PL182636B1

PL182636B1 - Immunokoniugat, sposób wytwarzania immunokoniugatu i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL182636B1
Application number: PL95310493A
Authority: PL
Inventors: Wolfgang Hölzer; Hoegen Ilka Von; Wolfgang Strittmatter; Siegfried Matzku
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1994-09-16
Filing date: 1995-09-15
Publication date: 2002-02-28
Also published as: UA40611C2; AU3053395A; EP0706799A2; PL310493A1; JPH0899901A; AU702184B2; US5824782A; ES2167391T3; PT706799E; ZA957808B; NO953650D0; CA2158322C; DE69523857D1; ATE208633T1; CZ237595A3; NO953650L; HUT75836A; DK0706799T3; KR100386171B1; CN1123185A

Abstract

1. Immunokoniugat, znamienny tym, ze obejmuje przeciwcialo monoklonalne lub jego fragment po- chodzace z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotwo- rowej posiadajacej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz bialko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwcialem lub fragmentem przeciwciala. 9. Sposób wytwarzania immunokoniugatu obejmujacego przeciwcialo monoklonalne skierowane prze- ciwko komórce nowotworowej posiadajacej epitop antygenowy polaczony z aktywnym biologicznie ligandem polegajacy na fuzji sekwencji DNA kodujacej przeciwcialo lub fragment przeciwciala i ligand aktywny biologi- cznie, znamienny tym, ze poddaje sie fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujacych przeciwcialo mono- klonalne lub jego fragment pochodzace z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadajacej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzro- stowego (EGFR), oraz bialko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwcialem lub fragmen- tem przeciwciala, z zastosowaniem oligonukleotydu komplementarnego do sekwencji DNA pozadanej fuzji, umieszcza sie uzyskanakonstrukcje w wektorze ekspresyjnym, transformuje sie tym wektorem organizm gospo- darza, prowadzi sie hodowle komórek gospodarza w roztworze zawierajacym skladniki odzywcze i prowadzi sie ekspresje bialka fuzyjnego 16. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów, znamienna tym, ze zawiera immunokoniugat obejmujacy przeciwcialo monoklonalne lub jego fragment pochodzace z mysiego humanizowanego lub chi- merycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadajacej epitop antygenowy recep- tora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz bialko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwcialem lub fragmentem przeciwciala i fizjologicznie dopuszczalny nosnik. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest immunokoniugat, obejmujący przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała.

Przeciwciałem w immunokonigacie korzystnie jest fragment Fab lub fragment F(ab'), składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CHI regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CHI przeciwciała). Bardziej korzystnie przeciwciałem jest fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). Również korzystnie immunokoniugat według wynalazku obejmuje przeciwciało, które jest fragmentem przeciwciała składającego się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała).

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku immunokoniugat obejmuje przeciwciało składające się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała, odpowiedniego łańcucha lekkiego i sekwencji polipeptydowej, która łączy lekki i ciężki łańcuch (koniugat Fv przeciwciała). Również korzystnie immunokoniugat obejmuje aminokwas (sekwencję), dający się wyznaczyć na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej.

Immunokoniugat może obejmować też peptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie.

W korzystnym wykonaniu wynalazku immunokoniugat, może być wybrany z grupy obejmującej CHI MAb 425-IL-8, CH2 MAb 425-(Ncol)-IL8, CH2 MAb 425-(BclI)-IL8, Fv MAb 425-IL8, CH3 MAb 425-IL-8.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania immunokoniugatu obejmującego przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy połączony z aktywnym biologicznie ligandem polegający na fuzji sekwencji DNA kodującej przeciwciało lub fragment przeciwciała i ligand aktywny biologicznie polegający na tym, że, poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała, z zastosowaniem oliginukleotydu komplementarnego do sekwencji DNA pożądanej fuzji, umieszcza się uzyskaną konstrukcję w wektorze ekspresyjnym, transformuje się tym wektorem organizm gospodarza, prowadzi się hodowlę komórek gospodarza w roztworze zawierającym składniki odżywcze i prowadzi się ekspresję białka fuzyjnego. Korzystnie poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało będące fragmentem Fab lub fragmentem F(ab'), składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CHI regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH 1 przeciwciała). Bardziej korzystnie poddaje się fuzji na jednoniociowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łań

182 636 cucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). Również korzystnie, poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało będące fragmentem przeciwciała składającego się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH 1, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała). Najbardziej korzystnie poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało składające się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała, odpowiedniego łańcucha lekkiego i sekwencji polipeptydowej, która łączy lekki i ciężki łańcuch (koniugat Fv przeciwciała).

W sposobie według wynalazku jako sekwencję kodującą stosuje się sekwencję kodującą aminokwas przewidywalny na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej.

Korzystnie, jako sekwencje kodującą stosuje się sekwencję kodującą peptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczne do leczenia nowotworów, charakteryzująca się tym, że zawiera immunokoniugat obejmujący przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała i fizjologicznie dopuszczalny nośnik.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera przeciwciało będące fragmentem Fab lub fragmentem F(ab'), składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CHI regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CHI przeciwciała). Bardziej korzystnie, kompozycja wynalazku jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). Ewentualnie, jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). Również korzystnie kompozycja jako przeciwciało może zawierać fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała).

Kompozycja według wynalazku może korzystnie zawierać ponadto fragment przeciwciała dający się ocenić na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej.

Najbardziej korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera ponadto peptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie.

Konstrukcje kodujące białka fuzyjne tworzy się wykorzystując metody rekombinacji DNA. Białka fuzyjne zawierają zmienny region ciężkiego łańcucha przeciwciała oraz domenę CHI z regionu stałego (koniugaty CHI, fragment Fab) i odpowiedni lekki łańcuch lub region zmienny ciężkiego łańcucha przeciwciała oraz domenę CHI i CH2 regionu stałego lub też zmienny region ciężkiego łańcucha przeciwciała oraz domenę CH 1, CH2 i CH3 regionu stałego, w każdym przypadku poddane fuzji z ligandem aktywnym biologicznie. W wyniku koekspresji z odpowiednim lekkim łańcuchem, można utworzyć białko fuzyjne skierowane przeciw komórkom posiadającym antygen oraz dostarczające aktywny ligand do określonego miejsca w organizmie.

Analogicznie, można uzyskać inny immunokoniugat poprzez fuzję chemokiny z końcem C fragmentu Fv przeciwciała. W tym przypadku łańcuchy lekki i ciężki ulęgają ekspresji jako jeden polipeptyd, gdzie oba elementy łączy odpowiednia sekwencja łącznikowa, co zapewnia właściwe sfałdowanie miejsca wiążącego antygen. Na figurze 1 przedstawiono różne konstrukcje.

Wynikiem ekspresji immunokoniugatów są nowe cząsteczki łączące dwie funkcje po pierwsze są skierowane przeciw komórkom posiadającym antygen (EGFR) i po drugie dostarczają

182 636 one aktywny ligand do określonego miejsca w organizmie. Ligandy te są silnymi chemoatraktantami i cząsteczkami aktywującymi, w wyniku czego przenikają do komórek efektorowych w miejscu nowotworu i mogą powodować dalej niszczenie nowotworu.

Wykorzystując immunokoniugaty według niniejszego wynalazku, można wykrywać i z powodzeniem leczyć, bez znacznych ogólnych efektów toksycznych, nowotwory takie jak czerniak, glejak czy rak.

