JPS63267293A - マラリヤ特異性ＤＮＡ配列のクローニング：１４０ｋｄタンパク質をコードする遺伝子の分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マラリアは、最も広く蔓延している最も危険な熱帯性寄
生虫（原虫）疾病である。世界総人口の約３分の１が感
染の危険性に曝されており、アフリカ、アジアおよびラ
テンアメリカの約６０カ国で重大な健康問題になってい
る。毎年、１億５千万人の人々が感染しており、毎年、
熱帯アフリカ地域だけでも約１００万人の子供がマラリ
アで死亡している（ＷＨＯ，ＴＤＲ７ｔ、ｈ　Ｐｒｏｇ
ｒａｍ　Ｒｅｐｏｒｔ（１９８５））。マラリアは、原
生動物寄生虫プラスモジウム（Ｐ　Ｉａｓｍｏｄ　ｉｕ
ｍ）によって起き、４種がヒトへの感染能を有する。そ
れらは、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐ、　ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・ビバックス（Ｐ
、　ｖｉｖａｘ）、プラスモジウム・マラリア（Ｐ、　
ｍａｌａｒｉａｅ）およびプラスモジウム・オバーレ（
Ｐ、　ｏｖａｌｅ）である。プラスモジウム・ファルシ
パルムは、悪性のマラリアを起こし、最も危険なタイプ
である。急性の疾病では、治療しなけれは、とくに子供
においては、２．３日中に死亡する場合が多い。病原動
物は、雌のハマダラ力が噛むことによってヒトに伝播さ
れる。

近年、殺゛虫剤に対する媒体（蚊）の抵抗性および試用
的、試験的および新規開発の化学治療薬や予防剤に対す
るマラリア原虫プラスモジウム・ファルシパルムの抵抗
性がともに、急速に強まって広がっている。この事実は
、マラリア抑制のための新たな方法の開発を科学者に強
く要請している（ＷＨＯ（１９７９）　ＴＤＲ，ＩＭＭ
ＡＬ、　Ｖａｃ　７９、■、ｆ；　ｅ　ｎ　ｅ　ｖ　ａ
　）。

最も有望な手段は、能動免疫のためのマラリアワクチン
を開発することである。これに関連して、極めて有望な
展開が、能動免疫において抗原として作用する１個また
はそれ以上のプラスモジウム表面タンパク質の遺伝子工
学的な製造に見られる。

従来のワクチン製造に充分な大量の対応抗原は、原虫の
培養からは得ることができない。さらに、宿主細胞の混
入汚染（赤血球成分）によって起きるワクチンの不寛容
を排除することは不可能である。

感染したハマダラ力が噛むことによって、胞子小体（ス
ポロゾイト）は血液循環に達して、これらは肝臓の実質
細胞に速やかに定着し、増殖して多核構造物（シゾント
）になる。これらが寄生した肝臓細胞が破られて、河千
個もの単核原虫（メロゾイトという）を放出され、血流
に入る。これらメロゾイトは、赤血球に侵入のために完
全に特殊化されていて、特異的なレセプターによって認
識される（赤血球サイクル）。原虫は、侵入した赤血球
内で多様な発育期（多数分裂という）を経る。細胞分裂
を何度も繰り返した後、メロゾイトは、侵入した赤血球
を完全に満たす。成熟シゾントの破裂によって、１個の
白血球当り１８−２４個のメロゾイトが放出され、これ
らは新たな赤血球に侵入して、さらに、無性生殖による
血液サイクルを開始する。これらのサイクルの斉時性（
シンクロニズム）は、マラリアの種によって４８−７２
時間持続するが、マラリアの特徴的な兆候や症状を引き
起こす（例えば不安定な高熱や頭痛）。

血中で数代を経た後、原虫のいくつかは、雌および雄の
ガメトサイト（有性型）に分化し、蚊に血液と共に摂取
されて、昆虫の胃中で有性生殖によって感染性のスポロ
ゾイトになり、後に唾液に集まり、次いで、蚊が噛むこ
とによって宿主生物であるヒトに再び達する。

原理的には、このサイクル中において能動免疫のための
ワクチン免疫を、スポロゾイト、メロゾイトおよび／ま
たはカメトサイト期に対して行うことは可能である。抗
スポロゾイトワクチンは、絶対的に安全であり、侵入す
るスポロゾイトの不活性化を完全に保証するものである
はずである。

唯一個のスポロゾイトであっても免疫防御を逃れて肝臓
細胞に達すれは、間違いなくメロゾイトに発達すること
ができる。これは、完全に異なる抗原構造を有している
ので、抗スポロゾイト抗体では中和されない。ガメトサ
イトワクチンは、原虫のハマダラ力中での有性生殖を妨
げて、それがサイクル中で媒体としてもはや機能できな
いようにする。接種を受けたヒトは、したがって、マラ
リア感染からは防御されない。メロゾイトワクチンは、
マラリアが風土病となっている地域のヒトの多くに用い
ることができ、予防および治療の両方の点から極めて重
、要である。

メロゾイトは、ワクチン抗原として適すると思われる多
数の異なるタンパク質分子を細胞内と細胞表面の両方に
有している。そのような活性抗原性構造に対する免疫応
答は、インビトロで、ヒトおよび免疫した動物（モンキ
ー）からのマラリア抗血清およびモノクローナル抗体で
認められた。

今日までの、血液中の無性生殖器からの一連のプラスモ
ジウムタンパク質の分離およびその性質は、記述されて
いる（Ｄ、　Ｊ、　Ｋｅｍｐら：　（１９８６）Ｐａｒ
ａｓｉｔｏｌｏｇｙ　９１．８３−１０８）。

本発明による組換えマラリアワクチンの開発に用いる適
当な抗原は、サイミリ（Ｓａｉｍｉｒｉ）またはアオタ
ス（Ａｏｔｕｓ）モンキーにインビボ試験で接種した後
に、プラスモジウム・ファルシパルムの致死的静脈感染
からの防御効果をもたらしたタンパク質のひとつである
。すなオつち、これは特殊な原虫タンパク質で、ゲル電
気泳動によって精製され、分子ｆｔ１４０ｋｄを有する
（Ｌ、　Ｈ，Ｐｅｒｒｉｎら：（１９８４）、Ｃｌ１ｎ
、　　Ｅｘｐ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、５６、Ｇ７−７２
；　　Ｌ、　　Ｈ。

