CZ289641B6 - Imunokonjugát, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje - Google Patents
Imunokonjugát, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289641B6 CZ289641B6 CZ19952375A CZ237595A CZ289641B6 CZ 289641 B6 CZ289641 B6 CZ 289641B6 CZ 19952375 A CZ19952375 A CZ 19952375A CZ 237595 A CZ237595 A CZ 237595A CZ 289641 B6 CZ289641 B6 CZ 289641B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibody
- immunoconjugate
- mab
- fragment
- heavy chain
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Abstract
Imunokonjug t obsahuj c monoklon ln protil tku nebo jej fragment, vybran² ze souboru zahrnuj c ho Fv, Fab, F(ab').sub.2.n. a CH3 a CH2, zam °en² na n dorovou bu ku nesouc antigenov² epitop receptoru epiderm ln ho r stov ho faktoru (EGFR) a chemokinov² protein, kter² je fusov n na protil tku nebo na protil tkov² fragment navozuje cytotoxickou a chemotaktickou aktivitu a je vhodn² pro c lenou n dorovou terapii.\
Description
Oblast techniky
Vynález se týká nových fúzovaných proteinů, které sestávají z cílového prvku, spojeného s nádorem, s výhodou z monoklonální protilátky nebo z jejího fragmentu rozeznávajícího molekulu, který je přednostně expresován na lidských nádorových buňkách, jako je například lidský epidermální růstový faktorový receptor (EGFR = „Epidermal growth factor receptor“) a biologicky aktivní ligand ze souboru zahrnujícího chemokinové proteiny, s výhodou zrodu C-X-C. Výsledné fúzované proteiny se mohou používat k uvolňování biologicky aktivního ligandu na specifickou cílovou buňku nebo tkáň. Nové imunokonjugáty se mohou používat v terapii nádorů. Vynález se rovněž týká způsobu jejich přípravy a farmaceutického prostředku, který ho obsahuje.
Dosavadní stav techniky
Pro ošetřování pacientů s rakovinou byly vyvinuty různé terapeutické koncepty. V minulosti se prováděly klinické zkoušky s monoklonálními protilátkami, které rozeznávají specificky nebo přednostně buněčné povrchové molekuly expresované na maligních buňkách. Záměrem tohoto přístupu je navodit na protilátce závislé buněčné cytotoxicity (ADCC = antibody-dependent cellular toxicity) nebo komplementem zprostředkovávané cytotoxicity k eliminaci nádorových buněk. Druhým přístupem je cytokinem zprostředkovávaná aktivace imunní odezvy. Cytokinem navozená protinádorová aktivita se může zprostředkovávat
1) přímým cytotoxickým/cytostatickým působením cytokinu na růst nádoru,
2) tumor-antigenovými nespecifickými mechanismy, jako jsou LAK aktivita nebo systémem
3) nádor-antigenovými specifickými imunními odezvami zprostředkovávanými CD4 a CD8pozitivními T-buňkami.
Za těchto okolností byla pozorována systemická imunita proti nádoru na zvířecích modelech.
Avšak cytotoxicita vysokých dávek cytokinů a nedostatečnost přítomnosti in šitu vede ke konceptu cílové nádorové terapie. Princip cílové nádorové terapie je založen na fyzikální vazbě cílové molekuly, například monoklonální protilátky specifické pro antigen, spojený s nádorem, s biologicky aktivní molekulou by mělo zvyšovat cytokinovou koncentraci v nádoru a snižovat maximální potřebnou dávku. V případě zvířecích modelů se doložilo, že in šitu přítomnost cytokinu buď intranádorovou injekcí, nebo sekrecí transfektovaných nádorových buněk může vést k regresi nádoru (Colombo a Fomi, Immunology Today 15, str. 48 až 51, 1994). V těchto systémech cytokiny nenarušují proliferaci buněk, jsou však schopné aktivace a rychlé a mocné protinádorové reakce. Proto fyzikální spojení efektorové molekuly a cílového prvku představuje prostředky snížení periferální přítomnosti a podporuje intranádorovou dostupnost biologicky aktivního ligandu. Kromě toho jednotlivé nádoiy buňky nebo mikrometastasy se také mohou zacílovat těmito molekulami.
Biologicky aktivní ligand pro protilátkově zaměřené cílování má navést destrukci cílové buňky buď přímo, nebo vytvořením smrtícího prostředí pro cílovou buňku. Toho se může dosáhnout cytokiny, jako jsou například IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFN, TNFa a OSF. Tyto cytokiny vykázaly protinádorové působení buď přímo, nebo nepřímo aktivací hostitelových obranných mechanismů (Mire-Sluis, TIBTECH 11, str. 74 až 77, 1993, Colombo a kol., Cancer Res. 52, str. 4853 až 4857, 1992, Thomas & Balkwill, Pharmac. Ther. 52, str. 307 až 330,1991).
-1 CZ 289641 B6
Avšak většina těchto cytokinů aktivuje efektorové buňky, nevykazuje však žádnou nebo pouze slabou chemotaktickou aktivitu pro ně, takže protinádorová aktivita může být slabá v nepřítomnosti vhodných množství efektorových buněk v nádorové tkáni.
Naproti tomu chemokiny jsou chemotaktické pro četné efektorové buňky, a proto budou podporovat jejich přítomnost v místě nádoru a kromě toho navozují varianty funkcí efektorové buňky (například Miller a Krangel, 1992, Biology and Biochemistry of the Chemokines: A Novel Family of Chemotactic and Inflammatory Cytokines“ Critical Reviews in Immunology [Biologie a biochemie cytokinů: Nová rodina chemotaktických a zánětlivých cytokinů, kritický přehled imunologie], 12, 17.
IL-8, MIP 2a (známý také jako GRO-β) a MIP 2β (GRO-γ) jsou členy C-X-C chemokinového superrodu (také známé jako cytokinový rod nebo „intercriny“). Působí jako chemotaktické faktory a aktivují efektorové buněčné funkce a mohou proto představovat optimální efektorové molekuly. Tento rod C-X-C chemokinů je skupinou nejnověji charakterizovaných malých (8-10 kD) proteinů, které vykazují 20 až 50% homologii v aminokyselinové sekvenci a mají chemotaktické a protizánětlivé účinky. IL-8 má dobře definovanou trojrozměrnou strukturu (Clore a kol., Biochemistry 29, str. 1689 až 1696, 1990) a podílejí se na N-koncovém ELR motivu s některými C-X-C chemokiny. Očekávalo by se, že v důsledku sekvenční homologie mezi C-X-C chemokiny bude trojrozměrná struktura velmi podobná. To bylo již doloženo pro MCAF/MCP-1 (Gronenbom & Clore, Prot. Eng. 4, str. 263 až 269, 1991).
V roztoku IL-8 vytváří stabilní dimery (Clore a kol., Biochemistry 29, str. 1689 až 1896, 1990) a je možné, že F(ab’) IL-8 fúzovaný protein je dimenzován interakcí dvou IL-8 monomerů za vytvoření bivalentního imunokonjugátu. To bude zesilovat interakci fúze proteinu s antigenem.
Dosud popsané členy C-X-C skupiny působí hlavně na neutrofilní granulocyty. Geny byly lokalizovány na chromosomu 4. Členy této skupiny jsou PF4, destičkový bazický protein, hIPlO, IL-8, MIP 2a a MIP 2β. Působení těchto proteinů na neutrofily jsou chemotaktická aktivita, degranulace a dýchací záchvat („respirátory burst“) (Sherry a Cerami, Current Opinion in Immunology [Současné mínění v imunologii], 3, str. 56 a 60, 1991; Oppenheim a kol., Annu. Res. Immunol. 9, str. 617 až 648, 1991; Miller a Krangel, Critical Reviews in Immunology 12, str. 17 až 46,1992; Clark-Lewis a kol., J. Biol. Chem. 266, str. 23128 až 23134,1991).
Členy těsně příbuzného C-C-rodu chemokinů působí na monocyty. Geny jsou všechny umístěny na chromosomu 17. Těmito proteiny jsou LD78, Act-2, MCAF, 1309 a RANTES. Tyto molekuly vykazují silné chemotaktické působení na monocyty (Matsushima a kol., Chem. Immunol. 51, str. 236 až 265, 1992; Oppenheim a kol., Annu. Rev. Immunol. 9, str. 617 až 648, 1991).