Będący przedmiotem wynalazku immunokoniugat skierowany przeciw komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR) oraz ligand będący białkiem należącym do chemokin, jest poddany fuzji z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała.

Istniejąróżne grupy chemokin, takie jak chemokiny C-X-C i C-C. Białko należące do chemokin wybiera się z rodziny C-X-C. W rodzinie C-X-C, korzystnym rozwiązaniem według wynalazku jest IL-8. W wynalazku dostarcza się immunokoniugat, w którym białko chemokiny wybierane jest z rodziny C-X-C i jest nim Interleukina 8 (IL-8).

Przeciwciałami, które można stosować zgodnie z wynalazkiem są albo całe przeciwciała albo ich fragmenty. Odpowiednimi fragmentami sąFv, Fab lub F(ab') 2 (fragmenty CHI przeciwciała zgodnie z oznaczeniami użytymi w tym zgłoszeniu), fragmenty CH3 i CH2 przeciwciała (fig. 1). Korzystnymi rozwiązaniami są fragmenty Fv, CH1-, CH2 i CH3 przeciwciała.

Miejsca restrykcyjne zawarte w immunokoniugacie według wynalazku mogą znajdować się między przeciwciałem (fragmentem) a białkiem chemokiny, umożliwiając w ten sposób wprowadzenie, na przykład, określonego peptydu łącznikowego w celu zapewnienia optymalnego wiązania koniugatu z docelowym epitopem. Odpowiednie peptydy łącznikowe i metody ich wprowadzania są dobrze znane w nauce i opisane poniżej. Zgodnie z wynalazkiem, jako miejsce restrykcyjne wybiera się miejsce, które jest unikalne w danej konstrukcji DNA. Korzystnymi miejscami restrykcyjnymi sąNcol i Bell.

Immunokoniugaty według tego wynalazku są odpowiednie do zastosowań terapeutycznych a zwłaszcza do stosowania w terapii nowotworów.

Celem tego wynalazku jest utworzenie białka fuzyjnego składającego się z przeciwciała monoklonalnego jako elementu kierującego i chemokiny IL-8 jako cząsteczki efektorowej o właściwościach chemotaktycznych i aktywujących.

Po raz pierwszy mogło być wykazane, że IL-8 i inne chemokiny (takie jak MIP) zachowują aktywność biologiczną kiedy N-koniec jest zablokowany przez dodatkowe aminokwasy, takie jak przeciwciała. A zatem cząsteczka ta będzie użyteczna w ukierunkowanej terapii nowotworów, w której komórki efektorowe sąkierowane do komórek nowotworowych posiadających receptor EGF i aktywowane in situ.

Wykazano, że cDNA kodujące ciężki łańcuch MAb 425 i białko IL-8 można poddać fuzji metodami biologii molekularnej, a białka mogą ulegać ekspresji w odpowiednich nieładach ekspresyjnych oraz, że białka fuzyjne zachowują zdolność wiązania receptora EGF (fig. 2).

Głównymi komórkami docelowymi IL-8 sągranulocyty obojętnochłonne posiadające trzy funkcje biologiczne:

• ruch chemotaktyczny wzdłuż gradientu chemotaktycznego • uwalnianie zmagazynowanych ziarnistości zawierających uprzednio wytworzone enzymy proteolityczne • natychmiastowe wytwarzanie anionów ponadtlenkowych (wybuch oddechowy)

A zatem, przetestowano białka fuzyjne MAb 425/NcoI/IL-8 i MAb 425/BclI/IL-8 pod względem aktywności chemotaktycznej, indukcji uwalniania MPO oraz uwalniania ponadtlenków.

Ponadto, można było wykazać, że białka fuzyjne według wynalazku (na przykład MAb 425/NcoI/IL-8 oraz MAb 425/BclI/IL-8) powodują aktywność chemotaktyczną, indukcję uwalniania MPO oraz uwalniania ponadtlenków. Wyniki przedstawione na fig. 3a wykazują, że oba białka fuzyjne sąchemotaktyczne wobec ludzkich granulocytów obojętnochłonnych w zakresie zrekombinowanej IL-8. (fig. 3b). Oprócz białek fuzyjnych MAb 425/NcoI/IL-8 oraz MAb 425/BclI/IL-8, które powinny łączyć się w postać dwuwartościową utworzono jednowartościo

182 636 we białko fuzyjne F(ab')-IL-8, którego ekspresję prowadzono w E. coli i oczyszczono je. Figura 4 pokazuje, że białko fuzyjne F(ab')-IL-8, w porównaniu MAb 425 F(ab') w porównaniu z analogicznie eksprymowanym w E. coli i oczyszczonym, jest chemotaktyczne wobec ludzkich granulocytów obojętnochłonnych.

Białko fuzyjne MAb 425/BclI/IL-8 posiada raczej silną zdolność uwalniania ponadtlenków w porównaniu z wolną IL-8 (fig. 5); białko fuzyjne MAb 425/NcoI/IL-8 jest mniej aktywne, ale wartości są znacząco wyższe od wartości kontrolnych (fig. 5). Samo MAb 425 nie wykazuje aktywności.

Wszystkie testy przeprowadzono przy użyciu cytochalazyny B jako substancji wzmacniającej, która sama nie wykazuje aktywności (dane nie przedstawione).

Oba białka fuzyjne indukują uwalnianie mieloperoksydazy (MPO), ale białko fuzyjne MAb 425/NcoI/IL-8 jest bardziej aktywne niż białko fuzyjne MAb 425/BclI/IL-8 (fig. 6). Wszystkie dane obliczono w odniesieniu do danych komórek lizowanych tritonem, gdzie zawartość enzymu przyjęto za 100%. Wszystkie dane otrzymano przy użyciu cytochalazyny B jako substancji wzmacniającej.

Uprzednio wykazano, że N-końcowa cześć cząsteczki IL-8 z silnie konserwatywnym motywem E-L-R jest wymagana do wiązania receptora i przekazywania sygnału. Trzeciorzędowa struktura IL-8 jest homodimerem, w którym oba końce N są eksponowane. Prawdopodobnie aktywność biologiczna IL-8 została zahamowana, kiedy końce N zostały zablokowane dodatkowymi aminokwasami. Dlatego też dla wprowadzenia peptydów łącznikowych i w ten sposób przywrócenia dostępności końca N pomiędzy dwa cDNA wprowadzono miejsca restrykcyjne (Ncol/BcII).

Inne podejścia do wytwarzania białek fuzyjnych, takie jak sprzęganie chemiczne obu elementów prowadzą do niezdefiniowanych struktur, które mogą być różne w różnych preparatach. Ponadto, sprzęganie chemiczne może niszczyć drugorzędową strukturę ligandu lub powodować sytuacje, w której z braku dostępności, większość białek będzie nieaktywna pod względem wiązania receptora. W przeciwieństwie, podejście według wynalazku pozwala na wytwarzanie białek fuzyjnych o zdefiniowanej strukturze, które mogąulegać ekspresji z powtarzalną) akością, prawie bez ograniczeń.

Podsumowując, białka fuzyjne według wynalazku posiadają następujące właściwości:

- wiążą się z komórkami EGFR-dodatnimi,

- powodują aktywność chemotaktyczną,

- indukują uwalniania MPO i ponadtlenków,

- indukują lizę nowotworów in situ.