Ｐｅｒｒｉｎら：　（１９８４）、ｊ、　ＥＸＩＴ、　
Ｍｅｄ、　１６０．４４１−４５１）。

１４０ｋｄ抗原は、細胞質に可溶のタンパク質として産
生されて、メロゾイトおよびシゾントの膜に翻訳後に集
成されるものと見なされる（Ｃ。

Ｂｒａｕｎ−Ｂｒｅｔｏｎ　　ら　：　　（１９８６）
　、　ト１ｏ１．　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｃｔ＋ｅｍ。

Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　２０．３３−４３）。Ｐｅ
ｒｒｉｎらによって記述された抗原（１４０ｋｄタンパ
ク質の他、２００および４１　ｋｄのタンパク質）は、
原虫の表面タンパク質である。このタイプの抗原は、感
染によって変化する赤血球膜上に位置するタンパク質と
ともに、ワクチンに適する可能性があり、遺伝子工学的
手法によって血液中の無性生殖器に対して製造される。

このようなワクチンの効果は、サイミリおよび／または
アオタスモンキーでのインビボ試験で試験することがで
きる。

１４０ｋｄ抗原をコードするＤＮＡを分離することは、
今や極めて重要である。これに間しては、分離されたタ
ンパク質が防御作用を有することは、既に明らかにされ
ている。ざらに、このＤＮＡを適当な宿主細胞で発現さ
せること、および発現産物およびそれらの部分配列を免
疫実験において試験することは、極めて重要である。防
御能が証明された抗原は、マラリアワクチンの開発に適
していると見なされる。

本発明は、ａ）１４０ｋｄ抗原の遺伝子工学的製造工程
、ｌ）　）この目的のために必要な遺伝子およびその転
写産物、Ｃ）この遺伝子の全部または部分を含むＤＮＡ
構造物およびベクター、ｄ）このタイプのＤＮＡで形質
転換された細胞、およびこれらの細胞によって発現され
たポリペプチド、およびｅ）この遺伝子とクロスハイブ
リダイゼーショシ（交差対合）させた核酸部分、に関す
る。

さらに、本発明は、１４０ｋｄ抗原のアミノ酸配列、そ
れによって得られるまたは分離されるオリゴペプチドお
よび抗体、および免疫またはポリペプチドの分離のため
のこれらの使用に関する。本発明の他の態様およびその
好ましい実施態様は、以下に詳細に説明され、特許請求
の範囲に定義される。

１４０ｋｄ抗原をコードするクローンを見出すために、
単一特異性抗血清を用いて、γｇｔｌｌ遺伝子バンクの
分析を既知の方法（Ｌ、　Ｓ、　０ｚａｋｉ（１９８６
）、Ｊ、　１ｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈｏｄ、　８９．２１
３−２１９；Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ　（１９８
６）、Ｐｒｏｔｏ　Ｂｌｏｔ　１ｍｍｕｎｏ−ｓｃｒｅ
ｅｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍ
ａｎｕａｌ）で行った。

この抗血清は、以下、α１４０ｋｄ血清とも称され、ゲ
ル電気泳動によって精製されるタンパク質に対するもの
である。

このスクリーニングによってα１４０ｋｄ血清によって
認識された２個のクローン、１４０−１および１４０−
２、が得られた。これら２個のクローン中の挿入物は、
ＥｃｏＲＩによって切り出すことができ、これらは、各
々、１８０および１５０ｂｐを包含する。これら２個の
クローンか１４０ｋｄ抗原の異なる部分をコードするこ
とが、ファージ！　４０−１および１４０−２のマラリ
ア特異性核酸配列のβ−ガラクトシダーセ融合タンパク
質としての発現およびα１４０ｋｄ血清を用いるウエス
タンブロツＩ・分析によって、クローン１４０−１およ
び１４０−２の発現タンク（り質に対してできる血清と
のシゾントタンパク質のウェスタンプロット分析によっ
て、およびプラスモジウム・ファルシパルムゲノムＤＮ
Ａのサザンブロット分析ここよって、示された。

１４０−１および１４０−２挿入物のＤＮＡ配列決定に
よって、遺伝子のＤＮＡ配列および１４０ｋｄ抗原のア
ミノ酸配列をともに決定することが可能であった（第１
図：配列の囲み部分は、遺１云子バンクの調製に用いた
リンカ−に対応する）。両挿入フラグメントの発現は、
Ｐ１発現ベクターｐ　Ｅ　Ｘ　３０　ｂを使って、ウェ
スタンプロットで単一特異性α１４０ｋｄ血清と陽性に
反応するＭＳ２融合タンパク質（に、　５ｔｒｅｂｅｌ
　ら：　（１９８（３）Ｊ、〜’ｉｒｏｌｏｇｙ　５７
．９８３−９９１）として行わせた。

本発明によると、全１４０ｋｄ抗原または部分配列をコ
ードするＤＮＡ部分を用いて適当な宿主細胞中で発現産
物を製造させること、および発現産物を精製物にして動
物およびヒトの免疫に用いること、ができる。ざらに、
宿主を選択することによって、抗原の修飾の型に影響を
及ぼすことかできる。糖化は細菌内では行われない。一
方、酵母細胞内ての糖化は、より高等な真核細胞内での
糖化とは異なる。

さらに、既知のアミノ酸配列を基にして、免疫用の抗原
として用い得るオリゴペプチドを製造することが可能で
ある。

発現産物および合成オリゴペプチドは、また、防御エピ
トープを試験するためのインビトロまたはインビボ阻害
試験に用い得ると思われるポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体の製造に、抗原として用いることができる
。このタイプの抗体の中和は、マラリアに対する受動免
疫にも用いることができる。このような抗体は、さらに
、高度に精製された１４０ｋｄ抗原および遺伝子操作に
よって調製されるその誘導体を得るのに用いることがで
きろ。記述されたＤＮＡ部分または合成的に調製された
オリゴヌクレオチドプローブを利用す　−ることによっ
て、抗原をコードして、これら確立されたＤＮＡ配列の
５′および３゛末端の両方に向かって延びろ他のセグメ
ントを含む他のクローンを、ｃＤＮＡバンクまたはゲノ
ムバンクから分離することが可能である。種々の宿主シ
ステムにおけるこれらの発現産物は、また、エピトープ
の研究または免疫実験に用いることができる。

