JPH10507455A - 動物をノミ寄生から防御するためのノミプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤の使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はノミセリンプロテアーゼ及びアミノペプチダーゼのタンパク、同タンパクをコードする核酸分子を含めたノミセリンプロテアーゼ及びアミノペプチダーゼの核酸分子、同タンパクに対して誘起される抗体、ノミセリンプロテアーゼ及び／またはアミノペプチダーゼの活性を阻害する化合物に関する。また本発明は係るタンパク、核酸分子、抗体及び阻害剤を得るための方法を含む。また本発明は係るタンパク、核酸分子、抗体、及び／または阻害剤を含む治療的組成物と、宿主動物をノミ寄生から防御するための同治療的組成物の使用方法とを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 動物をノミ寄生から防御するためのノミプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤の 使用方法 発明の分野 本発明は、新規なノミプロテアーゼタンパクと、動物におけるノミ寄生を低減 するための同タンパクの使用方法とに関する。また、本発明は、動物におけるノ ミ寄生を低減させるべく、ノミプロテアーゼ活性を低下させる抗ノミプロテアー ゼ抗体及びその他の化合物の使用方法に関する。 発明の背景 昆虫ノミ（Siphonaptera）目に属するノミは、鳥類及び哺乳類を含む広範な動 物における強制寄生虫である。ノミは種々の疾病の原因となり、及び／またはこ れらを媒介することが知られていることから、動物におけるノミ寄生は健康上及 び経済上の問題とされている。ノミは、例えばノミアレルギー皮膚炎、貧血、発 疹熱、ペスト、条虫症を引き起こす感染因子の原因となり、及び／またはこれら を媒介する。また、ペットとして飼育されている動物についても、ノミが寄生す ることはそのペットの飼い主にとって、ペットに寄生しているノミにより住居が 全体的に汚染され得るという不快感の原因となるため問題である。即ち、ノミは 動物に寄生している場合のみならず、全般的な動物環境に存在している場合も問 題である。 ノミ寄生における医学的及び獣医学的な重要性から、ノミ寄生を制御するため の試薬の開発が促進されてきた。一般に見られるノミ寄生制御方法は全般的に、 スプレー剤、シャンプー剤、散布粉剤、浸液、または泡剤等の製剤、またはペッ ト用首輪における殺虫剤の使用に照準が合わされている。これらの製剤のいくつ かは有効であるが、大多数においては非常に限定的な期間における防御作用を提 供するに留まる。更に、係る方法のうちの多くにおいてはしばしば、ペットに寄 生するノミ数を減少させる上では、以下の理由のうちの１つ以上のことから好結 果が得られない。即ち、（１）飼い主による投薬遵守（頻回投与が必要である） が得られないこと、（２）殺虫剤製剤または投与方法に対するペットの行動的ま たは生理的不耐性、及び（３）処方された用量の殺虫剤に対して耐性を有するノ ミ集団の出現である。その他の抗ノミ製剤には、昆虫ホルモンを擬態してノミ幼 虫の生長に影響を及ぼすメトプレン（methoprene）を含む昆虫生長制御薬（ＩＧ Ｒ）等の非毒性試薬が含まれる。 ノミ寄生を制御するためのその他の方法として、ノミの寄生中または事前に動 物に投与するノミワクチンの使用がある。しかしながら、抗ノミ試薬の開発に対 してかなりの関心が寄せられているにも関わらず、ノミワクチンは現在のところ 存在しない。 発明の概要 本発明は宿主動物をノミ寄生から防御する方法に関し、同方法は、投与された 動物の血液を摂取するノミのプロテアーゼ活性を低下させる化合物を含む組成物 を動物に投与し、それにより動物及び動物環境におけるノミ負荷を減少させるス テップを含む。標的とすべきノミプロテアーゼはアミノペプチダーゼ、カルボキ シペプチダーゼ及び／またはエンドペプチダーゼでもよく、セリンプロテアーゼ 、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及びシステインプロテアー ゼも含まれ得る。 本発明における組成物に含まれる好適な化合物には、以下のうちの１つ以上の 化合物が含まれる。即ち、ノミプロテアーゼワクチン、抗ノミプロテアーゼ抗体 及び／またはプロテアーゼ阻害剤である。また、係る化合物を含む組成物も本発 明に含まれる。特に好適な化合物はノミセリンプロテアーゼ活性を低下させる化 合物であり、ノミセリンプロテアーゼワクチンは更に好ましい。 本発明の別の実施形態は、本発明の１つ以上の組成物を含む徐放性製剤、及び ノミ寄生に対する長期的防御作用を提供するための同製剤の使用方法である。 好適な実施形態において本発明の組成物を動物に投与すると、ノミが同投与さ れた動物の血液を摂取し始めてから少なくとも約２１日以内に、ノミ生存率は少 なくとも約５０％低下する。別の実施形態では、本発明の組成物を動物に投与す ると、ノミが同投与された動物の血液を摂取し始めてから少なくとも約３０日以 内に、ノミ繁殖能力は少なくとも約５０％低下する。 また、本発明は、ノミプロテアーゼ活性を低下させることが可能な第１の化合 物と、ノミプロテアーゼ活性を低下させること以外の方法によって、ノミ負荷を 減少させる第２の化合物とを含む組成物を動物に投与することを含むような宿主 動物をノミ寄生から防御する方法も含む。この実施形態では、第１の化合物はノ ミ中腸のタンパク分解活性を低下させることにより、同様に中腸を介してノミの 体内に入り、タンパク分解活性の低下がなければ、タンパク分解作用の影響を受 けやすい第２の化合物の有効性を促進する。また本発明は、このような第１及び 第２の化合物を含む組成物も含む。 また、本発明は、直接的にノミに対して、またはノミに寄生されやすい動物に 対して、ノミプロテアーゼ活性を低下させることができる化合物を含む組成物を 投与することを含むノミ寄生低減方法も含む。 本発明の別の局面はタンパク分解活性を有する溶解性ノミ中腸試料であって、 ４−２−アミノエチル−ベンゼンスルホニルフルオライド−塩酸塩によって、タ ンパク分解活性の少なくとも約７０％が阻害される（即ち、同活性の約７０パー セントはセリンプロテアーゼ活性である）。溶解性ノミ中腸試料は、好ましくは （ａ）液体部分及び固体部分を有する混合物を生成するためにノミ中腸を破砕し 、（ｂ）試料を得るために液体部分を回収することにより調製される。種々の精 製技術のうちのいずれの技術によっても、同試料からノミプロテアーゼを採取す ることが可能である。 また、本発明は、ノミ中腸に存在する中腸プロテアーゼをコードする核酸分子 と、厳密な条件下においてハイブリッド形成可能な核酸分子によってコードされ るアミノ酸配列を含む単離タンパクも含む。同タンパクは、タンパク分解活性及 び／またはノミ中腸プロテアーゼに対する免疫応答を誘起する能力を有すること が好ましい。また、本発明には、配列識別番号１を含むアミノ酸配列を有するノ ミ中腸プロテアーゼをコードする核酸分子と、厳密な条件下においてハイブリッ ド形成可能な核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む単離ノミプロテ アーゼタンパクも含まれる。 また、本発明は、ノミ中腸に存在するノミプロテアーゼをコードする遺伝子と 、厳密な条件下においてハイブリッド形成可能な核酸分子も含む。また、本発明 の１つ以上の核酸分子を含む組換え分子及び本発明の１つ以上の核酸分子を含む 組換え細胞も含まれる。本発明のノミプロテアーゼタンパクをコードする核酸分 子を、このようなタンパクを合成するために用いることができる。 また、本発明は、ノミ中腸に存在するプロテアーゼに選択的に結合可能な単離 抗体も含む。このような抗体は、受動免疫プロトコールにおける使用方法を含め 、種々の使用方法を有する。 本発明の別の局面は、ノミプロテアーゼのタンパク分解活性阻害能を有する化 合物を同定する方法である。このような方法は（ａ）阻害化合物候補が存在しな ければプロテアーゼはタンパク分解活性を有するという条件下で、単離ノミセリ ンプロテアーゼタンパクを同阻害化合物候補に接触させること、及び（ｂ）阻害 化合物候補によってプロテアーゼ活性が阻害されるか否かを判断することという ステップを含む。また、本発明には、ノミプロテアーゼのタンパク分解活性阻害 能を有する化合物を同定するためのテストキットも含まれる。このようなキット には、タンパク分解活性を有する単離ノミプロテアーゼタンパクと、阻害化合物 候補の存在下で同活性が阻害される度合いを判断する手段とを含む。 また、本発明は、ノミセリンプロテアーゼタンパク及びアミノペプチダーゼタ ンパク、同タンパクをコードする核酸分子を含めたノミセリンプロテアーゼ核酸 分子及びアミノペプチダーゼ核酸分子、同タンパクに対して産生される抗体、及 びノミセリンプロテアーゼ及び／またはアミノペプチダーゼに対する活性阻害能 を有する化合物に関する。また、本発明は前述のタンパク、核酸分子、抗体及び 阻害剤を得るための方法も含む。更に、このようなタンパク、核酸分子、抗体及 び／または阻害剤を含む治療的組成物、及び宿主動物をノミ寄生から防御するた めの同治療的組成物の使用方法もまた、本発明に含まれる。 本発明の一実施形態は、厳密なハイブリッド形成条件下にて、ノミセリンプロ テアーゼ遺伝子とハイブリッド形成する単離ノミセリンプロテアーゼ核酸分子で ある。特に好ましいノミセリンプロテアーゼ核酸分子には、核酸配列である配列 識別番号１６、配列識別番号１８、配列識別番号２０、配列識別番号２２、配列 識別番号２４、配列識別番号２６、配列識別番号２８、配列識別番号３０、配列 識別番号３２、配列識別番号３４、配列識別番号３６、配列識別番号３８、表２ に開示されている核酸配列（即ち配列識別番号５２、配列識別番号５４、配列識 別番号５６、配列識別番号５８、配列識別番号６０、配列識別番号６２、配列識 別番号６４、配列識別番号６６、配列識別番号６８、配列識別番号７０、配列識 別番号７２、配列識別番号７４、配列識別番号７６、配列識別番号７８）、配列 識別番号８０、配列識別番号８２、配列識別番号８４、配列識別番号８６、配列 識別番号８８、配列識別番号９０、配列識別番号９２、配列識別番号９４、配列 識別番号９６、配列識別番号９８、配列識別番号１００、配列識別番号１０２、 配列識別番号１０４、配列識別番号１０６、配列識別番号１０８、配列識別番号 １１０、及び／またはアミノ酸配列である配列識別番号１、配列識別番号２、配 列識別番号３、配列識別番号４、配列識別番号５、配列識別番号６、配列識別番 号７、配列識別番号８、配列識別番号９、配列識別番号１７、配列識別番号１９ 、配列識別番号２１、配列識別番号２３、配列識別番号２５、配列識別番号２７ 、配列識別番号２９、配列識別番号３１、配列識別番号３３、配列識別番号３５ 、配列識別番号３７、配列識別番号３９、配列識別番号４０、配列識別番号４１ 、配列識別番号４２、配列識別番号４３、配列識別番号４４、配列識別番号４５ 、配列識別番号４６、配列識別番号４７、表２に開示されているアミノ酸配列（ 即ち配列識別番号５３、配列識別番号５５、配列識別番号５７、配列識別番号５ ９、配列識別番号６１、配列識別番号６３、配列識別番号６５、配列識別番号６ ７、配列識別番号６９、配列識別番号７１、配列識別番号７３、配列識別番号７ ５、 配列識別番号７７、配列識別番号７９）、配列識別番号８１、配列識別番号８３ 、配列識別番号８５、配列識別番号８７、配列識別番号８９、配列識別番号９１ 、配列識別番号９３、配列識別番号９５、配列識別番号９７、配列識別番号９９ 、配列識別番号１０１、配列識別番号１０３、配列識別番号１０５、配列識別番 号１０７、配列識別番号１０９、及び／または配列識別番号１１１を有するタン パクをコードする核酸配列、及び前述の核酸配列の任意の配列における対立遺伝 子による変異型が含まれる。 本発明の別の実施形態は、厳密なハイブリッド形成条件下でノミアミノペプチ ダーゼ遺伝子とハイブリッド形成する単離ノミアミノペプチダーゼ核酸分子であ る。特に好適なノミアミノペプチダーゼ核酸分子には、配列識別番号５０の核酸 配列またはその対立遺伝子による変異型が含まれる。別の特に好適なノミアミノ ペプチダーゼ核酸分子には、配列識別番号１１２の核酸配列またはその対立遺伝 子による変異型が含まれる。 本発明はまた、本発明のノミセリンプロテアーゼ核酸分子及び／またはノミア ミノペプチダーゼ核酸分子を含む組換え分子、組換えウイルス及び組換え細胞に 関する。また、前述の核酸分子、組換え分子、組換えウイルス及び組換え細胞を 作製する方法も含まれる。 本発明の別の実施形態には、ノミセリンプロテアーゼタンパクを含むタンパク を含め、単離ノミセリンプロテアーゼタンパクが含まれる。好適なノミセリンプ ロテアーゼタンパクは、動物に投与されたときに天然ノミプロテアーゼに対する 免疫応答を誘起し、及び／またはセリンプロテアーゼ活性を有することが可能で ある。特に好適なノミセリンプロテアーゼタンパクは、本発明の好適なノミセリ ンプロテアーゼ核酸分子によってコードされるタンパクである。 本発明の更に別の実施形態には、ノミアミノペプチダーゼタンパクを含むタン パクを含め、単離ノミアミノペプチダーゼタンパクが含まれる。好適なノミアミ ノペプチダーゼタンパクは、動物に投与されたときに天然ノミプロテアーゼに対 する免疫応答を誘起し、及び／またはアミノペプチダーゼ活性を有することが可 能である。特に好適なノミアミノペプチダーゼタンパクは、配列識別番号５１を 含むタンパク、または配列識別番号５０を有する核酸分子の対立遺伝子による変 異型である核酸分子によってコードされるタンパクである。特に好適な別のノミ アミノペプチダーゼタンパクは、配列識別番号１１３を含むタンパク、または配 列識別番号１１２を有する核酸分子の対立遺伝子による変異型である核酸分子に よってコードされるタンパクである。 本発明は更に、ノミのセリンプロテアーゼタンパク及びアミノペプチダーゼタ ンパクのミメトープに関し、また、ノミセリンプロテアーゼタンパクまたはその ミメトープ、もしくはノミアミノペプチダーゼタンパクまたはそのミメトープに 選択的に結合する単離抗体に関する。更に、本発明のタンパク、ミメトープ及び 抗体を生成するための組換え方法を含む方法も含まれる。 本発明の更に別の実施形態は、ノミ寄生を低減させることができる治療的組成 物である。このような治療的組成物は、以下の防御化合物のうちの１つ以上を含 む。即ち単離ノミセリンプロテアーゼタンパクまたはそのミメトープ、厳密なハ イブリッド形成条件下でノミセリンプロテアーゼ遺伝子とハイブリッド形成する 単離ノミセリンプロテアーゼ核酸分子、ノミセリンプロテアーゼタンパクに選択 的に結合する単離抗体、ノミセリンプロテアーゼ活性阻害能により同定されるノ ミセリンプロテアーゼ活性阻害剤、単離ノミアミノペプチダーゼタンパクまたは そのミメトープ、厳密なハイブリッド形成条件下でノミアミノペプチダーゼ遺伝 子とハイブリッド形成する単離ノミアミノペプチダーゼ核酸分子、ノミアミノペ プチダーゼタンパクに選択的に結合する単離抗体、ノミアミノペプチダーゼ活性 阻害能により同定されるノミアミノペプチダーゼ活性阻害剤。本発明における好 適な治療的組成物には、賦形剤、アジュバント及び／または基剤も含まれる。更 に、ノミ寄生を低減させる方法もまた、本発明に含まれる。同方法には、本発明 の治療的組成物を動物に投与するステップが含まれる。 本発明の別の実施形態は、ノミセリンプロテアーゼ活性またはノミアミノペプ チダーゼ活性に対する阻害能を有する化合物を同定する方法である。同方法には （ａ）単離ノミセリンプロテアーゼタンパクまたはノミアミノペプチダーゼタン パクは、阻害化合物候補が存在しなければ、それぞれセリンプロテアーゼ活性ま たはアミノペプチダーゼ活性を有するという条件下で、それらのタンパクを同阻 害化合物候補に接触させること、及び（ｂ）阻害化合物候補がそれぞれの活性を 阻害するか否かを判断することというステップが含まれる。また本発明には、ノ ミセリンプロテアーゼ活性またはノミアミノペプチダーゼ活性に対する阻害能を 有する化合物を同定するテストキットも含まれる。同キットには、セリンプロテ アーゼ活性を有する単離ノミセリンプロテアーゼタンパク、またはアミノペプチ ダーゼ活性を有する単離ノミアミノペプチダーゼタンパク、及び阻害化合物候補 の存在下でそれぞれの活性が阻害される度合いを判断するための手段が含まれる 。 図面の簡単な説明 図１は、飼料を与えた、あるいは絶食させた雌ノミのいずれか一方から得られ た１，２，５又は１０個の中腸中の相対的タンパク分解活性のプロテアーゼ基質 ゲル分析結果を示す。 図２は、セリンプロテアーゼ阻害剤の存在下あるいは非存在下においてインキ ュベートされた飼料を与えた場合及び絶食させた場合の中腸試料のプロテアーゼ 基質ゲル分析結果を示す。 図３は、セリンプロテアーゼ阻害剤の存在下あるいは非存在下においてインキ ュベートされた可溶性ノミ中腸試料において得られる種々のフラクションのプロ テアーゼ基質ゲル分析結果を示す。 図４は、ノミに血液を給餌した後の中腸プロテアーゼ活性を時間の関数として 表したプロテアーゼ基質ゲル分析結果を示す。 図５Ａは、部分的に精製された（１，３−³Ｈ）−ジイソプロピルフルオロリ ン酸（ＤＦＰ）にてラベルされた、飼料を与えたノミの中腸セリンプロテアーゼ のクマシーブリリアントブルーにて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナ トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）を示す。 図５Ｂは、部分的に精製されたＤＦＰにてラベルされた飼料を与えたノミの中 腸セリンプロテアーゼの図５ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥのオートラジオグラムを示す 。 図６は、一定量のプロテアーゼ阻害剤を含む血液を摂取した成虫（雄及び雌） ノミの平均生存率を示す。 図７は、一定量のプロテアーゼ阻害剤を含む血液を摂取した成虫雌ノミの平均 繁殖能力を示す。 図８は、一定量のプロテアーゼ阻害剤を含む血液を摂取した成虫（雄及び雌） ノミの平均生存率を示す。 図９は、一定量のプロテアーゼ阻害剤を含む血液を摂取した成虫雌ノミの平均 繁殖能力を示す。 図１０は、ネコから飼料を摂取したノミ中のＤＦＰにてラベルされたプロテア ーゼの時間における誘導を示す。 図１１は、ネコから飼料を摂取したノミ中のＤＦＰにてラベルされたプロテア ーゼの時間における誘導のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、宿主動物をノミの寄生から防御するためのノミプロテアーゼ活性を 阻害する化合物の使用を含む。発明者らは、プロテアーゼがノミ中腸の主要な成 分であり、かつ宿主動物及び同動物に隣接した（すなわち、動物を取り巻く）環 境の双方におけるノミ負荷を低減するための免疫療法及び／又は化学療法的な介 在物の良好なターゲットであることを明らかにした。発明者らは、例えば、血液 飼料がノミプロテアーゼ活性を低減する化合物を含む場合、血液飼料を摂取する ノミの生存率及び／又は繁殖能力が減少することを示した。これは、化合物がノ ミの消化及びその他の機能に影響を与えることによるものと考えられる。宿主動 物にほとんど害を与えずにノミプロテアーゼの量及び／又は活性を低減する化合 物が本発明に含まれる。そのような化合物としては、ノミプロテアーゼワクチン 、抗ノミプロテアーゼ抗体、ノミプロテアーゼ阻害剤及び／又はプロテアーゼ合 成 を抑制する化合物が含まれ、これらは以下に詳細に記載される。 本発明の一実施態様は、ある組成物を宿主動物に投与することにより宿主動物 をノミの寄生から防御するための方法であり、同組成物は、処置された動物から 飼料を摂取したノミ（飼料摂取中のノミ並びに飼料を既に摂取したノミを含む） 中のプロテアーゼ活性を低減するような化合物を含み、それにより動物中及び同 動物の環境中のノミ負荷が低減される。ここで、単数で表されたものは、一つあ るいはそれ以上のものを含むことを意味し、例えば「一つの化合物」は、一つあ るいはそれ以上の化合物を指すことを明記しておきたい。すなわち、「一つの」 、「一つあるいはそれ以上の」及び「少なくとも一つ」という用語は、ここでは 相互に変更可能なものとして使用され得る。従って、本発明の組成物は、ノミ中 の一つあるいはそれ以上のプロテアーゼを標的とする（プロテアーゼ活性を低減 するような）一つあるいはそれ以上の化合物を含み得る。 本明細書において「ノミの寄生から動物を防御すること」とは、動物及び動物 の環境中のノミ個体数の拡大する可能性を低減すること（すわなち、ノミ負荷を 低減すること）を示す。好ましくはノミ個体数が減少し、最適には、動物がノミ によって悩まされることのないような個体数であることが望ましい。ここで定義 される宿主動物とは、ノミが同宿主動物の皮膚に付着し、その皮膚を介して飼料 を得るような動物である。ノミ及び他の外部寄生虫は、長期間にわたり宿主動物 中にて生存し、あるいは飼料を得るために一時的に動物を攻撃する。所定の時間 にて、ノミ個体数の内の所定の割合のノミは宿主動物中に存在し、一方、残りの ノミは動物の環境中（すなわち、動物のいる環境中）に存在する。このような環 境は、ノミ成虫のみならず、ノミの卵及び／又はノミ幼虫をも含み得る。この環 境とは、同環境中にあるノミが宿主動物中に跳び移ったり、あるいは跳び降りた りすることが可能な大きさである環境を指す。すなわち、動物におけるノミ負荷 を低減するのみならず、動物の環境中のノミ負荷をも低減することが好ましい。 本発明に従って、宿主動物は、化合物自身（例えばプロテアーゼ阻害剤、プロ テアーゼ合成抑制剤又は抗ノミプロテアーゼ抗体）あるいは化合物の投与に応答 して動物により生成される化合物（例えば、ノミプロテアーゼワクチンに応答し て生成される抗体、あるいは不活性阻害剤である「プロドラッグ」の活性プロテ アーゼ阻害剤への変換）が最終的にはノミの中腸へ侵入するような方法にて、本 発明の化合物が投与される。化合物あるいは同化合物を含む製品が、動物の血中 へと進入するように処置されることが好ましい。その後、動物から飼料を摂取す ることにより、ノミは化合物にさらされる。例えば、動物に投与されたノミプロ テアーゼ阻害剤は、阻害剤が動物の血流に進入し、その血液をノミが摂取するこ とにより同ノミの体内へ取り込まれるように投与される。別の実施態様では、宿 主動物がノミプロテアーゼワクチンを投与され、投与された動物が、同動物の血 管中を循環し、血液の摂取によりノミに取り込まれるようなプロテアーゼに対す る抗体（抗ノミプロテアーゼ抗体）を産生することにより免疫反応が形成される 。ノミにより摂取された動物の血液はノミの中腸に進入し、同中腸中にて、抗ノ ミプロテアーゼ抗体、ノミプロテアーゼ阻害剤及び／又はプロテアーゼ合成抑制 剤のような本発明の化合物あるいは同化合物の製品が作用し、ノミ中腸における タンパク分解活性を低減する。本発明はまた、本発明の治療組成物、本化合物の 化合物の少なくとも一部あるいは、同化合物の製品を投与された宿主動物からノ ミが血液を摂取した場合、このノミが排泄した糞をノミの幼虫が摂取することに より、幼虫ノミの寄生をも低減され得る。ここで、ノミの幼虫はその栄養の大部 分（全てではないが）をノミの糞から摂取することを明記しておきたい。 本発明に従って、ノミ中腸中のタンパク分解活性を低減することにより、化合 物を投与された動物及び同動物の環境中におけるノミ負荷を減少するような種々 の効果が得られる。そのような効果としては、（ａ）投与された動物から飼料を 摂取しているノミの生存率の低下、（ｂ）投与された動物から飼料を摂取してい る雌ノミの繁殖能力の低下、（ｃ）投与された動物から飼料を摂取している雄ノ ミの繁殖能力の低下、（ｄ）投与された動物から飼料を摂取している雌ノミの産 んだ卵の生存率の低下、（ｅ）投与された動物から飼料を摂取しているノミの血 液摂取習慣の変化、（ｆ）例えばノミ幼虫が、投与された動物から飼料を摂取し ているノミの糞を摂取することにより、同ノミ幼虫の生存率の低下、及び／又は （ｇ）ノミ幼虫の成長の変化（例えば栄養摂取量の減少、成長阻害、脱皮阻害（ 例えば遅延あるいは阻止）及び／又は成虫への成熟阻害）が挙げられるが、これ らに限定されるものではない。 本発明の一実施態様は、一つあるいはそれ以上のノミプロテアーゼ活性を直接 的（例えば、抗ノミプロテアーゼ抗体あるいはノミプロテアーゼ阻害剤）及び／ 又は間接的（例えばノミプロテアーゼワクチン）に低減する一つあるいはそれ以 上の化合物を含む組成物である。標的指向化される適切なノミプロテアーゼとし ては、ノミアミノペプチダーゼ、ノミカルボキシペプチダーゼ、及び／又はノミ エンドペプチダーゼが含まれる。標的に適する好ましいノミプロテアーゼとして は、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及 び／又はシステインプロテアーゼが含まれるが、これらに限定されるものではな い。これらの好ましいプロテアーゼの群には、アミノペプチダーゼ、カルボキシ ペプチダーゼ及び／又はエンドペプチダーゼも含まれることを明記されたい。標 的とされる好ましいノミプロテアーゼとしては、ヘモグロビンを分解するプロテ アーゼ、血液凝固及び／又は分解（抗凝血）経路に関するプロテアーゼ、ペプチ ドホルモンの成熟に関するプロテアーゼ、補体又はその他の宿主免疫応答因子（ 例えば抗体）を阻害するプロテアーゼ及び／又は卵黄形成に関するプロテアーゼ が含まれるが、これらに限定されるものではない。当業者にとっては公知である 種々のプロテアーゼとしては、ロイシンアミノペプチダーゼ及びアミノペプチダ ーゼＢ及びＭのようなアミノペプチダーゼ類、アスタシン様メタロプロテアーゼ 類、カルパイン類、カルボキシペプチダーゼＡ、Ｐ及びＹ等のカルボキシペプチ ダーゼ類、カテプシンＢ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ及びＬ等のカテプシン類、キモトリプ シン類、クルジパイン類（cruzipains）、メプリン類（meprins）、パパイン類 、ペプシン類、レニン類、サーモリシン類及びトリプシン類が含まれるが、これ らに限定されるものではない。標的とされる特に好ましいプロテアーゼは、タン パク分解活性を有するプロテアーゼであり、本発明の組成物で標的指向化される こ とにより、宿主動物にほとんど害を与えることなくノミ負荷を低減する。そのよ うなプロテアーゼは、例えば以下に開示されているような方法を用いて同定され 得る。 本発明の一つの態様として、ノミ中腸中に見いだされるタンパク分解活性の実 質的な量は、セリンプロテアーゼ活性であることが明らかにされた。種々のプロ テアーゼ阻害剤を用いたインビトロ及びインビボの研究にてこのことが実証され 、その詳細が実施態様に開示されている。すなわち、標的とされる特に好ましい プロテアーゼはセリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼの例としては、 アクロシン、ブロメライン、カテプシンＧ、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エ ラスターゼ、Ｘａ因子、フィシン、カリクレイン、パパイン、プラスミン、ブド ウ球菌Ｖ８プロテアーゼ、トロンビン及びトリプシンが含まれるが、これらに限 定されるものではない。ある実施態様において、標的とされる好ましいノミセリ ンプロテアーゼとしては、トリプシン様、又はキモトリプシン様活性を有するプ ロテアーゼが含まれる。「類似の」タンパク分解活性を有する酵素は、分解され るべき好ましい基質の正確な構造は異なっても参照されたプロテアーゼと類似の 活性を有することは当業者によって理解されよう。「類似の」プロテアーゼは、 参照される基質と同様の４級構造を有する。 実施態様にて記載されたプロテアーゼ阻害剤の研究において、標的とされる更 に好ましいプロテアーゼとしてはアミノペプチダーゼ及び／又はメタロプロテア ーゼが含まれることを指摘している。そのようなプロテアーゼの例としては、エ キソ−及びエンド−メタロプロテアーゼ、消化酵素及びペプチドホルモン成熟に 関する酵素が含まれる。メタロペプチダーゼでもあるアミノペプチダーゼの一例 として、ロイシンアミノペプチダーゼがある。 本発明の組成物中に含まれる適切な化合物は、ノミプロテアーゼからなるワク チン（ノミプロテアーゼワクチン）、ノミプロテアーゼと選択的に結合する抗体 （抗ノミプロテアーゼ抗体）、ノミプロテアーゼ阻害剤（ノミプロテアーゼを阻 害するワクチンあるいは抗体以外の化合物）及びそれらの化合物の混合物が挙げ られるが、これらに限定されるものではない。本明細書における混合物とは、引 用された物質の一種類あるいはそれ以上からなる配合物を示す。本発明の組成物 は、プロテアーゼモジュレーティングペプチドのようなプロテアーゼ合成あるい は成熟を抑制するような化合物も含まれるが、これらに限定されるものではない 。 本発明の好ましい実施態様は、動物及び同動物の環境中のノミ個体数を低減す るノミプロテアーゼワクチン及びその使用法である。ノミプロテアーゼワクチン は、ノミプロテアーゼに対する免疫応答を誘発できる一つあるいはそれ以上のタ ンパクを含み、かつその他の化合物をも含み得る。好ましいノミプロテアーゼワ クチンは、ノミセリンプロテアーゼ、ノミメタロプロテアーゼ、ノミアスパラギ ン酸プロテアーゼ及び／又はノミシステインプロテアーゼを含み、ノミセリンプ ロテアーゼ、ノミメタロプロテアーゼ及び／又はノミアミノペプチダーゼワクチ ンがより好ましい。ノミプロテアーゼワクチンの例としては、本発明の可溶性ノ ミ中腸試料並びに本発明の一つあるいはそれ以上の単離されたタンパクが含まれ る。 本発明の一実施態様は、可溶性ノミ中腸試料である。そのような試料は、ノミ 中腸管内に当初から存在する成分、及び調製の方法によっては、一つあるいはそ れ以上の中腸壁膜タンパクをも含み得る。そのような試料に膜タンパクを含む、 あるいは除去する好ましい方法は、当業者にとっては公知である。本発明は、そ のような試料がタンパク分解活性、実質的にはセリンプロテアーゼ活性を有する ことを明らかにした。タンパク分解活性の少なくとも約７０％を４−２−アミノ エチルベンゼンスルフォニルフルオライド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）が阻害すること から示されるように、可溶性ノミ中腸試料のタンパク分解活性の少なくとも約７ ０％がセリンプロテアーゼ活性であることが好ましい。