Epidermální růstový faktor (EGF = epiderma growth factor) je polypeptidový hormon, který je mitogenický pro epidermální a epitheliální buňky. Jestliže EGF vzájemně působí s citlivými buňkami, váže se na membránové receptory (EGFR). EGFR je transmembránový glykoprotein o přibližně 170 000 a je genovým produktem c-erb-B proto-onkogenu.
Myší monoklonální protilátka MAb 425 byla vybrána proti lidské rakovinové buněčné řadě A431 (ATCC CRL 1555) a zjistilo se, že se váže na polypeptidový epitop na extemální oblasti EGFR. Zjistilo se, že inhibuje vázání EGF a zprostředkovává nádorovou cytotoxicitu in vitro a potlačuje in vitro růst nádorových buněk epidermální a colorektální buněčné řady odvozené od karcinoma (Rodeck a kol., Cancer Res. 47, str. 3692, 1987). Humanizované a chimérické verze MAb 425 jsou známy z přihlášky číslo WO 92/15683.
Úkolem vynálezu je tudíž vyvinout protilátky nebo jejich fragmenty obsahující epitop zaměřený na EGFR antigen na povrchu nádorové buňky a biologicky aktivní ligand mající vysokou
-2CZ 289641 B6 chemotaktickou aktivitu pro jejich efektorové buňky a tak vedoucí k nízkotoxické cílené nádorové terapii. Imunokonjugáty proto představují zlepšené analogové cytokinové protilátkové imunokonjugáty, které jsou podobně účinné se zřetelem na svoji schopnost způsobovat lysí nádoru nikoliv však se zřetelem na možnost efektivně poutat efektorové buňky na specifické místo pro svoje chemotaktické vlastnosti.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je imunokonjugát obsahující monoklonální protilátku nebo její fragment, vybraný ze souboru zahrnujícího Fv, Fab, F(ab’)2 a CH3 a CH2, zaměřené na nádorovou buňku nesoucí antigenový epitop receptoru epidermálního růstového faktoru (EGFR) a chemokinový protein, kteiý je fúzován na protilátku nebo na protilátkový fragment.
Vynález se tedy týká fúzovaných proteinů, které spojují část monoklonální protilátky minimálně antigen rozpoznávající místo nebo kompletní monoklonální protilátku rozpoznávající epitop EGFR s biologicky aktivním ligandem ze souboru zahrnujícího chemokiny, s výhodou rodu C-X-C, zvláště IL-8. Konstrukty, kódující tyto fúzované proteiny, se generují způsoby rekombinantní DNA technologie. Fúzované proteiny obsahují variabilní oblast protilátkového těžkého řetězce a CH1 doménu konstantní oblasti (CHl-konjugáty, Fab-fragment) a vhodný lehký řetězec, nebo variabilní oblast protilátkového těžkého řetězce a CH1 a CH2 doménu konstantní oblasti nebo variabilní oblast protilátkového těžkého řetězce a CH1, CH2 a CH3 doménu konstantní oblasti fúzovanou na biologický ligand v každém případě. Koexpresí se vhodným lehkým řetězcem se může generovat fúzovaný protein, který zaciluje buňky nesoucími antigen a dodává aktivní ligand do specifických míst v těle.
Obdobně jiný imunokonjugát se může získat fúzí chemokinu na C-zakončení Fv-fragmentu protilátky. V takovém případě těžký a lehký řetězec se může expresovat v jednom polypeptidu, kde se oba prvky spojují na vhodnou spojovníkovou sekvenci k zajištění vhodného ohybu antigenového vázacího místa. Různé konstrukty jsou znázorněny na obr. 1.
K expresi imunokonjugátů dochází v nových molekulách, které kombinují dvě funkce: předně cílují antigen nesoucí buňky (EGFR) a za druhé uvolňují aktivní ligand do specifického místa v těle. Tyto ligandy jsou mocnými chemoatraktanty a aktivují molekuly a vedou k infiltraci efektorových buněk v místě nádoru a mohou způsobit následnou destrukci nádoru.
Prostřednictvím imunokonjugátů podle vynálezu se mohou zjišťovat nádory, například melanoma, glioma a karcinoma a mohou se následně ošetřovat bez obecného toxického působení.
Jsou různé skupiny chemokinů, například C-X-C a C-C chemokiny.
Podle výhodného provedení vynálezu se proto chemokinové proteiny volí z rodu C-X-C.
Z rodu C-X-C je podle výhodného provedení vynálezu dávána přednost IL-8.
Vynález se tudíž týká imunokonjugátů, přičemž chemokinový protein je volen z rodu C-X-C a je jím s výhodou interleukin 8 (IL-8).
Proteiny, kterých se může používat podle vynálezu, jsou buď celé protilátky, nebo jejich fragmenty. Vhodnými fragmenty jsou Fv, Fab nebo F(ab’)2 (zde používané označení CH1 protilátkové fragmenty), CH3 a CH2 protilátkové fragmenty (obr. 1). Výhodným provedením jsou Fv, CH1 a CH3 protilátkové fragmenty.
Vynález se tedy týká vytváření imunokonjugátů, přičemž protilátkou je Fab fragment nebo F(ab’)2 fragment sestávající v podstatě z variabilní oblasti protilátkového těžkého řetězce, z CH1
-3CZ 289641 B6 domény konstantní oblasti a ze vhodného lehkého řetězce (konjugát protilátka-CH-1), další imunokonjugát, přičemž protilátkou je protilátkový fragment sestávající v podstatě z variabilní oblasti těžkého řetězce, CH1 a CH2 domény konstantní oblasti a ze vhodného lehkého řetězce (konjugát protilátka-CH2), další imunokonjugát, přičemž protilátkou je kompletní protilátka sestávající v podstatě z variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky, CH1, CH2 a CH3 domén konstantní oblasti a ze vhodného lehkého řetězce (konjugát protilátka-CH3) a konečně další imunokonjugát, přičemž protilátka sestává v podstatě z variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky, ze vhodného lehkého řetězce a z polypeptidové sekvence, která váže lehký a těžký řetězec (konjugát protilátka-Fv).
Imunokonjugáty podle vynálezu mohou obsahovat popřípadě restrikční místo mezi protilátkou (fragmentem) a chemokinovým proteinem, které umožňuje zavádět například specifický spojovníkový peptid k zajišťování optimální vazby konjugátu na cílový epitop. Vhodné spojovníkové peptidy a způsoby jejich zavádění jsou dobře známy v oboru a jsou níže popsány. Podle vynálezu se volí restrikční místo jedinečné v určitém DNA konstruktu. Výhodným restrikčním místem je Ncol a Bell.
Vynález se proto také týká imunokonjugátu obsahujícího aminokyselinu (sekvenci), která je odvoditelná na DNA restrikční místo mezi protilátkou/protilátkovým fragmentem a biologicky aktivním ligandem, přičemž je restrikční místo jedinečné v kompletním fúzovaném konstruktu.
Vynález se proto také týká imunokonjugátu obsahujícího spojovníkový peptid mezi protilátkou/protilátkovým fragmentem a biologicky aktivním ligandem.
V podstatě jsou vhodné všechny protilátky, které jsou zaměřeny na EGF receptory na povrchy nádorových buněk. Výhodným provedením je však monoklonální protilátka 425.
Vynález se rovněž také týká imunokonjugátu, přičemž je protilátka nebo protilátkový fragment odvozena od myšího humanizovaného nebo chimemího MAb 425 a je s výhodou volena ze souboru zahrnujícího MAb 425-CH1-IL8, MAb 425-CH2-(Ncol)-IL8, MAb 425-CH2-(BclI)IL8, MAb 425-Fv-IL8 a MAb 425-CH3-IL8.
Způsob přípravy imunokonjugátu podle vynálezu spočívá vtom, že se fúzují DNA sekvence kódující vzájemně protilátku nebo fragment protilátky a biologicky aktivní ligand sjednořetězcovou DNA prostřednictvím oligonukleotidu, který je komplementární se zřetelem na žádanou fúzovanou DNA sekvenci, umísťuje se vzniklý konstrukt do expresního vektoru, který je transformován do hostujícího organismu, kultivují se hostitelské buňky v živném roztoku a expresuje se fúzovaný protein.
Imunokonjugáty podle vynálezu jsou vhodné pro terapeutické účely.
Vynález se proto také týká farmaceutických prostředků obsahujících alespoň jeden imunokonjugát podle vynálezu, shora definovaný, a fyziologicky vhodný nosič.
Záměrem vynálezu je generovat fúzovaný protein sestávající z monoklonální protilátky jakožto zacilujícícho prvku a chemokinu IL-8 jakožto efektorové molekuly s chemotaktickými a aktivačními vlastnostmi.