さらに、これら２個の部分配列のための完全な遺伝子を
分離することが可能であって、これを利用することによ
って１４０ｋｄ抗原の全部、あるいは少なくとも主要領
域、を発現させることができる。また、この目的のため
に、そのようなりローンに突然変異、例えは、非コード
領域や防弾に不適なコート領域などの欠失や、挿入およ
び塩基置換を施すことが可能である。

そのような操作によって、関連タンパク質構造物の発現
を行わせることが可能である。次いで、これらを、適当
なインヒドロおよびインビボ試験システムで防御作用を
調べて、臨床試験段階に供することができる。

このように、本発明によると、遺伝子操作によって、１
４０ｋｄ抗原さらに部分配列、および両抗原の変異配列
を製造することが可能である。非修飾タンパク質として
防御効果を示すそのような発現産物または合成ペプチド
は、したが−って、充分に高収量で得られ、精製物にし
て血液中の原虫の無性生殖器に対するマラリアワクチン
として使用することができる。

プラスモジウム・ファルシパルムＦＣＢＲ株のゲノムＤ
ＮＡのササンプロット分析によって、クローン１４０−
１および１４０−２の挿入ＤＮＡは、６．Ｏｋｂのゲノ
ムＸ　＋）　ａ　Ｉフラグメント上ここ位置しているこ
とが示されたく第１図）。この）ｆツムＤ　Ｎ　Ａフラ
グメントを分離するために、制限酵素Ｘ　ｂ　ａ　Ｉて
６．　　Ｏｋｂの大きざの範囲に切断したＤＮＡを、フ
ァージベクター人ｏｎｇＣ（Ｇｅｎｏｆ　ｉ　ｔ、　Ｇ
ｍｂＨ５Ｈｅ　ｉｄｅ　ｌ　ｈｅｒｇ）のＸｂａ　Ｉ部
位にクローニングする。この遺伝子バンクをクローン１
４０−１および１４０−２の挿入ＤＮＡてスクリーニン
グした結果、陽性反応するクローンかいくつか得られた
。これらファージクローンのひとつの挿入ＤＮＡをベク
ターｐＵｃ１８のＸｂａ　Ｉ部位ζこサブクローニング
して、制限酵素地図を作製した後に、配列、の３分の２
を決定した。これから、１４０ｋｄ抗原の全ＤＮＡ配列
および対応するアミノ酸配列を解明することが可能であ
った（表２）。

以下の諸例において、とくに記載がなけれは、パーセン
ト表示は重量パーセントを表す。

１０”ＰＦＵ（プラーク形成単位）のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ入
ｇｔ１１発現バンク（プラスモジウム・フフルシバルム
株Ｓ、ＧＥ２の後間シゾント期のｍＲＮＡから調製）を
、プラスモジウム・フフルシパルム株５ＧＥ２からの１
４０ｋｄ抗原に対する単一特異性抗血清を用いてＲ，Ａ
、　ＹｏｕｎｇおよびＲ，Ｗ、　Ｄａｖｉｓ（（１９８
３）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　８０．１１９４−１１９９）の方法によるスクリーニ
ングに供した。このため、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　
Ｋ　１２株Ｙ１０９０の低雑コロニーを０．０２％マル
トースを含む２５ｍ１のＬＢ培地に移して、３７℃で５
時間培養した。

細胞を遠心分離して、ＳＭ（２０ｍＭ）リス−塩酸、Ｉ
）Ｈ７，５，１５０ｍＭＮ　ａ　ＣＬ　　１０ｍＭＭｇ
５０４）に再懸濁させて、０．”６００を２．０にした
。１０６個の入ｇ　ｔ　１１バンクの組換えファージを
、１０…１のこれらの細胞と混合して、３７℃で２０分
間培養した。このファージ／細胞懸濁液の試料２００７
１１を４ｍｌの軟寒天（０，７％アガａ−スを含むＬＢ
）と各々混合して、この混合物を予め温度平衡させてお
いた５０枚のＬＢプレートに移して、４２℃で３時間培
養した。これらＬＢプレートを３２℃にして、各々、乾
燥させて番号を付したニトロセルロースフィルターで覆
った。

このフィルターは、予め１０ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）に浸漬して、
前辺て３７℃に温度平衡させておいた。さらに、３７℃
で３時間培養した後、プレートを室温にして、ブレーＩ
・上のフィルターの位置を針で印付けをしておき、フィ
ルターをプレートから慎重に引き上げて、次いで、２５
０ｍ１のミルク緩衝液（５％ミルク粉末、５０ｍＭ）リ
ス−塩酸、ｐＨ８，０、ｌ　５０ｍＭＮａＣｌ、０．０
５％非イオン系表面活性剤（（ＴＷＥＥＮ２０））中で
室温で注意深くｌＯ分間振とうした。最後にフィルター
を新たなミルク緩衝液に移して、−［１９Ｔｈ４℃で保
持した。

フィルターをざらに２回、それぞれ２５０ｍ１のミルク
Ｍ　２１　？ｌ中で１０分間培養した後、フィルターを
、１：２５０希釈のα１４０ｋｄ血清を含む２５０ｍ１
のミルク緩衝液中とともに室温で１時間注意深く振とう
しながら培養した。血清は、ウサギで調製して、大腸菌
タンパク質で飽和させておいたものを用いた。最後にフ
ィルターをそれぞれ２５０ｍ１のミルク緩衝液で室温で
１０分間振どうすることによって４回洗浄した後、抗ウ
サギＩ　ｇＧ／アルカリホスファターゼ接合体（プロメ
ガ社製、注文番号Ｐ　３７３１）への結合を行わせた。

