CN1322214A - 用LAIT/sCD14－蛋白诱导抗生蛋白和抗生多肽 - Google Patents

Abstract

一种减轻脓毒症症状的方法包括直接将需要治疗的哺乳动物的上皮细胞暴露于可溶性CD14,或其活性变体。描述了一种从含有乳腺分泌物蛋白的储存液中获得CD14的方法。描述了一种用可溶性多肽激活B细胞的方法,该多肽具有选自leu－leu－leu－leu－leu－leu－pro－ser、leu－leu－leu－leu－leu－leu－pro－leu、和leu－leu－leu－leu－leu－leu－val－his的氨基酸序列,并且该多肽能被单克隆抗体3C10所特异性识别并能激活B细胞。描述了牛CD14基因组DNA。

Description

用LAIT/sCD14-蛋白诱导抗生蛋白和抗生多肽

发明领域

本发明涉及源自哺乳动物的可溶性LAIT/蛋白(CD14)及其相关蛋白，它可以直接诱导抗生性多肽，尤其是防卫素(defensins)在哺乳动物细胞中的，尤其是上皮细胞中的表达。本发明还涉及鉴定对于CD14直接激活B细胞所必需的CD14部分。

抗生肽以及内毒素对抗生肽的诱导

抗生肽在自然界中广泛分布，并形成广泛的宿主防御机制(Lehrer,R.I.et al.1993,Ann.Rev.Immunol.11:105；Boman,H.G.1995,Ann Rev.Immunol,13:61；Lehrer,R.I.,T.Ganz,and M.E.Selsted,1991,Cell 64:229；Zasloff,M,1992.Curr.Opin.Immunol,4:3)。抗生肽作为先天免疫系统的因子的优势在于它们能无特异性、无记忆地发挥作用。它们的抗菌和抗病毒活性允许它们在感染后短时间内，在后天免疫系统动员之前，延迟或避免微生物的生长(Lehrer,R.I.et al.1993,Ann.Rev.Immunol.11:105；Boman,H.G.1995,Ann Rev.Immunol,13:61；Lehrer,R.I.,T.Ganz,and M.E.Selsted,1991,Cell 64:229；Zasloff,M,1992.Curr.Opin.Immunol,4:3)。防卫素是抗生肽中最大的家族，由29至35个氨基酸残基组成，

并在人类噬中性细胞中占细胞总蛋白的5％以上(Boman,H.G.1995,Ann Rev.Immunol,13:61；Lehrer,R.I.,T.Ganz,and M.E.Selsted,1991,Cell 64:229；Zasloff,M,1992.Curr.Opin.Immunol,4:3)在哺乳动物中已知防卫素是由肺巨噬细胞产生的(Lehrer,R.I.etal.1993,Ann.Rev.Immunol.11:105；Boman,H.G.1995,Ann Rev.Immunol,13:61；Lehrer,R.I.,T.Ganz,and M.E.Selsted,1991,Cell 64:229；Zasloff,M,1992.Curr.Opin.Immunol,4:3)，并且最近在牛气管(Diamond,G.J.P.Ru8ssell,and C.L.Bevins.1996.PNAS 93:5156)和舌头(Schonwetter,B.S.,Stolzenberg,E.D.andM.A.Zasloff,1995,Science 267:1645)的上皮细胞中防卫素的产生有所描述。

有人证明在原代气管上皮细胞中脂多糖形式的内毒素能诱导编码抗生肽的信使RNA mRNA的表达提高十倍(Diamond,G.J.Russell,and C.L.Bevins 1996,PNAS93:5156)。这种被命名为气管抗生肽的多肽是属于β-防卫素家族的。TAP从呼吸粘膜的上皮细胞诱导的机制是通过在上皮细胞中表达的膜CD14(mCD14)。有人观察到当存在对CD14特异的单克隆抗体时导致TAP表达的激活过程受到抑制，这与上皮细胞mCD14的功能相一致(Diamond,G.J.Russell,and C.L.Bevins 1996,PNAS93:5156)。

有一段时间认为mCD14的表达是单核巨噬细胞的独占性标志(Zeigler-Heitbrock,H.W.L.and R.J.Ulevitch.1993.ImmunologyToday 14:121)，但是现在已知它还在源自许多组织的上皮细胞中表达(Feams,C.etal.1995,J.Exp.Med.181:857)。还发现其它组织的上皮内层通过局部表达防卫素对内毒素或炎症产生应答。尤其是，有人表明舌头的鳞状上皮细胞内层对感染或炎症的应答为产生β-防卫素舌抗生肽(Schonwetter,B.S.,Stolzenberg,E.D.and M.A Zasloff,1995.Science 267:1645)。在此研究中表明在舌头上天然损伤周围的上皮细胞中大量存在编码舌抗生肽信使RNA(mRNA)。显然在该篇文献中没有报道mCD14的参与。

以上描述的结果提供了一种免疫应答模型，在该模型中先天免疫应答机制参与到感染或炎症的局部区域中，以便为宿主的最初防御作出贡献。这样，应答于革兰氏阴性菌LPS而局部产生的抗生蛋白和抗生肽可能在后天性免疫应答的攻击之前参与防止细菌的建群或随后的感染。下文通过提供背景知识的方式给出了目前对单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞和内皮细胞中内毒素介导的应答机制的理解概要。

CD14是单核细胞中LPS:LBP复合物的膜受体

LPS形式的内毒素在体内和体外通过单核细胞/巨噬细胞诱导炎症细胞因子(Beutler,B.et.al.Science 232:977；Michie,H.R.et al.1988,New Engl.J.Med 318:1481；Tacey,K.J.1987,Nature 330:662；Waage,A.,Halstensen,A.and T.Espevik.1987 Lancet 1:355)。这些源自单核细胞的细胞因子，包括TNFI,IL-1和IL-6是与脓毒性休克综合症相关的，最终导致多发性器官衰竭。最近的工作描述了CD14作为单核细胞LPS受体的特征，这转而导致了对LPS激活单核细胞/巨噬细胞的机制的最初描述。

在目前的范例中涉及了组成型表达的质膜蛋白，脂多糖结合蛋白(LBP)的参与，该蛋白和LPS形成高亲和性的复合物(Schumann,R.R.et al.1990 Science 249；1429；Wright,S.D.et al.1990 Science249:L1431；Wright,S.D.et.al.1989.J.Exp.Med.170:1231)LBP是由肝脏产生的质膜糖蛋白，在健康成人的细胞中以5-10Tg/ml的量组成型地存在着，并且在急性期应答后其浓度升高到20倍(Schumann,R.R.et al.1990,Science 249:1429；Tobias,P.S.et.al.1992,Cell,Mol.Biol,7:239；Tobias,P.S.,Mathison,J.C.and R.J.Ulevistch 1988,J.Biol.Chem.263:13479；Tobias,P.S.,Soldau,K.and R.J.Ulevitch 1986,J Exp.Med 164:777；Wright,S.D.et al.1990.Science 249；1431；Wright S.D.etal,1989,J.Exp.Med,170:1231)。和LBP结合时，LPS在巨噬细胞和单核细胞中刺激细胞因子产生的能力得以增强(Mathison,J.C.,Tobias,P.S.and R.J.Ulevitch 1991,Pathobiology 59:185；Schumann,R.R.et al.1990 Science 249:1429；Wright,S.D.et al.1990.Science 249:1431；Wright,S.D.et al.1989,J.Exp.Med 170:1231)。

通过糖基磷脂酰肌醇结合的膜CD14(mCD14)(Zeigler-Heitbrock,H.W.L.and R.J.Ulevitch,1993,Immunology Today14:121)的功能是作为LPS-LBP复合物的受体(Schumann,R.R.etal.1990,Science 249；1429；Wright,S.D.et al.1990.Science249:1431)。CD14在单核细胞中和巨噬细胞中高水平地表达，在噬中性细胞中较弱地表达(Ball,E.D.et al.1982.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:5374；Buckle,A.M.Jayaram,and N.Hogg 1990.Clin.Exp.Immunol.81:339；Ferrero,E.et al.1990.J.Immumnol.145:331；Goyert,S.et al.1988,Science 239:497；Haziot,A.etal.1988.J.Immunol,141:547)。鼠前B细胞系70Z/3(Piage,C.J.et al.1978.J.Immunol.121:641)的mCD14的表达水平为免疫荧光方法所不能检测到，并且通过northern印迹杂交法和RT-PGR检测表明编码CD14的信使RNA是阴性的(Filipp,D.and M,Julius未发表的观察；Lee,J.D.et al.1992.J.Exp.Med.175:1697)这种细胞系已为mCD14作为LPS-LBP复合物受体的角色提供令人信服的证据。尤其是，70Z/3细胞对LPS的应答是表达膜免疫球蛋白(mlg)(Paige,C.J.et al.1978,J.Immunol.121:641)。在mCD14^-70Z/3细胞中诱导mIg表达所需要的LPS的浓度比刺激mCD-14单核细胞产生细胞因子所需要的浓度的数量级要大(Lee,J.D.et al.1992.J.Exp.Med.175:1697)。当用编码人CD14的cDNA转染70Z/3细胞时表明诱导mCD⁺细胞克隆表达mIg所需的LPS的浓度比诱导野生型的mCD^-70Z/3亲本细胞所需要的要低10,000倍(Lee,J.D et al 1992,J.Exp.Med.175:1697)。

目前，这些结果为体内LPS介导的mCD14^-白细胞激活的模型提供了实验证据。暴露于LPS时，形成LPS-LBP复合物，这些复合物通过和mCD14相互作用激活单核细胞/巨噬细胞。

在内毒素介导的内皮细胞和上皮细胞激活中的可溶性CD14

和参与LPS介导的mCD14⁺白细胞激活的可能机制相反，对参与LPS介导的内皮细胞和上皮细胞激活机制的了解较少。直到最近内皮细胞和上皮细胞被认为是mCD14⁺。尽管在这些细胞中检测不到mCD14的表达，LPS介导的激活被证明是血清依赖的，并且为CD14的特异抗体所抑制。(Patrick,D.et al.1992,J inf.Dis 165:865；Pugin,J et al.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2744；Arditi,M.et al.1993,Infect,Immun.61:3149)。这意味着CD14在内毒素介导的内皮细胞和上皮细胞激活中起某些作用，尽管这些作用未知。

已经证明可溶的CD14(sCD14)缺少糖基磷脂酰肌醇锚着物，并存在于健康成人的血清中(Bazil,V.et a.1986,Eur.J.Immunol.16:1583)，参与LPS介导的内皮细胞激活(Arditi,M.et a 1993,Infect.Immun.61:L3149；Pugin,J.et al.1993.Proc.Natl.Acad Sci.USA90:2744；Frey,E.A.,et al,1992.J.Exp.Med.176；1665；Read,M.A.et al.1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:9887；Haziot,A.et al.1993.J.Immunol.151:1500)和上皮细胞激活(Pugin,J.et al.1993,Proc.Natl.Acad Sci.UsA 90:2744)。激活过程的血清依赖性被证明是由于sCD14的存在，并且对血清的需要可以为sCD14所取代。在一些研究的LPS介导的内皮细胞激活中LBP不起作用，这意味着sCD14自身是内皮细胞对内毒素应答的激动剂(Arditi,M.etal.1993,Infect.Immun,61:3149；Frey,E.A.,et al.1992,J.Exp Med.176:1665；Read,M.A.et al.1993,Proc.Natl.Acad SciUSA 90:9887)。在其它的研究中发现了血清在内皮细胞和上皮细胞的LPS应答中的双重功能。具体而言，在内毒素介导的内皮细胞激活中sCD14和LBP都是需要的(Pugin,J.et al.1993,Proc.Natl Acad.Sci.USA 90:2744；Haziot,A.et al.1993,J Immunol.151:1500)，这在存在的内毒素浓度很低时尤其显著(Haziot,A.et al.1993.J.Immunol.151:1500)。

以上的实验结果导致了在mCD14^-细胞激活中sCD-LPS复合物起作用的假设。在高LPS浓度时这些复合物被认为是通过LPS和sCD14的直接相互作用而产生的。在低LPS浓度时LBP被认为是首先与LPS相互作用，该相互作用通过目前未知的方式促进了sCD14-LPS复合物的产生。

在支持内皮细胞/水平细胞对LPS的应答的可能机制上以上结果彼此之间可能不一致，但是它们有一个共同点，即该机制(这些机制)和内毒素介导的mCD14^-细胞所涉及的机制明显不同。两项研究都暗示着sCD14作为激动剂发挥功能从而使得mCD14^-细胞对内毒素的应答成为可能，而不是mCD14^-细胞上LPS-LBP的受体发挥作用的。然而，最近的研究表明这可能不是事实，至少对于上皮细胞是如此。

内毒素介导的上皮细胞防卫素的诱导中的膜CD14

如上文所讨论，最近的研究表明内毒素在原代牛气管上皮细胞中诱导了防卫素的表达(Diamond,G.J.P.Russsell,and C.L.Bevins,1996 PNAS 93:5156)并且该表达涉及mCD14。未刺激的上皮细胞被证明是mCD14^-，但是在LPS介导的激活之后它们被诱导为mCD14⁺(Diamond,G.J.P.Russell and C.L.Bevins,1996.PNAS 93:5156)。在原代气管上皮细胞中mCD14的诱导被表明是与上皮细胞中对CD14特异的信息的诱导相关的，这意味着其来源可能是内源性的。进而，LPS介导的防卫素的诱导受到CD14的特异mAb的抑制(Diamond,G.J.P.Russell,and C.L.Bevins 1996 PNAS 93:5156)。

因此这表明LPS介导的上皮细胞激活的潜在机制与在mCD14^-单核细胞和巨噬细胞中观察到的类似。这两种细胞类型的LPS激活途径彼此之间的区别仅仅是两种类型的靶细胞mCD14表达基线水平的不同。涉及内皮细胞的类似研究尚无报道。

缺乏血清/LBP时可溶性CD14直接激活单核细胞

目前为止所描述的范例是LPS形式的内毒素通过它和细胞中mCD14的相互作用介导了单核细胞/巨噬细胞和内皮细胞的激活。反映了LBP参与该过程的血清依赖性在除了一种情况外的所有情况中都得以证明。

如上文所描述，在内毒素介导的内皮细胞的激活/损伤中已经涉及了sGD14。它的功能被假设为增强LPS和细胞的相互作用(Pugin,J.et al.1993,Proc.Natl.A cad Sci.USA 90:2744)。随后的研究表明分离自肾病病人尿液的sCD14能直接刺激人单核细胞产生炎症细胞因子TNFI和IL-6(Sundan,A.et al.1994,Eur.J.Immunol.24:1779)。

人单核细胞是mCD14^-,LPS介导的这两种细胞因子的诱导是血清依赖的(E spevik.T.等，1993,Eur.J.Immunol.23,255.Wright S.D等J.Enp M ed.176:719)相反，出于这种观点，分离自尿的sCD14活性证实是血清依赖的，不受LBP影响，亦不受LBP特异性抗体的影响(Sandan,A.等1994,Eur.J.Immunol 24.177)而且，sCD14刺激人单核细胞产生炎性细胞因子的能力显示出被CD14特异性mAb抑制(Sandan,A.等Eur.J.Immund.24:1779)。