セリンプロテアーゼ活性 は、その他公知の阻害剤あるいは基質を用いても同定され得る。本発明の可溶性 ノミ中腸試料のタンパク分解活性の少なくとも約７０％を阻害するその他の好ま しい阻害剤としては、ダイズトリプシン阻害剤、１，３−ジイソプロピルフルオ ロリン酸あるいはロイペプチンが含まれる。 本発明の可溶性ノミ中腸試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって決定されるように、約５キロダルト ン（ｋＤ）〜約２００キロダルトンの分子量であるプロテアーゼを含み、セリン プロテアーゼの少なくとも実質的な部分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて決定されるよ うに、約５ｋＤ〜約６０ｋＤの分子量の範囲であり得る。本発明の可溶性ノミ中 腸試料中におけるプロテアーゼ活性を示す部分は、約５〜約１０の至適ｐＨ活性 を有し、好ましくは約７〜約９の範囲の至適ｐＨ活性を有し、より好ましくは至 適ｐＨ約８である。理論によって導き出されてはいないが、そのようなｐＨ最適 値から、本発明の可溶性ノミ中腸試料中のプロテアーゼの大部分がセリンプロテ アーゼであることが示唆される。興味深いことに、ノミ中腸のｐＨもまた約ｐＨ ８であることを明記しておきたい。本発明の可溶性ノミ中腸試料中のプロテアー ゼが所定の型のプロテアーゼ阻害剤（例えばセリンプロテアーゼ阻害剤）によっ て阻害される種々のパターン並びにプロテアーゼの分子量及びｐＨ最適値にてみ られるような変化を示すという結果から、この試料中には種々のプロテアーゼイ ソホーム（isoform）が存在していることが示唆される。 本発明の可溶性ノミ中腸試料は、（ａ）液体部分及び固体部分を含む混合物を 生成するためにノミ中腸を破砕する工程と、（ｂ）可溶性ノミ中腸試料を得るた めに液体部分を回収する工程とを含む方法により調製されることが好ましい。そ のような方法の簡略化された方法が、米国特許第５，３５６，６２２号に開示さ れている。本発明に従う米国特許第５，３５６，６２２号に開示された方法はま た、類似のタンパク分解活性を有する可溶性ノミ中腸試料を調製するために使用 され得ることを明記したい。 ノミ中腸は、飼料を摂取していないノミ、又は血液飼料を摂取した直後のノミ （すなわち、血液摂取したノミ）から得られる（例えば、切断された状態）。こ のような中腸を、本明細書中では、飼料未摂取ノミ中腸及び飼料摂取ノミ中腸と それぞれ定義する。ノミ中腸は、雄あるいは雌ノミから得られる。実施例におい て示すように、雌ノミ中腸は雄ノミ中腸より幾分高いタンパク分解活性を示す。 更に飼料摂取ノミ中腸は、飼料未摂取ノミ中腸よりかなり高いタンパク分解活性 を示す。理論にて導き出されてはいないが、血液摂取は、ノミ中腸において、プ ロテアーゼ合成及び／又はプロテアーゼ活性、並びに血液飼料の消化及びノミに 損傷を与える可能性を有する宿主分子の中和（例えば補体、免疫グロブリン、血 液凝固因子）に関する重要なその他の因子（例えば酵素、他のタンパク、補助因 子等））を誘導すると考えられる。飼料未摂取ノミ中腸は、飼料摂取ノミ中腸中 には見られない重要な標的物を含む可能性及びその逆の可能性をもあり得ること を明記されたい。更に、本発明ではノミ中腸プロテアーゼを主として注目したが 、本発明はまた、動物及び同動物の環境中におけるノミ負荷を低減する目的に適 する標的を提供するために、本発明の可溶性ノミ中腸試料のその他の成分をも含 むことを明記したい。同様に、米国特許第５，３５６，６２２号を参照されたい 。 可溶性ノミ中腸試料を得るためにノミ中腸を破砕する方法は当業者においては 公知であり、例えば内容物が処理され、緩衝液が使用されることに応じて選択さ れ得る。そのような方法には、化学的破砕法（例えば、中腸を洗浄剤に浸す）並 びに機械的破砕法（例えば、ホモジネーション、超音波破砕、組織ブレンダある いはカラスビーズの使用及び凍結／解凍法）のような細胞崩壊を促進する方法が 含まれるが、これらに限定されるものではない。 可溶性ノミ中腸試料を回収する方法もまた、当業者においては公知であるが、 破砕されたノミ中腸の液体部分を固体部分から分離するいかなる方法（例えば、 ろ過あるいは遠心分離）をも含み得る。好ましい実施態様において、破砕された ノミ中腸は遠心分離による処理がなされ、約１０，０００×ｇ〜約１５，０００ ×ｇの範囲の回転速度にて数分間（例えば約１分間〜約１５分間）処理されるこ とが好ましい。この遠心分離にて得られた上澄み液は、本発明の可溶性ノミ中腸 試料を含む。 本発明はまた、血液摂取した雌ノミから得られた中腸、血液摂取した雄ノミか ら得られた中腸、飼料未摂取雌ノミから得られた中腸あるいは飼料未摂取雄ノミ から得られた中腸のようなノミ中腸中に存在する（すなわちノミ中腸から発見さ れ得る）プロテアーゼをコードする核酸分子と厳格な条件下においてハイブリッ ド形成することが可能な（すなわち、厳格なハイブリッド形成条件下にてハイブ リッド形成する）核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む単離された タンパクをも含む。好ましい中腸プロテアーゼは、中腸管中に存在する。 本明細書中では単離されたプロテアーゼタンパクとしても定義される、本発明 の単離されたタンパクは、ノミ中腸プロテアーゼ及び／又はタンパク分解活性に 対する免疫応答を誘発できることが好ましい。本発明によれば、単離されたタン パク、あるいは生物学的に純粋なタンパクは、その天然の環境から取り出された タンパクである。すなわち、「単離された」及び「生物学的に純粋な」とは、同 タンパクが精製される程度を必ずしも反映しない。単離されたプロテアーゼタン パクは、その天然資源から得られる。そのような単離されたタンパクは、組換え ＤＮＡ技術あるいは化学的合成を用いても製造できる。 本明細書で用いられるように、単離されたタンパクは、完全な長さのタンパク あるいは、同タンパクの相同体であり得、同相同体は天然のノミ中腸プロテアー ゼに十分類似したアミノ酸配列を有するタンパクを含むように、例えばアミノ酸 が削除（例えばペプチドのような、タンパクの端の切りとられた形）、挿入、逆 位（inverted）、置換及び／又は誘導体化（例えば、グリコシル化、リン酸化、 アセチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化及び／又は グリセロフォスファチジルイノシトールの付加による）されており、それにより 相同体をコードする核酸配列は、厳格な状態において対応する天然ノミ中腸プロ テアーゼアミノ酸配列をコードする核酸配列とハイブリッド形成することが可能 となる。本明細書で用いられる限りにおいて、厳格なハイブリッド形成条件とは 、オリゴヌクレオチドも含め、核酸分子が類似の核酸分子を同定するために使用 されるような標準的なハイブリッド形成条件を指す。そのような標準的な条件は 、例えばサムブルック（Sambrook）他による「分子クローニング：実験マニュア ル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual」（コールド スプリング ハー バー ラブズ プレス（ColdSpring Harbor Labs Press）、１９８９年）に開示 さ れている。 本発明のタンパク相同体の最小サイズは、対応する天然タンパクをコードする 核酸分子の相補配列と安定したハイブリッドを形成することができる核酸分子に よってコードされるに十分な大きさである。それ故に、そのようなタンパク同相 体をコードする核酸分子の大きさは、核酸組成、核酸分子及び相補配列間の相同 割合並びに本質的なハイブリッド形成状態（例えば、温度、塩濃度及びホルムア ミド濃度）に依存する。そのような核酸分子の最小サイズは、核酸分子がＧＣ（ グアニン，シトシン）に富む場合、全長中に少なくとも約１２〜１５のヌクレオ チドを有し、ＡＴ（アデニン，チミン）に富む場合、全長中に少なくとも約１５ 〜１７の塩基を有する。すなわち、本発明のプロテアーゼタンパク同相体をコー ドするために使用される核酸分子の最小サイズは、全長中に約１２〜１８のヌク レオチドを有するものである。実施における制限以外に限定されるものではない が、そのような核酸分子の最大サイズは、同核酸分子が遺伝子の一部、遺伝子全 体あるいは複数の遺伝子又は複数の遺伝子の一部を含み得る大きさである。同様 に、本発明のプロテアーゼタンパク同相体の最小サイズは全長中に約４〜６のア ミノ酸を有し、好ましいサイズは、全長を有するタンパク、多価タンパク（すな わち各ドメインが機能を備えたドメインを一つ以上含む融合タンパク）あるいは そのようなタンパクの機能的な部分を所望するかどうかに依存する。本発明のプ ロテアーゼタンパク同相体は、プロテアーゼ活性を有し、及び／又はノミ中腸プ ロテアーゼに対する免疫応答を誘発できることが好ましい。 本発明のプロテアーゼタンパク同相体は、ノミプロテアーゼをコードする天然 の対立遺伝子による変異型の結果であり得る。天然の遺伝子とは、天然にて最も 頻繁に発見され得る遺伝子の形状である。プロテアーゼタンパク同相体は、例え ば、無作為の、もしくは標的を定めた突然変異を実施するために、典型的なある いは組換えＤＮＡ手法を用いて、タンパクをコードする遺伝子を直接修飾するこ とを含む当業者にとって公知の方法を用いて合成されるが、これに限定されるも のではない。同相体を含む本発明の単離されたプロテアーゼタンパクは、同タン パクのタンパク分解活性及び／又はノミ中腸プロテアーゼに対する免疫応答を誘 発できる能力によって、簡明な方法で同定される。そのような技術は、当業者に おいて公知である。 本発明の好ましいプロテアーゼタンパクは、ノミセリンプロテアーゼ、ノミメ タロプロテアーゼ、ノミアスパラギン酸プロテアーゼ、ノミシステインプロテア ーゼあるいはこれらのプロテアーゼのいずれかの同相体である。より好ましいプ ロテアーゼタンパクは、ノミセリンプロテアーゼ、ノミメタロプロテアーゼある いはそれらのうちのいずれかの同相体である。ノミアミノペプチダーゼあるいは その同相体も好ましい。特に好ましいのは、ノミセリンプロテアーゼあるいはそ の同相体である。 本発明の好ましいプロテアーゼタンパクは、約５ｋＤ〜約２００ｋＤの分子量 を有するノミプロテアーゼタンパク及びその同相体であり、この分子量はＳＤＳ −ＰＡＧＥにて決定される。より好ましいプロテアーゼタンパクは、約５ｋＤ〜 約６０ｋＤの分子量を有するノミプロテアーゼタンパク及びその同相体であり、 この分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにて決定される。更に好ましいのは、ノミセリン プロテアーゼタンパク、特に約２６ｋＤ（ＰｆＳＰ２６にて表示される）、約２ ４ｋＤ（ＰｆＳＰ２４にて表示される）、約１９ｋＤ（ＰｆＳＰ１９にて表示さ れる）、約６ｋＤ（ＰｆＳＰ６にて表示される）の分子量を有するもの及びその ようなタンパクの同相体であり、その分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて決定され る。 本発明の好ましい一実施態様は、厳格なハイブリッド形成状態にてノミセリン プロテアーゼ遺伝子あるいはノミアミノペプチダーゼ遺伝子とハイブリッド形成 する核酸分子によってコードされたアミノ酸配列を含む単離されたノミプロテア アーゼタンパクである。本明細書中にて使用されるノミプロテアーゼ遺伝子は、 天然のノミプロテアーゼ遺伝子によってコードされるノミプロテアーゼタンパク の生成を制御する調節領域（転写、翻訳あるいは翻訳後調節領域のような領域で あるが、これらに限定されるものではない）並びに自身の解読領域のような同ノ ミプロテアーゼ遺伝子に関連する全ての核酸配列を含む。 発明者らは、セリンプロテアーゼ遺伝子の系によってコードされたセリンプロ テアーゼの広範囲の系を見いだした。そのような遺伝子系は、対立遺伝子による 変異型（すなわち、ノミ個体中の所定の遺伝子座にある類似ではあるが異なる配 列を有する遺伝子）及び／又は、ノミゲノム中にある一つ以上の遺伝子座におけ るセリンプロテアーゼ遺伝子の存在によるものであり得る。すなわち、本発明は 、本明細書中に開示された核酸配列（例えば、配列識別番号：１６、配列識別番 号：１８、配列識別番号：２０、配列識別番号：２２、配列識別番号：２４、配 列識別番号：２６、配列識別番号：２８、配列識別番号：３０、配列識別番号： ３２、配列識別番号：３４、配列識別番号：３６、配列識別番号：３８及び／又 は表２に開示された核酸配列（すなわち、配列識別番号：５２、配列識別番号： ５４、配列識別番号：５６、配列識別番号：５８、配列識別番号：６０、配列識 別番号：６２、配列識別番号：６４、配列識別番号：６６、配列識別番号：６８ 、配列識別番号：７０、配列識別番号：７２、配列識別番号：７４、配列識別番 号：７６、配列識別番号：７８）、配列識別番号：８０、配列識別番号：８２、 配列識別番号：８４、配列識別番号：８６、配列識別番号：８８、配列識別番号 ：９０、配列識別番号：９２、配列識別番号：９４、配列識別番号：９６、配列 識別番号：９８、配列識別番号：１００、配列識別番号：１０２、配列識別番号 ：１０４、配列識別番号：１０６、配列識別番号：１０８、配列識別番号：１１ ０の核酸配列を含む遺伝子及び／あるいは本明細書中に開示されるようなアミノ 酸配列を有するタンパクをコードする核酸配列（例えば、配列識別番号：１、配 列識別番号：２、配列識別番号：３、配列識別番号：４、配列識別番号：５、配 列識別番号：６、配列識別番号：７、配列識別番号：８、配列識別番号：９、配 列識別番号：１７、配列識別番号：１９、配列識別番号：２１、配列識別番号： ２３、配列識別番号：２５、配列識別番号：２７、配列識別番号：２９、配列識 別番号：３１、配列識別番号：３３、配列識別番号：３５、配列識別番号：３７ 、配列識別番号：３９、配列識別番号：４０、配列識別番号：４１、配列識別番 号 ：４２、配列識別番号：４３、配列識別番号：４４、配列識別番号：４５、配列 識別番号：４６、配列識別番号：４７、表２に開示されたアミノ酸配列（すなわ ち、配列識別番号：５３、配列識別番号：５５、配列識別番号：５７、配列識別 番号：５９、配列識別番号：６１、配列識別番号：６３、配列識別番号：６５、 配列識別番号：６７、配列識別番号：６９、配列識別番号：７１、配列識別番号 ：７３、配列識別番号：７５、配列識別番号：７７、配列識別番号：７９）、配 列識別番号：８１、配列識別番号：８３、配列識別番号：８５、配列識別番号： ８７、配列識別番号：８９、配列識別番号：９１、配列識別番号：９３、配列識 別番号：９５、配列識別番号：９７、配列識別番号：９９、配列識別番号：１０ １、配列識別番号：１０３、配列識別番号：１０５、配列識別番号：１０７、配 列識別番号：１０９及び／又は配列識別番号：１１１）のみならず、これらの核 酸配列のいずれかの対立遺伝子の変異型をも含むノミ中腸プロテアーゼ遺伝子を 含む。（核酸配列手法は完全に誤りがないとは言えないので、本明細書中に記載 された全ての配列は最も明らかな（すなわち、演繹された）核酸あるいはアミノ 酸配列であることを明記しておきたい。） 好ましいノミアミノペプチダーゼ遺伝子は配列識別番号：５０の核酸配列を含 み、同配列は、配列識別番号：５１を含むアミノペプチダーゼタンパクをコード する。別の好ましいノミアミノペプチダーゼ遺伝子は配列識別番号：１１２の核 酸配列を含み、同配列は配列識別番号：１１３を含むアミノペプチダーゼタンパ クをコードする。付随的な好ましいアミノペプチダーゼ遺伝子は、配列識別番号 ：５０及び配列識別番号：１１２の対立遺伝子変異型を含む。 本発明の好ましいノミセリンプロテアーゼタンパクは、厳格なハイブリッド形 成条件において、以下に示される核酸分子：ｎｆＳＰ１、ｎｆＳＰ２、ｎｆＳＰ ３、ｎｆＳＰ４、ｎｆＳＰ５、ｎｆＳＰ６、ｎｆＳＰ７、ｎｆＳＰ８、ｎｆＳＰ ９、ｎｆＳＰ１０、ｎｆＳＰ１１、ｎｆＳＰ１２、ｎｆＳＰ１３、ｎｆＳＰ１４ 、ｎｆＳＰ１５、ｎｆＳＰ１６、ｎｆＳＰ１７、ｎｆＳＰ１８、ｎｆＳＰ１９、 及びｎｆＳＰ２０の少なくとも一つとハイブリッド形成する核酸分子によってコ ー ドされる。本明細書にて使用される、これらの核酸分子の各々とは、本発明のノ ミセリンプロテアーゼ遺伝子の完全な解読領域を表す（例に示されるように、少 なくともノミクローン番号によっても参照される部分）。部分的に解読領域を含 む核酸分子あるいは遺伝子に対応するその他の部分は、これらの核酸分子の大き さを含む名称にて記載されている（例えば、ｎｆＳＰ４₁₅₆）。サイズが公知で あり、明らかに完全な長さの解読領域を含む核酸分子は、核酸分子の大きさを含 む名称にて記載されている（例えば、ｎｆＳＰ４₆₇₂）。そのような核酸分子の 製品及び少なくとも部分的な核酸配列は、実施例に開示されている。 特に好ましいセリンプロテアーゼタンパクは、厳格なハイブリッド形成条件に おいて、以下に示される核酸分子：ｎｆＳＰ４₆₇₂、ｎｆＳＰ１₁₅₆、ｎｆＳＰ２₁₆₈ 、ｎｆＳＰ３₁₇₇、ｎｆＳＰ４₁₅₆、ｎｆＳＰ５₁₅₉、ｎｆＳＰ６₁₆₈、ｎｆＳ Ｐ７₁₅₉、ｎｆＳＰ８₁₈₆、ｎｆＳＰ９₁₆₈、ｎｆＳＰ１０₁₂₀、ｎｆＳＰ１１₁₆₂ 並びに、これらに限定されるものではないが、例えば、ｎｆＳＰ１₇₇₉、ｎｆＳ Ｐ２₉₄₄、ｎｆＳＰ３₁₇₇、ｎｆＳＰ４₆₇₂、ｎｆＳＰ５₁₅₇、ｎｆＳＰ５₂₁₈、ｎ ｆＳＰ６₉₃₂、ｎｆＳＰ７₈₉₄、ｎｆＳＰ８₂₉₉、ｎｆＳＰ９₂₆₆、ｎｆＳＰ１０_{37 8} 、ｎｆＳＰ１１₂₅₂、ｎｆＳＰ１２₁₄₄、ｎｆＳＰ１２₂₂₅、ｎｆＳＰ１３₈₅₀、 ｎｆＳＰ１４₂₁₃、ｎｆＳＰ１５₂₅₂、ｎｆＳＰ１６₁₆₈、ｎｆＳＰ１８₅₃₄、ｎｆ ＳＰ１９₃₅₉及び／又はｎｆＳＰ２０₈₄₁のような実施態様に開示されているその 他特定の核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子によってコードされる。更に より好ましいセリンプロテアーゼタンパクは、以下に示すアミノ酸配列：配列識 別番号：１、配列識別番号：２、配列識別番号：３、配列識別番号：４、配列識 別番号：５、配列識別番号：６、配列識別番号：７、配列識別番号：８、配列識 別番号：９、配列識別番号：１７、配列識別番号：１９、配列識別番号：２１、 配列識別番号：２３、配列識別番号：２５、配列識別番号：２７、配列識別番号 ：２９、配列識別番号：３１、配列識別番号：３３、配列識別番号：３５、配列 識別番号：３７、配列識別番号：３９、配列識別番号：４０、配列識別番号：４ １、配列識別番号：４２、配列識別番号：４３、配列識別番号：４４、配列識別 番号：４ ５、配列識別番号：４６、配列識別番号：４７及び／又は表２に示すアミノ酸配 列（すなわち、配列識別番号：５３、配列識別番号：５５、配列識別番号：５７ 、配列識別番号：５９、配列識別番号：６１、配列識別番号：６３、配列識別番 号：６５、配列識別番号：６７、配列識別番号：６９、配列識別番号：７１、配 列識別番号：７３、配列識別番号：７５、配列識別番号：７７及び／又は配列識 別番号：７９）並びに配列識別番号：８１、配列識別番号：８３、配列識別番号 ：８５、配列識別番号：８７、配列識別番号：８９、配列識別番号：９１、配列 識別番号：９３、配列識別番号：９５、配列識別番号：９７、配列識別番号：９ ９、配列識別番号：１０１、配列識別番号：１０３、配列識別番号：１０５、配 列識別番号：１０７、配列識別番号：１０９及び／又は配列識別番号：１１１を 含む。付随的に特に好ましいセリンプロテアーゼタンパクは、例示されたアミノ 酸配列を含むタンパクをコードする核酸分子の対立遺伝子変異型によってコード される。また、好ましいノミセリンプロテアーゼタンパクは、少なくとも約５０ ％、好ましくは少なくとも約７５％、更に好ましくは少なくとも約９０％が本明 細書にて例示されたアミノ酸配列を有するノミセリンプロテアーゼタンパクと同 一である領域を含む。 本発明の好ましいノミアミノペプチダーゼタンパクは、厳格なハイブリッド形 成条件下において、実施態様に記載されている生成物である核酸分子ｎｆＡＰ_{45 3} 及び／又はｎｆＡＰ₁₅₈₀とハイブリッドを形成する核酸分子によってコードさ れる。更により好ましいアミノペプチダーゼは、配列識別番号：５１及び／又は 配列識別番号：１１３のアミノ酸配列、あるいは配列識別番号：５０及び／又は 配列識別番号：１１２を有する核酸分子の対立遺伝子の変異型によってコードさ れたアミノペプチダーゼを含む。また、好ましいノミアミノペプチダーゼタンパ クは、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、更に好ましくは少 なくとも約９０％が配列識別番号：５１及び／又は配列識別番号：１１３と同一 である領域を含む。 本発明の一実施態様は、セリンプロテアーゼ阻害剤によってほぼ阻害されるタ ンパク分解活性を有する単離されたタンパクである。この阻害は、当業者におい ては公知の方法にて測定される。ほぼ阻害されるとは、プロテアーゼタンパクの タンパク分解活性の少なくとも半分がセリンプロテアーゼ阻害剤によって阻害さ れることを意味する。プロテアーゼタンパクのタンパク分解活性の好ましくは少 なくとも７０％、更に好ましくは少なくとも９０％がセリンプロテアーゼ阻害剤 によって阻害されるとよい。 本発明の単離されたタンパクは、ノミ中腸から同タンパクを回収する方法及び 同タンパクを組換えにより合成する方法を含む、種々の方法にて合成され得る。 一実施態様では、ノミ中腸プロテアーゼは、前述の可溶性ノミ中腸試料を得る方 法によって回収され得る。ノミ中腸プロテアーゼタンパクは更に、当業者におい ては公知の種々の手法によって破砕されたノミ中腸から精製され得、同手法とし ては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ 過、電気泳動（例えば、標準型、キャピラリー型及びフロースル型電気泳動）、 疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフ ィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング及び示差 可溶化を含むが、これらに限定されるものではない。一実施態様において、ノミ 中腸プロテアーゼは本明細書中の実施態様にて開示されている一例のように、プ ロテアーゼ阻害剤アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。 本発明の別の実施態様は、組換えＤＮＡ技術を用いて本発明の単離されたタン パクを合成する方法である。この方法は、（ａ）タンパクを合成するために本発 明のタンパクをコードする核酸分子を含む組換え細胞を培養する工程及び（ｂ） 同培養液からタンパクを回収する工程とを備える。組換え細胞及びその培養に関 する詳細は以下に記載する。「タンパクを回収する」とは、タンパクを含む発酵 溶媒全体を単に回収することであり、分離あるいは精製という付随的な工程を意 味する必要はない。本発明のタンパクは、既に開示されたような種々の標準的な タンパク精製技術を用いて精製され得る。 本発明の単離されたタンパクは、「ほぼ純粋な」形状にて回収されることが好 ましい。本明細書にて使用される「ほぼ純粋な」とは、ワクチンとしてタンパク を効果的に使用可能な純度を指す。例えば動物用ワクチンは、ほぼ無毒で、かつ 接種された動物内において抗体の産生を誘発できるべきである。 本発明の別実施態様は、厳格な条件下において、ノミ中腸中に存在するノミプ ロテアーゼをコードする遺伝子とハイブリッドを形成可能な単離された核酸分子 である。そのような核酸分子は、本明細書中ではノミプロテアーゼ核酸分子とし ても示される。厳格な条件下において、ノミセリンプロテアーゼ遺伝子あるいは ノミアミノペプチダーゼ遺伝子とハイブリッドを形成する単離された核酸分子が 特に好ましい。そのような遺伝子の特徴は本明細書中に開示されている。本発明 によれば、単離された核酸分子とは、天然の環境から取り出された核酸分子であ る（すなわち、人為操作された核酸分子）。すなわち、「単離された」とは、同 核酸分子が精製されている程度を必ずしも反映しない。単離された核酸分子とし ては、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいは、ＤＮＡ又はＲＮＡの誘導体をも含み得る。 上述のように、ノミプロテアーゼ遺伝子は、遺伝子によってコードされたノミ プロテアーゼタンパクの生成を制御する調節領域（転写、翻訳あるいは翻訳後調 節領域のような領域であるが、これらに限定されるものではない）並びに自身の 解読領域のような天然のノミプロテアーゼ遺伝子に関連した全ての核酸配列を含 む。本発明の核酸分子は、単離された天然のノミプロテアーゼ核酸分子あるいは その同相体であり得る。本発明の核酸分子は、一つあるいはそれ以上の調節領域 、完全な長さの、又は部分的な解読領域あるいはそれらの組み合わせたものを含 み得る。本発明のノミプロテアーゼ核酸分子の最小サイズは、厳格なハイブリッ ド形成条件下において、対応する天然の遺伝子と安定したハイブリッドを形成可 能な最小サイズである。ノミプロテアーゼ核酸分子は、ハイブリッドタンパク、 融合タンパク、多価タンパクあるいは断端された断片をコードする核酸分子を含 む。 本発明の単離された核酸分子は、全体の（すなわち、完全な）遺伝子又はその 遺伝子と安定したハイブリッドを形成可能である部分のうちのいずれかとして天 然の資源から得られる。本明細書で使用される、ある物の「少なくとも一部」と は、その物の機能的な態様を少なくとも十分に備えているその物の量を指す。例 えば、本明細書にて使用される核酸配列の少なくとも一部とは、厳格なハイブリ ッド形成条件下において対応する遺伝子と安定なハイブリッドを形成可能な核酸 配列の量である。 本発明の単離された核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローン化）あるいは化学的合成を用いても製造され得 る。単離されたノミプロテアーゼ核酸分子は、天然の核酸分子、並びに、限定さ れるものではないが、天然の対立遺伝子変異型及び修飾された核酸分子を包含す る同相体を含み得る。この修飾は、本発明のノミプロテアーゼタンパクをコード する核酸分子の能力、又は厳格な条件下にて天然の核酸分子単離物と安定なハイ ブリッドを形成する核酸分子の能力をほぼ干渉しないようにして、ヌクレオチド を挿入、削除、置換及び／又は逆位するものである。 ノミプロテアーゼ核酸分子同相体は、当業者に公知の多数の方法（例えば、サ ムブルック他による前述の文献を参照されたい）を用いて合成され得る。例えば 、部位指向性突然変異誘発のような標準的な突然変異誘発技術及び組換えＤＮＡ 技術、核酸分子の突然変異を誘発する化学処理、制限酵素による核酸断片の切断 、核酸配列の選ばれた領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は突 然変異誘発、核酸分子の混合物を「形成する」ためのオリゴヌクレオチド混合物 の合成や混合物群の連結、並びにそれらの組み合わせを含む種々の技術を用いて 核酸分子を修飾できるが、これらに限定されるものではない。核酸分子同相体は 、修飾された核酸分子の混合物から、同核酸がコードしているタンパクの機能（ 例えば、ノミプロテアーゼに対する免疫応答反応を誘発できる能力、及び／又は タンパク分解活性）についてのスクリーニング、及び／又は厳格な条件下での単 離されたノミプロテアーゼ核酸とのハイブリッド形成によって選択され得る。 本発明の単離されたノミプロテアーゼ核酸分子は、本発明の少なくとも一つの ノミプロテアーゼタンパクをコードする核酸配列を含み得るが、そのようなタン パクの例を本明細書中に開示する。「核酸分子」は、主として物理的な核酸分子 を意味し、かつ「核酸配列」は、主として核酸分子上のヌクレオチドの配列を意 味するものの、二つの語句は、特にノミプロテアーゼタンパクをコードできる核 酸分子又は核酸配列に関しては、互換可能な形で用いることができる。 本発明の一実施態様は、厳格な条件化において、ノミプロテアーゼあるいはそ の同相体の少なくとも一部をコードする核酸とハイブリッド形成可能なノミプロ テアーゼ核酸分子である。ノミプロテアーゼ核酸分子は、ノミプロテアーゼタン パクの少なくとも一部をコードする核酸配列の対応する領域を備えた同相性を少 なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、更に好ましくは少なくとも８５ ％、それ以上に好ましくは少なくとも９５％有するような核酸配列を含むことが 好ましい。ノミ中腸に生来的に存在するノミプロテアーゼの少なくとも一部をコ ード可能であるノミプロテアーゼ核酸分子が特に好ましく、本発明の可溶性ノミ 中腸試料を含むことが好ましい。本発明の核酸分子の例は、実施態様中に開示さ れている。 本発明の好ましいノミセリンプロテアーゼ核酸分子は、厳格なハイブリッド形 成条件下において、以下に示す核酸分子：ｎｆＳＰ１、ｎｆＳＰ２、ｎｆＳＰ３ 、ｎｆＳＰ４、ｎｆＳＰ５、ｎｆＳＰ６、ｎｆＳＰ７、ｎｆＳＰ８、ｎｆＳＰ９ 、ｎｆＳＰ１０、ｎｆＳＰ１１、ｎｆＳＰ１２、ｎｆＳＰ１３、ｎｆＳＰ１４、 ｎｆＳＰ１５、ｎｆＳＰ１６、ｎｆＳＰ１７、ｎｆＳＰ１８、ｎｆＳＰ１９及び ／又はｎｆＳＰ２０の少なくとも一つをハイブリッドを形成する核酸分子である 。 厳格なハイブリッド形成条件下において、以下に示す核酸分子：ｎｆＳＰ４_{67 2} 、ｎｆＳＰ１₁₅₆、ｎｆＳＰ２₁₆₈、ｎｆＳＰ３₁₇₇、ｎｆＳＰ４₁₅₆、ｎｆＳＰ ５₁₅₉、ｎｆＳＰ６₁₆₈、ｎｆＳＰ７₁₅₉、ｎｆＳＰ８₁₈₆、ｎｆＳＰ９₁₆₈、ｎｆ ＳＰ１０₁₂₀及び／又はｎｆＳＰ１１₁₆₂並びに実施態様中に開示されたその他特 定の核酸分子の少なくとも一つをハイブリッドを形成する核酸分子がより好まし い。 ｎｆＳＰ１、ｎｆＳＰ２、ｎｆＳＰ３、ｎｆＳＰ４、ｎｆＳＰ５、ｎｆＳＰ６ 、ｎｆＳＰ７、ｎｆＳＰ８、ｎｆＳＰ９、ｎｆＳＰ１０、ｎｆＳＰ１１、ｎｆＳ Ｐ１２、ｎｆＳＰ１３、ｎｆＳＰ１４、ｎｆＳＰ１５、ｎｆＳＰ１６、ｎｆＳＰ １ ７、ｎｆＳＰ１８、ｎｆＳＰ１９及び／又はｎｆＳＰ２０及び更に詳細には、ｎ ｆＳＰ４₆₇₂、ｎｆＳＰ１₁₅₆、ｎｆＳＰ２₁₆₈、ｎｆＳＰ３₁₇₇、ｎｆＳＰ４₁₅₆ 、ｎｆＳＰ５₁₅₉、ｎｆＳＰ６₁₆₈、ｎｆＳＰ７₁₅₉、ｎｆＳＰ８₁₈₆、ｎｆＳＰ９₁₆₈ 、ｎｆＳＰ１０₁₂₀及び／又はｎｆＳＰ１１₁₆₂並びに実施例中に開示された その他特定の核酸分子を含む核酸分子が更により好ましい。 