정하기 위해 당업계에 공지된 임의의 표준 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 비제한적인 예에서, 복수의 표적 세포에서 세포 사멸 비율을 결정하는 것은 다음을 포함할 수 있다:
i) 단계 (a)에서 인큐베이션된 NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 하나 이상의 생존성 염료로 염색하는 단계;
ii) 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 이용하여 NK 세포 분획으로부터 복수의 표적 세포를 분리하는 단계; 및
iii) 생존성 염료를 사용하여 단계 (ii)에서 분리된 복수의 표적 세포에서 세포 사멸 비율을 결정하는 단계.
일부 양태에서, 적어도 하나의 증식 염료는 카르복시플루오레세인 디아세테이트, 숙신이미딜 에스테르(CFSE)일 수 있다. 숙련된 기술자가 이해하는 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 증식 염료가 본 명세서에 기술된 1차 효능 분석에 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 생존성 염료는 Helix NP™ Blue(Sytox™ Blue로도 알려짐)일 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 증식 염료가 1차 효능 분석에 사용될 수 있다.다.
일부 양태에서, 1차 효능 분석의 단계 (a)에서의 인큐베이션은 약 37℃에서 수행될 수 있다.
일부 양태에서, 1차 효능 분석의 단계 (a)에서의 인큐베이션은 적어도 약 3시간 동안 수행될 수 있다.
일부 양태에서, 1차 효능 분석 단계 (a)에서 NK 세포 분획의 세포 수 대 복수의 표적 세포의 세포 수의 비율은 약 2.5:1, 또는 약 3:1 또는 약 5:1 또는 약 10:1이다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 K562 세포이고, 표적 세포에서 세포 사멸 비율은 적어도 30%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 K562 세포이고, 표적 세포에서 세포 사멸 비율은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서, 표적 세포는 RPMI 세포이고, 표적 세포에서 세포 사멸 비율은 1:1의 E:T 비율에서 적어도 10%인 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 표적 세포에서 세포 사멸 비율은 5:1의 E:T 비율에서 적어도 25%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 표적 세포에서 세포 사멸 비율은 5:1의 E:T 비율에서 적어도 40%인 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 표적 세포에서 세포 사멸 비율은 2.5:1의 E:T 비율에서 적어도 40%인 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 표적 세포에서 세포 사멸 비율은 1.25:1의 E:T 비율에서 적어도 30%인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 개시내용은 2차 효능 분석을 제공하되, 분석은 다음을 포함한다:
a) 본 개시내용의 NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 인큐베이션하되, NK 세포 분획은 검출 가능한 표지를 포함하는 적어도 하나의 항-CD107α 항체로 염색되는 단계;
b) 단계 (a)에서 인큐베이션된 NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 하나 이상의 단백질 수송 억제제(protein trafficking inhibitor)로 처리하고, NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 추가로 인큐베이션하는 단계;
c) NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 적어도 하나의 생존성 염료; 검출 가능한 표지를 포함하는 하나 이상의 항-CD56 항체로 염색하는 단계;
d) NK 세포 분획과 복수의 표적 세포를 고정하는 단계;
e) NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 투과시키는 단계;
f) NK 세포 분획 및 복수의 표적 세포를 다음을 사용하여 염색하는 단계:
i) 검출 가능한 표지를 포함하는 항-IFNγ 항체;
ii) 검출 가능한 표지를 포함하는 항-TNFα 항체;
g) 다음 중 적어도 하나를 결정하는 단계:
g1) 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-CD107α 항체로 염색된 생존 세포의 비율(즉, CD107a+/CD56+ 세포 수 ÷ CD56+ 세포 수 x 100%);
g2) 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-IFNγ 항체로 염색된 생존 세포의 비율(즉, IFNγ+/CD56+ 세포 수 ÷ CD56+ 세포 수 x 100%); 및
g3) 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-TNFα 항체로 염색된 생존 세포의 비율(즉, TNFα+/CD56+ 세포 수 ÷ CD56+ 세포 수 x 100%).
2차 효능 분석의 일부 양태에서, 표적 세포는 K562 세포, RPMI, Raji 또는 K562 세포일 수 있다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 생존성 염료는 Zombie Violet™ 생존성 염료일 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 증식 염료가 1차 효능 분석에 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 하나 이상의 단백질 수송 억제제는 브레펠딘, GolgiStop™ 단백질 수송 억제제(BD), 브레펠딘과 GolgiStop™ 단백질 수송 억제제의 조합, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 단백질 추적 억제제를 포함할 수 있다.
2차 효능 분석의 일부 양태에서, 단계 (b)의 추가 인큐베이션은 약 37℃에서 수행된다.
2차 효능 분석의 일부 양태에서, 단계 (b)의 추가 인큐베이션은 적어도 약 37℃에서 수행된다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 단계 (g)의 적어도 하나의 (g1) - (g3)을 결정하는 단계는 검출 가능한 표지를 포함하는 항체로 표지된 세포의 비율을 결정하기 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함하여 당업계에 공지된 임의의 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
2차 효능 분석의 일부 양태에서, 단계 (g)는 (g1) - (g3) 각각을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 2차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 K562 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-CD107α 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 25%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 Raji 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-CD107α 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 2.5%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-CD107α 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 10%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-TNFα 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 10%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-TNFα 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 25%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 Raji 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-TNFα 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 5%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 K562 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-IFNgamma 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 25%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 Raji 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-IFNgamma 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 20%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-IFNgamma 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 10%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 K562 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-GM-CSF 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 4%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 K562 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-MIP1alpha 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 50%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-MIP1alpha 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 30%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 Raji 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-MIP1alpha 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 20%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 K562 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-MIP1beta 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 50%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-MIP1beta 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 25%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 Raji 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-MIP1beta 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 20%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-CD107alpha 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 40%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-TNFalpha 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 50%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-IFNgamma 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 5%인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 NK 세포 분획은 NK 세포 분획이 상기 기재된 1차 효능 분석을 사용하여 시험될 때, 여기서 표적 세포는 RPMI 세포이고, 적어도 하나의 항-CD56 항체로 염색되고, 또한 적어도 하나의 항-CM-CSF 항체로 염색된 생존 세포의 비율은 3:1의 E:T에서 적어도 15%인 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태에 따르면, 유전자 변형 자연 살해(NK) 세포의 엑스 비보 생산 방법이 제공되며, 이 방법은
(a) 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 NK 세포 집단을 얻기 위해 NK 세포 집단에서 목적 유전자의 발현을 하향조절하는 단계;
(b) 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단을 얻기 위해 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 NK 세포 집단을 확장시키는 단계; 및
(c) 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단에서 적어도 하나의 막 결합 단백질의 발현을 상향조절하여 유전자 변형된 NK 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 적어도 하나의 막 결합 단백질을 발현하는 자연 살해(NK) 세포의 엑스 비보 생산 방법이 제공되며, 이 방법은
a) 다음을 포함하는 방법에 의해 NK 세포 집단을 확장시키는 단계:
(i) 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 NK 세포 집단을 배양하되, 조건은 유효량의 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 제공하는 것을 포함하는 단계; 및
(ii) 단계 (i) 이후 5-10일에 유효량의 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 NK 세포 집단에 보충하여 확장된 NK 세포를 생산하는 단계;
엑스 비보 확장된 NK 세포 집단을 얻기 위해, 및
(b) 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단에서 적어도 하나의 막 결합 단백질의 발현을 상향조절하여 적어도 하나의 막 결합 단백질을 발현하는 NK 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "자연 살해 세포" 또는 "NK 세포"는 선천성 면역 반응에 관여하는 큰 과립형 림프구를 지칭한다. 기능적으로, NK 세포는 퍼포린, 그래눌리신 및 그랜자임 프로테아제를 비롯한 다양한 단백질을 함유한 세포질 과립의 엑소사이토시스를 통해 다양한 표적에 대해 세포용해 활성을 나타낸다. 살해는 항원에 대한 사전 감작을 필요로 하지 않는 접촉 의존적, 비-식세포 과정에서 유발된다.
인간 NK 세포는 세포 표면 표지인 CD16과 CD56이 존재하고 T 세포 수용체(CD3)가 없다는 특징이 있다. 인간 골수 유래 NK 세포는 추가로 CD2+CD16+CD56+CD3- 표현형을 특징으로 하며, 추가로 일반적으로 T 세포 수용체 제타 사슬[zeta-TCR]을 함유하고, 종종 NKp46, NKp30 또는 NKp44의 존재를 특징으로 한다. NKT 세포 또는 CD8NKT와 같은 비-NK 세포는 T 세포와 NK 세포 모두의 특성과 세포 표면 마커(예를 들어, CD3 발현)를 보유한다.
일 구체예에서, NK 세포 집단은 성숙한 NK 세포를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "성숙한 NK 세포"는 특징적인 표면 마커 및 NK 세포 기능을 갖고 추가 분화 가능성이 결여된 수임 NK 세포로 정의된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 성숙한 NK 세포에는 증식하여 풍부한 사이토카인을 생산할 수 있는 CD56bright 세포; 강력한 세포독성을 나타내는 CD56dim 세포; CD56brightCD94high 및 CD56dimCD94high 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. CD56, CD3, CD94 및 기타 마커의 세포 표면 발현은 예를 들어 FACS 분석 또는 면역조직학적 염색 기술에 의해 결정될 수 있다.
다른 구체예에서, NK 세포 집단은 NK 전구 세포, 또는 NK 전구 세포와 성숙한 NK 세포의 혼합 집단을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "전구 세포"는 하나 이상의 성숙한 효과기 세포로 분열 및/또는 분화를 겪을 수 있는 미성숙 세포를 지칭한다. 림프구 전구세포에는 예를 들어 B 세포, T 세포 및 NK 계통의 성숙한 세포를 생성할 수 있는 다능성 조혈 줄기 세포가 포함된다. B 세포 계통(즉, 성숙한 B 세포를 생성하는 발달 경로)에서 전구세포에는 면역글로불린 유전자 재배열 및 발현을 특징으로 하는 pro-B 세포 및 pre-B 세포도 포함된다. T 및 NK 세포 계통에서 전구세포에는 골수 유래 양성 T/NK 세포 전구세포[예를 들어, CD34(+)CD45RA(hi)CD7(+) 및 CD34(+)CD45RA(hi)Lin(-) CD10(+) 세포] 뿐만 아니라 이중 음성(CD4 및 CD8에 대해) 및 이중 양성 흉선 세포(T 세포 계통) 및 수임 NK 세포 전구세포를 포함하는 흉선내 전구세포도 포함된다.
본 발명의 일부 구체예의 NK 세포는 분리된 세포이다.
용어 "분리된"은 자연 환경, 예를 들어 조직, 예를 들어 인체로부터 적어도 부분적으로 분리된 것을 지칭한다.
용어 "NK 세포 집단"은 성숙도가 다르거나, 특징이 다르거나, 기능이 다른 등의 이질적인 NK 세포 혼합물을 지칭한다.
본 발명의 일부 구체예의 NK 세포는 이러한 세포를 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. NK 세포는 많은 조직에서 발견되며, 예를 들어 림프절, 비장, 간, 폐, 내장, 탈락조직에서 얻을 수 있으며 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)에서도 얻을 수 있다. 일반적으로, 이종 림프구 세포 집단을 포함하는 제대혈, 말초 혈액, 동원된 말초 혈액 및 골수(예를 들어, CD34+ 세포)는 연구 및 임상 용도를 위한 다수의 NK 세포를 제공하는 데 사용된다.
일 구체예에 따르면, NK 세포는 말초 혈액으로부터 얻는다.
본 교시에 따라 임의의 혈액 수집 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈액 분획을 수집하는 일반적인 방법은 성분채집술로, 공여자 혈액을 일반적으로 원심분리에 의해 혈액 성분(예를 들어, 혈장, 백혈구 및 적혈구)으로 분리하고, 조작(예를 들어, 백혈구 분획 배양)을 위해 선택된 성분을 빼내고, 나머지는 공여자에게 반환된다. 많은 적합한 성분채집 장치가 시판 중이다. 전형적으로 성분채집술은 공여자의 말초 혈액에서 혈액 성분을 분리하는 데 적용된다.
"버피 코트" 또는 성분채집 단위와 같은 림프구 분획을 처리하여 특정하게 정의된 세포 집단을 농축, 정제 또는 분리할 수 있다. 용어 "정제하다"와 "분리하다"는 절대적인 순도를 요구하지 않는다. 오히려 이는 상대적인 용어로 사용된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 림프구 집단은 특정 세포가 그 공급원 조직에 있는 세포보다 더 농축된 집단이다. 실질적으로 순수한 림프구 제제는 원하는 세포(예를 들어, NK 세포)가 제제에 존재하는 전체 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상을 나타내도록 농축될 수 있다. 림프구를 농축, 정제 및 분리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 원하는 집단에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, 림프구 농축은 원치 않는 세포를 부정적으로 선택하기 위한 시판 제제, 예를 들어 FICOLL-HYPAQUE™ 및 전체 림프구, T 세포 또는 NK 세포의 농축을 위한 제형화된 기타 밀도 구배 배지를 사용하여 수행될 수 있다.
혈액, 골수, 림프구 제제(예를 들어, 성분채집 단위) 또는 조직 샘플로부터 NK 세포를 선택하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Litwin 등의 미국 특허 번호 5,770,387 참조, 이는 그 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함됨). 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜은 일반적으로 단핵 세포 분획화와 CD3+, CD19+, CD14+, CD34+ 및/또는 CD133+ 세포 등과 같은 비-NK 세포의 고갈 이후 CD56+ 세포의 분리 및 정제를 기반으로 하는 프로토콜이다. 2개 이상의 프로토콜을 조합하여 비-NK 오염물질로부터 더 높은 순도를 갖는 NK 세포 집단을 제공할 수 있다. T 세포 및 NKT 세포와 같은 비-NK 세포는 이식편대숙주병(GVHD)과 같은 항원 특이적인 반응에 기여하여 NK 세포 이식의 잠재적인 이점을 손상시키므로 NK 세포 제제의 순도는 임상 적용에 매우 중요하다. NK 세포 분리를 위해 시판되는 키트에는 1단계 절차(예를 들어, Miltenyi Biotec, Auburn CA의 CD56 마이크로비드 및 CD56+, CD56+CD16+ 분리 키트)와 CD3+의 고갈 또는 부분 고갈을 포함한 다단계 절차가 포함된다. T 세포(예를 들어, OKT-3), B 세포, 줄기 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구 및 적혈구 세포를 인식하고 제거하는 비-NK 세포 항체로 구성된다.
표현형에 따라 NK 세포를 선택하는 방법에는 면역검출 및 FACS 분석이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, NK 세포 집단은 CD3+ 세포, CD14+ 세포, CD19+ 세포 등이 고갈되거나, 예를 들어 CliniMACS(LS 컬럼, Miltenyi Biotec)를 사용하는 면역자기 선택에 의해 CD56+ 세포에 대해 선택된다.
따라서, 특정 구체예에서, NK 세포 집단은 NK 세포에 대해 선택 또는 농축되고, CD3-고갈된 NK 세포 분획일 수 있다.
또 다른 구체예에 따르면, NK 세포 집단은 NK 세포에 대해 선택 또는 농축되고, CD56+ NK 세포 분획일 수 있다.
일 구체예에 따르면, NK 세포 집단은 CD56+CD16+CD3- 세포 및/또는 CD56+CD16-CD3- 세포를 포함한다.
특정 구체예에서, 배양 개시 시(즉, 엑스 비보 확장 전) NK 세포를 포함하는 세포 집단은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상의 CD3-/CD56+ 세포를 포함한다.
특정 구체예에서, 배양 개시 시 NK 세포를 포함하는 세포 집단은 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상의 CD3-/CD56+ 세포를 포함한다. .
일부 구체예에서, 배양 개시 시 NK 세포를 포함하는 세포 집단은 10%-30% CD3-/CD56+ 세포, 10%-50% CD3-/CD56+ 세포, 20%-40% CD3-/CD56+ 세포, 20%-60% CD3-/CD56+ 세포, 30%-50% CD3-/CD56+ 세포, 30%-70% CD3-/CD56+ 세포, 40%-60% CD3-/CD56+ 세포, 40%-80% CD3-/CD56+ 세포, 50%-70% CD3-/CD56+ 세포, 50%-90% CD3-/CD56+ 세포, 60%-80% CD3-/CD56+ 세포, 60%-100% CD3-/CD56+ 세포, 70%-90% CD3-/CD56+ 세포 또는 80%-100% CD3-/CD56+ 세포를 포함한다.
배양 개시 시 NK 세포를 포함하는 세포 집단은 잔류 단핵구, B 세포, T 세포, 수지상 세포 등을 포함할 수 있지만, 이들은 엑스 비보 배양 과정을 통해 제거된다는 것이 이해될 것이다.
일부 구체예에서, NK 세포 집단에는 적혈구가 없다. 따라서, 일부 구체예에서, CD3+/CD14+/CD19+ 세포 고갈 또는 CD56+ 세포 선택 전 또는 후에, NK 세포 분획은 배양 전에 적혈구(RBC) 용해를 겪는다. 특정 구체예에서, 적혈구 용해는 암모늄 클로라이드 포타슘(ACK) 완충액(Gibco, Thermo Fischer Scientific)를 사용하여 달성된다.
일부 구체예에 따르면, NK 세포는 신선한 세포 집단으로부터 배양될 수 있는 반면, 다른 구체예에서는 저장된 세포 집단(예컨대 냉동보존 및 해동된 세포) 또는 이전에 배양된 세포 집단으로부터 NK 세포를 배양한다.
본 발명의 일부 구체예의 NK 세포는 유전자 변형된다.
용어 "유전자 변형된"은 필요한 적용(예를 들어, 치료할 질병)에 따라 특정 유전자, 마커 또는 펩타이드를 발현하거나 발현하지 않거나 특정 펩타이드(예를 들어, 사이토카인)를 분비하거나 분비하지 않도록 조작된 세포를 지칭한다.
유전적 변형은 세포에 영구적이거나 일시적인 유전적 변화를 초래할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 유전적 변형은 세포 게놈에 있다. 이러한 변형은 일반적으로 안정적이다.
일 구체예에 따르면, NK 세포는 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 NK 세포 집단을 얻기 위해 NK 세포 집단에서 목적 유전자의 발현을 하향조절함으로써 유전자 변형된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "목적 유전자"는 원하는 mRNA 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 맥락에 따라, 목적 유전자는 데옥시리보핵산, 예를 들어 RNA 전사체로 전사될 수 있는 DNA 주형의 목적 유전자, 또는 리보핵산, 예를 들어 RNA 전사체 내 목적 유전자를 지칭한다. 인 비트로(in vitro), 인 비보(in vivo), 또는 엑스 비보(ex vivo)에서 인코딩된 목적 폴리펩타이드를 생산하도록 번역될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 목적 유전자는 전사 인자, 전사 억제인자, 리쿠르팅 단백질, 비-코딩 RNA(예: tRNA, rRNA, snoRNA, siRNA, miRNA, long ncRNA 등), 분비 단백질(예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 호르몬), 막 단백질, 세포 표면 단백질(예를 들어, 수용체, 마커), 효소(예를 들어, 키나제), 리소좀 관련 단백질, 세포용해 단백질 및 금속단백분해효소를 인코딩한다.
일 구체예에 따르면, 목적 유전자는 그 산물이 NK 세포의 증식, 생존, 기능성, 예컨대 사이토카인 생산(예를 들어, IFNγ) 및/또는 세포독성 활성에 영향을 미치는 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에 따르면, 목적 유전자는 CISH, TGFβ 수용체 또는 CD38을 포함한다.
특정 구체예에 따르면, 목적 유전자는 NK 세포를 IL-15에 더욱 민감하게 만든다.
특정 구체예에 따르면, 목적 유전자는 CISH를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CISH"는 유전자 기호 "CISH"를 갖는 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CIS) 또는 예를 들어, GeneBank 등록 번호. NP_037456.5 및 NP_659508.1(단백질) 및 NM_013324.7 및 NM_145071.4(mRNA), 또는 이들의 상동체를 인코딩하는 유전자를 지칭한다.
특정 구체예에 따르면, 목적 유전자는 TGFβ 수용체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "TGFβ 수용체"는 유전자 기호 "TGFBR1"을 갖는 형질전환 성장 인자 베타 수용체 1, 또는 예를 들어, GeneBank 등록 번호 NP_001124388.1, NP_001293139.1 또는 NP_004603.1(단백질) 및 NM_001130916.3, NM_001306210.2 또는 NM_004612.4(mRNA), 또는 이들의 상동체를 인코딩하는 유전자; 유전자 기호 "TGFBR2"를 갖는 형질전환 성장 인자 베타 수용체 2, 또는 예를 들어 GeneBank 등록 번호 NP_001020018.1 또는 NP_003233.4(단백질) 및 NM_001024847.2 또는 NM_003242.6(mRNA), 또는 이들의 상동체를 인코딩하는 유전자; 또는 유전자 기호 "TGFBR3"을 갖는 형질전환 성장 인자 베타 수용체 3, 또는 예를 들어, GeneBank 등록 번호 NP_001182612.1, NP_001182613.1 또는 NP_003234.2(단백질) 및 NM_001195683.2, NM_001195684.1 또는 NM_003243.5(mRNA) 또는 이의 상동체를 인코딩하는 유전자를 지칭한다.
특정 구체예에 따르면, 목적 유전자는 CD38을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD38"은 유전자 기호 "CD38"을 갖는 CD38 분자, 또는 예를 들어 GeneBank 등록 번호 NP_00 1766.2(단백질) 및 NM_001775.4(mRNA) 또는 이의 상동체를 인코딩하는 유전자를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 문구 "발현을 하향조절하는"은 전사(예를 들어, DNA 편집제) 및/또는 번역(예를 들어, RNA 침묵제)을 간섭하는 다양한 분자를 사용하여 게놈 및/또는 전사체 수준에서 목적 유전자(예를 들어 CISH, CD38 또는 TGFβ 수용체)의 단백질 산물의 발현을 하향조절하는 것을 지칭한다.
발현의 하향조절은 일시적일 수도 있고 영구적일 수도 있다.
동일한 배양 조건에서 발현은 일반적으로 동일 종의 세포에서의 발현과 비교하여 발현되지만 하향조절제와 접촉되지 않거나 "대조군"이라고도 불리는 비히클 대조군과 접촉되지 않는다.
특정 구체예에 따르면, 발현을 하향조절하는 것은 각각 RT-PCR 또는 웨스턴 블롯에 의해 검출되는 바와 같이 mRNA 및/또는 단백질이 없다는 것을 의미한다.
다른 특정 구체예에 따르면 발현을 하향조절하는 것은 각각 RT-PCR 또는 웨스턴 블롯에 의해 검출되는 바와 같이 mRNA 및/또는 단백질 수준의 감소를 의미한다. 감소는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%일 것이다.
목적 유전자(예를 들어 CISH, CD38 또는 TGFβ 수용체)의 발현을 하향조절할 수 있는 제제의 비제한적인 예는 본 명세서에서 아래에 상세하게 설명되어 있다.
다음은 본 발명의 특정 구체예에 따라 사용될 수 있는 게놈(DNA) 수준에서 목적 유전자의 발현을 하향조절하는 데 사용되는 방법 및 DNA 편집제와 이를 실행하기 위한 제제의 다양한 비제한적 예에 대한 설명이다.
조작된 엔도뉴클레아제를 이용한 게놈 편집 - 이 접근법은 인위적으로 조작된 뉴클레아제를 사용하여 게놈의 원하는 위치(들)에서 특정 이중 가닥 절단을 절단하고 생성하는 역유전학 방법을 지칭하며,그런 다음 상동성 지정 복구(HDR) 및 비상동성 말단 결합(NHEJ)과 같은 세포 내인성 프로세스에 의해 복구된다. NHEJ는 이중 가닥 절단으로 DNA 말단을 직접 연결하는 반면, HDR은 절단 지점에서 누락된 DNA 서열을 재생하기 위한 주형으로 상동 서열을 활용한다. 게놈 DNA에 특정 뉴클레오티드 변형을 도입하려면 HDR 중에 원하는 서열을 포함하는 DNA 복구 주형이 존재해야 한다.
대부분의 제한 효소는 DNA의 몇 가지 염기쌍을 표적으로 인식하고 인식된 염기쌍 조합이 게놈 전체의 여러 위치에서 발견되어 원하는 위치에 제한되지 않는 다중 절단이 발생할 확률이 매우 높기 때문에 전통적인 제한 엔도뉴클레아제로는 게놈 편집을 수행할 수 없다. 이러한 과제를 극복하고 부위별 단일 또는 이중 가닥 절단을 생성하기 위해 현재까지 몇 가지 독특한 종류의 뉴클레아제가 발견되고 생명공학적으로 설계되었다. 여기에는 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제(Zinc finger nucleases, ZFN), 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(transcription-activator like effector nucleases, TALEN), T-GEE 시스템 및 CRISPR/Cas 시스템이 포함된다.
메가뉴클레아제 - 메가뉴클레아제는 일반적으로 LAGLIDADG 계열, GIY-YIG 계열, His-Cys 박스 계열 및 HNH 계열의 4개의 계열로 분류된다. 이러한 계열은 촉매 활성 및 인식 순서에 영향을 미치는 구조적 모티프가 특징이다. 예를 들어 LAGLIDADG 계열의 구성원은 보존된 LAGLIDADG 모티프의 복사본이 하나 또는 두 개 있는 것이 특징이다. 메가뉴클레아제의 4개의 계열은 보존된 구조적 요소들 측면에서 결과적으로 DNA 인식 서열 특이성 및 촉매 활성이 서로 매우 구분되어 있다. 메가뉴클레아제는 미생물 종에서 흔히 발견되며 매우 긴 인식 서열(>14bp)을 갖는 독특한 특성을 갖고 있어 원하는 위치에서 절단하는 데 자연적으로 매우 특이적이다.
이는 게놈 편집에서 부위별 이중 가닥 절단을 만드는 데 활용될 수 있다. 당업자는 이러한 자연적으로 발생하는 메가뉴클레아제를 사용할 수 있지만, 이러한 자연적으로 발생하는 메가뉴클레아제의 수는 제한되어 있다. 이러한 과제를 극복하기 위해 돌연변이 유발 및 고처리량 스크리닝 방법을 사용하여 고유한 서열을 인식하는 메가뉴클레아제 변이체를 생성하였다. 예를 들어, 새로운 서열을 인식하는 하이브리드 효소를 생성하기 위해 다양한 메가뉴클레아제가 융합되었다.
대안으로, 서열 특이적인 메가뉴클레아제를 설계하기 위해 메가뉴클레아제의 DNA 상호작용 아미노산이 변경될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 8,021,867 참조). 메가뉴클레아제는 예를 들어 문헌[Certo, MT et al. Nature Methods(2012) 9:073-975; 미국 특허 번호 8,304,222; 8,021,867; 8,119,381; 8, 124,369; 8, 129,134; 8,133,697; 8,143,015; 8,143,016; 8,148,098; 또는 8,163,514]에 기술된 방법을 사용하여 설계될 수 있으며, 각각의 내용은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다. 대안으로, 부위 특이적인 절단 특징을 갖는 메가뉴클레아제는 상업적으로 이용 가능한 기술, 예를 들어 Precision Biosciences의 Directed Nuclease Editor™ 게놈 편집 기술을 사용하여 얻을 수 있다.
ZFN 및 TALEN - 조작된 뉴클레아제의 2종의 고유한 클래스인 ZFN(징크핑거 뉴클레아제)과 TALEN(전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제)은 둘 다 표적 이중 가닥 절단을 생성하는 데 효과적인 것으로 입증되었다(Christian 등, 2010; Kim 등, 1996; Li 등, 2011; Mahfouz 등, 2011; Miller 등, 2010).
기본적으로 ZFN 및 TALEN 제한 엔도뉴클레아제 기술은 특정 DNA 결합 도메인에 연결된 비특이적인 DNA 절단 효소를 활용한다(각각 일련의 징크핑거 도메인 또는 TALE 리피트). 일반적으로 DNA 인식 부위와 절단 부위가 서로 분리되어 있는 제한효소를 선택한다. 절단 부분이 분리된 후 DNA 결합 도메인에 연결됨으로써 원하는 서열에 대해 매우 높은 특이성을 갖는 엔도뉴클레아제가 생성된다. 이러한 특성을 갖는 예시적인 제한효소는 FokI이다. 추가로, Fokl은 뉴클레아제 활성을 가지기 위해 이량체화가 필요하다는 장점이 있으며 이는 각 뉴클레아제 파트너가 고유한 DNA 서열을 인식함에 따라 특이성이 극적으로 증가한다는 것을 의미한다. 이 효과를 향상시키기 위해, Fokl 뉴클레아제는 이종이량체로만 기능할 수 있고 촉매 활성이 증가하도록 설계되었다. 이종이량체 기능을 하는 뉴클레아제는 원치 않는 동종이량체 활성 가능성을 방지하여 이중 가닥 절단의 특이성을 높인다.
따라서, 예를 들어 특정 부위를 표적화하기 위해 ZFN 및 TALEN은 뉴클레아제 쌍으로 구성되며, 쌍의 각 구성원은 표적 부위에서 인접한 서열에 결합하도록 설계된다. 세포에서 일시적으로 발현되면 뉴클레아제는 표적 부위에 결합하고 FokI 도메인은 이종이량체화되어 이중 가닥 절단(DSB)을 생성한다. NHEJ(비상동성 말단 결합) 경로를 통한 이러한 이중 가닥 절단의 복구는 가장 흔히 작은 결실 또는 작은 서열 삽입(Indel)을 초래한다. NHEJ에 의해 수행되는 각각의 복구는 고유하므로 단일 뉴클레아제 쌍을 사용하면 표적 부위에서 상이한 결실 범위를 갖는 대립유전자 시리즈를 생성할 수 있다.
