SK282263B6 - Imunokonjugát, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje - Google Patents

Imunokonjugát, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje Download PDF

Info

Publication number
SK282263B6
SK282263B6 SK1145-95A SK114595A SK282263B6 SK 282263 B6 SK282263 B6 SK 282263B6 SK 114595 A SK114595 A SK 114595A SK 282263 B6 SK282263 B6 SK 282263B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antibody
immunoconjugate
mab
fragment
chemokine
Prior art date
Application number
SK1145-95A
Other languages
English (en)
Other versions
SK114595A3 (en
Inventor
Wolfgang H�Lzer
Hoegen Ilka Von
Wolfgang Strittmatter
Siegfried Matzku
Original Assignee
Merck Patent Gesellschaft Mit Beschr�Nkter Haftung
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gesellschaft Mit Beschr�Nkter Haftung filed Critical Merck Patent Gesellschaft Mit Beschr�Nkter Haftung
Publication of SK114595A3 publication Critical patent/SK114595A3/sk
Publication of SK282263B6 publication Critical patent/SK282263B6/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Imunokonjugát obsahujúci monoklonálnu látku alebo jej fragment špecifický pre ľudskú EGF receptorovú molekulu a chemokinový proteín, ktorý je fúzovaný na protilátku zvolený z rodu C-X-C napríklad interleukín-8 (IL-8), ktorý navodzuje cytotoxickú a chemotaktickú aktivitu a je vhodný na cielenú nádorovú terapiu.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka nových fuzovaných proteínov, ktoré sa skladajú z cieľového prvku, spojeného s nádorom, výhodne z monoklonálnej protilátky alebo z jej fragmentu rozoznávajúceho molekulu, ktorý je prednostne expresovaný na ľudských nádorových bunkách, ako je napríklad ľudský epidermálny rastový faktorový receptor (EGFR = „Epidermal growth factor receptor“) a biologicky aktívny ligand zo súboru zahŕňajúceho chemokínové proteíny, výhodne z rodu C-X-C. Výsledné fúzované proteíny sa môžu používať na uvoľňovanie biologicky aktívneho ligandu, na špecifickú cieľovú bunku alebo tkanivo. Nové imunokonjugáty sa môžu používať v terapii nádorov. Vynález sa tiež týka spôsobu ich prípravy a farmaceutického prostriedku, ktorý ho obsahuje.
Doterajší stav techniky
Na ošetrovanie pacientov s rakovinou boli vyvinuté rôzne terapeutické koncepty. V minulosti sa vykonávali klinické skúšky s monoklonálnymi protilátkami, ktoré rozpoznávajú špecificky alebo prednostne bunečné povrchové molekuly, exprimované na malígnych bunkách. Zámerom tohto prístupu je navodiť na protilátke závislej bunečnej cytotoxicity (ADCC = antibody-dependent cellular toxicity) alebo komplementom sprostredkovávanej cytotoxicity elimináciu nádorových buniek. Druhým prístupom je cytokínom sprostredkovávaná aktivácia imunitnej odozvy. Cytokínom navodená protinádorová aktivita sa môže sprostredkovávať:
1. priamym cytotoxickým/cytostatickým pôsobením cytokínu na rast nádoru,
2. tumor-antigénovými nešpecifickými mechanizmami, ako sú LAK aktivita alebo systémom monocyt/granulocyt sprostredkovávaná cytotoxicita,
3. nádor-antigénovými špecifickými imunitnými odozvami sprostredkovávanými CD4 a CD8-pozitívnymi T-bunkami.
Za týchto okolností bola pozorovaná systemická imunita voči nádoru na zvieracích modeloch.
Ale cytotoxicita vysokých dávok cytokínov a nedostatočnosť prítomnosti in situ vedie ku konceptu cieľovej nádorovej terapie. Princíp cieľovej nádorovej terapie je založený na fyzikálnej väzbe cieľovej molekuly, napríklad monoklonálnej protilátky špecifickej pre antigén, spojený s nádorom, s biologicky aktívnou efektorovou molekulou. Uvoľňovanie efektorových molekúl cieľovou molekulou by malo zvyšovať cytokínovú koncentráciu v nádore a znižovať maximálnu potrebnú dávku. V prípade zvieracích modelov sa doložilo, že prítomnosť in situ cytokínu buď intranádorovou injekciou alebo sekréciou transfektovaných nádorových buniek môže viesť k regresii nádoru (Colombo a Fomi, Immunology Today 15, str. 48 až 51, 1994). V týchto systémoch cytokíny nenarušujú proliferáciu buniek, sú však schopné aktivácie a rýchlej a mohutnej protinádorovej reakcie. Preto fyzikálne spojenie efektorovej molekuly a cieľového prvku predstavuje prostriedky zníženia periferálnej prítomnosti a podporuje intranádorovú dostupnosť biologicky aktívneho ligandu. Okrem toho, jednotlivé nádorové bunky alebo mikrometastázy sa tiež môžu zacieľovať týmito molekulami.
Biologicky aktívny ligand, pre protilátkovo zamerané cielenie, má naviesť deštrukciu cieľovej bunky buď priamo alebo vytvorením smrtiaceho prostredia pre cieľovú bunku. To sa môže dosiahnuť cytokínmi, ako sú napríklad IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFN, TNFa a CSF.
Tieto cytokíny vykázali protinádorové pôsobenie buď priamo alebo nepriamo, aktiváciou hostiteľových obranných mechanizmov (Mire-Sluis, TIBTECH 11, str. 74 až 77, 1993, Colombo a kol., Cancer Res. 52, str. 4853 až 4857, 1992, Thomas & Balkwill, Pharmac. Ther. 52, str. 307 až 330,1991).
Ale väčšina týchto cytokínov aktivuje efektorové bunky, nevykazuje pre nich však žiadnu alebo len slabú chemotaktickú aktivitu, takže protinádorová aktivita môže byť slabá v neprítomnosti vhodných množstiev efektorových buniek v nádorovom tkanive.
Naproti tomu, chemokíny sú chemotaktické pre početné efektorové bunky, a preto budú podporovať ich prítomnosť v mieste nádoru a okrem toho navodzujú varianty funkciou efektorovej bunky (napríklad Miller a Krangel, 1992, Biology and Biochemistry of the chemokines: A Novel Family of Chemotactic and Inflamatory Cytokines” Critical Reviews in Immunology [Biológia a biochémia cytokínov: Nová rodina chemotaktických a zápalových cytokínov, kritický prehľad imunológie], 12,17.
IL-8, MIP 2a (známy tiež ako GRO-β) a MIP 2β (GRO-gama) sú členmi C-X-C chemokínového superrodu (tiež známe ako cytokínový rod alebo „intereriny“). Pôsobia ako chemotaktické faktory a aktivujú efektorové bunečné funkcie a môžu preto predstavovať optimálne efektorové molekuly. Tento rod C-X-C chemokínov je skupinou najnovšie charakterizovaných malých (8-10 kD) proteínov, ktoré majú 20 až 50 % homológiu v aminokyselinovej sekvencii a majú chemotaktické a protizápalové účinky. IL-8 má dobre definovanú trojrozmernú štruktúru (Clore a kol., Biochemistry 29, str. 1689 až 1696,1990) a podieľajú sa na N-koncovom ELR motíve, s niektorými C-X-C chemokínmi. Očakávalo by sa, že v dôsledku sekvenčnej homológie medzi C-X-C chemokínmi bude trojrozmerná štruktúra veľmi podobná. To bolo už doložené pre MCAF/MCP-1 (Gronenbom & Clore, Prot. Eng. 4, str. 263 až 269,1991).
V roztoku IL-8 vytvára stabilné diméry (Clore a kol. Biochemistry 29, str. 1689 až 1896, 1990) aje možné, že F(ab') IL-8 fúzovaný proteín je dimenzovaný interakciou dvoch IL-8 monomérov s vytvorením bivalentného imunokonjugátu. To bude zosilňovať interakciu fúzy proteínu s antigénom.