因此，sCD14似乎能和单核细胞上尚未鉴定的受体结构以不依赖于血清的方式直接相互作用，并导致细胞因子的产生。这样内毒素和sCD14能在单核细胞中介导类似的生物学应答。进而，同一种CD14特异mAb,3C10(Van Voorhis,W.C.et a.,1983.J.Exp.Med.158:126)，能同时抑制这两种方式的激活，这意味着涉及内毒素和sCD14的信号途径至少有一部分是共有的，共有的部分可能是在受体结构水平上。CD14特异的mAb 3C10识别CD14的N末端部分，这种识别依赖于CD14分子N末端氨基酸7-14的存在(Juan,T.S.-C.etal.1995.J.Biol.Chem.270:17237)。3C10抑制LPS介导的单核细胞激活的能力被认为是反映了mCD14残基7-14是mCD14和LPS的相互作用位点(Todd.S.C.et al.1995.J.Biol.Chem.270:17237)。与之相反，在没有LPS存在的情况下，mAb3C10抑制sCD14对单核细胞的功能的基础仍然不清楚(Sundan,A.et al.1994,Eur.J.Immunol.24:1779)。最简单的解释认为在单核细胞上存在尚未描述的sCD14的受体结构，即干扰sCD14和这样的结构之间的相互作用的mAb。

可溶性CD14以剂量依赖的方式体外抑制LPS诱导的单核细胞和嗜中性粒细胞的激活

在1993年10月4日发表的国际专利申请No.WO93/19772中描述了通过重组的人类可溶性CD14以剂量依赖的方式体外抑制LPS-诱导的单核细胞和嗜中性粒细胞的激活，至少已发表文件的图1所示的数据是这样表明的。该实验是在LPS-LBP复合物存在的情况下进行的，并且和该复合物的结合相一致，加入CD14以降低复合物和单核细胞以及噬中性粒细胞的膜结合CD14之间的相互作用程度。这一结果的有趣之处在于已知sCD14自身能刺激单核细胞产生炎症细胞因子。

哺乳期相关的免疫营养(Lactation-Associated ImmunoTrophic(LATI))蛋白和B细胞的激活

重组LAIT蛋白(牛CD14)的分离，生物学活性描述、分子克隆和表达的描述参见联合申请的1996年11月18日归档的美国专利申请序列号No.08/746,883和1997年11月18日归档的国际专利申请序列号No.PCT/CA97/00880。

从牛和人类的初乳和乳汁中分离得到一种蛋白质，该蛋白质被命名为哺乳期相关的免疫营养(LATI)蛋白。

使LAIT蛋白和其它细胞因子区分开的的生物学活性是它在成体动物中支持B细胞的生长和分化，因此可能在B细胞激活的调节中起着独特作用。在成体中诱导大多数体液反应需要在“辅助”T淋巴细胞、抗原递呈细胞(APC)和B淋巴细胞之间的一系列细胞相互作用(Spent.J.J.1978.J Exp.Med.147:1159；Anderson.J.et al.1982.Proc.Natl.Aead.Sci.USA 77:1612；Julius,M.H.et al.1982.Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:1989)。这些相互作用是强制性的(Sprent,J.J.1978.J.Exp.Med.147:1159；Andersson,J.et.al.1982.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:1612；Julius,M.H.et.al.1982.Proc.Matl.Acad.Sci.USA 79:1989；Julius.M.H.et.al.1987.Immunol.Rev.95:914)，因此反映了特定的质膜相关分子作为先决信号的转导者的功能。T细胞-B细胞接触的必要性反映了必需的分子相互作用，这种相互作用是由B细胞质膜上表达的CD40，其同源的配基，gp39(或CD40L)介导的，后者在T细胞的质膜上表达(Noelle,R.J.et.al.1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6550；Armitage,R.J.et al.1992,Nature 357:80)。CD40和CD40L之间的相互作用必然将诱导B细胞生长、B细胞分化成免疫球蛋白分泌细胞，以及免疫球蛋白同种型之间的转换(Foy,T.M.et al.1993,J.Exp.Med.178:1567)，进而，由这些相互作用的细胞产生的一系列细胞因子在B淋巴细胞激活、生长和分化的调节中处于中心地位(Andersson,J.et al.1982.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:1612；Noelle.R.J.et.al.1983,Proc.Natl Acad.Sci.USA 80:6628；Hodgkin,P.D.1990,J.Immunol.145:2025；Noelle,R.J.et al.1991,J.Immunol.146:1118；Parker,D.C.1980.Immunol.Rev.52:115；Howardm M.et al.1982,J.Exp.Med.155:914)这些淋巴细胞激活的可溶性介导剂在分离后并不起作用。相反，它们彼此互相补充，各自将B淋巴细胞驱动向激活的下一阶段，使它们可接受后续的和更进一步的激活信号(Julius,M.H.et al.1987.Immunol.Rev.95.:914)。

相反，LAIT蛋白在nM浓度的水平上是B细胞的直接分裂原，并且作为B细胞生长的辅助激活剂，它与在pM的范国内的B细胞抗原受体一起发挥功能。在后一情况下，这些源自抗原的信号将B细胞转化到一种生理状态，在该状态下B细胞能接受T细胞的辅助。当考虑到处于抑制状态的发育中的新生儿时，为新生儿持续提供直接支持B细胞生长和分化的因子，与抗原联合施用是很重要的。

已经证明，与成体胸腺不同(Bill,J.et al.1989,J.Exp.Med.169:1405；MacDonald,H.R.et al.1988,Nature 332:4020)，在个体发生的早期，当胸腺有效产生T细胞时它不会有效除去那些表达潜在自体反应受体的T淋巴细胞(Schneider,R.et al.1989.J.Exp.Med.169:2149；Smith,H.et al.1989,Science 245；749；Ceredig,R.1990Intl.Immunol.2:859；Ceredig,R.and C.Waltzinger,1990.Ihtl.Immunol.2:869)。同时，这些新生儿是健康的。初乳和早期乳汁中含有了解得很清楚的T细胞功能抑制剂，尤其是TGFβ1和TGFβ2，它们抑制T细胞的生长(Sporn,M.B.et al.1987,J.Cell.Biol.105:1039；Massaqgue,J.1987,Cell 49:437；Wrann,M.et al.1987,EMBO J.6:1633；Stoeck,M.et al.1989.J.Immunol.143:3258)。因此，在新生儿中，T细胞的功能似乎可能被这些细胞因子有效抑制以允许一定的时间让胸腺功能成熟。考虑到源自母体的Ig是暂时的并且同时其反映的特异性是母体所遇到的抗原，因此对于新生儿而言开始产生自身保护性抗体显然是很重要的。估计LAIT蛋白的功能是T细胞的代用品，在初次暴露于环境抗原的新生儿中它支持B细胞的生长和分化。LAIT的这种作用因此提供了一种激活免疫系统的替代的，缩短的途径，该途径是独立于T细胞功能的。

牛LAIT-蛋白片段的序列分析揭示了它和人类CD14具有很高的同源性。CD14是后来利用可获得的单克隆抗体通过亲和层析从初乳中纯化得到的，并且CD14和牛LAIT蛋白具有相同范围的活性。编码牛LAIT-蛋白的基因克隆自牛cDNA文库，并且和人CD14在核酸水平上和在蛋白水平上都具有很高的同源性。人和鼠重组CD14以及牛重组LAIT/CD14的制备都是在昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统中进行的，并且每种蛋白都含有来自初乳的牛LAIT蛋白的所有生物学活性，它们的比活和从三种种属中分离得到的天然物质相比2倍以内。

在本发明的上下文中“抗生蛋白”或“抗生多肽”具有抗生特性：(ⅰ)不含半胱氨酸的，线性的，具有或不具有铰链的，大部分是螺旋的肽，(cecropins)(ⅱ)高比例某些残基如脯氨酸和精氨酸，不含半胱氨酸的线性肽；(ⅲ)具有一个二硫键的抗菌肽；(ⅳ)具有两个或多个S-S键，主要或只有β-折叠片的肽，包括但不限于人防卫素，HNP-1，兔防卫素NP-1，鼠防卫素NP-1，牛β-防卫素，TAP，猪protegrin,PG-3和H-s螃蟹tachypiesin；和(ⅴ)源自较大多肽的具有其它已知功能的抗菌肽(Boman,H.G.Ann.Rev.Immunol.13:61)

“防卫素”是一组抗生多肽(Edwards,S.W Biochem istry andPhysio logy of the Neutrophil,1994 Cam bridge University Press pp67-70)。

“脓毒症”是指在病人被微生物侵入时在病人自身中表现出的如下状况：温度高于38℃或低于36℃；心率高于90次每分钟；呼吸频率大于20次每分钟或PaCO₂小于32mmHg；白细胞计数大于12,00mm^-3或小于4000mm^-3，或者不成熟形式大于10％；器官功能紊乱，低灌注或低血压。低灌注或灌注异常包括但不限于乳酸酸中毒，少尿症或精神状态急剧改变(1992,Chestl01:1644)。

在上下文中除非特定地注明，可以是牛，人或鼠的重组的或分离自天然来源的CD14蛋白之任一种，其序列分别相应于SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

本发明提供了一种减轻脓毒症的方法。根据本发明的第一方面，有一个步骤直接将需要治疗的哺乳动物的上皮细胞暴露于有效剂量的复合物，该复合物含有(由这些物质组成或包含)可溶性CD14，或CD14的刺激上皮细胞表达防卫素的多肽片段，或上述CD14或其刺激上述表达的片段的保守替代的变体。

本发明还包括通过施用一种复合物在需要治疗的哺乳动物中增强防卫素表达的方法，该复合物含有可溶性的CD14或CD14的增强上述表达的多肽部分，或上述CD14或其刺激上述表达的片段的保守替代的变体。

施用步骤包括，优选地包括，直接将上述哺乳动物的哺乳动物的上皮细胞暴露于上述复合物。

本发明包括刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的方法，该方法包括对其施用有效剂量的一种复合物，该复合物包含可溶性CD14或CD14刺激上述表达的一个多肽片段，或者上述CD14或其刺激该表达的片段的保守替代变体。

根据一些方面，防卫素的表达在哺乳动物的舌头上进行。防卫素的表达可以在肠道，尤其是，哺乳动物的小肠进行。

根据本发明的整体特征，防卫素在上皮细胞中的的表达是诱导的。

上述CD14可以具有选自SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或它们的保守替代变体。

在另一方面，本发明是减轻脓毒症的方法，包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的可溶蛋白以直接将该哺乳动物的上皮细胞暴露于该蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ ID NO:5的氨基酸序列相比至少63％是保守的，并且具有在上皮细胞中诱导防卫素表达的能力。

替代地，上述蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ ID NO:5的氨基酸序列相比具有至少约68％或约71％或约73％或约78％或约83％或约93％的保守性。

本发明包括一种在哺乳动物中预防性地治疗脂多糖诱导的宿主炎症反应的方法，该方法包括对哺乳动物施用有效治疗剂量的有效剂量的一种蛋白以直接使该哺乳动物的上皮细胞暴露于该蛋白，该蛋白的氨基酸序列相对于标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少63％是保守的，并且具有增强牛上皮细胞中一种或多种防卫素的表达的能力。

本发明包括增强防卫素在需要治疗的哺乳动物中表达的方法，该方法通过在哺乳动物中施用一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序列相对于标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少63％是保守的，并且具有增强防卫素在哺乳动物上皮细胞中表达的能力。

本发明包括一种刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的方法，该方法包括将上述细胞暴露于有效剂量的一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序列相对于标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少63％是保守的，并且具有刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的能力。

本发明包括一种刺激防卫素沿着哺乳动物的胃肠道表达的方法，该方法包括将上述胃肠道暴露于一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序列相对于标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少63％是保守的，并且具有刺激牛上皮细胞表达防卫素的能力。

本发明包括一种刺激防卫素沿着哺乳动物的呼吸道和/或舌头，或小肠道表达的方法，该方法包括将舌头暴露于有效剂量的一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序列相对于标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少63％是保守的，并且具有刺激上皮细胞表达防卫素的能力。

本发明包括一种诱导需要治疗的哺乳动物的上皮细胞表达防卫素的方法，该方法包括施用有效剂量的一种蛋白，该蛋白的氨基酸序列相对于标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少63％是保守的，并且具有诱导上皮细胞表达防卫素的能力。

CD14或多肽部分或变体可以通过重组方法或化学方法得到。

在另一方面，本发明是一种制备CD14浓缩物的方法。该方法包括提供乳腺分泌物的含有蛋白的储存溶液，从上述溶液中分离含有内源CD14的浓缩物；确定浓缩物中CD14的浓度。

上述乳腺分泌物可以是奶、全奶或全奶的含蛋白部分，或者其可以是初乳或初乳的含蛋白部分。

优选地，上述分泌物预先进行了处理，该处理足够温和，以保持CD14诱导或刺激防卫素的产生和/或刺激B细胞的活性。

乳腺分泌物可以是人的或牛的。在CD14是从哺乳动物得到的情况下，在CD14是内源的情况下(即在未进行分子遗传学操作的哺乳动物中)，上述CD14优选地为牛的。

当溶液是液态溶液时，分离步骤可以包括从溶液中盐析蛋白。

CD14浓度的确定包括将从浓缩物得到的样品暴露于对CD14特异的一抗以形成抗体CD14复合物，然后将复合物暴露于对第一抗体特异的第二抗体，其中第二抗体包括报告分子。

在另一方面，本发明是获得CD14的方法，包括提供含有乳腺分泌物蛋白的储存液，从该储存液中沉淀出含有CD14的蛋白组分并将蛋白组分和上清分离。ELISA试验特别方便用于该实验。

另一方面，本发明是获得CD14的一种方法，包括提供含有乳腺分泌物蛋白的贮存液，从贮存液中沉淀出含有CD14的蛋白级分，并从上清液中分离蛋白级分。

沉淀步骤包括盐析出含CD14的蛋白组分。优选地，升高溶液的盐浓度，以使离子强度至少达到硫酸铵饱和水溶液和一定体积的上述乳腺分泌物(天然来源)混合时的离子强度一样高，其中上述硫酸铵溶液的体积等于混合后溶液总体积的65％。

该方法经常包括在分离步骤中得到的CD14的量的测定。

同样，上述乳腺分泌物可以是初乳和/或乳汁，并且可以是牛的或人的，或来自乳腺分泌物中存在CD14的其它哺乳动物。

本发明包括获得CD14的另一种方法，它包括提供含有乳腺分泌物蛋白的储存液；从上述储存液中分离出含有蛋白质的组分，当硫酸铵饱和水溶液和一定体积的上述乳腺分泌物混合时上述蛋白在乳腺分泌物中不溶，硫酸铵溶液的体积等于混合溶液总体积的65％。优选地，该方法包括测定分离步骤得到的CD14的量的步骤。

根据本发明的方法得到的内源CD14蛋白处于适当的可溶形式时可被直接用于激活B细胞。类似地，它们可被用于生产用于这种用途的药物。

根据另一方面，本发明是一种检测含有乳腺分泌物蛋白的组合物中是否存在CD14的方法。该方法包括将该组合物暴露于对CD14特异的抗体；根据在暴露步骤中是否形成CD14-抗体复合物判定样品中是否存在分泌物的内源CD14。

