CN101754978A - 与肿瘤转移的新生血管相关的纤维蛋白原的ed-a抗原 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种结合纤连蛋白的额外结构域(ED-A)同种型的结合成员，用于检测和治疗肺癌和淋巴瘤。

Description

与肿瘤转移的新生血管相关的纤维蛋白原的ED-A抗原
技术领域
本发明涉及肺癌的检测和治疗。本发明还涉及淋巴瘤的检测和治疗。本发明包括结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员，尤其是结合纤连蛋白的ED-A结构域的结合成员的应用。
背景技术
血管发生描述从已有的血管生长新的血管，在成人中很少发生，但是是多种疾病，包括实体瘤的生长，的典型特征。对于肿瘤来说，血管发生必须是直径生长超过几毫米，肿瘤可以通过分泌各种生长因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)来诱导血管发生。由血管发生导致形成的新血管被称为肿瘤新生血管，旺盛的新生血管是恶性肿瘤的特征。
纤连蛋白(FN)是在各种正常组织和体液中广泛表达的糖蛋白。它是细胞外基质(ECM)的成分，在多种生物进程中起作用，包括细胞黏附、细胞迁移、瘀血、血栓症、伤口愈合、组织分化和致癌性转化。
通过初级转录本FN pre-iriRNA的三个区(ED-A、ED-B、HICS)的选择性剪接产生不同的FN同种型，一个通过细胞因子和胞外pH调节的过程(Balza 1988；Carnemolla 1989；Borsi 1990；Borsi 1995)。纤连蛋白包含可进行选择性剪接的两种类型III球状额外结构域：ED-A和ED-B(ffrench-Constant 1995、Hynes 1990、  Kaspar et al.2006)。小鼠纤连蛋白和人纤连蛋白的ED-A是96.7％相同的(在两个90个氨基酸的序列中只有3个氨基酸不同，见图2)。
已报道了纤连蛋白ED-A在肿瘤细胞和实体肿瘤中的表达，在乳腺癌(Jacobs et al.2002、Matsumoto et al.1999)和肝癌(Oyama et al.1989、Tavian et al.1994)中以mRNA水平，和在纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和黑素瘤中以分离蛋白质的水平(Borsi et al.1987)。
在免疫组织化学水平上，已在牙源性肿瘤(Heikinheimo et al.1991)和肝细胞癌(Koukoulis et al.1995)的细胞外基质中检测到了ED-A的存在。相比之下，在恶性乳腺肿瘤(Koukoulis et al.1993)的基质中，在分化良好的肾细胞癌(Lohi et al.1995)的血管和基底膜中检测到了ED-A。但是，在分化较少的肾细胞癌(Lohi et al.1995)和甲状腺乳头状癌(Scarpino et al.1999)中，在血管中、基底膜和肿瘤基质中检测到了ED-A。也已报道了ED-A在神经胶质瘤的脉管系统中的存在(Borsi et al.1998)。因此，不同类型肿瘤的ED-A的表达形式是高度可变的。
本文中显示了ED-A在肺肿瘤，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌的肿瘤，的新生血管中选择性表达。因为对于静脉给药的治疗剂，肿瘤血管是容易接触的(Neri and Bicknell 2005，Rybak et al.2006，Thorpe 2004，Trachsel and Neri 2006)，结合分子，如结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的抗体分子，代表了新型制剂，其可以被用于治疗肺癌，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌的药物的制备。
此外，在本文中显示了ED-A在淋巴瘤的新生血管中选择性表达。因为，对于静脉给药的治疗剂，血管是容易接触的(Neri andBicknell 2005，Rybak et al.2006，Thorpe 2004，Trachsel and Neri2006)，结合分子，如结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的抗体分子代表了新型制剂，其可以被用于治疗淋巴瘤的药物的制备。
肿瘤新生血管(肿瘤血管靶向)治疗是用于治疗肿瘤的有前途的方法。肿瘤细胞靶向的目的在于在肿瘤自身内部破坏血管，减少血流从而剥夺肿瘤的氧气和营养，造成肿瘤细胞死亡。
发明内容
本文中提供了抗-ED-A抗体，其选择性地识别肺肿瘤(包括小细胞肺肿瘤和非小细胞肺肿瘤)的新生血管。
本文还提供了抗ED-A抗体，其选择性地识别淋巴瘤的新生血管。
本发明提供了结合纤连蛋白(或称“纤维连接蛋白”)的额外结构域-A(ED-A)同种型(A-FN)的结合成员例如抗体分子在制备治疗肺癌的药物中的应用。本发明还提供了结合纤连蛋白的ED-A的结合成员例如抗体分子在用于制备治疗肺癌的药物的应用。
本发明提供了结合纤连蛋白的额外结构域-A(ED-A)同种型(A-FN)的结合成员例如抗体分子在用于制备治疗淋巴瘤的药物中的应用。本发明还提供了结合纤连蛋白的ED-A的结合成员例如抗体分子在用于制备治疗淋巴瘤的药物中的应用。
本发明还提供了结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员例如抗体分子的应用，用于将结合到该结合成员的分子递呈到肺肿瘤的新生血管。本发明还提供了结合纤连蛋白的ED-A的结合成员例如抗体分子的应用，用于将结合到该结合成员的分子递呈到肺肿瘤的新生血管。该结合成员可被用于制造用于递呈这种分子的药物。
本发明还提供了结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员例如抗体分子的应用，用于将结合到该结合成员的分子递呈到淋巴瘤的新生血管。本发明还提供了结合纤连蛋白的ED-A的结合成员例如抗体分子的应用，用于将结合到该结合成员的分子递呈到淋巴瘤的新生血管。该结合成员可被用于制造用于递呈这种分子的药物。
本发明提供了结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员例如抗体分子在用于制造在肺癌诊断中使用的诊断产品中的应用。本发明还提供了结合纤连蛋白的ED-A的结合成员例如抗体分子在制造用于肺癌诊断的诊断产品中的应用。
本发明提供了结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员例如抗体分子在用于制造在淋巴瘤断中使用的诊断产品中的应用。本发明还提供了结合纤连蛋白的ED-A的结合成员，例如抗体分子，在制造用于淋巴瘤诊断的诊断产品中的应用。
本发明还提供了检测和诊断人和动物的肺癌的方法，其包含以下步骤：
(a)将结合纤连蛋白的ED-A的结合成员，例如抗体分子，给药于人和动物，和
(b)确定该结合成员在人和动物体的肺中是否存在；其中该结合成员在肺中的定位显示了肺癌的存在。
本发明还提供了检测和诊断人和动物的淋巴瘤的方法，其包含以下步骤：
(a)将结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员，例如抗体分子，给药于人和动物，和
(b)确定该结合成员在人和动物体的淋巴系统中是否存在；其中该结合成员在淋巴系统中的定位显示了淋巴瘤的存在。
本发明提供了治疗个体的肺癌的方法，包括将治疗有效量的包含了结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员例如抗体分子的药物给药于个体。本发明还提供了治疗个体的肺癌的方法，包含将治疗有效量的包含了结合纤连蛋白的ED-A的结合成员，例如抗体分子，的药物给药于个体。
本发明提供了治疗个体的淋巴瘤的方法，包括将治疗有效量的包含了结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员例如抗体分子的药物给药于个体。本发明还提供了治疗个体的淋巴瘤的方法，包括将治疗有效量的包含了结合纤连蛋白的ED-A的结合成员例如抗体分子的药物给药于个体。
本发明提供了将分子递呈给人或动物的肺肿瘤新生血管的方法，包括将结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员，例如抗体分子，给药于人或动物，其中该结合成员连接该分子。本发明还提供了将分子递呈给人或动物的肺肿瘤新生血管的方法，包括将结合纤连蛋白的ED-A的结合成员，例如抗体分子，给药于人或动物，其中该结合成员连接(conjugate)该分子。
本发明提供了将分子递呈给人或动物的淋巴瘤新生血管的方法，包括将结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员，例如抗体分子，给药于人或动物，其中该结合成员连接该分子。本发明还提供了将分子递呈给人或动物的淋巴瘤新生血管的方法，包括将结合纤连蛋白的ED-A的结合成员，例如抗体分子，给药于人或动物，其中该结合成员连接该分子。
用于本发明的结合成员可以是结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的抗体，包含抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9或其变异体的一个或多个互补决定区(CDR)。优选，用于本发明的结合成员是结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的抗体，包含B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9或其变异体的一个或多个互补决定区(CDR)。最优选，用于本发明的结合成员是结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的抗体，包含抗体F8或其变异体的一个或多个互补决定区(CDR)。
用于本发明的结合成员可以包含抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的一组H和/或L CDR，或抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的一组H和/或L CDR，并且在公开的H和/或L CDR组中具有10个或更少，如一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代。优选，用于本发明的结合成员包含抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9的一组H和/或L CDR，并且在所公开的H和/或L CDR组中具有10个或更少，如一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代。优选，用于本发明的结合成员包含抗体F8的一组H和/或L CDR，并且在所公开的H和/或L CDR组中具有10个或更少，如一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代。
可能在CDR组中的任何残基上潜在地进行取代，可能在CDR 1、CDR2和/或CDR3中。
例如，本发明中使用的结合成员可以包含如本文所描述的一个或多个CDR，例如CDR3，并且可选地还有CDR1和CDR2从而形成一组CDR。
用于本发明的结合成员还包含抗体分子，例如，人抗体分子。该结合成员通常包含抗体VH和/或VL域。还提供结合成员的VH域用于本发明。在每个VH和VL域中是互补决定区(CDR)和构架区(FR)。VH域包含一组HCDR，V1域包含一组LCDR。抗体分子可以包含含有VH CDR1、CDR2和CDR3和构架的抗体VH域。它可替换地或者还包含含有VL CDR1、CDR2和CDR3和构架的抗体VL域。在本文描述了抗体 1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9的VH和VL域和CDR。本文中公开的所有VH和VL序列、CDR序列、CDR组和HCDR组和LCDR组代表了用于本发明的结合成员的实施例。如本文中所描述的，“CDR组”(或称“一组CDR”)包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，一组HCDR(或称“HCDR组”)是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，一组LCDR(或称“LCDR组”)是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有说明，“CDR组”包括HCDR和LCDR。
在本发明中使用的结合成员可包括包含了互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3和构架的抗体VH域，其中HCDR1是SEQ ID NO：3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113，其中可选地，HCDR2是SEQ ID NO：4和/或HCDR3是SEQ ID NO：5。优选，HCDR1是SEQ ID NO：23、33、43、53、73、83或103。最优选，HCDR1是SEQ ID NO：83。