결실의 범위는 전형적으로 몇 개의 염기쌍부터 수백 개의 염기쌍까지 다양하지만 두 쌍의 뉴클레아제를 동시에 사용하여 세포 배양에서 더 큰 결실이 성공적으로 생성되었다(Carlson 등, 2012; Lee 등, 2010). 또한, 표적 영역과 상동성을 갖는 DNA 단편이 뉴클레아제 쌍과 함께 도입되면 상동성 지정 복구를 통해 이중 가닥 절단을 복구하여 특정 변형을 생성할 수 있다(Li 등, 2011; Miller 등, 2010; Urnov 등, 2005).
ZFN과 TALEN의 뉴클레아제 부분은 유사한 특성을 가지고 있지만 이러한 조작된 뉴클레아제 간의 차이점은 DNA 인식 펩타이드에 있다. ZFN은 Cys2-His2 아연핑거와 TALE의 TALEN에 의존한다. 이들 DNA 인식 펩타이드 도메인은 모두 단백질 내에서 자연적으로 조합되어 발견되는 특징을 갖고 있다. Cys2-His2 아연핑거는 일반적으로 3bp 떨어진 리피트에서 발견되며 다양한 핵산 상호작용 단백질에서 다양한 조합으로 발견된다. 반면에 TALE는 아미노산과 인식된 뉴클레오티드 쌍 사이의 일대일 인식 비율을 갖는 리피트에서 발견된다. 징크핑거와 TALE는 모두 반복되는 패턴으로 발생하기 때문에 다양한 조합을 시도하여 다양한 서열 특이성을 생성할 수 있다. 부위 특이적인 징크핑거 엔도뉴클레아제를 만드는 접근법은 예를 들어, 모듈식 조립(삼중항 서열과 상관된 아연핑거가 필요한 서열을 커버하기 위해 연속적으로 부착되는 경우), OPEN(펩타이드 도메인 대 삼중항 뉴클레오티드의 낮은 엄격성 선택 후 세균 시스템의 최종 표적 대비 펩타이드 조합의 높은 엄격성 선택) 및 아연핑거 라이브러리의 세균성 원-하이브리드 스크리닝 등을 포함한다. ZFN은 또한 예를 들어 Sangamo BiosciencesTM(Richmond, CA)로부터 설계되고 상업적으로 입수될 수 있다.
TALEN을 설계하고 얻는 방법은 예를 들어 Reyon et al. Nature Biotechnology 2012 May;30(5):460-5; Miller et al. Nat Biotechnol. (2011) 29: 143- 148; Cermak et al. Nucleic Acids Research (2011) 39 (12): e82 and Zhang et al. Nature Biotechnology (2011) 29 (2): 149-53에 기술되어 있다. 최근 개발된 Mojo Hand라는 웹 기반 프로그램은 게놈 편집 응용 프로그램을 위한 TAL 및 TALEN 작제물을 설계하기 위해 Mayo Clinic에서 도입되었다(http://www(dot)talendesign(dot)org를 통해 접근할 수 있음). TALEN은 또한 예를 들어 Sangamo BiosciencesTM(Richmond, CA)로부터 설계되고 상업적으로 입수될 수 있다.
T-GEE 시스템(TargetGene의 게놈 편집 엔진) - 생체 내 표적 세포에서 조립되고 미리 결정된 표적 핵산 서열과 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드 부분과 특이성 부여 핵산(specificity conferring nucleic acid, SCNA)을 포함하는 프로그래밍 가능한 뉴클레오단백질 분자 복합체가 제공된다. 프로그래밍 가능한 뉴클레오단백질 분자 복합체는 표적 핵산 서열 내의 표적 부위를 특이적으로 변형 및/또는 편집하고/하거나 표적 핵산 서열의 기능을 변형시킬 수 있다. 뉴클레오단백질 조성물은 (a) 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하고 (i) 표적 부위를 변형시킬 수 있는 기능적 도메인, 및 (ii) 특이성 부여 핵산과 상호작용할 수 있는 연결 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자, 및 (b) (i) 표적 부위 측면에 있는 표적 핵산의 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 폴리펩타이드의 연결 도메인에 특이적으로 부착할 수 있는 인식 영역을 포함하는 특이성 부여 핵산(SCNA)을 포함한다. 본 조성물은 특이성 부여 핵산과 표적 핵산의 염기쌍 결합을 통해 높은 특이성과 표적 핵산에 대한 분자 복합체의 결합 능력을 통해 특정 핵산 서열 표적을 정확하고 안정적이며 비용 효율적으로 변형시킬 수 있게 한다. 본 조성물은 유전 독성이 적고 조립이 모듈식이며 맞춤화 없이 단일 플랫폼을 활용하고 전문 핵심 시설의 외부에서 독립적으로 사용하기에 실용적이며 개발 시간이 짧고 비용이 절감된다.
CRISPR-Cas 시스템 - 많은 세균과 고세균에는 침입 파지와 플라스미드의 핵산을 분해할 수 있는 내인성 RNA 기반 적응 면역 시스템이 포함되어 있다. 이러한 시스템은 RNA 구성성분을 생산하는 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 유전자와 단백질 구성성분을 인코딩하는 CRISPR 관련(Cas) 유전자로 구성된다. CRISPR RNA(crRNA)는 특정 바이러스 및 플라스미드에 대한 상동성의 짧은 스트레치를 포함하고, Cas 뉴클레아제가 상응하는 병원균의 상보적 핵산을 분해하도록 지시하는 가이드 역할을 한다. 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)의 II형 CRISPR/Cas 시스템에 대한 연구에 따르면 세 가지 구성성분이 RNA/단백질 복합체를 형성하고 함께 서열 특이적인 뉴클레아제 활성에 충분하다는 사실이 밝혀졌다: Cas9 뉴클레아제, 표적 서열에 대한 20개의 염기쌍 상동성을 함유하는 crRNA(gRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)(Jinek et al. Science (2012) 337: 816-821.).
crRNA와 tracrRNA 사이의 융합으로 구성된 합성 키메라 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 인 비트로에서 Cas9가 crRNA에 상보적인 DNA 표적을 절단하도록 지시할 수 있다는 것이 추가로 입증되었다. 또한 합성 sgRNA와 함께 Cas9의 일시적인 발현을 사용하여 다양한 종에서 표적화된 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있다는 것이 입증되었다(Cho 등, 2013; Cong 등, 2013; DiCarlo 등, 2013; Hwang 등, 2013a,b; Jinek 등, 2013; Mali 등, 2013). sgRNA(본 명세서에서는 단일 가이드 RNA(sgRNA)라고도 함)는 일반적으로 단일 키메라 전사체에서 crRNA를 Cas9 뉴클레아제(tracrRNA)에 연결하는 내인성 세균 RNA와 표적 상동 서열(crRNA)의 조합을 인코딩하는 80-100개 뉴클레오티드 서열이다.
게놈 편집을 위한 CRISPR/Cas 시스템에는 2종의 고유한 구성성분이 포함되어 있다: sgRNA 및 엔도뉴클레아제(예: Cas9), 또는 3종의 구성성분인 siRNA, tracrRNA 및 엔도뉴클레아제, 예를 들어, Cas9.
sgRNA/Cas9 복합체 또는 gRNA/tracrRNA/Cas9는 gRNA 서열과 보체 게놈 DNA 사이의 염기쌍 결합에 의해 표적 서열로 모집된다. Cas9의 성공적인 결합을 위해서는 게놈 표적 서열이 표적 서열 바로 다음에 올바른 PAM(Protospacer Adjacent Motif) 서열을 포함해야 한다. sgRNA/Cas9 복합체 또는 gRNA/tracrRNA/Cas9의 결합은 Cas9를 게놈 표적 서열에 국한시켜 Cas9가 DNA의 두 가닥을 모두 절단하여 이중 가닥 절단(DSB)을 일으킬 수 있도록 한다. ZFN 및 TALEN과 마찬가지로 CRISPR/Cas에 의해 생성된 이중 가닥 절단(DSB)은 상동 재조합 또는 NHEJ를 겪을 수 있으며 DNA 복구 중에 특정 서열 변형에 취약하다.
Cas9 뉴클레아제에는 RuvC와 HNH라는 2종의 기능적 도메인이 있으며, 각각은 서로 다른 DNA 가닥을 절단한다. 이 두 도메인이 모두 활성화되면 Cas9는 게놈 DNA에서 이중 가닥 절단을 유발한다.
CRISPR/Cas의 중요한 장점은 이 시스템의 높은 효율성이 합성 sgRNA 또는 gRNA를 쉽게 생성할 수 있는 능력과 결합된다는 것이다. 이는 상이한 게놈 부위의 변형을 목표로 하고 및/또는 동일한 부위(예를 들어 CISH, CD38 또는 TGFβ 수용체 유전자좌에서)의 상이한 변형을 목표로 하기 위해 쉽게 변형될 수 있는 시스템을 생성한다. 또한 여러 유전자를 동시에 표적화할 수 있는 프로토콜이 확립되었다. 돌연변이를 운반하는 대부분의 세포는 표적 유전자에 이중 대립유전자 돌연변이를 나타낸다.
그러나 sgRNA 또는 gRNA 서열과 게놈 DNA 표적 서열 사이의 염기쌍 상호작용의 명백한 유연성은 Cas9에 의해 절단될 표적 서열과의 불완전한 일치를 허용한다.
단일 비활성 촉매 도메인인 RuvC- 또는 HNH-를 포함하는 Cas9 효소의 변형된 버전을 '닉카아제'라고 한다. 활성 뉴클레아제 도메인이 하나만 있는 Cas9 닉카아제는 표적 DNA의 한 가닥만 절단하여 단일 가닥 절단 또는 '닉'을 생성한다. 단일 가닥 절단 또는 닉은 대부분 PARP(센서) 및 XRCC1/LIG III 복합체(결찰)와 같은 단백질과 관련된 단일 가닥 절단 복구 메커니즘에 의해 복구된다. 그러나 Cas9 니카아제에 의해 도입된 2개의 근위 반대 가닥 닉은 종종 '이중 닉' CRISPR 시스템이라고 불리는 이중 가닥 절단으로 처리된다. 기본적으로 비병렬 DSB인 이중 닉은 유전자 표적에 대한 원하는 효과에 따라 HR 또는 NHEJ에 의해 다른 DSB처럼 복구될 수 있다. 따라서 특이성과 감소된 표적 이탈 효과가 중요한 경우 게놈 DNA의 반대 가닥에 근접해 있는 표적 서열을 갖는 2개의 gRNA를 설계하여 Cas9 닉카아제를 사용하여 이중 닉을 생성하면 gRNA만으로는 게놈 DNA를 변경할 가능성이 없는 닉이 발생하기 때문에 표적 이탈 효과가 감소할 것이다.
2종의 비활성 촉매 도메인(죽은 Cas9 또는 dCas9)을 포함하는 Cas9 효소의 변형 버전은 뉴클레아제 활성이 없지만 여전히 sgRNA 또는 gRNA 특이성을 기반으로 DNA에 결합할 수 있다. dCas9는 비활성 효소를 알려진 조절 도메인에 융합시켜 유전자 발현을 활성화하거나 억제하는 DNA 전사 조절자의 플랫폼으로 활용될 수 있다. 예를 들어, dCas9 단독이 게놈 DNA의 표적 서열에 결합하면 유전자 전사를 간섭할 수 있다.
대안으로, CRISPR 시스템은 DNA 절단 도메인과 같은 다양한 효과기 도메인과 융합될 수 있다. DNA 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. DNA 절단 도메인이 유래될 수 있는 엔도뉴클레아제의 비제한적인 예에는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제, 예를 들어 Fokl 엔도뉴클레아제 및 I-CreI가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, New England Biolabs Catalog 또는 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 참조).
gRNA를 사용하여 DNA 편집을 수행하는 데 사용할 수 있는 추가 Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cpf1(Zetsche et al., 2015, Cell. 163(3):759-71), C2c1, C2c2, C2c3(Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov. 5;60(3):385-97), CasX 및 Cpf1/Cas 12a를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
생물정보학적으로 결정된 고유한 sgRNA 또는 다양한 종의 다양한 유전자에 대한 gRNA 목록뿐만 아니라 표적 서열을 선택 및/또는 설계하는 데 도움이 되는 공개적으로 사용 가능한 여러 도구가 있다. 예컨대, Feng Zhang 연구실의 타겟 파인더, Alex Scier 연구실의 타겟 파인더(ChopChop), Michael Boutros 연구실의 타겟 파인더(E-CRISP), RGEN 도구: Cas-OFFinder, CasFinder: 게놈에서 특정 Cas9 표적을 식별하기 위한 유연한 알고리즘 및 CRISPR 최적 타겟 파인더가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
CRISPR 시스템을 사용하기 위해서, crRNA(gRNA), tracrRNA 및 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9)는 표적 세포에서 발현되거나 존재해야 한다(예를 들어, RNP(ribonucleoprotein complex)로서). 대안으로, sgRNA 및 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 또는 gRNA, tracrRNA 및 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 둘 다 표적 세포에서 별현되거나, 존재해야 한다(RNP로서). 삽입 벡터는 단일 플라스미드의 모든 카세트를 포함할 수 있고, 또는 카세트는 별도의 플라스미드에서 발현된다. CRISPR 플라스미드는 Addgene(Cambridge, MA)의 px330 플라스미드와 같이 상업적으로 이용 가능하다.
특정 구체예에 따르면, DNA 편집제는 DNA 표적화 모듈(예를 들어, sgRNA)을 포함한다.
특정 구체예에 따르면, DNA 편집제는 뉴클레아제(예: 엔도뉴클레아제) 및 DNA 표적화 모듈(예: sgRNA)을 포함한다.
특정 구체예에 따르면, DNA 편집제는 CRISPR/엔도뉴클레아제이다.
특정 구체예에 따르면, DNA 편집제는 CRISPR/Cas, 예를 들어 sgRNA 및 Cas9 또는 gRNA, tracrRNA 및 Cas9이다.
특정 구체예에 따르면, DNA 편집제는 sgRNA와 Cas9의 RNP 복합체이다.
본 발명에 사용될 수 있는 sgRNA의 비제한적인 예는 아래 표 2에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
특정 구체예에 따르면, RNP 복합체는 예를 들어 Nucleofector 또는 BTX-Gemini Twin Wave Electroporator를 사용하여 RNP 전기천공에 의해 NK 세포에 도입된다.
게놈(DNA) 수준에서 목적 유전자의 발현을 하향조절하는 데 사용될 수 있는 추가적인 DNA 편집제 및 시스템에는 트랜스포존 및 TFO가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 이에 대해서는 아래에서 간략하게 설명한다.
트랜스포존(Transposon) - 단일 세포의 게놈 내에서 다른 위치로 이동할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이동성 유전 요소를 지칭한다. 이 과정에서 트랜스포존은 돌연변이를 일으키거나 세포 게놈의 DNA 양을 변화시킬 수 있다. 세포, 예를 들어, 척추동물 내에서도 전치할 수 있는 다수의 트랜스포존 시스템은 Sleeping Beauty[Izsv_k and Ivics Molecular Therapy (2004) 9, 147-156], piggyBac[Wilson et al. Molecular Therapy (2007) 15, 139-145], Tol2[Kawakami et al. PNAS (2000) 97 (21): 11403-11408] 또는 Frog Prince[Miskey et al. Nucleic Acids Res. Dec 1, (2003) 31(23): 6873-6881]와 같이 분리 또는 설계되었다. 일반적으로 DNA 트랜스포존은 간단한 잘라서 붙여넣기 방식으로 한 DNA 부위에서 다른 DNA 부위로 이동한다.
트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(TFO) - 서열 특이적인 방식으로 이중 가닥 나선형 DNA의 폴리퓨린/폴리피리미딘 영역을 인식하고 결합할 수 있는 TFO를 설계할 수 있다. 이러한 인식 규칙은 Maher III, L. J., et al., Science, 1989;245:725-730; Moser, H. E., et al., Science, 1987;238:645-630; Beal, P. A., et al, Science, 1992;251:1360-1363; Cooney, M., et al., Science, 1988;241:456-459; 및 Hogan, M. E., et al., EP Publication 375408에 의해 설명된다. 인터칼레이터 및 백본 대체 도입, 결합 조건 최적화(pH 및 양이온 농도)와 같은 올리고뉴클레오티드의 변형은 전하 반발 및 불안정성과 같은 TFO 활동에 대한 고유한 장애물을 극복하는 데 도움이 되었으며, 합성 올리고뉴클레오티드가 특정 서열을 표적으로 삼을 수 있다는 것이 밝혀졌다(Seidman and Glazer, J Clin Invest (2003) 112:487-94 참조).
일반적으로 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열 일치성을 갖는다:
올리고(oligo) 3'--A G T
듀플렉스(duplex) 5'―A G C T
듀플렉스(duplex) 3'--T C G A
TFO로 세포를 형질감염(예를 들어, 양이온성 리포좀을 통해)하고 표적 DNA로 삼중 나선 구조를 형성하면 입체적 및 기능적 변화가 유도되어 전사 개시 및 신장이 차단되고 내인성 DNA에 원하는 서열 변화가 도입될 수 있으며 결과적으로 유전자 발현의 특정 하향조절을 초래한다.
또한, 위에서 언급한 원리에 따라 설계된 TFO는 DNA 복구에 영향을 미칠 수 있는 직접 돌연변이 유발을 유도할 수 있으므로 내인성 유전자 발현의 하향조절 및 상향조절을 모두 제공한다(Seidman and Glazer, J Clin Invest (2003) 112:487-94). 효과적인 TFO의 설계, 합성 및 투여에 대한 상세한 설명은 Froehler 등의 미국 특허 출원 번호 2003 017068 및 2003 0096980, Emanuele 등의 미국 특허 출원 번호 2002 0128218 및 2002 0123476, 및 Lawn의 미국 특허 번호 5,721,138에서 찾을 수 있다.
DNA 편집제는 무작위 돌연변이를 유발하는 돌연변이원일 수 있고 목적 유전자의 발현 수준 및/또는 활성의 하향조절을 나타내는 세포가 선택될 수 있음이 이해될 것이다.
돌연변이원은 유전적, 화학적 또는 방사선 제제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 돌연변이원은 자외선, 감마선 또는 알파 입자와 같으나 이에 제한되지 않는 이온화 방사선일 수 있다. 기타 돌연변이원은 복사 오류를 일으킬 수 있는 염기 유사체; 아질산과 같은 탈아민제; 에티듐 브로마이드와 같은 인터킬레이팅제; 브로모우라실과 같은 알킬화제; 트랜스포존; 천연 및 합성 알칼로이드; 브롬 및 이의 유도체; 아지드화나트륨; 소랄렌(예: 자외선과 결합)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 돌연변이원은 ICR191, 1,2,7,8-디에폭시-옥탄(1,2,7,8-diepoxy-octane)(DEO), 5-azaC, N-메틸-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N-nitrosoguanidine)(MNNG), 에틸 메탄 술포네이트(ethyl methane sulfonate)(EMS) 또는 N-에틸-N-니트로소우레아(N-ethyl-N-nitrosourea)(ENU)와 같은 화학적 돌연변이원을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
언급한 바와 같이, NK 세포에서 목적 유전자의 발현을 하향조절하는 데 사용될 수 있는 추가 제제는 RNA 침묵 제제를 포함한다. 예시적인 RNA 침묵 제제는 siRNA, miRNA 및 shRNA와 같은 dsRNA; 안티센스 RNA(즉, 단일 가닥 RNA); DNAzymes, RNAzymes 및 MNAzymes를 포함한다.
목적 유전자의 발현을 하향조절하기 위해 사용된 방법에 관계없이, 하향조절은 일반적으로 세포 배양물 중 NK 세포 집단의 엑스 비보에서 달성된다(아래에서 추가로 논의됨).
일 구체예에 따르면, 하향조절은 세포 배양 개시로부터 1-7일, 1-6일, 1-5일, 1-4일, 1-3일, 1-2일에 달성된다.
일 구체예에 따르면, 하향조절은 세포 배양 개시로부터 12-24시간, 12-36시간, 12-48시간, 24-36시간, 24-48시간, 24-60시간, 24-72시간, 36-48시간, 36-60시간, 36-72시간, 48-60시간, 48-72시간, 48-84시간, 60-72시간, 60-84시간, 60-96시간, 72-84시간, 72-96시간 또는 72-120시간 동안 달성된다.
특정 구체예에 따르면, 하향조절은 세포 배양 개시로부터 24-48시간에 달성된다.
특정 구체예에 따르면, 하향조절은 세포 배양 개시로부터 24-72시간에 달성된다.
일 구체예에 따르면, 방법은 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단을 얻기 위해 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 NK 세포 집단을 확장시키는 단계를 포함한다.
NK 세포 집단과 관련하여 용어 "확장된"은 세포의 생존력이나 기능성에 부정적인 영향을 주지 않고 엑스 비보 또는 인 비트로 내 확장(증식)을 통해 NK 세포의 증가된 수를 지칭한다.
일 구체예에 따르면, 본 발명의 일부 구체예의 NK 세포의 확장 배수는 2 내지 12, 예를 들어 3 내지 11, 예컨대, 4 내지 10(즉, 배양 0일 내지 14-16일)이다.
NK 세포의 확장은 일반적으로 엑스 비보 세포 배양에서 달성된다.
이전 연구에서는 사이토카인과 함께 배양되었지만 0.1 mM 미만의 니코틴아미드 및/또는 다른 니코틴아미드 모이어티를 사용하여 배양된 세포와 비교한 결과, 성장 인자 및 니코틴아미드 및/또는 기타 니코틴아미드 모이어티와 함께 최소 7일 또는 최대 3주 동안 배양된 NK 세포는 향상된, 우선적인 증식 및/또는 기능을 나타냄이 입증되었다(PCT 공개 WO2011/080740 참조). 면역요법에 임상적으로 적합한 NK 세포를 제조함에 있어서, 긴 배양 기간을 요구하지 않고, 확장된 NK 세포의 치료적으로 유리한 기능성을 유지하면서 상당한 엑스 비보 NK 세포 확장을 제공하는 것이 바람직하다.
일 구체예에 따르면, NK 세포의 확장은 7-30일, 7-25일, 7-21일, 7-14일, 10-24일, 10-21일, 10-18일, 10-15일, 10-12일, 12-21일, 12-18일, 12-15일, 14-21일, 14-18일, 14-16일, 14-15일, 16-21일, 16-18일 또는 18-21일의 기간 동안 달성된다.
특정 구체예에 따르면, NK 세포의 확장은 12-18일의 기간 동안 달성 된다.
특정 구체예에 따르면, NK 세포의 확장은 14-16일의 기간 동안 달성 된다.
본 발명의 이 양태에 따라 NK 세포의 엑스 비보 배양은 엑스 비보에서 NK 세포에 세포 증식을 위한 조건을 제공하고 엑스 비보에서 NK 세포를 니코틴아미드 모이어티와 함께 배양함으로써, 엑스 비보에서 NK 세포 집단을 확장하여 달성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "배양"에는 NK 세포 유지에 필요한 화학적 및 물리적 조건(예를 들어, 온도, 가스)은 물론 영양소 및 성장 인자를 제공하는 것이 포함된다. 일 구체예에서, NK 세포를 배양하는 것은 NK 세포에 NK 세포 증식을 위한 조건을 제공하는 것을 포함한다. NK 세포 증식을 지원할 수 있는 화학적 조건의 예에는 완충액, 영양소, 혈청, 비타민 및 항생제뿐만 아니라 성장(즉, 배양) 배지에 일반적으로 제공되는 사이토카인 및 기타 성장 인자가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 세포 증식을 위한 조건은 영양소, 혈청 및 사이토카인(들)을 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 성장 인자는 예를 들어 IL-15, IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, SCF 및 FLT3을 포함한다.
일 구체예에 따르면, 세포 증식을 허용하는 조건은 NK 세포가 1일, 1.25일, 1.5일, 1.75일 또는 2.0일마다 두 배로 증가하도록 한다.
일 구체예에서, NK 배양 배지는 MEMα(BI, Bet HaEmek, Israel)과 같은 최소 필수 배지(MEM) 및 혈청을 포함한다. 일부 구체예에서, 혈청은 배양 배지의 2-20%, 5-15% 또는 5-10%로 제공된다. 특정 구체예에서, 혈청은 배양 배지의 10%로 제공되는 인간 혈청이다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 MEMα(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 배지는 Glascow 배지(Gibco Carlsbad CA), RPMI 배지(Sigma-Aldrich, St Louis MO) 또는 DMEM(Sigma-Aldrich, St Louis MO)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 많은 배양 배지는 비타민 보충제로서 니코틴아미드, 예를 들어 MEMα(8.19 mM 니코틴아미드), RPMI(8.19 pM 니코틴아미드), DMEM(32.78 pM 니코틴아미드) 및 Glascow 배지(16.39 pM 니코틴아미드)를 포함하지만, 본 발명의 방법은 배지의 공식에 포함된 임의의 니코틴아미드 및/또는 니코틴아미드 모이어티를 보충하는 외인성 첨가 니코틴아미드, 또는 배지 성분 농도의 전반적인 조정으로부터 발생하는 것에 관한 것임을 유의할 것이다.
일 구체예에 따르면, 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 NK 세포를 배양하는 것은 세포에 영양소, 혈청 및 사이토카인을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 성장 인자는 사이토카인 및/또는 케모카인(예를 들어, IL-15, IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, SCF 및 FLT3)을 포함한다. 사이토카인 및 기타 성장 인자는 일반적으로 0.5-100 ng/ml 또는 1.0-80 ng/ml, 보다 일반적으로 5-750 ng/ml, 더욱 일반적으로 5.0-50 ng/ml(최대 10배의 농도가 고려될 수 있음) 범위의 농도로 제공되며, 예를 들어 Perpo Tech, Inc.(Rocky Hill, NJ, USA)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 일 구체예에서, 세포 증식을 가능하게 하는 조건은 사이토카인 인터루킨 15(IL-15)를 제공하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, NK 세포 집단은 20 ng/ml의 IL-15와 함께 배양된다.
또한, 이러한 양태에서 신규 사이토카인이 지속적으로 발견되고 있으며, 그 중 일부가 본 발명의 NK 세포 증식 방법에 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
배양 배지는 전형적으로 또한 겐타마이신, 페니실린 또는 스트렙토마이신과 같은 항생제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
세포가 인간 대상체에게 도입(또는 재도입)되는 적용의 경우, 림프구 배양용 AIM v® 무혈청 배지 또는 MARROWMAX® 골수 배지와 같은 무혈청 제제를 사용하는 것이 종종 바람직하다. 이러한 배지 제형 및 보충제는 Invitrogen(GIBCO)(Carlsbad, CA, USA)과 같은 상업적 공급원으로부터 입수 가능하다. 최적의 생존력, 증식, 기능성 및/또는 생존을 촉진하기 위해 배양물에 아미노산, 항생제 및/또는 사이토카인이 보충될 수 있다.
일 구체예에 따르면, NK 세포 집단은 영양소, 혈청, 사이토카인(예를 들어 IL-15) 및 니코틴아미드 및/또는 니코틴아미드 모이어티와 함께 배양된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "니코틴아미드 모이어티"는 니코틴아미드뿐만 아니라 니코틴아미드, 이의 유도체, 유사체 및 대사산물, 예를 들어 NAD, NADH 및 NADPH로부터 유도된 산물을 지칭하며, 이는 NK 세포 증식 및/또는 활성화를 효과적이고 우선적으로 향상시킬 수 있다. 니코틴아미드 유도체, 유사체 및 대사산물은 아래에 기술된 바와 같이 유지된 NK 배양물에 추가하거나, 사멸 및 운동성 분석과 같은 기능적 분석에 추가하거나, 또는 당업계에 잘 알려져 있고 아래에서 추가로 논의되는 고처리량 분석을 위해 설계된 자동화된 스크리닝 프로토콜로 배양 내 엑스 비보 NK 증식에 미치는 효과를 스크리닝하고 평가할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 문구 "니코틴아미드 유사체"는 상기 언급된 또는 유사한 분석에서 니코틴아미드와 유사하게 작용하는 것으로 알려진 모든 분자를 지칭한다. 니코틴아미드 유사체의 대표적인 예는 벤즈아미드, 니코틴티오아미드(니코틴아미드의 티올 유사체), 니코틴산 및 α-아미노-3-인돌프로피온산을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
문구 "니코틴아미드 유도체"는 니코틴아미드 자체 또는 니코틴아미드 유사체의 임의의 구조적 유도체를 추가로 지칭한다. 이러한 유도체의 예에는 치환된 벤즈아미드, 치환된 니코틴아미드 및 니코틴티오아미드 및 N-치환된 니코틴아미드 및 니코틴티오아미드, 3-아세틸피리딘 및 나트륨 니코티네이트가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 한 특정 구체예에서 니코틴아미드 모이어티는 니코틴아미드이다.