上述分泌物可以进行也可以不进行预先处理，但如果进行预先处理，那么预处理步骤足够温和以允许其保持CD14诱导或刺激防卫素的产生和/或刺激B细胞的活力。

同样，优选地，该方法包括确定样品中CD14的浓度。

在另一方面，本发明是在哺乳动物中防止、减轻或治疗脓毒症的方法，包括对哺乳动物施用从哺乳动物乳腺分泌物中获得的有效剂量的CD14。

优选地，CD14是根据此处描述的方法之一从乳腺分泌物获得的。

CD14可以是包含在液体中，该液体可以包含富含CD14的乳汁的组分。CD14可以包含于可食用的产品中，如食物条(例如，巧克力条或蛋白条)。

在另一方面，本发明包括在含有乳腺分泌物蛋白的组合物中确定内源CD14的量的方法，即，在CD14产生的意义上未进行分子遗传学操作的动物中。该方法包括提供组合物；将该组合物的样品暴露于对CD14特异的抗体并根据暴露步骤中CD14-抗体复合物形成的量确定样品中分泌物内源CD14的量。

本发明包括确定源自乳腺分泌物的产物是否适用于在哺乳动物中诱导或刺激防卫素的产生的方法，该方法包括这些步骤：

提供该产物的样品；并

确定样品中存在的CD14的量。

因此在确定产品的量时本发明的这一方面可被用作预备步骤，当上述产品将被加入到药物或食品等等中，或者将根据本发明的方法被使用，或者将被其它已知可溶性CD14有用的方法使用。

因此，如果分泌物已经预先进行处理，并且处理步骤足够温和以允许保留CD14的诱导或刺激上述防卫素的产生的活性，那将是优选的。

类似地，本发明包括确定源自乳腺分泌物的产物是否适用于哺乳动物刺激B细胞的生长的方法，该方法包括这些步骤：

提供产物的样品

确定样品中存在的内源CD14的量。

在一个优选的方面，抗体被用于确定步骤，更优选地，该抗体是mAb3C10和或识别的氨基酸序列和3C10相同的mAb。

本发明包括使用此处描述的复合物制备用于减轻脓毒症的药物，以及用于增强哺乳动物中防卫素的表达的药物等等。

本发明的另一方面包括在需要治疗的哺乳动物中增强防卫素的表达的方法，该方法包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的重组多肽CD14，该CD14由非天然存在的重组DNA分子编码，该DNA分子含有选自以下一组的第一DNA序列：

(a)根据SEQ ID NO:2编码CD14的cDNA序列

(b)和(a)的非编码链特异性地杂交的cDNA序列，并且它编码表达的多肽也能为特异性的识别人类CD14的抗体所特异性地识别；以及

(c)编码的多肽和(a)或(b)的DNA序列所编码的多肽相同的DNA序列。

其中(b)或(c)的多肽增强上述表达。

本发明的另一方面为刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的方法，该方法包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的重组多肽CD14，该CD14由非天然存在的重组DNA分子编码，该DNA分子含有选自以下一组的第一DNA序列：

(a)根据SEQ ID NO:2编码CD14的cDNA序列

(b)和(a)的非编码链特异性地杂交的cDNA序列，并且它编码表达的多肽也能为特异性的识别人类CD14的抗体所特异性地识别；以及

(c)编码的多肽和(a)或(b)的DNA序列所编码的多肽相同的DNA序列。

其中(b)或(c)的多肽增强上述表达。

优选地，特异性杂交是在严紧的条件下进行的。

“严紧杂交条件”的意思为本领域技术熟练人员所指的常用意思。促使核酸杂交的适当条件包括，例如，技术熟练人员所知的6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC),45℃。以下例子来自Current Protocol inMolecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1989),6.3.1-6.3.6：配制50ml适当的第一杂交溶液，将24ml甲酰胺，12ml去离子水，10ml50％硫酸右旋糖苷，0.5ml 10％SDS混合。适当的第二杂交溶液可以是1％结晶BSA(组分V),1mM EDTA,0.5M Na₂HPO₄ pH7.2,7％SDS。洗涤步骤的盐浓度可选自从严紧性的洗涤，约为2×SSS,50℃，到高严紧性的洗涤，0.2×SSC,50℃。这两种洗涤溶液都可以含有0.1％SDS。此外，洗涤步骤的温度可以从室温的低严紧性条件，约22℃，升高到高严紧性条件，约65℃。引用的参考文献给出更详细的细节，但是，适当的洗涤严紧性依赖于同源性的程度和探针的长度。如果同源性是100％，可以使用高温(65℃到75℃)。如果同源性低，必须使用较低的洗涤温度。然而，如果探针很短，(＜100b0)，尽管同源性是100％也必须使用低温。通常来说，洗涤在低温开始(37℃到40℃)，以3-5℃的间隔逐步升高，直至背景足够低，不至于在放射自显影中成为主要影响因素。

优选地，这样的多肽也能为特异性地识别人CD14的抗体，如mAb3C10，所识别。

本发明的方法包括根据具体情况将气管上皮的局部，哺乳动物的外表皮，尤其是伤口，直接暴露于上述多肽或蛋白。

本发明的方法还包括用于对人皮肤伤口直接局部施用以减轻感染，尤其是细菌感染，的药膏的制备，该方法包括在药膏中掺入一定有效剂量的浓缩物或本发明的其它具有CD14防卫素诱导活性的复合物。

类似地，加入了牛奶产物的组分的婴儿制剂，牛奶或其它液体也是本发明的一部分，其中上述组分含有的CD14的浓度比天然存在的未分离的牛奶产品的浓度高，其中牛奶产品未经能使CD14变性以至于CD14丧失其合乎需要活性的过程的处理。

本发明的组合物可被用于需要抵抗微生物病原体的哺乳动物，其中病原体选自病毒、细菌、真菌和酵母，尤其是当哺乳动物为患有免疫缺陷的人类时。

诱导的防卫素包括RtNP1,RtNP2,RtNP3,RtNP4,HNP1,HNP2,HNP3,HNP3，以及它们的任何组合方式，或HNP1,HNP2和HNP3以及它们的任何组合方式。

优选地，本发明的蛋白或多肽根据具体情况以250μg至2500μg每千克哺乳动物的体重每天的剂量施用，或者以300μg至3000μg每千克哺乳动物的体重每天的剂量施用。

在另一方面，本发明是用可溶性多肽直接激活B细胞的方法，上述多肽的氨基酸序列选自leu-leu-leu-leu-leu-leu-pro-ser；leu-leu-leu-leu-leu-leu-pro-leu；和leu-leu-leu-leu-leu-leu-val-his，并且能被单克隆抗体3C10所识别和能激活B细胞。

在这样的方法中，优选地，氨基酸组成的序列选自SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，或者它们能激活B细胞的保守替代变体，或其能激活B细胞的片段或片段的能激活B细胞的保守替代变体。

本发明包括在基因组中引入一种核酸序列的转基因哺乳动物，该核酸序列编码具有标识为SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽，或编码上述多肽的能直接激活B细胞的片段；或上述多肽能直接激活B细胞的变体；或上述多肽的保守替代变体；或上述片段或其变体的能直接激活B细胞的缀合物，其中上述核酸序列是在哺乳动物内源CD14启动子的控制之下，并且该核酸序列是在哺乳动物的天然存在的核酸序列之外的。

供选地，该核酸序列编码氨基酸序列被标识为SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的多肽，或上述多肽的能直接激活B细胞的片段，或该多肽的保守替代变体，更为优选地，编码氨基酸序列被标识为SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多肽，或上述多肽的保守替代变体，或进而更为优选地，编码氨基酸序列被标识为SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多肽，最为优选地，核酸序列具有被标识为SEQ NO NO:1或SEQ ID NO:2的序列。

优选地，转基因小鼠的基因组中引入了编码一种蛋白的核酸序列，该蛋白能通过一种可溶性多肽直接激活B细胞，该多肽的序列选自leu-leu-leu-leu-leu-leu-pro-ser；leu-leu-leu-leu-leu-leu-pro-leu；和leu-leu-leu-leu-leu-leu-val-his，并且能被单克隆抗体3C10所识别和能激活B细胞。

替代地，可在转基因小鼠的基因组中引入编码本发明的其它蛋白的核酸序列。该核酸序列可以是外源序列。

在另一方面本发明是在基因组中引入了被标识为SEQ ID NO:8的核酸序列的转基因哺乳动物，其中核酸序列是哺乳动物的天然DNA的核酸序列之外的。SEQ ID NO:8包括编码序列(参见SEQ ID NO:1)和非编码部分，在产生只含有编码碱基的mRNA时非编码部分被切除。优选地，核酸序列通过重组技术被引入到哺乳动物或哺乳动物的祖代。优选地，该哺乳动物是牛。

附图简述

图1A示明CD14的特异抗体3C10和MEM-18对天然人类LAIT(Hu-LAIT,nhCD14)介导的B细胞激活的差异抑制(ToddS,-C,Juan.et al.1995,J.Biol.Chem.270:5219)。往96孔平底培养板(Costar)的0.2ml无血清培养基中分别加入注明浓度的mAbs3C10(——),MEM-18(---)或它们的同型非特异性抗体12CA5(IgG2_b)(-)(J.Field,et al.1988,Mol.Cell.Biol.8:2159)和W 325(IgG₁)(-----)(A.F.Williams 1977,Cell 12:663)，培养基中分别含有1Tg/ml天然(n)Hu-LAIT(■)或5Tg/mILPS(●)。37℃温育5小时后往每个培养孔孔中加入按照先前描述的方法(Ratcliffe,M.J.et al.1983.J.Immunol.131:581)分离得到的1.5×10⁵高浮力密度小鼠脾脏B细胞。培养40小时后用1TCi³H-TdR脉冲标记，6小时候在滤垫上收集细胞，胸腺嘧啶的吸收用闪烁分光法测量。结果用没有任何mAb时两种刺激中分别引起的应答的百分比表示。没有刺激时的背景应答大约在0.7到1.7×10³cpm；没有mAb时对5Tg/ml LPS和1Tg/ml nHu-LATI的应答分别为77.8×10³cpm和82.3×10³cpm。偏差条表示三次培养平均值的一个标准偏差。

图1B示明CD14特异抗体3C10对重组(r)Hu-和rBo-LAIT介导的B细胞激活的抑制。往96孔平底培养板(Costar)的0.2ml无血清培养基中分别加入注明浓度的mAbs 3C10或IgG2_b同型非特异性抗体，mAbOX40(Paterson,D.J.et al.1987,Mol.Immunol.24:12)培养基中分别含有15Tg/ml可溶性重组人类CD14(rHu-LAIT)(●),2Tg/ml可溶性重组牛CD14(rBo-LAIT)(↑)或5Tg/ml LPS(Σ)。37℃温育5小时后往每个培养孔中加入按照先前描述的方法(Ratcliffe,M.J.etal.1983.J.Immunol.131:581)分离得到的1.5×10⁵高浮力密度小鼠脾脏B细胞。培养40小时后用1TCi³H-TdR脉冲标记，6小时候在滤垫上收集细胞，胸腺嘧啶的吸收用闪烁分光法测量。结果用没有任何mAb时三种刺激中分别引起的应答的百分比表示。没有刺激时的背景应答大约在0.7到1.7×10³cpm；没有mAb3C10时对5Tg/mlLPS,15Tg/mlrHu-LATI和2Tg/ml rBo-LAIT的应答分别为77.8×10³cpm,10.9×10³cpm和82.3×10³cpm。重复培养之间的标准偏差＜10％。在所有的测试浓度，OX40介导的抑制都小于15％。

图2A和图2B示明在鼠前B细胞系，70Z/3，中LPS和rBo-LAIT诱导膜IgP(mIgP)表达的比较分析。在平底96孔培养板(Costar)0.1ml无血清培养基中加入8×10⁴70Z/3细胞，并在无刺激，或者注明浓度的rBO-LAIT(↑)，源自S.typh in urium(Sigma)的LPS(·)，或源自E.coli突变体D31m4的LPS粗制品(●)存在的条件下培养20小时(Kirkland,T.N.,Qureshi,N.and K.Takayam a 1991.Inf.and Imm.59:131)。收集细胞并荧光素交联的对小鼠IgP特异的mAb187.1(^F187.1)标记。mIgP⁺的细胞的比例用B-D FACSan5通过流式细胞的方法检测。上方图2A的三个频率分布图示明在无刺激(左)，3Tg/ml S.typh in urium LPS(中)和0.1Tg/ml rBo-LAIT(右)存在的情况下37℃培养20小时后mIgP^-70Z/3细胞的比率。图2B显示注明浓度的三种刺激所诱导的mIgP⁺70Z/3细胞的百分比。

图3A示明mAb3C10对rBo-LAIT介导的mIgP⁺70Z/3细胞的诱导。在0.1ml无刺激物(■)，或者含有3Tg/ml源自S.typhinurium(Sigma)的LPS(·)或0.1Tg/ml rBO-LAIT(●)无血清培养基中加入注明浓度的3C10，将混合物加入到平底96孔培养板(Costar)并在37℃培养2小时。在此预温育阶段后往每个培养孔中加入8×10⁴70Z/3细胞，然后在37℃培养20小时，此后收集细胞并用^F187.1标记。mIgP⁺的细胞的比例用B-D FACSan5通过流式细胞的方法检测。示明的是对照应答％，即，分别在rBo-LAIT和LPS诱导时在所示浓度的mAb 3C10存在时观察到的mIgP⁺70Z/3细胞比率除以无mAb 3C10时观察到的mIgP⁺70Z/3细胞比率。当mAb 3C10用于两种刺激之一时，在其任一浓度下同一种型非特异性mAb OX40不介导大于15％抑制。

图3B显示CD14特异性mAb对rHu-LAIT介导的mIgP⁺70Z/3细胞的诱导的抑制。在含有0.75Tg/ml nHu-LAIT的0.1ml无血清培养基中加入注明浓度的mAb 3C10(●),MEM-18(■)或它们相应的同型非特异mAb,12cA5(·)和W3/25(↑)。37℃温育2小时后往每个培养孔加入8×10⁴ 70Z/3细胞，然后在37℃温育20小时，随后收集细胞并用^F187.1标记。mIgP⁺的细胞的比例用B-D FACSan5通过流式细胞的方法检测。示明的是对照应答％，即，在所示浓度的mAb 3C10存在时观察到的mIgP⁺70Z/3细胞比率除以无mAb 3C10并存在0.75Tg/ml nHu-LAIT时观察到的mIgP⁺70Z/3细胞比率。