特に好ましいノミセリンプロテアーゼ核酸分子は、以下に示す配列：配列識別 番号：１６、配列識別番号：１８、配列識別番号：２０、配列識別番号：２２、 配列識別番号：２４、配列識別番号：２６、配列識別番号：２８、配列識別番号 ：３０、配列識別番号：３２、配列識別番号：３４、配列識別番号：３６、配列 識別番号：３８及び／又は表２に開示された核酸配列（すなわち、配列識別番号 ：５２、配列識別番号：５４、配列識別番号：５６、配列識別番号：５８、配列 識別番号：６０、配列識別番号：６２、配列識別番号：６４、配列識別番号：６ ６、配列識別番号：６８、配列識別番号：７０、配列識別番号：７２、配列識別 番号：７４、配列識別番号：７６、配列識別番号：７８）、並びに配列識別番号 ：８０、配列識別番号：８２、配列識別番号：８４、配列識別番号：８６、配列 識別番号：８８、配列識別番号：９０、配列識別番号：９２、配列識別番号：９ ４、配列識別番号：９６、配列識別番号：９８、配列識別番号：１００、配列識 別番号：１０２、配列識別番号：１０４、配列識別番号：１０６、配列識別番号 ：１０８及び／又は配列識別番号：１１０の少なくとも一つを含む。そのような 核酸分子の対立遺伝子変異型もまた好ましい。 本発明の好ましいノミアミノペプチダーゼ核酸分子は、厳格なハイブリッド形 成条件下において、ｎｆＡＰ₄₅₃及び／又はｎｆＡＰ₁₅₈₀とハイブリッド形成す る核酸分子である。より好ましくは、ｎｆＡＰ₄₅₃、ｎｆＡＰ₉₀₀、ｎｆＡＰ₇₃₂ 及び／又はｎｆＡＰ₁₅₈₀を含むアミノペプチダーゼ核酸分子である。配列識別番 号：５０、配列識別番号：１１２あるいはそれらの対立遺伝子の変異型を含む核 酸分子が特に好ましい。 本発明のノミプロテアーゼタンパクの核酸分子を知見することは、当業者が、 同核酸分子の複製を作成すること、並びにノミプロテアーゼのタンパク−コード 遺伝子（例えば翻訳開始部位及び／又は転写及び／又は翻訳調節領域を含む核酸 分子）の付随的タンパクを含む核酸分子及び／又はノミプロテアーゼ核酸分子同 相体を得ることも可能にする。本発明のノミプロテアーゼタンパクのアミノ酸配 列の一部を知見することは、当業者が、そのようなノミプロテアーゼタンパクを コードする核酸配列をクローン化することを可能にする。加えて、所望のノミプ ロテアーゼ核酸分子は、本発明のノミプロテアーゼタンパクと結合する抗体で適 切な発現ライブラリーをスクリーニングすること、本発明のオリゴヌクレオチド プローブを用いて適切なライブラリーもしくはＤＮＡをスクリーニングする慣用 のクローン化技術、及び本発明のオリゴヌクレオチドプライマー（ゲノム及び／ 又は相補的ＤＮＡライブラリーが使用され得る）を用いた適切なライブラリー、 ＲＮＡあるいはＤＮＡのＰＣＲ増幅を含む種々の方法にて得られる。ノミプロテ アーゼ核酸分子を単離するために、好ましい相補的ＤＮＡライブラリーは、飼料 を未摂取のノミ個体、飼料を摂取したノミ個体、飼料を摂取したノミの中腸、飼 料を未摂取のノミの中腸及びノミ唾液腺から得られる相捕的ＤＮＡライブラリー を含む。遺伝子をクローン化及び増幅する技術は、例えばサムブルック他による 前述の文献に開示されている。実施例の部は、本発明のノミプロテアーゼタンパ クをコードする相補的ＤＮＡを単離する例を含む。 本発明は、厳格な条件下にて、ノミプロテアーゼタンパクの少なくとも一部を コードする本発明の他の、好ましくはより長い核酸分子の相補的領域とハイブリ ッド可能なオリゴヌクレオチドである核酸分子を含む。本発明のオリゴヌクレオ チドは、ＲＮＡ、ＤＮＡあるいはそれらいずれかの誘導体であり得る。そのよう なオリゴヌクレオチドの最小の大きさは、与えられたオリゴヌクレオチドと、本 発明の別の核酸分子上の相補的配列との間に安定したハイブリッドを形成するの に必要な大きさである。最小の大きさの特徴は本明細書中に開示されている。オ リゴヌクレオチドの大きさはまた、本発明に従うオリゴヌクレオチドの用途に十 分な大きさである必要がある。本発明のオリゴヌクレオチドは、付随的な核酸分 子を同定するためのプローブとして、核酸分子を増幅もしくは延長するためのプ ライマーとして、又はノミプロテアーゼ生成を阻害するための治療上の用途を含 む種々の用途に使用され得るが、これらに限定されるものではない。そのような 治療上の用途としては、例えば、アンチセンス−、トリプレックス形成−、リボ ゾーム−及び／又はＲＮＡ薬物に基づく技術にそのようなオリゴヌクレオチドを 使用することを含む。従って、本発明は、そのような技術を一つあるいはそれ以 上使用することによるノミプロテアーゼタンパクの合成に関わるそのようなオリ ゴヌクレオチド及び方法を包含する。 本発明は、本発明のノミプロテアーゼ核酸分子を宿主細胞内に送達できるいか なるベクターにも挿入される、同核酸分子を含む組換えベクターも包含する。そ のようなベクターは、異種核酸配列、すなわち、本発明のノミプロテアーゼ核酸 分子の近隣には本来は見出されない核酸配列を含む。ベクターは、ＲＮＡ又はＤ ＮＡのいずれであることも、原核性又は真核性のいずれであることもでき、一般 的には、ウィルス又はプラスミドである。組換えベクターは、本発明のノミプロ テアーゼ核酸分子のクローン化、配列決定及び／又はそれ以外の操作に使用され 得る。組換えベクターの一類型は、本明細書中では組換え分子と呼び、より詳細 に下記で説明するが、本発明の核酸分子の発現に使用され得る。好ましい組換え ベクターは、形質転換した細胞中にて複製できる。本発明の組換えベクター中に 含まれる好ましい核酸分子は、本明細書中にて開示される。 既に開示したように、本発明の一実施態様は、本発明のノミプロテアーゼタン パクを合成するのに効果的な条件下において、同タンパクを発現し、かつ回収す ることができる細胞を培養することにより、同タンパクを合成する方法である。 培養するのに好ましい細胞は、本発明の一つ又はそれ以上の核酸分子にて宿主細 胞を形質転換することによって組換え細胞を形成しながら、ノミプロテアーゼタ ンパクを発現できる組換え細胞である。細胞中への核酸分子の形質転換は、核酸 分子を細胞中へ挿入できるいかなる方法を用いても達成できる。形質転換の手法 としては、トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、リ ポソーム注入法（lipofection）、吸着及びプロトプラスト融合法が拳げられる が、これらに限定されるものではない。組換え細胞は、単細胞のままでも、又は 組織、器官もしくは多細胞性器官系へと増殖させてもよい。本発明の形質転換さ れた核酸分子は、染色体外に留まることも、あるいは発現されるべきそれらの能 力を保持されるような様式にて、形質転換された（すなわち、組換えられた）細 胞の染色体内の一箇所又はそれ以上の部位へ統合することもできる。宿主細胞を 形質転換するのに好ましい核酸分子は、本明細書中に開示されている。 形質転換に適する宿主細胞は、形質転換でき、かつ導入されたノミプロテアー ゼタンパクを発現できるいかなる細胞をも含む。従って、そのような細胞は、本 発明の少なくとも一つの核酸分子と形質転換された後、本発明のノミプロテアー ゼタンパクを合成できる。宿主細胞は、形質転換されていない細胞、又は少なく とも一つの核酸分子で既に形質転換された細胞のいずれであることもできる。本 発明の適切な宿主細胞としては、細菌、真菌（酵母も含む）、昆虫、動物及び植 物細胞が含まれる。好ましい宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫及び哺乳類細胞であ り、この中でも、細菌（例えば、大腸菌（E．Coli））及び昆虫細胞（例えば、 スポドプテラ属（Spodoptera））が特に好ましい。 組換え細胞は、好ましくは、一つ又はそれ以上の転写調節配列を有する発現ベ クターに機能的に結合された、本発明の一種類又はそれ以上の核酸分子をそれぞ れ含む、一種類又はそれ以上の組換え分子で宿主細胞を形質転換させることによ って形成する。機能的に結合されたという語句は、核酸分子が宿主細胞中にて形 質転換された場合に発現可能となるように同分子を発現ベクターに挿入すること を意味する。本明細書中にて使用される、発現ベクターは宿主細胞を形質転換で き、かつ特定の核酸分子の発現を実施できるＤＮＡあるいはＲＮＡベクターであ る。発現ベクターは、宿主細胞内において複製可能であることも好ましい。発現 ベクターは、原核性又は真核性のいずれであることもでき、一般的には、ウィル ス又はプラスミドである。本発明の発現ベクターは、細菌、真菌、昆虫、動物及 び／又は植物細胞を含む本発明の組換え細胞内で機能する（すなわち、遺伝子発 現を指図する）いかなるベクターをも含む。すなわち、本発明の核酸分子は、プ ロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハンサー、終止配列、複製開始 点のような調節配列及び組換え分子に適合し、かつ本発明の核酸分子の発現を調 節するその他の調節配列を含む発現ベクターに機能的に結合できる。本明細書中 にて使用されるように、転写調節配列は、転写の開始、延長及び終結を調節でき る配列を含む。特に重要な転写調節配列は、転写開始を調節する配列、例えばプ ロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列である。適切な 転写調節配列は、本発明の少なくとも一つの組換え細胞にて機能できる、いかな る転写調節配列をも含む。種々のそのような転写調節配列は、当業者に公知であ る。好ましい転写調節配列は、細菌、酵母、蠕虫、昆虫及び哺乳類の細胞にて機 能する配列、例えば、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍ ｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージ（λ）（例えば、λP_L及びλP_R、並 びにそのようなプロモーターを有する融合）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７１ ａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファー ジＳＰ０１、メタロチオメイン、α交配因子、ピキア（Pichia）属アルコール酸 化酵素、アルファウィルスのサブゲノムプロモーター（例えば、シンドビスウィ ルスのサブゲノムプロモーター）、バキュロウィルス、ヘリオチス・ゼア（Heli othis zea）昆虫ウィルス、ワクシニアウィルス、ヘルペスウィルス、ポックス ウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０、レトロウィルスアクチン、 レトロウィルスの長い末端重複、ラウス肉腫ウィルス、熱ショック、リン酸及び 硝酸転写調節配列と同様に、原核及び真核細胞での遺伝子発現を調節できるその 他の配列を含むが、これらに限定されるものではない。付随的な適切な転写調節 配列は、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー並びにリンホカイン誘導型 プロモーター（例えば、インターフェロンあるいはインターロイキンで誘導でき るプロモーター）を含む。本発明の転写調節配列は、ノミプロテアーゼタンパク をコードするＤＮＡ配列に天然に付随する、天然に発生する転写調節配列をも含 む。 本発明の発現ベクターは、発現されたノミプロテアーゼタンパクが同タンパク を生成する細胞から分泌されることを可能にするための分泌シグナル（すなわち 、シグナルセグメントの核酸配列）を有していてもよい。適切なシグナルセグメ ントは、ノミプロテアーゼシグナルセグメント、又は本発明の、融合タンパクも 含めたノミプロテアーゼタンパクの分泌を支配できる、いかなる異種シグナルセ グメントをも包含する。好ましいシグナルセグメントとしては、ノミプロテアー ゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ｐＡ）、インターフェロン、イ ンターロイキン、成長ホルモン、組織適合性及びウィルス外皮の糖タンパクのシ グナルセグメントを含むが、これらに限定されるものではない。 本発明の発現ベクターは、本発明の挿入核酸分子の融合タンパクとしての発現 を招く融合配列を含んでいてもよい。本発明のノミプロテアーゼ核酸分子の一部 として融合配列を包含することは、核酸分子によってコードされたタンパクの生 成、保存及び／又は使用時の安定性を向上する。更に、融合セグメントは、例え ば得られた融合タンパクをアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製可能 にするような、ノミプロテアーゼタンパクの精製を簡略化するための手段として 機能する。適切な融合セグメントは、所望の機能（例えば、安定性の向上及び／ 又は精製手段）を有するいかなる大きさのドメインであり得る。一つあるいはそ れ以上の融合セグメントを使用することは、本発明の範囲内である。融合セグメ ントはノミプロテアーゼタンパクのアミノ及び／又はカルボキシ末端と結合され 得る。融合セグメントとノミプロテアーゼタンパク間の結合は、ノミプロテアー ゼタンパクの簡明な回収を可能とするような切断ができるように構成され得る。 融合タンパクは、ノミプロテアーゼタンパクのカルボキシ及び／又はアミノ基末 端のいずれかに結合された融合セグメントを含むタンパクをコードする融合核酸 配列によって形質転換された組換え細胞を培養することによって好ましくは合成 される。 本発明の組換え分子は、形質転換しようとする細胞での核酸分子の発現を効果 的に調節できる、いずれかの転写調節配列のうちの少なくとも一つに機能的に結 合された、前述の核酸分子のいずれかの少なくとも一つを含み得る分子である。 好ましい組換え分子は、本発明の一つあるいはそれ以上の核酸分子を含み、同核 酸分子は、一つあるいはそれ以上のノミプロテアーゼタンパク、及び特により好 ましくは一つあるいはそれ以上のノミセリンプロテアーゼ及び／又はノミアミノ ペプチダーゼタンパクをコードしている。同様に、好ましい組換え細胞は、本発 明の一つあるいはそれ以上の核酸分子を含み、同核酸分子は、一つあるいはそれ 以上のノミプロテアーゼタンパク、及び特により好ましくは一つあるいはそれ以 上のノミセリンプロテアーゼ及び／又はノミアミノペプチダーゼタンパクをコー ドしている。 組換えＤＮＡ技術の利用は、例えば、宿主細胞中の核酸分子のコピー数、これ らの核酸分子が転写される効率、得られた転写体が翻訳される効率及び翻訳後修 飾の効率を操作することによって、形質転換された核酸分子の発現を改善できる ことは当業者には理解されよう。本発明の核酸分子の発現を増大させるのに使用 される組換え技術は、核酸分子と高コピー数のプラスミドとの機能的な結合、一 つあるいはそれ以上の宿主細胞染色体への核酸分子の統合、プラスミドへのベク ター安定性配列の付加、転写調節シグナル（例えば、プロモーター、オペレータ ー、エンハンサー）の置換又は修飾、翻訳調節シグナルの置換又は調節（例えば 、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ配列）の置換又は修飾、宿主細胞 のコドンの使用に対応するような本発明の核酸分子の修飾、転写体を不安定化さ せるような配列の削除及び発酵の際に組換え細胞の増殖を組換えタンパク生産か ら一時的に分離する調節シグナルの利用を含むが、これらに限定されるものでは ない。本発明の発現された組換えタンパクの活性は、得られたタンパクの断片化 、修飾又は誘導体化することにより改善される。 本発明によれば、組換え細胞は、本発明のノミプロテアーゼタンパクを合成す るのに効果的な条件下で、同細胞を培養し、同タンパクを回収することによって 、同タンパクが合成される際に使用され得る。タンパクを合成するのに効果的な 条件としては、タンパク合成を許容するような、適切な培地、バイオリアクター 、温度、ｐＨ及び酸素条件が含まれるが、これらに限定されるものではない。適 切 な、あるいは効果的な培地とは、本発明の細胞が、培養時にノミプロテアーゼタ ンパクを合成可能とするいかなる培地をも意味する。そのような培地は、一般に 、同化できる炭水化物、窒素及びリン酸の供給源と同様に、適切な塩類、無機質 、金属及び例えばビタミン類のようなその他の栄養素を含む水性培地である。同 培地は複合栄養素を含んでよく、又は規定された最小培地でもよい。 本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクターで培養でき、同バイオリアクタ ーとしてはバッチ式、流加培養（fed-batch）式、細胞再循環式及び連続式発酵 槽が含まれるが、これらに限定されるものではない。培養は、振盪フラスコ、試 験管、微量滴定皿及びペトリ皿中にても実施され得る。培養は、組換え細胞に適 した温度、ｐＨ及び酸素含量にて実施される。そのような培養条件は、十分に当 業者の熟練の範囲内にある。 合成に使用されるベクター及び宿主系に応じて、得られたノミプロテアーゼタ ンパクは、組換え細胞内に残留するか；発酵培地に分泌されるか；例えば大腸菌 の細胞周辺腔のような２細胞膜間の空間に分泌されるか；あるいは細胞又はウィ ルス膜の外表面に保持されるかのいずれかである。そのようなタンパクを精製す る方法は、既に記載されている。 本発明は、単離された抗ノミプロテアーゼ抗体及び宿主動物及び同動物の環境 中のノミの寄生を低減するためにそれらを使用することを含む。抗ノミプロテア ーゼ抗体は、雄雌飼料摂取ノミ中腸及び雄雌飼料未摂取ノミ中腸を含む、ノミ中 腸中に存在するプロテアーゼと選択的に結合できる抗体である。抗ノミプロテア ーゼ抗体は、プロテアーゼのタンパク分解活性を低減するように同プロテアーゼ と結合することが好ましい。 単離された抗体は、天然の環境中から取り出された抗体である。「単離された 」という用語は、そのような抗体の精製の状態を指すものではない。すなわち、 単離された抗体は、そのような抗体又は種々の程度に精製された抗体を含む抗血 清を含み得る。本明細書中にて使用される「選択的に結合する」とは、そのよう な抗体が誘発されること（すなわち、混合物中からプロテアーゼと関連のない成 分とを区別して認識すること）に対してプロテアーゼに優先的に結合する能力を 意味する。結合親和性は、一般には約１０³Ｍ^-1〜約１０¹²Ｍ^-1の範囲である。 結合は、免疫ブロット検定、免疫沈降検定、放射線免疫検定、酵素免疫検定（例 えば、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法））、免疫蛍光抗体検定及び免疫電子顕 微鏡法を含む、当業者に公知の種々の方法を用いて測定できる；サムブルック他 による前述の文献を参照。 本発明の抗体は、ポリクロナールあるいはモノクロナール抗体のいずれである こともできる。本発明の抗体は、同抗体を得るために使用されるタンパクのエピ トープの少なくとも一つと選択的に結合できる一本鎖抗体を含む抗体断片及び遺 伝子工学による抗体のような、機能的等価物を包含する。本発明の抗体はまた、 一つ以上のエピトープと結合するキメラ抗体をも含む。好ましい抗体は、本発明 のノミプロテアーゼ核酸分子によって少なくとも部分的にコードされているタン パクに応答して誘発される。 本発明の抗ノミ抗体は、そのような抗体を含むワクチンを投与された動物の血 液をノミが摂取した場合、効果を現すような本発明のノミプロテアーゼワクチン を投与された動物中にて誘発される抗体を含む。本発明の抗ノミ抗体は、本発明 の一つあるいはそれ以上のノミプロテアーゼタンパク、又は可溶性ノミ中腸試料 に対して、動物中にて誘発される抗体を含み、当業者に公知の技術を用いて同動 物から回収される。更に本発明の付随的な抗体は、前述された技術を用いて、本 発明のノミプロテアーゼタンパクを組換えて合成される。規定されたタンパクに 対して産生される抗体は、そのような抗体が治療組成物に使用された場合、診断 用検定における干渉又は副作用を生ずるような他の物質に対する抗体で実質的に 汚染されていないために、好都合であり得る。 本発明の抗ノミプロテアーゼ抗体は、本発明の範囲内にある種々の用途を有す る。例えばそのような抗体は、動物を受動的に免疫して、同動物をノミの寄生か ら防御するために本発明の組成物中にて使用され得る。抗ノミ抗体はまた、発現 ライブラリーをスクリーニングする、及び／又はタンパクとその他の不純物を含 む混合物から本発明の所望のタンパクを回収するための手段として使用され得る 。更に本発明の抗体は、ノミを殺すために、細胞障害剤をノミに対して標的指向 化するのに使用され得る。標的指向化は、当業者に公知の技術を用いて、そのよ うな抗体を同細胞障害剤に接合（すなわち、安定的に結合）させることにより達 成できる。 本発明の好ましい抗ノミプロテアーゼ抗体は、ノミセリンプロテアーゼ、ノミ メタロプロテアーゼ、ノミアスパラギン酸プロテアーゼ及び／又はノミシステイ ンプロテアーゼと選択的に結合し、かつタンパク分解活性を優先的に低減できる 。より好ましい抗ノミプロテアーゼ抗体は、抗ノミセリンプロテアーゼ抗体、抗 ノミメタロプロテアーゼ抗体及び抗ノミアミノペプチダーゼ抗体を含む。特に好 ましいのは、本発明のノミセリンプロテアーゼタンパクあるいはノミアミノペプ チダーゼタンパクに対して誘発されることを含む、抗ノミセリンプロテアーゼ抗 体及び抗ノミアミノペプチダーゼ抗体である。 本発明は、動物及び同動物の環境中のノミの寄生を低減するためにノミプロテ アーゼのタンパク分解活性を減少するプロテアーゼ阻害剤の使用をも含む。本明 細書にて使用されるように、プロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼと直接作用す る化合物であり、それにより、通常、プロテアーゼ活性部位と結合あるいは相互 作用してプロテアーゼ活性を阻害する。プロテアーゼ阻害剤は、通常は比較的小 さな化合物であり、プロテアーゼ活性部位と相互作用する抗プロテアーゼ抗体と は区別される。 プロテアーゼ阻害剤は本発明の組成物中に含まれる化合物として、同化合物が 投与される動物に対して有害でない限り、同動物を治療するために直接使用され る。プロテアーゼ阻害剤は、本発明の組成物を用いて標的指向化するために好ま しい型のノミプロテアーゼを同定するために使用され得る。例えば、発明者らは 、プロテアーゼ阻害剤を用いて、ノミ中腸、特に可溶性ノミ中腸試料中における セリンプロテアーゼの有効性を本明細書中に示した。このような知見から、動物 に対するノミの寄生を効果的に低減することは、セリンプロテアーゼワクチン、 抗 ノミセリンプロテアーゼ抗体及び、動物が耐え得ることができるセリンプロテア ーゼ合成及び活性に対するその他の阻害剤を用いることにより達成される。その 他のプロテアーゼも本発明に従って中腸内に存在することは、そのようなプロテ アーゼを標的指向化することも示唆する。プロテアーゼ阻害剤を使用する方法は 当業者には公知であり、そのような方法の例は、本明細書中に開示されている。 一実施態様において、動物に投与するために本発明の組成物中に使用され得る プロテアーゼ阻害剤は、以下の工程を含む方法、すなわち、（ａ）（ｉ）インビ トロ（in vitro）中における、ノミプロテアーゼ活性を阻害する能力及び／又は （ｉｉ）ノミ給餌検定中（flea feeding assay）において、例えば、ウェイド（ Wade）他による、ジェイ．メッド エントモル．（J．Med Entomol.）２５刊、 １８６〜１９０頁、１９８８年に記載されているような給餌システム中にて維持 されるノミの血液飼料に阻害剤を加えることによりノミの生存及び／又は繁殖能 力を低減する能力に対して、一つあるいはそれ以上のプロテアーゼ阻害剤の効果 を試験することにより、候補となる（すなわち、推定される、あるいは可能性の ある）阻害剤化合物を同定する工程と、（ｂ）ノミに寄生された動物中において 同候補となる阻害剤化合物の効果を試験する工程とを備える方法によって同定さ れる。動物に投与するための候補化合物を決定するために、インビトロにおける 検定のデータ及びノミ給餌検定のデータの両方を必ずしも必要とはしないが、一 方の検定から得られるデータは、他方の検定から得られるデータより必ずしも推 測することができないので、両方のデータから評価することが好ましい。例えば 、インビトロにおける検定を用いて同定される候補化合物は、「試験管内におい ては」効果を現すが、種々の理由からインビボ（in vivo）においては効果を現 さない場合もあり、それら理由の一つとして、そのような化合物の活性を阻害す るような成分が血液飼料中に存在することが挙げられる。一例として、アプロチ ニンは、インビトロ中においては少なくともある種のノミセリンプロテアーゼを 阻害するが、血液中に存在するような血清タンパクが存在する場合はあまり作用 しない。更に、ノミ給餌検定によって同定される阻害剤の候補化合物は、所望の 化合 物のみならず、一般毒性（例えば、ノミのミトコンドリアに影響を与える）によ ってノミの生存及び／又は繁殖能力を低減する化合物をも含む。 別の実施態様において、プロテアーゼ阻害剤は、例えばアフィニティークロマ トグラフィーによって対応するプロテアーゼの精製にも使用され、同プロマトグ ラフィーにおいて、プロテアーゼ阻害剤は、所望のプロテアーゼと複合体を形成 するような条件下にて、同プロテアーゼを含む混合物とインキュベートされる。 その後、プロテアーゼは複合体から回収される。プロテアーゼ阻害剤は、複合体 を検知し、及び／又は回収するために使用され得る固体の支持体に装着され得る か、及び／又は、例えば放射性、蛍光又は酵素性の標識体でラベルされ得る。 本発明に従って使用される適切なプロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ 阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤、シス テインプロテアーゼ阻害剤及び／又はアミノペプチダーゼ阻害剤を含む。好まし いプロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害 剤及びアミノペプチダーゼ阻害剤であり、特に広域スペクトル阻害剤であるもの が好ましい。より好ましいのは、広域スペクトルセリンプロテアーゼ阻害剤であ る。 当業者には公知のように、比較的多数のプロテアーゼ阻害剤がある。これらの 例としては、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、塩化メチルケトンＴＬＣ Ｋ（Ｎα−ｐ−トシル−Ｌ−リジン 塩化メチルケトン）及び塩化メチルケトン ＴＰＣＫ（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニン 塩化メチルケトン）、キモスタ チン、シスタチン、３’４−ジクロロイソクマリン、Ｅ−６４（トランス−エポ キシスクシニル−Ｌ−ロイシルアミド−（４−グアニジノ）ブタン）、ＥＤＴＡ （エチレンジアミン４酢酸）、ロイペプチン、種々の離脱基を有するメチルケト ン類、酸化されたＬ−ロイシンチオール、ペプスタチン、１，１０−オルトフェ ナントロリン（1,10-orthophenanthroline）、ホスホラミドン、ダイズトリプシ ン／キモトリプシン阻害剤及びダイズトリプシン阻害剤が挙げられるが、これら に限定されるものではない。本発明に使用される好ましいプロテアーゼ阻害剤は 、 ＡＥＢＳＦ、ベスタチン、Ｅ−６４、ロイペプシン、ペプスタチン、１，１０− オルトフェナントロリン、ホスホラミドン、ＴＬＣＫ及びＴＰＣＫが含まれ、Ａ ＥＢＳＦ（広域スペクトルセリンプロテアーゼ阻害剤）、ベスタチン（ロイシン アミノペプチダーゼ阻害剤）及び１，１０−オルトフェナントロリン（広域スペ クトルメタロプロテアーゼ阻害剤）が特に好ましい。 プロテアーゼ阻害剤は、当業者に公知の方法を用いて合成される。例えば、シ スタチンあるいはプロテアーゼ基質からなる小さなペプチドのようなタンパクあ るいはペプチド系のプロテアーゼ阻害剤は、必要に応じて、組換え合成及び修飾 され得る。 本発明は、付随的なプロテアーゼ阻害剤を同定するために本発明のタンパク分 解性のノミプロテアーゼタンパクの使用及び、動物に投与されるべき本発明の組 成物中に含まれ得る好ましいプロテアーゼ阻害剤化合物をも含む。ノミプロテア ーゼ阻害剤を同定する方法は、（ａ）推定される（すなわち、候補となる）阻害 化合物が存在しない場合には、タンパクがタンパク分解活性を有するような条件 下にて、単離されたノミプロテアーゼタンパクを同阻害化合物と接触（例えば、 結合、混合）させる工程と、（ｂ）推定される阻害化合物がタンパクの分解活性 を阻害するか否かを決定する工程とを備える。スクリーニングするための推定さ れる化合物としては、有機分子、抗体（それらの機能的等価物も含む）及び基質 類似体を含む。プロテアーゼ活性を決定する方法は、本明細書中にて既に開示さ れたように、当業者には公知の方法である。阻害剤の同定において使用される特 に好ましいものは、本発明のノミセリンプロテアーゼタンパク及びノミアミノペ プチダーゼタンパクである。 本発明は、ノミプロテアーゼ活性を阻害可能である化合物を同定する試験キッ トも含む。そのような試験キットは、タンパク分解活性を有する単離されたノミ プロテアーゼタンパク及び推定される阻害化合物の存在下において（即ち阻害化 合物によって誘発される）タンパク分解活性の阻害される程度を決定するための 手段を含む。 本発明はまた、そのような方法及び／又は試験キットによって単離された阻害 剤、及びそのような阻害剤が適用されるいかなるノミプロテアーゼを阻害する方 法も含む。 本発明はまた、本発明の化合物に対して開示された方法に従って使用され得る 本発明の化合物のミメトープも含まれることは理解されよう。本明細書にて使用 されるように、本発明のタンパク様化合物（例えば、ノミプロテアーゼタンパク 、抗ノミプロテアーゼ抗体、プロテアーゼ活性あるいは合成のタンパク様阻害剤 ）のミメトープ（mimetope）は、同タンパク様化合物の活性を模倣できるいかな る化合物をも意味し、その理由としては、ミメトープが、しばしばタンパク様化 合物に類似した構造を有することによる。例えばノミプロテアーゼタンパクのミ メトープは、本発明の単離されたノミプロテアーゼタンパクのミメトープに類似 する活性を有する化合物である。