Dosiaľ opísané členy C-X-C skupiny pôsobia hlavne na neutrofilné granulocyty. Gény boli lokalizované na chromozóme 4. Členmi tejto skupiny sú PF4, doštičkový bázický proteín, hlPlO, IL-8, MIP 2a a MIP 2β. Pôsobenie týchto proteínov na neutrofily sú chemotaktická aktivita, degranulácia a dýchací záchvat („respirátory burst“) (Sherry a Cerami, Current opinion in Immunology [Súčasné názory v imunológii], 3, str. 56 až 60, 1991; Oppenheim a kol., Annu. Res. Immunol. 9, str. 617 až 648, 1991; Miller a Krangel, Critical Reviews in Immunology 12, str. 17 až 46,1992; Clark-Lewis a kol., J. Biol. Chem. 266, str. 23128 až 23134, 1991).
Členy tesne príbuzného C-C-rodu chemokínov pôsobia na monocyty. Gény sú všetky umiestnené na chromozóme 17. Týmito proteínmi sú LD 78, Act-2, MCAF, 1309 a RANTES. Tieto molekuly majú silné chemotaktické pôsobenie na monocyty (Mastsushima a kol., Chem. Immunol. 51, str. 236 až 265, 1992; Oppenheim a kol., Annu. Rev. Immunol. 9, str. 617 až 648,1991).
Epidermálny rastový faktor (EGF = epidermal growth factor) je polypeptidový hormón, ktorý je mitogénický pre epidermálne a epitelové bunky. Keď EGF vzájomne pôsobí s citlivými bunkami, viaže sa na membránové receptory (EGFR). EGFR je transmembránový glykoproteín s pri blížne 170 kD a je génovým produktom c-erb-B protoonkogénu.
Myšia monoklonálna protilátka MAb 425 bola vybraná voči ľudskému rakovinovému bunečnému radu A431 (ATCC CRL 1555) a zistilo sa, že sa viaže na polypeptidový epitop na extemálne oblasti EGFR. Zistilo sa, že inhibuje väzbu EGF a sprostredkováva nádorovú cytotoxicitu in vitro a potlačuje in vitro rast nádorových buniek epidermálneho a colorektálneho bunečného radu odvozeného od karcinómu (Rodeck a kol., Cancer Res. 47, str. 3692, 1987). Humanizované a chimérické verzie MAb 425 sú známe zo svetového patentového spisu číslo WO 92/15683.
Úlohou vynálezu je preto vyvinúť protilátky alebo ich fragmenty obsahujúce epitop zameraný na EGFR antigén na povrchu nádorovej bunky a biologicky aktívny ligand majúci vysokú chemotaktickú aktivitu pre ich efektorové bunky a tak vedúci k nízkotoxickej cielenej nádorovej terapii. Imunokonjugáty preto predstavujú zlepšené analógové cytokínové protilátkové imunokonjugáty, ktoré sú podobne účinné, so zreteľom na svoju schopnosť spôsobovať lýzu nádoru nie však so zreteľom na možnosť efektívne viazať efektorové bunky na špecifické miesto pre svoje chemotaktické vlastnosti.
Podstata vynálezu
Immunokonjugát podľa vynálezu obsahuje monoklonálnu protilátku alebo jej fragment zameranú na nádorovú bunku nesúcu antigénový epitop receptora epidermálneho rastového faktoru (EGFR = „epidermal growth factor receptor“) a ligand chemokínového proteínu, ktorý je fuzovaný na protilátku alebo na protilátkový fragment.
Vynález sa teda týka fuzovaných proteínov, ktoré spojujú časť monoklonálnej protilátky minimálne antigén rozoznávajúcej miesto alebo kompletnú monoklonálnu protilátku rozoznávajúcu epitop EGFR s biologicky aktívnym ligandom zo súboru zahŕňajúceho chemokíny, výhodne rodu C-X-C, najmä IL-8. Konštrukty, kódujúce tieto fuzované proteíny, sa generujú spôsobmi rekombinantnej DNA technológie. Fúzované proteíny obsahujú variabilnú oblasť protilátkového ťažkého reťazca a CHI doménu konštantnej oblasti (CHl-konjugáty, Fab-fragment) a vhodný ľahký reťazec, alebo variabilnú oblasť protilátkového ťažkého reťazca a CHI a CH2 doménu konštantnej oblasti alebo variabilnú oblasť protilátkového ťažkého reťazca a CHI, CH2 a CH3 doménu konštantnej oblasti íúzovaného na biologický ligand v každom prípade. Koexpresiou sa vhodným ľahkým reťazcom môže generovať fuzovaný proteín, ktorý zamieruje bunky nesúce antigén a dodáva aktívny ligand do špecifických miest v tele.
Obdobne iný imunokonjugát sa môže získať fúziou chemokínu na C-zakončenie Fv-fragmentu protilátky. V takom prípade ťažký a ľahký reťazec sa môže expresovať v jednom polypeptide, kde sa obidva prvky spojujú na vhodnú spojovú sekvenciu na zaistenie vhodného ohybu antigénového viazacieho miesta. Rôzne konštrukty sú znázornené na obr. 1.
K expresii imunokonjugátov dochádza v nových molekulách, ktoré kombinujú dve funkcie: po prvé cieľujú antigén nesúci bunky (EGFR) a po druhé, uvoľňujú aktívny ligand do špecifického miesta v tele. Tieto ligandy sú mocnými chemoatraktantmi a aktivujú molekuly a vedú k infiltrácii efektorových buniek v mieste nádoru a môžu spôsobiť následnú deštrukciu nádoru.
Prostredníctvom imunokonjugátov, podľa vynálezu, sa môžu zisťovať nádory, napríklad melanóm, glióm a karci nóm a môžu sa následne ošetrovať bez všeobecného toxického pôsobenia.
Existujú rôzne skupiny chemokínov, napríklad C-X-C a C-C chemokíny.
Podľa výhodného rozpracovania vynálezu sa preto chemokínové proteíny volia z rodu C-X-C.
Z rodu C-X-C je podľa výhodného vykonávania vynálezu venovaná prednosť IL-8.
Vynález sa preto týka imunokonjugátu, pričom chemokínový proteín je volený z rodu C-X-C a je ním výhodne interleukín 8 (IL-8).
Protilátky, ktoré sa môžu používať podľa vynálezu, sú buď celé protilátky alebo ich fragmenty. Vhodnými fragmentmi sú Fv, Fab alebo F(ab')2 (tu používané označenie CHI protilátkové fragmenty), CH3 a CH2 protilátkové fragmenty (obr. 1). Výhodným rozpracovaním sú Fv, CHI, CH2 a CH3 protilátkové fragmenty.
Vynález sa teda týka vytvárania imunokonjugátov, pričom protilátkou je Fab fragment alebo F(ab)2 fragment zostávajúci v podstate z variabilnej oblasti protilátkového ťažkého reťazca, z CHI domény konštantnej oblasti a z vhodného ľahkého reťazca (konjugát protilátka-CH-1), ďalší imunokonjugát, pričom protilátkou je protilátkový fragment zostávajúci v podstate z variabilnej oblasti ťažkého reťazca, CHI a CH2 domény konštantnej oblasti a z vhodného ľahkého reťazca (konjugát protilátka-CH2), ďalší imunokonjugát, pričom protilátkou je kompletná protilátka zostávajúca v podstate z variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky, CHI, CH2 a CH3 domén konštantnej oblasti a z vhodného ľahkého reťazca (konjugát protilátka-CH3) a konečne ďalší imunokonjugát, pričom protilátka zostáva v podstate z variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky, z vhodného ľahkého reťazca a z polypeptidovej sekvencie, ktorá viaže ľahký a ťažký reťazec (konjugát protilátka-Fv).
Imunokonjugáty podľa vynálezu môžu obsahovať prípadne reštrikčné miesto medzi protilátkou (fragmentom) a chemokínovým proteínom, ktoré umožňuje zavádzať napríklad špecifický spojovací peptid na zaistenie optimálnej väzby konjugátu na cieľový epitop. Vhodné spojovacie peptidy a spôsoby ich zavádzania sú dobre známe v odbore a sú neskôr opísané. Podľa vynálezu sa volí reštrikčné miesto jedinečné v určitom DNA konštrukte. Výhodným reštrikčným miestom je Ncol a Beli.
Vynález sa preto tiež týka imunokonjugátu obsahujúceho aminokyselinu (sekvenciu), ktorá je odvoditeľná na DNA reštrikčné miesto medzi protilátkou/protilátkovým fragmentom a biologicky aktívnym ligandom, pričom je reštrikčné miesto jedinečné v kompletnom fúzovanom konštrukte.