图4A到图4C示明nBo-LAIT或者源自Rhodopseudomonasshpaeroides(球状红色假单胞菌)(RSDPLA)的LPS，二磷酰基磷脂A在70Z/3细胞中对mIgP⁺的诱导效应。在96孔板(Costar)的0.1ml含10Tg/ml RSDPLA的无血清培养基中37℃培养8×10⁴ 70Z/3细胞2小时。在此预温育阶段后往加入注明浓度的ReLPS(↑，图4A)，或天然Bo-LAIT(·，图4B)，然后在37℃培养20小时，此后收集细胞并用^F187.1标记。mIgP⁺的细胞的比例用B-D FACSan5通过流式细胞的方法检测。进行两组实验作为对照以比较每种此举得到的结果。往用RSDPLA进行过类似的预处理的细胞中加入注明浓度的RSDPLA(▲)。往进行过类似的预处理但不含RSDPLA的细胞中加入注明浓度的ReLPS(■，图4A)。往进行过类似的预处理但不含RSDPLA的细胞中加入nBo-LAIT(●，图4B)。在图4C中平行测定的96孔平底板的0.1ml培养基中接种8×10⁴70Z/3细胞并在37℃温育2小时。在此预温育阶段后往往培养物中加入无刺激物(▲),5Tg/ml LPS(●)，或0.3Tg/ml nBo-LAIT(■)如图4C所示20小时后后收集一个培养板的细胞并用藻红蛋白交联的羊抗鼠IgP特异抗体(Southern Biotechnology)标记。mIgP⁺细胞的比率用B-D FACSan5检测。示明的是对照应答％，即，在所示浓度的RSDPLA存在时观察到的mIgP⁺细胞比率除以无RSDPLA但存在所示刺激物时观察到的mIgP⁺细胞比率(左手纵坐标)。加入刺激物14小时后，第二块板用1TCi的³H-TdR脉冲标记，6小时后用滤纸垫收集细胞，胸腺嘧啶的吸收用液体闪烁分光法测定(右手纵坐标)。

图5A是nHu-LAIT/CD14的简图。画出的两个区域是mAb 3C10所识别的表位(氨基酸7到14)和MEM18识别的表位(氨基酸57道65)。图5B是RSDPLA抑制Hu-LAIT介导的70Z/3分化的可能机制的示意图。RSDPLA可能与Hu-LAIT蛋白的LPS结合位点相互作用，或者RSDPLA可能与70Z/3细胞上假设的LAIT受体相互作用。LPS和LAIT介导的细胞激活的一些因素可能是共有的。图中还示出了MEM-18，根据一种可能的作用方式它可能阻断nHu-LAIT和RSDPLA的相互作用。图5C示明了在RSDPLA存在的条件下各种浓度的mAb MEM18对nHu-LAIT诱导mIgP⁺70Z/3细胞的抑制作用。8×10⁴ 70Z/3细胞在0.1ml含30Tg/mlRSDPLA的无血清培养基中37℃培养2小时。往上述培养物中加入已经与注明浓度的mAb MEM-18预温育2小时的0.75Tg/ml的nHu-LAIT。37℃进一步培养20小时后收集细胞并用藻红蛋白交联的羊抗鼠IgP特异抗体(Southern Biotechnology)标记。mIgP⁺细胞的比率用B-D FACSan5检测。示明的是对照应答％，即，在所示浓度的RSDPLA存在时观察到的mIgP⁺细胞比率除以无RSDPLA但存在0.75Tg/ml nHu-LAIT时观察到的mIgP⁺细胞比率(90％)

图6A示明在分娩后图中所注明的时间从9个受试者取得的成对乳汁和血清样品的nHu-LAIT/sCD14的定量。sCD14的定量用的是可由商业途径获得的ELISA试剂盒(IBL,Hamburg)。得到的结果用sCD14/乳汁(空心)和血清(实心)中总蛋白的比率来表示。每种形状的符号代表不同的受试者。总蛋白用比色检测系统测定(BioRad)。

图6B示明热变性nBo-LAIT的B细胞生长促进活性。按照先前描述的方法(Ratcliffe,M.J.H.and Julius,M.H.1983,J.Immunol131:581)从常规小鼠C57B1/6制备了1.5×10⁵高浮力密度小鼠脾脏B细胞，并且在所示浓度的刺激物存在的条件下在0.2ml无血清培养基中培养。所示浓度的nBo-LAIT是通过稀释10×溶液得到的，上述10×溶液已经在Perkin Elmer GeneAmp PCR系统9600上99.9℃处理10分钟，或者未经处理。处理后样品在冰上冷却5分钟，然后加入到含B细胞的培养物中。40小时时培养物用1TCi³H-TdR脉冲标记，6小时后收集，胸腺嘧啶的吸收用液体闪烁分光法测定。

图7A到图7C示明联合使用连续盐析和排阻层析部分纯化的具有生物学活性的nBo-LAIT/CD14。按照文中所描述制备牛奶乳清和进行盐析。图7A中所示的是澄清乳清(CM)，亲和层析纯化的nBo-LAIT(nBo)以及各种进行测试的(NH₄)₂SO₄级分的特异性免疫印迹。免疫印迹按照下文图7D的描述进行。图7B是用10％的SDS-PAGE和随后的银染图7A中描述的各个级分的蛋白。nBo-LAIT比率最高的62％(NH₄)₂SO₄级分用TN缓冲液(10mM Tris pH8.0,150mM NaCl)平衡的Superdexcl-75排阻层析FPLC柱(Parmacia)进行分子筛分离。用TN缓冲液洗脱蛋白，流速0.4ml/min，在40分钟内收集体积为0.2ml的级分，用OD₂₈₀nm检测器监测蛋白的洗脱图。利用图7D中描述的免疫印迹就nBo-LAIT/CD14检测每个级分。免疫印迹表明这一分离方法中级分47到49含有最高浓度的nBo-LAIT/sCD14。图7C示明亲和纯化的nBo-LAIT/sCD14(nBo-LAIT)在前B细胞系70Z/3中诱导mIgP表达的比较分析。用作分子筛层析的起始材料的62％(NH₄)₂SO₄级分(·)；根据免疫印迹测量含有峰尖含量的nBo-LAIT/sCD14的分离自Superdex-75的级分47(■)48(▲)和49(●)。在存在注明浓度的各种刺激物存在的情况下，在96孔细胞培养板(Costar)的0.1ml无血清培养基中培养8×10⁴70Z/3细胞20小时。收集细胞并用藻红蛋白交联的羊抗鼠IgP特异抗体(SouthernBiotechnology)标记。mIgP⁺细胞的比率用B-D FACSan5通过流式细胞法检测。

图7D示明纯化自牛初乳和牛奶的nBO-LAIT的B细胞刺激活性的比较。如图7A中所描述，通过提高(NH₄)₂SO₄浓度对澄清的初乳乳清和牛奶乳清进行连续盐析。62％(NH₄)₂SO₄级分溶解和脱盐后用交联到Sephadex 4B上的mAb 3C10亲和层析sCD14。见初乳(·)和牛奶(●)亲和层析得到材料以所注明的浓度加入到含有1.5×10⁵按照先前描述的方法分离得到的高浮力密度脾脏B细胞的0.2ml无血清培养基中。在40小时用1TCi³H-TdR脉冲标记培养物，6小时后用滤垫收集细胞，胸腺嘧啶的吸收用闪烁分光法测量。图7D中的插图代表牛奶(M)和初乳(C)的牛sCD14。用10％SDS-PAGE分辨250ng蛋白然后将蛋白转移到PVDF膜上。接着用5％脱脂牛奶封闭1小时，蛋白用兔抗牛CDl4多克隆抗体以及马辣根过氧化物酶交联的羊抗兔IgG(BioRad)显示。信号用ECI检测(Amersham)。

图8A示明用于检测对牛气管抗生多肽(TAP)特异的mRNA的寡聚核苷酸探针的序列。图8B示明用于检测对对牛微管蛋白特异的mRNA的寡聚核苷酸探针的序列，用作负载对照。

图9A示明利用LPS，源自牛(nBo-LAIT)和人(nHu-LAIT)的天然LAIT，以及利用源自哺乳动物表达系统(rBo-C127)或杆状病毒表达系统(rBo-Sf9)的重组LAIT蛋白在原代气管上皮细胞中诱导气管抗生多肽(TAP)mRNA的表达。牛气管上皮细胞原代培养物的制备按照先前发表的方法进行(Diamond,G.et al.1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5156)。在1ml含有注明浓度的各种刺激物的无血清培养基中培养5×10⁵气管上皮细胞。37℃培养16小时后用Trizol方法(Gibco)从各种培养物中分离总RNA，并且将20TgRNA上样到1.2％甲醛/琼脂糖凝胶上。然后用真空印迹仪(Vaccum blotter,Pharmacia),10×SSC将分离后的RNA转移到尼龙膜上(GeneScreen,Dupont)，并根据制造商的建议进行紫外交联。1∶1混合5’-端标记的TAP寡聚探针(参见图8A和图8B)并且与在50％(体积/体积)甲酰胺/6×标准柠檬酸盐溶液(SSC)/5×Denharts/0.5％SDS/10％(wt/vol)硫酸右旋葡萄糖苷/100g/ml鲑鱼精DNA在42℃中固定的RNA杂交16到20小时然后用2×SSC,0.1％SDS 65℃洗涤30min。通过测量每条泳道的牛微管蛋白的量使上样归一化。用高严紧性洗涤条件进行与牛微管蛋白特异性寡聚探针杂交，上述高严紧性条件为0.1×SSC,1％SDS,65℃2小时。利用Posphorlmage(Molecular Dynamics)通过测量上样的对照探针的信号强度得到的相对RNA含量使得TAP的信号强度归一化。

图9B示明在原代气管上皮细胞中LPS和nBo-LAIT/sCD14诱导气管抗生多肽(TAP)mRNA表达的时间过程。原代气管上皮细胞的制备根据图9A。所有的平行培养物都含有1Tg/ml LPS或1Tg/ml nBo-LAIT/sCD14。在注明的时间点分离总RNA，在琼脂糖凝胶上分辨，并首先用TAP特异性寡聚探针探测，然后用微管蛋白特异性寡聚探针探测，如图9A所描述。TAP信号强度归一化为利用Posphorlmage(Molecular Dynamics)测量上样的对照探针的信号强度得到的相对RNA含量。

优选实施方案的描述

下文所描述的实验显示了在无血清的培养基中，在重组形式的牛和人LAIT蛋白/sCD14的诱导下，分离自小鼠脾脏的高浮力密度B细胞进入并且通过细胞循环。在实验中还表明对人CD14的N末端残基7-14特异的mAb 3C10，而不是对残基57-65特异的mAb MEM-18，能特异性地抑制重组和天然的牛和人LAIT蛋白/sCD14对B细胞的生长促进活性。

还证实了在不含血清的合成培养基中，重组牛和人LAIT-蛋白/sCD14体外诱导mCD14^-,mIg^-鼠pre-B细胞系70Z/3向mIg⁺状态的分化。

还表明该过程被mAb 3C10，而不是mAb MEM-18抑制。

实验还表明LPS和重组牛LAIT-蛋白/sCD14诱导的鼠前-B细胞系70Z/3向mIg⁺的转化受到源自Rhodopseudomonassphaeroides(RSDPLA)的二磷酰基脂A的抑制。

实验还表明人类受试者的初乳中含有的天然人类LAIT蛋白/sCD14的浓度比起分娩后同一时间同一受试者的血清样品含有的浓度要高100到400倍。初乳和乳汁中人LAIT蛋白/sCD14纤对血清的浓度升高能持续到分娩后400天。

实验表明直到分娩后200天，从乳汁中观察到的天然牛LAIT蛋白/sCD14的活性和在牛初乳中观察到的活性是可比的。实验表明源自牛乳汁的LAIT/sCD14蛋白能诱导源自小鼠的高浮力密度脾脏B细胞进入和进行细胞循环，在不含血清的合成培养基的体外实验中，其比活和在源自初乳的天然LAIT蛋白/sCD14是可比的。

实验表明亲和纯化的nBo-LAIT的B细胞生长促进活性在99℃沸腾10分钟后显著降低。

实验表明按照下文详细描述的方法用(NH₄)₂SO₄从澄清牛乳清中连续盐析蛋白能在62％(NH₄)₂SO₄级分中富集天然牛LAIT蛋白/sCD14。这种从牛乳清得到的62％(NH₄)₂SO₄级分能在体外刺激mCD14^-,mIg^-鼠前B细胞系70Z/3向mIg⁺转化。

牛乳清62％(NH₄)₂SO₄级分蛋白的分子筛层析能得到的富含生物活性天然牛LAIT蛋白/sCD14的级分。这些富含级分在体外刺激mCD14^-,mIg^-鼠前B细胞系70Z/3向mIg⁺转化的特异性活性比牛乳汁62％(NH₄)₂SO₄级分的活性要高到约100倍。

实验表明LPS，天然形式的牛和人LAIT蛋白/sCD14以及在哺乳动物和杆状病毒表达系统中产生的重组形式的牛LAIT蛋白/sCD14分别都能在原代气管上皮细胞中诱导气管抗生多肽(TAP)的表达。

实验

LAIT蛋白/sCD14介导的B细胞激活受到MAb 3C10的抑制

CD14特异性抗体，3C10和MEM18抑制LPS-LBP复合物介导的单核细胞激活以及抑制它们随后产生炎症细胞因子。进而，mAb 3C10能抑制sCD14介导的单核细胞激活。后一结果与单核细胞上存在sCD14受体是一致的，并且sCD14和这些假设的受体的相互作用位点和单核细胞上mCD14和LPS-LBP复合物相互作用的位点相同或非常相近。由于单核细胞上mCD14^-,3C10介导的对sCD14功能的抑制可能是由于它与sCD14的相互作用，或者在目的单核细胞上表达mCD14，或者两者都有。

图1A中的结果表明了CD14特异性mAb抑制天然人LAIT蛋白/sCD14介导的B细胞激活的能力的差异。mAb 3C10，而不是mAb MEM-18，也不是它们相应的同型对照mAb，能抑制LAIT蛋白诱导的B细胞生长，而没有mAb能抑制LPS诱导的B细胞生长。图1B中的结果表明CD14特异mAb能抑制rBo-LAIT/sCD14和rHu-LAIT/sCD14介导的鼠B细胞的生长，而不影响LPS诱导的B细胞生长。

由于B细胞的mCD14的表达还不确定，这些结果并不能区分mAb 3C10对sCD14介导的B细胞激活的抑制的潜在机制。进而，此实验中用作靶细胞的高浮力密度鼠B细胞的纯度大约在88％到95％之间，污染的细胞是mCD14⁺。特别是，已经证明这些B细胞群含有编码CD14的mRNA(PCT申请No.PCT/C97/00880)。为澄清LAIT/sCD14介导B细胞激活的机制，进行了两个实验。

通过荧光激活细胞分类，使基于其mIgP表达而分离的B细胞纯度大于90％。Morthern印迹分析表明，这群B细胞对于限制性CD14特异的mRNA是阴性的。随后证明，这一“CD14”B细胞群对于源自初乳的天然Bo-LAIT/sCD14的应答和未经此技术纯化的一样强(PCT申请N o.PCT/CA97/00880)。用于确定mCD14是否参与LAIT蛋白介导的B细胞激活的方法需要测定其诱导CD14^-前B细胞系，70Z/3分化的能力。

LAIT/sCD14诱导的mCD14-前B细胞系的分化

免疫荧光方法不能检测出膜免疫球蛋白阴性(mIg^-)的鼠前B细胞系70Z/3(Paige,C.J.et al.1978.J.Immunol..121:641)，的mCD14表达，并且Northen杂交和PR-PCR分析都表明其编码CD14的mRNA为阴性(Filipp,D.andM.Julius未发表的数据；Lee.J.D.et al.J.Exp.Med.175:1697)。用LPS或IFN-K刺激时70Z/被诱导到mIgP⁺状态(Paige,C.J.et.al 1978.J.Immunol.121:641)。图2中的结果表明rBo-LAIT/sCD14诱导70Z/3向mIgP⁺的分化和LPS一样有效。该结果表明在70Z/3细胞上有rBo-LAIT的受体，进而，该受体不是mCD14。该方法因此提供了一种检测mAb 3C10介导的LAIT/sCD14生物活性抑制的mCD14依赖性的手段。