ミメトープは、分解の可能性を低減するように 修飾されたペプチド；抗イディオタイプ抗体及び／又は抗体触媒あるいはそれら の断片；単離されたタンパクの非タンパク様免疫原性部分（例えば、炭水化物構 造）；及び核酸を含む合成あるいは天然有機分子であり得るが、これらに限定さ れるものではない。そのようなミメトープは、本発明のタンパクのコンピュータ 生成構造を用いて設計され得る。ミメトープはまた、オリゴヌクレオチド、ペプ チドあるいはその他の有機分子のような分子の無作為なサンプルを生成し、同サ ンプルを対応する結合パートナーを用いたアフィニティークロマトグラフィーに よってスクリーニングすることによっても得られる。 本発明は、本発明の化合物（すなわち、少なくとも一つの化合物）を含む組成 物として本明細書中では定義される、治療組成物を含む。本発明の組成物中に包 含され得る好ましい化合物としては、本明細書中に開示されたノミプロテアーゼ ワクチン、抗ノミプロテアーゼ抗体及び／又はプロテアーゼ阻害剤を含む。その ような治療組成物は、ノミプロテアーゼ活性を低減することによりノミの寄生か ら動物を防御し、それにより動物中及び動物の環境中におけるノミ負荷を低減で きる。 特に好ましい本発明の治療組成物は、以下の化合物、すなわち、単離されたセ リンプロテアーゼタンパクあるいはそのミメトープ；厳格なハイブリッド形成条 件下においてノミセリンプロテアーゼ遺伝子とハイブリッド形成する単離された ノミセリンプロテアーゼ核酸分子；ノミセリンプロテアーゼタンパクと選択的に 結合する単離された抗体；ノミセリンプロテアーゼ活性を阻害する能力によって 同定されたノミセリンプロテアーゼ活性阻害剤；単離されたノミアミノペプチダ ーゼタンパクあるいはそのミメトープ；厳格なハイブリッド形成条件下において ノミアミノペプチダーゼ遺伝子とハイブリッド形成する単離されたノミアミノペ プチダーゼ核酸分子；ノミアミノペプチダーゼタンパクと選択的に結合する単離 された抗体；及びノミアミノペプチダーゼ活性を阻害する能力によって同定され たノミアミノペプチダーゼ活性の阻害剤の内の少なくとも一つを含む。 本発明の別の実施態様は、ノミプロテアーゼ活性を低減する第一の化合物及び ノミプロテアーゼ活性を低減する以外の方法にてノミ負荷を低減する第二の化合 物を含む治療組成物である。本発明はまた、そのような組成物を動物に投与する ことによりノミの寄生から動物を防御する方法も含む。ノミの中腸におけるノミ プロテアーゼ活性を効果的に減少することにより、そのような組成物の第一の化 合物は第二の化合物の活性を高める。理論的には証明されていないが、多くの抗 ノミ治療薬、特にタンパク様治療薬は、中腸にて分解されるのでそれほど効果を 示さない。本発明は、ノミの中腸によるそのような治療薬のタンパク分解を低減 することによって同抗ノミ治療薬の効果的な使用法を許容する。 そのような組成物中に含まれる好ましい第一の化合物としては、本明細書に開 示されているように、ノミプロテアーゼワクチン、抗ノミプロテアーゼ抗体及び ／又はプロテアーゼ阻害剤を含む。 適切な第二の化合物は、タンパク様化合物、殺虫剤及びノミのカラーを含む抗 ノミ剤を含むがこれらに限定されるものではない。好ましい第二の化合物は、能 動免疫（例えば、抗原ワクチン）、受動免疫（例えば、抗体）あるいは、それ以 外では、阻害が動物及び動物の環境中のノミ負荷を低減できる場合においてノミ の活動を阻害するタンパク様化合物である。第二の化合物の例としては、ノミの 膜タンパクとそのリガンド間の結合を阻害する化合物（例えば、ノミのＡＴＰア ーゼ（アデノシントリホスファターゼ）活性を阻害する化合物、あるいはペプチ ドあるいはステロイドホルモンの同レセプターとの結合を阻害する化合物）、ホ ルモン（ペプチドあるいはステロイドホルモンを含む）合成を阻害する化合物、 卵黄形成（ビテリンの生成及びその卵黄主要タンパクへの輸送及び成熟を含む） を阻害する化合物、脂肪体機能を阻害する化合物、ノミの筋肉運動を阻害する化 合物、ノミの神経系を阻害する化合物、ノミの免疫系を阻害する化合物及び／又 はノミの摂食を阻害する化合物が含まれる。 本発明の組成物はまた、薬剤学的に適用可能な賦形剤、捕助剤及び／又は担体 のようなその他の組成物も含む。例えば、本発明の組成物は、投与される動物が 耐え得る賦形剤中に処方される。そのような賦形剤の例としては、水、生理食塩 水、リンゲル液、デキトロース液、ハンクス液、及びその他の生理学的に均衡な 塩類水溶液を含む。例えば、不揮発油、ゴマ油、オレイン酸エチルあるいはトリ グリセリド類のような非水性賦形剤も使用され得る。その他の有用な処方物とし ては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールあるいはデキスト ランのような増粘剤を含有する懸濁剤を含む。賦形剤は、例えば等張性及び化学 的安定性を高める物質のような少量の添加物を含むこともできる。緩衝液の例と しては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液及びトリス緩衝液が挙げられ、保存剤の例 としては、チメロサール、ｍ−あるいはｏ−クレゾール、ホルマリン及びベンジ ルアルコールが挙げられる。標準的な化合物は、注射が可能な液体、あるいは適 切な液体に溶解し、注射に適した懸濁剤あるいは溶液となるような固体のいずれ であることもできる。従って、液体でない配合物では、賦形剤は、投与の前に滅 菌水あるいは生理食塩水を添加できるデキストロース、ヒト血清アルブミン、保 存剤等を含むことができる。 本発明の一実施態様においては、組成物は、アジュバントあるいは担体のよう な免疫強化剤も含むことができる。アジュバントは、一般に、特異抗原に対する 動物の免疫応答を全般的に強化する物質である。適切なアジュバントとしては、 フロインドアジュバント；他の細菌の細胞壁成分；アルミニウム系の塩類；カル シウム系の塩類；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク；ウィ ルスコートタンパク；他の細菌由来製剤；ガンマインターフェロン；ブロック共 重合体アジュバント、例えばハンター（Hunter）のチテルマックス（Titermax） アジュバント（バクセル（Vaxcel）（商標）社、米国ジョージア州ノルクロス（ Norcross））；Ｒｉｂｉアジュバント（リビ イムノケム リサーチ（Ribi Imm unoChem Research）社、米国モンタナ州ハミルトン（Hamilton）より入手可能） ；及びサポニン及びその誘導体、例えばクイル エー（Quil A）（デンマーク国 のスーパーフォス バイオセクタ エー／エス（Superfos Biosector A/S）より 入手可能）を含むが、これらに限定されるものではない。担体は、一般に、投与 された動物体内での治療組成物の半減期を増大させる化合物である。適切な担体 としては、ポリマーによる徐放性処方物、生分解可能なインプラント、リポソー ム、細菌、ウィルス、油類、エステル類及びグリコール類が含まれるが、これら に限定されるものではない。 本発明の一実施態様は、本発明の組成物を動物の体内にで徐々に放出すること が可能な徐放性処方物である。本明細書にて使用される徐放性処方物とは、徐放 性の担体に含有された本発明の組成物からなる。適切な徐放性の担体としては、 生体適合性ポリマー、その他のポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプ セル、マイクロパーティクル、ボルス製剤、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポ ソーム、リポスフェア及び経皮デリバリシステムが含まれるが、これらに限定さ れるものではない。本発明のその他の徐放性処方物は、動物に投与した場合、イ ンシトゥ（in situ）において固体あるいはゲルを形成するような液体を含む。 徐放性処方物は、生分解性（すなわち、生体内において侵食される）であること が好ましい。 本発明の好ましい徐放性処方物は、約１〜１２ヶ月の期間にわたり動物から飼 料を摂取したノミのプロテアーゼ活性を低減する目的にて組成物の十分治療可能 なレベル量を達成するために、本発明の組成物を一定の割合にて投与された動物 の血液中へ放出することを可能とする。本発明の徐放性処方物は、好ましくは少 なくとも１ヶ月、より好ましくは少なくとも約３ヶ月、更により好ましくは少な くとも約６ヶ月、それより好ましくは少なくとも約９ヶ月、そして最も好ましく は少なくとも約１２ヶ月にわたって治療効果を現すことが可能である。 ノミの寄生から動物を防御するために、本発明の治療組成物は、同組成物を投 与された動物の血流から血液を摂取するノミのプロテアーゼ活性を低減するよう な効果的な方法にて動物に投与される。すなわち、投与された動物は、ノミプロ テアーゼ活性を減少することによって、あるいはノミプロテアーゼ活性及びそれ 以外のノミ活性の少なくとも一つを低減することによってノミ負荷を減少するた めの応答能を有する動物である。好ましくは、プロテアーゼ活性は少なくとも約 ５０％減少し、より好ましくは少なくとも約７０％減少し、更により好ましくは 少なくとも約９０％減少する。そのような応答能を動物に与えるために動物に組 成物を投与する方法は、組成物の性質及び投与方法に依存する。 少なくとも一回のブースター予防接種プロテアーゼワクチンを投与された動物 は、いかなるワクチン治療に対して期待できる時間と同様の時間にて、応答能を 得る。例えば、最初の投与から約４〜６週間後にブースター投与量を投与された 動物は、通常、その後約３〜４週間以内に応答能を得る。抗ノミプロテアーゼ抗 体あるいはプロテアーゼ阻害剤を含む組成物を投与された動物は、化合物が適切 な血清レベルに達するとすぐに応答能を得、通常１〜３日にて応答能を得る。 好ましい実施態様において、本発明の組成物は、宿主動物に投与した場合、投 与された動物からノミが飼料を摂取した後、少なくとも約２１日以内に、同ノミ の生存率を少なくとも約５０％低減することが可能である（ノミは、通常一匹あ るいはそれ以上の動物中にて約４０〜約５０日間生存することを明記しておきた い）。より好ましい組成物は、宿主動物に投与した場合、投与された動物からノ ミが飼料を摂取した後、少なくとも約１４日以内に、同ノミの生存率を少なくと も約６５％低減することが可能である。更により好ましい組成物では、宿主動物 に投与した場合、投与された動物からノミが飼料を摂取した後、少なくとも約７ 日以内に、同ノミの生存率を少なくとも約９０％低減することが可能である。 別の好ましい実施態様において、本発明の組成物は、宿主動物に投与した場合 、投与された動物からノミが飼料を摂取した後、少なくとも約３０日以内に、同 ノミの繁殖能力（すなわち、卵を産む能力）を、少なくとも約５０％、より好ま しくは少なくとも約７０％、更により好ましくは少なくとも約９０％低減するこ とが可能である（ノミは、通常血液飼料を摂取してから約７日を経過するまで卵 を産まないことを明記しておきたい）。 本発明に従って、ノミが本発明の組成物を投与された動物から飼料を摂取し、 そのノミにおけるノミプロテアーゼ活性が低減するような応答能を動物が得るよ うに、すなわち、動物が処置された動物となるような方法にて同組成物が動物に 投与される。例えば、本発明のノミプロテアーゼワクチンは、効果的な方法にて 動物に投与した場合、動物の血流中に、ノミプロテアーゼ活性を減少するのに十 分な抗体力価を産生するような免疫応答を誘発する（すなわち、刺激する）こと を可能にする。同様に、本発明の抗ノミプロテアーゼ抗体は、効果的な方法にて 動物に投与した場合、ノミプロテアーゼ活性を低減するのに十分な力価にて動物 の血流中に存在するような量が投与される。本発明のプロテアーゼ阻害剤化合物 は、効果的な方法にて動物に投与した場合、ノミプロテアーゼ活性を低減するの に十分な濃度にて動物の血流中に存在するような量が投与される。本発明のオリ ゴヌクレオチド核酸分子も効果的な方法にて投与され、それによりノミプロテア ーゼの発現を低減する。 本発明の組成物は、ノミの寄生前あるいは寄生中に動物に投与され得る。本発 明のワクチンが動物に投与された場合、動物から飼料を摂取したノミのプロテア ーゼ活性を阻害する応答能を得るまでに、同動物が免疫応答を誘発する期間を必 要とすることを明記しておきたい。動物が免疫応答を得る方法は、当業者におい ては公知である。 治療組成物を効果的な方法で投与するための、許容され得るプロトコルは、個 別的な投与量の多少、投与の回数、投与量を投与する頻度、及び投与の様式を包 含する。そのようなプロトコルの決定は、当業者によって達成される。適切な一 回投与量は、適切な期間にわたって一回又はそれ以上投与した場合、ノミの寄生 から動物を防御できる量である。例えば、プロテアーゼワクチンあるいはそのミ メトープの好ましい一回量は、動物の体重１ｋｇ当たり、同組成物の約１マイク ログラム（μｇあるいはｕｇとも記載される）〜約１０ミリグラム（ｍｇ）であ る。ブースター予防接種は、最初の投与後、約２週間〜数年の間に投与され得る 。ブースター予防接種は、動物の免疫応答がノミの寄生から動物を防御するのに 不十分となった際に投与されることが好ましい。投与計画としては、動物の体重 １ｋｇあたりワクチン約１０μｇ〜約１ｍｇを、約２週間〜約１２ヶ月にわたっ て約１〜約２回投与する計画が好ましい。一実施態様において、本発明の組成物 のブースター投与量は、最初の投与後、約４〜６週間にて投与され、追加のブー スターは一年に約１あるいは２回投与される。投与の様式は、経口、鼻内、局所 、経皮、直腸及び非経口の投与経路が含まれるが、これらに限定されない。非経 口投与経路としては、皮下、皮内、静脈内及び筋肉内の経路が含まれるが、これ らに限定されない。 別の実施態様において、抗ノミプロテアーゼ抗体組成物あるいはそのミメトー プの好ましい一回投与量は、動物の体重１ｋｇ当たり、同組成物の約１μｇ〜約 １０ｍｇである。抗ノミ抗体は、最初の投与から約１時間〜週２回毎に数週間に わたって再投与され得る。ブースター処置は、動物の抗体力価がノミの寄生から 動物を防御するのに不十分となった場合に投与されるのが好ましい。投与計画と しては、動物の体重１ｋｇ当たり抗ノミプロテアーゼ抗体組成物の約１０μｇ〜 約１ｍｇが約２〜４週間毎に投与される計画が好ましい。投与の適切な様式は、 本明細書中に開示されたとおりであり、当業者に公知の方法である。 一実施態様によれば、本発明の核酸分子は、疾病から保護しようとする動物で の保護タンパク（例えば、ノミプロテアーゼワクチン、抗ノミプロテアーゼ抗体 あるいはタンパク様プロテアーゼ阻害剤）あるいは保護ＲＮＡ（例えば、アンチ センスＲＮＡ、リボザイムあるいはＲＮＡ薬）への同核酸分子の発現を可能にす る様式で、動物に投与できる。核酸分子は、（ａ）直接の注射（例えば、ウォル フ（Wolff）他（サイエンス（Science）、２４７刊、１４６５〜１４６８頁、１ ９９０年）によって示唆された「露出した」ＤＮＡあるいはＲＮＡとして）、あ るいは（ｂ）組換えウィルス粒子のワクチンもしくは組換え細胞のワクチンとし て包装（すなわち、組換えウィルス粒子のワクチン及び組換え細胞のワクチンか らなる群より選ばれる賦形剤によって細胞に送達される）を包含するが限定され ない種々の方法にて動物に送達される。 本発明の組換えウィルス粒子のワクチンは、ウィルスコートに包装され、投与 後に動物で発現させ得る本発明の組換え分子を含有する。好ましくは、同組換え 分子はパッケージングを欠く。アルファウィルス、ポックスウィルス、アデノウ イルス、ヘルペスウィルス及びレトロウィルスに基づくものを包含するが限定さ れない、種々の組換えウィルス粒子が使用され得る。 動物に投与された場合、本発明の組換えウィルス粒子のワクチンは、免疫され た動物の体内で細胞に感染し、本発明の寄生虫が引き起こす疾病から動物を保護 できる保護タンパクあるいはＲＮＡ核酸分子の生成を支配する。本発明の組換え ウィルス粒子のワクチンの好ましい一回投与量は、動物の体重１ｋｇ当たり約１ ×１０⁴〜約１×１０⁷ウィルスプラーク形成単位（ｐｆｕ）である。投与プロト コルは、タンパクに基づくワクチンに関して本明細書中に記載されたものと同様 である。 本発明の組換え細胞ワクチンは、本発明の少なくとも一つのタンパクを発現す る本発明の組換え細胞を含む。好ましい組換え細胞は、サルモネラ属、大腸菌、 ミコバクテリウム属、スポドプテラ・フルギペルダ、仔ハムスター腎、筋原細胞 Ｇ８、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ及びＣＲＦＫの組換え細胞を包含するが、サルモネラ属 の組換え細胞がより好ましい。そのような組換え細胞は、種々の方法にて投与で きるが、経口的に、好ましくは体重１ｋｇあたり細菌約１０⁸〜約１０¹²個とい う範囲の投与量にて投与できる利点を有する、投与プロトコルは、タンパクに基 づ くワクチンに関して本明細書中に記載したものと同様である。組換え細胞ワクチ ンは、全細胞あるいは細胞溶解物を含むことができる。 本発明の組成物は、温血動物を含む、ノミの寄生の可能性のある全ての動物に 投与され得る。治療されるべき好ましい動物としては哺乳類及び鳥類が含まれ、 ネコ、イヌ、ヒト、ウシ、チンチラ、ケナガイタチ、ヤギ、マウス、ミンク、ウ サギ、アライグマ、ラット、ヒツジ、リス、ブタ、ニワトリ、ダチョウ、ウズラ 及び七面鳥並びに、毛皮で覆われた動物、愛玩動物及び／又は経済的食用動物が より好ましい。防御されるべき特に好ましい動物は、ネコ及びイヌである。 本発明は、いかなるノミの寄生をも治療する組成物を含む。すなわち、本発明 の組成物はいかなるノミの種からも由来され得る。標的とされるノミとして好ま しいものは、以下の属：イヌノミ（Ctenocephalides）属、チョプシラス（Cyops yllus）属、ジアマナス（オロプシラ）（Diamanus(Oropsylla)）属、エチドノフ ァガ（Echidnophaga）属、ノソプシラス（Nosopsyllus）属、ヒトノミ（Pulex） 属、タンガ（Tunga）属、及びネズミノミ（Xenopsylla）属のノミを含み、イヌ ノミ（Ctenocephalides canis）、ネコノミ（Ctenocephalides felis）、ジアマ ナス モンタナス（Diamanus montanus）、ニワトリノミ（Echidnophaga gallin acea）、ヨーロッパネズミノミ（Nosopsyllus faciatus）、ヒトノミ（Pulex ir ritans）、プレックス シムランス（Pulex simulans）、スナノミ（Tunga pene trans）及びインドネズミノミ（Xenopsylla cheopis）がより好ましい。動物が 防御されるべき特に好ましいノミとしては、ネコノミ、イヌノミ及びヒトノミ属 （例えば、ヒトノミ及びプレックス シムランス）が含まれる。本発明の組成物 を直接ノミに投与することも本発明の範囲内に含まれる。 本発明は、他の外部寄生虫による寄生を低減するために本発明の組成物を使用 すること、並びに外部寄生虫の寄生を低減するために、いかなる外部寄生虫に由 来するプロテアーゼ合成／及び活性を阻害するプロテアーゼワクチン、抗プロテ アーゼ抗体及び化合物を含む組成物を使用すること、特にそのような組成物が含 まれる徐放性処方物の使用も含む。標的指向化される外部寄生虫として好ましい のは、クモ類（arachnids）、昆虫類及びヒル類（leeches）が含まれる。標的指 向化される外部寄生虫としてより好ましいのは、ノミ類、マダニ（Ixodidae）科 （例えばマダニ（Ixodes）属及びアンブリオーマ（Amblyomma）属）の硬いダニ （hard tick）及びヒメダニ（Argasidae）科（例えば、オー．パルケリ（O．par keri）及びオー．ツリカータ（O．turicata）のようなカズキダニ（Ornithodoro s）属）のような柔らかいダニ（soft tick）の両方を含むダニ類、ユスリカ（例 えば、キュリコイデス（Culicoides）属）のようなハエ、カ、スナバエ、ブユ、 アブ、ツノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、はえ幼虫症を起こ すハエ及び咬み型のブユ；アリ；クモ；シラミ；ダニ；及びシャガス症を引き起 こす媒体となるようなトコジラミ及びサシガメのような半翅類の昆虫が含まれる 。標的指向化される外部寄生虫として更により好ましいのは、ノミ、カ、ユスリ カ、スナバエ、ブユ、ダニ及びロドニウス（Rhodnius）属である。 下記の実施例が例示の目的で提示されているが、本発明の範囲を限定すること は意図されていない。 例 例１ 本例により、溶解性ノミ中腸試料はセリンプロテアーゼ活性及びロイシンアミ ノペプチダーゼ活性を有することを実証する。 米国特許第５，３５６，６２２号中に記載されている均質化／音波処理プロト コールを採用し、続いて約１０，０００ｘｇにおける約２分間の遠心分離ステッ プを行い、飼料を摂取させたノミ及び絶食させたノミから溶解性ノミ中腸試料を 得た。また、遠心分離ステップにて得られたペレットを回収し、分析のために再 懸濁した。また全ノミリゼイトを調製した。合成色原体トリプシン基質ＢＡＰＮ Ａ（Ｎα−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニライド；シグマ ケ ミカル コー．，セントルイス エムオー（Sigma Chemical Co.，St．Louis MO ）より入手可能）を用いてのペプチド基質スクリーニング試験によ り、溶解性ノミ中腸試料における顕著なタンパク分解活性及び再懸濁中腸ペレッ トにおけるいくらかのタンパク分解活性が実証された。絶食ノミ溶解性中腸試料 は対照例（ノミ中腸分画が添加されない試料）の約１０倍の活性を示し、飼料摂 取ノミ溶解性中腸試料は対照例の約２０倍の活性を示した。全ノミ試料は対照例 の約２〜３倍の活性を示した。 飼料摂取ノミ及び絶食ノミの溶解性中腸試料におけるＢＡＰＮＡ切断能は、ア プロチニン（シグマより入手可能）によってほぼ完全に（即ちほぼ１００％）阻 害され、係るタンパク分解活性はＰＭＳＦ（フェニルメタン−７−スルホニルフ ルオリド；シグマより入手可能）によって約５０％阻害された。試料のタンパク 分解活性はＥＤＴＡにより約１０％阻害され、同タンパク分解活性はカルシウム イオンを加えることにより約２５％刺激された。これらの結果から、これらの溶 解性ノミ中腸試料におけるセリンプロテアーゼ活性の存在、より詳細にはトリプ シン様活性の存在が示される。また、これらの結果により、同試料におけるセリ ンプロテアーゼイソ型の存在が示唆される。更に、ノミトリプシン様活性は、カ のトリプシンはＥＤＴＡまたはカルシウムイオンにより影響を受けないという点 で、カのトリプシン活性と区別されることに留意されたい。 メチル−ヘモグロビン基質により、溶解性ノミ中腸試料におけるタンパク分解 活性の最適ｐＨは、ｐＨ７〜９の範囲であることがわかり、最も活性が高くなる のはｐＨ８であることがわかった。このような最適pHから、溶解性ノミ中腸試料 におけるセリンプロテアーゼの存在が示唆される。 また、絶食ノミ及び飼料摂取ノミのいずれにおいても溶解性中腸試料は、標準 条件下において、ロイシンアミノペプチダーゼ特異基質ＬＰＮＡ（Ｌ−ロイシン ーｐ−ニトロアニライド；シグマより入手可能）を切断可能であり、同試料にお けるロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性の存在が示された。例２ 本例では、プロテアーゼ基質ゲル分析によって計数可能なノミ中腸プロテアー ゼの数を評価した。 プロテアーゼ基質ゲル（ノヴェックス ザイモゲル（Novex Zymogel）として 、ノヴェックス、サンディエゴ、シーエイ（Novex，San Diego，CA）から入手可 能）は、０．１％ジェラチンを含む１０％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルであ った。試料及びゲルは、ノヴェックスの指示に従い処理した。即ち、還元剤を含 まないＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝剤に試料を溶解させた。トリス−グリシンＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥを標準的な手順により行った。電気泳動後、室温にて３０分間（ｍ ｎ）、ゲルを０．２５％トリトンＸ−１０００中で培養した。次に室温にて３０ ｍｎ、展開緩衝剤（developping buffer）（５０ｍＭ（ミリモル）トリス−ＨＣ ｌ ｐＨ７．０、５ｍＭ ＣａＣｌ₂，０．０２％ブリージ３５、０．２Ｍ（モル ）ＮａＣｌ）中にて培養し、その後３７℃にて通常一晩、新鮮な展開緩衝剤中に て培養した。次に、０．５％クーマシーＲ−２５０、４０％メタノール、１０％ 酢酸中で、３０分間ゲルを染色し、４０％メタノール、１０％酢酸中で脱色した 。 以下のノミ中腸を切除して直接試料緩衝剤に溶解させた。即ち、絶食雄の中腸 １００個、絶食雌の中腸１００個、飼料摂取雄の中腸１００個、飼料摂取雌の中 腸１００個である。それぞれ１０個または２０個の中腸を含む試料をプロテアー ゼ基質ゲル分析にて評価し、多数の陰性染色バンドが認められた。一般的なパタ ーンは雌雄の中腸において同じであったが、雌の中腸を含むゲルレーンにおいて より高い活性があるように見られた。飼料摂取中腸を含むゲルレーンと絶食中腸 を含むゲルレーンとでは、明白な差異が確認された。飼料摂取中腸のレーンでは 総合的な活性の明確な増加が生じ、更にバンドパターンにおいても差異があった 。 飼料摂取雌及び絶食雌の中腸をプロテアーゼ基質ゲル分析により更に評価した 。その結果を図１に示す。図１に示すプロテアーゼ基質ゲルにより、飼料摂取雌 及び絶食雌から得られた１、２、５または１０個の中腸における相対的なタンパ ク分解活性が示される。即ち、レーン１には一組の分子量マーカーが含まれる。 レーン２からレーン５までには、それぞれ、１０、５、２及び１個の絶食ノミ中 腸 が含まれる。レーン６から９までには、それぞれ１、２、５及び１０個の飼料摂 取ノミ中腸が含まれる。レーン１０には乾燥ウシ血液１００μｇが含まれる。 タンパク分解活性は１個の飼料摂取雌中腸または絶食雌中腸から容易に検出可 能であったが、飼料摂取雌の中腸が大幅に高い活性を示した。レーン１０では、 飼料摂取中腸のレーンにて見られる活性増加が飼料である血液飼料中のプロテア ーゼによるものであるか否かを判断するために、１００μｇの乾燥ウシ血液を評 価した。血液レーンでは活性はなかった。例３ 本例では、ノミ中腸に存在するプロテアーゼのクラスを評価した。 絶食雌の中腸３個及び飼料摂取雌の中腸０．７５個から成る２組の試料を、い くつかのプロテアーゼ基質ゲルにて評価した。各ゲルは半分に切断した。半分は 例２に記載された方法によって処理され、もう半分は全ての培養緩衝剤中にプロ テアーゼ阻害剤を含んでいた。以下の阻害剤を評価した。 （ａ）セリンプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ（ボーリンジャーマンヘイム、イン ディアナポリス、イーエヌ（Boehringer Manheim，Indianapolis，IN）より入手 可能）を最終濃度１ｍＭにて用いた。 （ｂ）セリンプロテアーゼ阻害剤である大豆トリプシン阻害剤（シグマより入手 可能）を最終濃度１００μｇ／ｍｌ（ミリリットル）にて用いた。 （ｃ）システイン及びセリンプロテアーゼ阻害剤ロイペプチン（シグマより入手 可能）を最終濃度１０μｇ／ｍｌにて用いた。 （ｄ）アミノペプチダーゼ阻害剤ベスタチン（シグマより入手可能）を最終濃度 ０．２５ｍＭにて用いた。 （ｅ）メタロプロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡ（シグマより入手可能）を最終濃度２ ｍＭにて用いた。 （ｆ）システインプロテアーゼＥ−６４（シグマより入手可能）を最終濃度１０ μｇ／ｍｌにて用いた。 本アッセイの感受性にて何らかの効果を示した阻害剤は、ＡＥＢＳＦ、大豆ト リプシン阻害剤及びロイペプチンのみであった。セリンプロテアーゼが評価され た中腸試料に存在する唯一のプロテアーゼではないとすれば、セリンプロテアー ゼは優勢なプロテアーゼであると判断された。図２に、ＡＥＢＳＦを含む（レー ン３、４）及び含まない（レーン１、２）、飼料摂取（レーン２、４）及び絶食 （レーン１、３）中腸試料におけるプロテアーゼ基質ゲルを示す。阻害剤レーン における残留活性は、電気泳動中及び培養緩衝剤中での阻害剤によるゲルの飽和 前に生じたタンパク分解活性によるものであり得る。例４ 本例では、本発明の溶解性ノミ中腸試料に含まれるプロテアーゼ活性を評価す る。 飼料摂取雌雄ノミ中腸を、米国特許第５，３５６，６２２号に記載されている 方法に従って処理した。この手順におけるいくつかのステップのアリコートを、 例２にて記載したように、プロテアーゼ基質ゲル１レーン当たり０．４匹に相当 する中腸を加えることにより評価した。その結果を図３に示す。試料は、低速上 清（レーン２、９）、音波処理された中腸（レーン３、１０）、高速上清（レー ン４、１１）、低速及び高速上清の組み合わせ（ＦＧＳ）（レーン５、１２）及 び高速ペレット（レーン６、１３）であった。レーン７、８は対照例として、５ ０ナノグラム（ｎｇ）のトリプシンを含んでいた。二組のレーンを評価した。ゲ ルを半分に切断し、レーン１−７を例２に記載した方法に従い処理し、レーン８ −１４を全て培養緩衝剤中の１００μｇ／ｍｌ大豆トリプシンによって処理した 。 全試料にプロテアーゼ活性が見られ、ＦＧＳレーン（レーン５）にて最も高い 活性が見られた。また活性の大部分は、セリンプロテアーゼ阻害剤である大豆ト リプシン阻害剤によって阻害された。例５ 本例では、ノミに血液を摂取させた後にノミ中腸プロテアーゼ活性が増加する ことを実証する。 １５分間、イヌによってノミに飼料を摂取させた。飼料摂取後、複数の時間間 隔毎に、２つの中腸を切除して直接試料緩衝剤に溶解させ、例２に記載したよう にプロテアーゼ基質ゲル分析によって、プロテアーゼを評価した。図４に、血液 摂取完了後３０分経過時（レーン１）、１時間経過時（レーン２）、２時間経過 時（レーン３）、４時間経過時（レーン４）、６時間経過時（レーン５）、８時 間経過時（レーン６）、２４時間経過時（レーン７）及び５６時間経過時（レー ン８）における中腸プロテアーゼ活性を示すゲルを示す。 