このために、フィルターを、１　：５０００希釈の抗ウ
サギｒ　ｇＧ／アルカリボスファターゼ接合体を含む２
５０ｍ１のＴＢＳ（５０ｍＭ）リス−塩酸、１）Ｈ８，
Ｏｌｌ　５０ｍＭＮ　ａＣｌ、０．０５％Ｔ　Ｗ　Ｅ　
Ｅ　Ｎ　２０　）とともに、１ｍｇ／ｍｌの濃度で室温
で１時間培養した。フィルターをざらに４回、それぞれ
２５０ｍ１のＴＢＳ中で各１０分間洗浄した後、呈色反
応を製造者（プロメガ社）の方法に従って行わせた。フ
ィルター上の陽性の青色を、ペトリ皿上の領域と照合し
た。該当領域をパスツールピペットで取り出して、ファ
ージを１ｍｌのＳＭに再懸濁させた。さらに２回のスク
リーニング操作を行って、陽性のファージプラークを単
離した。

α１４０ｋｄ抗血清は大腸菌タンパク質とも反応するの
で、λｇｔｌｌバンクのスクリーニングのためには、抗
血清は、パックグランドを少なくするために大Ｒ菌特異
性抗体についても精製されねばならなかった。このため
に、挿入物のない入ｇｔｌｌファージを、３０枚のＬＢ
寒天プレート上に９０ｍｌＴｌの寒天プレート当り５　
Ｘ　１０４ＰＦＩＪの濃度で塗布して、３７℃で一晩培
養した。ニトロセルロースフィルターを各プレート上に
置き、プレートを３７で１時間培養して、フィルターを
裏返して、３７℃でさらに１時間培養した。最後に、フ
ィルターをミルク緩衝液中で、室温で１０分間２回培養
した。α１４０ｋｄ血清の１ｍｌを２５０ｍ１のミルク
緩衝液で希釈して、１０個のλｇｔｌｌフィルターと共
に３回、各１時間室温で注意深く振とうしながら培養し
た。大腸菌特異性抗体を除いて１：　２００に希釈した
血清を、アジ化ナトリウム濃度０．０１％に調整した後
、４℃で貯蔵した。これら血清を、λｇｔｌｌバンクの
スクリーニングおよびウェスタンプロットの両方に用い
た。

α１４０ｋｄ血）青を用いるｃ　Ｄ　Ｎ−Ａ入ｇｔｌｌ
バンクのスクリーニングによって、反応性の高い二つの
入ｇｔｌｌクローン、１４０−１および１゜１０−２、
が同定された。これらは、それぞれ１８０１］ｐおよび
１５０ｔ）ｐの大きさの挿入物を包含しており、それ以
上の性質を知るために、ベクターｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ
切断部位にクローニングさせた。次の諸実験は、これら
クローンの１４０ｋｄ抗原に対する明瞭な免疫学的な作
用を示すために行われた。

大腸菌Ｉ（１２株Ｙ１０８９　（ｌａｃ　　、！０１１
−１ｈｆＬＡ１５０）は、入ｇｔｌ１組換えＤＮＡをそ
のゲノムに安定して合体させる能力を有し、さらに、Ｉ
ＰＴＧによる１ａｃＺ遺伝子領域の誘導によって、β−
ガラクトシダーゼ融合タンパク質としての発現をするこ
ともできる。したがって、箔厚性細胞を、ふたつのファ
ージクローンから調製して、これらのガラクトシダーゼ
発現産物を分析した（Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ　（１
９８５）、ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｉ、ａ　ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）。

β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質は、５ＤＳＰＡＧ
Ｅゲル（Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ　（１９７０）、
Ｎａｔｕｒｅ２２７．６８０−６８５）で両方の株から
認められた。雨林からのタンパク質を電気泳動によって
分画して、ニトロセルロース（ｊＪ、　Ｎｅａｌ’　Ｂ
ｕｒｎｅｔｔｅ　（１９８１）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２．１９５−２０３）
に移し、抗β−ガラクトシダーゼ抗体（抗−β−ｇ　ａ
、１　）およびα１４０ｋｄ血清を用いて調べた。それ
によって、融合タンパク質および分解産物のいくつかが
抗−β−ｇａｌと反応することが示された。α１４０ｋ
ｄ血清を用いて、クローン１４０−１および１４０−２
の融合タンパク質を弱い反応性によって検出することが
可能であった。

発現ベクターｐＥＸ３０ａ、ｂおよびｃ　（Ｋ。

５ｔｒｅｂｅｌ　　ら：　（１９８６）、Ｊ、　Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ　５７．９８３−９９１’）を利用すること
によって、Ｈ，Ｋｕｐｐｅｒらの方法（（１９８１）、
Ｎａｔｕｒｅ　２８９．５５５−５５９）によって、熱
誘導性Ｐ、プロモーターの調節下で、３個の異なる読み
枠で、ＤＮＡフラグメントの発現をＭＳ２−ポリメラー
ゼ融合タンパク質として行わせることが可能である。こ
れに関して、ベクターｐＥＸ３０ｂのＥｃｏＲｒ部位は
、ファージ入ｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ挿入部位と同じ読み
枠を有している。