LAIT/sCD14诱导的70Z/3分化受到mAb 3C10的抑制

图3A中的结果表明3C10抑制LAIT/sCD14诱导的mIgP在70Z/3上的表达。LPS介导的mIgP诱导不受mAb 3C10的抑制，表明该抑制是对LAIT/sCD14特异的，进而表明了mAb 3C10介导的抑制的潜在机制并不需要其与70Z/3的直接相互作用。

图3B中的结果表明不是所有的CD14特异抗体都抑制LAIT蛋白/sCD14介导的70Z/3向mIgP⁺状态的分化。特别是，mAb 3C10，而不是同样对CD14特异的mAb MEM-18，也不是它们相应的同型对照抗体，能抑制重组人LAIT蛋白/sCD14介导的70Z/3向mIgP⁺状态的分化。这些结果表明mAb3C10和LAIT/sCD14相互作用并掩盖LAIT/sCD14和70Z/3细胞上表达的假设的LAIT/sCD14受体相互作用的决定簇。

内毒素和LAIT蛋白/sCD14共有信号途径

如在背景部分所讨论，许多模型被提出以解释LPS诱导单核细胞激活以及它们随后产生炎症前细胞因子的机制。作为内毒素可能受体的mCD14在假设的机制中处于中心地位。虽然mCD14的表达降低了诱导细胞激活所需要的LPS浓度的数量级，但它并不能决定LPS介导的激活。特别是，诱导mCD14^-70Z/3细胞表达mIgP所需要的LPS浓度比刺激mCD14^-单核细胞表达细胞因子所需要的浓度要高很多(Lee,J.D.et al.1992.J.Exp.Med.175,1697)。进而，当用编码人mCD14的cDNA转染70Z/3细胞时诱导mCD14^-克隆表达mIg所需要的LPS的浓度比诱导野生型mCD14^-的亲本70Z/3细胞系所需要的浓度低10,000倍。进而，在这些情况下LPS刺激的效率是血清依赖性的，这反应了LBP的参与(Lee,J.D.et al.1992.J.Exp.Med.175,1697)。因此，在强调mCD14在介导细胞和LPS-LBP复合物相互作用的中心位置的同时这些结果还表明LPS的激活存在独立于mCD14的途径，该途径是独立于血清的，因此也是独立于LBP的。

接着的问题是LPS激活70Z/3的mCD14独立途径是否和LAIT/sCD14对70Z/3的激活途径有共同的信号元素。图4的结果表明这种情况是可能的。先前已经证明源自LPS的二磷酰基脂A能抑制LPS对70Z/3的激活(Kirkland,T.N.Quershi,N.and Takayama,K.1991.Infection and Immunity 59:131)。尤其是，70Z/3与含有二磷酰基脂A(RSDPLA)的培养基预保温能随后抑制LPS诱导的mIg表达。图4A还表明在测试的浓度范围内即0.1至30Tg/ml RSDPLA自身不会诱导70Z/3表达IgP。图4B表明70Z/3与含有10Tg/m RSDPLA的培养基的预温育不仅抑制nBo-LAIT诱导的IgP表达并远远高于LPS作为刺激物时的效力，在所有测试的nBo-LAIT的浓度范围内至少能使nBo-LAIT介导的诱导被抑制10倍。图4C表明虽然RSDPLA抑制LPS和nBo-LAIT/sCD14诱导70Z/3表达mIgP，在任何测试的浓度，即0.03Tg/ml到10Tg/ml，它都不抑制70Z/3的生长。

RSDPLA对LPS介导的激活的抑制是同构体的抑制，因为前者是源自LPS，并且RSDPLA的抑制被认为是由于它和70Z/3所表达的生理学上的脂A受体的竞争结合。RSDPLA抑制LAIT/sCD14介导的激活的能力意味着LAIT/sCD14和LPS共有相同的受体元件，以及/或是由于RSPDLA和先前描述的CD14上的LPS相互作用序列，残基57-64(Juan,T.S.-C.et al.1995.J.Biol.Chem.270:5219)，相互作用，尽管LPS独立于LAIT/sCD14的功能，在这些实验中上述相互作用反过来抑制了LAIT/sCD14的活性。

RSDPLA通过直接和LAIT蛋白/sCD14的结合抑制LAIT蛋白/sCD14的功能的可能性的评估见图5。图5A示明了LAIT蛋白/sCD14的示意图并且突出了作为mAb 3C10和MEM18的结合位点的两个区域。MEM-18能阻止CD14和LPS的结合，因此残基57-65被认为是CD14上的LPS结合位点。图5B阐明了RSDPLA介导对LAIT蛋白/sCD14功能的抑制的两种可能的潜在机制。RSDPLA或者直接和LPS以及LAIT蛋白/sCD14共有的受体元件相互作用，或者可能直接结合LAIT蛋白/sCD14。如果后者成立，那么用mAb MEM-18(图5B)阻止RSDPLA和LAIT蛋白/sCD14的相互作用将干扰RSDPLA对LAIT蛋白/sCD14功能的抑制。如图5C所示，天然人类LAIT蛋白/sCD14与mAb MEM-18的预保温并未改变RSDPLA抑制LAIT蛋白/sCD14诱导70Z/3表达mIgP的能力。

在此已证明是mAb 3C10，而不是mAb MEM18，能够抑制LAIT/sCD14对成熟的鼠B细胞(图1A)以及对鼠前B细胞系70Z/3(图3A和图3B)的功能。如先前所描述，mAb 3C10识别CD14上的序列，残基7至14，该序列对于LPS介导的信号是必需的，但不是LPS结合所必需的(Juan.T.S.-C.et al.1995.J.Biol.Chem.270:17237)。由于mAb 3C10抑制不依赖于LPS的LAIT/sCD14信号，这意味着LAIT/sCD14上的残基7-14参与了该配基与假设的膜受体结构之间的相互作用。进而，已经证明对CD14上参与LPS结合的序列特异的，并且能阻止LPS-CD14相互作用的mAb MEM18对于RSDPLA介导的对LAIT蛋白/sCD14激活的抑制没有影响。因此，尽管尚未明确证明，我们更倾向于RSDPLA通过竞争共有的受体元件抑制LAIT/sCD14的信号的解释。

LAIT/sCD14在人初乳和乳汁中富集

考虑到可溶性Hu-LAIT对于新生婴儿可能具有重要作用，检测了分娩后人类女性的Hu-LAIT表达方式。在分娩后不同时间从9个人类受试者取得了初乳和乳汁样品。由于已知健康人受试者的血清中含有大约1-5Tg/ml的sCD14，从上述的9个受试者取得了血清样品以确定是否血清中含有的sCD浓度和乳腺分泌物中观察到的平行。用商业上可购得的ELISA试剂盒进行CD14定量，总蛋白的测定用的是可由商业途径获得的比色检测系统。图6A中出示的结果是每对乳汁和血清样品的Tg CD14/mg总蛋白。如图中所示，人乳汁含有的sCD14比同一个人的血清的要高100-400倍。还表明sCD14在乳汁中相对于血清的富集一直持续到分娩后400天。

亲和纯化的nBo-LAIT的热不稳定性

必须小心避免可能降低CD14或感兴趣的多肽变体的合乎需要的活性的条件。图6B示明了将亲和纯化的nBo-LAIT在99℃沸腾10分钟的影响。B细胞吸收的胸腺嘧啶大大降低，这表明它的B细胞刺激活性如果不是完全丧失也是极大降低。

从乳汁中部分纯化具有生物活性的牛LAIT-蛋白/sCD14；源自初乳和乳汁的牛LAIT-蛋白/sCD14具有可比的生物学活性

以前不知道可溶性CD14存在于母牛的乳汁中。在本文的上下文中，术语“乳汁分泌物”包括初乳和乳汁。“初乳”是从后代的出生开始并持续到固定的一段时间的乳腺分泌物，上述固定的时间通常不超过24小时。“乳汁”是初乳之后的乳腺分泌物。本领域中的技术熟练人员很容易分辨初乳和乳汁。初乳通常是在分娩后头几个小时到开始吸奶之前得到的。在此描述的实验，以及牛初乳被用作bo-LAIT来源的PCT/CA97/00880中初乳是在分娩后1个小时并在吸奶之前得到的。

先前用于从牛初乳中分离LAIT的方法(PCT/CA 97/00880)在此用于从乳汁中得到LAIT。未进行巴氏消毒的全牛奶来自研究农场。通过检测在液体培养基和血平板(blood auger plate)中的生长以确定培养基是无菌的。只有无菌的材料才被用于此处描述的实验。

制备澄清乳清时首先将初乳在4420g离心30分钟以除去细胞和细胞残渣。然后这一步离心的上清在250,000g离心2小时。弃除浮着的脂类和沉淀的酪蛋白，澄清的初乳乳清进行进一步分离。

乳清中蛋白的盐析是通过添加饱和硫酸铵溶液，使蛋白在(NH₄)₂SO₄中连续沉淀而完成的。所使用的逐步升高的盐浓度是42％、50％、62％、65％(v/v)的硫酸铵(AS)。因此，42％沉淀材料的上清中AS浓度被升高到50％；50％沉淀的材料被取出，剩下的上清中AS的浓度被升高到62％；如此类推。每一次AS沉淀的沉淀物溶于含有0.15M NaCl和1mM AEBSF的10mM Tris-HCl pH8.0,(TNAEBSF)中。这些级分被除盐，用10DG柱子将缓冲液置换成TNAEBSF，并检测生物活性。

用(NH₄)₂SO₄从牛乳清中连续盐析蛋白使得天然牛LAIT蛋白/sCD14富集于62％(NH₄)₂SO₄级分(比较图7A和图7B)。源自牛乳清和初乳乳清的62％(NH₄)₂SO₄级分的蛋白浓度分别为8-15mg/ml和47-65mg/ml。源自乳汁和初乳的62％(NH₄)₂SO₄级分中LAIT蛋白/sCD14的浓度分别为1-5Tg/ml和5-12Tg/ml。因此，从这两种来源的LAIT蛋白/sCD14的产量是可比的，在0.15-0.26Tg/mg蛋白之间。

然后对62％级分中的活性进行富集。五十五毫克的62％AS富集级分被上样到阴离子交换柱上，然后用10mMBis-Tris丙烷中的50mM到400mM NaCl盐梯度，以及同时进行的7.5-9.5的pH梯度分离上述材料。图7C是源自乳汁的牛LAIT蛋白/sCD14的部分纯化级分与同样来源的亲和纯化材料诱导70Z/3表达IgP的对比分析。如图所示，62％(NH₄)₂SO₄级分的比活大约比亲和纯化的源自乳汁的牛LAIT蛋白/sCD14低10,000倍。图7C还显示了62％(NH₄)₂SO₄级分在Superdex75分子筛树脂上进一步分离后得到的含有LAIT蛋白/sCD14主要活性(根据免疫印迹分析)的级分的生物学活性。级分47-49的比活比62％(NH₄)₂SO₄级分要高100倍，这和LAIT蛋白/sCD14浓度的相应提高是一致的。

图7D中所示的是源自乳汁和初乳的牛LAIT蛋白/sCD14介导的B细胞生长的比较分析。如图所示，源自乳汁的材料的比活和源自初乳的一样高。图7D中的插入图示明免疫亲和纯化的乳汁和初乳LAIT蛋白/sCD14。

因此本实验表明LAIT蛋白/sCD14天然存在于牛奶中，并且可能浓缩和纯化乳汁蛋白并保持B细胞激活活性。

LAIT/sCD14在原代牛气管上皮细胞中诱导TAP特异mRNA

如上文所述，LPS和LAIT/sCD14共有相同的受体元件的可能性导致了它们可能具有相同的生物学活性。在此研究了LAIT/sCD14在防卫素的诱导中起一定作用的可能性。最近牛特有的防卫素分子已有描述(Diamond,G.J.P.Russell,and C.L.Bevins.1996.PNAS 93:5156；Schonwetter,B.S.Stolzenberg,E.D.and M.A.Zasloff.1995.Science 267:1645)。因此制备了牛TAP的寡聚核苷酸探针以评估LPS和LAIT/sCD14体外诱导这种抗生多肽的信使的相对能力。

图8A示明了用于在原代牛气管上皮细胞中探测牛气管抗生肽(TAP)的寡聚核苷酸探针的序列。TAP是38氨基酸的多肽，它的表达似乎局限于牛呼吸道的柱状上皮细胞(Diamond,G.et al.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5156)。

原代牛气管上皮细胞的制备根据先前描述的方法进行(Diamond,G.et al.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5156)。准备24孔的培养板，每个孔含有1ml无血清培养基以及约5×10⁵上皮细胞，用注明浓度的(图9A)LPS、天然形式的人和牛LAIT蛋白/sCD14，或用哺乳动物表达系统(C127)或杆状病毒表达系统(Sfq)制备的重组形式的Bo-LAIT/sCD14刺激16小时。源自乳汁的牛LAIT被用于这些实验。如图9A所示，1Tg/ml天然或重组LAIT/sCD14诱导出的TAP特异mRNA的水平和1Tg/mlLPS的可比，并且比未刺激的细胞中观察到的信号升高15-20倍。图9A还示明了从牛微管蛋白特异mRNA得到的信号，这表示上样到每个泳道的RNA的量是可比的，并且被用于使TAP mRNA信号的归一化。

图9B中所显示的是1Tg/ml LPS或天然牛LAIT蛋白/sCD14在原代牛气管上皮细胞中诱导TAP mRNA的时间过程的比较研究。上皮细胞的培养按照图9A中所描述，在注明的时间点测量TAP特异mRNA的表达。如图所示，根据微管蛋白mRNA的水平进行归一化之后两种刺激物诱导TAP mRNA的表达的峰值都在16小时(图9B)。

因此本发明提供了从乳腺分泌物中制备CD14浓缩物的方法。上述分泌物可以是初乳或乳汁，或两者。上述分泌物可以来自牛或人或其他种属。由于牛CD14天然存在于牛乳汁中，因此生产内源牛CD14浓缩物的工业方法似乎是很有前途的。在一些情况下在遗传上改变一些生物体以生产CD14是优选的。这在下文描述。

由于对牛奶的热处理可能减低或破坏CD14的有益特性(防卫素诱导活性，和/或B细胞刺激活性)，避免对牛奶进行这样的预处理以得到CD14是必要的或合乎需要的。一种“浓缩”CD14的方法是上文所描述的盐析方法。但对于本领域的技术熟练人员而言这并不是唯一的方法。例如，可以使用离子交换层析，分子筛层析。此处所描述的方法可以进行改善和优化以用于商业生产CD14浓缩物或分离物。并且可以根据本领域中技术熟练人员所已知的方法除去乳汁或初乳中不合乎需要的其它组分。这些方法的例子在本文中有所描述，其中乳汁进行离心并且除去漂浮的脂类，将含蛋白的液体(乳清)从离心时形成的酪蛋白溶液上倒出。