タンパク分解活性の増加は飼料摂取後２時間経過時（レーン３）に最初に観察 されたが、４時間経過時（レーン４）に、これを大幅に上回る活性が認められた 。このような活性の増加は、飼料摂取後５６時間経過時（レーン８）にもなお認 められた。例６ 本例では、ウェイド（Wade）らにより記載されたノミ飼料供給装置を用いて、 複数のプロテアーゼ阻害剤がノミの生存率及び繁殖能力に及ぼす影響を評価する 。 以下のプロテアーゼ阻害剤を、以下に記載するような血液飼料中最終濃度にて 試験した。 （ａ）１．３ｍＭ及び１３ｍＭにおけるアミノペプチダーゼ阻害剤ベスタチン。 （ｂ）１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌにおけるアスパラギン酸プロテアーゼ阻 害剤ペプスタチンＡ。 （ｃ）１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌにおけるシステインプロテアーゼ阻害剤 Ｅ−６４。 （ｄ）１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌにおけるメタロプロテアーゼ阻害剤 ホスホラミドン。 （ｅ）以下のセリンプロテアーゼ阻害剤。 ・０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、５．０ｍＭ、６．０ｍＭにおけるＡＥＢＳＦ。 ・２μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌにおけるアプロチニン。 ・５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌにおけるロイペプチン。 ・１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌにおける大豆トリプシン阻害剤。 ・１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌにおける大豆トリプシン／キモトリプ シン阻害剤。 ＡＥＢＳＦはボーリンジャーマンヘイムより入手可能である。列挙されている その他の阻害剤は全てシグマより入手可能である。 プロテアーゼ阻害剤化合物を、適切な対照群を含む３〜６群にて試験した。阻 害剤は共通阻害型別の群ではなく、それらを溶解させるために必要な希釈剤別の 群にて試験された。（ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、 ホスホラミドン、大豆トリプシン阻害剤及び大豆トリプシン／キモトリプシン阻 害剤を水に溶解し、Ｅ−６４及びペプスタチンをエタノールに溶解した。）これ により、各アッセイにおける対照群（希釈剤のみ）の数が減少した。阻害剤の濃 度は、低い方の濃度が阻害剤供給者により推奨される範囲内にあるように選択さ れた。高い方の濃度は通常低い方の濃度の１０倍であり、用量−反応を調べるた めに用いられた。 全アッセイにおける一般的なプロトコールは以下の通りである。約２０００匹 の羽化直後ノミ成虫を複数の飼料供給チャンバに配置し、約２４〜４８時間正常 血液を摂取させた。以下の２つの理由からノミに予め飼料を摂取させた。第１の 理由は、供給装置にて飼料を与えられるノミのみが対照試験に用いられるよう保 証するためであり、第２の理由は、通常、飼料供給開始後３日目から、雌ノミに よる最大の１日当たり産卵数が認められることから、雌ノミを産卵のために活性 化するためである。 各チャンバに合計約１００匹のノミ中約８０匹の雌ノミと約２０匹の雄ノミの 割合で、予め飼料摂取ノミを「ミニフィーダ」飼料供給チャンバに配置した。各 チャンバに配置されたノミの実際の総数は約９０〜１２５匹の範囲内にあった。 過去の試験では、ノミ成虫の生存率及び繁殖能力において、１つのチャンバに配 置されるノミの数における同様のばらつきに基づく差異は全く認められなかった 。試験群及び対照群のそれぞれに、３つのチャンバを調製した。アッセイ期間で ある７日間、総容量３ｍｌ中に適切な阻害剤を含む新鮮血飼料を１日１回各チャ ンバに配置した。 アッセイの３、５及び７日経過時に、生存しているノミ成虫を清潔なチャンバ に移した。もとのチャンバにおける含有物を、５０ｍｌファルコン（Falcon）管 内にて約４０ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解させた。次に所定の 管の含有物を、真空フィルターに挿入され予め計量された＃１ファットマンフィ ルターディスク（Whatman filter disk）にて濾過した。５０ｍｌ管及びフィル ター漏斗を蒸留水で洗浄し、次に蒸留水をフィルターにて濾過した。チャンバの 含有物の濾過後、死亡したノミ成虫を濾紙から除去し、計数及び性別判定のため にラベル表示された管に入れた。次に濾紙を予め計量した１２ｘ７５ポリプロピ レン管に入れ、ヒーターをオンにしてスピードヴァック（SpeedVac）にて２．５ 時間乾燥した。乾燥後、濾紙を計量した。濾紙及び管の重量を減算して卵の乾燥 重量を求め、この数値をｙ＝４１３８４．３６１ｘ＋１６２．３７、ｘ＝卵の乾 燥重量という式を用いて卵の概算値に変換した。 ７日経過時に、試験期間中生存していたノミ成虫を冷凍し、計数及び性別判定 を行った。その数をアッセイ期間中に死亡した雄雌ノミの数に加算して、試験開 始時における各チャンバの雄雌ノミの数を確認した。 各アッセイの３、５及び７日経過時における全試験群及び全対照群について、 ノミ成虫の雌雄別及び総計の生存率を算出した。更に、３、５及び７日経過時に おける生存雌一匹当たり産卵数を算出した。所定の回収日に死亡が確認された雌 ノミは、前回の回収日から死亡確認日までの期間、産卵雌の総数に含めて、繁殖 能力における内輪の評価を行った。繁殖能力数値の平均を３回の回収日毎に算出 し、７日間における各群の平均値を求めた。 以下の表１、及び図６〜９にこれらの試験結果を示す。生存率及び繁殖能力数 値は全て、対照値のパーセンテージとして表す。 アミノペプチダーゼ阻害剤ベスタチンにより、１３ｍＭ（７７％低下）及び１ ．３ｍＭ（４０％低下）にて有意な繁殖能力低下（ｐ＜０．０５）が生じ、ノミ 中腸にはアミノペプチダーゼまたはその他のエキソペプチダーゼが存在すること が示された。しかしながらベスタチンは、試験を行った濃度ではいずれの濃度に おいても、成虫生存率に対して有意な影響を及ぼさなかった。これらの結果から アミノペプチダーゼは、卵巣機能または卵黄形成等これに関連する機能において 、１つの役割を担っている可能性があることが示唆される。 アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤ペプスタチンＡにより、１μｇ／ｍｌでは 繁殖能力における有意な低下（ｐ＜０．０５）が生じた（３２％低下）が、１０ μｇ／ｍｌでは生じなかった。ペプスタチンＡはいずれの濃度においても、成虫 生存率に対して有意な影響を示さなかった。 このアッセイでは、システインプロテアーゼ阻害剤Ｅ−６４によって、繁殖能 力の統計的に有意な低下は示されなかった。Ｅ−６４が酒精に溶解され、１μｇ ／ｍｌにて血液に添加されたとき、ノミ成虫総生存率における微小ではあるが有 意な低下（ｐ＜０．０５）が示された。しかしながら、１０μｇ／ｍｌの酒精内 Ｅ−６４を含む血液を与えられた群では、この低下は明かではなかった。 メタロプロテアーゼ阻害剤ホスホラミドンにより、成虫生存率における約３０ ％の低下が生じたが、統計的に有意ではなかった。繁殖能力においては有意な低 下はなかった。 セリンプロテアーゼ阻害剤を用いての結果は特に興味深く、ノミ中腸における セリンプロテアーゼの有意性を示唆していた。約５ｍＭから約６ｍＭまでの範囲 にある濃度にて投与されたＡＥＢＳＦにより、ノミ繁殖能力は８０％以上低下し た。更に、成虫生存率はほぼゼロになるまで減少した（ｐ＜０．０５）。 しかしながら、アプロチニンは繁殖能力または生存率のいずれに対しても有意 な効果を示さなかった。これは恐らくアルブミン等の血清タンパクは、アプロチ ニンの阻害活性を抑制することが可能であるためであろう。 ロイペプチンはいずれの濃度においても繁殖能力に影響を及ぼさなかったが、 ５μｇ／ｍｌでは成虫生存率を３０％低下させた。しかしながら、５０μｇ／ｍ ｌのロイペプチンよっては成虫生存率は影響を受けず、認められた低下はいずれ も統計的に有意ではなかった。 大豆トリプシン阻害剤により、１００μｇ／ｍｌにて、繁殖能力における統計 的に非有意な微小な低下（２０％）が生じた。低い方の濃度では何の影響もなか った。一方、大豆トリプシン阻害剤は、例のうちのいくつかにおいて開示されて いるように、インビトロの試験では非常に有効であり、例７において開示するよ うにセリンプロテアーゼを精製するために用いられた。大豆トリプシン／キモト リプシン阻害剤は、成虫生存率または繁殖能力のいずれにおいても、いかなる影 響も示さなかった。例７ 本例では、本発明における好適な溶解性ノミ中腸試料の調製と、同試料からの ノミセリンプロテアーゼ精製とを記載する。また、本発明のノミセリンプロテア ーゼにおけるアミノ酸配列分析を記載する。 溶解性ノミ中腸試料を以下のように調製した。飼料摂取雌雄混合ノミから採取 したノミ中腸（３，７３５）を、１．５ｍｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５から成る均質化緩衝剤にて均質化した。ホモジネート を１４，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。その結果得られたペレットを、更 に緩衝剤１．５ｍｌ中で再度均質化処理した。２つの上清溶液を一緒にして溶解 性ノミ中腸試料を調製した。 試料を３ｍｌのｐ−アミノベンズアミジン−セファロース６Ｂ（トリプシン様 プロテアーゼのためのアフィニティーマトリックス、シグマより入手可能）に加 え、５℃にてロッカー上で一晩培養した。セファロースビーズを採取し、７．５ ｍｌの均質化緩衝剤にて洗浄した。吸着したタンパクを、同緩衝剤中の０．１Ｍ ｐ−アミノベンズアミジン５ｍｌによって溶出させた。この溶出液を凝縮し、 ３ｋＤカットオフの膜による限外濾過によって、緩衝剤を５０ｍＭトリス−ＨＣ ｌ ｐＨ８．５、０．１ｍｌ ＣａＣｌ₂に交換した。最終容量は１４０μｌ（ マイクロリットル）であった。 １０μｌの（1,3−³Ｈ）−ジイソプロピルフルオロリン酸（ニューイングラン ドニュークリアー、ビヴァリー、エムエイ（New England Nuclear，Beverly，MA ）から入手可能、６．０Ｃｉ（キュリー）／ミリモル、１．０ｍＣｉ／ｍｌ）を 、９０μｌのアフィニティ精製されたタンパクに添加し、５℃で１８時間培養す ることによってタンパク標識を行った。反応産物を半分に分け、次にそれぞれを 以下のプロトコールに従い、Ｃ４逆相クロマログラフィーにて単離した。 緩衝剤Ａ：０．１％ ＴＦＡ水溶液 緩衝剤Ｂ：０．０８５％ ＴＦＡ、９０％ アセトニトリル ０．８ｍｌ／ｍｎ、２２０ｎｍ、１分間分画 ５．６％ Ｂ １５分間 ５．６％から１００％ Ｂ ６０分間以上 １０マイクロリットルの各分画をシンチレーション液に加え計数した。タンパク に関連するカウントの大部分は分画４４〜４７に認められた。１４％トリスーグ リシン ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルによるクロマトグラフィーを１回行い 、次にクーマシー染色を行って得られた分画４０（レーン２）、４４（レーン３ ）、４６（レーン４）及び４７（レーン５）の電気泳動を図５Ａに示す。その後 、図５Ｂに示すように、ゲルをエンテンシジー（Entensigy）（ＮＥＮ）により 処理し、１８時間フィルムに曝露した。図５Ａに示すように、各分画はいくらか のタンパクを含んでいたが、４バンドのみが標識されており、最も優勢であった のは、本明細書でＰｆＳＰ２６として記載される２６ｋｄ（レーン３、４及び５ ）であった。また、本明細書でＰｆＳＰ２４として記載される２４ｋｄのかすか なバンドは、レーン５に認められる。本明細書でＰｆＳＰ１９として記載される １９ｋｄのバンドは、ごくかすかに染色されたタンパクのバンドを伴うレーン４ に標識された。レーン４及び５の色素の前部にはいくらかの標識されたタンパク が認められ、本明細書でＰｆＳＰ６として記載される６ｋｄ未満の分子量を示し ている。 これらは分解産物であり得る。 第２回目のＣ４クロマトグラフィー分離試験から得られた分画４４（レーン３ に相似）を電気泳動させ、ＰＶＤＦ上にブロットし、クーマシーＲ−２５０によ り染色して、標準的な手順によって脱色した。ＰｆＳＰ２６に対応する２６ｋｄ のバンド（本明細書ではＰｆＳＰ４４−Ｅとして記載され、タンパクを溶出した 分画と、タンパクを除去したゲル／フィルターバンドを示す）を除去し、当該分 野の技術者に周知の技術を用いてＮ−末端アミノ酸配列決定を行った。約３２の アミノ酸における部分的なＮ−末端アミノ酸配列を推定し、本明細書で配列識別 番号１： Ｉ Ｉ Ｇ Ｇ Ｅ Ｖ Ａ Ｇ Ｅ Ｇ Ｓ Ａ Ｐ Ｙ Ｑ Ｖ Ｓ Ｌ Ｒ Ｔ Ｋ Ｅ Ｇ Ｎ Ｈ Ｆ Ｓ Ｇ Ｇ Ｓ Ｉ Ｌ として記載する。アミノ酸配列決定技術において過誤は完全に防止されるわけで はないので、配列識別番号：１はＰｆＳＰ２６における見かけ上の部分的なＮ− 末端アミノ酸配列に過ぎないことに留意されたい。このように留意することは、 このタンパクの配列決定は低ピコモル濃度にて行われたことを考慮すると、特に 重要である。 国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）にて、ＢＬＡＳＴネットワークを用いて非重複タンパク配列デー タベースの相同性調査を行った。このデータベースは+SwissProt + PIR +SPUpda te + GenPept +GPUpdate.ole levelを含む。調査の結果から、ＰｆＳＰ２６のＮ −末端は、種々のトリプシン、キモトリプシン及びプラスミンを含む複数のセリ ンプロテアーゼと、顕著なアミノ酸配列相同性を有することが示される。ＰｆＳ Ｐ２６における３２−アミノ酸Ｎ−末端アミノ酸配列は、スズメバチキモトリプ シンＩＩと最高の相同性を有していた。例８ 本例では、本発明における所定のノミプロテアーゼ核酸分子のクローニングを 記載する。また、本例では、本発明における所定の組換え分子、組換え細胞及び ノミプロテアーゼタンパクの合成を記載する。 約２５０〜約５００のヌクレオチドまでの範囲のサイズを有し、１つ以上の部 分的なノミセリンプロテアーゼ遺伝子を示すいくつかのノミセリンプロテアーゼ 核酸分子を、サムブルック（Sambrook）らにより記載された標準的なプロトコー ルを用いて、飼料摂取ノミ中腸から単離したＲＮＡより調製した飼料摂取ノミ中 腸ｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅反応においては、咬み 型昆虫（biting insect）（例えばカ及びブユ）より単離された発表されている セリンプロテアーゼ遺伝子配列から設計された縮重オリゴヌクレオチドを示す複 数対のプライマーが用いられた。トリプシンプロテアーゼ遺伝子における最も保 存されたドメイン（活性が高いと考えられるサイト）に対応するドメインがノミ セリンプロテアーゼ遺伝子に含まれていると仮定して、各プライマー対は、適切 に増幅されたノミセリンプロテアーゼ遺伝子フラグメントがこのようなドメイン を含むように設計されている。 増幅されたＰＣＲフラグメントは、用いられたプライマー対に応じて、約２５ ０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドまでの範囲の予測された大きさを有し ていた。全ての周知のトリプシン遺伝子の中で最も保存されているドメインから 設計されたプローブにハイブリッド形成されたＰＣＲフラグメントをゲル精製し 、例えば、ｐＣＲＩＩクローニングベクター（インヴィトロージェン、コープ． ，サンディエゴ、シーエイ（InVitrogen，Corp.，San Diego，CA）から入手可能 ）に、製造者の指示に従いクローン化した。フラグメントの核酸配列は標準的な 技術を用いて決定中である。 また、絶食ノミ及び飼料摂取ノミの中腸ｃＤＮＡライブラリーと、ノミ唾液腺 ｃＤＮＡライブラリーと、ノミゲノムＤＮＡライブラリーとにおいて、標準的な 手順を用いて完全な長さのノミプロテアーゼ遺伝子を同定するために、増幅され たＰＣＲフラグメントはプローブとして用いられている。 増幅ＰＣＲフラグメント及び完全な長さのノミプロテアーゼ遺伝子を含む組換 え分子及び組換え細胞を標準的な手順を用いて作製中である。このような組換え 細胞の培養により、本発明のノミプロテアーゼタンパクが合成される。例９ 本例では、本発明におけるノミプロテアーゼワクチンとしてのノミプロテアー ゼタンパクの試験を記載する。同試験は、動物への投与において、ノミプロテア ーゼ活性を低下させ、それによりノミ生存率及び／または繁殖能力を低下させる ような抗体の産生を誘起するノミプロテアーゼタンパクの能力を調べるためのも のである。また、本例では、このようなノミプロテアーゼタンパクをワクチンと してイヌに投与して次にノミを寄生させることによって、その有用性を実証する 。 例７に記載の方法によって合成されたノミプロテアーゼタンパクを、適切な追 加免疫注射を含む当業者に周知の標準的免疫プロトコールに従ってウサギに投与 する。類似のプロトコールに従って、前述のタンパクをモルモット及びイヌにも 投与する。 処置されたウサギから血清を採取し、抗ノミプロテアーゼ抗体が含まれている ことを確認する。次に、ウェイドらによって報告された飼料供給装置に配置され たノミに、この血清を飼料として摂取させる。ノミプロテアーゼタンパクを投与 されていないウサギから採取された血清を摂取させたノミと比較して、この血清 を摂取させたノミ生存率は減少する。処置されたモルモット及びイヌから採取さ れた血清も、類似の方法で証明する。 次に、ノミプロテアーゼタンパクを投与されたイヌと、ノミプロテアーゼタン パクを投与されていないイヌとに、ノミを寄生させる。ノミプロテアーゼタンパ クを投与されたイヌでは、係る投与が行われていないイヌと比較して、ノミ負荷 の有意な減少が示される。例１０ 本例では、本発明における更なるノミセリンプロテアーゼタンパクの部分的な Ｎ−末端アミノ酸配列決定を記載する。 別の８つのノミセリンプロテアーゼを精製し、部分的な共通Ｎ−末端アミノ酸 配列を例７に記載した方法によって決定した。結果は以下の通りである。ここで 、タンパクが溶出された分画と、タンパクが除去されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルバ ンドとによって、タンパクは命名されている。プロテアーゼは、それぞれ、周知 のプロテアーゼに対して少なくともいくらかの配列相同性を有し、同一性におい て最も高いパーセンテージは３０〜４０％に過ぎないと評価された。 ノミプロテアーゼＰｆＳＰ４５−Ｃは、本明細書にて配列識別番号２として記 載されているＸ Ｖ Ｇ Ｇ Ｈ Ｄ Ｔ Ｓ Ｉ Ｄ Ｘ Ｈ Ｐ Ｈ Ｑ Ｖ Ｔという部分 的なＮ−末端アミノ酸配列を有していた。ＰｆＳＰ４５−Ｃは、アミノ酸配列に おいてミバエのトリプシンエプシロンに最も類似していた。 ノミプロテアーゼＰｆＳＰ４６−Ｃは、本明細書にて配列識別番号３として記 載されているＩ Ｖ Ｇ Ｇ Ａ Ｄ Ａ Ａ Ｐ Ｇ Ｎ Ａ Ｐ Ｆ Ｑ Ｖ Ｓ Ｌ Ｒ Ｄ Ｋ Ｇという部分的なＮ−末端アミノ酸配列を有していた。ＰｆＳＰ４６−Ｃは 、アミノ酸配列において、カムチャッカカニから採取されたコラーゲン分解性３ ６ｋＤプロテアーゼに最も類似していた。 ノミプロテアーゼＰｆＳＰ４６−Ａは、本明細書にて配列識別番号４として記 載されているＩ Ｖ Ｇ Ｇ Ｑ Ｄ Ａ Ｄ Ｉ Ａ Ｋ Ｙ Ｇ Ｙ Ｑ Ａ Ｓ Ｌ Ｑ Ｖ Ｆ Ｎ Ｅ Ｈ Ｆ Ｘ Ｇ Ａ Ｘ Ｉ Ｌ Ｎ Ｎ Ｙという部分的なＮ−末端アミノ酸 配列を有していた。ＰｆＳＰ４６−Ａは、アミノ酸配列においてスズメバチのキ モトリプシンＩＩに最も類似していた。 ノミプロテアーゼＰｆＳＰ４６−Ｂは、本明細書にて配列識別番号５として記 載されているＩ Ｖ Ｇ Ｇ Ｔ Ｄ Ｖ Ｎ Ｉ Ｅ Ｎ Ｆ Ｇ Ｗ Ｑ Ｖ Ｓ Ｌ Ｆ Ｄ Ｒ Ｎ Ｇ Ｈ Ｆという部分的なＮ−末端アミノ酸配列を有していた。ＰｆＳＰ４ ６−Ｂは、アミノ酸配列においてミバエのトリプシンベータに最も類似していた 。 ノミプロテアーゼＰｆＳＰ４８−Ａは、本明細書にて配列識別番号６として記 載されているＩ Ｖ Ｇ Ｇ Ｈ Ｄ Ｔ Ｓ Ｉ Ｄ Ｋ Ｈ Ｐ Ｆ Ｑ Ｖ Ｓ Ｌ Ｉ Ｄ Ｋ Ｎという部分的なＮ−末端アミノ酸配列を有していた。ＰｆＳＰ４８−Ａは 、アミノ酸配列においてミバエのトリプシンエプシロンに最も類似していた。 ノミプロテアーゼＰｆＳＰ４８−Ｂは、本明細書にて配列識別番号７として記 載されているＶ Ｖ Ｇ Ｇ Ｌ Ｅ Ａ Ａ Ｅ Ｇ Ｓ Ａ Ｐ Ｙ Ｑ Ｖ Ｘ Ｌ Ｑ Ｗ Ｇ Ｎ Ｆという部分的なＮ−末端アミノ酸配列を有していた。ＰｆＳＰ４８−Ｂ は、アミノ酸配列においてヒトファクター１２に最も類似していた。 ノミプロテアーゼＰｆＳＰ４８−Ｄは、本明細書にて配列識別番号８として記 載されているＩ Ｖ Ｇ Ｇ Ｅ Ｄ Ａ Ｅ Ｌ Ｇ Ｅ Ｘ Ｐ Ｔ Ｑという部分的なＮ −末端アミノ酸配列を有していた。ＰｆＳＰ４８−Ｄは、アミノ酸配列において ウシファクター９に最も類似していた。 ノミプロテアーゼＰｆＳＰ４０−Ｂは、本明細書にて配列識別番号９として記 載されているＤ Ｅ Ｄ Ｇ Ｋ Ｄ Ｄ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｅ Ｉという部分的なＮ−末端 アミノ酸配列を有していた。ＰｆＳＰ４０−Ｂは、アミノ酸配列においてミバエ のフリン様プロテアーゼＩに最も類似していた。例１１ 本例では、本発明におけるノミセリンプロテアーゼタンパクをコードする核酸 分子の単離を記載する。 いくつかの中腸プロテアーゼｃＤＮＡ遺伝子を、例８に記載した方法に類似し た方法に従って、２つの縮重プライマーによって単離した。これらのプライマー は、複数の周知のセリンプロテアーゼにおける成熟アミノ末端から約１９５番目 のアミノ酸残基（平均的なプロテアーゼの大きさである約２４０の残基に基づく ）に位置する高度に保存されたセリンプロテアーゼアミノ酸配列（Ｃ Ｑ／Ｎ Ｇ Ｄ Ｓ Ｇ Ｇ Ｐ Ｌ、配列識別番号１０として記載されている）に基づき設計さ れた。ＰＣＲ増幅反応にて用いられる相補的プライマーは、本発明の核酸分子が 結合されたベクターに対応するプライマーであった。飼料摂取全ノミｃＤＮＡ発 現ライブラリー（例８に記載された方法に従って作製されたもの）からのセリ ンプロテアーゼ核酸分子のＰＣＲ増幅に実際に用いられたプライマーは、以下の セリンプロテアーゼ特異プライマーを含んでいた。即ち、本明細書にて配列識別 番号１１として記載される核酸配列 5' TAA WGG WCC WCC YGA ATC TCC CTG GCA 3'（YはCまたはTを示し、WはAまたはTを示す）を有するキャットートライ＃１と 、本明細書にて配列識別番号１２として記載される核酸配列 5' TAA WGG WCC AG A RTC TCC TTG ACA 3'（RはAまたはGを示す）を有するキャットートライ＃２と である。ベクター特異プライマーは、本明細書にて配列識別番号１３として記載 される核酸配列 5' GGAAACAGCTATGACCATG 3'を有するＭ１３リバースと、本明細 書にて配列識別番号１４として記載される核酸配列 5'ATTAACCCTCACTAAAG 3'を 有するＴ３プライマーとを含んでいた。標準的なＰＣＲの条件（例えば、サムブ ルックら記載の条件）を用いて、結果的に得られたＰＣＲ産物は、約６００から 約７００個のヌクレオチド長さを有していた。 ＰＣＲ産物は、標準ハイブリッド形成条件（例えば、サムブルックら記載の条 件）下にて、Ｈ５７という名称の内部合成ヌクレオチドプローブによって（即ち 、同プローブに）ハイブリッド形成された。Ｈ５７の配列は、周知のセリンプロ テアーゼにおける保存されたヒスチジン残基を有する領域に対応する。Ｈ５７の 核酸配列は、本明細書にて配列識別番号１５として記載される5' TGG GTW GTW A CW GCW GCW CAT TG 3'である。このプローブに対して強力にハイブリッド形成さ れたＰＣＲ産物はゲル精製され、ＴＡベクター^TM（インヴィトロージェン、コー プ．より入手可能）にクローン化された。約８０の組換えＴＡベクタークローン が単離された。同じセリンプロテアーゼクローンの反復配列を防止するため、酵 素ＨａｅＩＩ及びＨａｅＩＩＩによって、非反復制限エンドヌクレアーゼパター ンを有するクローンを識別すべく複数のクローンを特徴付けた。見かけ上、約６ ００から約７００のヌクレオチド長さを有する非反復ノミセリンプロテアーゼ核 酸分子を含む約１１のプラスミドを、この手順によって単離した。これらの核酸 分子において、サムブルックらによって記載されたサンジャー（Sanger）のジデ オキシ鎖終結方法による配列決定を実施した。 ノミセリンプロテアーゼ核酸分子のうちの１つ、即ちｎｆＳＰ４₆₇₂における 完全な核酸配列は、本明細書では配列識別番号１６として記載される。配列識別 番号１６の翻訳によって、アミノ酸配列識別番号１７を有し、ＰｆＳＰ４₂₂₃と して記載され約２２３のアミノ酸を有するタンパクが合成された。ＰｆＳＰ４_{22 3} のアミノ酸配列全体は、周知のセリンプロテアーゼのアミノ酸配列に高度に保 存されないが、以下のような留意すべきいくつかの保存領域（配列識別番号１７ において番号を付す）がある。即ち、（ａ）ほぼアミノ酸５からほぼアミノ酸９ までの配列ＩＶＧＧ、（ｂ）ほぼアミノ酸４６に位置し、ほぼアミノ酸４１から ほぼアミノ酸４７までの配列を包囲する活性部位ヒスチジン、（ｃ）ほぼアミノ 酸９０における保存アスパラギン酸残基、（ｄ）ほぼアミノ酸１２４からほぼア ミノ酸１２６までのＧＷＧ配列、ほぼアミノ酸１５２とほぼアミノ酸１６５に位 置する保存システイン、ほぼアミノ酸１７４からほぼアミノ酸１８２までの、活 性部位セリンを包囲する保存配列。 １１個のノミセリンプロテアーゼ核酸分子の全てにおける核酸配列及びアミノ 酸配列について、周知のセリンプロテアーゼにおける保存ＧＷＧ配列から保存Ｃ ＸＧＤＳＧＧＰ配列（配列識別番号１０）までの領域に対応する領域を決定した 。ノミ核酸分子ｎｆＳＰ１₁₅₆は、本明細書にて配列識別番号１８として記載さ れる核酸配列を有し、同核酸配列は、本明細書にて配列識別番号１９として記載 されるアミノ酸配列を有するタンパクＰｆＳＰ１₅₂をコードする。ノミ核酸分子 ｎｆＳＰ２₁₆₈は、本明細書にて配列識別番号２０として記載される核酸配列を 有し、同核酸配列は、本明細書にて配列識別番号２１として記載されるアミノ酸 配列を有するタンパクＰｆＳＰ２₅₆をコードする。ノミ核酸分子ｎｆＳＰ３₁₇₇ は、本明細書にて配列識別番号２２として記載される核酸配列を有し、同核酸配 列は、本明細書にて配列識別番号２３として記載されるアミノ酸配列を有するタ ンパクＰｆＳＰ３₅₉をコードする。ノミ核酸分子ｎｆＳＰ４₁₅₆は、本明細書に て配列識別番号２４として記載される核酸配列を有し、同核酸配列は、本明細書 にて配列識別番号２５として記載されるアミノ酸配列を有するタンパクＰｆＳＰ ４₅₂をコー ドする。ノミ核酸分子ｎｆＳＰ５₁₅₉は本明細書にて配列識別番号２６として記 載される核酸配列を有し、同核酸配列は、本明細書にて配列識別番号２７として 記載されるアミノ酸配列を有するタンパクＰｆＳＰ５₅₃をコードする。ノミ核酸 分子ｎｆＳＰ６₁₆₈は、本明細書にて配列識別番号２８として記載される核酸配 列を有し、同核酸配列は、本明細書にて配列識別番号２９として記載されるアミ ノ酸配列を有するタンパクＰｆＳＰ６₅₆をコードする。ノミ核酸分子ｎｆＳＰ７₁₅₉ は、本明細書にて配列識別番号３０として記載される核酸配列を有し、同核 酸配列は、本明細書にて配列識別番号３１として記載されるアミノ酸配列を有す るタンパクＰｆＳＰ７₅₃をコードする。ノミ核酸分子ｎｆＳＰ８₁₈₆は、本明細 書にて配列識別番号３２として記載される核酸配列を有し、同核酸配列は、本明 細書にて配列識別番号３３として記載されるアミノ酸配列を有するタンパクＰｆ ＳＰ８₆₂をコードする。ノミ核酸分子ｎｆＳＰ９₁₆₈は、本明細書にて配列識別 番号３４として記載される核酸配列を有し、同核酸配列は、本明細書にて配列識 別番号３５として記載されるアミノ酸配列を有するタンパクＰｆＳＰ９₅₆をコー ドする。ノミ核酸分子ｎｆＳＰ１０₁₂₀は、本明細書にて配列識別番号３６とし て記載される核酸配列を有し、同核酸配列は、本明細書にて配列識別番号３７と して記載されるアミノ酸配列を有するタンパクＰｆＳＰ１０₄₀をコードする。ノ ミ核酸分子ｎｆＳＰ１１₁₆₂は、本明細書にて配列識別番号３８として記載され る核酸配列を有し、同核酸配列は、本明細書にて配列識別番号３９として記載さ れるアミノ酸配列を有するタンパクＰｆＳＰ１１₅₄をコードする。 ノミセリンプロテアーゼ核酸配列及びカ（ネッタイシマカ）のトリプシン核酸 配列を比較すると、カのトリプシンにおける対応する領域に対して、配列識別番 号１８は約３３％同一であり、配列識別番号２０は約３３％同一であり、配列識 別番号２２は約２４％同一であり、配列識別番号２４は約２５％同一であり、配 列識別番号２６は約３２％同一であり、配列識別番号２８は約３８％同一であり 、配列識別番号３０は約３３％同一であり、配列識別番号３２は約３３％同一で あり、配列識別番号３４は約４０％同一であり、配列識別番号３６は約３３％同 一 であり、配列識別番号３８は約２９％同一である。ノミセリンプロテアーゼ核酸 配列及びブユ（S.Vittatum）のトリプシン核酸配列を比較すると、ブユトリプシ ンにおける対応する領域に対して、配列識別番号１８は約３４％同一であり、配 列識別番号２０は約３４％同一であり、配列識別番号２２は約２５％同一であり 、配列識別番号２４は約２８％同一であり、配列識別番号２６は約３６％同一で あり、配列識別番号２８は約４５％同一であり、配列識別番号３０は約２９％同 一であり、配列識別番号３２は約３６％同一であり、配列識別番号３４は約４２ ％同一であり、配列識別番号３６は約３４％同一であり、配列識別番号３８は約 ３０％同一である。同じ領域について、カ及びブユのトリプシンは約５０％同一 であることに留意されたい。 