Vynález sa preto tiež týka imunokonjugátu obsahujúceho spojovací peptid medzi protilátkou/protilátkovým fragmentom a biologicky aktívnym ligandom.
V podstate sú vhodné všetky protilátky, ktoré sú zamerané na EGF receptory na povrchy nádorových buniek. Výhodným rozpracovaním je však monoklonálna protilátka 425.
Vynález sa rovnako týka imunokonjugátu, pričom je protilátka alebo protilátkový fragment odvodený od myšieho humanizovaného alebo chimémeho MAb 425 a je s výhodou zvolená zo súboru zahŕňajúceho MAb 425-CH1-IL8, MAb 425-CH2-(Ncol)-IL8, MAb 425-CH2-(BclI)- IL8, MAb 25-Fv-IL8 a MAb 425-CH3-IL8.
Spôsob prípravy imunokonjugátu podľa vynálezu spočíva v tom, že sa fúzujú DNA sekvencie kódujúce vzájomne protilátku alebo fragment protilátky a biologicky aktívny ligand s jednoreťazcovou DNA prostredníctvom oligonukleotidu, ktorý je komplementárny so zreteľom na žiadanú
SK 282263 Β6 fúzovanú DNA sekvenciu, umiestňuje sa vzniknutý konštrukt do expresného vektora, ktorý je transformovaný do hosťujúceho organizmu, kultivujú sa hostiteľské bunky v živnom roztoku a expresuje sa fúzovaný proteín.
Imunokonjugáty, podľa vynálezu, sú vhodné na terapeutické účely. Vynález sa preto tiež týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich aspoň jeden imunokonjugát, podľa vynálezu, ktorý je definovaný, a fyziologicky vhodný nosič.
Zámerom vynálezu je generovať fúzovaný proteín zostávajúci z monoklonálnej protilátky ako zacieľujúceho prvku a chemokínu IL-8 ako efektorovej molekuly s chemotaktickými a aktivačnými vlastnosťami.
Bolo doložené, že IL-8 a iné chemokíny (napríklad MIP) si udržujú svoju biologickú účinnosť, keď je N-zakončenie blokované prídavnými aminokyselinami ako podielom protilátky. Preto je molekula užitočná v cielenej protinádorovej terapii, pričom sa efektorové bunky zamerajú na EGF receptorové pozitívne nádorové bunky a aktivujú sa in situ.
Bolo doložené, že cDNA kódujúca MAb 425 ťažký reťazec a IL-8 proteín môžu byť fúzované molekulárnymi biologickými spôsobmi a proteíny môžu byť expresované vo vhodných expresných systémoch a že EGF receptorová viazacia kapacita je zachovaná vo fúzovaných proteínoch (obr. 2).
Hlavné cieľové bunky IL-8 sú neutrofilné granulocyty, ktoré majú tri biologické funkcie:
- chemostatický pohyb v smere chemotaktického gradientu,
- uvoľňovanie zásobných granúl s vopred produkovanými proteolytickými enzýmami
- bezprostrednú produkciu superoxidových aniónov (dýchací záchvat) V súhlase s tým sa skúmajú MAb 425/Ncol/IL-8 a MAb 425/ Bc 1 I/IL-8 fuzované proteíny so zreteľom na chemotaktickú aktivitu navodenia uvoľňovania MPO a uvoľňovania superoxidu.
Okrem toho bolo doložené, že fuzované proteíny podľa vynálezu (napríklad MAb 425/Ncol/IL-8 a MAb 425/Bcl I/IL-8), spôsobujú chemotaktickú aktivitu, indukciu uvoľňovania MPO a superoxidu. Výsledky podľa obr. 3 a dokladajú, že obidva fuzované proteíny sú chemotaktické pre ľudské neutrofily v odbore rckombinantného IL-8 (obr. 3b). Prídavné k MAb 425/Ncol/IL-8 a MAb 425/Bcl I/IL-8 fuzovaným proteínom bol vytvorený monovalentný fúzovaný proteín F(ab')IL-8, ktorý by mal zhromažďovať do divalentnej formy, ktorý bol expresovaný v E. coli a vyčistený. Obr. 4 ukazuje, že F(ab')IL-8 luzovaný proteín je chemotaktický pre ľudské neutrofily v porovnaní s MAb 425 F(ab'), expresovaným v E coli a súhlasne vyčistený.
MAb 425/Bcl I/IL-8 fúzovaný proteín má skôr silnú kapacitu na uvoľňovanie superoxidu v porovnaní s voľným IL-8 (obr. 5), MAb 425/Ncol/IL-8 fúzovaný proteín je menej aktívny, avšak hodnoty sú výrazne vyššie ako hodnoty kontrolné (obr. 5). MAb 425 samotný nevykazuje žiadnu aktivitu. Všetky testy sa uskutočňujú s použitím cytochalazínu B ako podpornej látky, ktorá samotná nevykazuje žiadnu aktivitu (hodnoty nie sú uvedené).
Obidva fúzované proteíny navodzujú uvoľňovanie myeloperoxidázy (MPO) avšak MAb 425/Ncol/IL-8 fúzovaný proteín je mnohom aktívnejší ako MAb 425/Bcl I/IL-8 fúzovaný proteín (obr. 6). Všetky hodnoty sú vypočítané podľa údajov tritónom lýzovaných buniek, pre ktoré sa uvádza 100 % enzýmový obsah. Všetky hodnoty sa generujú pri použití cytochalazínu B ako podpornej zlúčeniny.
Bolo už doložené, že N-koncový podiel IL-8 molekuly s vysoko zakonzervovaným E-L-R motívom je potrebný na receptorovú väzbu a signálnu transdukciu. Trojrozmerná štruktúra IL-8 je homodiméma, pričom N-zakončenia sú vo vystavenej konfigurácii. Je možné, že biologická účinnosť IL-8 je zrušená, keď je N-zakončenie blokované prídavnými aminokyselinami. Preto reštrikčné miesta (Ncol/Bcll) sa zavádzajú medzi dve cDNA na zavedenie spojovacích peptidov a tým na obnovenie dostupnosti N-zakončenia.
Iné možnosti na vytvorenie fúzovaných proteínov, ako chemická kopulácia obidvoch prvkov, vedú k skôr nedefinovaným štruktúram, ktoré sa môžu v jednotlivých dávkach meniť. Okrem toho chemická kopulácia môže rozrušiť sekundárnu štruktúru ligandu alebo vytvoriť situáciu, keď je väčšina proteínov neaktívna so zreteľom na receptorovú väzbu v dôsledku nedostupnosti. Na rozdiel od prístupu podľa vynálezu, generuje fúzia proteínov definované štruktúry, ktoré môžu byť expresované v reprodukovateľnej kvalite takmer bez obmedzenia.
Súhrnne sa dá konštatovať, že proteíny podľa vynálezu majú tieto vlastnosti:
- viažu sa na EGFR pozitívne bunky, - spôsobujú chemotaktickú aktivitu,
- navodzujú uvoľňovanie MPO a superoxidu, - navodzujú lýzu nádoru in situ.
Preto sú imunokonjugáty podľa vynálezu vhodné pre nádorovú terapiu.
Vynález bližšie objasňuje nasledujúci podrobný opis doplnený tabuľkami a obrázkami:
tabuľka I sekvencia primerov používaných pre PCR ku generácii buď Ncoí alebo Bail-miesta k vytvoreniu fúzovaných proteínov na eukaryotickú expresiu obr. 1 modely imunokonjugátov protilátka-cytokín C = cytokín, HV = variabilná oblasť ťažkého reťazca, VL = variabilná oblasť ľahkého reťazca, CH = konštantná oblasť ťažkého reťazca, CL = konštantná oblasť ľahkého reťazca, obr. 2 doloženie MAb 425 v COS-7 transfekčnom supematante anti EGF-RELISOU štvorčeky: MAb 425-CH3 supematant trojuholníčky: MAb 425-CH2-(Ncol)-lL-8 supematant obrátené trojuholníčky: MAb 425-CH2-(BclI)-lL-8 supematant kolieska: pHCMV supematant vodorovná os: zriedenie supematantu zvislá os: optická hustota pri 490 nm.