KRÓTKI OPIS TABEL I FIGUR

Tab. 1. Tabela I przedstawia sekwencje starterów użytych w reakcji PCR do wytworzenia miejsc Ncol lub Bell w celu utworzenia białek fuzyjnych do ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Figura 1: Modele immunokoniugatów cytokina-przeciwciało.

c = cytokina;

VH = region zmienny łańcucha ciężkiego;

VL = region zmienny łańcucha lekkiego;

CH = region stały łańcucha ciężkiego;

CL = region stały łańcucha lekkiego.

Figura 2: Wykazanie obecności MAb 425 w supematantach transfekowanych komórek COS-7 przez test ELISA na wiązanie z EGFR:

kwadraty: supematant CH3 MAb 425 trójkąty: supematant CH2 MAb 425-(NcoI)-IL-8 odwrócone trójkąty: supematant CH2 MAb 425-(BclI)-IL-8 kropki: supematant pHCMV oś odciętych: rozcieńczenie supematantów oś rzędnych: gęstość optyczna przy długości fali 490 nm.

182 636

Figura 3a: Indukcja chemotaksji przez supematanty transfekowanych komórek COS-7:
słupek 1:	kontrola DMEM/PS
słupek 2:	nierozcieńczony supematant pHCMV
słupek 3:	supematant CH3 MAb 425 rozcieńczony 1:14 (zgodnie z wynika-
	mi testu ELISA przeciw EGFR)
słupek 4:	supematant CH3 MAb 425 rozcieńczony 1:28 (zgodnie z wynika-
	mi testu ELISA przeciw EGFR)
słupek 5:	nierozcieńczony supematant CH2 MAb 425-(BclI)-IL-8
	(1,76 x 10'¹⁰ mola/litr*)
słupek 6:	supematant CH2 MAb 425-(BclI)-IL-8 rozcieńczony 1:2
słupek 7:	nierozcieńczony supematant CH2 Mab 425- (Ncol) -IL-8 (2,0 x
	10'¹⁰ mola/litr*)
słupek 8:	supematant CH2 MAb 425-(NcoI)-IL-8 rozcieńczony 1:2*, stęże-
	nie IL-8 określono testem ELISA (Amersham)
oś rzędnych:	ilość komórek w polu liczenia
Figura 3b: Indukcja chemotaksji przez oczyszczoną IL-8
oś rzędnych:	ilość komórek w polu liczenia
oś odciętych:	stężenie IL-8 (mola/litr)
Figura 4: Indukcja chemotaksji przez CHI MAb 425-IL-8 (E. coli)
kropki:	CHI MAb 425-IL-8 ulegający ekspresji w E. coli
kwadraty:	F(ab') MAb 425 ulegający ekspresji w E. coli
trójkąty:	kontrola Dulbecco/BSA
oś rzędnych:	ilość komórek w polu liczenia
oś odciętych:	stężenie (mole/litr)
Fig. 5: Indukcja uwalniania ponadtlenków przez supematanty transfekowanych komórek
COS-7:
słupek 1:	komórki niestymulowane
słupek 2:	10'⁷MIL-8
słupek 3:	nierozcieńczony supematant CH2 425-(NcoI)-IL-8
	(2,0 x 10'¹⁰ mola/litr*)
słupek 4:	nierozcieńczony supematant CH2 MAb 425-(BclI)-IL-8
	(1,76 x 10'¹⁰ mola/litr*)
słupek 5:	nierozcieńczony supematant CH3 MAb 425 (0 mola/litr*)
	* stężenie IL-8 określono testem ELISA (Amersham)
oś rzędnych:	gęstość optyczna przy długości fali 550 nm.
Figura 6: Indukcja uwolnienia MPO przez supematanty transfekowanych komórek
COS-7:
słupek 1:	komórki niestymulowane
słupek 2:	komórki stymulowane cytochalazyną B
słupek 3:	10’⁷MIL-8
słupek 4:	nierozcieńczony supematant CH3 MAb 425
słupek 5:	supematant CH3 MAb 425 rozcieńczony 1:2
słupek 6:	nierozcieńczony supematant CH2 MAb 425-(NcoI)-IL-8
słupek 7:	supematant CH2 MAb 425-(NcoI)-IL-8 rozcieńczony 1:2
słupek 8:	nierozcieńczony supematant CH2 MAb 4252-(BclI)-IL-8
słupek 9:	supematant CH2 MAb 425-(BclI)-IL-8 rozcieńczony 1:2
oś pionowa:	% aktywności MPO w porównaniu z całkowitą ilością MPO
	(100%)
Szczegółowy opis
UWAGI OGÓLNE
Wszystkie mikroorganizmy, linie komórkowe, plazmidy, promotory, markery oporności,
miejsca początku replikacji,	miejsca restrykcyjne oraz inne fragmenty wektorów, o których

182 636 wspomina się w zgłoszeniu, są komercjalnie lub w inny sposób ogólnie dostępne. Zakładając, że nie wspomniano inaczej, stosuje się je jedynie jako przykłady i nie mają zasadniczego znaczenia dla wynalazku oraz można je zastąpić, odpowiednio, innymi odpowiednimi narzędziami i materiałami biologicznymi.

Techniki, które są zasadniczo zgodne z wynalazkiem opisano szczegółowo poniżej. Inne techniki, których nie opisano szczegółowo, odpowiadają znanym metodom standardowym, które są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie lub zostały opisane bardziej szczegółowo w cytowanych odnośnikach i zgłoszeniach patentowych oraz standardowej literaturze (np. „Antibodies, A Laboratory Manuał”, Harlow, Lane, Cold Spring Harbor, 1988).

PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE

Mysie przeciwciało monoklonalne MAb 425 z podklasy IgGl otrzymano stosując ludzka linię komórek rakowych A431 (ATCC CRL 1555).MAb 425 wiąże się z polipeptydowym epitopem zewnętrznej domeny ludzkiego receptora EGF i współzawodniczy z wiązaniem EGF. Stwierdzono, że MAb 425 ma udział w cytoksyczności komórek nowotworowych in vitro i hamuje in vitro wzrost komórek nowotworowych linii komórek rakowych pochodzących z nabłonka lub okrężnicy i odbytnicy (Rodeck i in., Cancer Res. 47: 3692,1987). Humanizowane i chimeryczne wersje MAb 425 ujawniono w światowym opisie patentowym WO 92/15683.

CHEMOKINY cDNA kodujące chemokiny albo zakupiono z British Biotechnology Limited (ludzka IL-8 BBG; Herrmann Biermann GrnBH, Bad Nauheim, Niemcy) lub utworzono na matrycy mRNA wyizolowanego z ludzkiej linii komórkowej wytwarzającej cytokinę U 937 (ATCC CRL 1593). Całkowity RNA z komórek wytwarzających chemokinę wyizolowano stosując RNAzol (WAKchemie, Niemcy) zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie RNA poddano transkrypcji na cDNA i sekwencję kodujące chemokinę zamplifikowano stosując odpowiednie startery o sekwencjach przewidzianych na podstawi opublikowanych sekwencji DNA.

WEKTORY pUC 19 jest jednym z serii zbliżonych wektorów klonujących opartych na plazmidzie E. coli o wysokiej liczbie kopii i zawiera części pBR322 i M13mpl9. pUC 19 zawiera indukowalny bakteryjny promotor-operator lac, po którym następuje miejsce wielokrotnego klonowania (Yanisch-Perron i in., Gene 33: 103-109,1985). Wektory pUC są komercjonalnie dostępne (np. New England Biolabs).