Předně bylo doloženo, že IL-8 a jiné chemokiny (například MIP) si podržují svoji biologickou účinnost, jestliže je N-zakončení blokováno přídavnými aminokyselinami jakožto podílem protilátky. Proto je molekula užitečná v cílené protinádorové terapii, přičemž se efektorové buňky zaměřují na EGF receptorové pozitivní nádorové buňky a aktivují se in šitu.
-4CZ 289641 B6
Bylo doloženo, že cDNA kódující MAb 425 těžký řetězec a IL-8 protein mohou být fúzovány molekulárními biologickými způsoby a proteiny mohou být expresovány ve vhodných expresních systémech a že EGF receptorová vázací kapacita je zachována ve fúzovaných proteinech (obr. 2).
Hlavní cílové buňky IL-8 jsou neutrofilní granulocyty, které mají trojí biologickou funkci:
chemotaktický pohyb ve směru chemotaktického gradientu, uvolňování zásobních granulí s předprodukovanými proteolytickými enzymy bezprostřední produkce superoxidových aniontů (dýchací záchvat)
V souhlase s tím se zkoumají MAb 425/Ncol/IL-8 a MAb 425/BclI/IL-8 fúzované proteiny se zřetelem na chemotaktickou aktivitu navození uvolňování MPO a uvolňování superoxidu.
Kromě toho bylo doloženo, že fúzované proteiny podle vynálezu (například MAb 425/Ncol/IL-8 a MAb425/BclI/IL-8) způsobují chemotaktickou aktivitu, indukci uvolňování MPO a superoxidu. Výsledky podle obr. 3a dokládají, že oba fúzované proteiny jsou chemotaktické pro lidské neutrofily v oboru rekombinantní IL-8 (obr. 3b). Přídavně kMAb425/Ncol/IL-8 a MAb 425/BclI/IL-8 fúzovaným proteinům byl vytvořen monovalentní fúzovaný protein F(ab’)IL-8 který by měly shromažďovat do divalentní formy, který byl expresován v E. coli a vyčištěn. Obr. 4 ukazuje, že F(ab’)IL-8 fúzovaný protein je chemotaktický pro lidské neutrofily ve srovnání s MAb 425 F(ab’), expresovaným v E. coli a souhlasně vyčištěný.
MAb 425/BclI/IL-8 fúzovaný protein má spíše silnou kapacitu pro uvolňování superoxidu ve srovnání svolným IL-8 (obr. 5), MAb 425/Ncol/IL-8 fúzovaný protein je méně aktivní, avšak hodnoty jsou výrazně vyšší než hodnoty kontrolní (obr. 5). MAb 425 samotný nevykazuje žádnou aktivitu. Všechny testy se provádějí za použití cytochalasinu B jakožto podpůrné látky, která samotná nevykazuje žádnou aktivitu (hodnoty nejsou uvedeny).
Oba fúzované proteiny navozují uvolňování myeloperoxidázy (MPO) avšak MAb 425/Ncol/IL-8 fúzovaný protein je mnohem aktivnější než MAb 425/BclI/IL-8 fúzovaný protein (obr. 6). Všechny hodnoty jsou vypočteny podle dat tritonem Iysovaných buněk, pro které se uvádí 100% enzymový obsah. Všechny hodnoty se generují za použití cytochalasinu B jakožto podpůrné sloučeniny.
Bylo již doloženo, že N-koncový podíl IL-8 molekuly s vysoce zakonzervovaným E-L-R motivem je potřebný pro receptorovou vazbu a signální transdukci. Trojrozměrná struktura IL-8 je homodimemí, přičemž N-zakončení jsou ve vystavené konfiguraci. Je možné, že biologická účinnost IL-8 je zrušena, když je N-zakončení blokováno přídavnými aminokyselinami. Proto restrikční místa (Ncol/Bcll) se zavádějí mezi dvě cDNA k zavedení spojovníkových peptidů a tím k obnovení dostupnosti N-zakončení.
Jiné možnosti pro vytvoření fúzovaných proteinů, jako chemická kopulace obou prvků, vedou ke spíše nedefinovaným strukturám, které se mohou v jednotlivých dávkách měnit. Kromě toho chemická kopulace může rozrušit sekundární strukturu ligandu nebo vytvořit situaci, kdy je většina proteinů neaktivní se zřetelem na receptorové vázání v důsledku nedostupnosti. Na rozdíl od přístupu podle vynálezu generuje fúze proteinů definované struktury, které mohou být expresovány v reprodukovatelné kvalitě téměř bez omezení.
Souhrnně možno konstatovat, že proteiny podle vynálezu mají tyto vlastnosti:
váží se na EGFR pozitivní buňky, způsobují chemotaktickou aktivitu, navozují uvolňování MPO a superoxidu, navozují lysi nádoru in šitu.
-5CZ 289641 B6
Proto jsou imunokonjugáty podle vynálezu vhodné pro nádorovou terapii.
Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis doplněný tabulkami a obrázky:
tabulka I sekvence primerů používaných pro PCR ke generaci buď Ncol, nebo Ball-místa k vytvoření fúzovaných proteinů pro eukaryotickou expresi obr. 1 modely imunokonjugátů protilátka-cytokin
C = cytokin, VH = variabilní oblast těžkého řetězce, VL = variabilní oblast lehkého řetězce, CH = konstantní oblast těžkého řetězce, CL = konstantní oblast lehkého řetězce, obr. 2 doložení MAb 425 v COS-7 transfekčním supematantu anti EGF-R ELISOU čtverečky: MAb 425-CH3 supematant trojúhelníčky: MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8 supematant obrácené trojúhelníčky: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8 supematant kolečka: pHCMV supematant vodorovná osa: zředění supematantu svislá osa: optická hustota při 490 nm.
obr. 3a navození chemotaxie COS-7 transfekčními supematanty sloupec I: kontrolní DMEM/PS sloupec II: pHCMV supematant nezředěný sloupec III: MAb 425-CH3 supematant zředěný 1:14 (podle výsledků EGF-r-ELISA) sloupec IV: MAb 425-CH3 supematant zředěný 1 : 28 (podle výsledků EGF-r-ELISA) sloupec V: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8 supematant zředěný (1,76 x 10'10 mol/1*) sloupec VI: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8 supematant zředěný 1 : 2 sloupec VII: MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8 supematant nezředěný (2,0 x 10'10 mol/1*) sloupec VIII: MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8 supematant zředěný* 1 : 2, IL-8 koncentrace zjištěna ELISA (Amersham) na svislé oseje počet buněk na čítané pole obr. 3b navození chemotaxie čištěným IL-8 na svislé oseje počet buněk na čítané pole na vodorovné oseje koncentrace IL-8 (mol/1) obr. 4 navození chemotaxie MAb 425-CH1-IL-8 (E. coli) kolečka: MAb 425-CH1-IL-8 expresovaný v E. coli čtverečky: MAb 425-F(ab’) expresovaný v E. coli trojúhelníčky: kontrola Dulbecco/BSA na svislé oseje počet buněk na čítané pole na vodorovné oseje koncentrace (mol/1) obr. 5 navození uvolňování superoxidu COS-7-transfekčními supematanty sloupec I: nestimulované buňky sloupec II: IL-8 10-7 M sloupec III: MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8 supematant nezředěný (2,0 x 10’10 mol/1*) sloupec IV: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8 supematant nezředěný (1,76 x 10’10 mol/1*)
-6CZ 289641 B6 sloupec V: MAb 425-CH3 supematant nezředěný (0 mol/1*)
IL-8 koncentrace zjištěna ELISA (Amersham) na svislé oseje optická hustota při 550 nm obr. 6 navození uvolňování MPO COS-7-transfekčními supematanty sloupec I: nestimulované buňky sloupec II: cytochalasinem B stimulované buňky sloupec III: IL-8 ΙΟ'7 M sloupec IV: MAb 425-CH3 supematant nezředěný sloupec V: MAb 425-CH3 supematant zředěný 1 : 2 sloupec VI: MAb 425-CH2-(Ncol)-lL-8 supematant nezředěný sloupec VII: MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8 supematant zředěný 1 : 2 sloupec VIII: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8 supematant nezředěný sloupec IX: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8 supematant zředěný 1 : 2 na svislé oseje % MPO aktivity ve srovnání s celkovým množstvím MPO (100 %)
Obecné poznámky
Všechny uváděné mikroorganismy, buněčné řady, plazmidy, promotory, signální znaky odolnosti, replikační počátky, restrikční místa, nebo jiné fragmenty vektorů jsou obchodně nebo jinak obecně dostupné. Pokud není jinak uvedeno, používá se jich toliko příkladně a nejsou podstatou vynálezu a mohou být popřípadě nahrazeny jinými vhodnými prostředky a biologickými materiály.