通常，VH域与VL域配对从而提供抗体抗原结合位点，尽管如下文中进一步讨论的可单独使用VH或VL域来结合抗原。因此，用于本发明的结合成员还可以包括包含了互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3和构架的抗体VL域，其中LCDR 1是SEQ ID NO：6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116，其中可选地，LCDR2是SEQ ID NO：7和/或LCDR3是SEQ ID NO：8。优选，LCDR1是SEQ ID NO：26、36、46、56、76、86或106。最优选，LCDR1是SEQ ID NO：86。
用于本发明的结合成员可以为纤连蛋白的ED-A的分离的抗体分子，包含VH域和VL域，其中VH域包含构架和一组互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中VL域包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3和构架，其中HCDR 1具有氨基酸序列SEQ ID NO：3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113，
HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：4，
HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：5，
LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116；
LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：7；和
LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：8。
抗体的一个或多个CDR或一组CDR可以被移植到一个构架中(例如，人构架)从而产生用于本发明的抗体分子。构架区可以包含人种系基因片段序列。因此，构架可以为种系，由此构架中的一个或多个残基可以被改变从而匹配最相似的人种系构架中的等效位置的残基。用于本发明的结合成员可为具有包含在人种系构架(例如DP47)中的一组HCDR的VH域的分离的抗体分子。通常，该结合成员还具有包含在人种系构架中的一组LCDR的VL域的分离的抗体分子。VL域的人种系构架可以为DPK22。
用于本发明的VH域可以具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。优选，用于本发明的VH域具有氨基酸序列SEQ ID NO：21、31、41、51、71、81或101。最优选，用于本发明的VH域具有氨基酸序列SEQ ID NO：81。用于本发明的VL域可以具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。优选，用于本发明的VL域具有氨基酸序列SEQ ID NO：22、32、42、52、72、82或102。最优选，用于本发明的VL域具有氨基酸序列SEQ ID NO：82。
用于本发明的结合成员可以为单链Fv(scFv)，包含通过连接肽(或肽连接子)连接的VH域和V1域。技术人员可以选择合适长度和序列的连接(子)，例如至少5或10个氨基酸的长度，达到约15、20或25个氨基酸的长度。该连接(子)可以具有氨基酸序列GSSGG(SEQ ID NO：28)。scFv可以由氨基酸序列SEQ ID NO：9组成或包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。
或者，用于本发明的结合成员可在非抗体分子中包含抗原结合位点，通常通过在非抗体蛋白质支架中的一个或多个CDR，例如一组CDR来提供。在本文的其它地方更详细的描述了包括非抗体和抗体分子的结合成员。
用于本发明的结合成员可以连接具有生物杀灭活性或细胞毒素活性的分子。或者，用于本发明的结合成员可以连接放射性同位素。作为另外一个选择，用于本发明的结合成员可以用可检测标记进行标记。
在下文中进一步详细描述本发明的这些和其它方面。
附图说明
图1：显示了用scFv抗ED-A抗体D5的原发肺肿瘤切片的免疫组织化学染色。1纵栏显示了肺癌的分类：A：小细胞肺癌，B：非小细胞肺癌，C：鳞状细胞癌，D：腺癌，E：细支气管肺泡癌和F：大细胞癌。2和3纵栏：显示了不同亚类型的肺肿瘤的组织切片中的ED-A的免疫组织化学检测。纵栏2和3中显示的每一亚类型的组织切片从相同的肿瘤样品获得。免疫组织化学染色(暗线)显示出在A：小细胞肺癌和B：非小细胞肺癌中的原发肿瘤切片中染色的强烈(strong，浓)的血管图案(C：鳞状细胞癌，D：腺癌，E：细支气管肺泡癌和F：大细胞癌)。
图2：显示了A：人ED-A(上部的序列)和B：小鼠ED-A(下部序列)之间的比对。星号显示人ED-A和小鼠ED-A的氨基酸相同的氨基酸位置。
图3A：显示了抗ED-A抗体H1的重链(VH)的核苷酸序列(SEQID NO：12)。抗ED-A抗体H1的重链CDR1的核苷酸序列是有下划线的。抗ED-A抗体H1重链CDR2的核苷酸序列以斜体和下划线表示。抗ED-A抗体H1重链CDR3的核苷酸序列以粗体和下划线表示。B：显示了抗ED-A抗体H1连接(子)序列的核苷酸序列(SEQID NO：14)。C：显示了抗ED-A抗体H1的轻链(VL)的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。抗ED-A抗体H1的轻链CDR 1的核苷酸序列以下划线表示。抗ED-A抗体H1的轻链CDR2的核苷酸序列以斜体和下划线表示。抗ED-A抗体H1的轻链CDR3的核苷酸序列以粗体和下划线表示。
图4A：显示了抗ED-A抗体H1重链(VH)的氨基酸序列(SEQID NO：1)。抗ED-A抗体H1重链CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)以下划线表示。抗ED-A抗体H1重链CDR2的氨基酸序列(SEQID NO：4)以斜体下划线表示。抗ED-A抗体H 1重链CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)以粗体下划线表示。B：显示了抗ED-A抗体H 1连接(子)序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。C：显示了抗ED-A抗体H1的轻链(VL)的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。抗ED-A抗体H1的轻链CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)是有下划线的。抗ED-A抗体H1的轻链CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)是以斜体和下划线表示的。抗ED-A抗体H1的轻链CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)是以粗体和下划线表示的。
具体实施方式
专用术语
纤连蛋白
纤连蛋白是进行选择性剪接的抗原，已知数种可选的纤连蛋白同种型，如在本文其它部分所描述的。额外结构域-A(EDA或ED-A)还被称为ED，额外类型III重复A(EIIIA)或EDI。Kornblihtt等(1984)，Nucleic Acids Res.12，5853-5868和Paolella等(1988)，NucleicAcids Res.16，3545-3557已经公布了人ED-A的序列。还可以从SwissProt数据库以登陆号为P02751存储的氨基酸序列的氨基酸1631-1720(纤连蛋白类型-III 12；额外结构域2)获得人ED-A序列。可以从SwissProt数据库以登陆号为P11276存储的氨基酸序列的氨基酸1721-1810(纤连蛋白III型13；额外结构域2)获得小鼠ED-A序列。
纤连蛋白的ED-A同种型(A-FN)包含额外结构域-A(ED-A)。人A-FN的序列可以从相应的人纤连蛋白前体序列(其可以登陆号P092751从SwissProt数据库获得)推导出。小鼠A-FN的序列可以从相应的小鼠纤连蛋白前体序列(其可以登陆号P11276从SwissProt数据库获得)推导出。A-FN可为人纤连蛋白的ED-A同种型。ED-A可以为人纤连蛋白的额外结构域-A。
ED-A是90个氨基酸序列，其通过选择性剪接插入纤连蛋白(FN)并且位于FN的结构域11和12之间(Borsi et al.1987，J.Cel lBiol.，104，595-600)。在多数情况下，ED-A不存在于血浆形式的FN，但是在胚胎发生、组织重塑、纤维化、心脏移植和实体瘤生长过程中大量存在。
选择性剪接
选择性剪接是指DNA的初级RNA转录本发生不同剪接形式从而产生不同的mRNA。在切除内含子之后，可以确定选择哪一个外显子被剪接在一起从而形成mRNA。选择性剪接导致包含不同外显子和/或不同数量外显子的不同的同种型的产生。例如，一种同种型可以包含对应于一个或多个外显子的额外的氨基酸序列，其可包含一个或多个结构域。
淋巴瘤
这描述了一种涉及被称为淋巴细胞的免疫系统细胞的癌症类型，并且其特征在于这些细胞的异常增殖。有多种淋巴瘤亚型，它们可以被分为两种主要类别：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。霍奇金淋巴瘤是由特异性异常B淋巴细胞系发展形成，而非霍奇金淋巴瘤可能来源于异常的B、T或NK细胞，并且可通过独特的基因标记进行区别。Burkitt淋巴瘤是B细胞非霍奇金淋巴瘤的实例。本文中提到的淋巴瘤可以为原发性淋巴瘤。本文中提到的淋巴瘤可以为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。优选，本文中提到的淋巴瘤为原发性霍奇金淋巴瘤或原发性非霍奇金淋巴瘤。
肺癌
这描述了肺组织的恶性变形和增大。肺癌可以被分为两种主要类别：小细胞肺癌(小细胞癌)和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌的亚类型为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。细支气管肺泡癌是腺癌的亚类型。本文中提到的肺癌可以为原发性肺癌。肺肿瘤是动物(例如，人)的肺中的肿瘤，其是肺癌的结果。本文中提到的肺肿瘤可以为原发性肺肿瘤。
原发性肿瘤
这描述了位于肿瘤最初形成的位点上(原发位点)的肿瘤。原发性肿瘤有时候从它们的初始位点(原发位点)散布从而在动物体的其它位点形成继发肿瘤(转移)，该散布被称为转移。
结合成员
这描述了互相结合的一对分子中的一个成员。结合对的成员可以源于自然，或部分或全部合成产生。分子对的一个成员在其表面上具有结合于并且因此互补于分子对的另外一个成员的特殊空间或极性组织的表面区域或空穴。结合对类型的实例为抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明关注的是抗原-抗体类型的反应。
结合成员通常包含具有抗原-结合位点的分子。例如，结合成员可以为包含抗原结合位点的抗体分子或非抗体蛋白。
可以通过在非抗体蛋白质支架，如纤连蛋白或细胞色素B等上安排互补决定区(CDR)来产生抗原结合位点(Haan&Maggos，2004；Koide 1998；Nygren 1997)，或通过随机排列或突变蛋白质支架内的环的氨基酸残基来产生抗原结合位点以提供对需要的目标的结合特异性。Nygren等已详细综述了用于在蛋白质中设计新型结合位点的支架(1997)。在专利WO/0034784中公开了用于抗体模拟的蛋白质支架，其全文通过引用结合到本文中作为参考，其中发明者描述了包括具有至少一个随机环的纤连蛋白类型III域的蛋白质(抗体模拟)。可以通过免疫球蛋白超基因族中的任意域成员来提供适合于移植入一个或多个CDR，例如一组HCDR的支架。支架可以为人或非人蛋白质。非抗体蛋白质支架的优势在于其可以在与至少一些抗体分子相比更小和/或更易制造的支架分子中提供抗原结合位点。小尺寸的结合成员可以提供有用的生理特性，如进入细胞的能力，深入组织或接触其它结构中的靶，或结合靶抗原的蛋白质空穴的能力。在Wess，2004中综述了抗原结合位点在非抗体蛋白质支架中的应用。一般为具有稳定骨架和一个或多个可变的环的蛋白质，其中一个或多个环的氨基酸序列被特异性或随机地突变从而产生结合靶抗原的抗原结合位点。这样的蛋白质包括金黄色酿脓葡萄球菌S.aureus的蛋白质A、铁传递蛋白、四联蛋白、纤连蛋白(例如，第10纤连蛋白III型结构域)和脂笼蛋白的IgG-结合结构域。其它的方法包括合成“微体(细胞)(Selecore GmbH)，其是基于具有分子内二硫键的小蛋白质-环蛋白。