ノミセリンプロテアーゼアミノ酸配列及びカ（ネッタイシマカ）のトリプシン アミノ酸配列を比較すると、カのトリプシンにおける対応する領域に対して、配 列識別番号１９は約１１％同一であり、配列識別番号２１は約３０％同一であり 、配列識別番号２３は約１９％同一であり、配列識別番号２５は約１９％同一で あり、配列識別番号２７は約２８％同一であり、配列識別番号２９は約２１％同 一であり、配列識別番号３１は約１４％同一であり、配列識別番号３３は約２２ ％同一であり、配列識別番号３５は約３０％同一であり、配列識別番号３７は約 ２２％同一であり、配列識別番号３９は約２９％同一である。ノミセリンプロテ アーゼアミノ酸配列及びブユトリプシンアミノ酸配列を比較すると、ブユトリプ シンにおける対応する領域に対して、配列識別番号１９は約１４％同一であり、 配列識別番号２１は約２８％同一であり、配列識別番号２３は約１６％同一であ り、配列識別番号２５は約１７％同一であり、配列識別番号２７は約３５％同一 であり、配列識別番号２９は約３３％同一であり、配列識別番号３１は約１１％ 同一であり、配列識別番号３３は約２２％同一であり、配列識別番号３５は約３ ３％同一であり、配列識別番号３７は約２１％同一であり、配列識別番号３９は 約２５％同一である。同じ領域について、カ及びブユのトリプシンは約５０％同 一であることに留意されたい。 クローン化されたノミセリンプロテアーゼ核酸分子のそれぞれについて、部分 的なＮ−末端アミノ酸配列を推定した。そのうちの４つは例１０に記載されたセ リンプロテアーゼのＮ−末端配列決定から得られた以下のアミノ酸配列と同一で あった。即ち、配列識別番号１、配列識別番号４、配列識別番号６及び配列識別 番号７である。その他の核酸分子は以下の推定されたＮ−末端アミノ酸配列を有 していた。配列識別番号４０、即ちＩ Ｖ Ｇ Ｇ Ｅ Ｎ Ａ Ｋ Ｅ Ｋ Ｓ Ｄ Ｖ Ｐ Ｙ Ｑ Ｖ Ｓ Ｌ Ｒ Ｎ Ａ Ｅ Ｎ Ｋ Ｈ Ｆ Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ｉ Ｉ Ｄ Ｄ Ｙ Ｗ Ｖ Ｌ Ｔ、この配列はダニ糞便アレルゲンＤｅｒ ｐＩＩＩのアミノ酸配列に最 も類似していた; 配列識別番号４１、即ちＩ Ｖ Ｇ Ｇ Ｌ Ｅ Ａ Ｋ Ｎ Ｇ Ｓ Ａ Ｐ Ｆ Ｍ Ｖ Ｓ Ｌ Ｑ Ａ Ｅ Ｄ Ｙ Ｆ Ｈ、この配列はキモトリプシン様タ ンパクのアミノ酸配列に最も類似していた; 配列識別番号４２、即ちＩ Ｉ Ｇ Ｇ Ｅ Ｖ Ａ Ｇ Ｅ Ｇ Ｓ Ａ Ｐ Ｙ Ｑ Ｖ Ｓ Ｌ Ｒ Ｔ Ｋ Ｅ Ｇ Ｎ Ｈ Ｆ、こ の配列はキモトリプシン様タンパクのアミノ酸配列に最も類似していた; 配列 識別番号４３、即ちＩ Ｖ Ｇ Ｇ Ｔ Ａ Ｖ Ｄ Ｉ Ｒ Ｇ Ｆ Ｐ Ｇ Ｒ Ｙ Ｑ Ｆ Ｋ Ｐ Ｋ Ｐ Ｓ Ｆ Ｌ Ｗ Ｗ Ｆ Ｙ、この配列はデータベースにおけるいかなる タンパクとも十分に適合しなかった; 配列識別番号４４、即ちＩ Ｖ Ｎ Ｇ Ｌ Ｅ Ａ Ｇ Ｖ Ｇ Ｑ Ｆ Ｐ Ｉ Ｑ Ｖ Ｆ Ｌ Ｄ Ｌ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｄ Ｅ Ｋ Ｓ Ｒ Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ｌ Ｆ、この配列はトリプシン前駆物質のアミノ酸配列に最も類似 していた; 配列識別番号４５、即ちＩ Ｖ Ｇ Ｇ Ｌ Ｅ Ａ Ｋ Ｎ Ｇ Ｉ Ｔ Ｐ Ｆ Ｉ Ｇ Ｆ Ｆ Ａ Ｓ Ｇ Ｒ Ｌ Ｆ、この配列はキモトリプシン様プロテアーゼ のアミノ酸配列に最も類似していた; 配列識別番号４６、即ちＩ Ｖ Ｇ Ｇ Ｎ Ｄ Ｖ Ｓ Ｘ Ｋ Ｉ Ｆ Ｗ Ｑ Ｖ Ｓ Ｉ Ｑ Ｓ Ｎ Ｘ Ｑ Ｈ Ｆ Ｃ Ｇ、この配列 はトリプシンのアミノ酸配列に最も類似していた; 配列識別番号４７、即ちＩ Ｉ Ｇ Ｇ Ｅ Ｄ Ａ Ｐ Ｅ Ｇ Ｓ Ａ Ｐ Ｙ Ｑ Ｖ Ｓ Ｌ Ｒ Ｎ Ｑ Ｎ Ｌ Ｅ Ｈ Ｆ Ｃ Ｇ Ｇ Ｓ Ｉ、この配列はキモトリプシン様タンパクのアミノ酸配列に最 も類似していた。 前述の配列を有するノミセリンプロテアーゼ核酸分子と、本明細書に記載され た技術によって同定されるその他の核酸分子とにおけるその他のアミノ末端配列 及びカルボキシル末端配列を、表２に示す。 例１２ 本例では、本発明のノミアミノペプチダーゼの精製を記載する。 ノミアミノペプチダーゼ単離のための出発原料は、ベンズアミジン−セファロ ースアフィニティーカラムを通過させることにより、セリンプロテアーゼを除去 したノミ中腸リゼイト試料であった。アミノペプチダーゼ活性をアッセイするた め、蛍光ＡＭＣ脱離基をタンパク分解切断において脱離する合成基質Ｌ−ロイシ ン−ＡＭＣ（Ｌｅｕ−ＡＭＣ）を、セリンプロテアーゼを除去したノミ中腸試料 と培養した。僅か１．２μｇのリゼイトにより、アミノペプチダーゼ活性は容易 に検出可能であり、これにより、アミノペプチダーゼの存在が証明される（本明 細書におけるその他の例にて示されるように）と共に、続いて行われる分画化及 び精製処理を通して回収された分画におけるアミノペプチダーゼ活性の検出が可 能になった。 セリンプロテアーゼを除去したノミ中腸リゼイト（約１．２μｇ及び約１２μ ｇの試料）を、以下の阻害剤の存在下にてＬｅｕ−ＡＭＣと培養した。即ち、１ ｍＭのペファブロック（pefabloc）、１ｍｇ／ｍｌのトリプシン／キモトリプシ ン阻害剤、１ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤、１ｍＭのＴＰＣＫ、１μｇ／ｍｌ のペプスタチン、１０μｇ／ｍｌのＥ−６４、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、 １０ｍＭのＥＤＴＡ、及び８６μｇ／ｍｌのベスタチンである。Ｌｅｕ−ＡＭＣ を切断するノミプロテアーゼを阻害したのはベスタチンのみであったが、ＥＤＴ Λ及びベスタチンはいずれも対照プロテアーゼであるロイシンアミノペプチダー ゼを阻害した。これらの結果から、特徴付けられたノミプロテアーゼはアミノペ プチダーゼではあるが、見かけ上、「古典的」ロイシンアミノペプチダーゼ等の メタロアミノペプチダーゼではないことが示された。 以下のプロトコールによって、ノミアミノペプチダーゼを精製した。セリンプ ロテアーゼ活性を除去したノミ中腸リゼイトを、陰イオン交換クロマトグラフィ ーによって分画化した。アミノペプチダーゼ活性を有する分画をプールして、陽 イオン交換クロマトグラフィーを行った。その結果得られた分画について、９６ −ウェル平板にてＬ−Ｌｅｕ−ＡＭＣにより活性を調べた。 アミノペプチダーゼ活性を有する分画においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色法 を行い、同活性を示すタンパクを同定した。アミノペプチダーゼ活性は、ＳＤＳ −ＰＡＧＥを行ったとき、分子量約９５ｋＤ及び約５６ｋＤにて移動したタンパ クに関連していることがわかった。９５ｋＤ及び５６ｋＤのタンパクは、それぞ れアミノペプチダーゼであるか、より大きい酵素のサブユニットであるかのいず れかであった。複数の周知のアミノペプチダーゼは、約４５ｋＤから約５５ｋＤ までの範囲及び約９０ｋＤから約９５ｋＤまでの範囲のサブユニットから成るマ ルチ−サブユニット酵素である。 更なる精製試験により、アミノペプチダーゼ活性の大部分は膜ペレット試料に 関連していることと、洗浄剤により可溶化されることとが示された。また、この 試料におけるアミノペプチダーゼ活性はＬ−Ｌｅｕ−ＡＭＣによる精製中にもモ ニターされ、活性分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色法により分析したとき、９ ５ｋＤ及び５６ｋＤのタンパクを伴うように見られた。陽イオン交換クロマトグ ラフィー、ｗ−アミノヘキシルアガロースによるアフィニティークロマトグラフ ィー、及びＣ−４逆相クロマトグラフィーによって、９５ｋＤ及び５６ｋＤタン パクを純度９０％以上まで共精製した。Ｎ−末端アミノ酸配列分析により、単離 されたアミノペプチダーゼはいずれもアミノ末端にて遮断されるように見られる ことが示された。例１３ 本例では、本発明におけるノミアミノペプチダーゼ核酸分子の単離を記載する 。 ノミアミノペプチダーゼをコードする核酸分子を、以下の方法により単離した 。飼料摂取全ノミｃＤＮＡ発現ライブラリー（ウシ水晶体ロイシンアミノペプチ ダーゼ（ＬＡＰ）の保存領域に基づき設計された縮重プライマーを用いて、例８ に記載の方法により調製）から、ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。詳細に は、使用されたＬＡＰに基づくプライマーは、以下のものを含む。即ち、ほぼア ミノ 酸２４７からほぼアミノ酸２５７までのウシ水晶体ＬＡＰアミノ酸配列に対応し 、本明細書では配列識別番号４８として記載される核酸配列5' GTW GGW AAA GGW WTW ACW TTY GAT TCW GGW GG 3'を有する縮重ＬＡＰセンスプライマーＡ、ほぼ アミノ酸３３５からほぼアミノ酸３２９までのウシ水晶体ＬＡＰアミノ酸配列に 対応し、本明細書では配列識別番号４９として記載される核酸配列5' CG WCC TT C WGC ATC WGT ATT 3'を有する縮重ＬＡＰアンチセンスプライマーＣである。ま た、例１１に記載されているように、配列識別番号１３及び配列識別番号１４を 有するベクタープライマーも用いられた。 第１の試験においては、発現ライブラリーからＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増 幅するために、配列識別番号４９を有するＬＡＰプライマーＣ及び配列識別番号 １３を有するＭ１３リバースベクタープライマーを用いた。その結果得られたＰ ＣＲ産物を、配列識別番号４８を有するＬＡプライマーＡによる標準的なハイブ リッド形成条件下におけるハイブリッド形成によってスクリーニングした。配列 識別番号４８とハイブリッド形成されたＰＣＲ産物において、ＬＡＰプライマー Ｃ及び配列識別番号１４を有するＴ３ベクタープライマーによる繰り込み（nest ed）（実際には半繰り込みされた（semi-nested））ＰＣＲ増幅を行った。その 結果得られたＰＣＲ産物は約９００個のヌクレオチド長さを有し（ｎｆＡＰ₉₀₀ として記載）、ＬＡＰプライマーＡを用いる標準的な（即ち厳密な）ハイブリッ ド形成条件下にてハイブリッド形成され、例１１に記載された方法に従って、Ｔ Ａ^TMベクターにクローン化されてＤＮＡ配列分析によって分析された。 ｎｆＡＰ₉₀₀、即ちｎｆＡＰ₄₅₃のタンパクにおける核酸配列は、本明細書では 配列識別番号５０として記載される。配列識別番号５０の翻訳により、本明細書 ではＰｆＡＰ₁₅₁として記載される約１５１のアミノ酸を有するタンパクが合成 される。ＰｆＡＰ₁₅₁のアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号５１として記 載される。配列識別番号５１の分析により、同配列は約１５のアミノ酸から成る リーダーセグメントを有し、これに続いてウシ水晶体ＬＡＰに対して約３２％の 同一性を有する成熟タンパクを有することが示唆される。対応するウシ及びノミ ヌク レオチド配列は、約２９％同一である。例１４ 本例では、抗ノミ中腸プロテアーゼ抗血清の生成、及びノミプロテアーゼ活性 を阻害するためにこれを用いることを記載し、それにより抗ノミ剤としてのプロ テアーゼを基剤とするワクチンの有用性を裏付ける。 抗ノミプロテアーゼ抗血清を以下の方法に従い生成した。例７に記載の方法に 従って、ベンズアミジンセファロースによりアフィニティー精製し、次に標準的 な手順に従って、第１回免疫のためにフロイントの完全アジュバントと一緒にし て、第２回及び第３回免疫のためにフロイントの不完全アジュバントと一緒にし た約４０〜５０μｇのノミ中腸プロテアーゼ試料によって、ウサギを３回免疫し た。第２回免疫後、約１：３２００の終末点力価が得られ、第３回免疫では抗プ ロテアーゼ力価は約１：６４００に激増した。結果的に得られた抗ノミプロテア ーゼ抗血清における、アフィニティー精製された中腸プロテアーゼ試料に対する 免疫反応性のウェスタンブロット分析により、少なくとも７〜８の反応性プロテ アーゼバンドの存在が実証された。あるクラスのプロテアーゼに対して高力価抗 血清を生成することが困難であることは、文献にて多数報告されていることから 、この事実は重要な観察結果であった。 ノミ中腸プロテアーゼに対するウサギの抗ノミプロテアーゼ抗血清の阻害活性 を評価するために、規定タンパク基質（即ちスクシニル化カゼイン）を用いてＯ Ｄ₄₅₀における吸光度の関数としてトリプシン活性を測定するインビトロのアッ セイを、市販のキット（ピアース、ロックフォード、アイエル（Pierce，Rockfo rd，IL）より入手可能）を用いて行った。予備アッセイでは、アフィニティー精 製ノミ中腸プロテアーゼ試料のタンパク分解活性は、トリプシン対照例にて認め られた活性の約２５〜３０％であった。ノミプロテアーゼは、最適な活性のため にはトリプシン対照例とは異なる反応条件を必要とすることから、前述のような 低い活性は予測されなかった訳ではない。また、例７、１０及び１１にて 記載された方法に従いノミプロテアーゼについて決定された一次アミノ酸配列に より、最適な活性を測定するためには特異基質を必要とする高度に特殊化された 機能が示唆された。第２回免疫後に採取されたウサギの抗ノミプロテアーゼ抗体 を含む約５００ｎｇの血清の存在下で、アフィニティー精製された中腸プロテア ーゼ試料をスクシニル化カゼイン基質により培養した結果、同プロテアーゼ試料 のタンパク分解性は約２０％減少した。準最適なアッセイによるこの結果は、ノ ミ中腸プロテアーゼ活性を阻害するために、免疫学的な方法を用いることの実施 可能性を支持するものである。 類似の免疫プロトコールにおいて、アフィニティー精製された中腸プロテアー ゼ試料のいくつかのプロテアーゼに対して、ウェスタンブロット分析により同定 されるような免疫反応性を示す抗ノミプロテアーゼ抗血清をネコにおいても生成 した。また、ウサギの抗血清を分析すべく記載されたものと同じアッセイを行っ たところ、ネコの抗ノミプロテアーゼ抗血清により、アフィニティー精製された 中腸プロテアーゼ試料のタンパク分解活性は約２０％減少した。例１５ 本例では、ノミ幼虫ではセリン型プロテアーゼが優勢であることを実証する。 発生直後のノミ幼虫を、標準的な技術を用いてコロニー養成皿にて飼育し、乾 燥ウシ血液を含む幼虫養成培養液を摂取させた。異なる発生段階における約３０ ０〜５００匹の幼虫を回収し、ノミ腸切除緩衝剤（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＣａＣｌ₂、ｐＨ８．０）内での音波処理によって均質化し、遠心分離してペレ ット細胞破砕片にした。約２５匹の幼虫に相当する量を、約２．５μｃｉの[1,3^-3 H]-ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）によって、一晩４℃にて培養し た。培養後、約１０匹の幼虫に相当する量を濾紙上にスポットし、１０％トリク ロロ酢酸によって沈殿させ、液体シンチレーションカウンターにて計数した。約 ２．５匹の幼虫に相当する量の試料にて還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、標準的な 技術を用いてオートラジオグラフィーを行った。更に、同様の方法によってノミ 成虫 中腸プロテアーゼを抽出して³Ｈ標識し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグ ラフィーによる試験を行った。ゲル分析によって、幼虫プロテアーゼはＤＦＰに より標識可能であることに基づき、成虫の場合と同様に血液摂取により産生が誘 起されるセリン型プロテアーゼが優勢であると考えられることが示された。血液 を摂取させた第３齢は、最高量のタンパク分解活性を有しているように見られた 。例１６ 本例では、ノミ糞便にタンパク分解活性があり、この活性ではセリンプロテア ーゼが優勢であることを実証する。 生存しているネコの体に配置したノミケージにて、または例６に記載したよう に、ノミにウシ血液を供給するためのノミ飼料供給装置にて飼料摂取ノミより、 ノミ糞便を回収した。９〜１７時間毎に新鮮なノミ糞便を回収し、水中で糞便１ ５０ｍｇ／ｍｌにて再懸濁し、遠心分離によりペレット不溶性材料にした。次に 、不溶性分画を２つの技術を用いてアッセイした。各レーンに約４０μｇのタン パクを配置して還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った試料において、ウェスタンブロッ ト分析を行った。ブロットされたタンパクを、１：５００にて、例１４に記載し た方法により生成したウサギ抗ノミプロテアーゼ抗血清とともに４℃で一晩培養 した。ヤギ抗ウサギ二次抗体を、ウェスタンブロットを展開するため１：２００ ０にて用いた。ウェスタンブロット分析により、ノミ糞便におけるセリン型プロ テアーゼの存在が示された。この系において約２５〜約３０ｋＤで移動するタン パクの存在は、完全な長さのセリンプロテアーゼの存在を示唆している。 非還元緩衝剤中電気泳動ゲルの各レーンに、約５０μｇのタンパクを配置する ことにより、チモグラム分析を行った。電気泳動後、試料を再生させるためにチ モグラムゲルを２．５％トリトン−Ｘ−１００に浸漬し、５０ｍＭトリス、ｐＨ ７．６、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５mＭ、ＣａＣｌ₂、０．０２％ブリージ３５内 にて３７℃で展開した。ゲルをクーマシー染色すると、活性プロテアーゼにより ゲルマトリックス内のゼラチンが消化された部位に透明なプラークが明らかに示 された。前述の技術はいずれも、ノミ糞便中のセリンプロテアーゼの存在を示し た。例１７ 本例では、抗体含有血液を摂取させたノミ糞便中に抗体が含まれることを実証 する。これにより、ノミ糞便を摂取するノミ幼虫の免疫学的な駆除方法が示唆さ れる。 ノミに摂取され、中腸を通過して糞便中にて排泄される血液飼料中の抗体力価 を、以下の方法により実証した。市販されているウサギの抗卵アルブミン抗体を 、例６に記載したノミ飼料供給装置内のノミ成虫の血液飼料に、ほぼ生理学的濃 度（即ち、約２ｍｇ／ｍｌ）にて添加した。飼料摂取後２４時間目及び４８時間 目に糞便を回収し、リン酸生理食塩水緩衝剤中にて再水和した。ウサギ抗体Ｆｃ 領域に対するウサギ特異二次抗体スクリーンにより、再水和された糞便飼料をウ ェスタンブロット分析し、見かけ上完全な長さのウサギ抗卵アルブミン抗体を含 むことを証明した。同じ時間間隔毎に回収されたノミ中腸上清は、残留量のウサ ギ抗卵アルブミン抗体を示した。 第２回試験にて、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に対して生成 されたネコ特異抗血清を含有する血液飼料を類似の方法によってノミに摂取させ 、摂取後２４、４８及び７２時間目に糞便を回収した。２４時間目に回収された 試料を半分に分割し、一方を直ちにＰＢＳ中にて再水和し、もう一方を７日後に 再水和した。４８時間目及び７２時間目に回収された糞便試料を、乾燥した状態 で回収した後、それぞれ６日及び５日間、再水和前に放置した。また、ノミに摂 取させたＫＬＨ抗血清含有血液飼料のアリコートを、１日目及び２日目に回収し た。ウェスタンブロット分析の結果、回収された全抗体はＫＬＨに対して活性が あり、ネコ抗ＫＬＨ血清のみの場合と判別不能なパターンまたは反応性が示され た。 これらの試験により、抗体はノミ中腸を未変化の状態で通過することが可能で あり、抗原結合特性を維持することが可能であることが実証された。従って、ノ ミ幼虫は通常の生息場所においてノミ糞便を摂取することから、幼虫の発生を標 的とする免疫学的方法の利用可能性が示唆される。例１８ 本例では、本発明のノミセリンプロテアーゼタンパクをコードする核酸分子の その他の核酸配列及び推定アミノ酸配列を供与する。同核酸分子の単離の例は、 例１１に記載されている。 Ａ．ノミセリンプロテアーゼクローン１は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分子 ｎｆＳＰ₇₇₉を有すると判定された。同核酸分子の核酸配列は、本明細書では配 列識別番号８０として記載される。配列識別番号８０の翻訳により、本明細書に てＰｆＳＰ１₂₃₂として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパクが合 成された。同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号８１として記 載され、配列識別番号８０はほぼヌクレオチド６９９から７０１までの見かけ上 の停止コドンを有する。ＰｆＳＰ１₂₃₂の成熟型のＮ−末端は、見かけ上配列識 別番号８１のアミノ酸１７に位置し、保存ＧＷＧ配列は配列識別番号８１のほぼ アミノ酸１３２から１３４までである。また、ＰｆＳＰ１₂₃₂は見かけ上、配列 識別番号７（精製されたセリンプロテアーゼタンパクの部分的なアミノ末端配列 、その生成方法は例１０に記載されている）を有する。また、ｎｆＳＰ１₇₇₉は 見かけ上、配列識別番号５２及び配列識別番号１８を有し、同様に、ＰＦＳＰ１₂₃₂ は見かけ上、配列識別番号５３及び配列識別番号１９を有する。ＢＬＡＳＴ 相同性調査により、配列識別番号８１はアミノ酸配列において、アノフェレスガ ンビアのキモトリプシンＩＩ及びカリクレインに最も類似していることが示され た。これらの分子においてはよくあることだが、配列に差異が生じるのは、配列 決定誤差または対立遺伝子による変異等の、しかしながらこれらに限定されない 複数の要因によるものであり得る。 Ｂ．ノミセリンプロテアーゼクローン２は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分子 ｎｆＳＰ２₉₄₄を有すると判定された。同核酸分子の核酸配列は、本明細書では 配 列識別番号８２として記載される。配列識別番号８２の翻訳により、本明細書に てＰｆＳＰ２₂₅₅として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパクが合 成された。同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号８３として記 載され、配列識別番号８２は、ほぼヌクレオチド７６８から７７０までの見かけ 上の停止コドンを有する。ＰｆＳＰ２₂₅₅の成熟型のＮ−末端は、見かけ上配列 識別番号８１のアミノ酸２３に位置し、保存ＧＷＧ配列は配列識別番号８３のほ ぼアミノ酸１４８から１５０までである。また、ＰｆＳＰ２₂₅₅は見かけ上、配 列識別番号５（精製されたセリンプロテアーゼタンパクの部分的なアミノ末端配 列、その生成方法は例１０に記載されている）を有する。また、ｎｆＳＰ２₉₄₄ は見かけ上、配列識別番号２０を有し、同様にＰＦＳＰ２₂₅₅は見かけ上、配列 識別番号２１を有する。ＢＬＡＳＴ相同性調査により、配列識別番号８３はアミ ノ酸配列において、カイコのビテリン分解プロテアーゼ前駆物質に最も類似して いることが示された。 Ｃ．ノミセリンプロテアーゼクローン３は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分子 ｎｆＳＰ３₁₇₇を有すると判定された。同核酸分子の核酸配列は、本明細書では 配列識別番号２２として記載される。配列識別番号２２の翻訳により、本明細書 にてＰｆＳＰ３₅₉として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパクが合 成された。同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号２３として記 載される。ノミセリンプロテアーゼタンパクＰｆＳＰ３₅₉は、配列識別番号２３ のほぼアミノ酸１から３までの保存ＧＷＧ配列を有する。ＢＬＡＳＴ相同性調査 により、配列識別番号２３はアミノ酸配列において、ラットのトリプシノーゲン に最も類似していることが示された。 Ｄ．ノミセリンプロテアーゼクローン４は、例１１に記載のノミセリンプロテ アーゼ核酸分子ｎｆＳＰ４₆₇₂を有すると判定された。核酸分子ｎｆＳＰ４₆₇₂は 核酸配列識別番号１６を有し、同核酸配列の翻訳により、本明細書にてＰｆＳＰ ４₂₂₃として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパクが合成された。 同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号１７として記載され、配 列 識別番号１６は、ほぼヌクレオチド６７０から６７２までの見かけ上の停止コド ンを有する。前述のように、ＰｆＳＰ４₂₂₃の成熟型のＮ−末端は、見かけ上配 列識別番号１７のアミノ酸５に位置し、保存ＧＷＧ配列は配列識別番号１７のほ ぼアミノ酸１２４から１２６までである。ＰｆＳＰ４₂₂₃は見かけ上、配列識別 番号４１及び配列識別番号４５に非常に類似する配列を有する。また、ｎｆＳＰ ４₆₇₂は見かけ上、配列識別番号２４、配列識別番号５６（配列識別番号５６の ヌクレオチド１４１以降）及び配列識別番号７４を有する。同様に、ＰＦＳＰ４₂₂₃ は見かけ上、配列識別番号２５、配列識別番号７５及び配列識別番号５７に 非常に類似する配列（配列識別番号５７のアミノ酸４７以降）を有する。ＢＬＡ ＳＴ相同性調査により、配列識別番号１７はアミノ酸配列において、アノフェレ スガンビアのキモトリプシンＩ前駆物質に最も類似していることが示された。 Ｅ．ノミセリンプロテアーゼクローン５は、本明細書で配列識別番号８４とし て記載される核酸配列を有するノミセリンプロテアーゼ核酸分子ｎｆＳＰ５₁₅₇ と、本明細書で配列識別番号８６として記載される核酸配列を有するノミセリン プロテアーゼ核酸分子ｎｆＳＰ５₂₁₈とを有すると判定された。配列識別番号８ ４の翻訳により、本明細書にてＰｆＳＰ５₅₂として記載される予測されたセリン プロテアーゼタンパクが合成された。同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では 配列識別番号８５として記載される。ノミクローン５によってコードされるセリ ンプロテアーゼタンパクの成熟型のＮ−末端は、見かけ上配列識別番号８５のほ ぼアミノ酸２９に位置する。配列識別番号８５は見かけ上、配列識別番号２の最 初の１０個のアミノ酸及び配列識別番号６の最初の１０個のアミノ酸を含む。配 列識別番号２及び配列識別番号６は精製されたセリンプロテアーゼタンパクの部 分的なＮ−末端であり、同精製タンパクの生成は例１０に記載されている。配列 識別番号８６の翻訳により、本明細書にてＰｆＳＰ５₇₂として記載される予測さ れたセリンプロテアーゼタンパクが合成された。同タンパクのアミノ酸配列は本 明細書では配列識別番号８７として記載される。ＰｆＳＰ５₇₂は、配列識別番号 ８７のほぼアミノ酸１４から１６までの保存ＧＷＧ配列を有する。ｎｆＳＰ５_{21 8} は見か け上配列識別番号２６を有し、同様にＰｆＳＰ５₇₂は見かけ上配列識別番号２７ を有する。ＢＬＡＳＴ相同性調査により、ノミクローン５によってコードされる タンパクはアミノ酸配列において、ショウジョウバエのトリプシンエタ前駆物質 に最も類似していることが示された。 Ｆ．ノミセリンプロテアーゼクローン６は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分子 ｎｆＳＰ６₉₃₂を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では配列 識別番号８８として記載される。配列識別番号８８の翻訳により、本明細書にて ＰｆＳＰ６₂₅₆として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパクが合成 された。同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号８９として記載 され、配列識別番号８８は、ヌクレオチド７７０から７７２までの見かけ上の停 止コドンを有する。ＰｆＳＰ６₂₅₆の成熟型のＮ−末端は、見かけ上配列識別番 号８９のほぼアミノ酸２６に位置し、保存ＧＷＧ配列は配列識別番号８９のほぼ アミノ酸１４９から１５１までである。また、ＰｆＳＰ６₂₅₆は見かけ上配列識 別番号４（精製されたセリンプロテアーゼタンパクの部分的なアミノ末端であり 、同精製タンパクの生成は例１０に記載される）を有する。また、ｎｆＳＰ６_{93 2} は見かけ上、配列識別番号２８、配列識別番号５４及び配列識別番号ＮＯ．６ ０（配列識別番号ＮＯ．６０のほぼヌクレオチド１１１以降）を有する。同様に 、ＰｆＳＰ６₂₅₆は見かけ上、配列識別番号２９、配列識別番号５５及び配列識 別番号ＮＯ．６１（配列識別番号ＮＯ．６１のほぼアミノ酸３７以降）を有する 。ＢＬＡＳＴ相同性調査により、配列識別番号８９はアミノ酸配列において、カ イコのビテリン分解プロテアーゼに最も類似していることが示された。 Ｇ．ノミセリンプロテアーゼクローン７は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分子 ｎｆＳＰ７₈₉₄を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では配列 識別番号９０として記載される。配列識別番号９０の翻訳により、本明細書にて ＰｆＳＰ７₂₅₅として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパクが合成 された。同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号９１として記載 され、配列識別番号９０は、ほぼヌクレオチド７６６から７６８までの見かけ上 の停止 コドンを有する。ＰｆＳＰ７₂₅₅の成熟型のＮ−末端は、見かけ上配列識別番号 ９１のほぼアミノ酸２３に位置し、保存ＧＷＧ（この場合はＧＷＡ）配列は配列 識別番号９１のほぼアミノ酸１５２から１５４までである。また、ＰｆＳＰ７_{25 5} は見かけ上配列識別番号４４を有する。また、ｎｆＳＰ７₈₉₄は見かけ上、配列 識別番号３０及び配列識別番号ＮＯ．６２を有する。