obr. 3 a navozenie chemotaxis COS-7 transfekčnými supematantmi stĺpec I: kontrolný DMEM/PS stĺpec II: pHCMV supematant nezriedený stĺpec III: MAb 425-CH3 supematant zriedený 1 :14 (podľa výsledkov EGF-r-ELISA) stĺpec IV: MAb 425-CH3 supematant zriedený 1 : 28 (podľa výsledkov EGF-r-ELISA) stĺpec V: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8 supematant nezriedený (1,76 x 1010 mol/1*) stĺpec VI: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8 supematant zriedený 1 : 2 stĺpec VII: MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8 supematant nezriedený (2,0 x 1O'10 mol/1*) stĺpec VIII: MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8 supematant zriedený* : 2, IL-8 koncentrácia zistená ELISA (Amersham) na zvislej osi je počet buniek na počítané pole
SK 282263 Β6 obr. 3b navozenie chemotaxis čisteným IL-8 na zvislej osi je počet buniek na počítané pole, na vodorovnej osi je koncentrácia IL-8 (mol/1) obr. 4 navozenie chemotaxis MAb 425-CH1-IL-8 (E. coli) kolieska: MAb 425-CH1-IL-8 expresovaný v E. coli štvorčeky: MAb 425-F(ab) expresovaný v E. coli trojuholníčky: kontrola Dulbecco/BSA na zvislej osi je počet buniek na počítané pole, na vodorovnej osi je koncentrácia (mol/1) obr. 5 navozenie uvoľňovania superoxidu COS-7-transfekčnými supematantmi stĺpec I: nestimulované bunky stĺpec II: IL-8 10'7 M stĺpec III: MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8 supematant nezriedený (2,0 x 1O10 mol/1*) stĺpce IV: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8 supematant nezdedený (1,76 x 1010 mol/1*) stĺpec V: MAb 425-CH3 supematant nezriedený (0 mol/1*) IL-8 koncentrácia zistená EL1SA (Amersham) na zvislej osi je optická hustota pri 550 nm obr. 6 navozenie uvoľňovania MPO COS-7-transfekčnými supernatantmi stĺpec I: nestimulované bunky stĺpec II: cytochalazínom B stimulované bunky stĺpec III: IL-8 10’7 M stĺpec IV: MAb 425-CH3 supematant nezriedený stĺpec V: MAb 425-CH3 supematant zriedený 1: 2 stĺpec VI: MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8 supematant nezriedený stĺpec VII: MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8 supematant zriedený 1 : 2 stĺpec VIII: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8 supematant nezriedený stĺpec IX: MAb 425-CH2-(Bcll)-lL-8 supematant zriedený 1 : 2 na zvislej osi je % MPO aktivity v porovnaní s celkovým množstvom MPO (100 %)
Všeobecné poznámky
Všetky uvádzané mikroorganizmy, bunkové línie, plazmidy, promotóry, signálne znaky rezistencie, replikačné počiatky, reštrikčné miesta, alebo iné fragmenty vektorov, sú obchodne alebo inak všeobecne dostupné. Pokiaľ nie je inak uvedené, používajú sa len ako príklad a nie sú podstatou vynálezu a môžu byť prípadne nahradené inými vhodnými prostriedkami a biologickými materiálmi.
Spôsoby, ktoré sú podľa vynálezu podstatné, sú nižšie opísané. Iné spôsoby, ktoré nie sú podrobne opísané, zodpovedajú známym spôsobom, ktoré sú pracovníkom v odbore dobre známe a sú podrobne opísané v uvádzaných odkazoch na patentovú a technickú literatúru (napríklad Antibodies, A Laboratory Manual [Protilátky, laboratórna príručka], Harlow, Lane, Cold Spring Harbor, 1988).
Monoklonálne protilátky
MAb 425 je IgGl myšia monoklonálna protilátka pôsobiaca voči bunkovej línii ľudského A 431 karcinómu (ATCC CRL 1555). MAb 425 sa viaže na polypeptidový epitop externej domény ľudského EGF receptora a kompletuje s viazaním EGF. MAb 425, podľa zistení, sprostredkováva nádorovú cytostatiku in vitro a potláča rast bunkovej línie odvodenej nádorovej bunky epidermálneho a colorektálncho karcinómu (Rodeck a kol., Cancer Res. 47, str. 3692,1987,). Humanizované a chimerické verzie MAb 425 sú opísané v zverejnenej prihláške WO 92/15683.
Chemokíny
Chemokín kódujúci cDNA je buď obchodným produktom spoločnosti British Biotechnology Limited (ľudský IL-8 BBG 44: Herrmann Biermann GmbH, Bad Neuheim NSR) alebo sa generuje z mRNA izolovaného z cytokín produkujúceho ľudského bunečného radu (ATCC CRL 1593). Celá RNA z chemokín produkujúcich buniek sa izoluje z RNAzolom (WAK-Chemie, Nemecko) podľa pokynov výrobcu. RNA sa následne transkribuje do cDNA a chemokín kódujúci sekvencie sa PCR zosilňuje s použitím vhodných primérov odvodených od zverejnených DNA sekvencii.
Vektory pUC 19 je časťou radu podobne vysokého čísla E.coli plazmid klonujúcich vektorov a obsahuje podiely pBR322 a M13mpl9. pUC 19 obsahuje navoditeľný bakteriálny lac promotór-operátor, nasledovaný mnohopočetným klonovacím miestom (Yanisch-Perron a kol., Gene 33, str. 103 až 109, 1985. pUC vektory sú obchodnými produktmi (napríklad spoločnosti New England Biolabs).
pBluescipt KS/SK+ a KS/SK-fagemidové vektory sú odvodené od pUC19. Vektory sú obchodnými produktmi (Stratagene, Heidelberg). Prokaryotické expresné vektory sú založené na pSWl vektore (Ward a kol., Náture 341, str. 544 až 546, 1989), ktoré sú odvodené od pUC19 vektora. pSWl obsahuje sekvenciu kódujúcu pre vedúci peptid bakteriálneho pelB génu z Erwinia carotovora (Lei a kol. J. Bact 169, str. 4379 až 4383, 1987). Cudzie DNA sa môžu zavádzať do štruktúry za pelB vedúcej sekvencie k priamej proteínovej expresii do periplazmy.
Eukaryotický expresný vektor pHCMV (Gilles a kol., Celí 33, str. 717, 1983) obsahuje počiatok replikácie opičieho vírusu 40 (SV40) a promotór a podpornú oblasť ľudského cytomegalovírusu. Systém promotór/podpomá oblasť je nasledovaný multiklonujúcim miestom na zavedenie génu, ktorý má byť expresovaný. V tomto vektore sa kombinuje chiméma forma variabilnej oblasti ťažkého reťazca MAb 425 a cgamalCII2 oblasť fúzovaná s chemokínom na konci CH2 domény, na generáciu íúzovaného proteínu MAb 425 ťažkého reťazca. Fúzovaný lg reťazec sa môže zhromažďovať na imunokonjugát kombináciou s vhodným ľahkým reťazcom za vytvorenia monovalentnej antigén viažucej oblasti, ktorá sa potom môže asociovať s vytvorením dvojvalentného imunokonjugátu špecifického na cieľový antigén, Konštrukty ťažkého reťazca a ľahkého reťazca sa môžu vniesť do jedného alebo do oddelených vektorov.
Expresia fúzovaných proteínov v eukaryotických bunkách
Konštrukcia eukaryotických expresných vektorov na Fab 425-chemokínovú fúznu proteínovú expresiu
Fúzia MAb 425 a chemokínov technológiou PCR
Ľudská egamal konštantná oblasť sa vnesie do pUC 19 ako fragment BamHI/BamHII. Konštantná oblasť egamal obsahuje dve SacII miesta: jedno je v 5' intrónu, 40 bp v smere od 5 BamHI miesta a druhé je 580 bp v smere od 5' BamHI miesta a 140 bp proti začiatku CH3 domény. Druhé SacII miesto je vhodné pre ďalšie subklonovanie a preto sa prvé SacII miesto rozrušuje zavedením SnaBI miesta s adaptérom. V tomto konštrukte (deltaSac II egamal) fragmenty v smere od SacII miesta sa môžu ľahko zameniť.