したがって、両挿入物を、制限酵素ＥｃｏＲＩによって
ｐＵＣ８ベクターから切り出して、ゲル電気泳動によっ
て精製し、ベクターｐＥＸ３０ｂの脱リン酸したＥｃｏ
ＲＩ部位にライゲーションさせた（Ｒ，Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら：　（１９８２）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）。こ
のライゲーション混合物で、修飾した大腸菌Ｃ６００株
５３７のコンピテント細胞を形質転換させた。この大腸
菌株は、プラスミドにカナマイシン耐性遺伝子および温
度感受性リプレッサーｃ１８５７の遺伝子を有した。コ
ンピテント細胞は、塩化カルシウム法によって得た。た
だし、大腸菌５３７の細胞の培養は２８℃で行った。形
質転換は、氷上で３０分間、さらに、４２℃で２分間行
い、２ｍｌのＬＢ培地を加えた後、細胞を２８℃で１時
間再生させた。次いで、細胞を５０μｇ／ｍｌのアンピ
シリンおよび２５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ
Ｂプレート上に塗布して、−晩２８℃で培養した。各形
質転換混合物からの２０個の単離コロニーを５０μｇ／
ｍｌのアンピシリンおよび２５μ呂／ｍｌのカナマイシ
ンを含み、２８℃に保持しておいたＬＢ培地５ｍｌに移
して、混合物を２８℃で２０時間激しく振とうした。こ
れら培養物の一部を各々を、４２”Ｃに予備加熱してお
いた抗生物質を含まないＬＢ培地でｌ：４に希釈して、
４２℃で３−４時間激しく振とうした。次ぎに、誘導の
後、各培養物の１００μｍを予めベレットにしておいて
、このベレットを、２０μｍのＬａｅｍｍｌ　ｉ緩衝液
（前出）に再懸濁させ、５分間煮沸して、１５％ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲルで分画した。最後に、クマシー
（ＣＯＯＭＡＳＳ　Ｉ　Ｅ）兜゛ルー（ＩＣＩ社製）で
染色したゲル中のタンパク質分画を誘導前後の発現産物
について調べた。両遺伝子フラグメントのＭＳ２融合タ
ンパク質としての発現を高い効率で行うことが可能であ
った。これら発現産物の分子量は、各々、３２および２
２ｋｄであった。１４０−ＩＤＮＡフラグメントと合体
した発現クローンは、このＤＮＡフラグメントを３回反
復して有している。融合タンパク質の３２ｋｄの分子量
は、これら３個のフラグメントが同じ位置方向で取り込
まれていることで説明されよう。

単一特異性１４０ｋｄ血清を用いる発現産物の分析によ
って、クローン１４０−１および１４〇−２のＭＳ２タ
ンパク質を、ウェスタンプロットを用いて明瞭に検出す
ることが可能であった。

クローン１４０−１および１４０−２からのＭＳ２融合
タンパク質を、尿素濃度を上げながら洗浄することによ
って全細菌抽出物から濃厚にした。この目的のために、
ふたつの発現クローンの培養物を５０ｎｇ／ｍｌのアン
ピシリンおよび２５μｇ／ｉｆのカナマイシンを含むＬ
Ｂ培地１リットＩｔ中で２８℃で２０時間激しく振とう
した。４２℃に加温しておいたＬＢ培地の４リヴ）Ｊ＆
を加えて、さらに、４２℃で４時間振とうした。最後に
細菌を遠心分離して、２００ｍ１の燐酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）に再懸濁させて、機械的に破砕した。可溶性
のタンパク質を遠心分離によって除去して、発現産物を
含む沈澱物をＰＢＳで２回洗浄し、ＩＭ、尿素に懸濁さ
せた。可溶化されたタンパク質を遠心分離で除去して、
沈澱物を２Ｍ尿素に再び懸濁させた。

これらの工程を尿素濃度を上げながら繰り返した。

両融合タンパク質とも尿素濃度４Ｍに溶解し、７０−８
０％の純度にまで精製された。

ウサギを次のように免疫した。

第１日目：１ｍｇを完全フロインドアジュバントに入れ
て皮下注射；第２−５．１５−１９．２９−３３日目：
毎回０．１ｍｇのＡＥＲＯ５ＩＬ０デグッサ社製）を静
脈注射：第４０日目：採血。

シソントを得るために、プラスモジウム・ファルシパル
ムの株ＦＣＢＲをヒト赤血球で培養しく　Ｔｒａｇｅｒ
およびＪｅｎｓｅｎ　（１９７６）、　５ｃｉｅｎｃｅ
　１９３゜６７３−６７５）、ソルビトール処理によっ
て同調させた（　ＬａｍｂｒｏｓおよびＶａｎｄｅｒｂ
ｅｒｇ　（１９７９）、Ｊ。

Ｉ’ａｒａｓｉｔｏ１．６５．４１８−４２０）。シゾ
ントを、ＧＥＬＡＦＵＮＤＩρ。アつつ＞ｌ＞Ｌ７：ツ
ケツ社５、（Ｐａｓｖｏｌ　　ら：（１９７８）、　Ａ
１１．　　Ｔｒ６．　　）ｌｅｄ、　　Ｐａｒａｓ。

７２．８７−８８と同様）に浮遊させることによって約
９０％までに濃厚にした。シゾントを遠心分離（５分間
、３０００Ｘｇ）　して、プロテアーゼインヒビターを
添加した緩衝液に再懸濁させて、等量づつに分けて一７
０℃で保存した。

シゾント懸濁液をＳＤＳ試料緩衝液に溶解して、Ｓ　Ｄ
　Ｓ　−Ｐ　ＡＧ　Ｅ　（Ｌａｅｍｍｌｉ（前出）緩衝
液システム、アクリルアミド勾配：　５％から１７．５
％）によって分画した。シゾントタンパク質を、ニトロ
セルロースに移して、膜を１　ｃｍ幅の小片に切り分け
、これらをミルク緩衝液で２回各々１０分間ずつ洗浄し
た後、クローン１４０−１および１４０−２からの発現
タンパク質に対する分離した抗血清および１４０　ｋｄ
抗血清とともに、室温で１時間インキュベートした。フ
ィルターをミルク緩衝液中で各１０分間づつ４回洗浄し
た後、特異的シゾントタンパク質に結合した抗体をパー
オキシダーゼ／ＩｇＧ接合体を用いて検出した。

これによって、単一特異性α１４０ｋｄ血清は、基本的
には、分子ｔｌ１３ｋｄのタンパク質バンドと反応する
ことが明らかにされた。同様に、クローン１４０−１お
よび１４０−２からの発現タンパク質に対する抗血清は
、１１３ｋｄのタンパク質を認識する。とくに、クロー
ン１４０−２からの融合タンパク質に対する抗血清は、
ざらに、多くの低分子量のプラスモジウム・ファルシパ
ルムタンパク質と交差反応を示す。

配列決定は、マクサム−ギルバート法（Ｍａｘａｍおよ
びＧ１１ｂｅｒｔ　（１９８０）、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、　６５．４９９）およびブライマーおよび逆
ブライマーを用いるジデオキシ法の両方でｐＵＣ８プラ
スミド（Ｅ、　Ｖ。