본 발명의 일부 구체예에 사용하기에 적합한 니코틴아미드 또는 니코틴아미드 모이어티의 농도는 전형적으로 약 0.5 mM 내지 약 50 mM, 약 1.0 mM 내지 약 25 mM, 약 1.0 mM 내지 약 15 mM, 약 1.0 mM 내지 약 10 mM, 약 2.5 mM 내지 약 20 mM, 약 2.5 mM 내지 약 10 mM, 약 5.0 mM mM 내지 약 10 mM의 범위이다. 니코틴아미드의 예시적인 유효 농도는 증식 및 NK 세포 기능에 대한 니코틴아미드 농도의 효과를 기반으로 약 0.5 mM 내지 약 15 mM, 1.0 mM 내지 약 10.0 mM, 전형적으로 2.5, 5.0 또는 7.0 mM일 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에 따르면, 니코틴아미드는 약 0.5, 약 0.75, 약 1.0, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2.0, 약 2.25, 약 2.5, 약 2.75, 약 3.0, 약 3.25, 약 3.5, 약 3.75, 약 4.0, 약 4.25, 약 4.5 , 약 4.75, 약 5.0, 약 5.25, 약 5.5, 약 5.75, 약 6.0, 약 6.25, 약 6.5, 약 6.75, 약 7.0, 약 7.25, 약 7.5, 약 7.75, 약 8.0, 약 8.25, 약 8.5, 약 8.75, 약 9.0, 약 9.25, 약 9.5, 약 9.75, 약 10.0, 약 11.0, 약 12.0, 약 13.0, 약 14.0, 약 15.0, 약 16.0, 약 17.0, 약 18.0 또는 약 20.0 mM의 농도(mM)로 제공된다. 모든 효과적인 중간 농도가 고려된다. 특정 구체예에서, 증식을 허용하는 조건은 1.0 내지 10.0 mM 니코틴아미드를 포함한다. 특정 구체예에서, 증식을 허용하는 조건은 5.0 mM 니코틴아미드를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 증식을 허용하는 조건은 7.0 mM 니코틴아미드를 포함한다.
니코틴아미드 및/또는 니코틴아미드 모이어티의 적합한 농도는 NK 증식 및/또는 활성, 예를 들어 세포 배양 또는 기능의 임의의 분석에 따라 결정될 수 있다. 동일한 분석 및 유사한 배양 조건(니코틴아미드에 대한 노출 기간, 니코틴아미드에 대한 노출 시간)에서 0.1 mM 미만의 니코틴아미드를 함유하고 동일한 NK 세포 공급원(예: 제대혈, 골수 또는 말초 혈액 제제)에서 시험된 "대조군" 배양물과 비교하여, 니코틴아미드의 적합한 농도는 배양에서 이의 사용이 "향상"되거나 배양 중 NK 세포의 증식 및/또는 기능의 순 증가를 초래하는 농도이다.
일부 연구에서는, 영양소, 혈청, 사이토카인 및 니코틴아미드와 함께 배양하여 정제된 NK 세포의 엑스 비보 확장은 배양 기간 동안 배지를 보충하거나 조작할 필요가 없는 반면, 다른 연구에서는 NK 세포 배양 중 서로 다른 간격으로 배양 배지 보충("재공급")을 지지하였다. 본 발명의 특정 구체예에서, NK 세포 집단은 배양 기간 동안 "재공급"된다. 따라서, 특정 구체예에서, NK 세포를 증식시키는 것은 엑스 비보 배양 개시 후 8-10일에 NK 세포 집단에 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 보충하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 보충은 엑스 비보 배양 개시 후 4-12일, 엑스 비보 배양 개시 후 5-10일, 또는 NK 세포 배양 개시 후 6-9일에 제공된다.
일부 구체예에서, 배양물에서 NK 세포를 보충(또는 "재공급")하는 것은 NK 세포 배양물로부터 배지를 제거하는 것을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 보충(또는 "재공급")은 NK 세포 배양 배지의 약 30-80%, 약 40-70% 또는 약 45-55%를 제거하는 것과, 제거된 배지와 동일한 구성 및 영양소, 혈청, 사이토카인(예: IL-15) 및 니코틴아미드의 수준을 갖는 유사한(예: 등가) 부피의 신선한 배지로 대체하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 재공급 후 배양 부피는 NK 세포 배양("씨딩") 개시 시 원래 배양 부피의 약 2배에 도달한다.
NK 세포 집단은 다양한 방법과 장치를 사용하여 배양될 수 있다. 배양 장비의 선택은 일반적으로 배양 규모와 목적에 따라 결정된다. 세포 배양의 규모 확대에는 전용 장치를 사용하는 것이 바람직하다. 대규모 임상 등급 NK 세포 생산을 위한 장치는 예를 들어 Spanholtz et al. (PLoS ONE (2010) 5:e9221) 및 Sutlu et al. (Cytotherapy (2010), Early Online 1-12)에 자세히 설명되어 있다. 일부 구체예에서, NK 세포의 배양은 플라스크 내에서 플라스크당 100-4000 X 106 세포의 세포 밀도로 수행된다. 특정 구체예에서, NK 세포의 배양(예를 들어 엑스 비보 배양의 개시 및/또는 "재공급")은 플라스크 내에서 플라스크당 200-300 X 106 세포의 세포 밀도로 수행된다. 특정 구체예에서, 플라스크는 G-Rex 배양 장치(G-Rex 100M 또는 폐쇄 시스템 G-Rex MCS, WolfWilson, St Paul MN)와 같은 기체 투과성 막을 포함하는 플라스크이다.
G-Rex 배양 장치와 같은 배양 플라스크에 NK 세포 집단을 씨딩하는 것은 배양 장치의 크기와 부피에 따라 다양한 밀도에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 그러한 결정을 내릴 수 있다. 일 구체예에 따르면, NK 세포 집단은 0.01 x l06 cells/ml 내지 10 x l06 cells/ml, 0.01 x l06 cells/ml 내지 7.5 x l06 cells/ml, 0.01 x l06 cells/ml 내지 5 x l06 cells/ml, 0.1 x l06 cells/ml 내지 10 x l06 cells/ml, 0.1 x l06 cells/ml 내지 7.5 x l06 cells/ml, 0.1 x l06 cells/ml 내지 5 x l06 cells/ml, 0.1 x l06 cells/ml 내지 2.5 x l06 cells/ml, 0.1 x l06 cells/ml 내지 1 x l06 cells/ml, 0.25 x l06 cells/ml 내지 10 x l06 cells/ml, 0.25 x l06 cells/ml 내지 7.5 x l06 cells/ml, 0.25 x l06 cells/ml 내지 5 x l06 cells/ml, 0.25 x l06 cells/ml 내지 2.5 x l06 cells/ml, 또는 0.25 x l06 cells/ml 내지 1 x l06 cells/ml의 밀도로 씨딩된다. 특정 구체예에 따르면, NK 세포 집단은 0.25 x l06 cells/ml 내지 0.5 x l06 cells/ml, 예를 들어, 0.35 x l06 cells/ml 내지 0.4 x l06 cells/ml의 밀도로 씨딩된다.
배양 플라스크 내 세포의 밀도는 배양 기간에 걸쳐 세포의 증식에 따라 증가한다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 일부 구체예에서, 배양의 확장 과정에 걸쳐, NK 세포 집단의 NK 세포는 플라스크당 10-4000 X 106 세포, 플라스크당 25-4000 X 106 세포, 플라스크당 50-4000 X 106 세포, 플라스크당 100-4000 X 106 세포, 플라스크당 20-3000 X 106 세포, 100-3000 X 106 플라스크당 세포, 플라스크당 200-3000 X 106 세포, 플라스크당 30-2000 X 106 세포, 플라스크당 100~2000 X 106 세포, 플라스크당 300~2000 X 106 세포, 플라스크당 40~1000 X 106 세포, 플라스크당 100~1000 X 106 세포, 플라스크당 400~1000 X 106 세포, 100~800 X 106 플라스크당 세포, 플라스크당 250-800 X 106 세포, 플라스크당 100-600 X 106 세포 또는 플라스크당 150-500 X 106 세포의 세포 밀도로 배양된다. 특정 구체예에서, 플라스크에서의 배양 기간에 걸쳐, NK 세포 집단의 NK 세포는 플라스크당 100-3000 X 106 세포의 세포 밀도로 배양된다.
NK 세포의 배양은 피더(feeder) 세포 또는 피더 세포층의 유무에 관계없이 수행될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 피더 세포는 T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다. 특정 구체예에 따르면, 피더 세포는 방사선 조사된 세포(즉, 비증식 세포), 예를 들어 방사선 조사된 T 세포 또는 방사선 조사된 말초 혈액 단핵 세포를 포함한다. 방사선 조사는 예를 들어 20-50 Gy(예: 20 Gy, 30 Gy, 40 Gy, 50 Gy), 130 KV, 5 mA에서 달성될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 피더 세포가 사용될 때, 배양물에서 NK 세포 대 피더 세포의 비율은 1:1, 1:2, 1:3, 2:1 또는 3:1일 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 배양물 중 NK 세포 대 피더 세포의 비율은 1:1이다.
특정 구체예에 따르면, T 세포 또는 PBMC(예를 들어, 방사선 조사된 T 세포 또는 방사선 조사된 PBMC)가 피더 세포로 사용되는 경우, 배양물에는 CD3 작용제가 추가로 보충되어 피더 세포층의 T 세포를 자극하여 NK 세포 확장에 유익한 성장 인자를 분비한다. 본 발명의 일부 구체예의 방법과 함께 사용하기에 적합한 CD3 작용제는 OKT-3, mAb 145-2C11, MGA031 및 ChAglyCD3과 같은 항-CD3 단클론 - CD3 작용제 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에 따르면, 방법은 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단에서 적어도 하나의 막 결합 단백질의 발현을 상향조절하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 문구 "발현을 상향조절하는"은 NK 세포에서 막 결합 단백질의 발현을 증가시키는 것을 지칭한다. 막 결합 단백질은 NK 세포에 의해 자연적으로 발현되는 단백질일 수도 있고, NK 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 단백질(즉, 외인성 단백질)일 수도 있다.
동일한 배양 조건에서 발현은 일반적으로 동일한 종의 세포에서의 발현과 비교하여 발현되지만 막 결합 단백질의 mRNA 및/또는 단백질의 수준을 증가하도록 변형되지 않거나, "대조군"으로도 지칭되는 비히클 대조군과 접촉된다.
일 구체예에 따르면, 막 결합 단백질의 발현을 상향조절하는 것은 각각 RT-PCR 또는 웨스턴 블롯에 의해 검출되는 바와 같이 mRNA 및/또는 단백질의 수준을 증가시키는 것을 의미한다. 증가는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 이상일 수 있다.
막 결합 단백질 발현의 상향조절은 게놈 수준(즉, 프로모터, 인핸서, 조절 요소를 통한 전사 활성화), 전사체 수준(즉, 정확한 스플라이싱, 폴리아데닐화, 번역 활성화) 또는 단백질 수준(즉, 번역 후 수식, 기질과의 상호작용 등)에서 달성될 수 있다. 특정 구체예에 따르면, NK 세포에서 막 결합 단백질 발현의 상향조절은 막 결합 단백질을 인코딩하는 외인성 핵산(예를 들어 mRNA)을 NK 세포에 도입함으로써 달성된다. 따라서, 본 발명의 일부 구체예의 NK 세포는 막 결합 단백질을 발현하도록 변형된다.
발현의 상향조절은 일시적일 수도 있고 영구적일 수도 있다. 특정 구체예에 따르면, 막 결합 단백질의 발현은 일시적이다(즉, 세포는 막 결합 단백질의 발현을 위해 그들의 게놈에서 유전적으로 변형되지 않는다)(Pato et al, Clin. Exp. Immunol. 2015 Nov; 182(2)220-9, 그 내용 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다).
본 명세서에서 사용된 용어 "막 결합 단백질"은 NK 세포막에 존재하는 재조합 분자를 지칭한다. 막 결합 단백질은 리간드(예: 항원)에 결합하고 NK 세포의 활성화(예: 항질병 세포독성 활성 또는 염증성 사이토카인 생성)를 매개하는 수용체일 수 있다. 대안으로, 막 결합 단백질은 NK 세포의 생존, 증식 및/또는 분화와 연관된 단백질일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 가용성 또는 비용해성(예: 막 관련) 분자로 정의된다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드는 물론 탄수화물, 지질 및 DNA를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로 작용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 항원은 아래에 더 자세히 설명되어 있듯이, 악성 질병, 즉 종양 항원(예를 들어, 종양 특이적인 항원 또는 종양 관련 항원), 바이러스 단백질 항원, 세균 단백질 항원, 또는 진균(fungal) 단백질 항원과 관련된다.
일 구체예에 따르면, 막 결합 단백질은 IL-15, IL-15R, 수용체 링커 IL-15(RLI) 또는 TLR을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "IL-15"는 유전자 기호 "IL15"를 갖는 인터루킨 15 유전자의 유전자 산물, 또는 예를 들어 GeneBank 등록 번호 NP_000576.1 및 NP_751915.1(단백질) 및 NM_000585.5 및 NM_172175.3(mRNA), 또는 이들의 상동체를 지칭한다.
특정 구체예에 따르면, IL-15는 나선 C의 말단에 위치하는 위치 72의 아스파라긴 잔기의 아스파르트산으로의 아미노산 치환(즉, N72D 치환)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "IL-15 수용체"는 유전자 기호 "IL15RA"를 갖는 인터루킨 15 수용체 서브유닛 알파 유전자의 유전자 산물, 또는 예를 들어, GeneBank 등록 번호. NP_001230468.1, NP_001243694.1, NP_002180.1 및 NP_751950.2(단백질) 및 NM_001243539.2, NM_001256765.1, NM_002189.4 및 NM_172200.3(mRNA), 또는 이들의 상동체를 지칭한다.
용어 "수용체 링커 IL-15(RLI)"는 유연한 링커 IL-15에 의해 IL-15에 결합된 IL-15Rα의 결합 도메인(즉, 소위 스시 도메인)을 포함하는 재조합 단백질을 지칭한다. 본 발명의 일부 구체예에 따라 사용될 수 있는 예시적인 RLI는 SEQ ID NO: 25(301.A로 지칭됨) 및 SEQ ID NO: 28(301.B로 지칭됨)에 제공된다.
본 명세서에 사용된 용어 "TLR"은 유전자 기호 "TLR4"를 갖는 톨 유사 수용체 4 유전자(toll like receptor 4 gene)의 유전자 산물, 또는 예를 들어 GeneBank Accession nos. NP_003257.1, NP_612564.1 및 NP_612567.1(단백질) 및 NM_003266.4, NM_138554.5 및 NM_138557.3(mRNA), 또는 이들의 상동체를 지칭한다. "TLR"이라는 용어는 또한 유전자 기호 "TLR1"을 갖는 톨 유사 수용체 1 유전자(toll like receptor 1 gene), 유전자 기호 "TLR2"를 갖는 톨 유사 수용체 2 유전자, 유전자 기호 "TLR3"을 갖는 톨 유사 수용체 3 유전자, 유전자 기호 "TLR5"를 갖는 톨 유사 수용체 5 유전자, 유전자 기호 "TLR6"을 갖는 톨 유사 수용체 6 유전자, 유전자 기호 "TLR7"을 갖는 톨 유사 수용체 7 유전자, 유전자 기호 "TLR8"을 갖는 톨 유사 수용체 8 유전자, 유전자 기호 "TLR9"를 갖는 톨 유사 수용체 9 유전자, 또는 유전자 기호 "TLR10"을 갖는 톨 유사 수용체 10 유전자의 유전자 산물을 지칭한다.
일 구체예에 따르면, 막 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 T 세포 수용체(tg-TCR)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "트랜스제닉 T 세포 수용체" 또는 "tg-TCR"은 T 세포 수용체(TCR)의 특이성, 즉 주조직적합성 복합체(MHC) 단백질에 의해 제시된 항원성 펩타이드(즉, 항원)의 인식을 포함하는 재조합 분자를 지칭한다. 일반적으로 TCR은 항원, 즉 세포에 의해 처리되어 MHC 복합체에 로드되고 펩타이드-MHC 복합체로서 세포막으로 이동되는 외래(예: 바이러스) 또는 세포(예: 종양) 기원의 펩타이드를 인식한다.
본 발명의 tg-TCR은 전형적으로 2개의 사슬(즉, 폴리펩타이드 사슬), 예컨대, T 세포 수용체(TCR)의 알파 사슬, TCR의 베타 사슬, TCR의 감마 사슬, TCR의 델타 사슬, 또는 이들의 조합(예를 들어 αβ 사슬 또는 γδ 사슬)을 포함한다. tg-TCR의 폴리펩타이드는 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 단, tg-TCR은 상기 기재된 바와 같은 항원 특이성 및 T 세포 효과기 기능을 갖는다. 항원 특이성은 TCR 이종이량체(즉, αβ 또는 γδ 사슬)에 의해 결정된다는 것이 이해될 것이다.
2개의 사슬 각각은 전형적으로 2개의 세포외 도메인, 즉 가변(V) 영역 및 불변(C) 영역으로 구성된다는 것이 이해될 것이다.
일 구체예에 따르면, tg-TCR은 TCR의 가변 영역을 포함한다. 특정 구체예에 따르면, tg-TCR은 TCR의 α- 및 β-사슬의 가변 영역을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에 따르면, tg-TCR은 TCR의 γ- 및 δ-사슬의 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, tg-TCR의 가변 영역은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. CDR은 CDR1, CDR2, CDR3 및/또는 CDR4 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예에 따르면, CDR은 단일 사슬에 존재하고, 바람직하게는 CDR은 tg-TCR의 두 사슬 모두에 존재한다.
일 구체예에 따르면, tg-TCR은 TCR의 불변 영역을 포함한다. 특정 구체예에 따르면, tg-TCR은 TCR의 α- 및 β-사슬의 불변 영역을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에 따르면, tg-TCR은 TCR의 C-사슬, γ-사슬 및 δ-사슬의 불변 영역을 포함한다.
tg-TCR의 선택은 표적 세포의 MHC-펩타이드 복합체를 정의하는 항원의 유형과 수에 따라 달라진다. 예를 들어, tg-TCR은 특정 질병 상태와 연관된 표적 세포 상의 MHC-펩타이드 복합체를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어 tg-TCR에 의한 인식을 위한 항원으로 작용할 수 있는 마커에는 바이러스, 세균 및 기생충 감염 및 암세포와 관련된 마커가 포함될 수 있다. 아래에 예가 나와 있다.
성공적인 tg-TCR을 생성하려면 먼저 적절한 표적 서열을 식별해야 한다. 따라서 TCR은 항원 반응성 T 세포(예: 종양 반응성 T 세포)로부터 분리될 수 있으며, 이것이 가능하지 않은 경우 대체 기술을 사용할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 트랜스제닉 동물(예: 토끼 또는 마우스, 바람직하게는 인간-HLA 트랜스제닉 마우스)을 인간 항원 펩타이드(예: 종양 또는 바이러스 항원)로 면역화하여 인간 항원에 대한 TCR을 발현하는 T 세포를 생성한다[예를 들어 Stanislawski et al., Nat Immunol. (2001) 2(10):962-70에 설명된 대로]. 또 다른 예시적 구체예에 따르면, 항원 특이적인 T 세포(예: 종양 특이적인 T 세포)는 질병(예: 종양) 관해를 겪고 있는 환자로부터 분리되고, 반응성 TCR 서열은 그로부터 분리된다[예를 들어 de Witte et al., Blood (2006) 108(3):870에 설명된 대로].
또 다른 예시적 구체예에 따르면, 표적 항원에 대한 약한 반응성 항원-특이적인 TCR의 결합력을 향상시키기 위해 기존 TCR의 서열을 변경하기 위해 인 비트로 기술이 사용된다(이러한 방법은 아래에 설명됨).
일 구체예에 따르면, tg-TCR의 신호전달 모듈은 단일 서브유닛 또는 복수의 신호전달 유닛을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 tg-TCR은 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 TCR과 협력하여 작용하는 보조 수용체뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 그의 임의의 유도체 또는 변이체를 사용할 수 있다.
일 구체예에 따르면, TCR 신호전달 모듈은 CD3 복합체(예를 들어, CD3 사슬, 예를 들어 CD3δ/ε, CD3γ/ε 및/또는 제타 사슬, 예를 들어 ζ/ζ 또는 ζ/η)를 포함한다.
추가로 또는 대안으로, TCR 신호전달 모듈은 T 세포에 추가 신호를 제공하기 위한 보조자극 도메인을 포함할 수 있다. 이것들은 본 명세서에서 아래 CAR 분자에 대해 자세히 논의된다.
일 구체예에 따르면, tg-TCR은 본 명세서에서 하기 CAR 분자에 대해 상세히 기재된 바와 같은 막관통 도메인을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 문구 "키메라 항원 수용체(CAR)"은 특정 항원에 대한 세포성 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하기 위해 원하는 항원에 대한 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인(즉, T 세포 수용체 신호전달 모듈)과 조합한 재조합 분자를 지칭한다. 전형적으로 CAR은 주조직적합성 복합체(MFIC)와 독립적으로 (내부 항원이 아닌) 세포 표면에 발현된 항원(예: 단백질 또는 비단백질)을 인식한다.
따라서, 본 발명의 CAR은 일반적으로 항원 결합 모이어티, 막관통 도메인 및 항원에 대한 T 세포의 효율적인 반응에 필요한 세포내 도메인(즉, 엔도-도메인이라고도 불리는 세포질 도메인)을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
항원 결합 모이어티
일 구체예에서, 본 발명의 CAR은 이외에 항원 결합 모이어티로도 지칭되는 표적-특이적인 결합 요소를 포함한다. 모이어티의 선택은 표적 세포의 표면을 정의하는 리간드(즉, 항원)의 유형과 수에 따라 달라진다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 표적 세포에서 세포 표면 마커로 작용하는 리간드(즉, 항원)를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서 본 발명의 CAR에서 항원 모이어티 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예에는 바이러스, 세균 및 기생충 감염 및 암세포와 관련된 것들이 포함된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 항원 결합 모이어티는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 이러한 CDR은 항체로부터 얻을 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 온전한 분자 뿐만 아니라 이의 기능성 단편, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 선형 항체, scFv 항체 및 항원에 결합할 수 있는 항체 단편으로 형성된 다중특이적인 항체를 포함한다. 이들 기능성 항체 단편은 다음과 같이 정의된다:
(1) 항체 분자의 1가 항원 결합 단편을 함유하는 단편인 Fab는 전체 항체를 파파인 효소로 분해하여 온전한 경쇄와 하나의 중쇄의 일부를 생성함으로써 생산될 수 있다.
(2) 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원시켜 온전한 경쇄와 중쇄의 일부를 생성함으로써 얻을 수 있는 항체 분자의 단편인 Fab'; 항체 분자당 2개의 Fab' 단편이 얻어진다;
(3) (Fab')2, 후속 환원 없이 전체 항체를 효소 펩신으로 처리하여 얻을 수 있는 항체 단편; F(ab')2는 2개의 이황화 결합에 의해 함께 결합된 2개의 Fab' 단편의 이량체이다;
(4) 경쇄의 가변 영역과 두 개의 사슬로 표현되는 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전자 조작 단편으로 정의되는 Fv;
(5) 단일쇄 항체("SCA")는 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 함유하고 유전적으로 융합된 단일 사슬 분자로서 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 유전적으로 조작된 분자이다;
(6) CDR 펩타이드는 단일 상보성 결정 영역(CDR)을 코딩하는 펩타이드이다; 및
(7) 단일 도메인 항체(나노바디라고도 함)는 특정 항원에 선택적으로 결합하는 유전적으로 조작된 단일 단량체 가변 항체 도메인이다. 나노바디의 분자량은 12-15 kDa에 불과하며 이는 일반적인 항체(150-160 kDa)보다 훨씬 작다.
본 명세서에 사용된 "항체 중쇄"는 모든 항체 분자에 자연적으로 발생하는 형태로 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 큰 사슬을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "항체 경쇄"는 모든 항체 분자에 자연적으로 발생하는 형태로 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파- 및 람다-경쇄는 두 가지 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "합성 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예를 들어 본 명세서에 설명된 박테리오파지에 의해 발현된 항체를 지칭한다. 이 용어는 또한 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질을 발현하는 항체, 또는 항체를 지정하는 아미노산 서열을 지칭하되, DNA 또는 아미노산 서열은 당업계에 이용 가능하고 잘 알려진 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 얻어지는 것으로 해석되어야 한다.
다클론성 및 단클론성 항체뿐만 아니라 이의 단편을 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 참조).
본 발명에 따른 항체 단편은 항체의 단백질 가수분해에 의해 또는 단편을 인코딩하는 DNA의 대장균(E. coli) 또는 포유동물 세포(예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 세포 배양 또는 기타 단백질 발현 시스템)에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체 단편은 전통적인 방법으로 전체 항체를 펩신 또는 파파인 분해하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 F(ab')2로 표시되는 5S 단편을 제공하기 위해 펩신으로 항체를 효소적으로 절단함으로써 생산될 수 있다. 이 단편은 티올 환원제 및 선택적으로 이황화 결합의 절단으로 인한 설프히드릴기에 대한 차단기를 사용하여 추가로 절단되어 3.5S Fab' 1가 단편을 생성할 수 있다. 대안으로, 펩신을 사용한 효소적 절단은 2개의 1가 Fab' 단편과 Fc 단편을 직접 생산한다. 이들 방법은 예를 들어 Goldenberg, 미국 특허 번호 4,036,945 및 4,331,647에 기술되며, 여기에 포함된 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 또한 Porter, R.R. [Biochem. J. 73: 119-126(1959)] 참조. 단편이 온전한 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한 1가 경중쇄 단편을 형성하기 위한 중쇄 분리, 단편의 추가 절단, 또는 기타 효소적, 화학적 또는 유전적 기술과 같은 항체 절단의 다른 방법도 사용될 수 있다.
Fv 단편은 VH 및 VL 사슬의 결합을 포함한다. 이 결합은 Inbar et al.[Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720]에 설명된 대로 비공유적일 수 있다. 대안으로, 가변 사슬은 분자간 이황화 결합에 의해 연결되거나 글루타르알데히드와 같은 화학물질에 의해 가교결합될 수 있다. 바람직하게는, Fv 단편은 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함한다. 이들 단일쇄 항원 결합 단백질(sFv)은 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 구축함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터에 삽입되고, 이후 대장균과 같은 숙주 세포에 도입된다. 재조합 숙주 세포는 2개의 V 도메인을 연결하는 링커 펩타이드를 사용하여 단일 폴리펩타이드 사슬을 합성한다. sFv를 생산하는 방법은 예를 들어 [Whitlow and Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Birdetal.,Science242:423-426(1988); Pack et al., Bio/Technology11:1271-77 (1993)]; 및 미국 특허 번호 4,946,778에 기술되며, 이는 전체 내용이 참조로 여기에 포함된다.
CDR 펩타이드("최소 인식 단위")는 목적 항체의 CDR을 인코딩하는 유전자를 구축하여 얻을 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 항체 생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성함으로써 제조된다. 예를 들어, Larrick 및 Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)] 참조.
일단 항체의 CDR이 확인되면, 통상적인 유전 공학 기술을 사용하여, 본 명세서에 기술된 항체의 임의의 형태 또는 단편을 인코딩하는 발현 가능한 폴리뉴클레오티드를 합성하고 관련 산물의 스펙트럼을 생산하기 위해 여러 방식 중 하나로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, CDR은 항원에 특이적으로 결합하는 αβ T 세포 수용체(TCR)로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, CDR은 항원에 특이적으로 결합하는 γδ T 세포 수용체(TCR)로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, CDR은 항원에 특이적으로 결합하는 조작된 친화도가 향상된 αβ T 세포 수용체 또는 γδ T 세포 수용체(TCR)로부터 유래된다(위에서 자세히 논의한 바와 같음).
본 발명의 일부 구체예에 따르면, CDR은 개선된 안정성 또는 임의의 다른 생물리학적 특성을 갖는 조작된 αβ T 세포 수용체 또는 γδ T 세포 수용체(TCR)로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, CDR은 항원에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체 유사(TCRL) 항체로부터 유래된다. TCRL 및 이를 생산하는 방법의 예는 WO03/068201, WO2008/120203, WO2012/007950, WO2009125395, WO2009/125394에 설명되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 항원 결합 도메인은 하나 이상의 단일쇄 Fv(scFv) 분자를 포함한다.
세포질 도메인
본 발명의 CAR 분자의 세포질 도메인("세포내 신호전달 도메인" 또는 "T 세포 수용체 신호전달 분자"로도 지칭됨)은 CAR이 배치된 세포의 정상 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다.
일반적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우 전체 사슬을 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 잘린 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 잘린 부분은 효과기 기능 신호를 전달하는 한 온전한 사슬 대신 사용될 수 있다. 따라서 용어 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 CAR 분자에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 바람직한 예는 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 시작하기 위해 협력하여 작용하는 T 세포 수용체(TCR) 및 공동 수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열도 포함한다.
따라서, NK 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2개의 별개의 클래스에 의해 매개될 수 있다: 항원 의존적인 1차 활성화(1차 세포질 신호전달 서열)를 시작하는 것 및 2차 또는 보조자극 신호를 제공하기 위해 항원 독립적인 방식으로 작용하는 것(2차 세포질 신호전달 서열).