除了抗体序列和/或抗原结合位点，用于本发明的结合成员可以包含其它氨基酸，例如形成肽或多肽，如折叠结构域，或者从而提供分子除了结合抗原能力的其它功能特性。用于本发明的结合成员可以具有可检测标记，或可以连接毒素或靶定部分targeting moiety或酶(例如，通过肽键或连接子)。例如，结合成员可以包含催化部位(例如，在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中抗原结合位点结合抗原并且因此将催化部位靶定于抗原。催化部位可以抑制抗原的生物功能，例如通过裂解。
尽管已知CDR可以被非抗体支架所附载，附载CDR或一组CDR的结构通常为抗体重链或轻链或其主要部分substantial portion，其中CDR或CDR组位于对应于由重组免疫球蛋白基因编码的自然产生的VH和VL抗体可变域的CDR或CDR组的位置。通过参考Kabat 1987和其现在互联网上可获得的更新(immuno.bme.nwu.edu或通过任何搜索引擎查找″Kabat″)，可以确定免疫球蛋白可变域的结构和位置。
通过CDR或CDR区，希望显示如Kabat等所定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区(1987)，(Kabat 1991a，和较新的版本)。抗体一般包含3个重链CDR和3个轻链CDR。这里使用的术语CDR是为了表示，根据该情况，包含大部分的负责通过抗体对其识别的抗原或抗原决定基的亲和力进行结合的氨基酸残基的这些区域中的一个或多个，甚至整个。
在六个短CDR序列中，重链的第三个CDR(HCDR3)具有更大的尺寸可变性(主要是由于生成基因的基因排列机制的更大的多样性)。它可以短到2个氨基酸，虽然最长的尺寸已知是26。功能上，HCDR3在确定抗体的特异性上起到部分作用(Segal 1974；Amit 1986；Chothia 1987；Chothia 1989；Caton 1990；Sharon 1990a；Sharon 1990b；Kabat et al.，1991b)。
抗体分子
这里描述了自然产生或部分或完全合成的免疫球蛋白。该术语还涵盖了包含抗体抗原结合位点的多肽或蛋白质。在这里必须理解本发明不涉及天然形式的抗体，即它们不是在它们天然的环境中，而是已经能够通过从天然来源纯化来分离或获得，或通过基因重组，或通过化学合成来获得，因此它们能够包含非天然的氨基酸残基，如此后描述的。包含抗体抗原结合位点的抗体片段包括，但是不限定于如Fab、Fab′、Fab′-SH、scFv、Fv、dAb、Fd的抗体分子和双体抗体。
采用单克隆或其它抗体，使用重组DNA技术产生结合靶抗原的其它抗体或嵌合分子是可能的。这样的技术可包括编码免疫球蛋白可变区或抗体CDR的DNA引入到不同的免疫球蛋白的恒定区或恒定区及构架区。例如，见EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400，以及大量的后续资料。产生抗体的杂交瘤细胞或其它细胞可以进行基因突变或其它改变，其可能会或不会改变抗体产生的结合特异性。
抗体可以以多种方法改进，术语“抗体分子”应该被理解为涵盖具有需要的特异性和/或结合抗原的抗体抗原结合位点的任何结合成员或物质。因此，该术语包括抗体片段和衍生物，包括包含抗体抗原结合位点的多肽，无论是天然或完全或部分合成。因此包括与其它的多肽(例如，来源于其它物种或属于其它抗体类或亚类)融合的包含抗体抗原结合位点的嵌合分子，或等效物。在EP-A-0120694和EP-A-0125023和大量后续的文献中描述了嵌合抗体的克隆和表达。
抗体工程技术领域中的其它可用技术已使分离人或人源化抗体成为可能。例如，可根据Kontermann&Dubel(2001)所描述的制造人杂种瘤。在许多公开文献如WO92/01047(后面进一步讨论)和美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、U S5871907、US 5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404和Kontermann&Dubel(2001)中已经详细描述了噬菌体展示，一种其它的已建立的产生结合成员的技术。其中小鼠抗体基因被失活并且被功能性地以人抗体基因取代，但是小鼠免疫系统的其他组成保持完整的基因改造小鼠可以被用于分离人抗体(Mendez 1997)。
可通过以合成寡核苷酸并且与合适的表达载体组装的方法产生的基因的表达来产生合成抗体分子，例如Knappik等(2000)或Krebs等(2001)所描述的。
已显示完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由VL、VH、CL和CH 1域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH 1域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH域组成的Fv片段；(iv)由VH和VL域组成的dAb片段(Ward 1989；McCafferty 1990；Holt 2003)；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH域与VL域通过肽连接子连接，其可使两个域相联合从而形成抗原结合位点(Bird 1988；Huston 1988)；(viii)双特异单链Fv二聚物(PCT/US92/09965)和(ix)“双体抗体(diabody)”，通过基因融合构建的多价或多特异片段(WO94/13804；Holliger1993a)。可通过整合连接VH和VL域的二硫键来稳定Fv、scFv或双体抗体分子(Reiter 1996)。还可以制造包含结合到CH3域的scFv的微抗体(minibody)(Hu 1996)。结合片段的其它实例为Fab′，其由于在重链CH1域的羧基末端加入几个残基而与Fab片段不同，包括一个或多个抗体铰链区的半胱氨酸，和Fab′-SH，其为其中恒定区的半胱氨酸残基具有自由硫醇基团的Fab′片段。
用于本发明的抗体片段可从本文描述的任意抗体分子，例如，包含本文描述的任意抗体的VH和/或VL域或CDR出发，通过如酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或通过化学还原来裂解二硫键的方法来获得。以另外一种方式，本发明的抗体片段可以通过所属领域一般技术人员熟知的基因重组技术等，或通过借助于例如肽自动合成仪(如Applied Biosystems公司等提供的肽自动合成仪)的肽合成，或通过核酸合成和表达来获得。
本发明的功能抗体片段包括任何通过化学修饰，尤其是通过聚乙二醇修饰，或通过整合入脂质体来提高其半衰期的功能片段。
dAb(域抗体)是抗体的小的单体抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变区(Holt 2003)。VH dAb在骆驼(例如，骆驼、美洲驼)中天然产生，可以通过以靶抗原来免疫骆驼，分离抗原特异性B细胞，直接从单个B细胞中克隆dAb基因来获得。在细胞培养物中也可产生dAb。它们较小的尺寸，良好的可溶性和温度稳定性使它们尤其在生理上适合用于筛选和亲和力成熟。本发明的结合成员可以为包含VH或VL域(基本如本文所列出的)或包含一组CDR(基本如本文所列出的)的VH或VL域的dAb。
如本文中所使用的，短语“基本如列出(set out，示出)的”是指本文所描述的结合成员的VH或VL域的相关的CDR与本文所显示的序列的特定区域相同或高度相似的特性。如本文中所描述的，短语相对于一个或多个可变区的特定区域的“高度相似”，被认为是可在CDR和/或VH或VL域进行1至约5，例如，1至4，包括1至3，或1或2，或3或4个的氨基酸取代。
双特异或双功能抗体形成了单克隆抗体的第二代，其中两个不同的可变区结合到同一分子中(Holliger 1999)。由它们募集新效应物功能或靶定肿瘤细胞表面上几个分子的能力，在诊断和治疗领域都证明了它们的用途。在要使用双特异抗体的情况下，它们可以为传统的双特异抗体，其可以以多种方法制造(Holliger 1993b)，例如化学制备或从杂交杂种瘤，或可以为以上所提到的任意的双特异抗体片段。可以通过化学方法(Glennie 1987；Repp 1995)或动物体方法(Staerz 1986；Suresh 1986)获得这些抗体，但是也可以通过基因工程技术，其可强制进行异二聚作用(heterodimerization)，因此有利于所需要的抗体的纯化过程(Merchand 1998)。双特异抗体的实例包括BiTETM技术的那些，其中可以使用具有不同特异性的两个抗体的结合域，并且通过短的柔性肽连接。这将两个抗体结合在一个短的多肽链上。可以只使用可变区域构建没有Fc区的双体抗体和scFv，可能会减少抗独特型反应的影响。
双特异抗体可被构建为完整IgG、双特异Fab′2、Fab′PEG、双体抗体或也可为双特异scFc。此外，可以使用所属领域已知的常规方法将两个双特异抗体连接从而形成四价抗体。
与双特异整体抗体相反，双特异双抗体(bispecific diabodies)还是尤其有用的，因为它们容易被构建及在E.coli中被表达。可通过使用噬菌体展示(WO94/13804)从文库方便地筛选合适的结合特异性的双体抗体(和许多其它的多肽，如抗体片段)。如果双体抗体的一个臂保持，例如针对靶抗原的特异性的恒定，则可制造一个文库，其中其它臂是可变的，选择合适特异性的抗体。
可通过Ridgeway 1996描述的可选择的工程方法来制造双特异整体抗体。
所属领域中具有多种方法来获得抗靶抗原的抗体。该抗体可为单克隆抗体，尤其是人的、鼠科的、嵌合的或人源化的，其可以根据所属领域的一般技术人员熟知的标准方法来获得。
一般来说，对于单克隆抗体或其功能片段(尤其是鼠源的)的制备，可能是指尤其是手册“Antibodies″(Harlow and Lane 1988)中描述的技术或是指Kohler和Mi lstein描述的从杂交瘤制备的技术(1975)。
单克隆抗体可从例如针对A-FN或它的包含所述的单克隆抗体识别的抗原决定基的片段之一(例如包含ED-A或由ED-A构成的片段、或ED-A的肽片段)免疫了的动物细胞来获得。特别是可以根据常规的工作方法来产生A-FN或其片段之一，通过从包含在编码A-FN或其片段的cDNA序列中的核酸序列出发的基因重组，通过从包含在A-FN和/或其片段的肽序列中的氨基酸序列出发的肽合成。
可以例如在亲和柱上纯化单克隆抗体，在亲和柱上A-FN或它的包含被所述的单克隆抗体识别的抗原决定基的片段之一(例如包含ED-A或由ED-A组成的片段或ED-A肽片段)先被固定。通过在蛋白A和/或G上的色谱层析可以纯化单克隆抗体，随后进行或不进行旨在去除其自身的残余的蛋白质污染物以及DNA和LPS的离子交换层析，随后进行或不进行用于去除由于二聚物或其它的多聚体的存在产生的可能的聚合体的在琼脂糖凝胶上的排阻层析。所有这些技术可以同时使用或者依次使用。
抗原结合位点
这描述了结合并且与整个或部分靶抗原互补的分子部分。在抗体分子中，它被称为抗体抗原结合位点，包含结合并且与整个或部分靶抗原互补的抗体部分。当抗原为大抗原时，抗体可能只结合到抗原的特定部分，该部分被称为抗原决定基。可通过一个或多个抗体可变区来提供抗体抗原结合位点。抗体抗原结合位点可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
分离的
这表示用于本发明的结合成员或编码这样的结合成员的核酸的状态，会基本与本发明一致。因此，本发明的结合成员、VH和/或VL域可以以被分离的和/或被纯化来被提供，例如从它们的天然环境，以基本纯化或均质的形式，或在核酸的情况下，除了编码具有所需功能的多肽的序列，没有或基本没有源核酸或基因。分离的成员或分离的核酸没有或基本没有它们天然相联的物质，如在其天然环境中或在其被制备的环境(例如，细胞培养物)(当这样的制备是通过体外或体内操作的重组DNA技术)中发现与其在一起的其它的多肽和核酸。成员和核酸可以与稀释剂或佐剂配制，仍然是基于被分离的操作目的-例如如果用于涂覆免疫测定用的微量滴定板，成员通常会与凝胶或其它载体混合，或当用于诊断或治疗时，会与药物可接受载体或稀释剂混合。结合成员可以为糖基化的，天然的或通过异源真核细胞系统(例如，CHO或N SO(ECACC 85110503)细胞)，或它们可以为非糖基化的(例如，如果通过在原核细胞中表达来产生)。
包含抗体分子的非均质制备也可以被用于本发明中。例如，这样的制备可以为具有完整长度的重链和缺少C-末端赖氨酸的重链，具有各种程度的糖基化和/或具有衍生化氨基酸，如N-末端谷氨酸的环化从而形成焦谷氨酸残基的抗体的混合物。
抗原(例如A-FN或纤连蛋白的ED-A)的一个或多个结合成员可以通过将本发明的结合成员的库与抗原或其片段(例如包含ED-A或由ED-A组成的片段或ED-A的肽片段)进行接触，并且选择一个或多个能够结合该抗原的库的结合成员来获得。
可以通过重复菌落过滤筛选(Iterative Colony Filter Screening)(ICFS)来筛选抗体库。在ICFS中，在液体培养基中生长包含编码几种结合特异性的DNA的细菌，一旦达到对数生长期，数十亿的细菌被分布到由适当预处理的膜过滤器(其被孵育直到完全融合的细菌菌落出现)构成的生长支持物上。由另外一个膜过滤器构成第二捕获培养基，预先湿润并且被所需的抗原覆盖。
然后，该捕获膜过滤器被放置在含有合适的培养基并且被具有覆盖了指向向上的细菌菌落的表面的生长过滤器覆盖的板上。将这样获得的夹层结构在室温中孵育约16小时。由此可能获得表达编码具有散布作用的抗体片段scFv的基因，因此那些在捕获膜上存在的特异性结合抗原的片段被捕获。然后处理该捕获膜从而以通常基于此目使用的比色方法来找出被结合的抗体片段scFv。