“分离”的CD14是指从至少一种污染物分开的，经过鉴定的CD14蛋白，该污染物通常在天然状态下与CD14在一起，例如在动物或人的CD14源中。在CD14被用作药物的优选实施例中CD14将被从其初始状态的蛋白中被分离至药用上可接受的纯度水平。在优选的实施例中，CD14蛋白将被纯化至大于蛋白重量的95％，最为优选地，大于蛋白重量的99％，蛋白重量的确定用的是Lowry法。这些是优选的纯化程度。

CD14“浓缩物”是指从天然来源得到的CD14蛋白，该蛋白已经经过处理使得呈现于浓缩物中的的浓度大于从天然来源得到的浓度。

“可溶性”CD14的意思为例如不通过糖基磷脂酰肌醇锚着物与膜结合的CD14。

涉及处理时，在浓缩的CD14中保留合乎需要的CD14活性是很重要的。因此，例如，在生产用于激活B细胞的CD14时含有CD14的溶液不得在99□C加热10分钟以上，已知这些条件严重地降低CD14的这种活力。参见图6B，图6B证明在这些条件下亲和纯化的n-bo-LAIT的活性基本上丧失。

使用此处描述的技术，技术熟练的人员很容易确定对所需要的活性有害的或相对来说较不利的条件。例如，可以对含有CD14的溶液进行不同时间(例如，1分钟，2分钟，……10分钟)的各种温度(例如，40□C,50□C,60□C,70□C等等)处理，然后根据此处所公布的方法确定处理对B细胞刺激活性的影响。类似地，通过类似的方案很容易确定这些的条件对在上皮细胞中诱导防卫素的影响。其他条件的影响，例如盐的影响，或其它可能用来处理乳汁的化学物质的影响，也很容易确定。应当谨慎避免CD14暴露于已被证实不利于其所需活性的条件。

当CD14经过浓缩时可根据常规方法确定CD14的量或浓度。一种受欢迎的方法是基于化学发光的ELISA检测。对于检测人CD14可以使用可由商业途径获得的试剂盒(IBL,Hamburg,Germany)。

对于牛或其它种属CD14的检测，技术熟练人员可以很容易建立一座ELISA方法，以下是例子。按照PCT申请No.PCT/CA 97/00880中所描述的方法制备重组CD14。重组材料被用于产生标准曲线。在兔中产生抗重组分子的多克隆抗体并分离IgG成分。然后将IgG固定到ELISA板上并洗涤以除去过量的(未结合的)免疫球蛋白。加入BSA(牛血清白蛋白)以“封闭”ELISA板上未反应的位点。在很广的浓度范围内滴定重组蛋白的浓度，例如，从100μg到1ng每毫升，浓度每次增加10倍。洗板。通过和酶交联标记抗体，例如，马辣根过氧化物酶，将酶联抗体暴露于滴定板，保温，洗去过量抗体。通过加入酶底物、显色并在ELISA读板机上读数而显示结合的外抗体。

曲线的线性部分(吸收对蛋白浓度)被用作标准曲线，因为这通常是合适的灵敏度范围。结合的抗体的量(如光密度所示)相应于该蛋白的一个已知浓度。为了确定该蛋白在未知样品中的浓度，顺序稀释的未知样品被加入到一块新ELISA板以得到吸收值适当的点(处于标准曲线的范围内)并计算该蛋白在原来未知样品中的浓度。

通常可以为任何种属的CD14的建立这样的检测方法，只要能得到该CD14的多克隆抗体。

当说一种抗体对具有特定氨基酸序列的多肽(或其它抗原)“具有特异性”时的意思为，或者说技术熟练人员将如此理解，该抗体和多肽将以高度选择性的方式结合，并且该多肽不会与其它抗原所引起的抗体结合。在这种情况下可以对等地说该多肽被该抗体特异性地识别”。

一旦确定了一种给定CD14浓缩物的浓度，如果它没有其他不合乎要求的成分的话，它就可以以合乎需要的量用于加入到药物，食用品等等中。因此，例如，在将含有10(500)TgCD14的食物条中可以加入0.1(5)g含有100Tg/gCD14的浓缩物。

将液体浓缩物转化为固体形式也许是合乎需要的，例如通过将该液体进行蒸发、冻干或通过其它技术。

如果CD14处于液体中，例如婴儿制剂中，那么有时包括一种或两种防腐剂以保持CD14的活性也许是合乎需要的。

本发明有一些惊人地简单但却非常有用的方面。例如，本发明的一个方面是检测含有乳腺分泌物蛋白的组合物中CD14存在的检测方法。这样的方法尽管应用起来很直接，但是在没有关于在乳腺分泌物，尤其是牛乳汁中，天然存在CD14的知识之前是不可能的。根据该方法，上述组合物被暴露于对CD14特异的抗体然后根据在暴露步骤是否形成CD14抗体来确定在样品中是否存在分泌物的内源CD14，举个例子，ELISA检测。

本发明还提供了确定含有乳腺分泌物，尤其是牛乳汁，的组合物中的内源CD14的方法。提供该组合物。将样品暴露于对CD14特异的抗体并根据暴露步骤形成的CD14-抗体复合物的量确定样品中分泌物内源CD14的量。同上，可以使用适当的ELISA检测。

根据这些方法人或牛的初乳或乳汁可用作CD14的来源。

在另一方面，本发明是确定源自乳腺分泌物的产品是否适用于所希望的用途，例如，用于在哺乳动物中诱导或刺激防卫素的产生(或B细胞的激活)，的方法。该方法包括提供产品的样品并确定样品中存在的CD14的量。已知了样品中CD14的量后技术熟练人员可以再一次根据所希望的活力将适当量的该产品加入到待使用的组合物中。例如，人可溶性CD14(重组)的一种用途在美国专利No.5,804,189中有所描述，确定达到可比效果所需要的牛CD14的量在本领域的技术熟练人员的能力范围内。

根据本发明的一些方面，具有类似CD14活性的蛋白(例如，B细胞刺激活性，或防卫素诱导活性)可以是天然存在的，如在乳腺分泌物中，或是根据化学或重组技术制备的。“重组”的蛋白或多肽是指它通过利用分子遗传学技术表达分离的核酸序列产生的，这将为本领域中的技术熟练人员所理解。

在此说明书中，同源性是根据常规方法计算的，计算时需要将两个待比较的序列进行序列对比以达到最大的配对，然后计算配对的百分比。在一个优选的方面中本发明是减轻脓毒症症状的方法，包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的可溶性蛋白以使得该哺乳动物的上皮细胞直接暴露于该蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ ID NO:5的氨基酸序列相比至少有63％的保守性，并且具有在上皮细胞中诱导防卫素的表达的能力。换句话说，所讨论的序列和SEQ ID NO:5至少有63％的同源性。

这些多肽的基本上等价的物质包括其天然序列的一个或多个残基被缺失、取代，或被插入不同的氨基酸或酸后的产物。

有可能此处所描述的多肽序列而至少保留一部分合乎需要的活性。优选的变化包括保守替代，即，一个残基被同一大类的另一个氨基酸替代后的产物。众所周知，天然存在的氨基酸可以被划分为酸性、碱性、中性和极性，或中性和非极性。当然，应当理解可以进行许多可能的氨基酸置换而同时“保留”负责此处所描述的多肽的主要刺激效应(bonestimulatory effects)的结构，而不必受到此处的限制。因此预期，例如，非极性脂肪族中性氨基酸，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸，缬氨酸和异亮氨酸之间的相互置换是可能的。类似地，极性脂肪族中性氨基酸，丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺之间的置换也是可能的。带电荷的酸性氨基酸，天冬氨酸和谷氨酸也可能进行替代，类似地，也可进行带电荷的碱性氨基酸，赖氨酸和精氨酸之间的替代。芳香族氨基酸，包括苯丙氨酸，组氨酸，色氨酸和酪氨酸之间的替代也是可能的。这些替代和互换，如美国专利No.5,487,983中所进行的举例说明中所示，对于本领域中的技术熟练人员是众所周知的。可以利用本领域中众所周知的计算机程序，例如DNASTAR软件，指导确定哪些氨基酸残基可以被替代、插入或缺失而不至于丧失生物学或免疫学活性。

“序列同一性或同源性”因而指两个多肽分子或两个核酸分子之间的序列一致性。当两个比较的多肽序列上的一个位点均被同一氨基酸占据时(例如，两个多肽的每一个上的该位点均是丙氨酸残基)，那么在该位点上，该分子是同源的或序列是同一的。两个分子之间同源性百分数或两个序列间的序列同一性是这样一个函数：两个序列共有的匹配位点的数目除以比较的位点的数目×100％。例如，如果两个序列的10个位点中的6个是同一的，那么这两个序列是60％同源性的或具有60％序列同一性。例如，多肽序列METL IA和MPTW IF具有50％同源性或序列同一性。一般地，当两个序列被对齐以给出最大同源性时进行比较。

序列的比较以及两个序列间的同源性百分比的确定可通过一种数学运算法则来完成。在本说明书中序列对比是根据Clustal方法进行的。

当相似性不一定是进化上相关时建议使用Clustal运算法则(此处通过DNASTAR Inc.1228South Park Street,Madison,Wisconsin,USA,1994的软件应用)进行序列对比。该运算法则由Higgins,D.G.et al.1989.CABIOS 5:151描述。同一软件程序提供了根据Jotun Hein方法进行的序列对比，Jotun Hein方法被建议用于具有清晰的进化关系的高的进化的家族的序列对比。该运行法则的描述见Hein,J.1990,Methodsin Enzym ology 183:626。使用程序的默认设置(标准参数)。基于进化取代模式、电荷、结构和化学相似性进行氨基酸残基的加权(weighting)时选择的可接受突变百分比(percent acceptable mutation,PAM)设置为250。对于序列对比，所使用的序列对比参数为K-tuple=1,Gappenalty=3,Window=5,Diagonals Saved=5。

在一个优选的实施例中本发明是减轻脓毒症症状的方法，它包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的可溶性蛋白以直接将该哺乳动物的上皮细胞暴露于上述蛋白，该蛋白的氨基酸序列相对于标识为SEQ IDNO:5的氨基酸序列的保守性至少为63％，并且具有诱导上皮细胞表达防卫素的能力。换句话说，所讨论的序列和SEQ ID NO:5的同源性至少为63％。

因此本发明还提供了含有有效剂量的本发明的复合物的组合物，以及它的无毒加成盐，胺和酯，它们可能单独就能提供上文描述的治疗效果。这样的组合物可以和生理上可耐受的液体、凝胶或固体稀释剂、佐剂以及赋形剂一起提供。

在涉及CD14蛋白的情况下可以以250Tg至300Tg多肽每千克体重的剂量喂养哺乳动物，例如，根据平均每天消耗的食物对哺乳动物每天喂养18至36ml液体。应当理解非常小的动物消耗的剂量随时间而增加。施用的剂量的根据是成体乳汁中测量得到的sCD14浓度为10至20Tg/ml，并且考虑到出生后头六个月内人类婴儿摄入的乳汁量每天增加0.11至11，同时假设人和大鼠的体重比为28。在实践中，特别是涉及人类受试者时，每天的剂量可以是250Tg至2500Tg或更多一些每千克体重每天。更为优选地，剂量可以是300Tg至1mg每千克体重每天左右。根据施用途径、方便性、以及治疗的有效性随施用的频率以及每次施用剂量的变化，优选的施用频率可以是大于或小于每天一次。施用的剂量也依赖于受试者以及施用所要达到的效果。任何一种或多种复合物的剂量决定于许多因素，包括所使用的特定复合物或几种复合物的组合，施用的方式，以及待治疗的哺乳动物。特定复合物或几种复合物的组合的剂量可根据传统的考虑因素而决定：例如，复合物与已知制剂的常规的活性差异比较，即，通过适当的药理学方法。

药用制剂包括任何被制备成可注射溶液的复合物，包括在使用前制备成可注射溶液的的复合物。可注射的复合物可以是溶液或悬浮液；也可以制备适合于在注射前溶解或悬浮于液体的固体形式。制备物也可以被乳化。活性蛋白经常与稀释剂和赋形剂混合，上述稀释剂与赋形剂是生理上可耐受的并且与上述多肽相容的。适当的稀释剂与赋形剂为，例如，水，盐水，右旋糖，甘油等等，以及它们的组合。此外，如果需要的话该组合物可以含有小量的辅助物质如润湿剂或乳化剂，稳定剂和pH缓冲剂等等。

药用制剂包括使用上述复合物与传统赋形剂混合，赋形剂即不会与上述复合物产生有害反应并且可能会增强上述复合物的储存和操作稳定性的，药用上可接受的有机或无机载体。制备步骤可以包括药用制剂的灭菌。该复合物可以和不会与其发生有害反应的辅助性物质如润滑剂、防腐剂、稳定剂、影响渗透压的盐等等混合。

该组合物通常通过注射，例如，皮下注射或皮内注射经过肠道外途径施用。适用于其它施用方式的制剂包括栓剂、鼻内气溶胶和一些情况下的口服制剂。对于栓剂通常包括结合剂和赋形剂，包括，例如，聚烷基二醇或甘油三酸酯：这样的栓剂可以从含有0.5％至10％范围内的活性成分，优选地含有1％至2％活性成分的混合物形成。口服制剂包括这些通常使用的赋形剂，例如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物的形式为溶液、悬浮液、药丸胶囊、持续释放制剂(sustained release formulation)或粉剂，并且含有10％-95％的活性成分，优选地25％-75％的活性成分。如果恰当的话口服制剂可以包括设计用来保护蛋白直至蛋白到达既定作用位点的制剂。

蛋白复合物可以被配制成中性的或盐形式的组合物。药用上可接受的无毒盐包括酸加成盐(和游离氨基基团形成)以及和无机酸，例如，高氯酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等形成的盐。和自由羧基形成的盐可以自无机碱如，例如，钠、钾、铵、钙或氢氧化铁，或来自有机碱如异丙胺、三甲基胺、2-甲基氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等等衍生。

本发明的复合物可以可以自身形成均一多聚物。该复合物还可以被交联到生物兼容的多聚复合物，如，BIOPOL^TM(WR Grace&Co.Conn)上。

本领域中配制制剂的方法见，例如，“Remington’s PahrmaceuticalSciences”。

在通常的保健方案(health promoting regimen)中优选的施用途径可能是口服。CD14存在于液体中以便在吞咽CD14液体时时GI道暴露于CD14。它还可以包含在耐嚼的或柔韧性好的物质中以保护CD14不会被降解，但在咀嚼时它又很容易将CD14释放出来，以便随后暴露于GI道。

本发明的组合物可以包含在任何适当的药用上可接受的载体中，例如，液体载体如丙二醇、丙二醇氯仿等等，外用到伤口部位。在这些组合物中活性物质的可能浓度至少为0.01％的重量比，更可能为重量比0.1％至0.5％，更可能为重量比0.05％至0.2％，但是任何治疗上有效的剂量都可以使用。