ＣｈｅｎおよびＰ、　Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇ　（１９８５
）、ＤＮＡ　４．１６５−１７０）から直接に行った。

クローン１４０−１および１４０−２のふたつのｃＤＮ
Ａフラグメントは、１４０ｋｄ抗原の４３および３６個
のアミノ酸の親水性領域をコードする（表１）。ふたつ
の挿入物の３′末端および１４０−１の５′末端の２３
ｂｐからなる同一の配列は、ベクターλｇｔｌｏへのｃ
ＤＮＡの挿入に用いたリンカ−配列に対応する。入ｇｔ
ｌＯ遺伝子バンクの挿入物を、発現バンクを作るために
ベクター人ｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ切断部位にクローニン
グした。また、クローン１４０−１および１４０−２の
挿入ＤＮＡと対合するふたつの異なるゲノムＥｃｏＲＩ
フラグメントを、１４０ｋｄ遺伝子内の少なくとも１個
のこのタイプの切断部位に結合させることも可能である
。

シゾント培養を溶解し、これをエチヂウムブロマイド／
ＣｓＣ１遠心分雌（Ｐ、　０ｑｕｅｎｄｏら：（１９８
６）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　１８．８９−１０１
）　ｂて得ておいたプラスモジウム・ファルシパルム株
ＦＣＢＲからのゲノムＤＮＡの試料１５μ８を、種々の
制限酵素で消化して、製造者の指示に従って「遺伝子ス
クリーン」膜（デュポン社製）に移した。次いで、クロ
ーン１４０−１および１４０−２の、比活性１０７−１
０８ｄｐｍ／　μｇのニックトランスレーションした（
Ｐ、　Ｗ、　Ｊ、　Ｒｉｇｂｙら：　（１９７７）１，
１．Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　１１３．２３７）挿入ＤＮＡ、　　または
比活性１１０９ｄｐｍ／μｇのブライマー標識した（Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　
１３７．２６６−２５７（１９８４））挿入ＤＮＡと、
ハイブリダイゼイションさせた。フィルターを、０．３
ｘＳＳＣ（ｌｘＳＳＣ：　　０．１５ＭＮａＣ１，０，
０１５Ｍクエン酸ナトリウム）および１％ＳＤＳで６５
°Ｃで１時間洗浄した後、フィルターをオートラジオグ
ラフィーで分析した。サザンプロット実験法を用いて、
約６ｋｂの大きさで、クローン１４０−１および１４０
−２の両方の挿入ＤＮＡと対合するゲノムＸｂａ　Ｉフ
ラグメントを検出した。これは、両方の挿入フラグメン
トは、ひとつの遺伝子に位置していること、および１４
０ｋｄタンパク質をコードするゲノムは、プラスモジウ
ム・ファルシパルムに唯一個存在していること、を示す
。

サザンプロット実験によって、さらに、クローン１４０
−１および１４０−２の挿入ＤＮＡのゲノムＸｂａ　Ｉ
フラグメントでの位置が明らかにされたく第１図）。こ
れは、クローン１４０−１の挿入ＤＮＡ中のＰ　ｓ　ｔ
、　Ｉ制限切断部位の存在およびクローン１４０−２の
挿入ＤＮＡ中のＥｃｏＲｒ切断部位の存在によって、よ
り容易になった。クローン１４０−１および１４０−２
の挿入ＤＮＡは、ゲノムＸ　））　ａ　Ｉフラグメント
のほぼ中央に位置していること、および既知の性質のわ
かったプラスモジウム・ファルシパルム遺伝子内のイン
トロン配列は極めて小さいか、あるいは存在しないので
、ゲノムＸｂａｌフラグメントは、１４０ｋｄの遺伝子
の全部または少なくとも遺伝子のほとんどを包含してい
ると見なされる。これらふたつの挿入フラグメントがこ
のようζこプラスモジウム・ファルシパルムゲノムに挿
入されているので、１４０ｋｄ遺伝子の単離が可能であ
る。

」と −ゝ　　　ロー−゛′ プラスモジウム・ファルシパルム株ＦＣＢＲからのゲノ
ムＤＮＡの６０　ノＬｇを制限酵素Ｘ、ｂ　ａ　Ｉで消
化して、ゲル電気泳動で分画した。５．５ｋｂから６．
　５ｋｂのＤＮＡフラグメントを電気溶出（Ｂ。

Ｐｅｒｂａｌ　　（１９８４）、　ａ　　ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ　　ｇｕｉｄｅ　　ｔ。

ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｔｏｎｉｎｇ）によって回収し
て、製造者（ゲノフィット社）のプロトコールに従って
、ベクター人ｏｎｇＣのＸｂａＩ制限部位にクローニン
グした。このようにしてファージ遺伝子バンクから得た
１０５個の刊換えファージクローンを既知の方法（Ｔ、
　Ｍａｎｉａｔｉｓら：　（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ（ｌｏｎｉｎ３、ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍ
ａｎｕａｌ）によって、クローンＩ４０−１および１４
０−２からのニックトランスレーションさせた挿入ＤＮ
Ａで分析した。

その結果、両方の挿入ＤＮＡと対合した２０個のファー
ジクローンを得た。これらクローンのひとつからファー
ジＤＮＡを得た後、６．Ｏｋｂからなる挿入ＤＮＡを、
ベクターｐＵｃ１８（クローンｐ　（Ｊ　Ｃ１４０ｇ−
ｅ　ｎ　）のＸｂａ　Ｉ部位にサブクローニングした。

クローン１４０−１および１４０−２のニックトランス
レイジョンされた挿入ＤＮＡで後者のクローンをサザン
プロット分析することによって、クローン１４０−１の
配列は、ａ、１ｋｂからなるＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ制限
フ／ラグメントのこのＰｓｔ１部位を含んでいること、
およびクローン１４０−２の配列は、２．７ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ制限フラグメント上に位置していること、が最後
に証明された（第１図を参照されたい）。