Ľudský IL-8 sa vyreže z pUC 18 vektora (Bgl H/Eco RI) a vnesie sa do pBluescriptu SK+ (Stratagene GmbH, Heidelberg) (Smal/EcoRI), takže sa miesto BglII a Smal vypustí. Fragment SacII/Xbal delta SacIIcgama 1 sa včlení
SK 282263 Β6 do pBuesktiptu SK+. Oba gény sa zezosilňujú vhodnými primármi s použitím technológie PCR:
- pre delta Sac II cgamal; 3' primér: koncová sekvencia CH2 domény a Ncol-miesto 5' primér: reverzný sekvenčný primér
- pre IL-8 3' primér: univerzálny sekvenčný primér 5' primér: Ncol-miesto a štartovacia sekvencia IL-8
Produkty sa režú a ligatujú s SK+SacII/EcoRI. Vo výslednej peptidovej sekvencií C-koncový lyzín CH2 domény sa zamieňa za metionín a N-koncový serín IL-8 podielu sa zamieňa za glycín.
Nová generovaná sekvencia na spojení medzi dvoma polypeptidmije: 5AAAGCC ATG GGTGCT3'
LysAlaMet GlyAla cgamalCH2 <= => IL-8 (2-72)
Rovnaký proces sa vykonáva s použitím primérov (tabuľka I) na zavedenie Beli miesta medzi dva gény. Výsledný fúzovaný gén má Beli miesto medzi konštantnou oblasťou cgamal génu a IL-8 génu, kódujúci plnú sekvenciu domény CH2, dve prídavné aminokyseliny (valín izoleucín) a IL-8 sekvenciu bez prvých dvoch aminokyselín (serín, alanín).
Novo generovaná sekvencia na spojení medzi dvoma polypeptidmije: 5GCCAAA GTG ATC AAA GAA3'
AlaLys Val íle Lys Glu
CgamalCH2 <= => IL-8 (3-72)
PCR-produkty sa subklonujú do SK+ použitím SacII a EcoRI reštrikčných miest. Pre eukaryotickú expresiu týchto fúzovaných génov sa klonujú do pHCMV vektora.
Tabuľka I
IXonetrukt Primér DNA sekvencií
CH2/Ncol IL-8/Ncol CH2/BCII IL-8/Bcll Ογ1 5' Cy1 3’ IL-8 5’ IL-8 3' Cy1 5* C7I 3’ IL-8 5’ IL-8 3’ 5'- CAGGAAACAGCTATGAC-3’ 5'- TGATCCATGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCG-3' 5·. GATCTACCTGCCATGGGTGCTAAAGAA-3' 5'- GTAAAACGACGGCCAGT- 3' 5'- CAGGAAACAGCTATGAC- 3' 5'- CGCGTGATCACTTTGGCTTTGGAGATGGTT-3' 5'- CTCGTGATCAAAGAACTTAGATGTCAATGC- 3' 5'- GTAAAACGACGGCCAGT- 3'
Expresia imunokonjugátov v eukaryotických bunkách
Expresia imunokonjugátov v eukaryotických bunkách vyžaduje zavedenie vektora DNA, obsahujúcej ťažký a ľahký reťazec do hostiteľskej bunky. Na tento účel boli opísané početné spôsoby, napríklad elektroporácia, DEAE dextrán, fosforečnan vápenatý, Lipofectin alebo protoplastová fúzia. Môže sa použiť akýkoľvek typ hostiteľskej bunky za podmienky, že rekombinantná DNA sekvencia, kódujúca imunokonjugát, je vhodne transkribovaná do mRNA v bunečnom type. Hostiteľskými bunkami môžu byť myšie bunky myelomu, ktoré neprodukujú imunoglobulín, ako sú napríklad Sp2/O-AG14 (ATCC CRL 1581), P3X63Ag8.653 (ATCC CRL 1580), alebo bunky chrčka napríklad CHO-K1 (ATCC CCL 61), alebo CHOZDHFR-(ATCC CRL 9096) alebo BHK-21 (ATCC CCL 10). Na prechodnú expresiu sa môže použiť COS-1 (ATCC CRL 1650) alebo COS-7 (ATCC CRL 1651).
Prechodná expresia imunokonjugátov
Expresný vektor pHCMV obsahuje počiatok replikácie opičieho vírusu 40 (SV40). Bunečný rad COS-7 je derivátom bunečného opičieho radu CV-1, ktorý bol transformovaný s pôvodným defektným SV40 vírusom. Preto plazmi dy, obsahujúce SV40 počiatok replikácie, budú zosilnené a produkcia imunokonjugátov sa zlepší. Supematanty sa zhromaždia za 72 hodín a skúšajú sa so zreteľom na EGF receptorovú väzbu a chemokínovú koncentráciu spôsobom ELISA.
Permanentná expresia imunokonjugátov
Vektory, obsahujúce rekombinantné konštrukty na expresiu imunokonjugátu, sa zavedú do vhodných hostiteľských buniek. Konštrukty ťažkých a ľahkých reťazcov môžu byť umiestnené do rovnakého vektora alebo do oddelených vektorov. Pri vnesení do oddelených vektorov môžu niesť obidva vektory rovnaký selekčný signálový znak, napríklad odolnosť k neomycínu alebo dehydrofolátovú reduktázu (DHFR) alebo dva odlišné selekčné signálové znaky k selekcii, na prítomnosť obidvoch vektorov. Selekcia pre DIIFR signálny znak sa môže vykonávať len v DHFR negatívnych radoch buniek, ako je CHO/DHFR. Zmesové populácie sa analyzujú na expresiu imunokonjugátov ELISA špecifickou pre EGF-receptor. Ďalšia selekcia pre pozitívne monoklonály je daná obmedzením zried’ovacieho klonovania.
Čistenie MAb 425 chemokínových imunokonjugátov
MAb 425 imunokonjugáty, produkované hostiteľskými bunkami, sa môžu zhromažďovať a čistiť akýmkoľvek bežným spôsobom, napríklad afinitnou, chromatografiou s použitím cieľového antigénu, anticytokínovej protilátky alebo antiidiotopickej protilátky (ako napríklad Harlow, Lane
I.C.).
V predmetnom prípade sa čistenie vykonáva antiidiotopickou protilátkou, ktorá je produkovaná MAb 425 známymi spôsobmi (napríklad Kostelny a kol., J. Immunol., 148, str. 1547, 1992). Na získanie čistých Fvimunokonjugátov E.coli kmene, vhodné na proteínovú expresiu, sa transformujú expresnými plazmidmi (ako je ďalej uvedené). Bunky sa nechajú rásť do veľkosti OD378 = 0,5 a indukujú sa s izopropyl-P-D-tiogalaktopyranozidom (IPTG) (lmM). Bunky sa nechávajú rásť cez noc a supematanty a bunky sa zhromaždia. Supematant sa nanesie na antiMMAb 425 antiidiotypický stĺpec, pripravený známymi spôsobmi. Stĺpec sa premyje fosfátom, tlmeným roztokom 0,5 M chloridu sodného a viazaný proteín sa eluujc s 100 mM glycínu 0,5 M roztokom chloridu sodného pri hodnote pH 2,5. Eluát sa bezprostredne neutralizuje Tris 2,5 M, hodnota pH 8,0. MAb 425-CH1-IL-8 obsahujúci frakcie sa spoja, skoncentrujú a dialyzujú sa proti pBS.
Konštrukcia prokaryotických expresných vektorov na Fav425-chemokínovú a Fv-chemokínovú fúznu proteínovú expresiu
Pripraví sa Fv fragment spôsobom, ktorý opísal Glockshuber a kol. (Biochemistry 29, str. 1362 až 1367, 1990). DNA sekvencie, kódujúce pre ľahký reťazec a Fd fragment ťažkého reťazca alebo Fv fragment sa zavádzajú do mnohopočetného klonujúceho miesta pSWl vektora. Zrelý ľahký reťazec kódujúci sekvencie, zrelý ťažký reťazec kódujúci sekvencie a Fv kódujúci sekvencie sú predchádzané vedúcim peptidom bakteriálneho pel B génu. Ťažký reťazec kódujúci sekvencie obsahuje Ncol (3 zakončenie) miesto. Chemokin kódujúci cDNA sa modifikuje PCR k zavedeniu Ncol (5 zakončenie) a Nôti (3 zakončenie) alebo EcoRI (pre Fv fúziu) reštrikčné miesta. Chemokínové gény sa fúzujú do rámca priamo do domény CH1 ťažkého reťazca alebo Fv fragmentu. Alebo sa spojovací peptid napríklad (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x, kde x znamená 1 až 4, môže zavádzať medzi CH1 doménu a chemokínový gén. Tiež spojovníky a spôsoby ich prípravy sú v literatúre opísané (na príklad Curtis a kol., Proc. Natl. Acad. Aci. U.S.A., 88, str. 5809,1991).