자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 본 발명에서 특히 사용되는 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예에는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들이 포함된다. 본 발명의 CAR에서 세포질 신호전달 분자는 CD3 제타로부터 유래된 세포질 신호전달 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
보조자극 신호전달 영역은 전형적으로 보조자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR 분자의 일부를 지칭한다. 보조자극 분자는 항원 수용체 또는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 보조자극 분자에는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 보조자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 보조자극 리간드(ICOS-L), 세포간 부착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보조자극 리간드는 또한 특히 T 세포 상에 존재하는 보조자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에 따르면, CAR의 세포질 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인 자체를 포함하거나 본 발명의 CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포질 도메인은 CD3 제타 사슬 부분 및 보조자극 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 보조자극 신호전달 영역은 보조자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 보조자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예에는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD30, CD40, PD-1, DAP10, 2B4, Lsk, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세포내 도메인은 내인성 TCR로부터의 신호의 주요 전달체인 CD3ζ-사슬["CD3-ZETA" 및 "CD3z"로도 알려진 CD247 분자; GenBank 등록 번호. NP_000725.1 및 NP_932170.1]을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세포내 도메인은 T 세포("2세대" CAR)에 추가 신호를 제공하기 위해 CAR의 세포질 꼬리에 대한 다양한 보조자극 단백질 수용체를 포함한다. 예시로 CD28[예: GenBank 등록 번호 NP_001230006.1, NP_001230007.1, NP_006130.1], 4-1BB[종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9(TNFRSF9), "CD137"로도 알려져 있음, 예를 들어 GenBank 등록 번호 NP_001552.2], ICOS[유도성 T 세포 보조자극제, 예를 들어 GenBank 등록 번호 NP_036224.1], DAP10[조혈 세포 신호 변환기, 예를 들어, GenBank 등록 번호 NP_001007470, NP_055081.1], 2B4[CD244 분자, 예: GenBank 등록 번호 NP_001160135.1, NP_001160136.1, NP_057466.1] 및 Lsk[LCK 원암유전자, Src 계열 티로신 키나제, 예를 들어 GenBank 등록 번호 NP_001036236.1, NP_005347.3]를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전임상 연구에서는 "2세대 CAR 설계가 T 세포의 항종양 활성을 향상시키는 것으로 나타났다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세포내 도메인은 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 이상을 포함한다: CD3ζ(CD247, CD3z), CD27, CD28, 4-1BB/CD137, 2B4, ICOS, OX40/CD134, DAP10, 종양 괴사 인자 수용체(TNFr) 및 Lsk.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세포내 도메인은 효능을 추가로 증가시키기 위해 CD3z-CD28-4-1BB 또는 CD3z-CD28-OX40과 같은 다중 신호전달 도메인을 포함한다. 용어 "OX40"은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 4(TNFRSF4), 예를 들어 GenBank 등록 번호 NP_003318.1("3세대" CAR)을 지칭한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세포내 도메인은 CD28-CD3z, CD3z, CD28-CD137-CD3z를 포함한다. 용어 "CD137"은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 9(TNFRSF9), 예를 들어 GenBank 등록 번호 NP_001552.2를 지칭한다.
특정 구체예에 따르면, 세포내 도메인은 CD3z 및 CD28을 포함한다.
특정 구체예에 따르면, 세포내 도메인은 CD3z 및 4-1BB를 포함한다.
특정 구체예에 따르면, 세포내 도메인은 CD3z 및 2B4를 포함한다.
막관통 도메인
CAR의 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우 도메인은 임의의 막 결합 또는 막관통 단백질에서 유래될 수 있다. 본 발명에서 특히 사용되는 막관통 영역은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 NKG2D로부터 유래될 수 있다(즉, 이들의 적어도 막관통 영역(들)을 포함한다). 대안으로 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우 이는 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다. 바람직하게는 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항이 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다.
특정 구체예에 따르면, 막관통 도메인은 CD8을 포함한다.
특정 구체예에 따르면, 막관통 도메인은 CD28을 포함한다.
특정 구체예에 따르면, 막관통 도메인은 NKG2D를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 본 발명의 일부 구체예의 CAR 분자에 포함된 막관통 도메인은 CAR의 도메인 중 하나와 자연적으로 결합된 막관통 도메인이다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
일부 구체예에 따르면, CAR 분자의 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이, 또는 CAR 분자의 세포질 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 도메인이 혼입될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "스페이서 도메인"은 일반적으로 막관통 도메인을 폴리펩타이드 사슬의 세포외 도메인 또는 세포질 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 스페이서 도메인은 최대 300개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다.
선택적으로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이는 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호전달 도메인 사이의 연결("힌지"로도 지칭됨)을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중항은 특히 적합한 링커를 제공한다.
특정 구체예에 따르면, CD8의 힌지 영역이 CAR 분자의 구축에 사용된다.
특정 구체예에 따르면, CD28의 힌지 영역이 CAR 분자의 구축에 사용된다.
언급된 바와 같이, CAR 또는 tg-TCR은 종양 항원, 바이러스 항원, 세균 항원, 진균(fungal) 항원, 원생동물 항원 및/또는 기생충 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 대해 항원 특이성을 갖는다.
본 명세서에 논의된 항원은 단지 예로서 포함된다. 목록은 배타적인 것이 아니며 추가 예는 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
본 명세서에 사용된 문구 "종양 항원"은 암과 같은 특정 과다증식성 장애에서 공통적인 항원을 지칭한다. 종양 항원은 면역 반응, 특히 T 세포 매개 면역 반응을 유도하는 종양 세포에 의해 생성되는 단백질이다. 본 발명의 항원 결합 모이어티의 선택은 치료할 특정 유형의 암에 따라 달라질 것이다.
일 구체예에 따르면, 종양 항원은 고형 종양과 연관되어 있다.
일 구체예에 따르면, 종양 항원은 혈액암(hematologic malignancy)과 연관되어 있다.
본 발명에서 언급되는 종양 항원의 유형에는 종양 특이적인 항원(TSA) 또는 종양 관련 항원(TAA)이 포함된다. "TSA"는 종양 세포에 고유하고 신체의 다른 세포에서는 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩타이드 항원을 지칭한다. "TAA"는 종양 세포에 의해 발현되는 단백질 또는 폴리펩타이드 항원을 지칭한다. 예를 들어, TAA는 종양 세포의 하나 이상의 표면 단백질 또는 폴리펩타이드, 핵 단백질 또는 당단백질, 또는 이들의 단편일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: MART-1/MelanA(MART-1), gp 100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2과 같은 분화 항원 및 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15와 같은 종양 특이적인 다중 계통 항원; CEA와 같은 과발현된 배아 항원; 과발현된 종양 유전자 및 p53, Ras, HER2/neu와 같은 돌연변이된 종양 억제 유전자; 염색체 전위로 인한 독특한 종양 항원, 예컨대, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA 및 HPV(인유두종 바이러스) 항원 E6 및 E7과 같은 바이러스 항원. 다른 대형 단백질 기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72- 4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.291＼BCAA, CA 195, CA 242 , CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, MUCI, NB/70K, NY-CO-1, NKG2DL, NR, ROBO1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C 관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS을 포함한다.
종양 항원의 추가 예에는 A33, BAGE, Bcl-2, β-카테닌, BCMA, CA125, CA19-9, CD5, CD7, CD19, CD20, CD21, CD22, CD33/IL3Ra, CD34, CD37, CD38, CD45, CD123, CD135(FLT3), CD138, 암배아항원(CEA), CLL1, c-Met, CS-1, 사이클린 B1, DAGE, EBNA, EGFR, EGFRvIII, ephrinB2, 에스트로겐 수용체, FAP, 페리틴, 엽산 결합 단백질, GAGE, G250, GD-2, GM2, gp75, gp100(Pmel 17), 당지질 F77, HER2/neu, HPV E6, HPV E7, Ki-67, LRP, 메조텔린, MY-ESO-1, MART-1, MAGE A3, p53, PRAME, PR1, PSMA, ROR1, SLAMF7, WT1(윌름스 종양) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가 종양 항원은 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun (2013), www(dot)cancerimmunity(dot)org/peptide/에서 제공되며, 참조로 본 명세서에 포함된다.
고형 종양에 대한 추가적인 CAR/tg-TCR 표적은 Ma et al., Int. J. Biol. Sci. (2019) 15(12): 2548-2560에 기술되며, 본 명세서에 참조로 포함된다.
특정 구체예에 따르면, 표적 항원은 HER2이다.
특정 구체예에 따르면, 표적 항원은 CD38이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 바이러스 항원은 임의의 바이러스, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인플루엔자, 사이토메갈로바이러스(CMV), T 세포 류케미아 바이러스 타입 1(TAX), C형 간염 바이러스(HCV), (HBV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 아데노바이러스(Adv), 감기 바이러스, 독감 바이러스, A형, B형, C형 간염 바이러스, 단순포진, 일본뇌염, 홍역, 소아마비, 광견병, 호흡기세포융합체, 풍진, 천연두, 대상포진, 로타바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 폴리오마바이러스(예: BK 바이러스), 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 예컨대, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 및/또는 지카 바이러스로부터 유래될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 바이러스 항원은 인간 T 세포 림프친화성 바이러스 타입 I(HTLV-1) 전사 인자(TAX), 인플루엔자 매트릭스 단백질 에피토프, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 유래 에피토프, HIV-1 RT, HIV Gag, HIV Pol, 인플루엔자 막 단백질 M1, 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 뉴라미니다아제, 인플루엔자 뉴클레오단백질, 인플루엔자 뉴클레오단백질, 인플루엔자 매트릭스 단백질(M1), 인플루엔자 이온 채널(M2), 인플루엔자 비구조 단백질 NS-1, 인플루엔자 비구조 단백질 NS-2, 인플루엔자 PA, 인플루엔자 PB1, 인플루엔자 PB2, 인플루엔자 BM2 단백질, 인플루엔자 NB 단백질, 인플루엔자 뉴클레오캡시드 단백질, 사이토메갈로바이러스(CMV) 인산화 매트릭스 단백질(pp65), TAX, C형 간염 바이러스(HCV), HBV pre-S 단백질 85-66, HTLV-1 tax 11-19, HBV 표면 항원 185-194, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS-CoV) 단백질 S1, SARS-CoV 단백질 RBD, SARS-CoV 뉴클레캡시드 단백질, SARS-CoV 단백질 Plpro, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 단백질 S1, SARS-CoV-2 단백질 S2, SARS-CoV-2 단백질 S1+S2 ECD, SARS-CoV-2 단백질 RBD, SARS-CoV-2 단백질 N 항원, SARS-CoV-2 단백질 S 항원 또는 SARS-CoV-2 뉴클레캡시드 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세균 항원은 임의의 세균, 예컨대, 탄저병; 그람 음성 간균, 클라미디아, 디프테리아, 헤모필루스 인플루엔자, 헬리코박터 파일로리, 말라리아, 결핵균, 백일해 독소, 폐렴 구균, 리케차, 포도상구균, 연쇄상구균 및 파상풍으로부터 유래될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세균 항원은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 탄저병 항원은 탄저병 보호 항원을 포함하나, 이에 제한되지 않고; 그람 음성 간균 항원은 지질다당류를 포함하나, 이에 제한되지 않으며; 헤모필루스 인플루엔자 항원은 협막 다당류를 포함하나, 이에 제한되지 않고; 디프테리아 항원은 디프테리아 독소를 포함하나, 이에 제한되지 않으며; 결핵균 항원은 미콜산, 열충격 단백질 65(HSP65), 30 kDa 주요 분비 단백질 및 항원 85A를 포함하나, 이에 제한되지 않고; 백일해 독소 항원은 헤마글루티닌, 퍼탁틴, FIM2, FIM3 및 아데닐레이트 사이클라제를 포함하나, 이에 제한되지 않으며; 폐렴 구균 항원은 뉴몰리신 및 폐렴구균 협막 다당류를 포함하나, 이에 제한되지 않고; 리케차 항원은 rompA를 포함하나, 이에 제한되지 않으며; 연쇄상구균 항원은 M 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않고; 및 파상풍 항원은 파상풍 독소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 항원은 슈퍼버그 항원(예를 들어 다약제 내성 세균)이다. 슈퍼버그의 예는 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae)(에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 엔테로박터 에스피피(Enterobacter spp.)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 진균(fungal) 항원은 임의의 진균, 예컨대, 칸디다, 콕시디오데스, 크립토코커스, 히스토플라스마, 레슈마니아, 플라스모디움, 원생동물, 기생충, 주혈흡충, 백선, 톡소플라스마 및 트리파노소마 크루지로부터 유래될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 진균 항원은 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 콕시디오데스 항원은 구형 항원을 포함하나, 이에 제한되지 않고; 크립토코커스 항원은 협막 다당류를 포함하나, 이에 제한되지 않으며; 히스토플라스마 항원은 열 충격 단백질 60(HSP60)을 포함하나, 이에 제한되지 않고; 레슈마니아 항원은 gp63 및 리포포스포글리칸을 포함하나, 이에 제한되지 않으며; 플라스모디움 팔시파룸 항원은 메로조이트 표면 항원, 포자소체 표면 항원, 포자소체 항원, 생식세포/생식체 표면 항원을 포함하나, 이에 제한되지 않고; 원생동물 및 기타 기생충 항원은 혈액 단계 항원 pf 155/RESA를 포함하며; 주혈흡충 항원은 글루타티온-S-트랜스퍼라제 및 파라미오신을 포함하나, 이에 제한되지 않고; 백선 진균 항원은 트리코피틴을 포함하나, 이에 제한되지 않으며; 톡소플라스마 항원은 SAG-1 및 p30을 포함하나, 이에 제한되지 않고; 및 트리파노소마 크루지 항원은 75-77 kDa 항원 및 56 kDa 항원을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다양한 방법을 사용하여 본 발명의 일부 구체예의 핵산을 NK 세포(예를 들어, 막 결합 단백질을 인코딩하는 핵산)에 도입할 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) and Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]에 설명되어 있으며, 예를 들어, 안정하거나 일시적인 트랜스펙션, 리포펙션, 전기천공 및 재조합 바이러스 벡터에 의한 감염을 포함한다. 또한, 양성-음성 선택 방법에 대해서는 미국 특허 번호 5,464,764 및 5,487,992를 참조.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 일부 구체예의 핵산은 네이키드(naked) DNA로서 또는 적합한 벡터로 NK 세포에 도입된다. 네이키드 DNA를 사용하여 전기천공법으로 세포를 안정적으로 형질감염시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,410,319 참조. 네이키드 DNA는 일반적으로 플라스미드 발현 벡터에 발현에 적합한 방향으로 포함된 CAR 또는 tg-TCR을 인코딩하는 DNA를 지칭한다.
대안으로, 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 본 발명의 일부 구체예의 핵산(예를 들어 CAR을 인코딩하는 핵산 또는 tg-TCR)을 NK 세포에 도입할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 따라 사용하기에 적합한 벡터는 NK 세포에서 복제되지 않는다. 세포 내에서 유지되는 바이러스의 카피 수가 세포의 생존능을 유지하기에 충분히 낮은 바이러스를 기반으로 한 다수의 벡터, 예를 들어, HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV를 기반으로 한 벡터가 공지되어 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 일부 구체예의 핵산은 비바이러스 유전자 전달에 의해 NK 세포에 도입된다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 일부 구체예의 핵산은 mRNA로서 NK 세포에 도입된다.
특정 구체예에 따르면, CAR 또는 tg-TCR의 발현을 상향조절하는 것은 NK 세포로의 핵산(예를 들어 mRNA)의 전기천공에 의해 달성된다. 전기천공은 Nucleofector 또는 BTX-Gemini Twin Wave Electroporator를 포함하되 이에 제한되지 않는 임의의 전기천공 장치를 사용하여 달성될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 2개, 3개 또는 그 이상의 막 결합 단백질이 단일 NK 세포에서 공동 발현될 수 있다.
일 구체예에 따르면, NK 세포는 다음을 공동 발현하도록 변형될 수 있다:
(i) CAR 또는 tg-TCR, 및
(ii) 인 비보에서 NK 세포의 생존에 영향을 미치는 사이토카인 또는 수용체(예: IL-15, IL-15R, 수용체 링커 IL-15(RLI), TLR 등)
특정 구체예에 따르면, 목적 유전자가 CISH인 경우, 적어도 하나의 막 결합 단백질은 IL-15를 포함한다.
특정 구체예에 따르면, 목적 유전자가 CD38인 경우, 적어도 하나의 막 결합 단백질은 항-CD38 CAR을 포함한다.
일 구체예에 따르면, 막 결합 단백질 발현의 상향조절은 세포 배양 개시로부터 8-20일, 8-18일, 10-18일, 12-18일, 12-16일, 12-14일에 달성된다.
특정 구체예에 따르면, 막 결합 단백질 발현의 상향조절은 세포 배양 개시로부터 12-16일에 달성된다.
특정 구체예에 따르면, 막 결합 단백질 발현의 상향조절은 세포 배양 개시로부터 12-14일에 달성된다.
특정 구체예에서, NK 세포가 적어도 하나의 막 결합 단백질을 발현하도록 변형된 후, 세포는 배양물로부터 수확될 수 있다.
특정 구체예에 따르면, 세포는 세포 수확 1-4일, 1-3일, 1-2일 또는 0.5-1일 전에 적어도 하나의 막 결합 단백질을 발현하도록 변형된다.
세포 수확은 부착된 세포를 방출하여(예를 들어, 배양 용기 표면을 "스크래핑") 수동으로 수행하거나, 배양 용기에서 세포를 효율적으로 세척하고 자동으로 세포를 수확하도록 설계된 세포 수확 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, 증폭된 NK 세포는 세포 수확 장치(예를 들어 G-Rex MCS, WolfWilson, St Paul MN의 수확 장치)에 의해 배양 용기로부터 수확된다. 특정 구체예에서, 증폭된 CD3-고갈 NK 세포 분획은 세포 수확 장치(예를 들어 Fresenius Kabi(독일 함부르크)의 LOVO 세포 처리 장치)에 의해 배양 용기로부터 수확된다.
일부 구체예에서, 배양물로부터 확장된 NK 세포를 수확하면 배양 용기로부터 세포의 대부분 또는 거의 전부가 제거된다. 다른 구체예에서, 수확은 2개 이상의 단계로 수행될 수 있으며, 이는 수확되지 않은 세포가 나중에 수확될 때까지 배양물에 남아 있도록 할 수 있다. 특정 구체예에서, 확장된 NK 세포는 확장된 NK 세포의 첫 번째 부분을 수확하고 이어서 확장된 NK 세포의 두 번째 부분을 수확하는 것을 포함하는 두 단계로 수확된다. 두 부분의 수확은 첫 번째 부분과 두 번째 부분의 수확 사이에 몇 시간, 며칠 또는 그 이상의 간격을 두고 수행될 수 있다. 수확된 두 부분은 배양액의 대략 동일한 부분(예: 동일한 양의 배양된 NK 세포)을 포함할 수 있거나, 부분 중 하나는 다른 부분보다 배양된 NK 세포의 더 큰 부분을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 수확은 배양 개시 후 약 12-18일 예를 들어 14-16일 동안 확장된 변형 NK 세포를 수확하는 것을 포함한다. 일 구체예에 따르면, 수확은 적어도 하나의 막 결합 단백질(예를 들어, CAR)을 발현하도록 세포를 변형한 후 약 1-4일 예를 들어 1-2일 동안 확장된 변형 NK 세포를 수확하는 것을 포함한다.
사용할 수 있도록 확장된 NK 세포 집단을 제조하기 위해, 수확된 세포를 배양 배지로 세척할 필요가 있으며, 중요한 파라미터를 평가하고, 임상적으로 합리적인 기간 동안 주입에 적합한 농도로 부피를 조정해야 한다.
수확 후, 확장된 변형 NK 세포는 수동으로 또는 바람직하게는 임상 적용을 위해 폐쇄 시스템을 사용하는 자동화 장치를 사용하여 배양 배지 없이 세척될 수 있다. 세척된 세포는 주입 용액으로 재구성될 수 있다(예를 들어, 예시적인 주입 용액 중 하나는 8% w/v HSA 및 6.8% w/v Dextran-40을 포함함). 일부 구체예에서, 재구성은 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구체예에서, 주입 용액은 본 발명의 방법 및 조성물과 함께 사용하기에 적합한지 스크리닝된다. 적합한 주입 용액 선택을 위한 예시적인 기준에는 세균, 효모 또는 진균(mold) 성장이 없고, 0.5 Eu/ml 미만의 내독소 함량 및 투명하고 이물질이 없는 외관을 나타내는 안전성 시험이 포함된다.
확장된 변형 NK 세포가 확보되면 세포 수(즉, 증식), 세포 시그니처(예: CD3-CD56+ 세포), 막 결합 단백질(예를 들어, CAR, tg-TCR, IL-15, RLI 등)의 발현 및 NK 세포 기능성에 대해 시험된다.
세포 증식에 대한 분석은 당업계에 잘 알려져 있으며, 세포를 낮은 밀도로 씨딩하고 성장시키며 콜로니를 계수하는 클론생성 분석, 기계적으로 세포를 측정하는 기계적 분석[플로우 사이토메트리(예를 들어, FACS™), 프로피디움 아이오다이드], 생존 세포의 수를 측정하는 대사적 분석(예컨대, 테트라졸리움 염의 결합, 예를 들어, XTT, MTT 등), 생장하는 집단의 DNA 합성을 측정하는 직접 증식 분석(예컨대 브로모디옥시우리딘, 티미딘 결합 등)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
세포 특징 및 세포막 상의 단백질 발현에 대한 분석은 당업계에 잘 알려져 있으며, FACS 분석 및 면역조직학적 염색 기술을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "NK 세포 기능성"은 NK 세포에 기인하는 임의의 생물학적 기능을 지칭한다. NK 세포 기능의 비제한적인 목록에는 예를 들어 세포독성, 세포사멸 유도, 세포 운동성, 지향성 이동, 사이토카인 및 기타 세포 신호 반응, 사이토카인/케모카인 생산 및 분비, 인 비트로에서 활성화 및 억제성 세포 표면 분자의 발현, 이식된 숙주에서 세포 귀소(homing) 및 생착(생체 내 체류), 및 생체 내 질병 또는 질병 과정의 변경이 포함된다. 일부 구체예에서, 니코틴아미드 및/또는 다른 니코틴아미드 모이어티의 존재 하에 확장에 의해 향상된 NK 세포 기능은 CD62L 표면 마커의 증가된 발현, 증가된 이동 반응, 및 NK 세포의 더 큰 세포독성 활성뿐만 아니라 주입된 NK 세포의 증가된 귀소 및 생체 내 체류 중 적어도 하나를 포함한다.
이식 시 세포의 귀소/생착 및 유지에 중요한 CD62L, CXCR-4, CD49e 등과 같은 점착 및 이동 분자에 대한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 세포에서의 CD62L 발현은 예를 들어 플로우 사이토메트리, 면역검출, 정량적 cDNA 증폭, 혼성화 등에 의해 분석될 수 있다.
세포 이동에 대한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 세포 이동은 예를 들어 이행(transmigration) 분석 또는 갭 폐쇄 분석에 의해 분석될 수 있다. 일 구체예에서, NK 세포의 상이한 집단의 이동 가능성은 "트랜스웰(Transwell)"TM 이행(transmigration) 분석에 의해 결정된다.
세포독성("세포 사멸")에 대한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 전환 사멸 분석(redirected killing assay)에 사용하기에 적합한 표적 세포의 예는 암 세포주, 원발성 암세포 고형 종양 세포, 백혈병 세포 또는 바이러스 감염된 세포이다. 특히, K562, BL-2, colo250 및 원발성 백혈병 세포가 사용될 수 있지만, 임의의 다수의 다른 세포 유형도 사용될 수 있으며 이는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136, Vitale et al.(1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072, Pessino et al.(1998) J. Exp. Med. 188: 953-960, Neri et al. al.(2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8: 1131-1135). 예를 들어, 세포 사멸은 세포 생존력 분석(예: 염료 배제, 크롬 방출, CFSE), 대사 분석(예: 테트라졸리움 염) 및 직접 관찰을 통해 평가할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에 의해 생성된 세척 및 농축되고 확장된 변형 NK 세포 분획은 약 60% 내지 약 99% CD56+/CD3- 세포, 약 70% 내지 약 99% CD56+/CD3- 세포, 약 80% 내지 약 99% CD56+/CD3- 세포, 약 99% CD56+/CD3- 세포 또는 약 90-99% CD56+/CD3- 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다. 일 구체예에서, 본 발명의 일부 구체예에 의해 생성된 세척 및 농축되고 확장된 NK 세포 분획은 적어도 약 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 CD56+/CD3- 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일부 구체예에 의해 생성된 세척 및 농축되고 확장된 변형 NK 세포 분획은 약 60% 내지 약 99% 막 결합 단백질 양성 세포, 약 70% 내지 약 99% 막 결합 단백질 양성 세포, 약 80% 내지 약 99% 막 결합 단백질 양성 세포 또는 약 90-99% 막 결합 단백질 양성 세포(예: CAR, tg-TCR, IL-15, RLI 등)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 일 구체예에서, 본 발명의 일부 구체예에 의해 생성된 세척 및 농축되고 확장된 NK 세포 분획은 적어도 약 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 막 결합 단백질 양성 세포(예를 들어, CAR, tg-TCR, IL-15, RLI 등)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일부 구체예의 변형된 NK 세포는 신선한 세포로 사용될 수 있다. 대안으로, 세포는 향후 사용 또는 "기성품" 사용을 위해 냉동보존될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예의 일 양태에 따르면, 본 발명의 일부 구체예의 방법에 따라 얻을 수 있는 분리된 NK 세포 집단이 제공된다.
일 구체예에 따르면, 분리된 NK 세포 집단(즉, 엑스 비보 확장 후, 예를 들어 배양 종료 시)은 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 NK 세포를 포함한다.
일 구체예에 따르면, 분리된 NK 세포 집단의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상(즉, 엑스 비보 확장 후, 예를 들어 배양 종료 시)은 유전자 변형된다.
일 구체예에 따르면, 분리된 NK 세포 집단의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상(즉, 엑스 비보 확장 후, 예를 들어 배양 종료 시)은 적어도 하나의 막 결합 단백질의 상향조절된 발현을 포함한다.
일 구체예에 따르면, 분리된 NK 세포 집단의 적어도 약 0%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상(즉, 엑스 비보 확장 후, 예를 들어, 배양 종료 시)은 둘 다 유전자 변형되고, 적어도 하나의 막 결합 단백질의 상향조절된 발현을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단은 유기체 자체에 투여될 수 있거나, 적합한 담체 또는 부형제와 혼합된 약학 조성물로 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "약학 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분과 함께 본 명세서에 기술된 하나 이상의 유효성분의 제제를 지칭한다. 약학 조성물의 목적은 유기체에 대한 화합물의 투여를 촉진하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "유효성분"은 생물학적 효과를 담당하는 분리된 NK 세포 집단을 지칭한다.
이하, 상호교환적으로 사용될 수 있는 문구 "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "약학적으로 허용되는 담체"는 유기체에 심각한 자극을 일으키지 않고 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다. 이 문구 아래에는 어쥬번트가 포함되어 있다.
본 명세서에서 용어 "부형제"는 유효성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 약학 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다. 부형제의 예에는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당 및 전분 유형, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
약물의 제형화 및 투여 기술은 본 명세서에 참고로 포함된 "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판에서 찾을 수 있다.
적합한 투여 경로는 예를 들어 경구, 직장, 경점막, 특히 경비강, 장 또는 비경구 전달(근육내, 피하 및 골수내 주사뿐만 아니라 척수강내, 직접 뇌실내, 심장내, 예를 들어 우심실 또는 좌심실강, 총관상동맥, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사를 포함할 수 있다.
중추신경계(CNS)로의 약물 전달을 위한 기존 접근법은 다음을 포함한다: 신경외과 전략(예를 들어, 뇌내 주사 또는 뇌실내 주입); BBB의 내인성 수송 경로 중 하나를 이용하려는 시도로 제제의 분자 조작(예를 들어, 그 자체로는 BBB를 통과할 수 없는 제제와 함께 내피 세포 표면 분자에 대한 친화성을 갖는 수송 펩타이드를 포함하는 키메라 융합 단백질의 생산); 제제의 지질 용해도를 증가시키기 위해 고안된 약리학적 전략(예: 수용성 제제를 지질 또는 콜레스테롤 운반체에 접합); 및 고삼투압 파괴에 의한 BBB 무결성의 일시적인 파괴(만니톨 용액을 경동맥에 주입하거나 안지오텐신 펩타이드와 같은 생물학적 활성제를 사용하여 발생). 그러나 이러한 각 전략에는 제한 사항, 예컨대, 침습적 수술 절차와 관련된 내재적 위험, 내생적 운송 시스템에 내재된 한계로 인해 부과되는 크기 제한, CNS 외부에서 활성적일 수 있는 담체 모티프로 구성된 키메라 분자의 전신 투여와 관련된 잠재적으로 바람직하지 않은 생물학적 부작용, 및 BBB가 파괴된 뇌 영역 내에서 뇌 손상이 발생할 위험이 있어 최적의 전달 방법이 아니다. 대안으로, 전신 방식보다는 국소 방식으로, 예를 들어 환자의 조직 부위에 직접적으로 약학 조성물을 주사함으로써 약학 조성물을 투여할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 투여 경로는 예를 들어 주사, 섭취, 수혈, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation)을 포함한다. 본 명세서에 기술된 조성물은 환자에게 피하, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사에 의해 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일 구체예에서 본 발명의 약학 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 i.v. 주입으로 투여된다. 약학 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위에 직접 주사될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예의 약학 조성물은 당업계에 널리 공지된 공정, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 부상형, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 구체예에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진시키는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택한 투여 경로에 따라 달라진다.
주사를 위해, 약학 조성물의 유효성분은 수용액, 바람직하게는 행크 용액, 링거 용액 또는 생리학적 염 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액으로 제형화될 수 있다. 경점막 투여의 경우에는 투과되는 장벽에 적합한 침투제를 제형에 사용한다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 알려져 있다.