Způsoby, které jsou podle vynálezu podstatné, jsou níže popsány. Jiné způsoby, které nejsou podrobně popsány, odpovídají o sobě známým způsobem, které jsou pracovníkům v oboru dobře známy a jsou podrobně popsány v uváděných odkazech na patentovou a technickou literaturu (například „Antibodies, A Laboratory Manual“ [Protilátky, laboratorní příručka], Harlow, Lané, Cold Spring Harbor, 1988).
Monoklonální protilátky
MAb425 je IgGl myší monoklonální protilátka působící proti buněčné řadě lidského A 431 karcinoma (ATCC CRL 1555). MAb 425 se váže na polypeptidový epitop extemální domény lidského EGF receptoru a kompletuje s vázáním EGF. MAb 425 podle zjištění zprostředkovává nádorovou cytostatiku in vitro a potlačuje růst buněčné řady odvozené od nádorové buňky epidermoidního a colorektálního karcinoma (Rodeck a kol., Cancer Res. 47, str. 3692, 1987). Humanizované a chimérické verze MAb 425 jsou popsány v přihlášce WO 92/15683.
Chemokiny
Chemokin kódující cDNA je buď obchodním produktem společnosti British Biotechnology Limited (lidský IL-8 BBG44: Herrmann Biermann GmbH, Bad Neuheim FRG), nebo se generuje z mRNA izolovaného z cytokin produkující lidské buněčné řady (ATCC CRL 1593). Celá RNA z chemokin produkujících buněk se izoluje s RNAzolem (WAK-Chemie, Německo) podle pokynů výrobce. RNA se následně transkribuje do cDNA a chemokin kódující sekvence se PCR zesilují za použití vhodných primerů odvozených od zveřejněných DNA sekvencí.
Vektory pUC 19 je částí řady podobně vysokého čísla E. coli plazmid klonujících vektorů a obsahuje podíly pBR322 a M13mpl9. pUC 19 obsahuje navoditelný bakteriální lac promotor-operátor, následovaný mnohočetným klonovacím místem (Yanisch-Perron a kol., Gene 33, str. 103 až 109, 1985. pUC vektory jsou obchodními produkty (například společnosti NEW England Biolabs).
-7CZ 289641 B6 pBluescript KS/SK+ a KS/SK-fagemidové vektory jsou odvozeny od pUC19. Vektory jsou obchodními produkty (Stratagene, Heidelberg). Prokaryotické expresní vektory jsou založeny na pSWl vektoru (Ward a kol., Nátuře 341, str. 544 až 546, 1989), které jsou odvozeny od pUC19 vektoru, pSWl obsahuje sekvenci kódující pro vedoucí peptid bakteriálního pelB genu z Erwinia carotovora (Lei a kol., J. Bact. 169, str. 4379 až 4383, 1987). Cizí DNA se mohou zavádět do struktury za pelB vedoucí sekvence k přímé proteinové expresi do periplazma.
Eukaryotický expresní vektor pHCMV (Gilles a kol., Cell 33, str. 717, 1983) obsahuje počátek replikace opičího viru 40 (SV40) a promotor a podpůrnou oblast lidského cytomegaloviru. Systém promotor/podpůmá oblast je následován multiklonujícím místem pro zavedení genu, který má být expresován. V tomto vektoru se kombinuje chimemí forma variabilní oblasti těžkého řetězce MAb 425 a cgamalCH2 oblast fúzovaná s chemokinem na konci CH2 domény ke generaci fúzovaného proteinu MAb 425 těžkého řetězce. Fúzovaný Ig řetězec se může shromažďovat na imunokonjugát kombinací se vhodným lehkým řetězcem za vytvoření monovalentní antigen vázající oblasti, která se pak může asociovat za vytvoření dvouvalentního imunokonjugátu specifického pro cílový antigen. Konstrukty těžkého řetězce a lehkého řetězce se mohou vnést do jednoho nebo do oddělených vektorů.
Exprese fúzovaných proteinů v eukaryotických buňkách
Konstrukce eukaryotických expresních vektorů pro Fab 425-chemokinovou fúzní proteinovou expresi
Fúze MAb 425 a chemokinů technologií PCR
Lidská cgamal konstantní oblast se vnese do pUC 19 jakožto fragment BamHI/BamHII. Konstantní oblast cgamal obsahuje dvě SacII místa: jedno je v 5’ intronu, 40 bp ve směru od 5’BamHI místa a druhé je 580 bp ve směru od 5’BamHI místa a 140 bp proti začátku CH3 domény. Druhé SacII místo je vhodné pro další subklonování, a proto se první SacII místo rozrušuje zavedením SnaBI místa s adaptorem. V tomto konstruktu (deltaSac Π cgama) fragmenty ve směru od SacII místa se mohou snadno zaměnit.
Lidský IL-8 se vyřízne zpUC 18 vektoru (Bgl II/Eco RI) a vnese se do pBluescriptu SK+ (Stratagene GmbH, Heidelberg) (Smal/EcoRI), takže se místo BglII a Smál vypustí. Fragment SacII/Xbal delta SacIIcgama 1 se včlení do pBluescriptu SK+. Oba geny se zesílí vhodnými primery za použití technologie PCR:
- pro delta Sac II cgamal: 3’primer: koncová sekvence CH2 domény a Ncol-místo
5’primer: reversní sekvenční primer
- pro IL-8 3 'primer: univerzální sekvenční primer
5’primer: Ncol-místo a startovací sekvence IL-8
Produkty se řežou a ligatují s SK+SacII/EcoRI. V resultující peptidové sekvenci C-koncový lysin CH2 domény se zaměňuje za methionin a N-koncový serin IL-8 podílu se zaměňuje za glycin. Nově generované sekvence na spojení mezi dvěma polypeptidy je:
5’AAA GCC ATG GGT GCT 3’
Lys Ala Met Gly Ala cgamal CH2 IL-8 (2-72)
Stejný proces se provádí za použití primerů (tabulka I) k zavedení Bell místa mezi dva geny. Výsledný fúzovaný gen má Bell místo mezi konstantní oblastí cgamal genu a IL-8 genu, kódující plnou sekvenci domény CH2, dvě přídavné aminokyseliny (valin, izoleucin) a IL-8 sekvenci bez prvních dvou aminokyselin (serin, alanin).
-8CZ 289641 B6
Nově generovaná sekvence na spojení mezi dvěma polypeptidy je:
5’GCC AAA GTG ATC AAA GAA 3’ Ala Lys Val lle Lys Glu cgamalCH2 IL-8 (3-72)
PCR-produkty se subklonují do SK+ použitím SacII a EcoRI restrikčních míst. Pro eukaryotickou expresi těchto fúzovaných genů se klonují do pHCMV vektoru.
Tabulka I
| Konstrukt | Primer | DNA sekvence |
| CH2/NcoI | cyl 5’ | 5 ’-CAGGAAAC AGCTATGAC-3 ’ |
| cyl 3’ | 5’-TGATCCATGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCG-3’ | |
| IL-8/NcoI | IL-8 5’ | 5’-GATCTACCTGCCATGGGTGCTAAAGAA-3’ |
| IL-8 3’ | 5 ’-GTAAAACGACGGCCAGT-3 ’ | |
| CH2/BcII | cyl 5’ | 5 ’-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ’ |
| cyl 3’ | 5’-CGCGTGATCACTTTGGCTTTGGAGATGGTT-3’ | |
| IL-8/BcII | IL-8 5’ | 5 ’-CTCGTGATC AAAGAACTTAGATGTC AATGC-3 ’ |
| IL-8 3’ | 5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’ |
Exprese imunokonjugátů v eukaryotických buňkách
Exprese imunokonjugátů v eukaryotických buňkách vyžaduje zavedení vektoru DNA obsahující těžký a lehký řetězec do hostitelské buňky. Pro tento účel byly popsány četné způsoby například elektroporace, DEAE dextran, fosforečnan vápenatý, Lipofectin nebo protoplastová fuze. Může se použít jakéhokoliv typu hostitelské buňky za podmínky, že rekombinantní DNA sekvence, kódující imunokonjugát, je vhodně transkribována do mRNA v buněčném typu. Hostitelskými buňkami mohou být myší buňky myeloma, které neprodukují imunoglobulin, jako jsou například Sp2/O-AG14 (ATCC CRL 1581), P3X63Ag8,653 (ATCC CRL 1580), nebo buňky křečka například CHO-K1 (ATCC CCL 61), nebo CHO/DHFR- (ATCC CRL 9096) nebo BHK-21 (ATCC CCL 10). Pro přechodnou expresi se může použít COS-1 (ATCC CRL 1650 nebo COS-7 (ATCC CRL 1651).