Wektory fagemidowe pBluescript KS/SK+ i KS/SK pochodzą od pUC19. Wektory te są dostępne komercjalnie (Stratagene, Heidelberg). Prokariotyczne wektory ekspresyjne oparte są na wektorze pSWl (Ward i in., Naturę 341: 544-546,1989), który pochodzi od wektora PUC 19. pSWl zawiera sekwenvcję kodującąpeptyd liderowy bakteryjnego genu pelB z Erwinia corotovora(Leiin., J.Bact. 169:4379-4383,1987). W celu kierowania ulegającego ekspresji białka do peryplazmy, obce DNA można wprowadzać we właściwej ramce odczytu za sekwencj ą liderowąpe 1B.

Eukariotyczny wektor ekspresyjny pHCMV (Gillies i in., Celi 33: 717, 1983) zawiera region początku replikacji wirusa małpiego 40 (SV40)oraz region promotora i sekwencji wzmacniającej ludzkiego cytomegalowirusa. Za regionem promotor/sekwencja wzmacniająca występuje miejsce wielokrotnego klonowania do wprowadzania genów mających ulegać ekspresji. W wektorze tym połączono chimerycznąpostać regionu zmiennego ciężkiego łańcucha MAb 425 i regionu cyCH2 poddanych fuzji z chemokinąprzy końcu domeny CH2 w celu wytworzenia białka fuzyjnego ciężkiego łańcucha MAb 425. Fuzyjny łańcuch Ig można składać w immunokoniugat przez jego łączenie z odpowiednim lekkim łańcuchem, z utworzeniem jednowartościowego regionu wiążącego antygen, który może następnie asocjować z wytworzeniem dwuwartościowego immunokoniugatu specyficznego wobec antygenu docelowego. Konstrukcje ciężkiego i lekkiego łańcucha można umieścić w jednym, lub w oddzielnych wektorach.

EKSPRESJA BIAŁEK FUZYJNYCH W KOMÓRKACH EUKARIOTYCZNYCH

Konstruowanie eukariotycznych wektorów ekspresyjnych do ekspresji białka fuzyjnego Fab 425-chemokina

182 636

FUZJA MAB-425 I CHEMOKIN TECHNIKĄ PCR

Ludzki region stały cy 1 wstawiono do pUC 19 w postaci fragmentu BamHI/BamHI. Region stały cyl zawiera dwa miejsca SacII: jedno położone w intronie 5'-końcowym, 40 bp za 5'-końcowym miejscem BamHI, i drugie, położone 580 bp za 5'-końcowym miejscem BamHI i 140 bp przed początkiem domeny CH3. Drugie miejsce SacII jest odpowiednie do dalszego subklonowania, a zatem pierwsze miejsce zniszczono przez wprowadzenie miejsca SnaBI z adaptora. W konstrukcji tej (ASac Π cyl) łatwo można wymieniać fragmenty znajdujące się za miejscem SacII.

LudzkąIL-8 wycięto z wektora pUC18 (Bgl II/Eco RI) i wstawiono do pBluescript SK+ (Stratagene GmbH, Heidelber) (Smal/EcoRI), tak że 3 wydeletowano miejsca Bglll i Smal. Fragment SacII/XbaI klonu ADacIIcyl wstawiono do pBluescript SK+. Stosując technikę PCR oba geny zamplifikowano wykorzystując odpowiednie startery:

- dla ASac II cyl: starter 3'-końcowy: sekwencja końcowa domeny CH2 i miejsce Ncol starter 5'-końcowy: starter do odwrotnego sekwencjonowania

- dla IL-8 starter 3'końcowy: uniwersalny starter do sekwencjonowania starter 5'-końcowy: miejsce Ncol i początek sekwencji IL-8

Produkty strawiono i zligowano z SK+ SacII/EcoRI. W sekwencji otrzymanego peptydu C-końcową lizynę domeny CH-2 wymieniono na metionionę, a N-końcową serynę części IL-8 wymieniono na glicerynę.

Nowo utworzona sekwencja w miejscu połączenia dwóch polipeptydów jest następująca:

' AAA GCC ATG GGT GCT 3'

Lys Ala Met Gly Ala cyCH2 <= => IL-8 (2-72)

Tę samąprocedurę przeprowadzono stosując startery (Tabela 1) do wprowadzania miejsca Bell pomiędzy dwa geny. Otrzymany gen fuzyjny posiada miejsce Bell pomiędzy genem regionu stałego cyl i genem IL-8, kodując pełną sekwencję domeny CH2, dwa dodatkowe aminokwasy (walina, izoleucyna) i sekwencję IL-8 bez pierwszych dwóch aminokwasów (seryna, alanina).

' GCC AAA GTG ATC AAA GAA 3'

Ala Lys Val Ile Lys Glu cyCH2 <= => IL-8 (3-72)

Produkty PCR zsubklonowano w SK+ wykorzystując miejsca restrykcyjne SacI i EcoRI. Dla uzyskania ekspresji w komórkach eukariotycznych te geny fuzyjne sklonowane w wektorze pHCMV.

Tabela

Konstrukcja	Starter	Sekwencja DNA
CH2/Ncol	cy5' cyl 3'	5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3' 5' -TGATCCATGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCG-3'
IL8/NcoI	IL-8 5' IL-8 3'	5' -GATCTACCTGCCATGGGTGCTAAAGAA-3' 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'
CH2/BclI	cyl 5' cyl 3'	5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3' 5' -CGCGTGATCACTTTGGCTTTGGAGATGGTT- 3'
IL-8/BclI	IL-8 5' IL-8 3'	5' -CTCGTGATCAAAGAACTTAGATGTCAATGC- 3' 5' -GTAAAACGACGGCCAGT-3'

EKSPRESJA IMMUNOKONIUGATÓW W KOMÓRKACH EUKARIOTYCZNYCH

Ekspresja immunokoniugatów w komórkach eukariotycznych wymaga wprowadzenia DNA wektora zawierającego sekwencje kodujące lekki i ciężki łańcuch do komórek gospodarza.

182 636

Opisano szereg różnych metod, takich jak elektroporacja, stosowanie DEAE-dekstranu, fosforanu wapniowego i Lipofectin oraz fuzja protoplastów. Można stosować każdy typ komórek gospodarza, pod warunkiem, że w tym typie komórek zrekombinowane sekwencje DNA kodujące immunokoniugat ulęgają właściwej transkrypcji do mRNA. Komórkami gospodarza mogą być mysie komórki szpiczaka, które nie wytwarzają immunoglobulin, takie jak Sp2/0-AG14 (ATCC CRL 1581), P3X63Ag8.653 (ATCC CRL 1580), komórki chomika, takie jak CHO-K1 (ATCC CCL 61) lub CHO/DHFR- (ATCC CRL 9096), bądź BHK-21 (ATCC CCL 10). Do jednorazowej ekspresji można użyć komórek COS-1 (ATCC CRL 1650) lub COS-7 (ATCC CRL 1651).