경구 투여의 경우, 활성 화합물을 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용되는 담체와 조합함으로써 약학 조성물을 쉽게 제형화할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물이 환자의 경구 섭취를 위한 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있게 한다. 경구 사용을 위한 약학적 제제는 고체 부형제를 사용하여 제조할 수 있으며, 선택적으로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 얻을 수 있다. 적합한 부형제는 특히 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함한 당류; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸스 검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르보메틸셀룰로스 등의 셀룰로스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리학적으로 허용되는 중합체와 같은 충전제이다. 원하는 경우, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 알긴산나트륨과 같은 이의 염과 같은 붕해제가 첨가될 수 있다.
당의정(Dragee) 코어에는 적합한 코팅이 제공된다. 이러한 목적을 위해, 선택적으로 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 카보폴 젤, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티타늄, 래커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축된 당류 용액이 사용될 수 있다. 활성 화합물 용량의 다양한 조합을 확인하거나 특성화하기 위해 염료 또는 색소를 정제 또는 당의정 코팅에 첨가할 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는 약학 조성물에는 젤라틴으로 만들어진 푸시핏(push-fit) 캡슐뿐만 아니라 젤라틴과 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제로 만들어진 연질의 밀봉 캡슐이 포함된다. 푸시핏 캡슐은 유효성분을 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 활석 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제 및 선택적으로 안정제와 혼합하여 함유할 수 있다. 연질 캡슐의 경우 유효성분은 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 액체에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한 안정화제가 첨가될 수도 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 선택한 투여 경로에 적합한 용량이어야 한다.
구강 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
비강 흡입 투여의 경우, 본 발명의 일부 구체예에 따라 사용하기 위한 유효성분은 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용하여 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정될 수 있다. 예를 들어 디스펜서에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물의 분말 혼합물과 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스를 함유하도록 제형화될 수 있다.
본 명세서에 기술된 약학 조성물은 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다.
주사용 제형은 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플 또는 선택적으로 방부제가 첨가된 다회 투여 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼일 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 약학 조성물은 수용성 형태의 활성 제제의 수용액을 포함한다. 또한, 유효성분의 현탁액은 적절한 유성 또는 수성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클에는 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올레이트, 트리글리세리드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르가 포함된다.
수성 주사 현탁액에는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시키는 물질이 포함될 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고농축 용액을 제조할 수 있도록 유효성분의 용해도를 증가시키는 제제를 함유할 수 있다.
대안으로, 유효성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균발열성물질제거수 기반 용액으로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 일부 구체예의 약학 조성물은 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 기타 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 기제를 사용하여 좌제 또는 정체 관장과 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예와 관련하여 사용하기에 적합한 약학 조성물은 유효성분이 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 치료적 유효량은 장애(예: 악성 또는 비악성 질병)의 증상을 예방, 완화 또는 개선하거나 치료받는 대상체의 생존을 연장하는 데 효과적인 유효성분(분리된 NK 세포 집단)의 양을 의미한다.
치료적 유효량의 결정은 특히 본 명세서에 제공된 상세한 개시 내용을 고려하여 당업자의 능력 내에 있다.
"치료량"이 지시되는 경우, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 질병 상태, 예를 들어 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 환자(대상체)의 상태, 질병 상태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 본 명세서에 기술된 세포를 포함하는 약학 조성물은 해당 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여, 체중 kg당 25 - 500 x 106 세포, 예를 들어, 체중 kg당 25 - 400 x 106 세포, 체중 kg당 50 - 300 x 106 세포, 예를 들어, 체중 kg당 50 - 250 x 106 세포의 투여량으로 투여될 수 있다고 언급할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 본 명세서에 기재된 세포는 체중 kg당 약 25 x 106 세포, 체중 kg당 약 50 x 106 세포, 체중 kg당 약 75 x 106 세포, 체중 kg당 약 100 x 106 세포, 체중 kg당 약 150 x 106 세포, 체중 kg당 약 200 x 106 세포, 체중 kg당 약 250 x 106 세포 또는 체중 kg당 약 300 x 106 세포의 투여량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예의 NK 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. NK 세포는 면역요법에서 일반적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(예를 들어 Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988 참조). 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 요법은 환자의 질병 징후를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
예를 들어, 병리학에 대한 유효성분(예를 들어, 본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단)의 효과는 치료 대상체의 생물학적 샘플에서 잘 알려진 방법(예를 들어, ELISA, FACS 등)을 사용하여 세포 마커, 호르몬, 글루코스, 펩타이드, 탄수화물, 사이토카인 등의 수준을 모니터링하거나, 잘 알려진 방법(예를 들어, 초음파, CT, MRI 등)을 사용하여 종양 크기를 모니터링함으로써 평가될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 임의의 제제에 대해, 치료적 유효량 또는 용량은 인 비트로 및 세포 배양 분석으로부터 초기에 추정될 수 있다. 예를 들어, 원하는 농도 또는 역가를 달성하기 위해 동물 모델에서 용량을 공식화할 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 유효성분의 독성 및 치료 효능은 인 비트로 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 이러한 인 비트로 및 세포 배양 분석과 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간에게 사용할 수 있는 다양한 용량을 공식화하는 데 사용될 수 있다.
투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태를 고려하여 개인 의사가 선택할 수 있다(예를 들어, Fingl, et al., 1975, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1 참조).
투여 함량 및 간격은 유효성분의 수준이 생물학적 효과(최소 유효 농도, MEC)를 유도하거나 억제하기에 충분하도록 개별적으로 조정될 수 있다. MEC는 각 제제마다 다르지만 인 비트로 데이터를 통해 추정할 수 있다. MEC를 달성하는 데 필요한 투여량은 개인의 특성과 투여 경로에 따라 달라진다. 검출 분석을 사용하여 혈장 농도를 결정할 수 있다.
치료할 상태의 중증도 및 반응성에 따라, 투여는 단일 또는 복수 투여일 수 있으며, 치료 과정은 수일에서 수주까지 또는 치료가 이루어지거나 질병 상태가 감소될 때까지 지속된다. 일 구체예에 따르면, 투여는 1일 1회, 2회, 3회 또는 그 이상의 투여일 수 있다. 투여는 다음 날에 이루어질 수도 있고, 며칠 또는 몇 주 간격으로 이루어질 수도 있다. 그러한 결정은 의학 분야의 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
투여될 조성물의 함량은 물론 치료 대상체, 고통의 중증도, 투여 방식, 처방 의사의 판단 등에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 본 발명의 치료제는 병리학적인 치료를 위해 고안된 다른 약물(들)과 함께 대상체에게 제공될 수 있다[즉. 예를 들어, 분리된 NK 세포 집단의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후의 병용 요법].
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단은 화학요법, 방사선 요법, 면역억제제(예를 들어 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506), 항체 또는 당업계에 공지된 기타 제제와 조합하여 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단은 항바이러스제(예를 들어, 간시클로비르, 발라시클로비르, 아시클로비르, 발간시클로비르, 포스카넷, 시도포비르, 마리바비르, 레플루노미드), 화학요법제(예를 들어, 시클로포스파미드, 부술판, 메클로레타민 또는 무스틴(HN2), 우라무스틴 또는 우라실 머스타드, 멜팔란, 클로람부실, 이포스파미드, 벤다무스틴, 니트로소우레아스 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 티오테파, 시스플라틴, 카보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴, 사트라질산트리플라틴, 프로카바진, 알트레타민, 트리아젠(다카르바진, 미토졸로미드, 테모졸로미드), 다카르바진, 테모졸로미드, 마일레란, 부설펙스, 플루다라빈, 디메틸 밀레란 또는 시타라빈을 포함하는 알킬화제와 같으나 이에 제한되지 않은 항종양제) 또는 치료적 단클론 항체(예를 들어, 트라스투주맙(Herceptin®), 페르투주맙(Perjeta®), 세르툭시맙(Erbitux®), 파니투무맙(Vectibix®), 네시투무맙(Portrazza®), 디누툭시맙(Unituxin®), 베바시주맙(Avastin®), 라무시루맙(Cyramza®), 올라라투맙(Lartruvo®), 이필리무맙(Yervoy®), 니볼루맙(Opdivo®), 펨브롤리주맙(Keytruda®), 아테졸리주맙(Tecentriq®), 아도-트라스투주맙 엠탄신(Kadcycla®) 융합, 데노수맙(Xgeva®), 알렘투주맙(Campath®), 아벨루맙(Bavencio®), 블리나투모맙(Blincyto®), 브렌툭시맙 베도틴(Adcetris®), 카프로맙 펜데타이드(ProstaScint®), 다라투무맙(Darzalex®), 더발루맙(Imfinzi®), 엘로투주맙(Empliciti®), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®), 오비누투주맙(Gazyva®), 오파투무맙(Arzerra®), 페르투주맙(Perjeta®), 리툭시맙(Rituxan®), 리툭시맙-히알루로니다제(Rituxan Hycela®), 이노투주맙 오조가미신(Besponsa®), 베바시주맙-awwb(Mvasi®), 트라스투주맙 dkst(Ogivri®), 또는 토시투모맙(Bexxar®))와 같은 제제를 사용한 치료를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 수의 관련 치료 양식과 함께 환자에게 투여된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단은 다라투무맙(DARA)과 함께 환자에게 투여된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단은 리툭시맙과 함께 환자에게 투여된다.
본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단은 화학요법제, 방사선 요법, 항체 요법, 수술, 광열요법 등과 함께 환자에게 투여될 수 있음이 인식될 것이다. 병용 요법은 치료 대상체에서 본 발명의 제제의 치료 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일부 구체예의 조성물은 원하는 경우 유효성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 FDA 승인 키트와 같은 팩 또는 디스펜서 장치에 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩이나 디스펜서 장치에는 투여 지침이 첨부될 수 있다. 팩 또는 디스펜서는 또한 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 용기와 관련된 통지서에 의해 수용될 수 있으며, 이 통지서는 조성물 또는 인간 또는 수의학적 투여의 형태에 대한 기관의 승인을 반영한다. 예를 들어, 그러한 통지서는 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 처방약에 대한 라벨링 또는 승인된 제품 삽입물일 수 있다. 또한, 적합한 약학적 담체에 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 위에 추가로 상세히 설명된 바와 같이 제조되고, 적절한 용기에 배치되고, 지시된 상태의 치료를 위해 라벨링될 수 있다.
키트는 예를 들어 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩이나 디스펜서 장치에는 투여 지침이 첨부될 수 있다. 팩 또는 디스펜서는 또한 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 용기와 관련된 통지서에 의해 수용될 수 있으며, 이 통지서는 조성물 또는 인간 또는 수의학적 투여의 형태에 대한 기관의 승인을 반영한다. 예를 들어, 그러한 통지서는 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 처방약에 대한 라벨링 또는 승인된 제품 삽입물일 수 있다. 또한, 적합한 약학적 담체에 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 위에 추가로 상세히 설명된 바와 같이 제조되고, 적절한 용기에 배치되고, 지시된 상태의 치료를 위해 라벨링될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예의 일 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 HER2 발현과 관련된 질병의 치료 방법이 제공되며, 이 방법은 치료적 유효량의 본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단을 대상체에게 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예의 일 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 HER2 발현과 관련된 질병을 치료하는데 사용하기 위한, 치료적 유효량의 본 발명의 일부 구체예의 분리된 NK 세포 집단이 제공된다.
용어 "치료하다"는 병리(질병, 장애 또는 상태)의 발생을 억제, 예방 또는 저지하고/하거나 병리의 감소, 완화 또는 퇴행을 유발하는 것을 지칭한다. 당업자는 다양한 방법론 및 분석을 사용하여 병리학의 발달을 평가할 수 있고, 유사하게 다양한 방법론 및 분석을 사용하여 병리학의 감소, 완화 또는 퇴행을 평가할 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 NK 세포로 치료될 수 있는 질병을 앓고 있는 모든 연령 또는 성별의 포유동물, 바람직하게는 인간, 남성 또는 여성을 지칭한다.
따라서, 본 발명의 방법은 임의의 질병, 예컨대 악성 질병(예를 들어, 암) 및 감염성 질병(예를 들어, 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염, 원생동물 감염 또는 기생충 감염)을 치료하는데 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에 따르면, 대상체는 악성 질병을 앓고 있다.
암 질병
본 발명의 일부 구체예의 방법에 의해 치료될 수 있는 악성 질병(암이라고도 함)은 임의의 고형 또는 비고형 종양 및/또는 종양 전이일 수 있다.
암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 그러한 암의 보다 구체적인 예는 편평세포암, 연조직 육종, 카포시 육종, 흑색종, 폐암(소세포폐암, 비소세포폐암, 폐선암종, 폐편평암종 포함), 복막암, 간세포암, 위(gastric)암 또는 위(stomach)암(위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 대장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 직장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 예컨대, 자궁암종, 카르시노이드 암종, 타액선 암종, 신장 또는 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 중피종, 골수종, 예컨대, 다발성 골수종, 이식 후 림프증식성 장애(PTLD), 신경모세포종, 식도암, 윤활막세포암, 신경교종 및 다양한 유형의 두경부암(예: 뇌종양)을 포함한다. 본 발명의 치료가 가능한 암 질병에는 전이성 암이 포함된다.
일 구체예에 따르면, 악성 질병은 혈액암(hematological malignancy)이다. 예시적인 혈액암은 백혈병[예: 급성 림프성, 급성 림프구성, 급성 림프구성 pre-B 세포, 급성 림프구성 T 세포 백혈병, 급성-거핵구성, 단핵구, 급성 골수성, 급성 골수성, 호산구성 급성 골수성, B 세포, 호염기성, 만성 골수성, 만성, B 세포, 호산구성, Friend, 과립구 또는 골수구, 털세포, 림프구, 거대핵모구, 단핵구, 단핵구-대식세포, 골수모구, 골수, 골수단구성, 형질세포, pre-B 세포, 전골수구성, 아급성, T 세포, 림프종양, 골수성 악성종양에 대한 소인, 급성 비림프구성 백혈병, T세포 급성림프구성백혈병(T-ALL), B 세포 만성림프구성백혈병(B-CLL)] 및 림프종[예를 들어, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 버킷, 피부 T 세포, 조직구, 림프구성, T 세포, 흉선, 저등급/여포를 포함한 B 세포; 소림프구(SL) NHL; 중간 등급/소포성 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고급 면역아세포성 NHL; 고급 림프구성 NHL; 고급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 및 Waldenstrom의 마크로글로불린혈증]을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 병리학은 고형 종양이다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 병리학은 종양 전이이다.
특정 구체예에 따르면, 악성 질병은 백혈병 또는 림프종이다.
특정 구체예에 따르면, 악성 질병은 다발성 골수종이다.
감염성 질병
감염성 질병의 예시로 만성 감염성 질병, 아급성 감염성 질병, 급성 감염성 질병, 바이러스성 질병, 세균성 질병, 원생동물 질병, 기생충 질병, 진균 질병, 마이코플라스마 질병 및 프리온 질병을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 교시에 따라 치료할 수 있는 감염성 질병을 유발하는 특정 유형의 바이러스 병원균은 레트로바이러스, 서코바이러스, 파보바이러스, 파포바바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 이리도바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스, 피코나바이러스, 칼리시바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 랍도바이러스, 분야바이러스, 코로나바이러스, 아레나바이러스 및 필로바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 교시에 따라 치료될 수 있는 바이러스 감염의 구체적인 예는 인간면역결핍바이러스(HIV)로 인한 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 인플루엔자, 코뿔소 바이러스 감염, 바이러스성 수막염, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 감염, A형, B형 또는 C형 간염 바이러스 감염, 홍역, 유두종 바이러스 감염/사마귀, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염, COVID-19 감염, 단순포진바이러스감염증, 황열병, 에볼라바이러스감염증, 광견병, 아데노바이러스(Adv), 감기 바이러스, 독감 바이러스, 일본뇌염, 소아마비, 호흡기세포융합체, 풍진, 천연두, 수두 대상포진, 로타바이러스, 웨스트 나일 바이러스 및 지카 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 구체예에 따르면, 바이러스 질병은 엡스타인 바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV), BK 바이러스, 아데노바이러스(Adv), 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2), 면역결핍 바이러스(HIV), 인플루엔자, 사이토메갈로바이러스(CMV), T세포 백혈병 바이러스 타입 1(TAX), C형 간염 바이러스(HCV) 또는 B형 간염 바이러스(HBV)로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발된다.
본 발명의 교시에 따라 치료될 수 있는 세균 감염의 구체적인 예는 탄저균; 그람 음성 간균, 클라미디아, 디프테리아, 헤모필루스 인플루엔자, 헬리코박터 파일로리, 말라리아, 결핵균, 백일해 독소, 폐렴 구균, 리케차, 포도상구균, 연쇄상구균 및 파상풍에 의해 유발된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 교시에 따라 치료될 수 있는 슈퍼버그 감염(예: 다약제 내성 세균)의 구체적인 예는 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae)(에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 엔테로박터 에스피피(Enterobacter spp.) 포함)에 의해 유발된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 교시에 따라 치료될 수 있는 진균 감염의 구체적인 예는 칸디다, 콕시디오데스, 크립토코커스, 히스토플라스마, 레슈마니아, 플라스모디움, 원생동물, 기생충, 주혈흡충, 백선, 톡소플라스마 및 트리파노소마 크루지(trypanosoma cruzi)에 의해 유발되는 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
NK 세포 치료에 대한 임상 경험에 따르면 동종 NK 세포는 숙주에 성공적으로 이식될 수 있으며 이식편대숙주병(GVHD) 발생률이 낮다. 이식 후보자(예: "대상체")의 신원이 알려진 경우, HLA 일치(호환성)와 같은 파라미터를 결정하여 선택 기준으로 사용할 수 있다. 일 구체예에 따르면, NK 세포는 HLA 반수체 또는 HLA 불일치 공여자로부터 선택된다. NK 세포 공여자는 혈연 공여자일 수도 있고 비혈연 공여자일 수도 있다. 일 구체예에 따르면, NK 세포는 동계 공여자로부터 획득된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 ± 10%를 지칭한다.
용어 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하는(includes)", "포함하는(including)", "갖는(having)" 및 이들의 결합형은 "포함하나 이에 제한되지 않음"을 의미한다.
"구성된(consisting of)"이라는 용어는 "포함하고 제한되는"을 의미한다.
용어 "필수적으로 구성된(consisting essentially of)"은 조성물, 방법 또는 구조는 추가 성분, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있지만, 추가 성분, 단계 및/또는 부분이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적이고 새로운 특성을 실질적으로 변경하지 않음을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함하여 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 구체예가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 점을 이해해야 한다. 따라서, 범위에 대한 기술은 가능한 모든 하위 범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치도 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1부터 6까지의 범위에 대한 기술은 1부터 3까지, 1부터 4까지, 1부터 5까지, 2부터 4까지, 2부터 6까지, 3부터 6까지 등의 하위 범위 뿐만 아니라, 해당 범위 내의 개별 번호, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 명세서에 수치 범위가 표시될 때마다, 이는 표시된 범위 내에 인용된 임의의 숫자(분수 또는 적분)를 포함한다는 의미이다. 제1 표시 번호 "내지" 제2 표시 번호의 "범위(ranging)/범위(ranges)" 및 제1 표시 번호"에서" 제2 표시 번호"까지"의 범위(ranging)/범위(ranges)"라는 문구는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 제1 및 제2 표시 번호 및 그 사이의 모든 분수 및 정수 숫자를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "방법"은 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야 종사자에게 알려져 있거나 알려진 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 쉽게 개발된 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하나, 이에 제한되지 않은 주어진 작업을 수행하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 상태의 진행을 폐지, 실질적으로 억제, 둔화 또는 역전시키는 것, 상태의 임상적 또는 미적 증상을 실질적으로 개선시키거나 상태의 임상적 또는 미적 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 포함한다.
명확성을 위해 별도의 구체예와 관련하여 설명된 본 발명의 특정 특징은 단일 구체예에서 조합하여 제공될 수도 있다는 것이 이해된다. 반대로, 간략화를 위해 단일 구체예의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징은 별도로 제공되거나 임의의 적절한 하위 조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 설명된 구체예에 적합하게 제공될 수도 있다. 다양한 구체예의 맥락에서 설명된 특정 특징은 구체예가 해당 요소 없이 작동하지 않는 한 해당 구체예의 필수 특징으로 간주되지 않는다.
위에 설명되고 아래 청구범위 부분에 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 구체예 및 측면은 다음 실시예에서 실험적 뒷받침을 찾는다
실시예
이제 위의 설명과 함께 본 발명을 비제한적인 방식으로 예시하는 다음 실시예를 참조한다.
일반적으로, 본 발명에 사용된 명명법과 본 발명에 사용된 실험실 절차에는 분자, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기술이 포함된다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); 이용 가능한 면역분석법은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 설명되어 있다, 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); 이들 모두는 본 명세서에 완전히 설명된 것처럼 참조로 포함된다. 이 문서 전반에 걸쳐 기타 일반 참조 자료가 제공된다. 그 절차는 해당 분야에 잘 알려져 있는 것으로 여겨지며 독자의 편의를 위해 제공된다. 본 명세서에 포함된 모든 정보는 참조로 여기에 포함된다.
일반 재료 및 실험 절차
T 세포를 피더 세포로 사용한 엑스 비보 배양
0일째, 건강한 공여자로부터 성분채집술을 통해 혈액 세포를 수집하였다. 적혈구(RBC)를 ACK 완충액(Gibco, Dublin, Ireland)으로 세척하여 용해시켰다. 제조사의 지침에 따라 CliniMACS 및 CD3 시약(Miltenyi Biotec, Germany)을 사용하여 CD3+ 세포를 고갈시켰다.
CD3이 고갈된 세포를 20% HSA가 포함된 CliniMACS 완충액으로 세척하고 완전 MEMα 배지에 재현탁시켰다.
세포를 0.05 mg/ml 겐타마이신(Braun), 2 mM L-글루타민(HyClone), 10% 인간 AB 혈청(Gemini), 7 mM 니코틴아미드(Vertillus) 및 20 ng/ml IL-15(Miltenyi)가 추가로 보충된 MEMα 배지에 씨딩하였다.
0.35 x 106 세포/ml의 CD3 고갈 세포는 400mL MEMα 배지와 피더 세포로서 방사선 조사된(즉, 40 Gy, 130 KV, 5 mA에서 조사) CD3+ 세포를 1:1 비율로 및 10 ng/ml OKT-3(Miltenyi)를 추가로 포함하는 GREX100MCS 세포 배양 플라스크(Wilson Wolf)에 씨딩되었다. 세포를 5% CO2 및 37℃의 가습 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.
6-9일에, 각 G-REX100MCS 배양 플라스크에 400 mL의 MEMα 배지를 첨가하여 부피를 두 배로 늘렸다.
12-14일에, 세포를 계수하고 아래 설명된 대로 키메라 항원 수용체(CAR), IL-15 등과 같은 목적하는 막 결합 단백질의 일시적 발현을 위한 mRNA 전기천공을 위해 제조하였다. 전기천공 후, 위에서 설명한 대로 인간 혈청이 풍부한 MEMα 배지가 포함된 24웰 플레이트로 세포를 옮겼다. 세포를 24-48시간 동안 회수한 후 분석하였다.
(선택적으로 CD3가 고갈된 세포는 배양 시작 후 24-72시간에 아래에 설명된 대로 유전자 발현의 넉아웃을 위한 전기천공을 위해 추가로 제조된다. 전기천공 후, CD3가 고갈된 세포를 위에서 설명한 대로 12-14일의 배양 기간 동안 GREX100MCS 세포 배양 플라스크에 씨딩한다)
PBMC를 피더 세포로 사용한 엑스 비보 배양
0일째, 건강한 공여자로부터 성분채집술을 통해 혈액 세포를 수집하였다. 적혈구(RBC)를 ACK 완충액(Gibco, Dublin, Ireland)으로 세척하여 용해시켰다. 제조업체의 지침(Miltenyi Biotec, 각각 Cat. No. 130-050-401 및 Cat. No. 130-042-401)에 따라 CD56 MicroBeads 및 LS Column을 사용하여 CD56+ 세포를 양성으로 선택하였다. 대안으로, CD56+ 세포는 MicroBeads(Miltenyi)의 혼합을 사용하여 음성 선택에 의해 선택된다.
CD56+ 세포는 10% 인간 혈청 및 50 ng/mL IL-2가 보충된 배지에 재현탁된 20% HSA가 포함된 CliniMACS 완충액으로 세척하고 플라스크에 2 x 106 세포/ml의 농도로 씨딩되었다.
24-72시간 후, 세포를 수확하고, 계수하며, CEDEX 계수기 및 플로우 사이토메트리 생존성 염료를 사용하여 생존성을 시험하고, 아래 설명된 대로 유전자 발현의 넉아웃을 위한 전기천공을 위해 제조되었다.
전기천공 후, 0.05 mg/ml 겐타마이신(Braun), 2 mM L-글루타민(HyClone)을 함유하고, 10% 인간 AB 혈청(Gemini), 7 mM 니코틴아미드(Vertillus) 및 20 ng/ml IL-15(Miltenyi)가 추가로 보충된 MEMI 배지에 세포를 씨딩하였다.
4 x 106 세포/ml의 CD56+ 세포는 16 mL MEMα 배지를 함유하고, 피더 세포로서 방사선 조사된(즉, 40 Gy, 130 KV, 5 mA에서 조사됨) 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(신선하거나 해동된)를 1:1 비율로, 및 10 ng/ml OKT-3 (Miltenyi)를 추가로 포함하는 6웰 Grex 배양 플라스크(Wilson Wolf)에 씨딩되었다. 세포를 5% CO2 및 37℃의 가습 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.
6-9일에 16 mL의 MEMα 배지를 각 6웰 Grex 배양 플라스크에 첨가하여 부피를 두 배로 늘렸다.
14-16일에, 세포를 계수하고 분석하였다.
선택적으로, 12-14일에, 추가로 세포는 아래 설명된 대로 목적하는 막 결합 단백질(예: CAR, IL-15 등)의 일시적인 발현을 위한 mRNA 전기천공을 위해 제조하였다. 전기천공 후, 위에서 설명한 대로 인간 혈청이 풍부한 MEMα 배지가 포함된 24웰 플레이트로 세포를 옮겼다. 세포를 24-48시간 동안 회수한 후 분석하였다.
일시적인 단백질 발현을 위한 mRNA 전기천공
배양 12-14일에 세포를 계수하고, PBSx1로 세척한 후 차가운 Opti-MEMTM(Gibco™)으로 다시 세척하였다.
mRNA 전기천공을 위해, 2 x 106 - 4 x 106 세포 및 100 ㎕의 최종 부피에서 10-30 ㎍ mRNA가 사용되었다. 전기천공은 보정된 프로그램(전압 300, 지속 시간 1 msc, 구형파 1펄스)에서 BTX-Gemini Twin Wave Electroporator를 사용하여 2 mm 차가운 큐벳에서 최대 400 ㎕의 부피로 수행되었다(위의 양에 따라 확대).
mRNA 발현을 위한 서열 목록
단백질 SEQ ID NO:
Receptor Linker IL-15 (RLI) GDA -301A 23-25
Receptor Linker IL-15 (RLI) GDA-301B 26-28
anti-p38 CAR GDA-601 35-37
anti-Her2 CAR GDA-501.A 60-61
anti-Her2 CAR GDA-501.B 62-63
anti-Her2 CAR GDA-501.C 64-65
anti-Her2 CAR GDA-501.D 66-67
전기천공 후, 위에서 설명한 대로 인간 혈청이 풍부한 MEME 배지가 포함된 12웰 플레이트로 세포를 옮겼다. 세포를 24시간 동안 회수한 후 분석하였다.
유전자 넉아웃
gRNA 스크리닝
각 가이드 RNA의 DNA 서열을 CRIS PR 발현 플라스미드에 클로닝하고 Hek293 세포주에서 게놈 편집 실험을 수행하였다. 추가 실험을 위해 가장 활성이 높은 gRNA(아래 표 2, III 참조)를 선택하였다. 편집 효율을 평가하기 위해, 조작된 유전자좌를 적합한 프라이머(아래 표 3 참조)를 사용하여 PCR로 증폭시키고 SANGER 시퀀싱으로 시퀀싱하였다. TIDE에서 분석한 INDEL 편집 비율 E
CD38 및 CISH를 위한 gRNA 서열
gRNA 서열 SEQ ID NO:
CD38-G5 TGTAGACTGCCAAAGTGTAT 1
CISH 1 GGGTTCCATTACGGCCAGCG 4
CISH-G4 (CISH2) GTCCTTTGCTGGCTGTGGAG 5
CISH-G10 (CISH3) GTTGGAGTCCAGACGGAAGC 6
프라이머 서열
정방향 역방향
CD38 5' CCTGGTAGACTGCATGTTAGACGAG3'
(SEQ ID NO: 2)		 5' AGCCCCTTTCCTATCTCTGTATCCC3'
(SEQ ID NO: 3)
CISH 5' CTGCTTCTGCGTACAAAGGGC 3'
(SEQ ID NO: 7)		 5' GGACTAACTGAGCCCATGGCTG 3'
(SEQ ID NO: 8)
RNP 복합체 제조
화학적으로 변형된 sgRNA 올리고머는 Integrated DNA Technologies(IDT, Coralville, IA, USA)에 의해 합성되었다. 각각의 전기천공 반응에 대해, 416 pmol의 Alt-R Cas9 단백질(IDT, Coralville, IA, USA)을 PBS 용액(20 ㎕ 총 부피)에서 Alt-R sg RNA와 1:2.5 몰비(반응당 1040 pmol)로 복합체화하였다. 전기천공 전에 실온에서 10-20분 동안 복합체가 형성되도록 두었다.