Přechodná exprese imunokonjugátů
Expresní vektor pHCMV obsahuje počátek replikace opičího viru 40 (SV40). Buněčná řada COS-7 je derivátem buněčné opičí řady CV-1, která byla transformována s původním defektním SV40 virem. Protoplazmidy, obsahující počátek replikace, budou zesíleny a produkce imunokonjugátů se zlepší. Supematanty se shromáždí za 72 hodin a zkoušejí se se zřetelem na EGF receptorové vázání a chemokinovou koncentraci způsobem ELISA.
Permanentní exprese imunokonjugátů
Vektory, obsahující rekombinantní konstrukty pro expresi imunokonjugátů, se zavedou do vhodných hostitelských buněk. Konstrukty těžkých a lehkých řetězců mohou být umístěny do téhož vektoru nebo do oddělených vektorů. Při vnesení do oddělených vektorů mohou nést oba vektory stejný selekční signálový znak například odolnost neomycinu nebo dehydrofolátovou reduktasu (DHFR) nebo dva odlišné selekční signálové znaky k selekci na přítomnost obou vektorů. Selekce pro DHFR signální znak se může provádět pouze v DHFR negativních řadách buněk, jako je CHO/DHFR. Směsné populace se analyzují na expresi imunokonjugátů ELISA
-9CZ 289641 B6 specifickou pro EGF-receptor. Další selekce pro pozitivní monoklonály je dána omezením zřeďovacího klonování.
Čištění MAb 425 chemokinových imunokonjugátů
MAb 425 imunokonjugáty, produkované hostitelskými buňkami, se mohou shromažďovat a čistit jakýmkoliv běžným způsobem, například afinitní chromatografií za použití cílového antigenu, anticytokinové protilátky nebo antiidiotopické protilátky (jako například Harlow, Lané I.C.)
V předmětném případě se čištění provádí antiidiotopickou protilátkou, která je produkovaná MAb 425 o sobě známými způsoby (například Kostelny a kol., J. Immunol., 148, str. 1547, 1992). K získání čistých Fv-imunokonjugátů E. coli kmeny vhodné pro proteinovou expresi se transformují expresními plazmidy (jak níže uvedeno). Buňky se nechají růst do velikosti OD578 = 0,5 a indukují se s izopropyl-P-D-thiogalaktopyranosidem (IPTG) (1 mM). Buňky se nechávají růst přes noc a supematanty a buňky se shromáždí. Supematant se nanese na antiMMAb 425 antiidiotypický sloupec, připravený o sobě známými způsoby. Sloupec se promyje fosfátem pufrovaným roztokem 0,5 M chloridu sodného a vázaný protein se eluuje se 100 mM glycinem 0,5 M roztokem chloridu sodného při hodnotě pH 2,5. Eluát se bezprostředně neutralizuje Tris 2,5 M, hodnota pH 8,0. MAb 425-CH1-IL-8 obsahující frakce se spojí, zkoncentrují a dialyzují se proti pBS.
Konstrukce prokaryotických expresních vektorů pro Fav425-chemokinovou a Fv-chemokinovou fúzní proteinovou expresi
Připraví se Fv fragment způsobem, který popsal Glockshuber a kol. (Biochemistry 29, str. 1362 až 1367, 1990). DNA sekvence kódující pro lehký řetězec a Fd fragment těžkého řetězce nebo Fv fragment se zavádějí do mnohočetného klonujícího místa pSWl vektoru. Zralý lehký řetězec kódující sekvence, zralý těžký řetězec kódující sekvence a Fv kódující sekvence jsou předcházeny vedoucím peptidem bakteriálního pel B genu. Těžký řetězec kódující sekvence obsahuje Ncol (3’ zakončení) místo. Chemokin kódující cDNA se modifikuje PCR k zavedení Ncol (5’ zakončení) a Notl (3’ zakončení) nebo EcoRI (pro Fv fúzi) restrikční místa. Chemokinové geny se fúzují do rámce přímo do domény CH1 těžkého řetězce nebo Fv fragmentu. Nebo spojovníkový peptid například (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x, kde x znamená 1 až 4, se může zavádět mezi CH1 doménu a chemokinový gen. Takové spojovníky a způsoby jejich přípravy jsou v literatuře popsány (například Curtis a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88, str. 5809,1991).
Tyto vektory umožňují účinnou expresi funkcionálního F(ab’) (=CH1) a Fv chemokinových fúzovaných proteinů v E. coli. Lehký řetězec a těžký řetězec chemokinového fúzovaného proteinu jsou umístěny na jednotlivém dicistronickém mediátoru RNA, umístěném za řízení navoditelného lac promotoru (Skerra a Pliickthun, Science 242, str. 1038 až 1040, 1988). Proto exprese Fab/Fv fúzovaného proteinu se může navodit podle požadavků kultivačních podmínek. Translace obou proteinů od dicistronického mediátoru RNA podporuje syntézu stejných množství Fd-chemokinového fúzovaného proteinu a lehký řetězec tak zvyšuje možnosti správného vytvoření funkčních Fab/Fv fúzovaných proteinů. Dva polypeptidy se sekretují do periplazmy E. coli, kde se ohýbají, vytvářejí disulfidické vazby a dochází k vytváření funkčního Fab 425CH1/Fv fúzovaného proteinu, prodloužená kultivace bakterie vede k částečné permeabilizaci venkovní membrány E. coli umožňující difúzi fúzovaného proteinu do kultivačního prostředí.
Vazné vlastnosti MAb 425 imunokonjugátů
Vazné vlastnosti MAb 425 imunokonjugátů se stanovují EGF receptorovou specifickou ELISA. Mikrotitrové destičky se povléknou přes noc při teplotě 4 °C čištěným EGF receptorem. Destičky se inkubují se supematanty obsahujícími fúzovaný protein nebo se supematanty obsahujícími nekonjugované MAb fragmenty. Destičky se omyjí a odstraní se nevázaný materiál a protilátka,
-10CZ 289641 B6 vázaná na EGF receptor, se zjišťuje inkubací s kozím antihumánním IgG a IgM (těžký a lehký řetězec) konjugovanými na peroxidázu následovanou substrátem. Množství specifického proteinu vázaného EGF receptorem se stanovuje měřením při 490 nm.
Biologická aktivita MAb 425-IL-8 imunokonjugátů
Izolace efektorových buněk
Pro stanovení biologické účinnosti se čerstvě izolují lidské periferální krevní neutrofilní granulocyty z krve jako celku zdravých dárců, jak popsal Haslett a kol. (Am. J. Pathol. 119, str. 101 až 110, 1985). Plazma se oddělí odstředěním, erythrocyty, dextranovou sedimentací alymfocyty a leukocyty se oddělí nakonec percollgradientovým odstředěním. Izolovaných neutrofilů se použije bezprostředně.
Stanovení chemotaktické aktivity
Stanovení chemotaktické aktivity se provádí způsobem, který popsal Falk a kol. (J. Immunol. Methods 33, str. 239 až 247, 1980). Použije se 48 důlkové komůrky a 5 pm membrán. Čištěné neutrofily se resuspendují v prostředí DMEM (DMEM, 1 % penicilinu, 1 % streptomycinu, 10 % FCS, 2mM L-gluthaminu, 1 mM pyruvátu sodného, 10 mM HEPES) v koncentraci 1 x 106 buněk/ml. Do nižších důlků se vnesou supematanty obsahující fúzovaný protein nebo kontrolní supematanty, pokryjí se membránou a nakonec se do horních důlků vnese suspenze buněk. Po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 30 minut se membrány odstraní a fixují se ve 2% glutardialdehydu po dobu 10 minut. Pak se buňky, vázané na membránu, zabarvují Weigertovým hematoxylinem železa (Sigma diagnostic) po dobu tří minut. Mikroskopicky se stanoví počet buněk vázaných na membráně.