Tieto vektory umožňujú účinnú expresiu funkcionálneho F(ab) (=CH1) a Fv chemokínových fuzovaných proteínov v E. coli. Ľahký reťazec a ťažký reťazec chemokínového fúzovaného proteínu sú umiestnené na jednotlivom dicistronickom mediátore RNA, umiestnenom za riadenia navoditeľného lac promotóru (Skerra a Plúckthun, Science 242, str. 1038 až 1040, 1988). Preto expresia Fab/Fv fúzovaného proteínu sa môže navodiť podľa požiadaviek kultivačných podmienok. Translácia obidvoch proteínov od dicistronického mediátora RNA podporuje syntézu rovnakých množstiev Fd-chemokínového fúzovaného proteínu a ľahký reťazec tak zvyšuje možnosti správneho vytvorenia funkčných Fab/Fv fuzovaných proteínov. Dva polypeptidy sa sekretujú do periplazmy E. coli, kde sa ohýbajú, vytvárajú disulfidické väzby a dochádza k vytvoreniu fUnkčného Fab 425CH1/Fv fúzovaného proteínu. Predĺžená kultivácia baktérie vedie k čiastočnej permeabilizácii vonkajšej membrány E.coli umožňujúcej difúziu fúzovaného proteínu do kultivačného prostredia.
Väzbové vlastnosti MAb 425 imunokonjugátov
Väzbové vlastnosti MAb 425 imunokonjugátov sa stanovujú EGF receptorovou špecifickou ELISA. Mikrotitrové doštičky sa potiahnu cez noc pri teplote 4 °C čisteným EGF receptorom. Doštičky sa inkubujú so supematantmi obsahujúcimi fuzovaný proteín alebo so supematantmi obsahujúcimi nekonjugované MAb fragmenty. Doštičky sa premyjú a odstráni sa neviazaný materiál a protilátka, viazaná na EGF receptor, sa zisťuje inkubáciou s kozím antihumánnym IgG a IgM (ťažký a ľahký reťazec) konjugovanými na peroxidázu nasledovanou substrátom. Množstvo špecifického proteínu viazaného EGF receptorom sa stanovuje meraním pri 490 nm.
Biologická aktivita MAb 425-IL-8 imunokonjugátov Izolácia efektorových buniek
Na stanovenie biologickej účinnosti, sa čerstvo izolujú ľudské periferálne krvné neutrofilné granulocyty z krvi ako celku zdravých darcov, ako to opísal Haslett a kol. (Am. J. Pathol. 119, str. 101 až 110, 1985). Plazma sa oddelí odstredením, erytrocyty, dextranovou sedimentáciou a lymfocyty a leukocyty sa oddelia nakoniec percollgradientovým odstredením. Izolované neutrofily sa použijú bezprostredne.
Stanovenie chemotaktickej aktivity
Stanovenie chemotaktickej aktivity sa vykonáva spôsobom, ktorý opísal Falk a kol. (J. Immunol. Methods 33, str. 239 až 247, 1980). Použijú sa 48 jamkové komôrky a 5 pm membrány. Čistené neutrofily sa resuspendujú v prostredí DMEM (DMEM, 1 % penicilínu, 1 % streptomycínu, 10 % FCS, 2mM L-glutamínu, lmM pyruvátu sodného, 10 mM HEPES) v koncentrácii 1 x 106 buniek/ml. Do nižších jamiek sa vnesú supematanty obsahujúce fuzovaný proteín alebo kontrolné supematanty, pokryjú sa membránou a nakoniec sa do horných jamiek vnesie suspenzia buniek. Po inkubácii pri teplote 37 °C počas 30 minút sa membrány odstránia a fixujú sa v 2 % glutardialdehyde 10 minút. Potom sa bunky, viazané na membránu, zafarbujú Weigertovým hematoxylínom železa (Sigma diagnostic) tri minúty. Mikroskopicky sa stanoví počet buniek viazaných na membráne.
Stanovenie kapacity k navozeniu uvoľňovania enzýmu v neutrofiloch
Na hodnotenie kapacity imunokonjugátov na neutrofiloch k navozeniu uvoľňovania granuly sa monitoruje myeoloperoxidázová aktivita v supematante (Henson a kol., J. Immunol. 121, str. 851, 1978). Skúška sa vykonáva na 96 jamkovej mikrotitrovej doštičke s 5 x 105 buniek na jamku. Po inkubácii (pri teplote 37 °C) so stimulmi sa doštičky odstredia a voľné bunky supematantu sa prenesú na inú 96 jamkovú mikrotitrovú doštičku. Voľné bunky supematantu sa inkubujú s dianizidínom (ako substrátom) a meria sa absorbancia pri 492 nm. Použije sa pozitívna kontrola FMLP v 10'7 M koncentrácii. Na stanovenie celkového množstva enzýmu sa bunky bez stimulu lýzujú tritónom. Aktivita sa vypočíta ako percento celkového obsahu enzýmu (lysis).
Stanovenie kapacity uvoľňovania superoxidu
Cytochróm c sa redukuje kyslíkom O2’ a tým sa mení absorbancia. Zmena absorbancie predstavuje hodnotný znak pre stanovenie superoxidovej aktivity. Skúška sa vykonáva spôsobom, ktorý opísal Guthrie a kol. (J. Exp. Med. 160, str. 1656 až 1671, 1984) na 96 jamkovej mikrotitrovej doštičke s 5 x 105 buniek na jamku. Po inkubácii so stimuli a cytochrómom c sa doštičky odstredia a stanovuje sa absorbancia supematantu pri 550 nm.
Ďalšie imunokonjugáty
Ako je opísané sa pripravujú a skúmajú antiEGFRCH1, -CH2, -CH3 a -Fv imunokonjugáty (s/bez reštrikčného miesta a spojovníka), obsahujúce MIP-2a a ΜΙΡ-2β ako chemokínovú zložku. Tieto konštrukty majú podobné vlastnosti ako IL-8 deriváty.
Terapeutické použitie imunokonjugátov
Imunokonjugáty sa podľa vynálezu môžu podávať ľuďom ako terapeutické ošetrovanie. Vynález sa preto tiež týka farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú ako účinnú látku aspoň jeden fuzovaný proteín definovaný a definovaný v patentových nárokoch, spolu s jedným alebo s niekoľkými farmaceutický vhodnými nosičmi, excipientmi alebo riedidlami.
Spravidla sa imunokonjugáty podľa vynálezu, podávajú intravenózne alebo parenterálne. Všeobecne podávaná dávka imunokonjugátu má byť dostatočná na potlačenie nádoru a k lýzi nádoru. Táto dávka závisí od veku, stavu, pohlavia a rozsahu ochorenia a môže byť 0,1 až 200 mg/kg telesnej hmotnosti, výhodne 0,1 až 100 mg/kg vo forme jednej alebo niekoľkých denných dávok počas jedného alebo niekoľkých dní.
Farmaceutické prostriedky na parenterálne podanie obsahujú sterilné vodné alebo nevodné roztoky, suspenzie alebo emulzie. Ako príklady nevodných rozpúšťadiel sa uvádzajú propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinné oleje, napríklad olivové oleje a vstrekovateľné organické estery, ako je etyoleát a iné rozpúšťadlá známe v odbore a vhodné na uvedené účely. Imunokonjugáty sa podľa vynálezu môžu používať vo farmaceutických prostriedkoch obsahujúcich fyziologicky vhodný nosič. Ako príklady vhodných nosičov sa uvádzajú: soľanka, PBS, Ringerov roztok alebo laktátovaný Ringerov roztok. Farmaceutické prostriedky môžu obsahovať tiež konzervačné prísady a iné prísady, ako sú napríklad antibiotiká, antioxidanty a chelatačné činidlá.
Farmaceutické prostriedky, podľa vynálezu, sú vhodné na ošetrovanie všetkých druhov nádorov, vrátane melanómu, gliómu a karcinómu, ako tiež krvných nádorov a pevných nádorov.
Priemyselná využiteľnosť
Imunokonjugát obsahujúci monoklonálnu protilátku alebo jej fragment špecifický pre Judskú EGF receptorovú molekulu a člen rodu chemokínov, zvolený s výhodou z rodu C-X-C napríklad interleukín-8 (IL-8) navodzuje cytotoxickú a chemotaktickú aktivitu a je vhodný pre cielenú nádorovú terapiu.
13. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aspoň jeden imunokonjugát, podľa nároku 1 až 10 a fyziologicky vhodný nosič.
14. Použitie imunokonjugátu, podľa nároku 1 až 10 na prípravu farmaceutického prostriedku proti nádorom.
Koniec dokumentu

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Imunokonjugát obsahujúci monoklonálnu protilátku alebo jej fragment zameranú na nádorovú bunku nesúcu antigénový epitop receptora epidermálneho rastového faktora (EGFR) a chemokínového proteínu, ktorý je fuzovaný na protilátku alebo na protilátkový fragment.
  2. 2. Imunokonjugát, podľa nároku 1, pričom chemokín je zvolený z rodu C-X-C.
  3. 3. Imunokonjugát, podľa nároku 2, pričom chemokínomjeIL-8.
  4. 4. Imunokonjugát, podľa nároku 1 až 3, pričom protilátkou je lFab fragment alebo F(ab)2 fragment pozostávajúci v podstate z variabilnej oblasti proti látkového ťažkého reťazca, CH1 domény konštantnej oblasti a z vhodného ľahkého reťazca (konjugát protilátka-CIIl).
  5. 5. Imunokonjugát, podľa nároku 1 až 3, pričom protilátkou je protilátkový fragment pozostávajúci v podstate z variabilnej oblasti proti látkového ťažkého reťazca, CH1 a CH2 domén konštantnej oblasti a z vhodného ľahkého reťazca (konjugát protilátka-CH2).
  6. 6. Imunokonjugát, podľa nároku 1 až 3, pričom protilátkou je protilátkový fragment pozostávajúci v podstate z variabilnej oblasti protilátkového ťažkého reťazca, CHI, CH2 a CH3 domén konštantnej oblasti a z vhodného ľahkého reťazca (konjugát protilátka-CH3).
  7. 7. Imunokonjugát, podľa nároku 1 až 3, pričom protilátkou je protilátkový fragment pozostávajúci v podstate z variabilnej oblasti protilátkového ťažkého reťazca, z vhodného ľahkého reťazca a z polypeptidovej sekvencie, ktorá viaže ľahký a ťažký reťazec (konjugát protilátka-Fv).
  8. 8. Imunokonjugát, podľa nároku 1 až 6, obsahujúci amínokyselinu alebo aminokoselinovú sekvenciu, ktorá je odvoditeľná od DNA reštrikčného miesta medzi protilátkou/protilátkovým fragmentom a biologicky aktívny ligand, pričom uvedené reštrikčné miesto jedinečné v kompletnom/fúzovanom konštrukte.
  9. 9. Imunokonjugát, podľa nároku 1 až 7, obsahujúci spojovací peptid medzi protilátkou/protilátkovým fragmentom a biologicky aktívnym ligandom.
  10. 10. Imunokonjugát, podľa nároku 1 až 8, pričom protilátka/protilátkový fragment sú odvodené od myšieho humanizovaného alebo chimémeho MAb 425.
  11. 11. Imunokonjugát zvolený zo súboru zahŕňajúceho MAb 425-CH1-IL8, MAb 425-CH2-(Ncol)-IL8, MAb 425CH2-(BclI)-IL8, MAb 25-Fv-IL8 a MAb 425-CH3-IL8.
  12. 12. Spôsob prípravy imunokonjugátu podľa, nároku 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že sa fúzujú DNA sekvencie kódujúce vzájomne protilátku alebo fragment protilátky a biologicky aktívny ligand sjednoreťazcovou DNA prostredníctvom oligonukletidu, ktorý je komplementárny so zreteľom na žiadanú fuzovanú DNA sekvenciu, sa umiestňuje konštrukt vzniknutý do expresného vektora, ktorý je transformovaný do hosťujúceho organizmu, kultivujú sa hostiteľské bunky v živnom roztoku a exprimuje sa fuzovaný proteín.
SK1145-95A 1994-09-16 1995-09-13 Imunokonjugát, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje SK282263B6 (sk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP94114572 1994-09-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK114595A3 SK114595A3 (en) 1997-03-05
SK282263B6 true SK282263B6 (sk) 2001-12-03

Family

ID=8216289

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1145-95A SK282263B6 (sk) 1994-09-16 1995-09-13 Imunokonjugát, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5824782A (sk)
EP (1) EP0706799B1 (sk)
JP (2) JP3865802B2 (sk)
KR (1) KR100386171B1 (sk)
CN (1) CN1123185A (sk)
AT (1) ATE208633T1 (sk)
AU (1) AU702184B2 (sk)
CA (1) CA2158322C (sk)
CZ (1) CZ289641B6 (sk)
DE (1) DE69523857T2 (sk)
DK (1) DK0706799T3 (sk)
ES (1) ES2167391T3 (sk)
HU (1) HU221989B1 (sk)
NO (1) NO315976B1 (sk)
PL (1) PL182636B1 (sk)
PT (1) PT706799E (sk)
RU (1) RU2157701C2 (sk)
SK (1) SK282263B6 (sk)
UA (1) UA40611C2 (sk)
ZA (1) ZA957808B (sk)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998055607A2 (en) * 1997-06-04 1998-12-10 Oxford Biomedica (Uk) Limited Tumor targeted vector
US7276488B2 (en) * 1997-06-04 2007-10-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
US7635687B2 (en) * 1997-06-04 2009-12-22 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
DE69824039T2 (de) 1997-12-08 2005-08-18 Lexigen Pharmaceuticals Corp., Lexington Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung
WO1999046392A1 (en) * 1998-03-12 1999-09-16 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and compositions of chemokine-tumor antigen fusion proteins as cancer vaccines
CA2326427A1 (en) * 1998-03-31 1999-10-07 Koichiro Yamada Preventives/remedies for urinary disorder
WO1999052562A2 (en) * 1998-04-15 1999-10-21 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor
CN1305387A (zh) * 1998-04-17 2001-07-25 利思进药品公司 通过共同给予前列腺素抑制剂增强抗体－细胞因子融合蛋白介导的免疫应答
US6869606B1 (en) 1999-02-22 2005-03-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Biotinylated-chemokine antibody complexes
WO2000078334A1 (en) * 1999-06-17 2000-12-28 University Of Maryland Biotechnology Institute Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor
GB9915074D0 (en) * 1999-06-28 1999-08-25 Cortecs Plc Ligand-binding composition
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US6617135B1 (en) 1999-08-09 2003-09-09 Emd Lexigen Research Center Corp. Multiple cytokine protein complexes
JP2003515323A (ja) * 1999-11-18 2003-05-07 オックスフォード バイオメディカ（ユーケイ）リミテッド 抗 体
US7208152B2 (en) * 1999-11-24 2007-04-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies for “Bonzo” chemokine receptor and therapeutic uses thereof
US6319675B1 (en) 1999-11-24 2001-11-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for detecting and/or identifying agents which bind and/or modulate function of “bonzo” chemokine receptor
WO2001058957A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
DE10019157A1 (de) * 2000-04-18 2001-11-15 Stefan Duebel Verfahren zum Einbringen von Liganden in lebende Zellen
US20040091485A1 (en) * 2000-05-19 2004-05-13 Ellis John Robert Maxwell Humanised antibodies to the epidermal growth factor receptor
US7754676B2 (en) 2000-09-15 2010-07-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Defensin-antigen fusion proteins
AU2001291050A1 (en) 2000-09-15 2002-03-26 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Viral chemokine-tumur antigen fusion proteins
GB0029407D0 (en) * 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
MXPA03008031A (es) 2001-03-07 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida.