NK 세포에서 RNP 전기천공을 통한 게놈 편집
배양 24-72시간에 CD56+ NK 세포를 계수하고 PBSx1로 세척한 후 Opti-MEMTM(GibcoTM)에 재현탁시켰다. 2 x 106 - 4 x 106 세포를 반응당 80 ㎕의 Opti-MEMTM에 사용하고 최종 농도 4 μM에서 RNP 복합체와 혼합하였다. 그런 다음 세포에 4 ㎕(100 μM) Alt-R Enhancer (IDT, Coralville, IA, USA)를 보충하였다. 보충된 세포 용액을 BTX-Gemini Twin Wave Electroporator로 옮기고 보정된 프로그램(전압 300, 지속시간 2 msc)을 사용하여 전기천공하였다.
전기천공 후, 세포를 GREX 배양 장치로 옮기고 (상기 논의된 바와 같이) 12-14일 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 세포를 수확하고 분석하였다. 또한 동시에 QuickExtract(Lucigen, Middleton, WI, USA)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 편집 효율성을 평가하기 위해 조작된 유전자좌를 적합한 프라이머(표 2)를 사용하여 PCR로 증폭시키고 SANGER 시퀀싱으로 시퀀싱하였다. TIDE에서 분석한 INDEL 편집 비율.
FACS 분석
FACS 분석을 위해 세포를 다음 형광 항체로 염색하였다:
FACS를 위한 항체 목록
항체 카탈로그 번호
CD56 VioBright B515 (FITC) Miltenyi 130-114-552
CD340 (eRBb-2) (APC) Miltenyi 130-124-467
CD38 (APC) Miltenyi 130-113-429
Viability- Helix NP Blue Biolegend 425305
샌드위치 플로우 사이토메트리 기술
이 방법을 사용하여 NK 세포에서 CAR 발현을 결정하였다. 이 방법에서 '샌드위치'라는 용어는 다음과 같은 순서로 사용되었다: 하단 - CAR 발현 NK 세포; 중간 - CAR에 결합된 단백질; 및 상단 - 단백질의 에피토프에 대한 AB 컨쥬게이트.
예를 들어, NK 세포 표면에서 항-Her2 CAR 발현을 검출하기 위해, NK 세포에 1 ㎍의 Her2 수용성 단백질을 첨가하여 30분간 배양한 후 세척한 후 항-Her2 APC 항체를 첨가하여 15분간 배양하였다.
효능 분석(전염증성 사이토카인 및 CD107a 탈과립 마커의 세포내 염색)
효능 분석은 세포내 및 표면 발현 모두에서 다양한 활성화 마커의 발현을 분석한다. 선택된 마커는 직접적인 세포 독성과 NK 세포의 항종양 활성을 촉진할 수 있는 염증성 사이토카인 분비의 지표였다.
NK 세포가 표적을 죽이는 메커니즘 중 하나는 용해성 과립에서 세포독성 분자를 방출하는 것이다. 이 과정은 과립막과 NK 세포의 세포질막의 융합을 포함하며, 그 결과 CD107a와 같은 용해성 과립을 둘러싸는 지질 이중층에 일반적으로 존재하는 리소좀 관련 단백질의 표면 노출이 발생한다. 따라서 CD107a의 막 발현은 면역 세포 활성화 및 세포 독성 탈과립의 마커를 구성한다. NK 세포가 갖고 있는 또 다른 살해 메커니즘은 사멸 수용체에 의해 유도된 표적 세포 사멸을 통한 것이다. 활성화된 NK 세포는 IFN-γ, TNFα, GM-CSF 등과 같은 다양한 사이토카인을 분비한다. IFN-γ는 NK 세포에서 분비되는 가장 강력한 효과기 사이토카인 중 하나이며 항종양 활성에 중요한 역할을 한다. IFN-γ는 카스파제, FasL 및 TRAIL 발현을 조절하고 항종양 면역을 활성화시키는 것으로 나타났다. 따라서, NK 세포의 효능은 CD107a, TNFα 및 IFN-γ의 발현을 기반으로 평가되었다.
1 x 106 NK 세포를 0.5 x 106 표적 세포(K562, RAJI)+/- RTX(0.5 ㎍/ml)와 함께 배양하고 2 ㎕의 CD107a 항체를 FACS 튜브 내 1 ml NK 배지(MEMα + 10 % AB 혈청)의 총 부피에 넣었다. 대조군은 다음과 같이 제조되었다: 양성 대조군: NK 세포 + 5 ㎕ PMA(50 ng/ml) + 1 ㎕ 이오노마이신(1 ㎍/ml), 음성 대조군: NK 세포(표적 없음) 및 크기 대조군: NK, K562, RAJI, NK+K562, NK+RAJI. 세포를 300 rpm에서 30초 동안 원심분리하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, BFA 및 Monensin/GolgiStop(5 ㎍/ml 최종 농도 BFA, 4 ㎕ GS)을 각 튜브에 첨가하였다. 세포를 300 rpm에서 30초 동안 원심분리하고 37℃에서 3.5시간 동안 배양한 후 좀비 생존성 염료를 첨가하고 세척하였다.
먼저 세포 표면 마커에 대해 다음과 같이 세포를 염색하였다: 1.5 ㎕의 외막 항체(CD56, CD16)를 첨가하고 2-8℃의 암실에서 10분 동안 배양한 후 세척하였다. 이 시점에서 세포내 염색을 위해 Inside Stain Kit(Miltenyi, CAT#130-090-4777)를 사용하고 추가하였다. 세포를 고정하고 투과시킨 후, 원심분리한 다음 세포내 mAb(IFN-γ 및 TNF-E)를 첨가하고 세포를 암실에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 세척하고 분석하였다.
효능 분석 및 탈과립을 위한 예시적인 항체 목록
항체 형광단 공급업체 및 카탈로그 번호
Zombie Violet Viability Dye B.V 421 Bio Legend, Cat. No. 4253
CD 107a VioGreen Miltenyi Cat. No. 130-111-629
CD56 FITC Miltenyi Cat. No. 130-114-549
TNF-α PE Miltenyi Cat. No. 130-118-974
IFN- PE-Vio770 Miltenyi Cat. No. 130-113-499
GM-CSF APC Miltenyi Cat. No. 130-123-420
CD16 APC- Vio770 Miltenyi Cat. No. 130-113-390
세포독성 분석/사멸 분석(IncuCyte)
세포독성 사멸 분석은 생세포 이미징 시스템 IncuCyte S3를 통해 수행되었으며, 이를 통해 NK 활동에 관한 실시간 데이터를 수집할 수 있다. 종양 표적 세포를 CFSE 염료(Life Technologies)로 표지하고, 배지 중 PI(propidium iodide, Sigma) 존재 하에 NK 세포와 20시간 동안 공동배양하였다. 생존 세포는 염색되지 않은 채로 남아 있는 반면, 죽은 세포는 CFSE 형광 염색과 PI의 중첩에 의해 검출되었다.
예시 구체예
구체예 1. 유전자 변형 자연 살해(NK) 세포의 엑스 비보 생산 방법으로서, 상기 방법은
(a) 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 NK 세포 집단을 얻기 위해 NK 세포 집단에서 목적 유전자의 발현을 하향조절하는 단계;
(b) 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단을 얻기 위해 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 NK 세포 집단을 확장시키는 단계; 및
(c) 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단에서 적어도 하나의 막 결합 단백질의 발현을 상향조절하여 유전자 변형된 NK 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
구체예 2. 적어도 하나의 막 결합 단백질을 발현하는 자연 살해(NK) 세포의 엑스 비보 생산 방법으로서, 상기 방법은
(a) 다음을 포함하는 방법에 의해 NK 세포 집단을 확장시키는 단계:
(i) 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 상기 NK 세포 집단을 배양하되, 상기 조건은 유효량의 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 제공하는 것을 포함하는 단계; 및
(ii) 단계 (i) 이후 5-10일에 유효량의 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 상기 NK 세포 집단에 보충하여 확장된 NK 세포를 생성하는 단계;
엑스 비보 확장된 NK 세포 집단을 얻기 위해, 및
(b) 상기 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단에서 적어도 하나의 막 결합 단백질의 발현을 상향조절하여 적어도 하나의 막 결합 단백질을 발현하는 NK 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
구체예 3. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 상기 NK 세포 집단은 제대혈, 말초 혈액, 골수, CD34+ 세포 또는 iPSC로부터 유래되는 방법.
구체예 4. 구체예 1 내지 구체예 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 NK 세포 집단에는 CD3+ 세포가 결핍되어 있는 방법.
구체예 5. 구체예 1 내지 구체예 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 NK 세포 집단은 CD3-CD56+ 세포를 포함하는 방법.
구체예 6. 구체예 1 또는 구체예 3 내지 구체예 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 하향조절은 유전자 편집 시스템에 의해 달성되는 방법.
구체예 7. 구체예 1 또는 구체예 3 내지 구체예 5 중 어느 하나에 있어서, NK 세포는 배양물에 존재하는 방법.
구체예 8. 구체예 7에 있어서, 상기 하향조절은 상기 배양의 개시로부터 24-72시간 동안 달성되는 방법.
구체예 9. 구체예 1 또는 구체예 3 내지 구체예 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 목적 유전자는 그 산물이 상기 NK 세포의 증식 및/또는 생존에 영향을 미치는 유전자를 포함하는 방법.
구체예 10. 구체예 1 또는 구체예 3 내지 구체예 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 관심 유전자는 CISH, TGFβ 수용체 및 CD38로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
구체예 11. 구체예 1 또는 구체예 3 내지 구체예 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 NK 세포 집단의 확장은 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 달성되되, 상기 조건은 유효량의 영양소, 혈청, 성장 인자 및 니코틴아미드를 포함하는 방법.
구체예 12. 구체예 1에 있어서, 상기 성장 인자는 IL-15, IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, SCF 및 FLT3으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성장 인자를 포함하는 방법.
구체예 13. 구체예 2 내지 구체예 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 니코틴아미드의 유효량은 1.0 mM 내지 10 mM의 양을 포함하는 방법.
구체예 14. 구체예 1 내지 구체예 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 NK 세포 집단의 확장은 피더 세포 또는 피더층의 존재 하에서 달성되는 방법.
구체예 15. 구체예 14에 있어서, 상기 피더 세포는 방사선 조사된 세포를 포함하는 방법.
구체예 16. 구체예 14 또는 구체예 15에 있어서, 상기 피더 세포는 T 세포 또는 PBMC를 포함하는 방법.
구체예 17. 구체예 16에 있어서, CD3 작용제를 더 포함하는 방법.
구체예 18. 구체예 1 내지 구체예 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 NK 세포 집단의 확장은 14-16일 동안 달성되는 방법.
구체예 19. 구체예 7 내지 구체예 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 막 결합 단백질 발현의 상기 상향조절은 배양 개시로부터 12-14일에 달성되는 방법.
구체예 20. 구체예 1 내지 구체예 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 막 결합 단백질 발현의 상기 상향조절은 mRNA 전기천공에 의해 달성되는 방법.
구체예 21. 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 막 결합 단백질은 일시적으로 발현되는 방법.
구체예 22. 구체예 1 내지 구체예 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 막 결합 단백질은 인 비보에서 상기 NK 세포의 항질병 기능 또는 생존에 영향을 미치는 단백질을 포함하는 방법.
구체예 23. 구체예 1 내지 구체예 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 막 결합 단백질은 IL-15, IL-15R, 수용체 링커 IL-15(RLI) 및 TLR로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
구체예 24. 구체예 1 내지 구체예 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 막 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 트랜스제닉 T 세포 수용체(tg-TCR)를 포함하는 방법.
구체예 25. 구체예 24에 있어서, 상기 CAR은 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함하는 방법.
구체예 26. 구체예 25에 있어서, 상기 적어도 하나의 보조자극 도메인은 CD28, 2B4, CD137/4-1BB, CD134/OX40, Lsk, ICOS 및 DAP10으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
구체예 27. 구체예 24 내지 구체예 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR은 적어도 하나의 활성화 도메인을 포함하는 방법.
구체예 28. 구체예 27에 있어서, 상기 활성화 도메인은 CD3ζ 또는 FcR-γ를 포함하는 방법.
구체예 29. 구체예 24 내지 구체예 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR은 막관통 도메인 및 힌지 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
구체예 30. 구체예 29에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8, CD28 및 NKG2D로부터 선택되는 방법.
구체예 31. 구체예 29 또는 구체예 30에 있어서, 상기 힌지 도메인은 CD8 및 CD28로부터 선택되는 방법.
구체예 32. 구체예 24 내지 구체예 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR은 항체 또는 항원 결합 단편인 항원 결합 도메인을 포함하는 방법.
구체예 33. 구체예 32에 있어서, 항원 결합 단편은 Fab 또는 scFv인 방법.
구체예 34. 구체예 24 내지 구체예 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR 또는 상기 tg-TCR은 종양 항원, 바이러스 항원, 세균 항원, 진균 항원, 원생동물 항원 및 기생충 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 대한 항원 특이성을 갖는 방법.
구체예 35. 구체예 34에 있어서, 상기 종양 항원은 고형 종양과 연관되어 있는 방법.
구체예 36. 구체예 34에 있어서, 상기 종양 항원은 혈액암과 연관되어 있는 방법.
구체예 37. 구체예 34 내지 구체예 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR 또는 상기 tg-TCR은 HER2/Neu, CD38, CD19, CD319/CS1, ROR1, CD20, CD5, CD7, CD22, CD70, CD30, BCMA, CD25, NKG2D 리간드, MICA/MICB, 암배아항원, 알파태아단백질, CA-125, MUC-1, 표피 종양 항원, 흑색종 관련 항원, 돌연변이 p53, 돌연변이 ras, ERBB2, 엽산 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메조텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 사슬, 람다 사슬, CSPG4, ERBB2, WT-1, EGFRvIII, TRAIL/DR4 및/또는 VEGFR2로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 대한 항원 특이성을 갖는 방법.
구체예 38. 구체예 1 내지 구체예 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 막 결합 단백질은 다음의 동시발현을 포함하는 방법:
(i) CAR 또는 tg-TCR, 및
(ii) 인 비보에서 상기 NK 세포의 생존에 영향을 미치는 사이토카인 또는 수용체.
구체예 39. 구체예 1 또는 구체예 3 내지 구체예 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 목적 유전자가 CISH인 경우, 상기 적어도 하나의 막 결합 단백질은 IL-15를 포함하는 방법.
구체예 40. 구체예 1 또는 구체예 3 내지 구체예 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 목적 유전자가 CD38인 경우, 상기 적어도 하나의 막 결합 단백질은 항-CD38 CAR을 포함하는 방법.
구체예 41. 구체예 1 내지 구체예 40 중 어느 하나의 방법에 따라 얻을 수 있는 분리된 NK 세포 집단.
구체예 42. 구체예 41의 분리된 NK 세포 집단 및 약학적 활성 담체를 포함하는 약학 조성물.
구체예 43. 이를 필요로 하는 대상체에서 질병의 치료 방법으로서, 상기 방법은 치료적 유효량의 제41항의 분리된 NK 세포 집단을 대상체에게 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
구체예 44. 이를 필요로 하는 대상체에서 질병을 치료하는데 사용하기 위한 치료적 유효량의 제41항의 분리된 NK 세포 집단.
구체예 45. 구체예 43 또는 구체예 44에 있어서, 질병은 악성 질병, 바이러스 질병, 세균 질병, 진균 질병, 원생동물 질병 및 기생충 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
구체예 46. 구체예 45에 있어서, 상기 악성 질병은 고형 종양 또는 종양 전이인 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
구체예 47. 구체예 46에 있어서, 상기 악성 질병은 유방암, 난소암, 방광암, 췌장암, 위암, 폐암, 흑색종, 육종, 신경모세포종, 대장암, 결장직장암, 식도암, 윤활막세포암, 자궁암, 신경교종 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
구체예 48. 구체예 45에 있어서, 상기 악성 질병은 혈액암인 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
구체예 49. 구체예 48에 있어서, 상기 혈액암은 백혈병, 림프종 또는 다발성 골수종을 포함하는 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
구체예 50. 구체예 43 또는 구체예 45 내지 구체예 49또는 구체예 44 내지 구체예 49에 있어서, 대상체는 인간 대상체인 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
실시예 1: 엑스 비보 확장된 NK 세포에서 NAM의 CISH 유전자 넉아웃(KO)
광범위한 바이러스 감염, 스트레스 및 변형 세포를 죽이는 NK 세포 고유의 능력에도 불구하고, 많은 진행성 고형 인간 암에서는 적은 수의 기능 장애 NK 세포가 종종 관찰된다. 따라서, 본 발명자들은 종양 미세환경에서 NK 세포의 기능을 조절하는 체크포인트를 표적으로 삼는 등 NK 세포 치료를 향상시키는 차세대 전략을 개발하였다.
IL-15는 NK 세포 발달, 항상성 및 활성화의 중요한 조절인자인 다발성 사이토카인이다. IL-15 신호전달은 종양 미세환경에서 NK 세포 증식, 생존 및 항종양 기능에 필요하다(아래 실시예 2에서 추가로 논의됨).
도 1A-B에 도시된 바와 같이, 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CIS, CISH에 의해 인코딩됨)은 사이토카인 신호 전달(SOCS) 억제제의 구성원이며 음성 피드백 루프를 통해 IL-15 신호 전달의 주요 억제 역할을 한다. SOCS 유전자는 사이토카인 수용체 결합 및 JAK/STAT 신호전달 케스케이드 활성화 후에 유도된다. 이들은 주로 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체에 대한 어댑터 역할을 하며 수용체 복합체 및/또는 관련 JAK 단백질 티로신 키나제에 결합하여 사이토카인 신호전달을 억제하고 프로테아좀 분해를 목표로 한다.
이에, 본 발명자들은 CISH 유전자가 넉아웃된 NK 세포를 생성함으로써, NK 활성화 역치를 낮추어 IL-15 감수성이 증가된 세포를 생성하는 것을 목적으로 하였다.
CISH 넉아웃의 경우, 3번째 엑손을 표적으로 하는 4개의 gRNA와 4번째 엑손을 표적으로 하는 또 다른 4개의 gRNA를 검사하였다(데이터는 표시되지 않음). 위에서 논의한 바와 같이, 각 가이드의 DNA 서열을 CRISPR 발현 플라스미드에 클로닝하고 Hek293 세포주에서 게놈 편집 실험을 수행하였다. 추가 실험을 위해 가장 활동적인 gRNA(위의 표 1 참조)를 선택하였다.
도 2A-C로부터 명백한 바와 같이, 시험된 3개의 gRNA 중 가이드 4(CISH-G4 또는 CISH2라고도 함) 및 가이드 10(CISH-G10 또는 CISH3이라고도 함)은 높은 편집률(각각 85% 및 82% INDEL 빈도)을 나타낸 반면 '기존 가이드'(공개 간행물에서 서열을 가져온 CISH1, Palmer et al, bioRxiv 2020년 9월 25일 참조)는 30% INDEL 빈도를 산출하였다. 가장 높은 INDEL 지수는 gRNA-4(CISH2)에 대해 결정되었다.
CISH 넉아웃은 도 3A-B에서 알 수 있듯이 전염증성 사이토카인 반응을 향상시켰다. 특히 가이드 4(CISH2)는 가이드 10(CISH3) 및 '기존 가이드'(CISH 1)에 비해 가장 활동적이고 효능이 증가한 것으로 나타났다.
더욱이, CISH 넉아웃은 도 4A-C에서 명백히 나타나는 바와 같이 종양 세포주에 대한 세포독성을 증가시켰다. 구체적으로, 가이드 4(CISH2)는 공동배양된 표적 세포에 대해 가장 효율적인 사멸 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2: 엑스 비보 확장된 NK 세포에서 NAM에 대한 막 결합 IL-15의 발현
IL-15는 IL-15R~과 연관된 막 결합 헤테로다이머로서 IL-2/IL-15Rβ 및 공통 γ 사슬 수용체를 발현하는 NK 세포 및 T 세포에 트랜스제시되는 방식으로 활성화된 골수 세포에 의해 주로 생산된다(도 5A-B 참조). 중요한 것은 IL-15가 NK 세포의 개체 발생에 매우 필요하며 실제로 인 비보에서 NK 세포 발달을 직접적으로 지원하는 것으로 밝혀진 유일한 사이토카인이다. 따라서 IL-15는 NK 세포에서 증식, 세포 독성 작용 및 IFN-γ와 같은 다른 사이토카인의 방출을 유도하여 면역 반응을 강화시키는 역할을 강조한다.
전임상 관찰은 NK 세포 및 T 림프구에 의해 매개되는 IL-15의 잠재적인 항종양 활성을 강력하게 뒷받침한다. IL-15의 전신 전달은 암 치료법으로 시도되었지만 독성으로 인해 사용에 대한 열정이 누그러졌다. 따라서 IL-15를 표적 세포에 보다 정확하게 전달하거나 표적 세포가 IL-15에 보다 반응하도록 하는 새로운 접근법은 매력적인 연구 방법이다.
수용체 링커 IL-15(RLI)
인 비트로 및 인 비보 전임상 연구에서는 IL-15가 IL-15R1 수용체 서브유닛에 흡착되어 트랜스제시될 때 생활성이 더 높은 것으로 나타났다. 재조합 IL-15는 분자 크기가 작기 때문에 혈액에서 빠르게 제거된다(인 비보 반감기는 2.5시간임). 따라서 여러 접근법은 더 긴 반감기와 더 나은 생체분포 파라미터를 표시하는 IL-15 및 IL-15RE를 포함하는 보다 안정적인 단백질 작제물을 설계하는 데 중점을 두었다.
재조합 단백질 수용체 링커 IL-15(RLI)는 유연한 링커에 의해 IL-15에 결합된 IL-15R(소위 스시 도메인)의 결합 도메인을 포함한다(도 5C-D 참조). 이 융합 단백질은 더 긴 반감기, IL-1 5R-β/γ 복합체에 대한 초작용제 활성을 나타내며 인 비보 모델에서 항종양 특성을 발휘한다.
IL-15 N72D 치환
나선 C의 끝에 위치한 위치 72에 있는 아스파라긴 잔기의 아미노산 치환은 부분 작용제 및 초작용제 활성을 모두 제공하는 것으로 밝혀졌으며 다양한 비보존적 치환은 향상된 활성을 제공하는 것으로 나타났다. 특히, N72D 치환은 인간 IL-15Rβ 및 공통 γ 사슬을 보유하는 세포를 사용한 증식 분석에 기초한 천연 분자에 비해 IL-15 뮤테인의 생물학적 활성이 4-5배 증가한 것으로 나타났다(Zhu et al., J Immunol( 2009) 183(6) 3598-3607). IL-15N72D 뮤테인은 인간 IL-15Rβ 사슬에 대한 향상된 결합 능력을 통해 초작용제 활성을 나타냈다. IL-15N72D의 향상된 생물학적 활성은 야생형 IL-15에 비해 Jak1 및 Stat5의 더 강한 인산화 및 더 나은 항-세포사멸 활성과 관련이 있었다. IL-15N72D 초작용제 활성은 또한 단일 사슬 T 세포 수용체 도메인에 연결되어 종양 특이적인 융합 단백질을 생성할 때 보존되었다(Zhu et al., J Immunol (2009) 183 (6) 3598-3607). 따라서, 인간 IL-15 초작용제 뮤테인 및 융합체는 임상적 유용성을 갖춘 보다 효과적인 면역치료제를 구성할 수 있는 기회를 창출할 수 있다.
막 결합 RLI N72D
RLI는 IL-15 β/γ 수용체에 높은 친화력으로 결합하며 IL-15 사이토카인의 위치 72에서 아스파라긴을 아스파르트산으로 아미노산 치환하면 수용체 리간드 접촉의 활성이 증폭된다(Guo et al. Cytokine Growth Factor Rev. (2017) 3 8: 10?21). 이러한 모든 특징을 종합하여, 본 발명자들은 N72D 돌연변이를 보유하고 HLA 세포외 사슬, 막관통 부분 및 세포질 앵커를 통해 세포막에 연결된 301.A 및 301.B라는 새로운 RLI 작제물을 설계하였다(도 6A-C 참조).
유전자 작제물 301.A의 구축(도 6A-B 및 6E)
RLI - Wong의 그룹(Zhu et al., J Immunol (2009) 183 (6) 3598-3607)에 기술된 바와 같이 위치 72에서 아스파라긴을 아스파르트산으로 아미노산 치환하고, SEQ ID NO: 11에 기재된다.
IL-15와 IL-15Ra 사이의 링커는 25 aa-(Gly4 Ser)5(SEQ ID NO: 17-18)의 통상적인 링커로 대체되었다.
IL-15Ra와 HLA 사슬 사이의 링커는 기존의 짧은(13 aa) GS 링커(SEQ ID NO: 19-20)로 대체되었다.
세포외, 막관통 및 세포질 절편을 인간 HLA-A 유전자(SEQ ID NO: 21-22)로 대체하였다.
301.A의 전체 작제물은 각각 SEQ ID NO: 23-24, 전체 서열 및 코돈 최적화 서열에 제공된다.
유전자 작제물 301.B의 구축(도 6C-D 및 6F)
RLI - Wong의 그룹(Zhu et al., J Immunol (2009) 183 (6) 3598-3607)에 기술된 바와 같이 위치 72에서 아스파라긴을 아스파르트산으로 아미노산 치환하고, SEQ ID NO: 11에 기재된다.
IL-15와 IL-15Ra 사이의 링커는 25 aa-(Gly4 Ser)5(SEQ ID NO: 17-18)의 통상적인 링커로 대체되었다.
IL-15와 HLA 사슬 사이의 링커는 기존의 짧은(13 aa) GS 링커(SEQ ID NO: 19-20)로 대체되었다.
세포외, 막관통 및 세포질 절편을 인간 HLA-A 유전자(SEQ ID NO: 21-22)로 대체하였다.
301.B의 전체 작제물은 각각 SEQ ID NO: 26-27, 전체 서열 및 코돈 최적화된 서열에 제공된다.
결과
도 7에 도시된 바와 같이, 막 결합 IL-15를 발현하는 NK 세포는 증가된 CD107a 관련 탈과립 마커를 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 조작 후 세포의 높은 활성화를 시사한다.
막 결합된 IL-15의 발현은 또한 도 8A-C에서 명백한 바와 같이 표적 종양 세포주와의 공동배양 후 전염증성 사이토카인 반응을 향상시켰다.
더욱이, 막 결합 IL-15의 발현은 도 9A-C에서 명백한 바와 같이 종양 세포주 K562, BL2 및 RPMI-8226에 대한 세포독성을 증가시켰다.
종합하면, RLI 작제물 301.B는 평가된 두 작제물 사이에서 더 나은 결과를 보여준다.
실시예 3: CD38 유전자 넉아웃(KO)을 포함하고 항-p38 CAR을 발현하는 NAM 엑스 비보 확장된 NK 세포
다발성 골수종(MM) 표적화를 향상시키기 위해 키메라 항원 수용체(CAR)를 이용한 동종 자연 살해(NK) 세포 치료법의 증강에 대한 강력한 생물학적 근거가 있다. CD38은 MM에서 확립된 면역치료 표적이지만 NK 세포에서의 발현과 엑스 비보 NK 세포 확장 동안의 추가 유도는 항-CD38 CAR-NK 세포 치료법 개발에 대한 장벽을 나타낸다(도 10 참조). 1차 확장된 NK 세포를 사용할 때 NK 세포 CD38 발현으로 인한 예상되는 동족 살해를 극복하기 위해, 본 발명자들은 NK 세포에서 CD38 단백질 발현을 방해하기 위해 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 적용하였다.
p38 넉아웃의 경우, 두 번째 엑손을 표적으로 하는 4개의 gRNA를 검사하였다(데이터는 표시되지 않음). 위에서 논의한 바와 같이, 각 가이드의 DNA 서열을 CRISPR 발현 플라스미드에 클로닝하고 Hek293 세포주에서 게놈 편집 실험을 수행하였다. 추가 실험을 위해 가장 활성이 높은 gRNA 서열(위의 표 1 참조)을 선택하였다.
도 11A-E로부터 명백한 바와 같이, CRISPR-Cas9를 사용한 CD38 KO는 효율적이었고 NK 세포 생존성에 영향을 미치지 않았다. 더욱이, CD38 KO NK 세포는 다라투무맙의 존재 하에서 동족 살해에 저항성을 보였다(도 11F). 그러나 동족 살해 구출은 더 나은 암세포 사멸에 반영되지 않았다(도 11F).
암 치료법을 개선하려면 다라투무맙(DARA)과 같은 항-CD38 항체를 병용할 필요가 없다. 본 발명자들은 p38-KO NK 세포 상에서 항-CD38 CAR을 추가로 구축하고 발현시켰다(도 13 참조).
항-CD38 CAR의 구축(도 12A-B)
항-CD38 CAR은 이전에 Zelig et al.에서 논의된 단일쇄 가변 단편(scFv)을 기반으로 구축되었다(PCT/IL2018/051325 SEQ ID Nos: 29-30). 구체적으로, CAR 작제물은 다음과 같았다: ~CD38scFv-CD28 힌지+TM+Cy-FC(SEQ ID Nos: 31-32).
도 14로부터 명백한 바와 같이, CD38 KO 및 항-CD38 CAR 발현의 조합은 다발성 골수종 세포에 대한 세포독성을 증가시켰다.