Stanovení kapacity k navození uvolňování enzymu v neutrofilech
K hodnocení kapacity imunokonjugátů na neutrofilech k navození uvolňování granula se monitoruje myeloperoxidázová aktivita v supematantu (Henson a kol., J. Immunol. 121, str. 851, 1978). Zkouška se provádí na 96 důlkové mikrotitrové destičce s 5 x 105 buněk na důlek. Po inkubaci (při teplotě 37 °C) se stimuli se destičky odstředí a volné buňky supematantu se přenesou na jinou 96 důlkovou mikrotitrovou destičku. Volné buňky supematantu se inkubují s dianisidinem (jakožto substrátem) a měří se absorbance při 492 nm. Použije se pozitivní kontroly FMLP v 10'7 M koncentraci. Pro stanovení celkového množství enzymu se buňky bez stimuli lysují tritonem. Aktivita se vypočte jako procento celkového obsahu enzymu (lysis).
Stanovení kapacity uvolňování superoxidu
Cytochrom c se redukuje kyslíkem O2' a tím se mění absorbance. Změna absorbance představuje hodnotný znak pro stanovení superoxidové aktivity. Zkouška se provádí způsobem, který popsal Guthrie a kol. (J. Exp. Med. 160, str. 1656 až 1671, 1984) na 96 důlkové mikrotitrové destičce s 5 x 105 buněk na důlek. Po inkubaci se stimuli a cytochromem c se destičky odstředí a stanovuje se absorbance supematantu při 550 nm.
Další imunokonjugáty
Jak shora popsáno se připravují a zkoumají anti EGFR-CH1, -CH2, -CH3 a -Fv imunokonjugáty (s/bez restrikčního místa a spojovníku), obsahující MIP-2a a ΜΙΡ-2β jakožto chemokinovou složku. Tyto konstrukty mají podobné vlastnosti jako IL-8 deriváty.
-11 CZ 289641 B6
Terapeutické použití imunokonjugátů
Imunokonjugáty podle vynálezu se mohou podávat lidem jako terapeutické ošetřování. Vynález se proto také týká farmaceutických prostředků, které obsahují jakožto účinnou látku alespoň jeden fúzovaný protein shora definovaný a definovaný v patentových nárocích, spolu s jedním nebo s několika farmaceuticky vhodnými nosiči, excipienty nebo ředidly.
Zpravidla se imunokonjugáty podle vynálezu podávají intravenosně nebo parenterálně. Obecně podávaná dávka imunokonjugátu má být dostatečná k dostatečnému potlačení nádoru a k lysi nádoru. Tato dávka závisí na věku, stavu, pohlaví a rozsahu onemocnění a může být 0,1 až 200 mg/kg tělesné hmotnosti, s výhodou 0,1 až 100 mg/kg ve formě jedné nebo několika denních dávek po dobu jednoho nebo několika dní.
Farmaceutické prostředky pro parenterální podání obsahují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze nebo emulze. Jakožto příklady nevodných rozpouštědel se uvádějí propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, například olivové oleje a vstřikovatelné organické estery, jako je ethyloleát a jiná rozpouštědla známá v oboru a vhodná pro uvedené účely. Imunokonjugátů podle vynálezu se může používat ve farmaceutických prostředcích obsahujících fyziologicky vhodný nosič. Jakožto příklady vhodných nosičů se uvádějí solanka, PBS, Ringerův roztok nebo laktátovaný Ringerův roztok. Farmaceutické prostředky mohou obsahovat také konzervační přísady a jiné přísady, jako jsou příkladně antibiotika, antioxidanty a chelatační činidla.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou vhodné pro ošetřování všech druhů nádorů, včetně melanoma, glioma a karcinoma, jakož také krevních nádorů a pevných nádorů.
Průmyslová využitelnost
Imunokonjugát obsahující monoklonální protilátku nebo její fragment specifické pro lidskou EGF receptorovou molekulu a člen rodu chemokinů, volený s výhodou z rodu C-X-C například interleukin-8 (IL-8) navozuje cytotoxickou a chemotaktickou aktivitu a je vhodný pro cílenou nádorovou terapii.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (13)
1. Imunokonjugát obsahující monoklonální protilátku nebo její fragment, vybraný ze souboru zahrnujícího Fv, Fab, F(ab’)2 a CH3 a CH2, zaměřený na nádorovou buňku nesoucí antigenový epitop receptorů epidermálního růstového faktoru a chemokinový protein z rodu C-X-C, který je fúzován na protilátku nebo na protilátkový fragment.
2. Imunokonjugát podle nároku 1, přičemž chemokinem je IL-8.
3. Imunokonjugát podle nároků 1 a 2, označený jako konjugát/protilátka-CHl, kde protilátka je Fab fragment nebo F(ab’)2 fragment sestávající z variabilní oblasti protilátkového těžkého řetězce, CH1 domény konstantní oblasti a ze vhodného lehkého řetězce.
4. Imunokonjugát podle nároků 1 a 2, označený jako konjugát/protilátka-CH2, kde protilátka je protilátkový fragment sestávající z variabilní oblasti protilátkového těžkého řetězce, CH1 a CH2 domén konstantní oblasti a ze vhodného lehkého řetězce.
-12CZ 289641 B6
5. Imunokonjugát podle nároků 1 a 2, označený jako konjugát/protilátka-CH3, kde protilátka je protilátkový fragment sestávající z variabilní oblasti protilátkového těžkého řetězce, CH1, CH2 a CH3 domén konstantní oblasti a ze vhodného lehkého řetězce.
6. Imunokonjugát podle nároků 1 a 2, označený jako konjugát/protilátka-Fv, kde protilátka je protilátkový fragment sestávající z variabilní oblasti protilátkového těžkého řetězce, ze vhodného lehkého řetězce a z polypeptidové sekvence, která váže lehký a těžký řetězec.
7. Imunokonjugát podle nároků 1 až 5, obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je dedukovatelná na DNA restrikční místo mezi systémem protilátka/protilátkový fragment a chemokinovým proteinem z rodu C-X-C, kde je restrikční místo jedinečné v kompletu fúzovaného konstruktu.
8. Imunokonjugát podle nároků 1 až 6, obsahující spojovníkový peptid mezi systémem protilátka/protilátkový fragment a chemokinovým proteinem z rodu C-X-C.
9. Imunokonjugát podle nároků 1 až 7, přičemž protilátka/protilátkový fragment jsou odvozeny od myšího humanizovaného nebo chimemího MAb 425.
10. Imunokonjugát volený podle nároku 1 ze souboru zahrnujícího MAb 425-CH1-IL-8, MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8, MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8, MAb 25-Fv-IL-8 a MAb 425-CH3-IL-8.
11. Způsob přípravy imunokonjugátu podle nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se fúzují DNA sekvence kódující vzájemně protilátku nebo fragment protilátky a chemokinový protein zrodu C-X-C sjednořetězcovou DNA prostřednictvím oligonukleotidu, který je komplementární se zřetelem na žádanou fúzovanou DNA sekvenci, umísťuje se vzniklý konstrukt do expresního vektoru, který je transformován do hostitelského organismu, kultivují se hostitelské buňky v živném roztoku a expresuje se fúzovaný protein.
12. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden imunokonjugát podle nároků 1 až 10 a fyziologicky vhodný nosič.