捕获膜上的有色点的位置使得能够返回于对应的细菌菌落，该细菌菌落存在于生长膜上并且产生被捕获的抗体片段。收集并培养这样的菌落，将数百万该细菌分布到新的培养膜上重复以上所描述的程序。进行相似的循环，直到捕获膜上的阳性信号对应于单一阳性菌落，单一阳性菌落中的每一个代表了针对筛选中使用的抗原的单克隆抗体片段的潜在源。在例如WO0246455中描述了ICFS，其通过引用结合到本文中作为参考。也可以在微粒上或分子配合物上显示库，例如可重复遗传包装，如噬菌体(例如，T7)粒子，或其它的体外展示系统，在其上展示包含编码抗体VH可变区的核酸的每一种微粒或分子配合物，或可选的还展示VL域(如果存在的话)。在WO92/01047和例如，美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160和US6521404描述了噬菌体展示，其每一个的全部内容都结合于此作为参考。
在选择了能够结合抗原的结合成员并且在噬菌体或其它的库粒子或分子配合物上展示之后，可从展示了所选的结合成员的噬菌体或其它的库粒子或分子配合物获得核酸。通过具有从展示了所选的结合成员的噬菌体或其它的库粒子或分子配合物获得的核酸序列的核酸的表达，这样的核酸可被用于随后生产结合成员或抗体VH或VL可变区。
可以以被分离的形式提供具有所选的结合成员的抗体VH可变区的氨基酸序列的抗体VH可变区，因为结合成员包含这样的VH域。
可进一步试验结合A-FN或纤连蛋白的ED-A或其它的靶抗原或同种型的能力，例如，与例如抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9中的任意一个竞争结合A-FN或A-FN片段(例如，纤连蛋白的ED-A)的能力。
用于本发明的结合成员可以特异性地结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。本发明的结合成员可以以与抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9相同的亲和力，例如以scFv形式，或更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。用于本发明的结合成员可以以3x10-8M的KD或更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白蛋白的ED-A。优选，用于本发明的结合成员可以以2x10-8M的KD或更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。更优选，用于本发明的结合成员可以以1.7x1-8的KD或更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。仍然更优选，用于本发明的结合成员可以以1.4x10-8M的KD或更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。最优选，用于本发明的结合成员可以以3x10-9M的KD或更高的亲和力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。
本发明的结合成员可以结合到与抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9相同的A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的抗原决定基。
用于本发明的结合成员可以不显示对A-FN和/或纤连蛋白的ED-A以外的分子的显著结合。尤其是，该结合成员可以不结合纤连蛋白的其它同种型，例如纤连蛋白的ED-B同种型和/或IIICS同种型。
本文所公开的抗体分子的变体可以由本发明产生并且用于本发明中。在CDR、抗体Vh或VL域和结合成员的氨基酸序列中进行取代所需的技术在所属领域中一般是可获得的。可通过取代来制造变体序列，预测该取代对活性可具有或不具有最小或有利的影响，并且试验变体序列结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的能力和/或任何其它需要的特性。
根据本发明可以使用任意VH和VL域的可变区氨基酸序列变体(其序列在本文进行了特别的公开)，如讨论。特殊变体可以包括一个或多个氨基酸序列的改变(氨基酸残基的增加、缺失、取代和/或插入)，可少于约20个的改变，少于约15个的改变，少于约10个的改变，少于约5个的改变，可以为5、4、3、2或1(个的改变)。可以在一个或多个构架区和/或一个或多个CDR中进行改变。该改变通常不会导致功能丧失，因此包含这样改变了的氨基酸序列的结合成员会保持结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的能力。例如，其可能保持了与其中不进行改变的结合成员相同数量的结合，例如，如在本文所描述的试验中测量的。包含这样改变了的氨基酸序列的结合成员可能提高了结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的能力。
可以使用随机诱变一个或多个选择的VH和/或VL基因在整个可变区内产生突变，从而产生用于本发明的新型的具有CDR源序列的VH或VL区。在某些实施例中，在整个可变区或CDR组中进行一个或两个氨基酸取代。另外可用的方法是定向诱变VH或VL基因的CDR区。
如上所知，基本上根据本文显示的CDR氨基酸序列可以作为CDR被携带在人抗体可变区或其主要部分(substantial portion，实质部分)。基本如本文列出的HCDR3序列代表本发明的实施例，例如其每一个可以作为HCDR3被携带在人(抗体)重链可变区或其主要部分。
本发明中使用的可变区可以获自或来源自任何种系或重新设计的人可变区，或者可以为基于已知的人可变区的共有序列或实在序列的合成可变区。可变区可来源于非人抗体。用于本发明的CDR序列(例如，CDR3)可使用重组DNA技术被引入到缺乏CDR(例如，CDR3)的全套可变区中。例如，Marks等(1992)描述了产生全套抗体可变区的方法，其中位于或接近可变区区域的5’末端的共有引物与人VH基因的第三构架区的共有引物联合使用从而产生缺乏CDR3的全套VH可变区。Marks等还表述了这样的全套可变区怎样与特殊抗体的CDR3结合。使用相似的技术，本发明的CDR3源序列可以与缺乏CDR3的全套VH或VL区改组，改组后的完整的VH或VL区与同源VL或VH区结合从而提供用于本发明的结合成员。然后该全套可变区可在合适的宿主体系进行展示，如WO92/01047的噬菌体展示系统，其全文通过引用结合到本文中作为参考，或任何此后大量的资料，包括Kay，Winter&McCafferty(1996)，因此可以选择合适的结合成员。全套可变区可由104以上的任何值的单独成员组成，例如至少105，至少106，至少107，至少108，至少109或至少1010成员。
与此相似，一个或多个或全部的三个CDR可以移植入全套VH或VL域，然后筛选A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的结合成员。
可以使用抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个或多个，或HCDR组，和/或可以使用抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的LCDR1、LCDR2或LCDR3中的一个或多个，或抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的LCDR组。
与此相似，可以使用本文公开的其它VH和VL域、CDR组和HCDR组和/或LCDR组。
A-FN和/或纤连蛋白的ED-A可被用于筛选用于制备治疗肺癌的药物的结合成员，例如抗体分子。该筛选可以为本文其它处公开的全套的筛选。
A-FN和/或纤连蛋白的ED-A还可以被用于筛选用于制备治疗淋巴瘤的药物的结合成员，例如抗体分子。该筛选可以为本文其他处公开的全套的筛选。
免疫球蛋白可变区的主要部分(substantial portion，重要部分)可包含至少三个CDR区，以及它们其间的构架区。该部分还包括第一和第四框架区的任意一个或两个的至少约50％，该50％为第一框架区的C末端50％和第四框架区的N末端50％。可变区的主要部分的N末端和C末端的其它残基可以为那些通常与自然产生的可变区不相关的。例如，通过重组DNA技术制造的本发明的结合成员的构建可以导致为方便克隆和其它操作步骤而引入的连接子编码的N-和C-末端残基的引入。其它的操作步骤包括引入连接子从而将本文其他处公开的可变区连接起来成为包括抗体恒定区、其它的可变区(例如在双体抗体的产生中的)或可检测/功能标记的其它蛋白质序列，如本文其它处更详细讨论的。
虽然结合成员可包含一对VH和VL域，基于VH或VL域序列的单一结合域也可以被用于本发明中。已知单一免疫球蛋白结构域，尤其是VII域，能够以特殊的形式结合靶抗原。例如，见以上对dAb的讨论。
在任一单一结合域的情况下，这些域可以被用于筛选能够形成可结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A的双域结合成员的互补域。这可以通过使用如WO92/01047中公开的所谓的分级双组合法(hierarchical dual combinatorial approach)(其全文通过引用结合到本文中作为参考)的噬菌体展示筛选方法来实现，其中包含H或L链克隆的单个菌落被用于感染编码另外一条链(L或H)的克隆的完整库，根据噬菌体展示技术(如参考文献中描述的)来选择得到的双链结合成员。在Marks 1992中也公开了该技术。
用于本发明的结合成员还可包含抗体恒定区或其部分，例如人抗体恒定区或其部分。例如，VL域可在其C-末端连接到包括人Cκ或Cλ链的抗体轻链恒定区，例如Cλ。与此相似，基于VH域的结合成员可以以其C-末端连接到来源于任何抗体同种型，例如IgG、IgA、IgE和IgM和任意同种型亚类，尤其是IgG1和IgG4，的免疫球蛋白重链的全部或部分(例如，CH1域)。具有这些特性并且稳定可变区的任何合成的或其它的恒定区变体也可使用在本发明的实施例中。
用于本发明的结合成员可使用可检测标记或功能标记进行标记。标记可为产生或能被诱导产生信号的任何分子，包括但是不限定于荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂或光敏剂。因此，结合可以被检测，和/或通过检测荧光或冷光、放射性、酶活性或光吸收率来被测量。使用所属领域已知的常规化学，可检测标记可以被连接到用于本发明的抗体。
这里有多种通过其标记可产生被外部装置检测到的信号的方法，例如，通过表观检查、电磁辐射、热和化学试剂。标记还可以结合于另外的结合用于本发明的抗体的结合成员，或结合于支持物。
被标记的结合成员，例如标记了可检测标记的scFv，可以在体内或体外诊断中使用，和/或治疗使用。
例如，放射标记的结合成员(例如，连接放射性同位素的结合成员)可以用于放射性诊断和放射性治疗。可以连接于用于本发明的结合成员的放射性同位素包括如94mTc、99mTc、186Re、188Re、203Pb、67Ga、68Ga、47Sc、111In、97Ru、62Cu、64Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、123I、124I、125I和131I的同位素。
例如，用于本发明的标记有可检测标记的结合成员可用于检测、诊断或监控人或动物的肺癌。
或者，用于本发明的标记有可检测标记的结合成员可用于检测、诊断或监控人或动物的淋巴瘤。
本发明的结合成员可用于制造用于诊断肺癌的诊断产品。
本发明的结合成员还可用于制造用于诊断淋巴瘤的诊断产品。
本发明提供了检测或诊断人或动物的肺癌的方法，包含以下步骤：
(a)将本发明的结合成员，例如标记了可检测标记的结合成员，给药于人或动物，该结合成员结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A，和
(b)确定该结合成员在人或动物身体的肺中是否存在；其中结合成员定位到人或动物肺显示了肺癌的存在。
本发明还提供了检测或诊断人或动物的淋巴瘤的方法，包含以下步骤：
(a)将本发明的结合成员，例如标记了可检测标记的结合成员，给药于人或动物，该结合成员结合纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A，和
(b)确定该结合成员在人或动物身体的淋巴系统中是否存在；其中结合成员定位至人或动物淋巴系统显示了淋巴瘤的存在。
在标记有可检测标记的结合成员中，可通过检测出标记来确定可检测标记是否存在。
用于本发明的结合成员和对损伤中的靶细胞具有杀灭或细胞毒素作用(细胞毒性作用)的分子和针对这样的损伤中的细胞外基质成分的抗体的之间的连接或融合可以被用于本发明中。例如，杀灭或细胞毒素分子可以为白细胞介素-2(IL-2)、阿霉素、白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)或组织因子(优选截短的)。这样的结合物可以被治疗性使用，例如本文提到的淋巴瘤的治疗。或者，这样的结合物可以治疗性使用，用于本文提到的肺癌的治疗。