制限酵素Ｘ　ｂ　ａ　Ｔ　／　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ　／　Ｅ
　ｃ　ｏ　ＲＩ、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａ　Ｉを用いて
、プラスミドｐＵｃ１４０ｇｅｎから２．　３ｋｂ、０
．　８ｋｂおよび２．　７ｋｂの長さのＤＮＡフラグメ
ントを得て、これらをベクターｐＵｃ１８にサブクロー
ニングした。これらサブクローンの挿入Ｄ　Ｎ　Ａの０
．３μｇの試料を多種の制限酵素とインキュベートして
、ゲル電気泳動によって分画して、ニトロセルロースフ
ィルター上に塗抹した。これをλｇｔｌｌクローン１４
０−１および１４０−２のニックトランスレーションさ
せた挿入ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせて、洗浄
して、露出させた。ふたつのファージクローンの各々の
配列を調製されたサブクローンの挿入ＤＮＡの末端領域
に位置させる（既知のＰｓｔｌおよびＥｃｏＲＩ部位に
関して）ことが可能であったので、対合している制限フ
ラグメントの長さを基にして、既知のＰｓｔＩまたはＥ
ｃｏＲＴ部位から決定さるべき制限部位までの距離を決
定することが可能であった。ざらに、比較的大きな制限
フラグメントのいくつかを２、　７ｋｂのＥ　ｃ　ｏ　
ＲＩ　−Ｘ　ｂ　ａ　Ｉフラグメントから分離して、他
の制限部位の位置を調へた。このタイプの制限地図の作
製は、ファージＤＮＡのＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍ
ｐ１９への制限フラグメントのサブクローニング、およ
びジデオキシチェイン−ターミネーション法（Ｆ、　Ｓ
ａｎｇｅｒら：（１９７？）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、’ＵＳＡ　７４．５４６３−５
４６７：　Ｅ、　Ｙ、　ＣｈｅｎおよびＰ、　Ｈ，Ｓｅ
ｅｂｕｒｇ　（１９８５）ＤＮＡ　４．１６５−１７０
）によるこの目的の配列決定のためのプラスミドベクタ
ーｐ　ＵＣ１８へのサブクローニングの要件を満足する
。この方法で、６．０ｋｂからなるＸ　ｌ）　ａ　Ｉフ
ラグメントの約３分の２が両方の鎖で配列決定され、１
４０ｋｄ抗原をコードする全配列がこうして解明された
。

１４０ｋｄ抗原の完全なりＮＡ配列および対応するアミ
ノ酸配列を表２に示す。この遺伝子の非コード５′末端
および非コード３′末端（位置ｌ−３０１および３７０
Ｇ−３９７５）は、プラスモジウム・フフルシバルム遺
伝子の非コード領域について予見されていたように（Ｊ
、　Ｌ、　ＩｖＪｅｖｅｒ（１９８７）、Ｇｅ１ｌｅ　
、５２．１０３−１０９）、両方共に、極めてＡＴに富
んでいる（ＡＴ含有量は、各々、９２．４％および８７
．４％）。ＡＴＣ開始コードン（位置３０２）からＴＡ
Ａ終止コードン（位置３７０６）までのコード領域は、
ＡＴ含有量が６０．６％で、３個のイントロン配列（位
置３３６−４８７、位置１２８０−１４５４および位置
１５９６−１７２０）によって４個のエクソン区分に分
割されている。３個のイントロンのいずれも、高いＡＴ
含有量を示し、その平均は８６．５％であり、３個の読
み枠のいずれも数個の終止コードンを有する。３個のイ
ントロンの末端配列は、他の生物の多数のイントロンで
決定されている共通配列（Ｓ、　Ｍ、　Ｍｏｕｎｔ　（
１９８２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
１０．４５９−４７２）と実質的には一致させることが
できる。３個のイントロンの位置はすべて、Ｓ１ヌクレ
アーゼマツピング（Ａ。

Ｊ、　ＢｅｒｋおよびＰ、　Ａ、　５ｈａｒｐ　（１９
７７）　Ｃｅ１ｌ　１２、？２ｌ−７３２）によって、
および予示されたイントロン配列の塩基約３０個分下流
でｍ　ＲＮ　Ａに結合するヌクレオチドブライマーを利
用するＲＮＡ配列決定（ＢＲＬ−Ｆｏｃｕｓ　９、Ｎｏ
、　１　（１９８７）　５−８）によって、明らかにさ
れた。

コード領域は、２９５２個のヌクレオチドを含み、これ
は、９８４個のアミノ酸、分子量として１１０ｋｄに対
応する。これは、ウェスタンプロットで見出された分子
量１１３ｋｄとよく一致している。第１番目のエクソン
は、わずかに１１個のアミノ酸をコードする。この配列
は、第２番目のエクソン区分によってコードされる後続
の５個のアミノ酸とともに、典型的な疎水性のシグナル
配列を形成する。同様のシグナル配列は、池のプラスモ
ジウムタンパク質についても記述されている（Ａ、　Ａ
、　ｆ（ｏｌｄｅｒら：　（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ
　３１７．２７０−２７３；　Ｄ、　Ｓｉｍｍｏｎｓら
：　（１９８７）、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、　６．４８５
−４９１；　Ｊ、　Ｖ、　Ｒａｖｅｔｃｈら：　（１９
８４）、Ｎａｔｕｒｅ３１２．６１６−６２０）。この
シグナル配列には、共通配列のオクタペプチド 並　　　Ｘ　　　並 Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｎ０６個をコードする反復配列部分（位置５
２〇−６６３）が直接に続いている。このなかで、位置
ｌのスレオニン残基および位置７のグリシン残基は、極
めて恒久的である。位置１０００から１１１３までの１
４０ｋ（ｌ抗原の２＠目の反復配列部分は、１９個のへ
キサヌクレオチド配列ＡＧＴＴＣＴＡからなり、１個の
アミノ酸残基を除いては全てセリン残基からなる反復領
域をコードする。第３番目のエクソンは、第１番目のエ
クソンと全く同様に極めて小さく、わずか４７個のアミ
ノ酸をコードし、反復配列部分を含まない。