同様に、ＰｆＳＰ７₂₅₅は 見かけ上配列識別番号３１及び配列識別番号６３を有する。ＢＬＡＳＴ相同性調 査により、配列識別番号９１はアミノ酸配列において、スズメバチキモトリプシ ンＩＩ及びコラゲナーゼに最も類似していることが示された。 Ｈ．ノミセリンプロテアーゼクローン８は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分子 ｎｆＳＰ８₂₉₉を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では配列 識別番号９２として記載される。配列識別番号９２の翻訳により、本明細書にて ＰｆＳＰ８₉₉として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパクが合成さ れ、同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号９３として記載され る。ＰｆＳＰ８₉₉は、配列識別番号９３のほぼアミノ酸３１から３３までの保存 ＧＷＧ配列を有する。また、ｎｆＳＰ８₂₉₉は見かけ上配列識別番号３２を有し 、同様に、ＰｆＳＰ８₉₉は見かけ上配列識別番号３３を有する。ＢＬＡＳＴ相同 性調査により、配列識別番号９３はアミノ酸配列において、Tachypleus trident atus凝固因子Ｂに最も類似していることが示された。 Ｉ．ノミセリンプロテアーゼクローン９は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分子 ｎｆＳＰ９₂₆₆を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では配列 識別番号９４として記載される。配列識別番号９４の翻訳により、本明細書にて ＰｆＳＰ９₈₈として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパクが合成さ れ、同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号９５として記載され る。ＰｆＳＰ９₈₈は、配列識別番号９５のほぼアミノ酸３３から３５までの保存 ＧＷＧ配列を有する。また、ｎｆＳＰ９₂₆₆は見かけ上配列識別番号３４を有し 、同様に、ＰｆＳＰ９₈₈は見かけ上配列識別番号３５を有する。ＢＬＡＳＴ相同 性調査により、配列識別番号９５はアミノ酸配列において、アノフェレスガンビ アのキ モトリプシン２前駆物質に最も類似していることが示された。 Ｊ．ノミセリンプロテアーゼクローン１０は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分 子ｎｆＳＰ１０₃₇₈を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では 配列識別番号９６として記載される。配列識別番号９６の翻訳により、本明細書 にてＰｆＳＰ１０₁₂₆として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパク が合成され、同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号９７として 記載される。ＰｆＳＰ１０₁₂₆は、配列識別番号９７のほぼアミノ酸６３から６ ５までの保存ＧＷＧ配列を有する。また、ｎｆＳＰ１０₃₇₈は見かけ上配列識別 番号３６を有し、同様に、ＰｆＳＰ１０₁₂₆は見かけ上配列識別番号３７を有す る。ＢＬＡＳＴ相同性調査により、配列識別番号９７はアミノ酸配列において、 アノフェレスガンビアのキモトリプシン１前駆物質に最も類似していることが示 された。 Ｋ．ノミセリンプロテアーゼクローン１１は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分 子ｎｆＳＰ１１₂₅₂を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では 配列識別番号９８として記載される。配列識別番号９８の翻訳により、本明細書 にてＰｆＳＰ１１₈₄として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパクが 合成され、同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号９９として記 載される。ＰｆＳＰ１１₈₄は、配列識別番号９９のほぼアミノ酸２３から２５ま での保存ＧＷＧ配列を有する。また、ｎｆＳＰ１１₂₅₂は見かけ上配列識別番号 ３８を有し、同様に、ＰｆＳＰ１１₈₄は見かけ上配列識別番号３９を有する。Ｂ ＬＡＳＴ相同性調査により、配列識別番号９９はアミノ酸配列において、ハツカ ネズミプラスミノーゲン前駆物質に最も類似していることが示された。 Ｌ．ノミセリンプロテアーゼクローン１２は、本明細書で配列識別番号６４と して記載される核酸配列を有するノミセリンプロテアーゼ核酸分子ｎｆＳＰ１２₁₄₄ と、本明細書で配列識別番号１００として記載される核酸配列を有するノミ セリンプロテアーゼ核酸分子ｎｆＳＰ１２₂₂₅とを有すると判定された。配列識 別番号６４の翻訳により、本明細書にてＰｆＳＰ１２₅₂として記載される予測さ れたセリンプロテアーゼタンパクが合成された。同タンパクのアミノ酸配列は本 明細 書では配列識別番号６５として記載される。ノミクローン１２によってコードさ れるセリンプロテアーゼタンパクの成熟型のＮ−末端は、見かけ上配列識別番号 ６５のほぼアミノ酸２０に位置する。配列識別番号６５は見かけ上、配列識別番 号４０の最初の３０個のアミノ酸を含む。配列識別番号１００の翻訳により、本 明細書にてＰｆＳＰ１２₆₉として記載される予測されたセリンプロテアーゼタン パクが生成した。同タンパクのアミノ酸配列は同明細書では配列識別番号１０１ として記載され、配列識別番号１００は、見かけ上ほぼヌクレオチド２０８から ２１０までの停止コドンを有する。ｎｆＳＰ１２₂₂₅は見かけ上配列識別番号７ ６を有し、同様にＰｆＳＰ１２₆₉は見かけ上配列識別番号７７を有する。ＢＬＡ ＳＴ相同性調査により、ノミクローン１２によってコードされるタンパクはアミ ノ酸配列において、アノフェレスガンビアのトリプシンに最も類似していること が示された。 Ｍ．ノミセリンプロテアーゼクローン１３は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分 子ｎｆＳＰ１３₈₅₀を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では 配列識別番号１０２として記載される。配列識別番号１０２の翻訳により、本明 細書にてＰｆＳＰ１３₂₅₂として記載される予測されたセリンプロテアーゼタン パクが合成された。同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号１０ ３として記載され、配列識別番号１０２は、ほぼヌクレオチド７５８から７６０ までの見かけ上の停止コドンを有する。ＰｆＳＰ１３₂₅₂の成熟型のＮ−末端は 、見かけ上配列識別番号１０３のほぼアミノ酸２８に位置し、保存ＧＷＧ配列は 配列識別番号１０３のほぼアミノ酸１３７から１３９までである。また、ＰｆＳ Ｐ１３₂₅₂は見かけ上配列識別番号１（精製されたセリンプロテアーゼタンパク の部分的なアミノ末端であり、同精製タンパクの生成は例１０に記載される）及 び配列識別番号４２を有する。また、ｎｆＳＰ１３₈₅₀は見かけ上、配列識別番 号６６及び配列識別番号ＮＯ．７８を有し、同様に、ＰｆＳＰ１３₂₅₂は見かけ 上配列識別番号６７及び配列識別番号７９を有する。ＢＬＡＳＴ相同性調査によ り、配列識別番号１０３はアミノ酸配列において、アノフェレスガンビアのキモ トリプシンに 最も類似していることが示された。 Ｎ．ノミセリンプロテアーゼクローン１４は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分 子ｎｆＳＰ１４₂₁₃を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では 配列識別番号６８として記載される。配列識別番号６８の翻訳により、本明細書 にてＰｆＳＰ１４₇₁として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパクが 合成され、同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号６９として記 載される。ノミクローン１２によってコードされるセリンプロテアーゼタンパク の成熟型のＮ−末端は、見かけ上配列識別番号６９のほぼアミノ酸２９に位置す る。配列識別番号６９は、見かけ上配列識別番号４３の最初の１３個のアミノ酸 を有する。ＢＬＡＳＴ相同性調査により、配列識別番号６９によってコードされ るタンパクはアミノ酸配列において、アノフェレスガンビアのトリプシンに最も 類似していることが示された。 Ｏ．ノミセリンプロテアーゼクローン１５は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分 子ｎｆＳＰ１５₂₅₂を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では 配列識別番号１０４として記載される。配列識別番号１０４の翻訳により、本明 細書にてＰｆＳＰ１５₈₄として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパ クが合成され、同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号１０５と して記載される。ノミクローン１５によってコードされるセリンプロテアーゼタ ンパクの成熟型のＮ−末端は、見かけ上配列識別番号１０５のほぼアミノ酸２８ に位置する。配列識別番号１０５は、見かけ上配列識別番号４６を有する。また 、ｎｆＳＰ１５₂₅₂は見かけ上、配列識別番号７０を有し、同様に、ＰｆＳＰ１ ５₈₄は見かけ上配列識別番号７１を有する。ＢＬＡＳＴ相同性調査により、配列 識別番号１０５によってコードされるタンパクはアミノ酸配列において、アノフ ェレスガンビアのトリプシンに最も類似していることが示された。 Ｐ．ノミセリンプロテアーゼクローン１６は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分 子ｎｆＳＰ１６₁₆₈を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では 配列識別番号７２として記載される。配列識別番号７２の翻訳により、本明細書 に てＰｆＳＰ１６₅₆として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパクが生 成し、同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号７３として記載さ れる。ノミクローン１６によってコードされるセリンプロテアーゼタンパクの成 熟型のＮ−末端は、見かけ上配列識別番号７３のほぼアミノ酸２６に位置する。 配列識別番号７３は、見かけ上配列識別番号４７を有する。ＢＬＡＳＴ相同性調 査により、配列識別番号７３によってコードされるタンパクはアミノ酸配列にお いて、アクロシンに最も類似していることが示された。 Ｑ．ノミセリンプロテアーゼクローン１８は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分 子ｎｆＳＰ１８₅₃₄を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では 配列識別番号１０６として記載される。配列識別番号１０６の翻訳により、本明 細書にてＰｆＳＰ１８₁₇₈として記載される予測されたセリンプロテアーゼタン パクが合成され、同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号１０７ として記載される。ＰｆＳＰ１８₁₇₈の成熟型のＮ−末端は、見かけ上配列識別 番号１０７のほぼアミノ酸２８４に位置し、保存ＧＷＧ配列は配列識別番号１０ ７のほぼアミノ酸１２６から１２８までである。ＢＬＡＳＴ相同性調査により、 配列識別番号１０７はアミノ酸配列において、キモトリプシンに最も類似してい ることが示された。 Ｒ．ノミセリンプロテアーゼクローン１９は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分 子ｎｆＳＰ１９₃₅₉を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では 配列識別番号１０８として記載される。配列識別番号１０８の翻訳により、本明 細書にてＰｆＳＰ１９₁₁₉として記載される予測されたセリンプロテアーゼタン パクが合成され、同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号１０９ として記載される。保存ＧＷＧ配列は、配列識別番号１０９のほぼアミノ酸６９ から７１までである。ＢＬＡＳＴ相同性調査により、配列識別番号１０９はアミ ノ酸配列において、ウシのデュオデナーゼＩに最も類似していることが示された 。 Ｓ．ノミセリンプロテアーゼクローン２０は、ノミセリンプロテアーゼ核酸分 子ｎｆＳＰ２０₈₄₁を有すると判定され、同核酸分子の核酸配列は本明細書では 配 列識別番号１１０として記載される。配列識別番号１１０の翻訳により、本明細 書にてＰｆＳＰ２０₂₄₈として記載される予測されたセリンプロテアーゼタンパ クが合成された。同タンパクのアミノ酸配列は本明細書では配列識別番号１１１ として記載され、配列識別番号１１０は、ほぼヌクレオチド７４６から７４８ま での見かけ上の停止コドンを有する。ＰｆＳＰ２０₂₄₈の成熟型のＮ−末端は、 見かけ上配列識別番号１１１のほぼアミノ酸２７に位置し、保存ＧＷＧ配列は配 列識別番号１１１のほぼアミノ酸１４７から１４９までである。また、ＰｆＳＰ ２０₂₄₈は見かけ上配列識別番号２及び配列識別番号６（精製されたセリンプロ テアーゼタンパクの部分的なアミノ末端であり、同精製タンパクの生成は例１０ に記載される）を有する。また、ｎｆＳＰ２０₈₄₁は見かけ上、配列識別番号５ ８を有し、同様に、ＰｆＳＰ２０₂₄₈は見かけ上配列識別番号５９を有する。Ｂ ＬＡＳＴ相同性調査により、配列識別番号１１１はアミノ酸配列において、トリ プシンに最も類似していることが示された。例１９ 本例では、本発明におけるノミアミノペプチダーゼタンパクをコードする核酸 分子のその他の核酸配列及び推定されるアミノ酸配列を供与する。 ノミアミノペプチダーゼ核酸分子ｎｆＡＰ₉₀₀におけるその他の部分の核酸配 列を決定し、例１３に記載の方法に従い、飼料摂取全ノミｃＤＮＡ発現ライブラ リーからノミアミノペプチダーゼコード領域の３’末端フラグメントをＰＣＲ増 幅させるべく、ベクタープライマー（即ち、Ｍ１３ユニバーサルプライマー）と 共に用いられるプライマーを設計するために用いた。ＰＣＲ産物をＤＮＡ配列決 定分析し、ほぼ完全な長さのノミアミノペプチダーゼコード領域を示す複合配列 を推定した。本明細書でｎｆＡＰ₁₅₈₀として記載される複合核酸分子の核酸配列 は、本明細書では配列識別番号１１２として記載される。３’末端フラグメント を得るために用いられたプライマーは、配列識別番号１１２のほぼヌクレオチド ８４９から８７７までである。配列識別番号１１２のほぼヌクレオチド９１８か ら９ ３８までのプローブを、３’末端フラグメントがノミアミノペプチダーゼ核酸分 子であることを証明するために用いた。本明細書でｎｆＡＰ₇₃₂として記載され る３’末端フラグメントのノミアミノペプチダーゼ遺伝子を含む配列は、配列識 別番号１１２のほぼヌクレオチド８４９から１５８０までである。 配列識別番号１１２の翻訳により、ほぼ４９６のアミノ酸を有する推定された ノミアミノペプチダーゼタンパクが合成され、同タンパクは本明細書にてＰｆＡ Ｐ₄₉₆として記載され、アミノ酸配列識別番号１１３を有する。推定された成熟 ノミアミノペプチダーゼは、成熟ウシロイシンアミノペプチダーゼと約４８％同 一である。ウシ及びノミにおいて対応する核酸配列は約３３％同一である。例２０ 本例では、本発明における所定のノミセリンプロテアーゼタンパクの合成を例 証する。 Ａ．ノミセリンプロテアーゼタンパクＰｆＳＰ１₂₁₆を以下の方法により合成 した。本明細書でｎｆＳＰ１₆₇₀記載され、見かけ上の成熟セリンプロテアーゼ タンパクをコードするよう設計された約６７０−ｂｐのＤＮＡフラグメントを、 ＸｈｏＩ領域を含むプライマーであるＦ１センス５’ＧＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＡ ＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＣ ３’（配列識別番号１１４）及び Ｆ１アンチセンス５’ＧＧＡＣＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＡＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡ ＴＧＧＴＣ ３’（配列識別番号１１５）によって、ノミセリンプロテアーゼク ローン１からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物ｎｆＳＰ１₆₇₀をＸｈｏＩ制限エンド ヌクレアーゼによって消化し、ゲル精製し、予めＸｈｏＩにより消化して脱リン 酸化した発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（インヴィトロジェンより入手可能）内 にサブクローン化した。その結果得られた組換え分子は、本明細書ではｐＨｉｓ −ｎｆＳＰ１₆₇₀として記載され、組換え細胞大腸菌：ｐＨｉｓ−ｎｆＳＰ１₆₇₀ を形成するため、大腸菌ＨＢ１０１感応細胞（ギブコビーアールエル、ゲーサー ズバーグ、エムディー（Gibco BRL，Gaithersburg，MD）より入手可能）に形質 転換さ れた。同組換え細胞を、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン及び０．１％グルコース を含む細菌培養強化培地にて、３２℃で培養した。細胞が約０．４〜０．５のＯ Ｄ６００に達したとき、０．５ｍＭイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ ＩＰＴＧ）を添加することにより、ｎｆＳＰ１₆₇₀の発現を誘起し、細胞を約２ 時間３２℃にて培養した。組換えＰＨＩＳ−ＰｆＳＰ１₂₁₆融合タンパクの融合 部分に特異なＴ７タグモノクローナル抗体（ノヴァジェン、インク．，マディソ ン、ダブリューアイ（Novagen，Inc.，Madison，WI）より入手可能）を用いて、 組換え細胞大腸菌：ｐＨｉｓ−ｎｆＳＰ１₆₇₀リゼイトのイムノブロット分析を 行った結果、適切な大きさを有するタンパク即ち約２９ｋＤのタンパクが同定さ れた。 Ｂ．ノミセリンプロテアーゼタンパクＰｆＳＰ２₂₃₃を以下の方法により合成 した。本明細書でｎｆＳＰ２₇₁₅と記載され、見かけ上の成熟セリンプロテアー ゼタンパクをコードするよう設計された約７１５−ｂｐのＤＮＡフラグメントを 、ＸｈｏＩ領域を含むプライマーであるＦ２センス５’ＧＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧ ＣＡＴＣＧＴＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＧ ３’（配列識別番号１１６）及び Ｆ２アンチセンス５’ＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＣＡＧＴＴＴＴＴ ＴＴＧＣＧ ３’（配列識別番号１１７）によって、ノミセリンプロテアーゼク ローン２からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物ｎｆＳＰ２₇₁₅をＸｈｏＩ制限エンド ヌクレアーゼによって消化し、ゲル精製し、予めＸｈｏＩにより消化して脱リン 酸化した発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（インヴィトロジェンより入手可能）内 にサブクローン化した。その結果得られた組換え分子は、本明細書ではｐＨｉｓ −ｎｆＳＰ２₇₁₅として記載され、組換え細胞大腸菌：ｐＨｉｓ−ｎｆＳＰ２₇₁₅ を形成するため、大腸菌ＨＢ１０１感応細胞（ギブコビーアールエルより入手可 能）に形質転換された。同組換え細胞を例２０Ａに記載した方法により培養した 。組換えＰＨＩＳ−ＰｆＳＰ２₂₃₃融合タンパクの融合部分に特異なＴ７タグモ ノクローナル抗体（ノヴァジェン、インク．より入手可能）を用いて、組換え細 胞大腸菌：ｐＨｉｓ−ｎｆＳＰ２₇₁₅リゼイトのイムノブロット分析を行った結 果、適切な大きさを有するタンパク即ち約３５ｋＤのタンパクが同定された。 Ｃ．ノミセリンプロテアーゼタンパクＰｆＳＰ１３₂₂₅を以下の方法により合 成した。本明細書でｎｆＳＰ１３₇₀₀と記載され、見かけ上の成熟セリンプロテ アーゼタンパクをコードするよう設計された約７００−ｂｐのＤＮＡフラグメン トを、ＸｈｏＩ領域を含むプライマーであるＦ１３センス５’ＧＡＧＣＴＣＴＣ ＧＡＧＴＡＴＣＡＴＣＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣ ３’（配列識別番号１１ ８）及びＦ１３アンチセンス５’ＧＧＡＣＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＡＴＧＣＧＣＣ ＧＴＣＡＴＴＴＧＣ ３’（配列識別番号１１９）によって、ノミセリンプロテ アーゼクローン１３からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物ｎｆＳＰ１３₇₀₀をＸｈｏ Ｉ制限エンドヌクレアーゼによって消化し、ゲル精製し、予めＸｈｏＩにより消 化して脱リン酸化した発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（インヴィトロジェンより 入手可能）内にサブクローン化した。その結果得られた組換え分子は、本明細書 ではｐＨｉｓ−ｎｆＳＰ１３₇₀₀として記載され、組換え細胞大腸菌：ｐＨｉｓ −ｎｆＳＰ１３₇₀₀を形成するため、大腸菌ＨＢ１０１感応細胞（ギブコビーア ールエルより入手可能）に形質転換された。同組換え細胞を例２０Ａに記載した 方法により培養した。組換えＰＨＩＳ−ＰｆＳＰ１３₂₂₅融合タンパクの融合部 分に特異なＴ７タグモノクローナル抗体（ノヴァジェン，インク．より入手可能 ）を用いて、組換え細胞大腸菌：ｐＨｉｓ−ｎｆＳＰ１３₇₀₀リゼイトのイムノ ブロット分析を行った結果、適切な大きさを有するタンパク即ち約３３ｋＤのタ ンパクが同定された。例２１ 本例では、ネコにて飼料摂取させるノミにおける一時的なセリンプロテアーゼ 誘導を実証する。 インビトロの飼料供給試験にて用いたものと類似するチャンバ内に配置された ノミをネコの体上に配置し、種々の時間間隔にて飼料摂取させた。ネコから離し た時、ノミ中腸組織の溶解性抽出物を本明細書に記載の方法によって調製した。 １９８８年、アーク．インセクト．バイオケム．フィジオル．(Arch．Insect Biochem．Physiol.)７、１８７−２１０においてボロブスキー（Borovsky）らに より記載された方法に類似する方法に従い、[１，３−³Ｈ]ＤＦＰによって抽出 物を標識することによって、抽出物に含まれるプロテアーゼを定量した。標識さ れた試料は（ａ）沈殿させて沈殿物の放射能を定量したか、または（ｂ）ＳＤＳ −ＰＡＧＥを行い、オートラジオグラフィーを行った。 試料を計数することにより生成されたデータを図１０に示す。同図では、ノミ 中腸１０個当たり１分間当たり[³Ｈ]−ＤＦＰカウント（ｃｐｍ）が、ネコによ るノミの飼料摂取時間に対してプロットされている。また図１０では比較のため に、ネコによって飼料を供給されたチャンバ内のノミにおいて、それぞれ１、２ 、３及び４日目における雌ノミ１匹当たり１日当たり産卵数がプロットされてい る。これらの結果は、飼料供給への応答としてノミにおいてＤＦＰ標識プロテア ーゼ（即ち、セリンプロテアーゼが優勢）が誘導されたことを示唆している。カ の場合と異なり、飼料供給開始後に誘導は極めて迅速に生じ、一定時間持続する 。また、これらの結果により、ノミプロテアーゼ活性及び繁殖能力の間には正相 関があることが示された。 飼料供給時にノミにおいて一時的に誘導されたＤＦＰ標識プロテアーゼの大き さプロフィールを得るために、試料においてＳＤＳ−ＲＡＧＥを実施してオート ラジオグラフィーを行った。図１１は、タンパク分子量標準値と、種々の時間間 隔（即ち、３，８，１５，１８，２４，３０，３４，４０，４４，４８，５２， ５８，６８，７２，７８及び８８時間の飼料供給）においてネコによって飼料を 供給されたノミから得られた溶解性ノミ中腸抽出物試料とを示す。結果を分析す ると主として、約２５〜３５ｋＤの分子量にて移動するプロテアーゼは、ノミの 飼料摂取開始後、ノミにおいて比較的直ぐに（即ち、少なくとも約３〜８時間以 内）誘導されることが示される。このプロテアーゼの量は、ほぼ最初の２日間に わたり増加する。また、一定時間にわたって、分解中のプロテアーゼを示し得る ような、強度に標識されたいくつかの低分子量バンド（主として約１２〜１５ｋ Ｄの範囲）が出現する。 以上、本発明における種々の実施形態を詳細に記載したが、これら実施形態の 変更例及び応用例は、当業者により実施可能であることは明らかである。しかし ながら、このような変更例及び応用例は、特許請求の範囲に記載される本発明の 範囲に含まれることを明白に理解されたい。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年５月１５日 【補正内容】 【図１】 【図２】 【図３】 【図４】 【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/35 Ａ６１Ｋ 47/30 Ｃ 39/395 ＡＥＡ Ｃ０７Ｋ 14/435 47/30 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ１２Ｎ 7/00 16/18 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｎ 7/00 9/99 9/64 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9/99 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＦＪ Ｃ１２Ｐ 21/02 37/547 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ４８４，２１１ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ４８５，４４３ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ４８５，４５５ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハンター、シャーリー ウ アメリカ合衆国 80525 コロラド州 フ ォート コリンズ タングルウッド ドラ イブ 2325 (72)発明者 フランク、グレン アール. アメリカ合衆国 80549 コロラド州 ウ エリントン ノース カウンティー ロー ド サーティーン 10317 (72)発明者 スティーグラー、ゲリー エル. アメリカ合衆国 80526 コロラド州 フ ォート コリンズ ゼンドト ストリート 2934 (72)発明者 ヒース、アンドリュー イギリス国 Ｓ６ ６ＡＦ シェフィール ド スターリントン ロード 661 (72)発明者 ヤマナカ、マイルス アメリカ合衆国 95826 カリフォルニア 州 サクラメント メディタレイニアン ウェイ 8480 (72)発明者 アルフステン、アン アメリカ合衆国 94002 カリフォルニア 州 ベルモント ベル モンティ アベニ ュー 2031 (72)発明者 デイル、ビバリー アメリカ合衆国 94022 カリフォルニア 州 ロス アルトス デル モンテ アベ ニュー 204