13. Použití imunokonjugátu podle nároků 1 až 10 pro přípravu farmaceutického prostředku proti nádorům.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94114572 | 1994-09-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ237595A3 CZ237595A3 (en) | 1996-04-17 |
| CZ289641B6 true CZ289641B6 (cs) | 2002-03-13 |
Family
ID=8216289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19952375A CZ289641B6 (cs) | 1994-09-16 | 1995-09-14 | Imunokonjugát, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5824782A (cs) |
| EP (1) | EP0706799B1 (cs) |
| JP (2) | JP3865802B2 (cs) |
| KR (1) | KR100386171B1 (cs) |
| CN (1) | CN1123185A (cs) |
| AT (1) | ATE208633T1 (cs) |
| AU (1) | AU702184B2 (cs) |
| CA (1) | CA2158322C (cs) |
| CZ (1) | CZ289641B6 (cs) |
| DE (1) | DE69523857T2 (cs) |
| DK (1) | DK0706799T3 (cs) |
| ES (1) | ES2167391T3 (cs) |
| HU (1) | HU221989B1 (cs) |
| NO (1) | NO315976B1 (cs) |
| PL (1) | PL182636B1 (cs) |
| PT (1) | PT706799E (cs) |
| RU (1) | RU2157701C2 (cs) |
| SK (1) | SK282263B6 (cs) |
| UA (1) | UA40611C2 (cs) |
| ZA (1) | ZA957808B (cs) |
Families Citing this family (80)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998055607A2 (en) * | 1997-06-04 | 1998-12-10 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Tumor targeted vector |
| WO2001036486A2 (en) * | 1999-11-18 | 2001-05-25 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Scfv antibodies against disease associated molecules |
| US7635687B2 (en) * | 1997-06-04 | 2009-12-22 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Vector system |
| US7276488B2 (en) * | 1997-06-04 | 2007-10-02 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Vector system |
| DE69824039T2 (de) | 1997-12-08 | 2005-08-18 | Lexigen Pharmaceuticals Corp., Lexington | Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung |
| US6562347B1 (en) | 1998-03-12 | 2003-05-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Chemokine-tumor antigen fusion proteins as cancer vaccines |
| NZ506877A (en) * | 1998-03-31 | 2002-04-26 | Tanabe Seiyaku Co | Benzenesulfonamide compounds useful in treating dysuria |
| PL343462A1 (en) * | 1998-04-15 | 2001-08-13 | Lexigen Pharm Corp | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor |
| RU2217168C2 (ru) * | 1998-04-17 | 2003-11-27 | Лексиген Фармасьютикэлс Корпорейшн | Усиление иммунных ответов, опосредованных белками, слитыми из антитела и цитокина, посредством совместного введения ингибитора простагландина |
| US6869606B1 (en) | 1999-02-22 | 2005-03-22 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Biotinylated-chemokine antibody complexes |
| WO2000078334A1 (en) * | 1999-06-17 | 2000-12-28 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor |
| GB9915074D0 (en) * | 1999-06-28 | 1999-08-25 | Cortecs Plc | Ligand-binding composition |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| BR0013231A (pt) | 1999-08-09 | 2002-07-23 | Lexigen Pharm Corp | Complexos citocina-anticorpo múltiplos |
| US6319675B1 (en) | 1999-11-24 | 2001-11-20 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods for detecting and/or identifying agents which bind and/or modulate function of “bonzo” chemokine receptor |
| US7208152B2 (en) * | 1999-11-24 | 2007-04-24 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies for “Bonzo” chemokine receptor and therapeutic uses thereof |
| ES2269366T3 (es) | 2000-02-11 | 2007-04-01 | Merck Patent Gmbh | Mejoramiento de la vida media en circulacion de proteinas de fusion basadas en anticuerpos. |
| DE10019157A1 (de) * | 2000-04-18 | 2001-11-15 | Stefan Duebel | Verfahren zum Einbringen von Liganden in lebende Zellen |
| CN1239701C (zh) * | 2000-05-19 | 2006-02-01 | 梨树化学株式会社 | 抗表皮生长因子受体的人源化抗体 |
| AU2001291049A1 (en) | 2000-09-15 | 2002-03-26 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health, Office Of Technology Transfer | Defensin-antigen fusion proteins |
| AU2001291050A1 (en) | 2000-09-15 | 2002-03-26 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Viral chemokine-tumur antigen fusion proteins |
| GB0029407D0 (en) * | 2000-12-01 | 2001-01-17 | Affitech As | Product |
| BR0207854A (pt) | 2001-03-07 | 2004-08-24 | Merck Patent Gmbh | Tecnologia de expressão para proteìnas contendo uma porção de anticorpo de isotipo hìbrido |
| US6992174B2 (en) | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| DE60239454D1 (de) | 2001-05-03 | 2011-04-28 | Merck Patent Gmbh | Rekombinanter, tumorspezifischer antikörper und dessen verwendung |
| EP1256354A1 (en) * | 2001-05-11 | 2002-11-13 | Schering Corporation | Methods for treating cancer |
| US20020193569A1 (en) * | 2001-06-04 | 2002-12-19 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells |
| CN100497389C (zh) | 2001-06-13 | 2009-06-10 | 根马布股份公司 | 表皮生长因子受体(egfr)的人单克隆抗体 |
| US7595378B2 (en) | 2001-06-13 | 2009-09-29 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR) |
| DE60237282D1 (de) * | 2001-06-28 | 2010-09-23 | Domantis Ltd | Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung |
| WO2004058821A2 (en) * | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand |
| GB0126378D0 (en) * | 2001-11-02 | 2002-01-02 | Oxford Biomedica Ltd | Antigen |
| ES2381025T3 (es) | 2001-12-04 | 2012-05-22 | Merck Patent Gmbh | Inmunocitocinas con selectividad modulada |
| JP4212921B2 (ja) * | 2002-03-29 | 2009-01-21 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 抗体を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤およびタンパク質中空ナノ粒子 |
| PT1517921E (pt) * | 2002-06-28 | 2006-09-29 | Domantis Ltd | Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada |
| US9321832B2 (en) * | 2002-06-28 | 2016-04-26 | Domantis Limited | Ligand |
| US7696320B2 (en) | 2004-08-24 | 2010-04-13 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor |
| US20040110929A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-06-10 | Bjorn Soren E. | TF binding compound |
| EP1551876B1 (en) | 2002-10-16 | 2011-03-16 | Purdue Pharma L.P. | Antibodies that bind cell-associated ca 125/0722p and methods of use thereof |
| US7388079B2 (en) * | 2002-11-27 | 2008-06-17 | The Regents Of The University Of California | Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor |
| JP4494977B2 (ja) | 2002-12-17 | 2010-06-30 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Ｇｄ２に結合するマウス１４．１８抗体のヒト化抗体（ｈ１４．１８）およびそのｉｌ−２融合タンパク質 |
| US8795672B2 (en) * | 2003-02-14 | 2014-08-05 | University Of Southern California | Compositions and methods for cancer immunotherapy |
| CA2551915C (en) | 2003-12-30 | 2015-06-23 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Il-7 fusion proteins |
| EP1702069A2 (en) | 2004-01-05 | 2006-09-20 | EMD Lexigen Research Center Corp. | Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin |
| US7670595B2 (en) | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
| GB2424886A (en) | 2005-04-04 | 2006-10-11 | Dxs Ltd | Polynucleotide primers against epidermal growth factor receptor and method of detecting gene mutations |
| US8053569B2 (en) * | 2005-10-07 | 2011-11-08 | Armagen Technologies, Inc. | Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins |
| US8741260B2 (en) * | 2005-10-07 | 2014-06-03 | Armagen Technologies, Inc. | Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS |
| US8124095B2 (en) * | 2005-10-07 | 2012-02-28 | Armagen Technologies, Inc. | Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS |
| TW200730539A (en) * | 2005-12-01 | 2007-08-16 | Domantis Ltd | Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1 |
| US8497246B2 (en) * | 2006-08-18 | 2013-07-30 | Armagen Technologies, Inc. | Methods for diagnosing and treating CNS disorders by trans-blood-brain barrier delivery of protein compositions |
| CN101173008B (zh) * | 2006-11-01 | 2011-06-22 | 复旦大学 | 一种双功能融合蛋白及其制备方法和应用 |
| US20090011040A1 (en) * | 2007-05-02 | 2009-01-08 | Naash Muna I | Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases |
| KR20100040840A (ko) | 2007-06-06 | 2010-04-21 | 도만티스 리미티드 | 폴리펩티드，항체 가변 도메인 및 길항제 |
| US8974791B2 (en) | 2007-07-27 | 2015-03-10 | Armagen Technologies, Inc. | Methods and compositions for increasing α-L-iduronidase activity in the CNS |
| BRPI0817108B8 (pt) | 2007-09-21 | 2021-05-25 | Univ California | composição compreendendo uma proteína de fusão, kit compreendendo a referida composição e uso da mesma. |
| EP2262531A1 (en) * | 2008-03-08 | 2010-12-22 | Immungene, Inc. | Engineered fusion molecules immunotherapy in cancer and inflammatory diseases |