在例如WO01/62298(其通过引用结合到本文中作为参考)中描述了结合成员与杀灭或毒性分子的融合或连接的产生和应用。
本发明提供了治疗肺癌的方法，该方法包含将治疗有效量的包含用于本发明的结合成员的药物给药于个体。
本发明还提供了治疗淋巴瘤的方法，该方法包含将治疗有效的包含用于本发明的结合成员的药物给药于个体。
该结合成员可以为(i)通过细胞相互作用对靶细胞具有杀灭或细胞毒素作用的分子和(ii)纤连蛋白的ED-A同种型和/或纤连蛋白的ED-A的结合成员的结合物。
本发明提供了用于本发明的结合成员在制备用于治疗肺癌的药物中的用途。
本发明还提供了用于本发明的结合成员在制备治疗淋巴瘤的药物中的用途。
该结合成员可以与本文所描述的施加杀灭或细胞毒性作用的分子连接或融合。该结合成员可以为(i)通过细胞相互作用对靶细胞具有杀灭或细胞毒素作用的分子和(ii)本发明的人纤连蛋白的结合成员的结合物。
本文中还描述的是(i)通过细胞相互作用对靶细胞具有杀灭或细胞毒素作用的分子和(ii)根据用于本发明的人纤连蛋白的结合成员的结合物。这样的结合物优选包含含有杀灭或细胞毒素分子和所述的结合成员的融合蛋白质，或者其中该结合成员为双链或多链，包含杀灭或细胞毒素分子和所述的结合成员的多肽链成分的融合蛋白质。优选，该结合成员是单链多肽，例如单链抗体分子，如scFv。包含杀灭或细胞毒素分子和单链Fv抗体分子的融合蛋白质可以用于本发明。
通过细胞相互作用对靶细胞起作用的杀灭或细胞毒素分子，可以直接与靶细胞相互作用，可以与靶细胞上的膜结合受体相互作用，或干扰细胞膜的电化学势。与膜结合受体相互作用的分子包括趋化因子、细胞因子和激素。干扰细胞膜电化学势的化合物包括溶血素、离子载体、作用于离子通道的药物。在示例性优选的实施例中，该分子是白细胞介素-2、组织因子(优选为截短的)或阿霉素。另一个实施例可使用白细胞介素-12、干扰素-γ、IP-IO和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。
如下文中进一步讨论的，特异性的结合成员优选为抗体或包含抗体抗原结合位点。方便地，特异性结合成员可以为单链多肽，如单链抗体。这可以方便生产包含单链抗体和杀灭或细胞毒素分子(例如，白细胞介素-2或组织因子)的融合蛋白。可通过将不同多肽的抗体VH域和抗体VL域联合的方法来产生抗体抗原结合位点，例如在完整抗体中或如Fab的抗体片段或双体抗体中。当特异性结合成员是双链或多链分子(例如，分别为Fab或完整抗体)，杀灭或细胞毒素分子可以结合为与特异性结合成员的一个或多个多肽链结合的融合多肽。
结合成员可以通过肽键与杀灭或细胞毒素分子结合，即在包含所述分子和特异性结合成员或其多肽链成分的融合多肽中。参见Taniguchi et al.(1983)Nature 302，305-310；MaED-A et al.(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.115：1040-1047；Devos et al.(1983)Nucl.Acids Res.11：4307-4323中在制备包含IL-2的融合多肽中有用的IL-2序列信息。Scarpati et al.(1987)Biochemistry 26：5234-5238和Ruf et al.(1991)J.Biol.Chem.226：15719-15725提供了截短组织因子的序列信息。用于连接的其它方法包括化学连接，尤其是使用双功能试剂的交联(例如使用DOUBLE-REAGENTSTM交联剂选择指导，Pierce)。
当需要缓释时，例如当该杀灭或细胞毒素分子是阿霉素或其它的干扰细胞膜的电化学势的分子时，化学连接可以为通过特异性结合成员(如抗体或抗体片段的多肽)的伯胺基与如阿霉素的杀灭或细胞毒素分子的氧化糖部分(六碳氨糖)之间形成席夫碱(亚胺)的方法。
本文还描述的是编码用于本发明的结合成员的分离的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。核酸可以编码如上所定义的CDR或CDR组或VH域或VL域或抗体抗原结合位点或抗体分子，例如scFv或IgG，例如IgG1。该核酸序列可编码本文公开的VH和VL域。
本文还描述的是以包含至少一个如上所述的多核苷酸的质粒、载体、转录或表达盒形式的结构物。
还描述了包含一个或多个以上所述结构物的重组宿主细胞。描述了编码任意CDR或CDR组或VH域或VL域或抗体抗原结合位点或抗体分子，例如如提供的scFv或IgG1或IgG4，的核酸，以及被编码产品的产生方法，该方法包含编码核酸的表达。通过在合适的条件下培养含有该核酸的宿主细胞可以方便的实现表达。在通过VH或VL域的表达来产生之后，或可使用任何合适的技术来分离和/或纯化结合成员，然后根据情况使用。
核酸可以包含DNA或RNA，可以为完全或部分合成。参考本文中所显示的核酸序列，包含具有规定序列的DNA分子，并且包含其中U取代T的具有规定序列的RNA分子，除非环境另有所需。
还描述了产生抗体VH可变区的方法，该方法包括使编码核酸进行表达。这样的方法还包含在产生所述的抗体VH可变区的条件下培养宿主细胞。
产生方法可包含分离和/或纯化产品的步骤。产生方法可包含将该产品配置到包括至少一种附加成分，如药物可接受的赋形剂的组合物中。
用于在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统和转基因植物和动物。所属领域中已经很好的建立了抗体和抗体片段在原核细胞中的表达。对于综述，见，例如Pluckthun1991。一般的细菌宿主是E.coli。
对于所述的领域的一般技术人员，作为产生结合成员的一个选择，在培养的真核细胞中的表达也是可利用的(能得到的)，例如Chadd&Chamow(2001)，Andersen&Krummen(2002)，Larrick&Thomas(2001)。在所属领域中可获得的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾细胞、人胚视网膜细胞和许多其它细胞。
可以选择或构建合适的载体，包含合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸序列、增强子序列、标记基因或其它合适的序列。载体可以为合适的质粒，例如噬粒，或病毒，如噬菌体(′phage)。例如，从Sambrook&Russell(2001)可知更多的细节。在Ausubel 1999中详细描述了许多已知的核酸操作的技术和方法，例如制备核酸构建、突变、测序、在细胞中引入DNA和基因表达，和蛋白质分析。
宿主细胞可包含本文所描述的核酸。这样的宿主细胞可在体外并且可以进行培养。这样的宿主细胞可在体内。宿主细胞在体内的存在可以允许用于本发明的结合成员作为“内抗体(intrabody)”或细胞内抗体在细胞内表达。内抗体可被用于基因治疗。
还描述了包含将本文公开的核酸引入宿主细胞的方法。该引入可使用任意现有的方法。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒(例如牛痘，或对于昆虫细胞，杆状病毒)的转导。将核酸引入到宿主细胞，尤其是真核细胞中，可使用病毒或质粒系统。质粒系统可以游离存在于或整合到宿主细胞内或到人工染色体中。结合可以是通过在单一或多位点的单拷贝或多拷贝的随机或定点整合。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。
在引入之后，可使该核酸表达，例如通过在该基因表达的条件下培养宿主细胞。通过所属领域一般技术人员已知的方法来实现表达产品的纯化。
该核酸可以被整合到宿主细胞的基因组(例如，染色体)中。根据标准技术，通过插入促进与基因组的再结合的序列来提高整合。
还描述了包含使用在表达系统中的如上所述的构建物从而表达如上的结合成员或多肽的方法。
用于本发明的结合成员被设计用于人或动物主体，例如人，中的诊断或治疗方法。用于本发明的结合成员可用于淋巴瘤的诊断和治疗。
或者，用于本发明的结合成员可用于肺癌的诊断和治疗。
因此，本发明提供了治疗方法，其包含将所提供的结合成员，包含这样的结合成员的药物组合物进行给药，和这样的结合成员在给药药物的生产中的应用，例如在包含将该结合成员与药物可接受赋形剂配制的药物或药物组合物的制造方法中。药物可接受的载体是熟知的，并且可被所属领域的一般技术人员根据被选的活性化合物的特性和给药模式进行改变。
用于本发明的结合成员通常以药物组合物的形式被给药，其可包含除了该结合成员之外的至少一个成分。因此，本发明的和根据本发明使用的药物组合物可包含(除了活性成分)药物可接受赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或所属领域一般技术人员熟知的其它物质。这样的物质应该是无毒的，并且不应干扰活性成分的效力。载体和其它物质的准确性质会取决于给药途径，其可以为口服的、吸入的或通过注射，例如静脉注射。
用于口服给药的药物组合物，如，例如纳米体等也可以考虑在本发明中。这样口服配方可以为药片、胶囊、粉末、液体或半固体的形式。药片可包含固体载体，如凝胶或佐剂。液体药物组合物一般包含液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐溶液、葡萄糖或其它的糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉注射，或在疾病位点的注射，活性成分是注射用药物可接受的水溶液形式，其是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。所述领域中相关的一般技术人员能够使用例如等压媒介，如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液来制备合适的溶液。根据需要，可以使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。对于所属领域一般技术人员，制备药物配方的多种方法是已知的。见，例如Robinson，1978。
根据治疗条件，组合物可以单独给药或与其它治疗组合同时或依次地给药，或与另外的治疗剂一起作为组合制剂。
用于本发明的结合成员可以作为与其它的药物成分结合的组合治疗的部分。组合治疗可被用于产生显著的协同效应，尤其是用于本发明的结合成员与一种或多种其它药物的组合。用于本发明的结合成员可与另外的治疗剂同时给药或依次给药或作为组合制剂，用于治疗本文所列出的一种或多种病症。
例如，用于本发明的结合成员可以与现有的治疗淋巴瘤的治疗剂组合使用。
现有的治疗非霍奇金淋巴瘤的治疗剂包括：利妥昔单抗(Rituximab)；和组合的环磷酰胺(Cytoxan)、Hydroxyrubicin(阿霉素(Adriamycin))、长春新碱(Oncovin)(长春新碱)和强的松(CHOP化学疗法方案)。
现有的治疗霍奇金淋巴瘤的治疗剂包括：组合的阿霉素、博来霉素、长春碱和氮烯唑胺(ABVD化学疗法方案)。
或者，用于本发明的结合成员可以与现有的治疗肺癌的治疗剂组合使用。
现有的治疗非小细胞肺癌的治疗剂包括：顺铂(cisplatin)或卡铂(carboplatin)，与吉西他滨(gemcitabine)、紫杉醇、多烯紫杉醇、依托泊苷或长春瑞滨(Vinorelbine)的组合。现有的治疗小细胞肺癌的治疗剂包括：顺铂或依托泊苷，单独或与卡铂、吉西他滨、紫杉醇、长春瑞滨、拓扑替康(Topotecan)、或依立替康(irinotecan)的组合。
用于本发明的结合成员和一种或多种以上的另外的药物成分可以用于制造药物。该药物可以为用于个体的单独或组合给药，因此可包含结合成员和作为组合制剂或独立制剂的附加成分。独立制剂可被用于方便独立的和依次的或同时的给药，并允许通过不同途径进行多种成分给药，例如口服或肠胃外给药。
根据本发明，提供的组合物可以给药于哺乳动物。给药可以以“治疗有效量”，这是充分显示对患者有效的量。这样的有效性可为至少改善了至少一种症状。给药的实际量和给药的速率和时间过程会取决于被治疗的(病症)特性和严重程度，被治疗的特定的哺乳动物，个体患者的临床情况，病症的起因，递呈组合物的位点，结合成员的类型，给药的方法，给药的时序安排和执业医生已知的其他因素。处方治疗，例如剂量的确定，是在一般从业者和其他的医生的责任范围内的，并且取决于症状的严重程度和/或被治疗疾病的发展。抗体的合适剂量在所属领域中是熟知的(Ledermann 1991和Bagshawe 1991)。可使用本文中显示的，或Physician′s Desk Reference(2003)中的适合于给药药物类型的确切剂量。可通过比较动物模型中用于本发明的结合成员的体外和体内的活性来确定结合成员的治疗有效量或合适的剂量。从小鼠或其它实验动物的有效剂量推断出对人的有效剂量的方法是已知的。精确的剂量取决于多种因素，包括该抗体是用于诊断、预防还是治疗，治疗区的尺寸和位置，抗体的准确性质(例如完整抗体、片段或双体抗体)和连接于该抗体的任意可检测标记或其它分子的性质。对于全身应用，一般抗体的剂量在100μg至1g的范围内，对于局部应用在1μg至1mg的范围内。可以以初始较高的负荷剂量，随后一个或多个降低的剂量来给药。抗体可为完整抗体，例如IgG 1或IgG4同种型。这是对成人患者的单次治疗的剂量，对于小孩和婴儿其可以按比例进行调整，或者还可对于其它抗体形式根据分子量按比例调整。治疗可以以每天、一周两次、每周或每个月的间隔时间重复，根据医生自由决定。治疗可以为每二至四周的皮下给药，和每四至八周的静脉给药。在本发明的某些实施例中，治疗是周期性的，两次给药之间的时间为约二周或更多，例如，约三周或更多，约四周或更多，或约一月一次。在本发明的其它实施例中，可在手术之前和/或之后提供治疗，可以直接在手术治疗的解剖位点进行给药或应用。