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．宿主動物をノミの寄生から防御するための方法であって、 前記動物に組成物を投与し、前記組成物は前記投与された動物から飼料を摂取 するノミのプロテアーゼ活性を低減する化合物を含有し、それにより前記動物及 び同動物の環境中におけるノミ負荷を低減することを含む方法。 ２．宿主動物をノミの寄生から防御するための方法であって、 前記方法は、ノミのプロテアーゼ活性を低減可能とする第一の化合物と、ノミ のプロテアーゼ活性を低減することによる以外の方法にてノミ負荷を低減する第 二の化合物とを含む組成物を前記動物に投与する工程を含み、前記投与工程が前 記動物及び同動物の環境中におけるノミ負荷を低減する方法。 ３．ノミのプロテアーゼ活性を低減可能とする化合物を含む組成物を動物に投与 することを含むノミの寄生を低減する方法であって、 前記動物はノミ及びノミの寄生する可能性のある動物からなる群より選択され ており、前記投与工程により前記動物及び同動物の環境中におけるノミ負荷を低 減する方法。 ４．ノミプロテアーゼ活性の低減を可能とする組成物を含む徐放性処方物を動物 に投与することを含み、それにより前記動物及び同動物の環境中におけるノミ負 荷を減少するノミの寄生を治療する方法。 ５．血液を摂取した雌ノミから得られる中腸、血液を摂取した雄ノミから得られ る中腸、血液未摂取の雌ノミから得られる中腸、血液未摂取の雄ノミから得られ る中腸及びそれらの混合物からなる群より選択されたノミ中腸に存在するノミプ ロテアーゼをコードする核酸分子と厳格な条件下においてハイブリダイズできる 同核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有する単離されたタンパク。 ６．血液を摂取した雌ノミから得られる中腸、血液を摂取した雄ノミから得られ る中腸、血液未摂取の雌ノミから得られる中腸、血液未摂取の雄ノミから得られ る中腸及びそれらの混合物からなる群より選択されたノミ中腸に存在するプロテ アーゼと選択的に結合可能な単離された抗体。 ７．厳格な条件下において、ノミ中腸に存在するノミプロテアーゼをコードする 遺伝子とハイブリダイズする単離された核酸分子。 ８．プロテアーゼ活性を有する可溶性のノミ中腸調製物であって、前記プロテア ーゼ活性の少なくとも約７０％は、４−２−アミノエチルベンゼンスルホニルフ ルオライド塩酸塩によって阻害され得る調製物。 ９．ノミプロテアーゼワクチン、抗ノミプロテアーゼ抗体、プロテアーゼ阻害剤 及びそれらの混合物からなる群より選択された化合物を含む組成物であって、前 記組成物は、動物に投与された場合、前記動物及び同動物の環境中におけるノミ 負荷を低減可能である組成物。 １０．ノミプロテアーゼ活性を低減可能とする第一の化合物及びノミプロテアー ゼ活性を低減することによる以外の方法によってノミ負荷を低減する第二の化合 物を含む組成物。 １１．動物から飼料を摂取したノミのプロテアーゼ活性を減少する化合物を含む 、ノミの寄生を長期間制御する徐放性処方物であって、前記化合物は徐放性の担 体に処方されている処方物。 １２．ノミプロテアーゼを含む可溶性ノミ中腸調製物を製造する方法であって、 （ａ）液体部分及び固体部分を含む混合物を製造するために、ノミ中腸を破砕 する工程と、 （ｂ）前記調製物を得るために、前記液体部分を回収する工程とを備える方法 。 １３．ノミプロテアーゼを製造する方法であって、 （ａ）液体部分及び固体部分を含む混合物を製造するために、ノミ中腸を破砕 する工程と、 （ｂ）前記液体部分から前記プロテアーゼを精製する工程とを備える方法。 １４．ノミプロテアーゼタンパクを製造する方法であって、 （ａ）前記タンパクを製造するために、前記タンパクを発現できる組換え細胞 を効果的な培地で培養する工程と、 （ｂ）前記タンパクを回収する工程とを備える方法。 １５．ノミプロテアーゼのタンパク分解活性を阻害できる化合物を同定する方法 であって、前記方法は、 （ａ）前記化合物の非存在下においては、前記プロテアーゼがタンパク分解活 性を有するような条件下にて、単離されたノミプロテアーゼタンパクを阻害剤と なる可能性を有する化合物と接触させる工程と、 （ｂ）前記阻害剤となる可能性を有する化合物が前記活性を阻害するかを判定 する工程とを備える方法。 １６．ノミプロテアーゼのタンパク分解活性を阻害できる化合物を同定するため の試験キットであって、前記試験キットは、タンパク分解活性を有する単離され たノミプロテアーゼタンパクと、阻害剤となる可能性を有する化合物の存在下に おける前記活性の阻害の程度を決定する手段とからなる試験キット。 １７．ノミセリンプロテアーゼ遺伝子及びノミアミノペプチダーゼ遺伝子からな る群より選択された遺伝子と、厳格なハイブリダイゼーション条件下においてハ イブリダイズする単離されたノミ核酸分子。 １８．ノミセリンプロテアーゼ遺伝子及びノミアミノペプチダーゼ遺伝子からな る群より選択された遺伝子と厳格なハイブリダイゼーション条件下においてハイ ブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたノ ミタンパク。 １９．動物に投与された場合、ノミの寄生を低減する治療組成物であって、前記 組成物は：厳格なハイブリダイゼーション条件下において、ノミセリンプロテア ーゼ遺伝子とハイブリダイズする単離されたノミセリンプロテアーゼ核酸分子と ；単離されたノミセリンプロテアーゼタンパクあるいはそのミメトープと；ノミ セリンプロテアーゼタンパクと選択的に結合する単離された抗体と；ノミセリン プロテアーゼ活性を阻害する能力によって同定されたノミセリンプロテアーゼ活 性の阻害剤と；厳格なハイブリダイゼーション条件下においてノミアミノペプチ ダーゼ遺伝子とハイブリダイズする単離されたノミアミノペプチダーゼ核酸分子 と；単離されたノミアミノペプチダーゼタンパクあるいはそのミメトープと；ノ ミアミノペプチダーゼタンパクと選択的に結合する単離された抗体と；ノミアミ ノペプチダーゼ活性を阻害する能力によって同定されるノミアミノペプチダーゼ 活性の阻害剤と；それらの混合物、とからなる群より選択された防御化合物を含 む治療組成物。 ２０．厳格なハイブリダイゼーション条件下において、ノミセリンプロテアーゼ 遺伝子とハイブリダイズする単離されたノミセリンプロテアーゼ核酸分子と；単 離されたノミセリンプロテアーゼタンパクあるいはそのミメトープと；ノミセリ ンプロテアーゼタンパクと選択的に結合する単離された抗体と；ノミセリンプロ テアーゼ活性を阻害する能力によって同定されたノミセリンプロテアーゼ活性の 阻害剤と；厳格なハイブリダイゼーション条件下においてノミアミノペプチダー ゼ遺伝子とハイブリダイズする単離されたノミアミノペプチダーゼ核酸分子と； 単離されたノミアミノペプチグーゼタンパクあるいはそのミメトープと；ノミア ミノペプチダーゼタンパクと選択的に結合する単離された抗体と；ノミアミノペ プチダーゼ活性を阻害する能力によって同定されるノミアミノペプチダーゼ活性 の阻害剤と；それらの混合物、とからなる群より選択された防御化合物を有する 治療組成物を動物に投与することを含むノミの寄生を低減する方法。 ２１．ノミセリンプロテアーゼタンパク及びノミアミノペプチダーゼタンパクか らなる群より選択されたタンパクを製造する方法であって、前記方法は、前記タ ンパクを発現できる細胞を培養する工程を含み、前記タンパクは、厳格なハイブ リダイゼーション条件下において、ノミセリンプロテアーゼ遺伝子及びノミアミ ノペプチダーゼ遺伝子からなるグループより選択された遺伝子とハイブリダイズ する核酸分子によってコードされる方法。 ２２．前記プロテアーゼは、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エ ンドペプチダーゼ及びそれらの混合物からなる群より選択されている請求項１− １６のいずれか１項に記載の発明。 ２３．前記プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパ ラギン酸プロテアーゼ及びシステインプロテアーゼからなる群より選択されてい る請求項１−１６のいずれか１項に記載の発明。 ２４．前記プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及びそれ らの混合物からなる群より選択されている請求項１−１６のいずれか１項に記載 の発明。 ２５．前記プロテアーゼはセリンプロテアーゼを含む請求項１−１６のいずれか １項に記載の発明。 ２６．前記プロテアーゼはアミノペプチダーゼを含む請求項１−１６のいずれか １項に記載の発明。 ２７．前記プロテアーゼは、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン様プロ テアーゼ、アミノペプチダーゼ及びそれらの混合物からなる群より選択されてい る請求項１−１６のいずれか１項に記載の発明。 ２８．前記プロテアーゼは、前記中腸の内腔に存在するノミプロテアーゼを含む 請求項１−１６のいずれか１項に記載の発明。 ２９．前記組成物あるいは処方物は、ノミプロテアーゼ、抗ノミプロテアーゼ抗 体、ノミプロテアーゼ阻害剤及びそれらの混合物からなる群より選択された化合 物を含む請求項１−４，１０−１１のいずれか１項に記載の発明。 ３０．前記組成物あるいは処方物は、ノミセリンプロテアーゼ、ノミメタロプロ テアーゼ、ノミアスパラギン酸プロテアーゼ、ノミシステインプロテアーゼ及び それらの混合物からなる群より選択されるノミプロテアーゼワクチンを含む請求 項１−４，９−１１のいずれか１項に記載の発明。 ３１．前記組成物あるいは処方物は、ノミセリンプロテアーゼワクチン、ノミメ タロプロテアーゼワクチン及びそれらの混合物からなる群より選択されるノミプ ロテアーゼワクチンを含む請求項１−４，９−１１のいずれか１項に記載の発明 。 ３２．前記組成物あるいは処方物は、アミノペプチダーゼワクチンを含む請求項 １−４，９−１１のいずれか１項に記載の発明。 ３３．前記組成物あるいは処方物は、ノミセリンプロテアーゼ、ノミメタロプロ テアーゼ、ノミアスパラギン酸プロテアーゼ、ノミシステインプロテアーゼ及び それらの混合物からなる群より選択されたノミプロテアーゼと選択的に結合する 抗ノミプロテアーゼ抗体を含む請求項１−４，９−１１のいずれか１項に記載の 発明。 ３４．前記組成物あるいは処方物は、ノミセリンプロテアーゼ及びノミメタロプ ロテアーゼからなる群より選択されたノミプロテアーゼと選択的に結合する抗ノ ミプロテアーゼ抗体を含む請求項１−４，９−１１のいずれか１項に記載の発明 。 ３５．前記組成物あるいは処方物は、ノミアミノペプチダーゼと選択的に結合す る抗ノミプロテアーゼ抗体を含む請求項１−４，９−１１のいずれか１項に記載 の発明。 ３６．前記組成物あるいは処方物は、セリンプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテ アーゼ阻害剤、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻 害剤、アミノペプチダーゼ阻害剤及びそれらの混合物からなる群より選択される ノミプロテアーゼ阻害剤を含む請求項１−４，９−１１のいずれか１項に記載の 発明。 ３７．前記組成物あるいは処方物は、セリンプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテ アーゼ阻害剤、アミノペプチダーゼ阻害剤及びそれらの混合物からなる群より選 択されたノミプロテアーゼ阻害剤を含む請求項１−４，９−１１のいずれか１項 に記載の発明。 ３８．前記組成物あるいは処方物はノミセリンプロテアーゼ阻害剤を含む請求項 １−４，９−１１のいずれか１項に記載の発明。 ３９．前記組成物あるいは処方物は、薬剤学的に適用可能な賦形剤、アジュバン ト、担体及びそれらの混合物からなる群より選択された成分を更に含む請求項１ −４，９−１１のいずれか１項に記載の発明。 ４０．前記組成物あるいは処方物は、前記投与された動物から飼料を摂取するノ ミの生存率を減少すること、前記投与された動物から飼料を摂取する雌ノミの繁 殖能力を低減すること、前記投与された動物から飼料を摂取する雄ノミの繁殖能 力を低減すること、前記投与された動物から飼料を摂取した雌ノミの産んだ卵の 生存率を減少すること、前記投与された動物から飼料を摂取したノミの血液摂取 習慣を変えること、ノミ幼虫の生存率を減少すること、ノミ幼虫の成長を変える こと、及びそれらの混合からなる群より選択された方法によってノミ負荷を低減 する請求項１−４，９−１１のいずれか１項に記載の発明。 ４１．前記組成物あるいは処方物は、前記ノミが前記投与された動物より飼料を 摂取し始めてから少なくとも約２１日以内に、ノミの生存率を少なくとも約５０ ％低減する請求項１−４，９−１１のいずれか１項に記載の発明。 ４２．前記組成物あるいは処方物は、前記ノミが前記投与された動物より飼料を 摂取し始めてから少なくとも約３０日以内に、ノミの繁殖能力を少なくとも約５ ０％低減する請求項１−４，９−１１のいずれか１項に記載の発明。 ４３．前記組成物あるいは処方物は、経口、鼻内、局所、経皮、直腸及び非経口 の投与経路からなる群より選択された少なくとも一つの投与経路により投与され る請求項１−４，９−１１のいずれか１項に記載の発明。 ４４．前記組成物あるいは処方物は、ほ乳類及び鳥類からなる群より選択される 動物に投与される請求項１−４，９−１１のいずれか１項に記載の発明。 ４５．前記組成物あるいは処方物は、ネコ及びイヌからなる群より選択される動 物に投与される請求項１−４，９−１１のいずれか１項に記載の発明。 ４６．前記ノミは、イヌノミ属、チョプシラス属、ジアマナス属、エチドノファ ガ属、ノソプシラス属、ヒトノミ属、タンガ属及びネズミノミ属からなる群より 選択される属である請求項１−１６のいずれか１項に記載の発明。 ４７．前記ノミは、ネコノミ、イヌノミ、ヒトノミ及びプレックス シムランス からなる群より選択される種である請求項１−１６のいずれか１項に記載の発明 。 ４８．前記組成物は、徐放性処方物からなる請求項１−３，９−１０のいずれか １項に記載の発明。 ４９．前記組成物あるいは処方物は、生分解性ポリマーからなる請求項１−４， ９−１１のいずれか１項に記載の発明。 ５０．前記組成物あるいは処方物は、動物に投与した場合に、インシトゥにおい て固体あるいはゲルの形態となる液体を含む請求項１−４，９−１１のいずれか １項に記載の発明。 ５１．前記組成物あるいは処方物は、生分解可能である請求項１−４，９−１１ のいずれか１項に記載の発明。 ５２．前記組成物あるいは処方物は、同組成物あるいは処方物を動物に投与後、 少なくとも約１カ月間にわたって治療の効果をあらわす請求項１−４，９−１１ のいずれか１項に記載の発明。 ５３．前記第一の化合物はノミのタンパク分解活性を低下させることにより、前 記第二の化合物の有効性を増進させる請求項２または請求項１０に記載の発明。 ５４．前記第一の化合物は、ノミプロテアーゼワクチン、抗ノミプロテアーゼ抗 体、プロテアーゼ阻害剤及びそれらの混合物から成る群より選択される請求項２ または請求項１０に記載の発明。 ５５．前記第二の化合物は、能動免疫を行う化合物及び受動免疫を行う化合物か ら成る群より選択される請求項２または請求項１０に記載の発明。 ５６．前記第二の化合物は、ノミ膜タンパクとそのリガンドとの結合を抑制する 化合物、ホルモン合成を抑制する化合物、卵黄形成を抑制する化合物、脂肪体機 能を抑制する化合物、ノミ筋作用を抑制する化合物、ノミ神経系を抑制する化合 物、ノミ免疫系を抑制する化合物、ノミ飼料摂取を抑制する化合物、及びそれら の混合物から成る群より選択される請求項２または請求項１０に記載の発明。 ５７．前記タンパクは、動物に投与された場合に、ノミ中腸プロテアーゼに対す る免疫応答を誘起することが可能である請求項５に記載の発明。 ５８．前記タンパクはプロテアーゼ活性を有する請求項５に記載の発明。 ５９．前記プロテアーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されるように約５ｋＤ から約２００ｋＤまでの分子量を有する中腸プロテアーゼ群より選択される請求 項１〜１６のいずれか１項に記載の発明。 ６０．前記プロテアーゼは、約２６ｋＤの分子量を有するセリンプロテアーゼ、 約２４ｋＤの分子量を有するセリンプロテアーゼ、約１９ｋＤの分子量を有する セリンプロテアーゼ、約６ｋＤの分子量を有するセリンプロテアーゼから成る群 より選択される中腸プロテアーゼを有し、該分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測 定される請求項１〜１６のいずれか１項に記載の発明。 ６１．前記プロテアーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されるように約２６ｋ Ｄの分子量を備えたセリンプロテアーゼを有する請求項１〜１６のいずれか１項 に記載の発明。 ６２．前記プロテアーゼは、約ｐＨ５から約ｐＨ１０までの最適ｐＨ活性を備え た中腸プロテアーゼを有する請求項１〜１６のいずれか１項に記載の発明。 ６３．前記プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ阻害剤により、少なくとも約５ ０％阻害されるタンパク分解活性を備えた中腸プロテアーゼを有する請求項１〜 １６のいずれか１項に記載の発明。 ６４．請求項１、請求項３、請求項９または請求項１１に記載の前記化合物、請 求項２または請求項１０に記載の前記第一の化合物、請求項４に記載の前記組成 物、請求項５、請求項１５または請求項１６に記載の前記タンパク、または請求 項８に記載の前記調製物は、 （ａ）液体部分及び固体部分を有する混合物を調製するために、ノミ中腸を破 砕することと、 （ｂ）材料を含む溶解性ノミ中腸調製物を得るために、前記液体部分を回収す ることとから成る方法により回収された該材料を有する請求項１〜５、請求項８ 〜１１または請求項１５〜１６のいずれか１項に記載の発明。 ６５．前記材料は更に精製される請求項６４に記載の発明。 ６６．請求項１〜５、請求項８〜１１または請求項１５〜１６のいずれか１項に 記載の発明であって、該発明のタンパクは、該タンパクを合成するために同タン パクをコードする核酸分子を有する組換え細胞を培養することと、同タンパクを 該組換え細胞から回収することとから成る方法によって合成される発明。 ６７．前記抗体は、宿主動物に投与された場合に、該動物及び同動物の環境にお けるノミ負荷を減少させる受動免疫療法組成物を有する請求項６に記載の発明。 ６８．転写調節配列に機能的にリンクされた請求項７に記載の単離核酸分子を有 する組換え分子。 ６９．請求項７に記載の少なくとも１つの核酸分子を有する細胞を備えた組換え 細胞であって、該核酸分子を発現可能である組換え細胞。 ７０．前記セリンプロテアーゼ遺伝子は、配列識別番号１６、配列識別番号１８ 、配列識別番号２０、配列識別番号２２、配列識別番号２４、配列識別番号２６ 、配列識別番号２８、配列識別番号３０、配列識別番号３２、配列識別番号３４ 、配列識別番号３６、配列識別番号３８、配列識別番号５２、配列識別番号５４ 、配列識別番号５６、配列識別番号５８、配列識別番号６０、配列識別番号６２ 、配列識別番号６４、配列識別番号６６、配列識別番号６８、配列識別番号７０ 、配列識別番号７２、配列識別番号７４、配列識別番号７６、配列識別番号７８ 、配列識別番号８０、配列識別番号８２、配列識別番号８４、配列識別番号８６ 、 配列識別番号８８、配列識別番号９０、配列識別番号９２、配列識別番号９４、 配列識別番号９６、配列識別番号９８、配列識別番号１００、配列識別番号１０ ２、配列識別番号１０４、配列識別番号１０６、配列識別番号１０８、及び配列 識別番号１１０から成る群より選択された核酸配列を有し、前記アミノペプチダ ーゼ遺伝子は配列識別番号５０及び配列識別番号１１２から成る群より選択され た核酸配列を有する請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の発明。 ７１．前記セリンプロテアーゼ遺伝子は、配列識別番号１、配列識別番号２、配 列識別番号３、配列識別番号４、配列識別番号５、配列識別番号６、配列識別番 号７、配列識別番号８、配列識別番号９、配列識別番号１７、配列識別番号１９ 、配列識別番号２１、配列識別番号２３、配列識別番号２５、配列識別番号２７ 、配列識別番号２９、配列識別番号３１、配列識別番号３３、配列識別番号３５ 、配列識別番号３７、配列識別番号３９、配列識別番号４０、配列識別番号４１ 、配列識別番号４２、配列識別番号４３、配列識別番号４４、配列識別番号４５ 、配列識別番号４６、配列識別番号４７、配列識別番号５３、配列識別番号５５ 、配列識別番号５７、配列識別番号５９、配列識別番号６１、配列識別番号６３ 、配列識別番号６５、配列識別番号６７、配列識別番号６９、配列識別番号７１ 、配列識別番号７３、配列識別番号７５、配列識別番号７７、配列識別番号７９ 、配列識別番号８１、配列識別番号８３、配列識別番号８５、配列識別番号８７ 、配列識別番号８９、配列識別番号９１、配列識別番号９３、配列識別番号９５ 、配列識別番号９７、配列識別番号９９、配列識別番号１０１、配列識別番号１ ０３、配列識別番号１０５、配列識別番号１０７、配列識別番号１０９、及び配 列識別番号１１１から成る群より選択されたアミノ酸配列をコードする核酸配列 を有し、前記アミノペプチダーゼ遺伝子は、配列識別番号５１及び配列識別番号 １１３から成る群より選択されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する請 求項１７〜２１のいずれか１項に記載の発明。 ７２．前記核酸分子は、セリンプロテアーゼタンパクまたはアミノペプチダーゼ タンパクから成る群より選択されたタンパクをコードする核酸配列を有する請求 項１７、請求項１９または請求項２０に記載の発明。 ７３．前記核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下にて、ｎｆＳＰ１ 、ｎｆＳＰ２、ｎｆＳＰ３、ｎｆＳＰ４、ｎｆＳＰ５、ｎｆＳＰ６、ｎｆＳＰ７ 、ｎｆＳＰ８、ｎｆＳＰ９、ｎｆＳＰ１０、ｎｆＳＰ１１、ｎｆＳＰ１２、ｎｆ ＳＰ１３、ｎｆＳＰ１４、ｎｆＳＰ１５、ｎｆＳＰ１６、ｎｆＳＰ１７、ｎｆＳ Ｐ１８、ｎｆＳＰ１９、ｎｆＳＰ２０及びｎｆＡＰ₁₅₈₀から成る群より選択され た核酸分子とハイブリダイズする請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の発明 。 ７４．前記核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下にて、ｎｆＳＰ１₇₇₉ 、ｎｆＳＰ２₉₄₄、ｎｆＳＰ３₁₇₇、ｎｆＳＰ４₆₇₂、ｎｆＳＰ５₁₅₇、ｎｆＳ Ｐ５₂₁₈、ｎｆＳＰ６₉₃₂、ｎｆＳＰ７₈₉₄、ｎｆＳＰ８₂₉₉、ｎｆＳＰ９₂₆₆、ｎ ｆＳＰ１０₃₇₈、ｎｆＳＰ１１₂₅₂、ｎｆＳＰ１２₁₄₄、ｎｆＳＰ１２₂₂₅、ｎｆＳ Ｐ１３₈₅₀、ｎｆＳＰ１４₂₁₃、ｎｆＳＰ１５₂₅₂、ｎｆＳＰ１６₁₆₈、ｎｆＳＰ１ ８₅₃₄、ｎｆＳＰ１９₃₅₉、ｎｆＳＰ２０₈₄₁及びｎｆＡＰ₁₅₈₀から成る群より選 択された核酸分子とハイブリダイズする請求項１７〜２１のいずれか１項に記載 の発明。 ７５．前記核酸分子は、ｎｆＳＰ１₇₇₉、ｎｆＳＰ２₉₄₄、ｎｆＳＰ３₁₇₇、ｎｆ ＳＰ４₆₇₂、ｎｆＳＰ５₁₅₇、ｎｆＳＰ５₂₁₈、ｎｆＳＰ６₉₃₂、ｎｆＳＰ７₈₉₄、 ｎｆＳＰ８₂₉₉、ｎｆＳＰ９₂₆₆、ｎｆＳＰ１０₃₇₈、ｎｆＳＰ１１₂₅₂、ｎｆＳＰ １２₁₄₄、ｎｆＳＰ１２₂₂₅、ｎｆＳＰ１３₈₅₀、ｎｆＳＰ１４₂₁₃、ｎｆＳＰ１５₂₅₂ 、ｎｆＳＰ１６₁₆₈、ｎｆＳＰ１８₅₃₄、ｎｆＳＰ１９₃₅₉、ｎｆＳＰ２０₈₄₁ 及びｎｆＡＰ₁₅₈₀から成る群より選択された核酸分子を有する請求項１７〜２１ のいずれか１項に記載の発明。 ７６．前記核酸分子は、配列識別番号１、配列識別番号２、配列識別番号３、配 列識別番号４、配列識別番号５、配列識別番号６、配列識別番号７、配列識別番 号８、配列識別番号９、配列識別番号１７、配列識別番号１９、配列識別番号２ １、配列識別番号２３、配列識別番号２５、配列識別番号２７、配列識別番号２ ９、配列識別番号３１、配列識別番号３３、配列識別番号３５、配列識別番号３ ７、配列識別番号３９、配列識別番号４０、配列識別番号４１、配列識別番号４ ２、配列識別番号４３、配列識別番号４４、配列識別番号４５、配列識別番号４ ６、配列識別番号４７、配列識別番号５１、配列識別番号５３、配列識別番号５ ５、配列識別番号５７、配列識別番号５９、配列識別番号６１、配列識別番号６ ３、配列識別番号６５、配列識別番号６７、配列識別番号６９、配列識別番号７ １、配列識別番号７３、配列識別番号７５、配列識別番号７７、配列識別番号７ ９、配列識別番号８１、配列識別番号８３、配列識別番号８５、配列識別番号８ ７、配列識別番号８９、配列識別番号９１、配列識別番号９３、配列識別番号９ ５、配列識別番号９７、配列識別番号９９、配列識別番号１０１、配列識別番号 １０３、配列識別番号１０５、配列識別番号１０７、配列識別番号１０９、配列 識別番号１１１、及び配列識別番号１１３から成る群より選択されたアミノ酸配 列を有するタンパクをコードする核酸配列、及び前記核酸分子のいずれかにおけ る対立遺伝子による変異型を有する請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の発 明。 ７７．前記核酸分子は、配列識別番号１６、配列識別番号１８、配列識別番号２ ０、配列識別番号２２、配列識別番号２４、配列識別番号２６、配列識別番号２ ８、配列識別番号３０、配列識別番号３２、配列識別番号３４、配列識別番号３ ６、配列識別番号３８、配列識別番号５０、配列識別番号５２、配列識別番号５ ４、配列識別番号５６、配列識別番号５８、配列識別番号６０、配列識別番号６ ２、配列識別番号６４、配列識別番号６６、配列識別番号６８、配列識別番号７ ０、配列識別番号７２、配列識別番号７４、配列識別番号７６、配列識別番号７ ８、配列識別番号８０、配列識別番号８２、配列識別番号８４、配列識別番号８ ６、配列識別番号８８、配列識別番号９０、配列識別番号９２、配列識別番号９ ４、配列識別番号９６、配列識別番号９８、配列識別番号１００、配列識別番号 １０２、配列識別番号１０４、配列識別番号１０６、配列識別番号１０８、配列 識別番号１１０、配列識別番号１１２、及び前記核酸分子のいずれかにおける対 立遺伝子による変異型から成る群より選択された核酸配列を有する請求項１７〜 ２１のいずれか１項に記載の発明。 ７８．前記核酸分子は、オリゴヌクレオチドを有する請求項１７、請求項１９ま たは請求項２０に記載の発明。 ７９．前記タンパクは、動物に投与された場合に、ノミセリンプロテアーゼタン パク及びノミアミノペプチダーゼタンパクから成る群より選択されたノミタンパ クに対して、免疫応答を誘起可能である請求項７２に記載の発明。 ８０．前記タンパクはタンパク分解活性を有する請求項７２に記載の発明。 ８１．前記核酸分子は、動物に投与された場合にノミ寄生を低減可能である請求 項１７に記載の発明。 ８２．転写調節配列に機能的にリンクされた請求項１７に記載の核酸分子を有す る組換え分子。 ８３．請求項８２に記載の組換え分子を有する組換えウイルス。 ８４．請求項１７に記載の核酸分子を有する組換え細胞であって、前記核酸分子 を発現可能である組換え細胞。 ８５．前記タンパクは、動物に投与された場合に、ノミセリンプロテアーゼタン パク及びノミアミノペプチダーゼタンパクから成る群より選択されたノミタンパ クに対して、免疫応答を誘起可能である請求項１８〜２１のいずれか１項に記載 の発明。 ８６．前記タンパクはタンパク分解活性を有する請求項１８〜２１のいずれか１ 項に記載の発明。 ８７．前記タンパクは、配列識別番号１、配列識別番号２、配列識別番号３、配 列識別番号４、配列識別番号５、配列識別番号６、配列識別番号７、配列識別番 号８、配列識別番号９、配列識別番号１７、配列識別番号１９、配列識別番号２ １、配列識別番号２３、配列識別番号２５、配列識別番号２７、配列識別番号２ ９、配列識別番号３１、配列識別番号３３、配列識別番号３５、配列識別番号３ ７、配列識別番号３９、配列識別番号４０、配列識別番号４１、配列識別番号４ ２、配列識別番号４３、配列識別番号４４、配列識別番号４５、配列識別番号４ ６、配列識別番号４７、配列識別番号５１、配列識別番号５３、配列識別番号５ ５、配列識別番号５７、配列識別番号５９、配列識別番号６１、配列識別番号６ ３、配列識別番号６５、配列識別番号６７、配列識別番号６９、配列識別番号７ １、配列識別番号７３、配列識別番号７５、配列識別番号７７、配列識別番号７ ９、配列識別番号８１、配列識別番号８３、配列識別番号８５、配列識別番号８ ７、配列識別番号８９、配列識別番号９１、配列識別番号９３、配列識別番号９ ５、配列識別番号９７、配列識別番号９９、配列識別番号１０１、配列識別番号 １０３、配列識別番号１０５、配列識別番号１０７、配列識別番号１０９、及び 配列識別番号１１１、配列識別番号１１３、前記アミノ酸配列のいずれかを有す るタンパクをコードする核酸分子の対立遺伝子による変異型によってコードされ るタンパクから成る群より選択されたアミノ酸配列を有する請求項１８〜２１の いずれか１項に記載の発明。 ８８．前記タンパクは、該タンパクを合成するために、同タンパクをコードする 核酸配列により形質転換された組換え細胞を培養することから成る方法により合 成される請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の発明。 ８９．前記タンパクまたはそのミネトープは、動物に投与された場合にノミ寄生 を低減可能である請求項１８または請求項２１に記載の発明。 ９０．前記タンパクまたはそのミネトープは、宿主動物に投与された場合に、該 動物及び同動物の環境におけるノミ負荷を低減可能である請求項１８または請求 項２１に記載の発明。 ９１．前記タンパクは、ノミセリンプロテアーゼ活性阻害剤及びノミアミノペプ チダーゼ活性阻害剤から成る群より選択された阻害剤を同定するために用いられ る請求項１８または請求項２１に記載の発明。 ９２．前記阻害剤は、動物に投与された場合にノミ寄生を低減可能である請求項 ９１に記載の発明。 ９３．請求項１８または請求項２１に記載のタンパクに選択的に結合する単離抗 体。 ９４．前記組成物は更に、賦形剤、アジュバント、基剤及びそれらの混合物から 成る群より選択された成分を有する請求項１９または請求項２０に記載の発明。 ９５．前記組成物は徐放性処方物を有する請求項１９または請求項２０に記載の 発明。 ９６．前記組成物は更に、ノミプロテアーゼ活性を低減させること以外の方法に よって、ノミ負荷を減少させる化合物を有する請求項１９または請求項２０に記 載の発明。 ９７．前記動物は、ノミ成虫、ノミ幼虫及びノミに寄生され易い動物から成る群 より選択される請求項１９または請求項２０に記載の発明。 ９８．ノミ幼虫寄生は、ノミ幼虫が前記治療的組成物を含むノミ成虫糞便を摂取 することによって減少する請求項１９または請求項２０に記載の発明。 ９９．ノミ幼虫寄生は、ノミ幼虫がノミ成虫糞便を摂取することによって減少し 、該糞便は、前記単離ノミプロテアーゼタンパクのうちの１つ以上の投与に応答 して宿主動物にて誘起される抗ノミプロテアーゼ抗体を有し、該ノミ成虫は該投 与後に該宿主動物によって飼料を摂取し、該プロテアーゼはセリンプロテアーゼ 及びアミノペプチダーゼから成る群より選択される請求項１９または請求項２０ に記載の発明。 １００．前記動物は、哺乳類及び鳥類から成る群より選択される請求項１９また は請求項２０に記載の発明。 １０１．前記動物はイヌ及びネコから成る群より選択される請求項１９または請 求項２０に記載の発明。 １０２．前記ノミはイヌノミ属、チョプシラス属、ジアマナス属、エチドノファ ガ属、ノソプシラス属、ヒトノミ属、タンガ属及びネズミノミ属から成る群より 選択される属に属する請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の発明。 １０３．前記ノミは、ネコノミ、イヌノミ、ヒトノミ及びプレックス シムラン スから成る群より選択される種に属する請求項１７〜２１のいずれか１項に記載 の発明。