실시예 4: 항-Her2 CAR을 발현하는 NAM 엑스 비보 확장된 세포
ERBB2 과발현 종양이 있는 고형암 환자를 치료하기 위한 시도로, 이전에 Rosenberg et al. (Mol Ther. (2010) 18(4): 843-851)에 의해 논의된 바와 같이, 널리 사용되는 인간화 단클론 항체(mAb) Trastuzumab(Herceptin)의 단일쇄 가변 단편(scFv)을 기반으로 NK 키메라 항원 수용체(CAR) 세포를 개발하였다.
Her2 scFv에 부착된 신호전달 모이어티의 상이한 단편들이 사용되었다. 이들은 mRNA 전기천공을 사용하여 NK 세포막에서 발현되었다.
항-HER2 CAR 구축
도 15, 16A-D 및 17에 도시된 바와 같이 힌지, 막관통, 세포질 도메인은 변형되었지만 항-Her2 scFv는 그대로 유지되는 모듈식 방식으로 항-HER2 CAR에 대해 상이한 작제물을 설계하였으며 다음과 같다:
힌지
힌지 영역의 길이는 면역 시냅스 형성에 중요하다. 세포 표면으로부터의 항원 거리에 따라 힌지 길이는 효과기와 표적 세포 사이의 최적의 거리를 허용하도록 조정되어야 한다. CD28 또는 CD8의 아미노산 서열을 항-HER2 CAR의 구축에 사용하였다(SEQ ID Nos: 38-41에 명시됨).
막관통
막관통(TM) 도메인은 세포막에 걸쳐 있고 CAR 작제물을 고정하는 소수성 알파 나선으로 구성된다. TM 도메인의 선택은 세포 활성화 정도를 통해 매개되는 CAR 작제물의 기능성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. CD28 또는 CD8의 아미노산 서열은 현재까지 가장 일반적으로 사용되고 NKG2D의 아미노산 서열(SEQ ID Nos: 42-47에 명시된 바와 같음)과 함께 항-HER2 CAR의 구축에 사용되었다.
엔도-도메인
CAR 작제물의 진화는 주로 세포내 신호전달 도메인을 최적화하는 데 중점을 두었으며, 처음 3세대의 CAR 작제물은 엔도 도메인을 구성하는 활성화 및 보조자극 분자의 수를 나타낸다. 보조자극 도메인을 선택하면 원하는 NK 세포 반응을 미세 조정할 수 있으며, 이에 따라 CD28 기반 CAR은 4-1BB 기반 CAR에 비해 증가된 세포용해 능력과 짧은 지속성을 나타낸다.
항-HER2 CAR의 구축은 CD3ζ, 또는 FC-γ 수용체 활성화 도메인(SEQ ID Nos: 48-55에 명시된 바와 같음)을 갖는 보조자극 도메인 CD28, 4-1BB 및 2B4를 포함하였다. A-D로 지정된 항-HER2 CAR를 인코딩하는 전체 작제물은 각각 SEQ ID Nos: 60, 62, 64 및 66에 제공된다.
C, B 및 D로 지정된 3개의 CAR 작제물은 모두 HER2 단백질의 인식에 의해 명백한 바와 같이 항-HER CAR을 발현하였다(도 18B-G). 샌드위치 플로우 사이토메트리 기술을 사용하여, NK를 Erbb2 단백질과 함께 사전 인큐베이션한 후 항-Her2 염색을 통해 NK 세포에서 CAR 작제물 발현을 확인하였다.
실시예 5: NAM 엑스 비보 확장된 NK 세포에서의 TGFβ 수용체 유전자 넉아웃(KO)
TGFβ는 TGFβ 수용체를 통해 면역 반응을 억제하는 사이토카인이다. 많은 종양은 면역 방어 메커니즘으로 TGFP를 과발현한다.
TGFβ 수용체 2 넉아웃은 NK 세포를 TGFβ 매개 면역억제에 둔감하게 만든다. 이에 본 발명자들은 TGFβ 수용체 2 유전자가 넉아웃된 NK 세포를 생성하였다(도 19 참조).
본 발명은 특정 구체예와 관련하여 설명되었지만, 당업자에게는 많은 대안, 수정 및 변형이 명백할 것이 분명하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 정신과 넓은 범위에 속하는 모든 대안, 수정 및 변형을 포괄하려는 의도이다.
실시예 6: 수용체 링커 IL-15 CISH 넉아웃 NK 세포의 세포 표면 표현형
CISH 넉아웃(KO)과 수용체 링커 IL-15(mbIL-15)의 발현을 결합한 전략은 항종양 세포독성을 증가시킨다. mbIL-15의 동시 발현과 함께 CISH KO에서 NKp30 표면 발현의 플로우 분석은 도 20에 나와 있다(가이드4 = CISH3 및 가이드3 = CISH4). mbIL-15(GDA-301)의 동시발현과 함께 CISH KO에서의 CD122 및 NKG2A 표면 발현의 플로우 분석은 도 25에 나와 있다. 더욱이, mbIL-15(GDA-301) NK 세포의 공동 발현을 갖는 CISH KO는 전기천공 후 24시간 동안 NKG2A가 감소한 것으로 나타났으며, 이는 4일 동안 유지되었다. mbIL-15(GDA-301)의 동시발현과 함께 CISH KO에서 TIGIT 및 LAG3 표면 발현의 플로우 분석은 도 26에 나와 있다.
실시예 7: 수용체 링커 IL-15 NK는 종양 세포에 대한 세포독성을 나타낸다
종양 세포주 대 동종 말초 혈액 단핵 세포에 대한 수용체 링커 IL-15 NK(mbIL-15)의 비교를 시험하였다. 도 29에 도시된 바와 같이, 대조군과 비교하여 mbIL-15 전기천공된 NK와 K562 세포(비율 1:1)의 공동배양 후에 유의미한 사멸 활성이 발견되었다.
실시예 8: 결합된 CISH KO 및 수용체 링커 IL-15 NK는 세포독성 효능을 나타낸다
도 28에 나타난 바와 같이, CISH의 CRISPR 매개 KO가 확인되었다. 또한, 가이드4/CISH3 및 가이드10/CISH4를 동시에 사용하여 이중 가이드 KO(DK)가 달성되었다(도 28 젤). CISH KO 및 mbIL-15를 사용한 NK 생성을 위한 작업 흐름은 도 28에 나와 있다. EGFP mRNA의 발현은 14일에 수행된 전기천공 과정에 대한 양성 대조군 역할을 하였다. 도 21 및 도 22에 도시된 바와 같이, CISH KO 및 mbIL-15 NK는 각각 K562, Raji 및 RPMI 세포와의 6시간 공동배양(3:1 E:T) 후에 세포독성 효능을 나타낸다. 추가로, 도 23에 나타난 바와 같이, CISH KO와 함께 mbIL-15를 발현하는 NK 세포에서도 MIP1alpha 및 MIP1beta의 발현이 증가하였다.
실시예 9: 결합된 CISH KO 및 수용체 링커 IL-15 NK는 증가된 사멸을 나타낸다
도 24에 도시된 바와 같이, CISH KO + mbIL-15 NK(E:T의 1:1 또는 5:1 비율)와 공동배양한 경우 K562, Raji 및 RPMI 세포주의 사멸 증가가 관찰되었다. K562 및 Raji 세포는 변형된 NK와 4-5시간 동안 공동배양된 반면, RPMI 세포는 변형된 NK와 6시간 동안 공동배양되었다.
실시예 10: CD38 KO를 갖는 NK 세포 및 결합된 CD38 KO/CD38 CAR(GDA-601) 발현을 갖는 NK 세포는 낮은 CD38 발현을 입증한다
도 27은 CD38이 넉아웃된(KO) NK 및 CD38 CAR 발현과 CD38 KO가 결합된 NK와 관련된 CD38 발현의 플로우 분석을 보여준다.
실시예 11: 결합된 CD38 KO/CD38 CAR(GDA-601) 발현을 갖는 NK 세포는 향상된 효능 및 사멸을 입증한다
CD38 KO 및 CD38 CAR 발현이 결합된 NK 세포를 다라투무맙 유무에 관계없이 1:3의 E:T 비율로 6시간 동안 RPMI 8226 세포와 공동배양하였다. 도 30에 도시된 바와 같이, 상승된 CD107alpha, TNFalpha, IFNgamma 및 CM-CSF가 관찰되었다. 도 31은 플레이트 포맷에서 사전 코팅된 BSA와 혼합된 인간 재조합 CD38과 6시간 동안 인큐베이션했을 때 CD38 KO 및 CD38 CAR 발현이 결합된 NK 세포의 상승된 효능을 입증한다.
GDA-601 세포 사멸을 확인하기 위해, GDA-601 세포를 5:1 내지 0:1의 E:T 비율로 다라투무맙의 존재 또는 부재하에 6시간 동안 CFSE-표지된 RPMI 8226 세포와 함께 배양하였다(도 32). 표적 세포를 CFSE 게이팅하고 죽은 세포의 비율을 결정하였다. 대안으로, CFSE 음성 세포를 게이팅하고 죽은 NK 세포(동족 살해)의 비율을 결정하였다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조 시 여기에 참조로 포함되는 것이 구체적이고 개별적으로 언급된 것처럼 그 전체가 참조로 명세서에 포함되는 것이 출원인의 의도이다. 또한, 본 출원의 참고문헌의 인용 또는 식별은 그러한 참고문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 섹션 제목이 사용되는 정도까지는 반드시 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 본 출원의 우선권 문서(들)는 그 전체가 참고로 본 문서에 포함된다.
서열목록
SEQ ID NO 설명 서열 (5’- 3’ 방향)
1 CD38-G5 gRNA 서열 TGTAGACTGCCAAAGTGTAT
2 CD38 정방향 프라이머 CCTGGTAGACTGCATGTTAGACGAG
3 CD38 역방향 프라이머 AGCCCCTTTCCTATCTCTGTATCCC
4 CISH1 GGGTTCCATTACGGCCAGCG
5 CISH-G4 gRNA 서열 (CISH2) GTCCTTTGCTGGCTGTGGAG
6 CISH-G10 gRNA 서열 (CISH3) GTTGGAGTCCAGACGGAAGC
7 CISH 정방향 프라이머 CTGCTTCTGCGTACAAAGGGC
8 CISH 역방향 프라이머 GGACTAACTGAGCCCATGGCTG
9 인간 IL-15 NA seq-
NM_000585.5 (성숙 단백질)		 ATGAGAATTTCGAAACCACATTTGAGAAGTATTTCCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTTCTAAACAGTCATTTTCTAACTGA AGCTGGCATTCATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAAAACAGAAGCCAACTGGGTGAATGTAATAAG TGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGT TGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGAT ACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGT GAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGA
10 인간 IL-15 아미노산 서열-성숙 단백질 NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKE CEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
11 인간 IL-15 아미노산 서
열-성숙 단백질
N72D 변형		 NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKE
CEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
12 인간 IL-15Ra - NM_002189.4 ATGGCCCCGCGGCGGGCGCGCGGCTGCCGGACCCTCGGTCTCCCGGCGCTGCTACTGCTGCTGCTGCTCCGGCCGCCGGC GACGCGGGGCATCACGTGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCA GGGAGCGGTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACGTCCAGCCTGACGGAGTGCGTGTTGAACAAGGCC ACGAATGTCGCCCACTGGACAACCCCCAGTCTCAAATGCATTAGAGACCCTGCCCTGGTTCACCAAAGGCCAGCGCCACCC TCCACAGTAACGACGGCAGGGGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGAAAAGAGCCCGCAGCTTCATCTCC CAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGG AACCACAGAGATAAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCCTCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCAT CCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTGTGGCTATCTCCACGTCCACTGTCCTGC TGTGTGGGCTGAGCGCTGTGTCTCTCCTGGCATGCTACCTCAAGTCAAGGCAAACTCCCCCGCTGGCCAGCGTTGAAATG GAAGCCATGGAGGCTCTGCCGGTGACTTGGGGGACCAGCAGCAGAGATGAAGACTTGGAAAACTGCTCTCACCACCTAT GA
13 인간 IL-15Ra - 성숙 단백질 NA 서열 - Sushi+Exon 3 start ATCACGTGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCAGGGAGCGGTA CATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACGTCCAGCCTGACGGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACGAATGTCG CCCACTGGACAACCCCCAGTCTCAAATGCATTAGAGACCCTGCCCTGGTTCACCAAAGGCCAGCGCCACCC
14 인간 IL-15Ra - 성숙 단백질 AA 서열 - Sushi+Exon 3 start ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPP
15 리더 펩타이드 NA 서열-
항체 카파 경쇄[Mus musculus]. GenBank: AB048522.1		 ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGA
16 리더 펩타이드 AA 서열 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG
17 링커- (Gly4 Ser)5 - NA 서열 GGAGGGGGTGGTAGTGGGGGTGGTGGGAGTGGAGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGGGGCAGCGGAGGGGGTGGTAGT
18 링커 - AA 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
19 짧은 GS 링커 - NA 서열 GGAGGAGGTGGCTCCGGCGGAGGTTCCGGGGGTGGCTCC
20 짧은 GS 링커 - AA 서열 GGGGSGGGSGGGS
21 HLA - 세포외 + 막관통 + 세포질 TCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGAGCTGTGATCACTGGAGCTGTGGTC GCTGCCGTGATGTGGAGGAGGAAGAGCTCAGATAGAAAAGGAGGGAGTTACACTCAGGCTGCAAGCAGTGACAGTGCC CAGGGCTCTGATGTGTCTCTCACAGCTTGTAAAGTGTGA
22 HLA - 세포외 + 막관통 + 세포질-aa- NCBI 참조 서열: NM_001242758. 1 SSQPTIPIVGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKGGSYTQAASSDSAQGSDVSLTACKV
23 전장 막 결합 N72D RLI GDA-301A - NA 서열 ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAAACTGGGTGAATGTA ATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACC CCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTC ATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACGACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAA GAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACT TCTGGAGGGGGTGGTAGTGGGGGTGGTGGGAGTGGAGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGGGGCAGCGGAGGGGGTGGT AGTATCACGTGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCAGGGAGCG GTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACGTCCAGCCTGACGGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACGAATG TCGCCCACTGGACAACCCCCAGTCTCAAATGCATTAGAGACCCTGCCCTGGTTCACCAAAGGCCAGCGCCACCCGGAGGA GGTGGCTCCGGCGGAGGTTCCGGGGGTGGCTCCTCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGT TCTCCTTGGAGCTGTGATCACTGGAGCTGTGGTCGCTGCCGTGATGTGGAGGAGGAAGAGCTCAGATAGAAAAGGAGGG AGTTACACTCAGGCTGCAAGCAGTGACAGTGCCCAGGGCTCTGATGTGTCTCTCACAGCTTGTAAAGTGTGA
24 코돈 최적화- 전장 막 결합 N72D RLI GDA-301A - NA 서열 ATG GAT TTC CAG GTG CAA ATT TTC AGT TTC CTC CTC ATC TCT GCT TCC GTA ATT ATG TCC CGG GGA AAC TGG GTA AAC GTG ATT TCA GAT CTT AAG AAG ATA GAG GAT TTG ATC CAA AGT ATG CAT ATT GAC GCG ACA CTC TAT ACT GAA TCA GAC GTT CAT CCT AGT TGC AAG GTT ACG GCT ATG AAA TGC TTT CTG CTT GAG CTG CAA GTT ATA AGT CTG GAG TCA GGC GAT GCT TCT ATA CAT GAT ACG GTG GAG AAT TTG ATT ATT CTC GCA AAC GAT TCT CTT AGC TCC AAT GGT AAT GTG ACA GAG AGC GGT TGC AAG GAG TGT GAA GAA CTT GAG GAA AAA AAC ATA AAA GAG TTT CTC CAA AGT TTC GTG CAC ATC GTT CAA ATG TTT ATA AAT ACG TCA GGA GGT GGT GGA AGT GGC GGC GGT GGA TCT GGG GGA GGT GGT TCA GGC GGA GGG GGA AGC GGA GGA GGG GGT TCT ATC ACT TGT CCG CCC CCA ATG TCC GTG GAG CAC GCC GAC ATC TGG GTG AAG TCT TAT TCT CTT TAC AGT CGA GAA AGG TAC ATC TGT AAC AGT GGC TTT AAA CGC AAA GCT GGT ACC AGT TCT CTG ACG GAA TGT GTG CTG AAC AAA GCG ACC AAT GTA GCT CAC TGG ACG ACG CCT AGT CTC AAG TGC ATT AGG GAT CCC GCT TTG GTA CAT CAG AGG CCG GCG CCG CCA GGA GGC GGA GGA AGC GGA GGT GGA AGC GGA GGA GGG TCA TCA TCA CAG CCC ACT ATT CCA ATC GTC GGG ATA ATT GCA GGC CTG GTA TTG CTT GGG GCA GTC ATT ACT GGT GCA GTG GTT GCA GCT GTG ATG TGG CGA AGA AAG AGC AGC GAC CGG AAA GGC GGA AGC TAT ACT CAA GCA GCC TCT TCT GAC TCC GCG CAA GGC TCC GAT GTC TCT CTC ACT GCG TGT AAG GTA TGA
25 전장 막 결합 N72D RLI GDA-301A - AA 서열 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVE NLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSV EHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPGGGGSGGGSGGGSSSQ PTIPIVGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKGGSYTQAASSDSAQGSDVSLTACKV*X
26 전장 막 결합 N72D RLI GDA-301B - NA 서열 ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAATCACGTGCCCTCCCC CCATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCAGGGAGCGGTACATTTGTAACTCTGGT TTCAAGCGTAAAGCCGGCACGTCCAGCCTGACGGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACGAATGTCGCCCACTGGACAACCCC CAGTCTCAAATGCATTAGAGACCCTGCCCTGGTTCACCAAAGGCCAGCGCCACCCGGAGGGGGTGGTAGTGGGGGTGGT GGGAGTGGAGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGGGGCAGCGGAGGGGGTGGTAGTAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTT GAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAA GTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTA GAAAATCTGATCATCCTAGCAAACGACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGA ACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTGGAGGAGG TGGCTCCGGCGGAGGTTCCGGGGGTGGCTCCTCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCT CCTTGGAGCTGTGATCACTGGAGCTGTGGTCGCTGCCGTGATGTGGAGGAGGAAGAGCTCAGATAGAAAAGGAGGGAG TTACACTCAGGCTGCAAGCAGTGACAGTGCCCAGGGCTCTGATGTGTCTCTCACAGCTTGTAAAGTGTGA
27 코돈 최적화- 전장 막 결합 N72D RLI GDA-301.B (IDT 코돈 최적화 툴) - NA 서열 ATG GAT TTT CAA GTA CAA ATT TTT AGT TTC CTG CTG ATC AGC GCC TCA GTC ATA ATG TCC AGG GGT ATC ACG TGT CCA CCC CCG ATG TCC GTA GAG CAC GCT GAT ATT TGG GTA AAG TCC TAC TCC CTT TAT TCA AGG GAG CGG TAT ATC TGC AAC AGT GGT TTC AAA CGG AAA GCA GGA ACG TCT AGC TTG ACA GAA TGT GTT CTC AAT AAA GCT ACG AAT GTC GCC CAT TGG ACC ACT CCA TCA CTG AAG TGC ATA CGG GAT CCG GCC CTG GTA CAC CAA CGG CCT GCT CCT CCT GGT GGG GGA GGC TCC GGA GGG GGA GGT TCT GGA GGG GGA GGT AGC GGT GGC GGA GGG TCT GGG GGA GGC GGG TCC AAC TGG GTG AAC GTC ATA TCA GAT TTG AAG AAG ATC GAA GAT CTG ATT CAG TCT ATG CAT ATT GAT GCC ACC CTT TAC ACG GAA AGT GAT GTT CAC CCA AGT TGT AAG GTC ACA GCA ATG AAA TGC TTT TTG CTG GAA CTC CAA GTT ATA TCC CTT GAG AGC GGT GAT GCG AGC ATC CAT GAT ACC GTT GAA AAT TTG ATT ATA CTT GCA AAC GAC AGT TTG AGC TCC AAC GGA AAT GTC ACC GAG TCC GGT TGT AAA GAG TGC GAG GAG CTC GAG GAG AAA AAT ATT AAG GAA TTC CTC CAA TCT TTT GTA CAT ATC GTA CAA ATG TTC ATA AAT ACC AGT GGT GGG GGT GGT TCC GGG GGA GGC TCA GGT GGC GGT AGC TCC AGT CAA CCC ACA ATT CCA ATT GTC GGA ATC ATC GCA GGC TTG GTC TTG CTG GGT GCC GTC ATA ACG GGG GCA GTT GTC GCG GCA GTA ATG TGG CGA AGA AAA TCA TCT GAC CGG AAG GGG GGA TCT TAC ACT CAA GCA GCA AGT TCA GAC TCA GCC CAA GGG TCT GAC GTA TCC TTG ACG GCA TGT AAA GTT TGA
28 전장 막 결합 N72D RLI GDA-301.B- AA 서열 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCI RDPALVHQRPAPPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCF LLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGSGGGSSSQ PTIPIVGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKGGSYTQAASSDSAQGSDVSLTACKV*X
29 항CD38 scFv - NA 서열 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAG AGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGG GCCACTGGCATTCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGA AGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAG GGTCGACTTCCGGTAGCGGCAAATCCTCTGAAGGCAAAGGTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACA GCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTTAACAGCTTTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGC TCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGT ATATTTCTGTGCGAAAGATAAGATTTTATGGTTTGGGGAGCCGGTCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG TCTCCTCA
30 항CD38 scFv - AA 서열 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QQRSNWPPTFGQGTKVEIKGSTSGSGKSSEGKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSS
31 CD28 힌지+막관통+세포질-NA 서열: NCBI 참조 서열-NM_006139.4 ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTT TGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGC TTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACAT GACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCG
32 CD28 - AA 서열 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRR PGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
33 인간 FC-감마 사슬 활성화 도메인 - NA 서열: NCBI NM_004106.2 CAAGTGCGAAAGGCAGCTATAACCAGCTATGAGAAATCAGATGGTGTTTACACGGGCCTGAGCACCAGGAACCAGGAGA CTTACGAGACTCTGAAGCATGAGAAACCACCACAG
34 인간 FC-감마 사슬 활성화 도메인 - AA 서열 QVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ
35 전체 항CD38 CAR - NA 서열 ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGAAATTGTGTTGACG CAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTAC TTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATTCCA GCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTAT TACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGGTCGACTTCCGGTA GCGGCAAATCCTCTGAAGGCAAAGGTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTTAACAGCTTTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGG CTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTGGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGA AAGATAAGATTTTATGGTTTGGGGAGCCGGTCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGTGAAA GGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTG GCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGA CTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGC CTATCGCTCCCAAGTGCGAAAGGCAGCTATAACCAGCTATGAGAAATCAGATGGTGTTTACACGGGCCTGAGCACCAGGA ACCAGGAGACTTACGAGACTCTGAAGCATGAGAAACCACCACAGTAG
36 전체 항CD38 CAR 서열- IDT 코돈 최적화 ATG GAC TTC CAA GTG CAG ATT TTT TCA TTT CTG CTG ATA TCT GCT TCA GTA ATC ATG TCT AGG GGA GAG ATC GTA CTT ACG CAA TCC CCG GCA ACC TTG TCT CTC TCA CCC GGG GAA AGG GCG ACT CTG TCA TGC AGG GCA AGC CAA AGC GTG TCT AGT TAC CTT GCG TGG TAT CAA CAG AAG CCA GGA CAA GCT CCC CGG CTC CTG ATT TAC GAC GCC TCA AAC CGG GCC ACT GGT ATA CCC GCG CGA TTC TCA GGC TCC GGG TCA GGG ACT GAC TTT ACT CTC ACA ATC TCC TCC CTC GAA CCT GAA GAC TTT GCG GTC TAC TAT TGC CAA CAG AGA AGC AAC TGG CCG CCT ACC TTC GGG CAA GGA ACT AAA GTG GAG ATT AAG GGC TCC ACG TCC GGA AGT GGG AAA TCT TCT GAA GGT AAG GGC GAG GTA CAG CTG TTG GAG AGC GGA GGT GGC CTG GTA CAA CCG GGA GGA TCT CTC CGC TTG TCC TGC GCA GTG TCA GGC TTC ACC TTC AAT TCC TTT GCT ATG AGC TGG GTT AGA CAA GCC CCC GGG AAG GGT CTG GAA TGG GTT TCA GCC ATC TCA GGC TCA GGG GGA GGA ACC TAC TAT GCG GAC AGC GTC AAA GGG AGG TTT ACG ATT TCA AGG GAC AAT TCT AAA AAT ACT CTT TAC CTT CAA ATG AAC TCT TTG CGG GCG GAG GAT ACC GCA GTA TAC TTC TGC GCA AAG GAC AAA ATC CTC TGG TTC GGA GAA CCC GTC TTC GAT TAT TGG GGC CAG GGG ACC TTG GTT ACT GTG AGC TCA GTT AAG GGA AAG CAT CTG TGT CCC AGC CCA TTG TTC CCG GGG CCG TCT AAG CCA TTT TGG GTT CTC GTT GTT GTC GGG GGG GTA TTG GCG TGC TAT TCA TTG CTT GTC ACT GTG GCC TTT ATA ATA TTT TGG GTA CGA TCC AAG AGG AGC CGC CTT TTG CAT AGC GAC TAT ATG AAT ATG ACT CCA CGG AGA CCC GGT CCA ACA CGC AAG CAT TAT CAG CCA TAC GCA CCT CCT CGC GAC TTC GCT GCA TAC AGG TCT CAG GTT CGG AAG GCG GCG ATT ACC TCC TAC GAG AAA AGC GAC GGA GTG TAC ACG GGA TTG TCT ACC CGC AAC CAG GAG ACC TAC GAA ACC CTG AAG CAT GAA AAA CCG CCA CAG TAG
37 전체 항CD38 CAR - AA 서열 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGS GSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKGSTSGSGKSSEGKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTF NSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDY WGQGTLVTVSSVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHY QPYAPPRDFAAYRSQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ*X
38 CD28 힌지 서열: NCBI 참조 서열-NM_006139.4 ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTT TGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC
39 CD28 힌지 aa 서열 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
40 CD8 힌지 서열: NCBI 참조 서열: NM_001768.7 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTG CCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
41 CD8 힌지 aa 서열 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
42 CD28 막관통 서열: NCBI 참조 서열-NM_006139.4 TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTG
GCCTTTATTATTTTCTGGGTG
43 CD28 막관통 aa 서열 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
44 CD8 막관통 서열: NCBI 참조 서열: NM_001768.7 ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACC
45 CD8 막관통 aa 서열 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
46 NKG2D 막관통 서열: NCBI 참조 서열: NM_007360.4 CCATTTTTTTTCTGCTGCTTCATCGCTGTAGCCATGGGAATCCGTTTCATTATTATGGTAGCA
47 NKG2D 막관통 aa 서열 PFFFCCFIAVAMGIRFIIMVA
48 CD28 엔도 도메인 서열: NCBI 참조 서열-NM_006139.4 AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTA CCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCG
49 CD28 엔도 도메인 aa 서열 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
50 4-1BB 엔도 도메인 서열: NCBI 참조 서열: NM_001561.6 AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGG CTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
51 4-1BB 엔도 도메인 aa 서열 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
52 2B4 엔도 도메인 서열: NCBI 참조 서열: NM_016382.4 TGGAGGAGAAAGAGGAAGGAGAAGCAGTCAGAGACCAGTCCCAAGGAATTTTTGACAATTTACGAAGATGTCAAGGATC TGAAAACCAGGAGAAATCACGAGCAGGAGCAGACTTTTCCTGGAGGGGGGAGCACCATCTACTCTATGATCCAGTCCCA GTCTTCTGCTCCCACGTCACAAGAACCTGCATATACATTATATTCATTAATTCAGCCTTCCAGGAAGTCTGGATCCAGGAAG AGGAACCACAGCCCTTCCTTCAATAGCACTATCTATGAAGTGATTGGAAAGAGTCAACCTAAAGCCCAGAACCCTGCTCGA TTGAGCCGCAAAGAGCTGGAGAACTTTGATGTTTATTCC
53 2B4 엔도 도메인 aa 서열 WRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPS FNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYS
54 CD3제타 엔도 도메인 서열: NCBI 참조 서열: NM_198053.3 AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAG GACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGG AAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAA GGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
55 CD3 제타 엔도 도메인 aa 서열 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
56 IgE 수용체 Ig의 Fc 단편CER1G): NCBI 참조 서열: NM_004106.2 CAAGTGCGAAAGGCAGCTATAACCAGCTATGAGAAATCAGATGGTGTTTACACGGGCCTGAGCACCAGGAACCAGGAGA CTTACGAGACTCTGAAGCATGAGAAACCACCACAG
57 IgE 수용체 Ig의 Fc 단편 aa 서열 QVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ
58 리더 펩타이드 서열: GenBank: KF419288.1 ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCC
AGAGGA
59 리더 펩타이드리더 펩타이드MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG
60 GDA-501.A: 항-Her2 scFv- CD8힌지-NKG2D TM- 2B4- CD3 제타 전체 서열 코돈 최적화 ATG GAT TTT CAG GTA CAA ATT TTC TCA TTC CTT CTC ATT TCA GCA TCC GTA ATA ATG TCC AGA GGC GAC ATC CAA ATG ACT CAA TCA CCA AGT TCC TTG TCC GCG TCC GTT GGG GAT AGA GTA ACC ATA ACC TGT AGG GCA TCA CAA GAT GTG AAT ACG GCC GTA GCG TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGA AAG GCT CCA AAA CTC CTT ATT TAT TCC GCG AGT TTT CTT TAC AGC GGA GTC CCG AGT AGA TTC TCT GGT TCT CGC TCT GGC ACT GAT TTT ACT CTG ACC ATA AGT TCA CTG CAA CCT GAA GAC TTT GCG ACC TAT TAC TGT CAA CAG CAC TAC ACA ACG CCT CCC ACT TTT GGA CAA GGT ACT AAA GTA GAG ATT AAA CGG ACC GGA TCC ACA AGT GGG AGC GGG AAG CCT GGT TCT GGC GAA GGA TCC GAA GTT CAG CTG GTT GAA TCC GGC GGT GGG TTG GTG CAA CCC GGG GGG AGC CTG CGC CTC AGC TGT GCC GCG AGT GGG TTT AAC ATA AAA GAT ACC TAC ATT CAC TGG GTG CGC CAA GCT CCG GGC AAA GGA CTT GAA TGG GTC GCG AGG ATC TAC CCG ACC AAC GGT TAC ACA AGA TAT GCG GAC TCC GTA AAA GGG CGA TTC ACG ATA TCC GCT GAC ACA TCC AAG AAC ACG GCG TAC TTG CAA ATG AAT TCT CTT AGG GCC GAG GAC ACC GCA GTT TAT TAC TGT AGT CGC TGG GGA GGT GAT GGA TTT TAT GCG ATG GAC GTT TGG GGG CAA GGG ACG CTG GTC ACG GTT TCC AGT GCT GCA ACC ACA ACG CCA GCA CCA AGA CCT CCC ACA CCC GCT CCT ACC ATC GCT TCA CAA CCC CTT TCT CTG CGA CCA GAG GCG TGT AGA CCC GCC GCT GGG GGC GCC GTT CAC ACG AGG GGC CTG GAC TTC GCG TGC GAC CCC TTT TTC TTC TGC TGC TTT ATA GCT GTG GCG ATG GGA ATT CGA TTT ATA ATT ATG GTG GCA TGG AGA CGG AAG CGG AAG GAG AAA CAG TCC GAG ACT AGC CCG AAG GAG TTC TTG ACC ATT TAT GAA GAC GTA AAA GAT TTG AAG ACC CGG CGC AAT CAC GAA CAA GAA CAA ACG TTT CCA GGA GGC GGT AGT ACT ATA TAC TCA ATG ATT CAA AGT CAA TCT TCA GCA CCG ACT TCT CAA GAA CCC GCA TAT ACT CTC TAT AGC CTG ATT CAA CCC TCA CGG AAG TCA GGG AGC AGG AAA AGG AAC CAT TCA CCG AGT TTT AAT TCC ACG ATT TAC GAG GTG ATA GGC AAG AGC CAG CCT AAG GCC CAG AAC CCG GCA AGA TTG TCC CGA AAG GAA CTC GAA AAC TTT GAT GTG TAC TCT AGG GTG AAA TTC AGT CGG TCA GCA GAT GCC CCT GCA TAT CAA CAA GGA CAA AAC CAA CTG TAT AAC GAG CTC AAT CTT GGT CGA CGC GAG GAA TAC GAC GTA CTT GAC AAG AGA AGA GGA AGA GAC CCC GAG ATG GGG GGC AAG CCG CAG CGA AGA AAG AAT CCA CAA GAA GGG CTC TAC AAT GAA CTG CAG AAG GAC AAA ATG GCC GAA GCC TAT TCC GAG ATC GGA ATG AAG GGT GAG CGA AGG CGA GGA AAG GGG CAC GAC GGC CTT TAC CAG GGT CTG TCA ACC GCT ACG AAA GAC ACG TAC GAC GCC CTG CAC ATG CAA GCG CTC CCA CCA CGA TAG
61 GDA-501.A: 항- Her2 scFv-CD8힌지-NKG2D TM- 2B4-CD3zetta 전체 AA 서열 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFS GSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA MDVWGQGTLVTVSSAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAW RRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFN STIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
62 GDA-501.B: 항-Her2 scFv-CD8힌지+TM-4-1BB-CD3zetta 전체 서열 코돈 최적화 ATG GAC TTC CAA GTG CAG ATA TTC TCC TTT CTT CTT ATT TCC GCA TCC GTT ATA ATG AGC AGG GGG GAT ATA CAA ATG ACT CAG TCT CCG TCC TCT CTG AGT GCA TCC GTG GGC GAC CGA GTA ACT ATC ACG TGC CGG GCA TCC CAA GAT GTA AAC ACA GCC GTA GCT TGG TAC CAA CAA AAA CCA GGT AAA GCT CCT AAA TTG CTT ATT TAC TCT GCA AGT TTC TTG TAC AGT GGG GTG CCG TCC CGG TTT AGT GGC TCC AGA AGC GGC ACT GAT TTC ACT CTG ACA ATA TCT TCT CTT CAA CCC GAG GAT TTT GCT ACA TAT TAT TGC CAA CAA CAT TAT ACG ACT CCC CCT ACT TTC GGC CAA GGG ACT AAA GTC GAG ATC AAA CGA ACC GGT TCC ACG TCC GGG TCA GGT AAA CCT GGT TCA GGA GAA GGA TCA GAG GTG CAA TTG GTC GAG AGT GGC GGG GGA TTG GTA CAA CCA GGT GGC AGT CTT AGG CTG TCT TGT GCA GCC TCA GGC TTT AAC ATT AAG GAC ACG TAC ATA CAC TGG GTC CGA CAA GCA CCG GGC AAG GGT CTG GAA TGG GTG GCA CGG ATT TAT CCT ACA AAC GGA TAT ACT CGA TAC GCG GAT TCA GTC AAG GGG CGC TTT ACC ATA AGT GCC GAC ACT AGC AAG AAC ACT GCC TAT CTT CAG ATG AAT TCA TTG AGG GCG GAA GAC ACT GCG GTA TAC TAT TGC TCT AGA TGG GGA GGA GAC GGC TTT TAT GCA ATG GAT GTG TGG GGT CAG GGA ACC CTC GTT ACC GTA TCT TCT GCT GCA ACC ACC ACC CCC GCC CCC CGA CCA CCG ACA CCA GCA CCA ACA ATC GCA TCC CAG CCT TTG TCA TTG AGA CCA GAG GCG TGT AGA CCC GCA GCT GGA GGC GCA GTC CAT ACG CGG GGG CTG GAT TTT GCC TGC GAC ATA TAT ATA TGG GCT CCT CTC GCG GGT ACG TGC GGT GTT TTG CTC CTG TCA CTC GTG ATA ACA AAG CGA GGC CGG AAA AAA TTG CTC TAT ATC TTC AAA CAG CCG TTC ATG CGA CCG GTG CAG ACA ACA CAA GAA GAA GAC GGC TGC AGC TGC AGA TTC CCT GAG GAG GAA GAA GGT GGG TGT GAA TTG AGG GTT AAA TTC TCC CGA AGC GCG GAT GCA CCG GCG TAT CAG CAG GGC CAA AAT CAA CTC TAC AAC GAG CTC AAC CTG GGG CGG CGG GAA GAG TAC GAC GTA CTG GAC AAG CGC CGA GGC AGA GAC CCT GAG ATG GGG GGC AAG CCT CAA AGG CGA AAG AAC CCT CAG GAG GGG CTT TAC AAC GAG CTC CAA AAG GAC AAG ATG GCG GAG GCC TAT TCA GAA ATC GGC ATG AAA GGC GAA CGA AGG AGA GGT AAA GGA CAC GAC GGG CTG TAT CAG GGT TTG AGT ACT GCA ACA AAG GAT ACC TAC GAC GCT CTC CAC ATG CAA GCG CTG CCC CCA AGG TAG
63 GDA-501.B: 항-Her2 scFv-CD8힌지+TM-4- 1BB-CD3zetta 전체 AA 서열 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFS GSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA MDVWGQGTLVTVSSAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRG RKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
64 GDA-501.C: 항-Her2 scFv-CD28힌지-TM-Cy-CD3zetta 전체 서열 코돈 최적화 ATG GAT TTT CAG GTA CAG ATT TTC TCT TTT CTT CTT ATA AGC GCG TCT GTG ATC ATG AGT CGG GGC GAT ATA CAG ATG ACC CAA AGC CCT TCC TCA CTG TCA GCG AGC GTA GGA GAT AGG GTG ACC ATC ACA TGC AGG GCG AGC CAA GAT GTG AAC ACA GCC GTA GCT TGG TAT CAG CAA AAG CCA GGC AAG GCT CCC AAA CTG CTG ATA TAT TCT GCT AGC TTT CTG TAT TCC GGT GTA CCC AGC AGG TTC AGC GGC TCC AGA AGT GGA ACC GAC TTC ACT CTG ACA ATC AGT AGC CTT CAA CCA GAA GAT TTC GCA ACG TAC TAC TGT CAA CAA CAT TAC ACG ACG CCC CCA ACC TTC GGG CAA GGA ACG AAA GTT GAG ATA AAA AGG ACC GGC AGC ACC TCC GGA AGC GGG AAG CCA GGA TCC GGG GAG GGT TCC GAG GTG CAA CTC GTC GAG TCA GGT GGC GGT CTC GTG CAA CCA GGA GGC TCC CTG CGG CTC TCT TGT GCG GCT AGT GGA TTT AAT ATA AAA GAT ACC TAT ATT CAC TGG GTG CGC CAA GCA CCT GGA AAA GGG CTG GAG TGG GTC GCC AGG ATA TAT CCG ACA AAT GGA TAC ACA CGG TAT GCG GAC AGT GTT AAA GGC AGG TTC ACA ATT AGC GCA GAC ACG AGC AAG AAT ACA GCC TAT CTT CAG ATG AAT TCT CTC AGG GCT GAA GAT ACT GCA GTC TAC TAT TGC TCT AGG TGG GGT GGT GAC GGC TTT TAC GCT ATG GAT GTC TGG GGG CAG GGC ACT CTG GTT ACT GTC AGC TCT GCG ATA GAA GTC ATG TAC CCT CCG CCG TAT CTT GAC AAT GAG AAG TCT AAT GGG ACA ATC ATA CAC GTG AAA GGC AAG CAC TTG TGC CCC TCT CCC CTG TTC CCC GGC CCT AGT AAA CCG TTC TGG GTG CTC GTA GTG GTC GGT GGA GTT CTT GCC TGT TAT AGT TTG TTG GTA ACC GTC GCG TTT ATA ATA TTC TGG GTC CGG TCC AAG AGA AGC CGC CTC CTG CAT TCC GAT TAC ATG AAC ATG ACC CCA CGG AGG CCC GGC CCT ACA CGG AAG CAT TAC CAG CCA TAC GCT CCG CCT CGA GAT TTT GCT GCT TAT AGG TCA CGA GTA AAG TTT AGT AGA TCC GCT GAC GCC CCT GCC TAC CAG CAG GGT CAG AAT CAG CTC TAC AAT GAA CTG AAC TTG GGC AGG CGA GAA GAG TAT GAC GTT CTC GAC AAG CGA AGG GGG AGA GAT CCC GAA ATG GGT GGT AAA CCA CAA AGA CGC AAG AAT CCT CAG GAA GGA TTG TAC AAC GAG CTC CAA AAG GAT AAG ATG GCG GAA GCA TAT TCC GAA ATT GGG ATG AAG GGC GAG CGA AGG CGG GGC AAA GGA CAC GAC GGC CTT TAT CAA GGA CTG TCT ACG GCT ACT AAA GAC ACT TAT GAT GCG CTG CAC ATG CAA GCA TTG CCG CCG AGA TAG
65 GDA-501.C: 항-Her2 scFv-CD28힌지-TM-Cy-CD3zetta 전체 서열 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFS
GSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA
MDVWGQGTLVTVSSAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSK
RSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE
MGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
66 GDA-501.D: 항-Her2 scFv-CD8힌지+TM-2B4-CD3zetta 전체 서열 코돈 최적화 ATG GAT TTC CAA GTC CAA ATC TTT AGT TTT TTG CTT ATT TCA GCC TCC GTC ATT ATG AGT AGA GGG GAT ATA
CAA ATG ACC CAG TCC CCT AGT AGC CTG AGC GCA AGC GTT GGA GAC CGG GTA ACC ATA ACA TGT AGG GCT
AGC CAG GAC GTT AAT ACA GCC GTT GCG TGG TAT CAG CAA AAA CCG GGC AAA GCA CCT AAA CTC CTG ATC
TAT AGC GCC TCA TTC CTG TAT AGC GGC GTC CCT AGT CGA TTC TCA GGA AGT AGA TCT GGT ACT GAC TTC ACG
TTG ACC ATA TCC TCA CTC CAA CCC GAG GAC TTC GCA ACA TAT TAT TGC CAG CAG CAC TAT ACC ACG CCG CCG
ACG TTC GGG CAA GGG ACC AAA GTC GAA ATT AAG AGA ACA GGG TCT ACG AGT GGC AGT GGT AAA CCC GGT
TCC GGC GAG GGG TCC GAA GTG CAA TTG GTG GAA TCT GGA GGG GGT CTC GTA CAA CCG GGG GGC TCC CTT
AGA CTC AGT TGT GCC GCG AGC GGC TTC AAT ATT AAG GAC ACT TAT ATC CAT TGG GTT CGG CAA GCT CCC
GGC AAG GGT CTT GAA TGG GTA GCA CGC ATA TAC CCG ACA AAT GGA TAC ACG CGG TAC GCG GAT AGT GTC
AAG GGT AGG TTT ACC ATA TCT GCG GAC ACG TCC AAA AAC ACC GCC TAC CTT CAG ATG AAT TCC CTC CGC GCT
GAA GAC ACT GCG GTG TAT TAC TGC AGC CGC TGG GGC GGG GAT GGG TTT TAC GCC ATG GAT GTG TGG GGT
CAG GGT ACA CTC GTA ACT GTG AGC AGC GCC ACC ACG ACG CCC GCA CCG AGG CCA CCG ACT CCA GCA CCC
ACT ATC GCT TCT CAA CCT CTG TCA CTG CGC CCT GAA GCC TGT CGG CCT GCG GCC GGG GGA GCG GTT CAT
ACG CGG GGG CTG GAT TTC GCT TGC GAC ATT TAT ATA TGG GCA CCC CTC GCG GGT ACA TGT GGC GTC CTC
TTG CTG AGT CTC GTA ATT ACG TGG AGA CGA AAG AGG AAA GAG AAG CAG TCT GAA ACT AGC CCT AAG GAG
TTC CTT ACT ATA TAT GAG GAT GTT AAA GAT CTG AAA ACC CGA AGA AAC CAT GAA CAG GAA CAA ACT TTC CCT
GGC GGG GGA AGT ACG ATT TAC AGC ATG ATC CAA TCT CAG TCA AGT GCG CCA ACC AGT CAA GAA CCT GCG
TAT ACA TTG TAT TCC CTC ATT CAG CCA TCT AGG AAA AGC GGT TCA CGC AAA AGG AAC CAT AGC CCT TCT TTC
AAT TCA ACC ATC TAT GAA GTT ATT GGT AAA AGT CAA CCT AAA GCG CAA AAT CCG GCG CGA CTT AGC CGC
AAA GAA CTC GAA AAC TTC GAT GTA TAC AGT CGG GTA AAA TTC TCT CGC AGT GCC GAT GCG CCT GCC TAC
CAG CAG GGA CAG AAT CAG TTG TAC AAC GAA CTG AAC CTC GGC CGA AGA GAG GAG TAT GAT GTT CTT GAT
AAG CGG AGG GGC AGA GAT CCC GAG ATG GGT GGG AAG CCA CAA AGA CGA AAA AAT CCT CAG GAG GGA CTG
TAC AAT GAA CTT CAA AAA GAC AAG ATG GCT GAA GCC TAC TCT GAG ATT GGG ATG AAA GGT GAG CGC CGA
AGG GGA AAG GGC CAC GAC GGC TTG TAT CAA GGA CTG TCC ACC GCC ACT AAA GAT ACG TAC GAT GCC TTG
CAT ATG CAA GCC CTT CCT CCA CGC TAG
67 GDA-501.D: 항-Her2 scFv-CD8힌지+TM-2B4-CD3zetta 전체 AA 서열 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFS GSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA
MDVWGQGTLVTVSSATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITWRR KRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTI YEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRK
NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
68 CXCR4R334X 전체 서열 코돈 최적화 ATG GAG GGT ATT TCA ATT TAT ACC TCC GAC AAT TAC ACG GAG GAA ATG GGA AGT GGA GAT TAC GAC TCC ATG AAA GAG CCA TGC TTT AGG GAA GAG AAC GCC AAC TTT AAT AAG ATC TTT CTC CCG ACA ATT TAT TCT ATT ATC TTC CTC ACC GGC ATT GTC GGA AAT GGT CTT GTT ATT CTT GTT ATG GGC TAT CAA AAG AAA CTT CGA TCT ATG ACT GAT AAG TAC AGG CTT CAC CTC AGT GTC GCC GAT CTG TTG TTT GTA ATA ACT CTT CCG TTT TGG GCG GTA GAT GCC GTT GCT AAC TGG TAC TTC GGT AAC TTC CTT TGT AAA GCT GTA CAT GTC ATT TAC ACA GTT AAT CTG TAT AGC AGC GTG CTG ATA CTG GCG TTT ATT TCA CTG GAC CGC TAC CTC GCC ATC GTT CAC GCC ACG AAT AGT CAG CGA CCG CGG AAG CTC TTG GCC GAG AAG GTT GTG TAC GTG GGC GTG TGG ATT CCC GCT CTG CTC TTG ACA ATT CCC GAC TTC ATA TTT GCC AAT GTG AGC GAA GCC GAT GAT CGC TAC ATC TGT GAT AGA TTC TAT CCG AAT GAT TTG TGG GTA GTA GTT TTT CAA TTC CAA CAC ATC ATG GTG GGC CTG ATC TTG CCG GGA ATC GTA ATC CTG AGT TGT TAC TGC ATT ATT ATC TCT AAG TTG TCC CAC TCA AAG GGC CAT CAG AAG CGC AAG GCG TTG AAG ACG ACT GTT ATA CTC ATA TTG GCA TTC TTT GCC TGT TGG CTG CCT TAC TAT ATT GGG ATA TCT ATA GAT TCT TTC ATA CTC CTG GAG ATC ATA AAG CAG GGA TGT GAA TTT GAA AAT ACT GTA CAT AAG TGG ATT TCC ATA ACT GAA GCG CTT GCG TTC TTT CAT TGT TGT CTG AAT CCA ATT CTC TAT GCG TTT CTG GGG GCA AAA TTT AAA ACC TCA GCG CAA CAT GCA CTG ACC AGT GTA TCA CGG GGC TCT AGC CTT AAA ATA CTT TCC AAA GGC AAG TAA
69 CXCR4R334X 아미노산 서열 MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKX

Claims (46)

  1. 복수의 자연 살해(NK) 세포를 포함하는 유핵 세포 집단으로서, 상기 집단은 적어도 1.0 x 106의 유핵 세포를 포함하고, 집단 내 NK 세포의 적어도 약 70%는 생존 가능하며, 수용체 링커 IL-15를 발현하되,
    집단 내 세포의 적어도 약 70%는 CD56+이고;
    집단 내 세포의 약 0.5% 이하는 CD3+이며;
    집단 내 세포의 약 10% 이하는 CD19+이고;
    집단 내 세포의 약 10% 이하는 CD14+이며;
    집단 내 세포의 약 40% 이하는 LAG3+이고;
    집단 내 세포의 적어도 약 50%는 CD122+이며;
    집단 내 세포의 약 60% 이하는 NKG2A+이고;
    집단 내 세포의 약 20% 이하는 TIGIT+이며; 및
    집단 내 세포의 적어도 50%는 NKp30+인 유핵 세포 집단.
  2. 제1항에 있어서,
    수용체 링커 IL-15는 SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 28인 유핵 세포 집단.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    수용체 링커 IL-15를 발현하는 NK 세포의 적어도 약 75%는 CISH를 발현하지 않는 유핵 세포 집단.
  4. 복수의 NK 세포를 포함하는 유핵 세포 집단으로서, 상기 집단은 적어도 1.0 x 106의 유핵 세포를 포함하고, 집단 내 NK 세포의 적어도 약 70%는 생존 가능하며, 항-CD38 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하되,
    집단 내 세포의 적어도 약 70%는 CD56+이고;
    집단 내 세포의 약 0.5% 이하는 CD3+이며;
    집단 내 세포의 약 10% 이하는 CD19+이고;
    집단 내 세포의 약 10% 이하는 CD14+이며; 및
    집단 내 세포의 약 15% 이하는 CD38+인 유핵 세포 집단.
  5. 제4항에 있어서,
    집단 내 세포의 약 5% 이하는 CD38+인 유핵 세포 집단.
  6. 제4항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    집단 내 세포의 약 1% 이하는 CD38+인 유핵 세포 집단.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR은 항-CD38 scFv를 포함하는 유핵 세포 집단.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR은 CD28 및 CD8로부터 선택된 힌지 도메인을 포함하는 유핵 세포 집단.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR은 CD28, CD8 및 NKG2D로부터 선택된 막관통 도메인을 포함하는 유핵 세포 집단.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR은 CD28, 4-1BB, 2B4, CD3zetaR, OX40, Lsk, ICOS, DAP10 및 IgE 수용체 Ig의 Fc 단편으로부터 선택된 보조자극 도메인을 포함하는 유핵 세포 집단.
  11. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR은 CD3ζ, FcR-γ 및 Fc-epsilon-R로부터 선택되는 활성화 도메인을 포함하는 유핵 세포 집단.
  12. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR은 신호 펩타이드를 포함하는 유핵 세포 집단.
  13. 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR은 SEQ ID NO: 31 및 SEQ ID NO: 32로부터 선택되는 유핵 세포 집단.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    수용체 링커 IL-15 또는 항 CD38 CAR을 발현하는 세포는 돌연변이 케모카인 수용체를 더 포함하는 유핵 세포 집단.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이 케모카인 수용체는 SEQ ID NO: 69인 유핵 세포 집단.
  16. (a) 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 NK 세포 집단을 얻기 위해 NK 세포 집단에서 목적 유전자의 발현을 하향조절하는 단계;
    (b) 엑스 비보(ex vivo) 확장된 NK 세포 집단을 얻기 위해 목적 유전자를 하향조절하도록 유전자 변형된 상기 NK 세포 집단을 확장시키는 단계; 및
    (c) 상기 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단에서 적어도 하나의 막 결합 단백질의 발현을 상향조절하여 유전자 변형된 NK 세포를 생산하는 단계를
    포함하는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 자연 살해(NK) 세포의 엑스 비보 생산 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 하나 이상의 막 결합 단백질을 발현하는 자연 살해(NK) 세포의 엑스 비보(ex vivo) 생산 방법으로서,
    (a) 다음을 포함하는 방법에 의해 NK 세포 집단을 확장시키는 단계:
    (i) 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 상기 NK 세포 집단을 배양하되, 상기 조건은 유효량의 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 제공하는 것을 포함하는 단계; 및
    (ii) 단계 (i) 이후 5-10일에 유효량의 신선한 영양소, 혈청, IL-15 및 니코틴아미드를 상기 NK 세포 집단에 보충하여 확장된 NK 세포를 생산하는 단계;
    엑스 비보 확장된 NK 세포 집단을 얻기 위해, 및
    (b) 상기 엑스 비보 확장된 NK 세포 집단에서 적어도 하나의 막 결합 단백질의 발현을 상향조절하여 적어도 하나의 막 결합 단백질을 발현하는 NK 세포를 생산하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 NK 세포 집단은 제대혈, 말초 혈액, 골수, CD34+ 세포 또는 iPSC로부터 유래되는 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포 집단은 CD3+ 세포가 결핍되어 있는 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포 집단은 CD3-CD56+ 세포를 포함하는 방법.
  21. 제16항 또는 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하향조절은 유전자 편집 시스템에 의해 달성되는 방법.
  22. 제16항 또는 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포는 배양물 내에 존재하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 하향조절은 상기 배양 개시로부터 24-72에 동안 달성되는 방법.
  24. 제16항 또는 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목적 유전자는 그 산물이 상기 NK 세포의 증식 및/또는 생존에 영향을 미치는 유전자를 포함하는 방법.
  25. 제16항 또는 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목적 유전자는 CISH, TGFβ 수용체 및 CD38로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  26. 제16항 또는 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포 집단의 상기 확장은 세포 증식을 허용하는 조건 하에서 달성되되, 상기 조건은 유효량의 영양소, 혈청, 성장 인자 및 니코틴아미드를 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 성장 인자는 IL-15, IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, SCF 및 FLT3으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성장 인자를 포함하는 방법.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 니코틴아미드의 유효량은 1.0 mM 내지 10 mM의 양을 포함하는 방법.
  29. 제16항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포 집단의 상기 확장은 피더 세포(feeder) 또는 피더 층의 존재 하에서 달성되는 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 피더 세포는 방사선 조사된 세포를 포함하는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    상기 피더 세포는 T 세포 또는 PBMC를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    CD3 작용제를 더 포함하는 방법.
  33. 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포 집단의 상기 확장은 14-16일 동안 달성되는 방법.
  34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 막 결합 단백질 발현의 상기 상향조절은 배양 개시로부터 12-14일에 달성되는 방법.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 막 결합 단백질 발현의 상기 상향조절은 mRNA 전기천공에 의해 달성되는 방법.
  36. 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 막 결합 단백질은 일시적으로 발현되는 방법.
  37. 제16항 내지 제36항 중 어느 한 항의 방법에 따라 얻을 수 있는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 분리된 NK 세포 집단.
  38. 제37항의 분리된 NK 세포 집단 및 약학적 활성 담체를 포함하는 약학 조성물.
  39. 치료적 유효량의 제38항의 분리된 NK 세포 집단을 대상체에게 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 질병의 치료 방법.
  40. 이를 필요로 하는 대상체에서 질병을 치료하는데 사용하기 위한 치료적 유효량의 제38항의 분리된 NK 세포 집단.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서,
    질병은 악성 질병, 바이러스 질병, 세균 질병, 진균 질병, 원생동물 질병 및 기생충 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
  42. 제40항에 있어서,
    상기 악성 질병은 고형 종양 또는 종양 전이인 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 악성 질병은 유방암, 난소암, 방광암, 췌장암, 위암, 폐암, 흑색종, 육종, 신경모세포종, 대장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 식도암, 윤활막세포암, 자궁암, 신경교종 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
  44. 제42항에 있어서,
    상기 악성 질병은 혈액암인 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 혈액암은 백혈병, 림프종 또는 다발성 골수종을 포함하는 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
  46. 제39항 또는 제41항 내지 제45항, 또는 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체는 인간 대상체인 방법 또는 분리된 NK 세포 집단.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117721079A (zh) * 2024-01-26 2024-03-19 广东壹加再生医学研究院有限公司 一种促进nk细胞抗肿瘤活性的培养基及培养方法

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1706803A (en) 1928-02-10 1929-03-26 Kenneth F Middour Ash pit
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
CA2006008C (en) 1988-12-20 2000-02-15 Donald J. Kessler Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex dna molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US6933286B2 (en) 1991-03-19 2005-08-23 R. Martin Emanuele Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof
US20020123476A1 (en) 1991-03-19 2002-09-05 Emanuele R. Martin Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
US5721138A (en) 1992-12-15 1998-02-24 Sandford University Apolipoprotein(A) promoter and regulatory sequence constructs and methods of use
AU1908395A (en) 1994-01-28 1995-08-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Antibodies to mammalian natural killer antigens and uses
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
US6992176B2 (en) 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
JP5937292B2 (ja) 2005-10-18 2016-06-22 デューク大学 配列特異性およびｄｎａ−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ
US8361473B2 (en) 2007-03-29 2013-01-29 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibodies and their uses for diagnosis and treatment of cytomegalovirus infection and associated diseases
US8747855B2 (en) 2008-04-09 2014-06-10 Technion Research & Development Foundation Limited Anti human immunodeficiency antibodies and uses thereof
EP2297200A1 (en) 2008-04-09 2011-03-23 Technion Research & Development Foundation Ltd. Anti influenza antibodies and uses thereof
ES2627910T3 (es) 2009-12-29 2017-08-01 Gamida-Cell Ltd. Métodos para potenciar la proliferación y la actividad de células destructoras naturales
JP2013535963A (ja) 2010-07-15 2013-09-19 テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド Ｍｈｃクラスｉｉと糖尿病関連自己抗原性ペプチドとの天然型複合体に対するｔ細胞受容体様特異性を有する単離された高親和性実体
US9165756B2 (en) 2011-06-08 2015-10-20 Xenex Disinfection Services, Llc Ultraviolet discharge lamp apparatuses with one or more reflectors
GB201807944D0 (en) * 2018-05-16 2018-06-27 Ospedale San Raffaele Srl Compositions and methods for haematopoietic stem cell transplantation
KR102261407B1 (ko) * 2018-10-10 2021-06-08 한국화학연구원 Hvem을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체
KR20210033436A (ko) * 2019-09-18 2021-03-26 주식회사 에스엘바이젠 신규 키메라 항원 수용체 암호화 유전자가 형질도입된 유전자 변형 nk 세포주 및 그의 용도
KR20220106803A (ko) * 2019-11-27 2022-07-29 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 Nk 세포에 대한 대규모 조합형 car 형질도입 및 crispr 유전자 편집

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