JEDNORAZOWA EKSPRESJA IMMUNOKONIUGATÓW

Wektor ekspresyjny pHCMV zawiera miejsce początku replikacji wirusa małpiego 40 (SV40). Linia komórkowa COS-7 pochodzi od małpiej linii komórkowej CV-1, którą stransformowano wirusem SV40 pozbawionym miejsca początku replikacji. Dlatego też, plazmidy zawierające miejsce początku replikacji SV40 będą ulegać amplifikacji, i wytwarzanie immunokoniugatów będzie ulepszone. Supematanty zbierano 24 godziny później i testowano pod względem wiązania z receptorem EGF i stężenia chemokiny przez test ELISA.

CIĄGŁA EKSPRESJA IMMUNOKONIUGATÓW

Wektory zawierające zrekombinowane konstrukcje do ekspresji immunokoniugatów wprowadzono do odpowiednich komórek gospodarza. Konstrukcje ciężkiego i lekkiego łańcucha można umieścić w tym samym lub oddzielnych wektorach; w tym ostatnim przypadku oba wektory mogą posiadać identyczne markery selekcyjne, takie jak gen oporności na neomycynę lub gen reduktazy dehydrofolianowej (DHFR), bądź dwa różne markery selekcyjne do selekcji obecności obu wektorów. Selekcję pod kątem markera DHFR można prowadzić tylko w DHFR-ujemnych liniach komórkowych, takich jak CHO/DHFR-. Mieszane populacje analizuje się pod względem ekspresji immunokoniugatów przez test ELISA specyficzny wobec receptora EGF. Dalszą selekcję dodatnich monoklonów prowadzi się przez klonowanie z ograniczonym rozcieńczaniem. Oczyszczanie immunokoniugatówMAb425-chemokina

Immunokoniugaty MAb 425 wytwarzane przez komórkę gospodarza można zbierać i oczyszczać każdą odpowiednią metodą taką jak chromatografia powinowactwa z zastosowaniem docelowego antygenu, przeciwciał skierowanych przeciw cytokinie lub przeciwciał antyidiotypowych (np. Harlow, Lane, I. c.). W tym przypadku, oczyszczenie uzyskano przez przeciwciała antyidiotypowe, które otrzymano standardowymi metodami (np. Kostelny i in., (1992) J. Immunol. 148, 1547) wykorzystując MAb 426.

Dla uzyskania czystych immunokoniugatów Fv, odpowiednie do ekspresji białka szczepy E. coli transformowano plazmidami ekspresyjnymi (patrz poniżej). Wzrost komórek prowadzono do uzyskania OD₅₇₈ = 0,5 i indukowano izopropylo-[3-D-tiogalaktopiranozydem (IPTG) (1 mM). Wzrost komórek prowadzono przez noc i zbierano supematanty i komórki. Supematant nakładano na kolumnę z przeciwciałem antyidiotypowym skierowanym przeciw MAb 425, przygotowanązgodnie ze standardowymi procedurami. Kolumnę przemywano buforem fosforanowym z 0,5 M NaCl i związane białko eluowano 100 mM glicynąz 0,5 M NaCl o pH 2,5. Eluat natychmiast zobojętniano 2,5 M Tris pH 8,0. Frakcje zawierające CHI MAb 425-IL8 łączono, zatężano i dializowano wobec PBS.

KONSTRUOWANIE WEKTORÓW EKSPRESYJNYCH DO EKSPRESJI BIAŁEK FUZYJNYCH FAB25-CHEMOKINAIF_V-CHEMOKINA W KOMÓRKACH PROKARIOTYCZNYCH

Fragment Fv utworzono zgodnie z Glockshuber i in. (Biochemistry 29:1362-1367,1990). Sekwencje DNA kodujące lekki łańcuch i fragment Fd ciężkiego łańcucha lub fragment Fv wprowadzono do miejsca wielokrotnego klonowania wektora pSWl. Dojrzałą sekwencję kodującą lekki łańcuch, dojrzałą sekwencję kodującąciężki łańcuch i sekwencję kodującąFv poprzedzono sekwencjąpeptydu liderowego z bakteryjnego genu pel B. Sekwencja kodująca ciężki łańcuch zawiera miejsce Ncol (koniec 3^. cDNA kodujące chemokiny tak zmodyfikowano przez PCR, aby zawierały miejsca restrykcyjne Ncol (koniec 5') i Notl (koniec 3') lub EcoRI (w przypadku fuzji Fv). Geny chemokin poddano fuzji we właściwej ramce odczytu bezpośrednio z domeną

182 636

CHI ciężkiego łańcucha lub fragmentu Fv. Alternatywnie, pomiędzy domenę CHI i gen chemokiny można wprowadzić peptyd łącznikowy, taki jak (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x, gdzie x ma wartość od 1 do 4. Takie łączniki i metody ich tworzenia są znane w literaturze (np. Curtis i in., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88,5809). Wektory te umożliwiają wydajną ekspresję funkcjonalnych białek fuzyjnych F(ab')- (=CH1) i Fv-chemokina w E.coli. Sekwencje kodujące lekki łańcuch i białko fuzyjne ciężki łańcuch-chemokina umieszcza się na pojedyńczym dwucistronowym matrycowym RNA pozostającym pod kontrolą indukowalnego promotora lac (Skerra i Pliickthun, Science 242: 1038-1040, 1988). Dlatego też, ekspresję białka fuzyjnego Fab/Fv można indukować zgodnie z wymaganiami warunków hodowli. Translacja obu białek z dwucistronowego matrycowego RNA sprzyja syntezie równych ilości białka fuzyjnego Fd-chemokina i lekkiego łańcucha, zwiększając w ten sposób szanse właściwego łączenia w funkcjonalne białko fuzyjne Fab/Fv. Dwapolipeptydy są wydzielane do peryplazmy E. coli, gdzie zachodzi ich ufałdowanie, tworzenie wiązań dwusiarczkowych i łączenie w funkcjonalne białko fuzyjne FAb 425CH1/Fv. Wydłużona hodowla bakterii prowadzi do częściowej permeabilizacji zewnętrznej błony E. coli, co umożliwia dyfuzję białek fuzyjnych do podłoża hodowlanego.

WŁAŚCIWOŚCI WIĄŻĄCE IMMUNOKONIUGATÓW MAB 425

Właściwości wiążące immunokoniugatów MAb 425 określano przez test ELISA specyficzny wobec receptora EGF. Krótko, płytki do mikromiareczkowania opłaszczano przez noc w temperaturze 4°C oczyszczonym receptorem EGF. Płytki inkubowano z supematantami zawierającymi białka fuzyjne lub supematantami zawierającymi nieskoniugowane fragmenty MAb. Płytki przemywano w celu usunięcia niezwiązanego materiału, i przeciwciało związane z receptorem wykrywano przez inkubację z ze skoniugowanymi z peroksydaząkozimi przeciwciałami skierowanymi przeciw ludzkim IgG i IgM (ciężki i lekki łańcuch), a następnie substratem. Ilość związanego białka specyficznego wobec receptora EGF określano przez pomiar absorpcji przy długości fali 490 nm.

AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNA IMMUNOKONIUGATÓW MAB 425-IL-8.

Izolowanie komórek efektorowych

W celu określenia aktywności biologicznej, bezpośrednio przed użyciem z pełnej krwi zdrowych dawców izolowano ludzkie granulocyty obojętnochłonne krwi obwodowej, jak uprzednio opisali Hasletti in. (Am. J. Pathol. 119: 101-110,1985). Osocze oddzielano przez wirowanie, erytrocyty przez sedymentację z dekstranem, a na końcu limfocyty i leukocyty oddzielano przez wirowanie w gradiencie perkolu. Wyizolowane granulocyty obojętnochłonne wykorzystywano natychmiast.