本发明的组合物也可通过任意多的其它途径配制，这依赖于需要的是水溶液、膏霜还是药膏，以及它是否被用于，或者说它使用的位点是否为皮肤的或眼睛的表面。

配制成膏霜的组合物可以含有膏霜稳定剂如呫吨胶、乳化剂，优选地为非离子型乳化剂，至少一种液体和一种固体疏水材料，上述液体和固体疏水材料选自液体和固体脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、药用级的蜡以及碳氢复合物，后者在液体和半液体之间变动，如凡士林或者在液体和固体之间变动等等；上述组合物还含有防腐剂，抗氧化剂和水。

通过减轻皮肤感染而促进治疗伤口的方法包括将本发明的促进上皮细胞产生防卫素的组合物直接施用或与伤口接触。允许组合物和伤口保持接触一段时间，该段时间的长度足以使上述组合物帮助减轻感染。这样的方法包括将本发明的组合物加入到膏霜制剂或者将本发明的组合物的溶液浸泡到纱布中，然后将膏霜或浸泡过的纱布用于处理伤口，例如，烧伤、供体部位伤口(donor site wound)、溃疡或人任何形式的皮肤伤口。此外，缝合处或缝合线可以被涂覆或浸泡一层本发明的组合物并用与缝合开口道伤口。

可以用本发明的组合物治疗的伤口的类型包括任何由于医疗或意外原因引起的导致上皮损伤的伤口，如asophthalmic伤口，如由于角膜溃疡而产生的伤口，皮肤伤，如烧伤、皮肤移植的供体部位伤口和溃疡。进而，皮肤被损伤的皮肤病可以用本发明的组合物治疗。脚和腿的溃疡也可以用本发明的组合物治疗。

通过气溶胶施用本发明的组合物尤其适合于将气管和肺暴露于CD14。

在任何情况下，通常都应理解在摄入或吸入等等时将细菌(或病毒，真菌等等)暴露于一种或多种防卫素的有利之处。在受试者不一定能进行完全的或正常的免疫应答时尤为如此。在能产生LPS的革兰氏阴性菌的情况下在被认为是脓毒症休克高危人群的GI道或气管中存在一种或多种防卫素是特别有利的。

在另一方面，本发明包括了基因被改变以在其乳汁中增强CD14的产生的转基因哺乳动物。尽管产生转基因小鼠的技术已经使用了二十年，将外源基因引入到家畜基因组，包括山羊、绵羊、奶牛和猪基因组的可能性直到最近才被证实。尽管技术上更为困难，将编码具有制药学重要意义分子的克隆基因转入到家畜中的优点在于使得重组蛋白的大量生产成为可能。这转而将大大降低生产费用。在这一方面，转基因家畜可以被认为是在乳汁、血液或尿液中具有制药用途的蛋白的“生物反应器”。

在过去的几年里在血液和组织中表达蛋白已经大大地扩大了转基因动物在医学上的应用。例如，用于人类移植的“隐形动物器官(stealthanimal organs)”最近得到了很大的重视。重要的是在乳汁中表达转基因蛋白的能力上最近取得了重大进展。目前为在进行的研究集中于在动物的乳腺中直接表达蛋白以及提高它们的产量。

产生转基因动物的技术根据的是已经很好地确立的原理(Marki,U.and Harri,A.1996.Int.J.Exp.Path.77:247)。感兴趣的基因与启动子结合，上述启动子指导和调节该基因在转基因动物的特定组织/细胞中表达。表达构建体(DNA)被注射到受精卵的的前体核中，注射后的卵被植入到激素同步化的代孕母亲中。控制这种通过人工授精得到的动物以使注射的DNA构建体整合。检测上述基因在这些原初动物的后代中的表达及其产物，以及该基因的遗传方式以确认该基因的生殖细胞传递，即，转基因被整合入了该动物的生殖细胞系中。

在一个优选的方面本发明是转基因的牛科哺乳动物动物，其中CD14(或其直接激活B细胞的类似物，或直接在上皮细胞中诱导防卫素表达的类似物)是通过重组DNA技术引入到上述哺乳动物中并处于内源性CD14启动子的控制之下。

在另一个优选的方面该转基因哺乳动物是牛，该牛的基因组被引入了额外的基因组序列的拷贝(外显子和内含子，即，SEQ ID NO:8)，从上述这些拷贝可得到编码内源性牛CD14的mRNA。

在目前为止测试的三个种属：人、牛、和小鼠中可溶性CD14是初乳和乳汁的天然组分。尽管可溶性CD14出现在这些分泌物中的潜在分子机制还不清楚，内源性CD14启动子可能在这一方面起重要作用。因此，使用内源性CD14启动子序列驱动“转基因”CD14的表达，以及使用一种组织特异性启动子，该启动子选择性地激活转基因CD14在乳腺组织中的表达。

使用基因组序列，而不是cDNA序列，制备转基因动物已经被证明能使转基因的表达更有效(Janne,J.et al.1994.Int.J.Biochem.26:859)。因此可以把编码CD14的牛和/或人基因组DNA和牛内源性CD14启动子一起克隆。替代地，绵羊的θ-乳球蛋白启动子(Wright,G.et al.1991.Biotechnology 9:830)指导和调节基因主要在乳腺中表达。带有该基因构建物的载体可以被添加有效的转录终止子以及基质附着区域(matrix attached region)和特定的染色体序列以增强该转基因的表达并且将其与染色体环境中的下调效应隔绝开。该构建体被注射到源自任何合乎需要的种属的卵子的前体核中，并将卵子植入到该种属的激素同步化的受体中。

本申请中任何提及的引用都在此全文引入作为参考。1999年5月27日归档的美国临时专利申请第60/086,884号的说明书和权利要求也在此引入作为参考，根据这些本申请要求优先权和目前悬而未决的(本申请的归档日期)美国专利申请序列号第08/746,883,1996年11月18日归档。

此处所讨论的多肽和蛋白序列标识如下：

SEQ ID NO:1编码牛CD14的核酸序列。

SEQ ID NO:2编码人CD14的核酸序列。

SEQ ID NO:3编码鼠CD14的核酸序列。

SEQ ID NO:4牛CD14的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5人CD14的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6鼠CD14的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7兔CD14的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8牛CD14的基因组核酸序列序列。

在SEQ ID NO:8中碱基1到83是5’-非翻译区。84到86是ATG起始密码子。87到163是内含子，碱基164到1282是编码序列，碱基1283到-1405是3’-非翻译区。

兔CD14的氨基酸序列是先前已知的(Ikeda.A.et al.1997.J.Vet.Med.Sci.59:715)。

人和牛之间的同源性被发现是70.8％，人和小鼠之间的同源性被发现是63.4％，人和兔之间的同源性被发现是71.8％，牛和鼠之间的同源性被发现是58.7％。

                      序列表<110>    GEMMA生物技术公司；JULIUS,Michael H.；FILIPP,Dominik<120>    用LAIT/sCD14-蛋白诱导抗生蛋白或抗生多肽<130>    47841/00048<140>    PCT/CA99/00482<141>    1999-05-27<150>    US 60/086,884<151>    1998-05-27<160>    8<170>    Wordperfec 6.1<210>    1<211>    1122<212>    DNA<213>    牛<400>    1atggtgtgcg tgccctacct gctgctgctg ctgctgccgt cactgctgcg tgtgtctgcg          60gacacaacag aaccctgcga gctggacgac gacgatttcc gttgtgtctg caacttcacg         120gatccgaagc ctgactggtc tagcgccgtt cagtgtatgg ttgccgtcga ggtggagatc         180agtgccggcg gccgcagcct ggaacagttt ctcaagggag ccgacaccaa cccgaagcag         240tatgctgaca caatcaaggc tctgcgcgtt cggcgactca agctgggcgc tgcacaggtt         300cctgctcagc ttctggtcgc cgttctgcgc gcgctcgggt actctcgtct caaggaactg         360acgcttgagg acctggaggt aaccggccca acgcccccga cgcctctgga agccgctggg         420cctgcgctca ccaccctcag tctgcgtaac gtatcgtgga caacaggagg tgcctggctc         480ggcgaactgc agcagtggct caagcctggg ctcagggtgc tgaacattgc ccaagcacac         540tcgcttgcct ttccgtgcgc agggctctcc accttcgagg cgctcaccac cctagacctg         600tctgacaatc ccagtctcgg cgacacgggg ctgatggcag ctctctgtcc gaacaagttc         660ccggccctcc aatatctagc gctacgcaac gcggggatgg agacgccgag cggcgtgtgc         720gcggcgctgg cggcagcgag ggtgcagccc caaagcctgg acctcagcca caactcgctg         780cgcgtcaccg ccccgggtgc tacccgatgt gtctggccca gtgcactaag gtctctcaat         840ttgtcgttcg ctgggctgga gcaagtgcct aagggactgc cccctaagct cagcgtgctt         900gatctcagct gcaacaagct aagcagggag ccgcggcgag acgagctgcc cgaggtaaat         960gacctgactc tggacggaaa tccctttctg gaccctggag ccctccagca ccaaaatgac        1020ccgatgatct ccggcgtggt cccagcctgt gcgcgttctg ccttgaccat gggggtgtca        1080ggagccctgg cgctgcttca aggagcccga ggcttcgcgt aa                           1122<210>    2<211>    1128<212>    DNA<213>    人<400>    2atggagcgcg cgtcctgctt gttgctgctg ctgctgccgc tggtgcacgt ctctgcgacc         60acgccagaac cttgtgagct ggacgatgaa gatttccgct gcgtctgcaa cttctccgaa        120cctcagcccg actggtccga agccttccag tgtgtgtctg cagtagaggt ggagatccat        180gccggcggtc tcaacctaga gccgtttcta aagcgcgtcg atgcggacgc cgacccgcgg        240cagtatgctg acacggtcaa ggctctccgc gtgcggcggc tcacagtggg agccgcacag        300gttcctgctc agctactggt aggcgccctg cgtgtgctag cgtactcccg cctcaaggaa        360ctgacgctcg aggacctaaa gataaccggc accatgcctc cgctgcctct ggaagccaca        420ggacttgcac tttccagctt gcgcctacgc aacgtgtcgt gggcgacagg gcgttcttgg        480ctcgccgagc tgcagcagtg gctcaagcca ggcctcaagg tactgagcat tgcccaagca        540cactcgcctg ccttttcctg cgaacaggtt cgcgccttcc cggcccttac cagcctagac        600ctgtctgaca atcctggact gggcgaacgc ggactgatgg cggctctctg tccccacaag        660ttcccggcca tccagaatct agcgctgcgc aacacaggaa tggagacgcc cacaggcgtg        720tgcgccgcac tggcggcggc aggtgtgcag ccccacagcc tagacctcag ccacaactcg        780ctgcgcgcca ccgtaaaccc tagcgctccg agatgcatgt ggtccagcgc cctgaactcc        840ctcaatctgt cgttcgctgg gctggaacag gtgcctaaag gactgccagc caagctcaga        900gtgctcgatc tcagctgcaa cagactgaac agggcgccgc agcctgacga gctgcccgag        960gtggataacc tgacactgga cgggaatccc ttcctggtcc ctggaactgc cctcccccac       1020gagggctcaa tgaactccgg cgtggtccca gcctgtgcac gttcgaccct gtcggtgggg       1080gtgtcgggaa ccctggtgct gctccaaggg gcccggggct ttgcctaa                    1128<210>    3<211>    1101<212>    DNA<213>    鼠<400>    3ATGGAGCGTG TGCTTGGCTT GTTGCTGTTG CTTCTGGTGC ACGCCTCTCC CGCCCCACCA            60GAGCCCTGCG AGCTAGACGA GGAAAGTTGT TCCTGCAACT TCTCAGATCC GAAGCCAGAT           120TGGTCCAGCG CTTTCAATTG TTTGGGGGCG GCAGATGTGG AATTGTACGG CGGCGGCCGC           180AGCCTGGAAT ACCTTCTAAA GCGTGTGGAC ACGGAAGCAG ATCTGGGGCA GTTCACTGAT           240ATTATCAAGT CTCTGTCCTT AAAGCGGCTT ACGGTGCGGG CCGCGCGGAT TCCTAGTCGG           300ATTCTATTCG GAGCCCTGCG TGTGCTCGGG ATTTCCGGCC TCCAGGAACT GACTCTTGAA           360AATCTCGAGG TAACCGGCAC CGCGCCGCCA CCGCTTCTGG AAGCCACCGG ACCCGATCTC          420AACATCTTGA ACCTCCGCAA CGTGTCGTGG GCAACAAGGG ATGCCTGGCT CGCAGAACTG          480CAGCAGTGGC TAAAGCCTGG ACTCAAGGTA CTGAGTATTG CCCAAGCACA CTCACTCAAC          540TTTTCCTGCG AACAGGTCCG CGTCTTCCCT GCCCTCTCCA CCTTAGACCT GTCTGACAAT          600CCTGAATTGG GCGAGAGAGG ACTGATCTCA GCCCTCTGTC CCCTCAAGTT CCCGACCCTC          660CAAGTTTTAG CGCTGCGTAA CGCGGGGATG GAGACGCCCA GCGGCGTGTG CTCTGCGCTG          720GCCGCAGCAA GGGTACAGCT GCAAGGACTA GACCTTAGTC ACAATTCACT GCGGGATGCT          780GCAGGCGCTC CGAGTTGTGA CTGGCCCAGT CAGCTAAACT CGCTCAATCT GTCTTTCACT          840GGGCTGAAGC AGGTACCTAA AGGGCTGCCA GCCAAGCTCA GCGTGCTGGA TCTCAGTTAC          900AACAGGCTGG ATAGGAACCC TAGCCCAGAT GAGCTGCCCC AAGTGGGGAA CCTGTCACTT          960AAAGGAAATC CCTTTTTGGA CTCTGAATCC CACTCGGAGA AGTTTAACTC TGGCGTAGTC         1020ACCGCCGGAG CTCCATCATC CCAAGCAGTG GCCTTGTCAG GAACTCTGGC TTTGCTCCTA         1080GGAGATCGCC TCTTTGTTTA A                                                   1101<210>    4<211>    3738<212>    PRT<213>    牛<400>    4Met Val Cys Val Pro Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ser Leu Leu1               5                   10                  15Arg Val Ser Ala Asp Thr Thr Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Asp Asp

        20                  25                  30Phe Arg Cys Val Cys Asn Phe Thr Asp Pro Lys Pro Asp Trp Ser Ser

    35                  40                  45Ala Val Gln Cys Met Val Ala Val Glu Val Glu Ile Ser Ala Gly Gly

50                  55                  60Arg Ser Leu Glu Gln Phe Leu Lys Gly Ala Asp Thr Asn Pro Lys Gln65                  70                  75                  80Tyr Ala Asp Thr Ile Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Lys Leu Gly

            85                  90                  95Ala Ala Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Ala Val Leu Arg Ala Leu

        100                 105                 110Gly Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Glu Val Thr

    115                 120                 125Gly Pro Thr Pro Pro Thr Pro Leu Glu Ala Ala Gly Pro Ala Leu Thr

130                 135                 140Thr Leu Ser Leu Arg Asn Val Ser Trp Thr Thr Gly Gly Ala Trp Leu145                 150                 155                 160Gly Glu Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Arg Val Leu Asn Ile

            165                 170                 175Ala Gln Ala His Ser Leu Ala Phe Pro Cys Ala Gly Leu Ser Thr Phe

        180                 185                 190Glu Ala Leu Thr Thr Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Ser Leu Gly Asp