提供了包括以下实验示例的本说明书，所述领域的一般技术人员会明白本发明的其它方面和实施例。
实验
材料和方法
抗体
之前已经描述了抗ED-B抗体片段scFv(L19)的分离(Pini et al.1998)。使用公开发表的方法从ETH-2库分离母源抗ED-A抗体(Giovannoni，Nucleic.Acid Research，2001，29(5)：E27)。在以下的部分中描述了母源抗ED-A抗体的亲和力成熟，产生高亲和力抗ED-A抗体。
母源抗ED-A抗体的亲和力成熟
母源抗ED-A抗体(ETH-2-源抗体)被用作构建亲和力成熟库的模板。使用部分简并引物，对于VH的5′-CTGGAGCCTGGCGGACCCAGCTCATMNNMNNMNNGCTAAAGGTGAATCCAGA-3′(SEQ ID NO：17)和对于VL的5′-CCAGGTTTCTGCTGGTACCAGGCTAAMNNMNNMNNGCTAACACTCTGACTGGCCCTGC-3′(所有的寡核苷酸购自Operon Biotechnologies，Cologne，Germany)，在VH CDR1的31、32和33的位置以及VL CDR1的31、31a和32的位置产生随机突变的方法中，通过PCR引入库的VH CDR1(DP47种系)和VL CDR1(DPK22种系)的序列可变性。使用引物LMB3long(5′-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3′)(SEQ ID NO：19)和fdseqlong(5′-GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3′)(SEQ ID NO：20)以凝胶纯化的VH和VL片段作为模板，通过PCR拼接将VH VL组合拼接成scFv形式。以Ncol/NotI双消化该拼接的VH-VL片段，并且克隆到Ncol/Notl消化pHEN1噬粒载体(Hoogenboom et al.，1991)。根据(Viti et al.，2000)，得到的连接产物被电穿孔进入到电感受态E.coli TG-1细胞，产生包含1.5x107单独抗体克隆的库，其被用于筛选具有提高的亲和力的结合ED-A的抗体。
抗-ED-A抗体的选择
使用BIAcore分析，在以上所述的抗体库筛选以比母源抗ED-A抗体更高的亲和力结合ED-A的抗体。该BIAcore分析中使用的抗原(11A12)包含人纤连蛋白的ED-A域，并且具有以下的氨基酸序列(SEQ ID NO：120)：
MRSYRTEIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGPTKTKTAGPDQ
TEMTIEGLQPTVEYVVSVYAQNPSGESQPLVQTAVTNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESP
QGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALIIDDMESQPLIG
TQSTAIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMKEINLAPDSSSV
VVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLENVRSHHHHHH
抗原(11A12)的核苷酸序列(SEQ ID NO：121)如下：
atgagatcctaccgaacagaaattgacaaaccatcccagatgcaagtgaccgatgttcaggacaaca
gcattagtgtcaagtggctgccttcaagttcccctgttactggttacagagtaaccaccactcccaa
aaatggaccaggaccaacaaaaactaaaactgcaggtccagatcaaacagaaatgactattgaaggc
ttgcagcccacagtggagtatgtggttagtgtctatgctcagaatccaagcggagagagtcagcctc
tggttcagactgcagtaaccaacattgatcgccctaaaggactggcattcactgatgtggatgtcga
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使用分别在5’和3’含有BamHI和BglII限制性内切酶位点的引物通过PCR来扩增该抗原的核苷酸序列。用BamHI和BglII限制性内切酶消化得到的PCR产物和载体pQE12(QIAGEN)，随后以具有插入载体率为3∶1的反应被连接。得到的载体被测序从而检查该序列是否正确。
抗原的制备如下：
10ml 2TY、Amp、1％葡萄糖中的TG1电感受态预培养物在有1μl的11A 12的DNA微量提取的存在下被电穿孔。然后预培养物被稀释1∶100(8ml加入到800ml的2TY、Amp、1％葡萄糖中)，并且生长至OD600为0.4-0.6，然后以IPTG诱导过夜。第二天，破碎细胞，上清液被过滤(微孔过滤器，0.22μm)。在离心和澄清培养液之后，使用FPLC的Hitrap柱纯化11A12。再生Ni/柱如下：以5倍柱体积(CV)的H2O冲洗该柱，随后通过用3CV的0.5M EDTA/0.2M Tris pH 8将老化的镍冲洗出柱外。此后，用5CV的H2O冲洗柱子。然后用2CV的100mM的NiSO4装柱，然后用几CV的H2O冲洗柱子。然后用5CV的裂解液(20mM咪唑/250mM NaCl/PBS pH7.4)来平衡柱子。然后过滤细胞裂解物(微孔过滤器，0.45μm)，并且将其负载在柱子上(手工)。然后该柱子被放回FPLC，流动裂解液(大约3CV)直至UV信号稳定(恒定)。然后开始洗脱程序：5CV的级数为0％至100％的洗脱液(400mM咪唑/250mM NaCl/PBS pH 7.4)。收集含有被洗脱抗原的部分，并且在PBS中渗析过夜。
抗ED-A抗体的表达和纯化
抗ED-A抗体的表达和纯化如下：10ml 2TY、Amp、1％葡萄糖中的TG 1电感受态预培养物在有1μl的抗ED-A抗体之一的DNA微量提取物的存在下被电穿孔。然后预培养物被稀释1∶100(8ml加入到800ml的2TY、Amp、1％葡萄糖)，并且生长至OD600为0.4-0.6，然后以IPTG诱导过夜。第二天，破碎细胞，过滤上清液(微孔过滤器，0.22μm)。以蛋白质A-琼脂糖柱来纯化scFv，三乙胺(Triethylemmine)被用于从柱上洗脱scFv。含有被洗脱scFv的部分于4℃在PBS中渗析过夜。然后将该scFv部分装上Supcrdex 75柱，以0.5ml/min流动的PBS，收集0.25ml部分。单体部分被用于进行BIAcore分析。
BIAcore分析1
用HBS-EP缓冲液BIACORE，0.01M Hepes pH 7.4，0.15MNaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20(试验使用同样的缓冲液)，以5μl/min的流速冲洗BIAcore芯片过夜。抗原(11A12)在醋酸缓冲液(pH4.0)中被稀释到50μg/ml的浓度，通过注入50μl的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和乙基-N-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的混合物使芯片上的COOH基团活化。将40μl的11A21抗原注入到芯片上，以30μl的乙醇胺来封闭残余的游离COOH基团。在以0.22μm过滤之后，将20μl的每种细菌的上清液注入到芯片上并且监控与抗原的实时相互作用。
BIAcore分析2
使用表面等离子共振来测量母源抗ED-A抗体和抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9的kon，kOff和KD。使用与实验中相同的缓冲液以5μl/min的缓冲液流速平衡芯片过夜。以该流速进行完全覆盖程序。用醋酸盐缓冲液pH4.00(BIACORE提供)将抗原11A12稀释1∶25至终浓度20μg/ml。然后混合NHS和EDC，并且注入50μl从而活化CM5芯片上的COOH基团。然后注入40μl的抗原(持续约40″)。然后注入30μl的乙醇胺从而封闭可能存在的游离COO H的反应。
以20μl/min的流速试验每个样品。注入20μl的未稀释的单体蛋白质(如其从凝胶过滤中出来的)。瓦解时间持续约200″。然后注入10μl的HCl 10mM从而再生芯片。以不同稀释程度，即1∶2稀释(在PBS中)重复注入单体蛋白质，然后以HCl再生。此之后第三次注入以1∶4稀释的蛋白质，再次进行以HCl再生。使用BIAevaluation软件测试每个抗ED-A抗体的kon、koff和KD值。
淋巴瘤切片的免疫组织化学
在低温丙酮(-200C)中固定Ramos淋巴瘤切片(section)10分钟，载玻片(slide，切片)于室温(RT)干燥30分钟。然后将该载玻片侵入TBS 5至10分钟，用纸弄干载玻片的背面而不碰触切片。然后以＞100μl的TBS(50mM TRIS、100mM NaCl、调节到pH 7.4，0.01％抑肽酶)中的20％胎牛血清(FCS)来封闭切片30分钟。倒掉封闭液，载玻片浸没在TBS 5分钟。100μl携带有myc-标记的一抗scFv F8(～20ng/μl)，以及10μl的生物素化的抗myc抗体9E 10(OD0.25，1∶20稀释)在TBS/3％BSA中稀释，然后加入到载玻片。作为阴性对照，以相同的方法进行Ramos淋巴瘤切片免疫组织化学染色，但是省略掉一抗，即myc-标记scFv抗ED-A抗体F8。该载玻片在保湿室中孵育1小时。用TBS清洗载玻片，然后加入在TBS/3％BSA中1∶150稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶，在保湿室中孵育30分钟。然后用TBS清洗载玻片两次达5分钟，用纸干燥载玻片的背面。500μl的坚牢红底物(5mg的坚牢红粉末加入到5ml的坚牢红溶液中[49ml TRI S-HCl，0.1M，pH 8.2；1.0ml N，N-二甲基甲酰胺；10mg萘酚AS-MX-磷酸盐和50μl左旋咪唑溶液(1ml 0.1MTRIS-HCl pH 8.2，240.8mg左旋咪唑粉末)]并且用孔径0.45μm的过滤器过滤)加入到每个载玻片，载玻片在保湿室中孵育15分钟。通过以塑料巴氏吸管直接将去离子水施加到每个切片上的方式用去离子水清洗载玻片两次，然后放在水中。然后将载玻片转移到Gillis Hematoxilin溶液中50分钟，然后快速转移到水中，并且用水冲洗6次。最后，用Glycergel(DakoCytomation，Glostrup，丹麦)封固剂来封固载玻片，用使用Axiovision软件(Carl Zeiss)的Axiovert S 100TV显微镜(CarlZeiss，Feldbach，瑞士)来进行分析。
肺癌切片的免疫组织化学染色
小细胞肺癌(小细胞癌)的切片和几个非小细胞肺癌(鳞状细胞癌、腺癌、细支气管肺泡癌和大细胞癌)的切片以携带了myc-标记的scFv抗ED-A抗体来进行免疫组织化学染色，如前所述(见，例如Brack et al.2006)。简单来说，切片与scFv抗ED-A抗体D5(终浓度2-15μg/mL)和二抗(单克隆抗-myc抗体9E10)同时一起孵育。用兔抗小鼠免疫球蛋白抗体(Dakocytomation，Glostrup，丹麦)，然后通过小鼠单克隆碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合体(Dakocytomation)检测结合的抗体。坚牢红(Sigma)被用作磷酸酶底物，切片用苏木精(Sigma)复染。最后，用Glycergel(DakoCytomation，Glostrup，丹麦)封固剂来封固切片，用使用Axiovision软件(Carl Zeiss)的Axiovert S 100TV显微镜(Carl Zeiss，Feldbach，Switzerland)来进行分析。
结果
筛选抗ED-A抗体
BIAcore分析1
BIAcore分析产生了每个抗ED-A抗体的图，分析其从而推导出抗体对抗原的亲合力，如下：每个图的X轴对应于时间，Y轴对应于共振单位(显示试验抗体对覆盖在BIAcore芯片上的抗原的结合亲和力的测量)。每个图显示了3个峰值和1个谷值，其对应于缓冲液的变换，因此与结果分析无关。
每个图的上升部代表结合阶段。图中该部分的曲线越陡，抗体与抗原的结合越快。每个图中的下降部分代表了抗体从抗原解离的阶段。图中该部分的曲线越平缓，抗体从抗原的解离就越慢。
抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9都显示了比它们所起源的母源抗ED-A抗体更平缓的解离曲线，说明它们以比母源抗ED-A抗体更高的亲和力结合ED-A，A-FN也是同样。抗体E5、F1、F8和H1的图显示出所有被试验的抗ED-A抗体中最平缓的解离曲线。抗体H1、C5、D5、E5、C8、F8和F1的结合曲线比从母源抗ED-A抗体观察到的要平缓，而抗体B2、B7、E8和G9的结合曲线的陡度与从母源抗ED-A抗体观察到的一样。但是，因为IPTG-诱导的E.coli TG-1细胞的细菌上清液被用于抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9的BIAcorc分析，所试验的抗体样品的浓度未知，但是很可能低于用于比较的母源抗-ED-A抗体样品的浓度。因此，由于用于BIAcore分析的样品中抗体的浓度低，抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9的结合曲线可能人为地低。但是，因为浓度不显著影响BIAcore分析中抗体从其靶抗原的解离，从抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9观察到的平缓的解离曲线表示这些抗体至少以与母源抗-ED-A抗体相等，或可能更高的亲和力结合ED-A。
BIAcore分析2
使用BIAevaluation软件评价了每个抗ED-A抗体的kon、kOff和KD值。表2中详细表示了母源抗ED-A抗体和抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9对抗原11A12的kon、kOff和KD值。抗ED-A抗体B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9都具有比它们起源的母源抗ED-A抗体更好的对抗原11A12的KD值，显示这些抗原以比母源抗ED-A抗体更高的亲和力结合ED-A，A-FN也是同样。
淋巴瘤切片的免疫组织化学
人原发性Romas淋巴瘤(非霍奇金B细胞淋巴瘤(博基特氏淋巴瘤))切片以抗ED-A scFv F8抗体的免疫组织化学染色显示了新生血管的强烈和特异性染色。相比之下，在阴性对照中，其中除了省略了抗ED-A scFv F8抗体，原发性Romas淋巴瘤在相同的条件下染色，未观察到原发性Romas淋巴瘤包括新生血管的染色。这表明本发明的抗ED-A scFv抗体特异性地靶定于淋巴瘤的新生血管。因此，ED-A可作为淋巴瘤中基于结合成员(例如抗体)的靶定方法的一般目标。
肺癌切片的免疫组织化学
一般在某些类别的癌症中发现“泛肿瘤抗体(pantumoralantibodies)”是困难的，例如赫赛汀(Herceptin)仅染色20％的乳腺癌。图1显示了抗ED-A抗体F8特异性地定位于肺癌的新生血管。尤其是，抗ED-A抗体F8在小细胞肺癌和非小细胞肺癌的新生血管都特异性定位。非小细胞肺癌占所有肺癌的～75％-85％，而小细胞肺癌占所有肺癌的～15％-25％。图1还表明抗ED-A抗体特异性地定位于所试验的所有非小细胞肺癌亚型，即鳞状细胞癌、腺癌、细支气管肺泡癌和大细胞癌。因此图1的结果令人惊奇地表明抗ED-A抗体，F8，染色所试验的肺癌的所有组织学类型。因此，ED-A可以作为肺癌中基于结合成员(例如，抗体)的靶定方法的一般目标。
测序
抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9都是scFv抗体，使用常规的方法进行测序。图3中显示了抗ED-A抗体H1的核苷酸序列。图4中显示了抗ED-A抗体H1的氨基酸序列。
优选的编码抗ED-A抗体B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9的VH和/或VL的核苷酸序列与编码抗ED-A抗体H1的VH和/或VL的核苷酸序列是一致的，除了编码轻链(VL)和重链(VH )的H1CDR1的核苷酸序列被表1中示出的各个抗体的编码轻链(VL)和重链(VH)CDR1的核苷酸序列所取代。
优选的编码抗ED-A scFv F8双体抗体的VH和/或VL的核苷酸序列与编码抗ED-A抗体H 1的VH和/或VL的核苷酸序列是一致的，除了编码轻链(VL)和重链(VH)的H1CDR 1的核苷酸序列被表1中列出的抗ED-A抗体F8的编码轻链(VL)和重链(VH)CDR1的核苷酸序列所取代。优选的编码连接抗ED-A scFv F8双体抗体的VH和VL的连接子的核苷酸序列是gggtccagtggcggt(SEQ ID NO：29)。
抗ED-A抗体B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9与抗ED-A抗体H1具有相同的氨基酸序列，除了轻链(VL)和重链(VH)的H1 CDR1的氨基酸序列被表1中列出的(显示的)各个(respective，相应)抗体的轻链(VL)和重链(VH)CDR1的氨基酸序列所取代。抗ED-A scFv F8双体抗体的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的氨基酸序列是一致的，除了轻链(VL)和重链(VH)的H1 CDR1的氨基酸序列被表1中列出的抗ED-A F8的轻链(VL)和重链(VH)CDRI的氨基酸序列所取代，H 1中的连接子的氨基酸序列被连接子氨基酸序列GSSGG(SEQ ID NO：28)取代。
抗ED-A抗体B2VH域(SEQ IDNO：21)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：23取代了H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体C5VH 域(SEQ ID NO：41)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：43取代了H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体D5VH域(SEQ ID NO：51)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：53取代了H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体E5VH域(SEQ ID NO：61)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：63取代了H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体C8VH域(SEQ ID NO：71)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：73取代了H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体F8VH域(SEQ ID NO：81)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：83取代了H1I的VH CDR1。抗ED-AF8双体抗体的VH域与抗ED-A抗体F8的VH域具有相同的氨基酸序列(即SEQ ID NO：81)。
抗ED-A抗体F1 VH域(SEQ ID NO：91)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：93取代了H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体B7VH域(SEQ ID NO：101)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H 1的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：103取代了H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体E8 VH域(SEQ ID NO：111)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：113取代了H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体G9VH域(SEQ ID NO：31)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：33取代了H1的VH CDR1。
抗ED-A抗体B2VL域(SEQ ID NO：22)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：26取代了HI的VL CDRI。
抗ED-A抗体C5VL域(SEQ ID NO：42)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：46取代了H1的VLCDR1。
抗ED-A抗体D5VL域(SEQ ID NO：52)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：56取代了H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体E5VL域(SEQ ID NO：62)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：66取代了HI的VL CDRI。
抗ED-A抗体C8 VL域(SEQ ID NO：72)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：76取代了H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体F8 VL域(SEQ ID NO：82)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：86取代了H 1的VL CDR1。抗ED-A F8双体抗体的VL域与抗ED-A抗体F8具有相同的氨基酸序列(即SEQ ID NO：82)。
抗ED-A抗体F1 VL域(SEQ ID NO：92)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：96取代了H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体B7VL域(SEQ ID NO：102)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：106取代了H1的VLCDR1。
抗ED-A抗体E8VL域(SEQ ID NO：112)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：116取代了H1的VL CDR1。
抗ED-A抗体G9VL域(SEQ ID NO：32)的氨基酸序列与抗ED-A抗体H1的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQ ID NO：36取代了H1的VLCDR1。
可选地，抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8、G9和scFv F8双体抗体的VH域的位置5的氨基酸可以为亮氨酸残基(L)而不是缬氨酸残基(V)，如图4A所示。此外，或者抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8、G9和scFv F8双体抗体的VL域的位置18的氨基酸可以为精氨酸残基(R)而不是赖氨酸残基(K)，如图4C所示。
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本说明书任何地方列出的所有的文献，包括在上文的任何地方列出的，通过引用其全文而结合于本文中，用于所有的目的。
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表1
抗ED-A亲和力成熟抗体的重链(VH)和轻链(VL)CDR1的核苷酸和氨基酸序列
  抗体   CDR 1(VH)   CDR1(VL)
H1   CCC CGGCGGP    R    R    (SEQ IDNO：3)   TCT GCG TGGS    A    W    (SEQID NO：6)
B2   GCG GCTAAGA    A    K    (SEQ IDNO：23)   GTG GCT TTTV    A    F    (SEQID NO：26)
C5   CCG ATT ACTP    I    T    (SEQ IDNO：43)   TTG CAT TTTL    H    F    (SEQID NO：46)
D5   GTG ATG AAGV    M    K    (SEQ IDNO：53)   AAT GCT TTTN    A    F    (SEQID NO：56)
  抗体   CDR 1(VH)   CDR1(VL)
E5   ACT GGT TCTT    G    S    (SEQ IDNO：63)   CTTGCGCATL    A    H    (SEQID NO：66)