| US20100098693A1 (en) * | 2008-10-07 | 2010-04-22 | Pardridge William M | Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of organophosphatases |
| RU2636046C2 (ru) | 2009-01-12 | 2017-11-17 | Сайтомкс Терапьютикс, Инк | Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения |
| WO2010108048A2 (en) | 2009-03-18 | 2010-09-23 | Armagen Technologies, Inc. | Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of igg-decoy receptor fusion proteins |
| CA2759333A1 (en) | 2009-04-22 | 2010-10-28 | Merck Patent Gmbh | Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites |
| SI2485761T1 (sl) | 2009-10-09 | 2019-05-31 | Armagen, Inc. | Postopki in sestavki za povečanje aktivnosti iduronat-2-sulfataze v CŽS |
| UY34317A (es) | 2011-09-12 | 2013-02-28 | Genzyme Corp | Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß |
| EP3559049A4 (en) | 2011-10-28 | 2019-12-04 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | POLYPEPTIDE CONSTRUCTS AND APPLICATIONS THEREOF |
| JP6266529B2 (ja) | 2011-12-02 | 2018-01-24 | アーマジェン・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ， Ｉｎｃ． | Ｃｎｓにおけるアリールスルファターゼａ活性を増加するための方法および組成物 |
| US9790268B2 (en) | 2012-09-12 | 2017-10-17 | Genzyme Corporation | Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function |
| US9803021B2 (en) | 2012-12-07 | 2017-10-31 | The Regents Of The University Of California | CD138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities |
| IL275376B2 (en) | 2013-03-11 | 2024-01-01 | Genzyme Corp | Polypeptides with hyperglycosidic bonds |
| US11117975B2 (en) | 2013-04-29 | 2021-09-14 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B |
| EP2992013B1 (en) | 2013-04-29 | 2019-12-04 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b |
| US10093745B2 (en) | 2013-05-29 | 2018-10-09 | The Regents Of The University Of California | Anti-CSPG4 fusions with interferon for the treatment of malignancy |
| SG10201808158UA (en) | 2014-03-19 | 2018-10-30 | Genzyme Corp | Site-specific glycoengineering of targeting moieties |
| UA119352C2 (uk) | 2014-05-01 | 2019-06-10 | Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд | Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину |
| CA2964123C (en) | 2014-10-09 | 2023-09-05 | Genzyme Corporation | Glycoengineered antibody drug conjugates |
| AU2015337858B2 (en) | 2014-10-29 | 2020-09-24 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. | Interferon alpha2b variants |
| US10538589B2 (en) | 2015-01-14 | 2020-01-21 | Armagen Inc. | Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU |
| WO2018014067A1 (en) | 2016-07-19 | 2018-01-25 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | Anti-cd47 combination therapy |
| AU2018338786A1 (en) * | 2017-09-29 | 2020-04-16 | Nantcell, Inc. | Antigenic proteins and methods therefor |
| EP3898615A1 (en) | 2018-12-19 | 2021-10-27 | Array Biopharma, Inc. | 7-((3,5-dimethoxyphenyl)amino)quinoxaline derivatives as fgfr inhibitors for treating cancer |
| CN113490666A (zh) | 2018-12-19 | 2021-10-08 | 奥瑞生物药品公司 | 作为fgfr酪氨酸激酶的抑制剂的取代的吡唑并[1,5-a]吡啶化合物 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5470571A (en) * | 1988-01-27 | 1995-11-28 | The Wistar Institute | Method of treating human EGF receptor-expressing gliomas using radiolabeled EGF receptor-specific MAB 425 |
| IE63847B1 (en) * | 1989-05-05 | 1995-06-14 | Res Dev Foundation | A novel antibody delivery system for biological response modifiers |
| US5112946A (en) * | 1989-07-06 | 1992-05-12 | Repligen Corporation | Modified pf4 compositions and methods of use |
| US5314995A (en) * | 1990-01-22 | 1994-05-24 | Oncogen | Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins |
| CA2078689C (en) * | 1990-03-20 | 2003-02-11 | Sherie L. Morrison | Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region |
| EP0574395B1 (en) * | 1990-11-09 | 2002-06-12 | GILLIES, Stephen D. | Cytokine immunoconjugates |
| JP3854306B2 (ja) * | 1991-03-06 | 2006-12-06 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | ヒト化及びキメラモノクローナル抗体 |
| JPH06509563A (ja) * | 1991-07-05 | 1994-10-27 | セラゲン・インコーポレイテッド | 炎症性関節炎の治療用の表皮細胞成長因子受容体を標的とする分子 |
| DK0586002T3 (da) * | 1992-08-18 | 2000-06-19 | Centro Inmunologia Molecular | Monoklonale antistoffer, som genkender epidermisvækstfaktor-receptoren, celler og fremgangsmåder heraf og præparater indeho |
-
1995
- 1995-09-06 ES ES95113956T patent/ES2167391T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-06 DE DE69523857T patent/DE69523857T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-06 AT AT95113956T patent/ATE208633T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-09-06 EP EP95113956A patent/EP0706799B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-06 PT PT95113956T patent/PT706799E/pt unknown
- 1995-09-06 DK DK95113956T patent/DK0706799T3/da active
- 1995-09-08 AU AU30533/95A patent/AU702184B2/en not_active Ceased
- 1995-09-11 JP JP23283295A patent/JP3865802B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-13 SK SK1145-95A patent/SK282263B6/sk unknown
- 1995-09-14 CN CN95116279A patent/CN1123185A/zh active Pending
- 1995-09-14 CZ CZ19952375A patent/CZ289641B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-09-14 CA CA002158322A patent/CA2158322C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-14 UA UA95094164A patent/UA40611C2/uk unknown
- 1995-09-15 ZA ZA957808A patent/ZA957808B/xx unknown
- 1995-09-15 NO NO19953650A patent/NO315976B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-09-15 KR KR1019950030385A patent/KR100386171B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-09-15 PL PL95310493A patent/PL182636B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-09-15 RU RU95115976/14A patent/RU2157701C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-09-15 HU HU9502711A patent/HU221989B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-09-15 US US08/528,523 patent/US5824782A/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-11-17 JP JP2005332965A patent/JP2006117684A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0706799A3 (en) | 1996-12-04 |
| DK0706799T3 (da) | 2002-02-25 |
| AU3053395A (en) | 1996-03-28 |
| RU2157701C2 (ru) | 2000-10-20 |
| KR960010023A (ko) | 1996-04-20 |
| PT706799E (pt) | 2002-05-31 |
| ZA957808B (en) | 1996-05-07 |
| PL182636B1 (pl) | 2002-02-28 |
| NO953650L (no) | 1996-03-18 |
| CN1123185A (zh) | 1996-05-29 |
| SK114595A3 (en) | 1997-03-05 |
| HU9502711D0 (en) | 1995-11-28 |
| CZ237595A3 (en) | 1996-04-17 |
| ATE208633T1 (de) | 2001-11-15 |
| JPH0899901A (ja) | 1996-04-16 |
| ES2167391T3 (es) | 2002-05-16 |
| NO953650D0 (no) | 1995-09-15 |
| CA2158322C (en) | 2009-06-16 |
| EP0706799B1 (en) | 2001-11-14 |
| JP2006117684A (ja) | 2006-05-11 |
| DE69523857T2 (de) | 2002-06-13 |
| SK282263B6 (sk) | 2001-12-03 |
| PL310493A1 (en) | 1996-03-18 |
| DE69523857D1 (de) | 2001-12-20 |
| HU221989B1 (hu) | 2003-03-28 |
| UA40611C2 (uk) | 2001-08-15 |
| CA2158322A1 (en) | 1996-03-17 |
| NO315976B1 (no) | 2003-11-24 |
| EP0706799A2 (en) | 1996-04-17 |
| US5824782A (en) | 1998-10-20 |
| KR100386171B1 (ko) | 2003-08-21 |
| JP3865802B2 (ja) | 2007-01-10 |
| HUT75836A (en) | 1997-05-28 |
| AU702184B2 (en) | 1999-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ289641B6 (cs) | Imunokonjugát, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje | |
| RU2129018C1 (ru) | Иммуноконьюгат, способ получения иммуноконьюгата и фармацевтическая композиция | |
| US5650150A (en) | Recombinant antibody cytokine fusion proteins | |
| CA2095836C (en) | Cytokine immunoconjugates | |
| Chen et al. | Potent antitumour activity of a new class of tumour-specific killer cells | |
| CA2411470C (en) | T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof | |
| WO1995009917A1 (en) | Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies | |
| KR20010022075A (ko) | T세포활성화를유도하는슈퍼항원접합체에의한표적세포의세포용해 | |
| JP7356726B2 (ja) | タンパク性ヘテロ二量体及びその使用 | |
| WO2007122511A2 (en) | Antibody-rnase-conjugate | |
| Barth et al. | Construction and in vitro evaluation of RFT5 (scFv)-ETA', a new recombinant single-chain immunotoxin with specific cytotoxicity toward CD25+ Hodgkin-derived cell lines. | |
| Choe et al. | B3 (Fab)-PE38M: a recombinant immunotoxin in which a mutant form of Pseudomonas exotoxin is fused to the Fab fragment of monoclonal antibody B3 | |
| CA2318284A1 (en) | Antibody/receptor targeting moiety for enhanced delivery of armed ligand | |
| Sun et al. | Antitumour activity of a chimeric antibody against the leucocyte antigen CD48 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20040914 |