これは、最大のエクソン、すなわち第４番目のエクソン
にも当てはまる。これは、位置１７２１に始まって、遺
伝子の残りの領域を含み、６６２個のアミノ酸をコード
する。このエクソンは、クローン１４０−１および１４
０−２０ＣＤ　Ｎ　Ａ配列と一致する、位置３３３９−
３４６９および２１８２−２２２９の配列部分を含む（
表１を参照されたい）。ゲノム配列とふたつのｃＤＮＡ
配列は、異なるプラスモジウム・ファルシパルム株に由
来することから、１４０ｋｄ抗原のこれらの部分は、恒
久性が極めて大きいと見なされる。

１４０ｋｄ抗原のアミノ酸配列を、ＵＷＧＣＣ（ｌＪｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ　　ｏｆ　　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　ＣｏｍｐｕｔｅｒＧｌ・ｏｕｐ）
プログラムによって、可能な糖化部位、親水性および表
面領域および抗原活性を有する領域について調べた。そ
の結果、可能な糖化部位は、９８４個のアミノ酸を包含
する１４０ｋｄ抗原の、アミノ酸位置１７６．１９３．
３０５および８１５のアスパラギン残基であることが判
明した。

抗原性エピトープである可能性を示す親水性表面領域は
、主に、第４番目のエクソンによってコードされるアミ
ノ酸領域の位置１８８２−１９１７．２３１４−２４０
３および２６０２−２６３１に見出される。

地理的に異なるプラスモジウム・ファルシパルムの４種
の分離株、ＦＣＢＲ（コロンビア）、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔ
ｏ　（ウガンダ）、■ｔＧ２Ｇ２（ブラジル）および５
ＧＥ２　（ザイール）、を制限酵素ＸｂａＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩ、ＰｖｕＵ、ＰｖｕＩ［とＨ
ｇ」Ａ　Ｉ、ＨｊｎｃＩＩとＡｃｃｌおよびＮ５ｉＩで
消化して、０．８％アガロースゲルで分画し、ニトロセ
ルロースフィルターに塗床して、１４０ｋｄ遺伝子のコ
ード領域からの３２Ｐ−標識ＤＮＡとハイブリザイゼー
ションさせた。その結果、４個の分離株の消化したゲツ
ムＤＮＡは、全て、同一サイズのバンドを示す同一のハ
イブリダイゼーションパターンを、有する。

これらのデータから、１４０ｋｄ遺伝子の配列は、これ
らの株のいずれにも１呆持されていることが確認された
。同様に、種々のプラスモジウム・ファルシパルム分離
株（ＦＣＢＲ，コロンビア；５ＧＥ２、ザイール；ＶＯ
Ｒ，ベトナム）の１４０ｋｄ抗血清を用いるウェスタン
プロット分析によっても、１４０ｋｄ抗原の大きさおよ
び配列が保持されていることが示された。

また、全ての分離株において、唯一個のＥｃｏＲＩ制限
部位が６．０ｋｂＸｂａＩＤＮＡフラグメントに位置し
ていることが示される（表２の位置２６４５）。したが
って、クローン１４０−２のＥｃｏＲＩ部位（表１）は
、用いたＤＮＡリンカ−による挿入物の最初の２個のヌ
クレオチド（ＧＡ）の導入、したがって、ＥｃｏＲ１部
位の偶然の産生の結果として説明□されよう。

表１ 威ＧＣＡ礎伺四先灯面馬叫肛ＡＡＴＡＩＩＴのｎ＾Ｇ１
０口促灯１ｖ日Ｅ　＃？Ｇ　ｆｌ　ｊＬＡわＶ丸弼旧し
■畑Ｖ丸ρ球實ＩＬＥＶ丸煙り胃賊Ｇ＾＾ｎｃａ；ｒ＾
＾丁ＣＣ＾６Ｃ丁ＧＴＡＴ’ＧＴＣＴＴ＾＾＾＾＾ＴＧ
ＴＴＧ＾ｒｃ＾丁ＴＧＧ＾ＴＴＧＴＡ＾＾Ｔ＾＾Ｇ＾Ｇ
＾＝Ｕ弧 −へ　　　　　　　　　　■　　　　　■裳　　　５　
　３　　　　　　″　　　ゞ０（ｆ） 表」しのＪＬ期 １４０ｋｄ遺伝子の全塩基配列およびブラシモジラム・
ファルシパルム株ＦＣＢＲの１４０ｋｄ抗［の対応アミ
ノ酸配列。ヌクレオチドは、コードＤＮＡ鎖の上に２０
塩基間隔で番号が付しである。

抗原のアミノ酸の位置番号は、右端方に示しである。イ
ントロン配列は矢印で示しである。反復配列部分には下
線が施しである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の１４０ｋｄ抗原を図示する、説明図
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、遺伝子操作によって製造された、プラスモジウム・
   ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐ
   ａｒｕｍ）のメロゾイトおよびシゾントの１４０ｋｄ抗
   原および抗原性活性を有する当該抗原の部分配列。 ２、請求項１に記載の抗原を含む融合タンパク質。 ３、請求項１に記載の抗原をコードする ＤＮＡおよびＲＮＡ。 ４、請求項１に記載の１４０ｋｄ抗原をコードし、表２
   に対応する精製分離されたＤＮＡ配列、およびこれに相
   補的であってこれと対合する配列。 ５、請求項１に記載の抗原または請求項２に記載の融合
   タンパク質をコードする、ＤＮＡ構造物およびベクター
   。 ６、請求項３または４に記載のＤＮＡまたは請求項５に
   記載のＤＮＡ構造物またはベクターを含む、宿主細胞。 ７、請求項６に記載の宿主細胞によって発現したタンパ
   ク質。 ８、請求項１または２に記載のタンパク質に対する抗体
   。 ９、請求項１または２に記載の抗原を含むワクチン。 １０、請求項８に記載の抗体を含む受動免疫予防剤。 １１、請求項３または５に記載のＤＮＡまたはＲＮＡを
   含む診断補助物。 １２、請求項８に記載の抗体を含む診断補助物。 １３、請求項７に記載のタンパク質を含む診断補助物。 １４、請求項８に記載の抗体を使って分離させたタンパ
   ク質。