OKREŚLANIE AKTYWNOŚCI CHEMOTAKTYCZNEJ

Badanie chemotaksji prowadzono według Falka i in. (J. Immunol. Methods 33: 239-247, 1980). Krótko, stosowano 48-studzienkową komorę Boydena i 5pm membrany. Oczyszczone granulocyty obojętnochłonne ponownie zawieszano w podłożu DMEM (DMEM, 1% penicylina, 1% streptomycyna, 10% cielęca surowica płodowa, 2 mM L-glutamina, 1 mM pirogronian sodowy, 10 mM HEPES) w stężeniu 1 x 10⁶komórek/ml. W dolnych studzienkach umieszczano supematanty zawierające białka fuzyjne lub supematanty kontrolne, przykrywano je membranami i ostatecznie w górnych studzienkach umieszczono zawiesinę komórek. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37°C membrany usuwano i w ciągu 10 minut utrwalano w 2% glutaraldehydzie. Następnie komórki przylegające do membrany barwiono w ciągu 3 minut w Weigerts Iron Hematoxylin (odczynnik diagnostyczny Sigma). Ilość komórek związanych z membraną określano mikroskopowo.

OKREŚLENIE ZDOLNOŚCI DO INDUKOWANIA UWALNIANIA ENZYMÓW Z GRANULOCYTÓW OBOJĘTNOCHŁONNYCH

W celu oceny zdolności immunokoniugatów do indukowania uwalniania ziarnistości z granulocytów obojętnochłonnych, monitorowano aktywność mieloperoksydazy w supematancie (Henson i in., J. Immunol. 121: 851, 1978). Oznaczanie prowadzono w 96-studzienkowych płytkach do miareczkowania z 5 χ 10⁵ komórkami na studzienkę. Po inkubacji (37°C) z czynnikami stymulującymi, płytki wirowano i pozbawione komórek supematanty przenoszono do in

182 636 nej 96-studzienkowej płytki do mikromiareczkowania. Wolne od komórek supematanty inkubowano z dianizydyną(jako substratem) i mierzono absorbancję przy długości fali 492 nm. Jako kontrolę dodatnią stosowano FMLP w stężeniu ΙΟ’⁷ M. Dla określenia całkowitej zawartości enzymu, komórki bez czynników stymulujących lizowano tntionem. Aktywność obliczano jako procent całkowitej zawartości enzymu (liza).

OKREŚLENIE ZDOLNOŚCI UWALNIANIA PONADTLENKÓW

Cytochrom c ulega redukcji pod wpływem O²‘ i dlatego zmienia swojąabsorbancję. Zmiany absorbancji stanowią wartościowy wskaźnik do oceny aktywności ponadtlenków. Oznaczanie prowadzono według Guthrie'go i in. (J. Exp. Med. 160: 1656-1671, 1984) w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania z 5 χ 10⁵ na studzienkę. Po inkubacji z czynnikami stymulującymi i cytochromem c płytki wirowano i określono absorbancję supematantu przy długości fali 550 nm.

DALSZE IMMUNOKONIUGATY

Zgodnie z powyższym opisem przygotowano i zbadano skierowane przeciw EGFR immunokoniugaty CHI, CH2, CH3 i Fv (z/bez miejsca restrykcyjnego i łącznika), zawierające jako składnik chemokinowy MIP-2ai mIP-2p. Konstrukcje te wykazują podobne właściwości jak pochodne IL-8.

LECZNICZE ZASTOSOWANIE IMMUNOKONIUGATÓW

Immunokoniugaty według wynalazku można podawać ludziom w celach leczniczych. Dlatego też, przedmiotem wynalazku jest dostarczenie postaci farmaceutycznej zawierającej jako składnik aktywny co najmniej jedno ze zdefiniowanych powyżej i w zastrzeżeniach białko fuzyjne, połączone z jednym lub więcej jego farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, zaróbką lub rozcieńczalnikiem.

Zazwyczaj immunokoniugaty według tego wynalazku podawać się będzie jako iniekcje dożylne lub pozajelitowe. Ogólnie rzecz biorąc, zakresy dawek przy podawaniu immonokoniugatów są dostatecznie duże do wywoływania pożądanego wpływu hamującego i lizującego nowotwór. Dawkowanie zależeć będzie od wieku, stanu, płci i zaawansowania choroby u pacjenta, i może wahać się od 0,1 mg/kg do 200 mg/kg, korzystnie od 0,1 mg/kg do 100 mg/kg/dawkę do podawania w jednej lub więcej dawek dziennie, w ciągu jednego lub kilku dni.

Preparaty do podawania pozajelitowego obejmująjałowe roztwory wodne i niewodne, zawiesiny i emulsje. Przykładami rozpuszczalników niewodnych sąglikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak oliwy, i nadające się do iniekcji estry organiczne, takie jak oleinian etylowy, oraz inne rozpuszczalniki znane w nauce, które są odpowiednie do tych celów. Immunokoniugaty według wynalazku można stosować w kompozycji zawierającej fizjologicznie dopuszczalny nośnik. Przykładami takich odpowiednich nośników są sól fizjologiczna, sól fizjologiczna zbuforowana fosforanami, roztwór Ringera lub roztwór Ringera z mleczanem. W postaciach framaceutycznych mogą być obecne środki konserwujące i inne dodatki, takie jak antybiotyki, przeciwutleniacze i czynniki chelatujące.

Farmaceutyczne postacie według niniejszego wynalazku są odpowiednie do leczenia wszystkich rodzajów nowotworów, włącznie z czerniakami, glejakami i rakami, jak również nowotworów krwi i guzów litych.

182 636

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Merck Patent GmbH (B) ULICA: Frankfurterstr. 250 (C) MIEJSCOWOŚĆ: Darmstadt (E) KRAJ: Niemcy (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 64271 (G) TELEFON: 49-6151-727022 (H) TELEFAX: 49-6151-727191 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Immunokoniugaty II (iii) LICZBA SEKWENCJI: 8 (iv) ZAPIS KOMPUTEROWY:

(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release #1.0, wersja #1.30(EPO) (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DłUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (iii)HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (V) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

182 636 (A) ORGANIZM° starter 5'-końcowy c-gamma 1 (B) SZCZEP: E. coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 1:

CAGGAAACAGCTATGAC 17 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DłUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (iii)HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (V) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: starter 3'-końcowy c-gamma 1 (B) SZCZEP: E. coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 2:

TGATCCATGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCG 30 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DłUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa

182 636 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (iii)HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: starter 5'-końcowy IL-8 (B) SZCZEP: E. coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 3:

GATCTACCTGCCATGGGTGCTAAAGAA 27 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) ORGANIZM: starter 3'-końcowy IL-8 (B) SZCZEP: E. coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 4:

GTAAAACGACGGCCAGT

182 636 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) ORGANIZM: starter 5'-końcowy c-gamma 1 (B) SZCZEP: E. coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5:

CAGGAAACAGCTATGAC 17 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) ORGANIZM: starter 3'-końcowy c-gamma 1 (B) SZCZEP: E. coli

182 636 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6:

CGCGTGATCACTTTGGCTTTGGAGATGGTT 30 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) ORGANIZM: starter 5’-końcowy IL-8 (B) SZCZEP: E. coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 7:

CTCGTGATCAAAGAACTTAGATGTCAATGC 30 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DłUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA

182 636 (iii)HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (V) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: starter 3'-końcowy IL-8 (B) SZCZEP: Ε» coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 8:

GTAAAACGACGGCCAGT 17

~T

100

Fig. 2

182 636

Fig. 3a

182 636

Fig. 3b

182 636

Fig. 4

182 636

OD 550 nm

Fig. 5

182 636

Konstrukcja
CHlmAb425-chemokina
CH2mAb425-chemokina CH3mAb425-chemokina	Yeti r!4X ) IdEJ kJld
F_vmAb4 2 5-chemokina

Fig. 1

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Immunokoniugat, znamienny tym, że obejmuje przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała.

2. Immunokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciałem jest fragment Fab lub fragment F(ab'), składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CH 1 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (komugat CH 1 przeciwciała)

3. Immunokoniugat według jednego z zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że przeciwciałem jest fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała).

4. Immunokoniugat według jednego z zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że przeciwciałem jest fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała).

5. Immunokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciało składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała, odpowiedniego łańcucha lekkiego i sekwencji polipeptydowej, która łączy lekki i ciężki łańcuch (koniugat Fv przeciwciała).

6. Immunokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje aminokwas (sekwencję), dający się wyznaczyć na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej.

7. Immunokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje peptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie.

8. Immunokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że wybrany jest z grupy obejmującej CHI MAb 425-IL-8, CH2 MAb 425-(NcoI)-IL8, CH2 MAb 425-(BclI)-IL8, Fv MAb 425-IL8, CH3 MAb 425-IL-8.

9. Sposób wytwarzania immunokoniugatu obejmującego przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy połączony z aktywnym biologicznie ligandem polegający na fuzji sekwencji DNA kodującej przeciwciało lub fragment przeciwciała i ligand aktywny biologicznie, znamienny tym, że poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała, z zastosowaniem oligonukleotydu komplementarnego do sekwencji DNA pożądanej fuzji, umieszcza się uzyskaną konstrukcję w wektorze ekspresyjnym, transformuje się tym wektorem organizm gospodarza, prowadzi się hodowle komórek gospodarza w roztworze zawierającym składniki odżywcze i prowadzi się ekspresję białka fńzyjnego.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że poddaje się fuzji najednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało będące fragmentem Fab lub fragmentem F(ab'), składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CHI regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CHI przeciwciała).

182 636

11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała).

12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało będące fragmentem przeciwciała składającego się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała).

13. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało składające się zregionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała, odpowiedniego łańcucha lekkiego i sekwencji polipeptydowej, która łączy lekki i ciężki łańcuch (koniugat Fv przeciwciała).

14. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą stosuje się sekwencję kodującą aminokwas przewidywalny na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej.

15. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą stosuje się sekwencję kodującąpeptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie.

16. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów, znamienna tym, że zawiera immunokoniugat obejmujący przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała i fizjologicznie dopuszczalny nośnik.

17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że zawiera przeciwciało będące fragmentem Fab lub fragmentem F(ab0, składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CH1 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH1 przeciwciała).

18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała).

19. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała).

20. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CHI, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała).

21. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że zawiera ponadto fragment przeciwciała dający się ocenić na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej.

22. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera ponadto peptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie.

♦ * ♦

Niniejszy wynalazek dotyczy immunokonigatu, sposobu wytwarzania immunokoniugatu i kompozycji farmaceutycznej. Immunokoniugat stanowi nowe białko fuzyjne, które składa się z elementu wiążącego się w sposób ukierunkowany z nowotworem, w szczególności przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentu, rozpoznającego cząsteczkę, która ulega ekspresji głównie

182 636 na powierzchni ludzkich komórek nowotworowych, taką jak ludzki receptor epidermalnego czynnika wzrostowego (EG-FR), oraz biologicznie aktywnego ligandu wybranego z grupy białek chemokin, korzystnie z rodziny C-X-C. Otrzymane białka fuzyjne można wykorzystać do dostarczania ligandu aktywnego biologicznie do określonej komórki lub tkanki docelowej. Nowe immunokoniugaty można wykorzystywać w terapii nowotworów.

W leczeniu pacjentów chorych na raka wykorzystuje się różnorodne koncepcje terapeutyczne. W przeszłości prowadzono próby kliniczne z przeciwciałami monoklonalnymi specyficznie lub preferencyjnie rozpoznającymi cząsteczki ulegające ekspresji na powierzchni komórek złośliwych. Celem tego podejścia jest indukowanie komórkowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC) lub cytotoksyczności zależnej od dopełniacza dla eliminacji komórek nowotworowych. Inne podejście polega na aktywacji odpowiedzi immunologicznej zależnej od cytokin. Indukowana cytokinami aktywność przeciwnowotworowa może polegać na:

1) bezpośrednim cytotoksycznym/cytostatycznym wpływie na wzrost nowotworu
2) zależnych od antygenu nowotworowego mechanizmach niespecyficznych, takich jak aktywność komórek LAK lub cytotoksyczność zależna od monocytów/granulocytów
3) specyficznych dla antygenu nowotworowego odpowiedziach immunologicznych zależnych od komórek T CD4-dodatnich i CD8-dodatnich.

Na modelach zwierzęcych obserwowano w takich warunkach uogólnioną odporność na nowotwór.

Jednakże, cytotoksyczność wysokich dawek cytokin i ich niewystarczająca obecność in situ prowadzą do koncepcji ukierunkowanej terapii nowotworów. Zasada tej terapii opiera się na fizycznym związaniu kierującej cząsteczki, takiej jak przeciwciało monoklonalne specyficzne wobec antygenu związanego z nowotworem, z aktywnąbiologicznie cząsteczkę efektorową. Dostarczanie cząsteczek efektorowych przez cząsteczkę kierującą powinno zwiększać stężenie cytokin w nowotworze i zmniejszyć wymaganą dawkę maksymalną. Na modelach zwierzęcych wykazano, że obecność cytokin in situ spowodowana iniekcją donowotworową lub wydzielaniem przez stransfekowane komórki nowotworowe może prowadzić do regresji nowotworu (patrz w pracy przeglądowej: Colombo i Fomi, Immunology Today 15: 48-51, 1994). W tych układach cytokiny nie zakłócają proliferacji nowotworowej, ale są w stanie aktywować szybką i silną reakcję przeciwnowotworową. Dlatego też, fizyczne połączenie cząsteczki efektorowej z elementem kierującym stanowi sposób zmniejszania obwodowej obecności i zwiększania wewnątrznowotworowej dostępności ligandu aktywnego biologicznie. Ponadto, cząsteczki te mogąrównież kierować się do pojedynczych komórek nowotworowych oraz mikroprzerzutów.

Ligand aktywny biologicznie do ukierunkowywania za pośrednictwem przeciwciała powinien indukować niszczenie komórki docelowej w sposób bezpośredni lub poprzez tworzenie letalnego dla niej środowiska. Można to osiągnąć poprzez takie cytokiny jak: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFN, TNFalub CSF. Wykazano, że cytokiny te wywołują reakcję przeciwnowotworową bezpośrednio lub pośrednio przez aktywację mechanizmów obronnych gospodarza (Mire-Sluits, TIBTECH 11: 74-77,1993; Colombo i in., Cancer Res. 52: 4853-4857, 1992; Thomas i Balkwill, Pharmac. Ther. 52: 307-330, 1991).