C8   CTT CAG ACTL    Q    T    (SEQ IDNO：73)   CTT CCT TTTL    P    F(SEQ ID NO：76)
F8   CTG TTT ACGL    F    T    (SEQ IDNO：83)   ATG CCG TTTM    P    F    (SEQID NO：86)
F1   TAG GCG CGTQ(琥珀)A  R    (SEQ IDNO：93)   GCG CCT TTTA    P    F    (SEQID NO：96)
B7   CAT TTT GATH    F    D    (SEQ IDNO：103)   CTG GCT TTTL    A    F    (SEQID NO：106)
E8   GAT ATG CATD    M    H    (SEQ IDNO：113)   TCG TCT TTTS    S    F    (SEQ IDNO：116)
G9   CAT ATG CAGH    M    Q    (SEQID NO：33)   ACT GCT TTTT    A    F    (SEQ IDNO：36)
表2
BIAcore测定值
  抗体   Kon(1/Ms)   Koff(1/s)   KD(M)
  母源抗ED-A抗体   2.5×105   0.02   ～1×107
  B2   3.8×105   7.54×10-3   ～2×10-8
  C5   3.04×105   9.23×10-3   ～3×10-8
  D5   4.53×105   7.6×10-3   ～1.7×10-8
  抗体   Kon(1/Ms)   Koff(1/s)   KD(M)
  C8   3.8×105   5.3×10-3   ～1.4×10-8
  F8   4.65×105   1.4×10-3   ～3.1×10-9
  B7   2.67×105   4.5×10-3   ～1.68×10-8
  G9   3.6×105   7.54×10-3   ～2.09×10-8

Claims (55)

1.结合纤连蛋白的额外结构域-A(ED-A)同种型的结合成员在制备用于治疗肺癌的药物中的应用。
2.结合纤连蛋白的额外结构域-A(ED-A)同种型的结合成员在制备用于治疗淋巴瘤的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其中所述结合成员结合所述纤连蛋白的ED-A。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其中所述结合成员连接可检测标记。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其中所述结合成员连接具有杀灭或细胞毒素活性的分子。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其中所述结合成员连接放射性同位素。
8.结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员在制备用于将连接所述结合成员的分子递呈至肺肿瘤的药物中的应用。
9.结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员在制备将连接所述结合成员的分子递呈至淋巴瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的应用，其中所述结合成员结合所述纤连蛋白的ED-A。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的应用，其中所述分子是可检测标记。
13.根据权利要求8至11中任一项所述的应用，其中所述分子具有杀灭或细胞毒素活性。
14.根据权利要求8至11中任一项所述的应用，其中所述连接的分子是放射性同位素。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的应用，其中所述结合成员包含VH域，其中所述VH域包含构架和一组互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中
HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：3、23、33、43、53、63、73、83、93、103.或113，
HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：4，和
HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：5；
或其中所述VH域包含具有在所述互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3中10个或更少的氨基酸取代的一组互补决定区。
16.根据权利要求15所述的应用，其中所述VH域构架是人种系构架。
17.根据权利要求16所述的应用，其中所述VH域具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的应用，其中所述结合成员进一步包含含有一组互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3以及构架的VL域。
19.根据权利要求18所述的应用，其中
LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116，
LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：7，和
LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：8；
或其中所述VL域包含具有在所述互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3内10个或更少的氨基酸取代的一组互补决定区。
20.根据权利要求18或19所述的应用，其中所述VL域构架是人种系构架。
21.根据权利要求20所述的应用，其中所述VL域具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的应用，其中所述结合成员是单链Fv。
23.根据权利要求18至21中任一项所述的应用，其中所述结合成员是双体抗体。
24.结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员在制造用于诊断肺癌的诊断产品中的应用。
25.结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员在制造用于诊断淋巴瘤的诊断产品中的应用。
26.根据权利要求25所述的应用，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的应用，其中所述结合成员结合所述纤连蛋白的ED-A。
28.一种在人或动物中检测或诊断肺癌的方法，其包含以下步骤：
(a)将结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员给药于所述人或动物，和
(b)确定所述结合成员是否在所述人或动物体的肺中存在；
其中所述结合成员在所述人或动物的肺中的定位显示肺癌的存在。
29.一种在人或动物中检测或诊断淋巴瘤的方法，包含以下步骤：
(a)将结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员给药于所述人或动物，和
(b)确定所述结合成员是否在所述人或动物体的淋巴系统中存在；
其中所述结合成员在所述人或动物的淋巴系统中的定位显示淋巴瘤的存在。
30.根据权利要求28至29中任一项所述的方法，其中所述结合成员结合所述纤连蛋白的ED-A。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述结合成员连接可检测标记。
32.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述结合成员连接放射性同位素。
33.一种治疗个体中肺癌的方法，其包含将治疗有效量的包含结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员的药物给药于所述个体。
34.一种治疗个体中淋巴瘤的方法，其包含将治疗有效量的包含结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员的药物给药于所述个体。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述结合成员结合所述纤连蛋白的ED-A。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述结合成员连接可检测标记。
38.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述结合成员连接具有杀灭或细胞毒素活性的分子。
39.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述结合成员连接放射性同位素。
40.一种将分子递呈至人或动物的肺肿瘤新生血管的方法，其包含将结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员给药于所述人或动物，其中所述结合成员连接所述分子。
41.一种将分子递呈至人或动物的淋巴瘤新生血管的方法，其包含将结合纤连蛋白的ED-A同种型的结合成员给药于所述人或动物，其中所述结合成员连接所述分子。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述结合成员结合所述纤连蛋白的ED-A。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述分子是可检测标记。
45.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述分子具有杀灭或细胞毒素活性。
46.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述分子是放射性同位素。
47.根据权利要求28至46中任一项所述的方法，其中所述结合成员包含VH域，其中所述VH域包含构架和一组互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中
HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113，
HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：4，和
HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：5；
或其中所述VH域包含具有在所述互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3中10个或更少的氨基酸取代的一组互补决定区。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述VH域构架是人种系构架。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述VH域具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。
50.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述结合成员进一步包含含有一组互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3和构架的VL域。
51.根据权利要求50所述的方法，其中
LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116，
LCR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：7，和
LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：8；
或其中所述VL域包含具有在所述互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3内10个或更少的氨基酸取代的一组互补决定区。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述VL域构架是人种系构架。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述VL域具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。
54.根据权利要求50至53中任一项所述的应用，其中所述结合成员是单链Fv。
55.根据权利要求50至53中任一项所述的应用，其中所述结合成员是双体抗体。
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