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
CN100503639C (zh) 2001-05-03 2009-06-24 默克专利有限公司 重组肿瘤特异性抗体及其应用
EP1256354A1 (en) * 2001-05-11 2002-11-13 Schering Corporation Methods for treating cancer
US20020193569A1 (en) * 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
BRPI0210405B8 (pt) 2001-06-13 2021-05-25 Genmab As anticorpo monoclonal humano, molécula biespecífica, método in vitro para inibir o crescimento de uma célula expressando egfr, para induzir a citólise de uma célula expressando egfr, e para detectar a presença de antígeno egfr ou uma célula expressando egfr em uma amostra, e, vetor de expressão
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
DK1399484T3 (da) * 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
GB0126378D0 (en) * 2001-11-02 2002-01-02 Oxford Biomedica Ltd Antigen
WO2003048334A2 (en) 2001-12-04 2003-06-12 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
JP4212921B2 (ja) 2002-03-29 2009-01-21 独立行政法人科学技術振興機構 抗体を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤およびタンパク質中空ナノ粒子
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
EP2135879A3 (en) * 2002-06-28 2010-06-23 Domantis Limited Ligand
US9321832B2 (en) * 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US20040110929A1 (en) * 2002-07-12 2004-06-10 Bjorn Soren E. TF binding compound
DE60336406D1 (de) 2002-10-16 2011-04-28 Purdue Pharma Lp Antikörper, die an zellassoziiertes ca 125/0722p binden, und verfahren zu deren anwendung
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
ATE471946T1 (de) 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
CA2511910A1 (en) * 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
EP1599572A4 (en) * 2003-02-14 2007-06-13 Univ Southern California COMPOSITIONS AND METHODS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY
JP2008502317A (ja) 2003-12-30 2008-01-31 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング Ｉｌ−７融合タンパク質
AU2005203962C1 (en) 2004-01-05 2012-11-08 Antisoma Research Limited Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
GB2424886A (en) * 2005-04-04 2006-10-11 Dxs Ltd Polynucleotide primers against epidermal growth factor receptor and method of detecting gene mutations
US8124095B2 (en) * 2005-10-07 2012-02-28 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS
US8053569B2 (en) * 2005-10-07 2011-11-08 Armagen Technologies, Inc. Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
EP1957536A2 (en) * 2005-12-01 2008-08-20 Domantis Limited Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
WO2008022349A2 (en) * 2006-08-18 2008-02-21 Armagen Technologies, Inc. Agents for blood-brain barrier delivery
CN101173008B (zh) * 2006-11-01 2011-06-22 复旦大学 一种双功能融合蛋白及其制备方法和应用
US20090011040A1 (en) * 2007-05-02 2009-01-08 Naash Muna I Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
WO2008149147A2 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists
CA3184105A1 (en) * 2007-07-27 2009-02-05 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing alpha-l-iduronidase activity in the cns
WO2009039409A1 (en) * 2007-09-21 2009-03-26 The Regents Of The University Of Californina Targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
EP2262531A1 (en) * 2008-03-08 2010-12-22 Immungene, Inc. Engineered fusion molecules immunotherapy in cancer and inflammatory diseases
US20100098693A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-22 Pardridge William M Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of organophosphatases
CN106995495A (zh) 2009-01-12 2017-08-01 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
JP5873003B2 (ja) 2009-03-18 2016-03-01 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． ＩｇＧデコイ受容体融合タンパク質の血液脳関門送達のための組成物および方法
EP2421896A1 (en) 2009-04-22 2012-02-29 Merck Patent GmbH Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites
DK2485761T3 (da) 2009-10-09 2019-05-06 Armagen Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til øgning af iduronat-2-sulfatase-aktivitet i CNS
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
CN109022465B (zh) 2011-10-28 2022-04-29 特瓦制药澳大利亚私人有限公司 多肽构建体及其用途
EP2785378B1 (en) 2011-12-02 2020-05-13 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
US9803021B2 (en) 2012-12-07 2017-10-31 The Regents Of The University Of California CD138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
KR20240023184A (ko) 2013-03-11 2024-02-20 젠자임 코포레이션 과글리코실화된 결합 폴리펩티드
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
DK3677591T5 (da) 2013-04-29 2024-08-26 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antistoffer og fusioner til svækket interferon alpha-2b
WO2014194100A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 The Regents Of The University Of California Anti-cspg4 fusions with interferon for the treatment of malignancy
CN106471010A (zh) 2014-03-19 2017-03-01 建新公司 靶向模块的位点特异性糖工程化
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
ES2838680T3 (es) 2014-10-09 2021-07-02 Genzyme Corp Conjugados de anticuerpo-fármaco glucomodificados
PE20170908A1 (es) 2014-10-29 2017-07-12 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd VARIANTES DE INTERFERON a2b
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
CN108700565B (zh) * 2015-10-07 2021-10-29 善威生物私人有限公司 血液制备和图谱分析
JP7241677B2 (ja) 2016-07-19 2023-03-17 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 抗ｃｄ４７併用療法
CN111164099A (zh) * 2017-09-29 2020-05-15 河谷细胞有限公司 抗原蛋白及其方法
JP2022515198A (ja) 2018-12-19 2022-02-17 アレイ バイオファーマ インコーポレイテッド ＦＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤としての置換ピラゾロ［１，５－ａ］ピリジン化合物
CN113474337A (zh) 2018-12-19 2021-10-01 奥瑞生物药品公司 作为fgfr抑制剂用于治疗癌症的7-((3，5-二甲氧基苯基)氨基)喹喔啉衍生物

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5470571A (en) * 1988-01-27 1995-11-28 The Wistar Institute Method of treating human EGF receptor-expressing gliomas using radiolabeled EGF receptor-specific MAB 425
IE63847B1 (en) * 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5112946A (en) * 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
AU654811B2 (en) * 1990-03-20 1994-11-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
CA2095836C (en) * 1990-11-09 1999-04-06 Stephen D. Gillies Cytokine immunoconjugates
ES2204890T3 (es) * 1991-03-06 2004-05-01 Merck Patent Gmbh Anticuerpos monoclonales humanizados.
EP0603194A4 (en) * 1991-07-05 1994-12-07 Seragen Inc TO THE RECEPTOR OF THE EPIDERMAL GROWTH FACTOR TARGETED MOLECULES FOR TREATING INFLAMMABLE ARTHRITIS.
ES2144440T3 (es) * 1992-08-18 2000-06-16 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor del factor de crecimiento epidermico, celulas y metodos para su produccion y compuestos que los contienen.

Also Published As

Publication number Publication date
CZ237595A3 (en) 1996-04-17
CZ289641B6 (cs) 2002-03-13
EP0706799A3 (en) 1996-12-04
SK114595A3 (en) 1997-03-05
ATE208633T1 (de) 2001-11-15
JP2006117684A (ja) 2006-05-11
ZA957808B (en) 1996-05-07
AU702184B2 (en) 1999-02-18
RU2157701C2 (ru) 2000-10-20
KR960010023A (ko) 1996-04-20
NO315976B1 (no) 2003-11-24
PL182636B1 (pl) 2002-02-28
DE69523857T2 (de) 2002-06-13
US5824782A (en) 1998-10-20
CN1123185A (zh) 1996-05-29
NO953650D0 (no) 1995-09-15
HUT75836A (en) 1997-05-28
JPH0899901A (ja) 1996-04-16
AU3053395A (en) 1996-03-28
PT706799E (pt) 2002-05-31
UA40611C2 (uk) 2001-08-15
DE69523857D1 (de) 2001-12-20
DK0706799T3 (da) 2002-02-25
CA2158322C (en) 2009-06-16
PL310493A1 (en) 1996-03-18
JP3865802B2 (ja) 2007-01-10
CA2158322A1 (en) 1996-03-17
HU9502711D0 (en) 1995-11-28
ES2167391T3 (es) 2002-05-16
EP0706799A2 (en) 1996-04-17
HU221989B1 (hu) 2003-03-28
KR100386171B1 (ko) 2003-08-21
EP0706799B1 (en) 2001-11-14
NO953650L (no) 1996-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK282263B6 (sk) Imunokonjugát, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje
RU2129018C1 (ru) Иммуноконьюгат, способ получения иммуноконьюгата и фармацевтическая композиция
CA2095836C (en) Cytokine immunoconjugates
US5650150A (en) Recombinant antibody cytokine fusion proteins
AU2001275246B2 (en) T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
WO1995009917A1 (en) Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
KR20010022075A (ko) T세포활성화를유도하는슈퍼항원접합체에의한표적세포의세포용해
IE63186B1 (en) Cloned genes encoding IG-CD4 fusion proteins and the use thereof
US20100015661A1 (en) Antibody-rnase-conjugate
CA2294223C (en) Anti-cd40l immunotoxins for the treatment of diseases
Burbage et al. Ricin fusion toxin targeted to the human granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor is selectively toxic to acute myeloid leukemia cells
Sun et al. Antitumour activity of a chimeric antibody against the leucocyte antigen CD48