Jednakże, większość tych cytokin aktywując komórki efektorowe, wykazuje wobec nich brak lub tylko słabą aktywność chemotaktyczną, tak że przy braku odpowiedniej ilości komórek efektorowych w tkance nowotworowej ich aktywność przeciwnowotworowa może być niska.

Jednakże, chemokiny są chemotaktyczne wobec wielu komórek efektorowych, a zatem będą one zwiększać ich obecność w miejscu nowotworu, a poza tym indukują różnorodne ich funkcje (patrz na przykład: Miller i Krangel (1992), „Biology and Biochemistry of the Chemokines: A Novel Family of Chemotactic and Inflammatory Cytokines”, Critical Reviews in Immunology 12, 17).

IL-8, MIP 2α (znana również jako GRO-β) i ΜΙΡ 2β (GRO-γ) należą do nadrodziny chemokin C-X-C (znanej również jako nadrodzina małych cytokin lub interkryn). Działają one jako czynniki chemotaktyczne oraz aktywują funkcje komórek efektorowych, i dlatego mogłyby stanowić optymalne cząsteczki efektorowe. Ta rodzina chemokin C-X-C jest grupą ostatnio scha

182 636 rakteryzowanych małych (8-10 kD) białek wykazujących od 20 do 50% homologii sekwencji aminokwasowej i mających aktywność chemotaktycznąi prozapalną. IL-8 posiada dobrze scharakteryzowaną strukturę trzeciorzędową (Clore i in., Biochemistry 29: 1689-1696, 1990) i ma wspólny z niektórymi chemokinami CXC N-końcowy motyw ELR. Należy oczekiwać, że ze względu na homologię sekwencji wśród chemokin CXC, ich struktura trzeciorzędowa będzie dość podobna. Wykazano to już dla MCAF/MCP-1 (Gronenbom i Clor, Prot. Eng. 4,263-269,1991).

W roztworze IL-8 tworzy stabilne dimery (Clore i in., Biochemistiy 29:1689-1696,1990) i jest możliwe, że białko fuzyjne E(ab')-IL-8 ulega dimeryzacji poprzez oddziaływania dwóch monomerów IL-8, tworząc dwuwartościowy immunokoniugat. Wzmacniać to będzie oddziaływania białka fuzyjnego z antygenem.

Opisani dotąd przedstawiciele grupy C-X-C wykazują aktywność wobec granulocytów obojętnochłonnych. Ich geny zlokalizowano w chromosomie 4. Przedstawicielami tej grupy są PF4, zasadowe białko płytek krwi, hIPlO, IL-8, ΜΙΡ 2α i ΜΙΡ 2β. Efektem działania tych białek na granulocyty obojętnochłonne są: aktywność chemotaktyczna, degranulacja i wybuch oddechowy (Sherry i Cerami, Current opinion in Immunology 3:56-60,1991; Oppenheim i in., Annu. Rev. Immunol. 9: 617-648, 1991; Miller i Krangel, Critical Reviews in Immunology 12: 17-46, 1992; Clark-Lewis i in., J. Biol. Chem. 266: 23128-23134, 1991).

Przedstawiciele zbliżonej rodziny chemokin C-C działająprzede wszystkim na monocyty. Wszystkie ich geny są zlokalizowane w chromosomie 17. Tymi białkami są LD 78, Act-2, MCAF, 1309i RANTES. Cząsteczki te wykazują silną aktywność chemotaktyczną wobec monocytów (Matsushima i in., Chem. Immunol. 51: 236-265, 1992; Oppenheim i in., Annu. Rev. Immunol. 9: 617-648, 1991).

Epidermalny czynnik wzrostowy (EGF) jest hormonem polipeptydowym, mitogennym dla komórek nabłonkowych i śródbłonkowych. Podczas oddziaływania EGF z wrażliwymi komórkami wiąże się on z receptorami błonowymi (EGFR). EGRF j est transbłonową glikoproteiną o masie cząsteczkowej około 170000 i jest produktem protoonkogenu c-erb-B.

Mysie przeciwciało monoklonalne MAb 425 otrzymano stosując ludzką linię komórek rakowych A431 (ATCC CRL1555) i stwierdzono, że wiąże się ono z polipeptydowym epitopem na zewnętrznej domenie EGFR. Stwierdzono, że hamuje ono wiązanie EGF i ma udział w cytotoksyczności komórek nowotworowych in vitro oraz wywołuje in vitro supresję wzrostu komórek nowotworowych linii komórek rakowych pochodzących z nabłonka oraz okrężnicy i odbytnicy (Rodeck i in., 1987, Cancer Res. 47, 3692). Humanizowane i chimeryczne wersje MAb 425 są znane ze światowego opisu patentowego numer WO 92/15683.

W EP 0 439 095 opisane jest białko fuzyjne zawierające przeciwciało monoklonalne (L6) i interleukinę-2. Przeciwnie do mterleukiny-8, interleukina-2 posiada aktywność niechemotaktyczną, ale posiada natomiast co najmniej pośrednią aktywność cytotoksyczną. Białko fuzyjne, zgodnie z tym ujawnieniem wiąże się do komórek nowotworu i indukuje proliferację cytotoksycznych limfocytów. Jednakże, limfocyty te w zasadzie maja swobodny dostęp do krwioobiegu i mogą powodować niepożądane efekty uboczne (z powodu ich cytotoksyczności).

EP 0 396 387 ujawnia immunokoniugaty zawierające przeciwciało i cytokinę takąjak interleukina-1 do interleukiny-7 lub TNF-a, TNF-β, INF-a, INF-β i INF-γ. Wszystkie te związki mają wspólną naturę, taką, że mają one aktywność niechomotaktyczną ale cytotoksyczną.

Podsumowując, zarówno EP 0 439 095 jak i EP 0 396 387 opisują immunokoniugaty zawierające przeciwciało skierowane na komórkę nowotworową! związek cytotoksyczny. Cząsteczki te były wykreowane w celu zabicia nowotworowych komórek.

Celowym było zatem opracowanie takiego immunokoniugatu, który uczyniłby możliwym przeprowadzenie nisko toksycznej terapii przeciwnowotworowej.

Celem opracowania niniejszego wynalazku było też polepszenie odpowiedzi immunologicznej dzięki potencjałowi patocytotoksycznemu neutrofili zdolnych do przyciągania i zagęszczania bezpośrednio w miejscu nowotworu we współdziałaniu z cząsteczką IL-8.

Cząsteczki według wynalazku zostały wykreowane w celu poparcia naturalnej odpowiedzi immunologicznej bez jakiegokolwiek efektu cytotoksycznego.

182 636

Ta więc przedmiotem tego wynalazku było utworzenie przeciwciał lub ich fragmentów, zawierających epitop skierowany przeciw antygenowi EGFR na powierzchni komórki nowotworowej oraz aktywnego biologicznie ligandu o wysokiej aktywności chemotaktycznej w stosunku do ich komórek efektorowych prowadząc w ten sposób do niskotoksycznej, ukierunkowanej terapii nowotworów. Tak więc immunokoniugaty reprezentują ulepszoną wersję analogicznych immunokoniugatów cytokina-przeciwciało, które mają podobną aktywność pod względem wywoływania liz nowotworów, ale nie pod względem ich możliwości efektywnego przyciągania komórek efektorowych do określonego miejsca ze względu na ich właściwości chemotaktyczne.