    195                 200                 205Thr Gly Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro Asn Lys Phe Pro Ala Leu Gln

210                 215                 220Tyr Leu Ala Leu Arg Asn Ala Gly Met Glu Thr Pro Ser Gly Val Cys225                 230                 235                 240Ala Ala Leu Ala Ala Ala Arg Val Gln Pro Gln Ser Leu Asp Leu Ser

            245                 250                 255His Asn Ser Leu Arg Val Thr Ala Pro Gly Ala Thr Arg Cys Val Trp

        260                 265                 270Pro Ser Ala Leu Arg Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu Glu Gln

    275                 280                 285Val Pro Lys Gly Leu Pro Pro Lys Leu Ser Val Leu Asp Leu Ser Cys

290                 295                 300Asn Lys Leu Ser Arg Glu Pro Arg Arg Asp Glu Leu Pro Glu Val Asn305                 310                 315                 320Asp Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Asp Pro Gly Ala Leu Gln

            325                 330                 335His Gln Asn Asp Pro Met Ile Ser Gly Val Val Pro Ala Cys Ala Arg

        340                 345                 350Ser Ala Leu Thr Met Gly Val Ser Gly Ala Leu Ala Leu Leu Gln Gly

    355                 360                 365Ala Arg Gly Phe Ala

370<210>        5<211>        375<212>        PRT<213>        人<400>        5Met Glu Arg Ala Ser Cys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val His1               5                   10                  15Val Ser Ala Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe

        20                  25                  30Arg Cys Val Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala

    35                  40                  45Phe Gln Cys Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu

50                  55                  60Asn Leu Glu Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg65                  70                  75                  80Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr Val

            85                  90                  95Gly Ala Ala Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Gly Ala Leu Arg Val

        100                 105                 110Leu Ala Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile

    115                 120                 125Thr Gly Thr Met Pro Pro Leu Pro Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Leu

130                 135                 140Ser Ser Leu Arg Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Gly Arg Ser Trp145                 150                 155                 160Leu Ala Glu Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser

            165                 170                 175Ile Ala Gln Ala His Ser Pro Ala Phe Ser Tyr Glu Gln Val Arg Ala

        180                 185                 190Phe Pro Ala Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Gly Leu Gly

    195                 200                 205Glu Arg Gly Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Phe Pro Ala Ile

210                 215                 220Gln Asn Leu Ala Leu Arg Asn Thr Gly Met Glu Thr Pro Thr Gly Val225                 230                 235                 240Cys Ala Ala Leu Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro His Ser Leu Asp Leu

            245                 250                 255Ser His Asn Ser Leu Arg Ala Thr Val Asn Pro Ser Ala Pro Arg Cys

        260                 265                 270Met Trp Ser Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu

    275                 280                 285Glu Gln Val Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu

290                 295                 300Ser Cys Asn Arg Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Asp Glu Leu Pro Glu305                 310                 315                 320Val Asp Asn Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr

            325                 330                 335Ala Leu Pro His Glu Gly Ser Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys

        340                 345                 350Ala Arg Ser Thr Leu Ser Val Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu

    355                 360                 365Gln Gly Ala Arg Gly Phe Ala

370                 375<210>        6<211>        366<212>        PRT<213>        鼠<400>        6Met Glu Arg Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val His Ala Ser1               5                   10                  15Pro Ala Pro Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Glu Glu Ser Cys Ser Cys

        20                  25                  30Asn Phe Ser Asp Pro Lys Pro Asp Trp Ser Ser Ala Phe Asn Cys Leu

    35                  40                  45Gly Ala Ala Asp Val Glu Leu Tyr Gly Gly Gly Arg Ser Leu Glu Tyr

50                  55                  60Leu Leu Lys Arg Val Asp Thr Glu Ala Asp Leu Gly Gln Phe Thr Asp65                  70                  75                  80Ile Ile Lys Ser Leu Ser Leu Lys Arg Leu Thr Val Arg Ala Ala Arg

            85                  90                  95Ile Pro Ser Arg Ile Leu Phe Gly Ala Leu Arg Val Leu Gly Ile Ser

        100                 105                 110Gly Leu Gln Glu Leu Thr Leu Glu Asn Leu Glu Val Thr Gly Thr Ala

    115                 120                 125Pro Pro Pro Leu Leu Glu Ala Thr Gly Pro Asp Leu Asn Ile Leu Asn

130                 135                 140Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Arg Asp Ala Trp Leu Ala Glu Leu145                 150                 155                 160Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser Ile Ala Gln Ala

            165                 170                 175His Ser Leu Asn Phe Ser Cys Glu Gln Val Arg Val Phe Pro Ala Leu

        180                 185                 190Ser Thr Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Glu Leu Gly Glu Arg Gly Leu

    195                 200                 205Ile Ser Ala Leu Cys Pro Leu Lys Phe Pro Thr Leu Gln Val Leu Ala

210                 215                 220Leu Arg Asn Ala Gly Met Glu Thr Pro Ser Gly Val Cys Ser Ala Leu225                 230                 235                 240Ala Ala Ala Arg Val Gln Leu Gln Gly Leu Asp Leu Ser His Asn Ser

            245                 250                 255Leu Arg Asp Ala Ala Gly Ala Pro Ser Cys Asp Trp Pro Ser Gln Leu

        260                 265                 270Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Thr Gly Leu Lys Gln Val Pro Lys Gly

    275                 280                 285Leu Pro Ala Lys Leu Ser Val Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Asp

290                 295                 300Arg Asn Pro Ser Pro Asp Glu Leu Pro Gln Val Gly Asn Leu Ser Leu305                 310                 315                 320Lys Gly Asn Pro Phe Leu Asp Ser Glu Ser His Ser Glu Lys Phe Asn

            325                 330                 335Ser Gly Val Val Thr Ala Gly Ala Pro Ser Ser Gln Ala Val Ala Leu

        340                 345                 350Ser Gly Thr Leu Ala Leu Leu Leu Gly Asp Arg Leu Phe Val

    355                 360                 365<210>        7<211>        377<212>        PRT<213>        兔<400>        7Met Glu Pro Val Pro Cys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Xaa Leu Leu1               5                  10                  15Arg Ala Ser Thr Asp Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Asp Asp

        20                  25                  30Ile Arg Cys Val Cys Asn Phe Ser Asp Pro Gln Pro Asp Trp Ser Ser

    35                  40                  45Ala Leu Gln Cys Met Pro Ala Val Gln Val Glu Met Trp Gly Gly Gly

50                  55                  60His Ser Leu Glu Gln Phe Leu Arg Gln Ala Asp Leu Tyr Thr Asp Gln65                  70                  75                  80Arg Arg Tyr Ala Asp Val Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr

            85                  90                  95Val Gly Ala Val Gln Val Pro Ala Pro Leu Leu Leu Gly Val Leu Arg

        100                 105                 110Val Leu Gly Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu Glu Asp Ile Glu

    115                 120                 125Val Thr Gly Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Leu Glu Ala Thr Gly Pro

130                 135                 140Ala Leu Ser Thr Leu Ser Leu Arg Asn Val Ser Trp Pro Lys Gly Gly145                 150                 155                 160Ala Trp Leu Ser Glu Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Gln Val

            165                 170                 175Leu Asn Ile Ala Gln Ala His Thr Leu Ala Phe Ser Cys Glu Gln Val

        180                 185                 190Arg Thr Phe Ser Ala Leu Thr Thr Leu Asp Leu Ser Glu Asn Pro Gly

    195                 200                 205Leu Gly Glu Arg Gly Leu Val Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Glu Pro

210                 215                 220Ala Leu Gln Asp Leu Ala Leu Arg Asn Ala Gly Met Lys Ile Leu Gln225                 230                 235                 240Gly Val Cys Ala Ala Leu Ala Glu Ala Gly Val Gln Pro His His Leu

            245                 250                 255Asp Leu Ser His Asn Ser Leu Arg Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Asp Thr Gln

        260                 265                 270Arg Cys Ile Trp Pro Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Thr

    275                 280                 285Gly Leu Gln Gln Val Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Asn Val Leu

290                 295                 300Asp Leu Ser Cys Asn Lys Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Gly Glu Leu305                 310                 315                 320Pro Lys Val Val Asn Leu Ser Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro

            325                 330                 335Gly Ala Ser Lys Leu Gln Glu Asp Leu Thr Asn Ser Gly Val Phe Pro

        340                 345                 350Ala Cys Pro Pro Ser Pro Leu Ala Met Gly Met Ser Gly Thr Leu Ala

    355                 360                 365Leu Leu Gln Gly Ala Arg Gly Phe Ile

370                 375<210>        8<211>        1405<212>        DNA<213>        牛<400>        8gcgtgacgca ctgtaaagga aagaatccac agtccagccc gacaaccaga gagagaggca        60caggctctga gaatctactg actatgttct tggggccgaa gcgtgggcta tttggggact        120taggaacagg cttgggccgc cctgacctcc gctgtcgggc caggtgtgcg tgccctacct        180gctgctgctg ctgctgccgt cactgctgcg tgtgtctgcg gacacaacag aaccctgcga        240gctggacgac cacgatttcc gttgtgtctg caacttcacg gatccgaagc ctgactggtc        300tagcgccgtt cagtgtatgg ttgccgtcga ggtggagatc agtgccggcg gccgcagcct        360ggaacagttt ctcaagggag ccgacaccaa cccgaagcag tatgctgaca caatcaaggc        420tctgcgcgtt cggcgactca agctgggcgc tgcacaggtt cctgctcagc ttctggtcgc        480cgttctgcgc gcgctcgggt actctcgtct caaggaactg acgcttgagg acctggaggt        540aaccggccca acgcccccga cgcctctgga agccgctggg cctgcgctca ccaccctcag        600tctgcgtaac gtatcgtgga caacaggagg tgcctggctc ggcgaactgc agcagtgcct        660caagcctggg ctcagggtgc tgaacattgc ccaagcacac tcgcttgcct ttccgtgcgc        720agggctctcc accttcgagg cgctcaccac cctagacctg tctgacaatc ccagtctcgg        780cgacagcggg ctgatggcag ctctctgtcc gaacaagttc ccggccctcc aatatctagc        840gctacgcaac gcggggatgg agacgccgag cggcgtgtgc gcggcgctgg cggcagcgag        900ggtgcagccc caaagcctgg acctcagcca caactcgctg cgcgtcaccg ccccgggtgc        960tacccgatgt gtctggccca gtgcactaag gtctctcaat ttgtcgttcg ctgggctgga       1020gcaagtgcct aagggactgc cccctaagct cagcgtgctt gatctcagct gcaacaagct       1080aagcagggag ccgcggcgag acgagctgcc cgaggtaaat gacctgactc tggacggaaa       1140tccctttctg gaccctggag ccctccagca ccaaaatgac ccgatgatct ccggcgtggt       1200cccagcctgt gcgcgttctg ccttgaccat gggggtgtca ggagccctgg cgctgcttca       1260aggagcccga ggcttcgcgt aaggccaggg gaagagaggg aagaggaatg aattggctca       1320gattgccctg gctccgggag accctcgcca ggacatctca accaaccagc cttctgcccc       1380atccttatta aaatcttaaa cagca                                             1405

Claims (158)

1．一种减轻脓毒症症状的方法包括直接将需要治疗的哺乳动物的上皮细胞暴露于有效剂量的复合物，上述复合物含有可溶性CD14，或CD14的能刺激上皮细胞表达防卫素的多肽片断，或上述CD14的保守替代变体，或能刺激上述表达的片断的保守替代变体。

2．在需要治疗的哺乳动物中增强防卫素表达的方法，该方法是通过施用一种复合物，该复合物含有可溶性CD14或增强上述表达的CD14多肽部分，或上述CD14的保守替代变体，或能刺激上述表达的部分的保守替代变体。

3．权利要求2中的方法，其中所述的施用步骤包括直接将上皮细胞暴露于上述哺乳动物。

4．刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的方法，该方法是通过在上皮细胞上施用有效剂量的一种复合物，该复合物含有可溶性CD14或增强上述表达的CD14多肽片断，或上述CD14的保守替代变体，或能刺激上述表达的片断的保守替代变体。

5．沿着哺乳动物的胃肠道刺激防卫素的表达的方法包括将上述胃肠道暴露于有效剂量的复合物，该复合物含有可溶性CD14或增强上述表达的CD14多肽片断，或上述CD14的保守替代变体，或能刺激上述表达的片断的保守替代变体。

6．沿着哺乳动物的呼吸道道刺激防卫素的表达的方法包括将上述呼吸道暴露于有效剂量的复合物，该复合物含有可溶性CD14或增强上述表达的CD14多肽部分，或上述CD14的保守替代变体，或能刺激上述表达的部分的保守替代变体。

7．在哺乳动物的舌头刺激防卫素的表达的方法包括将舌头暴露于有效剂量的复合物，该复合物含有可溶性CD14或CD14增强上述表达的多肽片断，或上述CD14的保守替代变体，或能刺激上述表达的片断的保守替代变体。

8．在哺乳动物的小肠刺激防卫素的表达的方法包括将小肠暴露于有效剂量的复合物，该复合物含有可溶性CD14或CD14增强上述表达的多肽部分，或上述CD14的保守替代变体，或能刺激上述表达的部分的保守替代变体。

9．诱导需要治疗的哺乳动物的上皮细胞表达防卫素的方法，该方法包括施用有效剂量的复合物，该复合物含有可溶性CD14或CD14增强上述表达的多肽片断，或上述CD14的保守替代变体，或能刺激上述表达的片断的保守替代变体。

10．任何先前的权利要求中的方法，其中CD14的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7。

11．权利要求10中的方法，其中的复合物含有选自SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或它们的保守替代变体。

12．权利要求11中的方法，其中的复合物含有选自SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

13．一种减轻脓毒症症状的方法包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的一种可溶性蛋白以将该哺乳动物的上皮细胞直接暴露于该蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ ID NO:5的氨基酸序列相比至少有63％的保守性，并且该蛋白能够诱导上皮细胞表达防卫素。

14．权利要求13中的方法，其中蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ IDNO:5的氨基酸序列相比至少有约68％，或约71％，或约73％，或约78％，或约83％，或约88％，或约93％，或约98％的保守性。

15．在哺乳动物中预防性地治疗脂多糖引起的炎症反应的方法，该方法包括对上述哺乳动物施用药用有效剂量的一种蛋白以直接将该哺乳动物的上皮细胞暴露于该蛋白，该蛋白的氨基酸序列和被标识为SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比至少有63％的保守性，并且该蛋白能在牛上皮细胞中增强一种或多种防卫素的表达。

16．权利要求15中的方法，其中蛋白的氨基酸序列和被标识为SEQID NO:5的氨基酸序列相比至少有约68％，或约71％，或约73％，或约78％，或约83％，或约88％，或约93％，或约98％的保守性。

17．在需要治疗的哺乳动物中增强防卫素的表达的方法，该方法通过对上述哺乳动物施用有效剂量的一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比至少有63％的保守性，并且该蛋白能在哺乳动物上皮细胞中增强防卫素的表达。

18．权利要求17中的方法，其中蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ IDNO:5的氨基酸序列相比至少有约68％，或约71％，或约73％，或约78％，或约83％，或约88％，或约93％，或约98％的保守性。

19．刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的方法，该方法通过将上述细胞暴露于有效剂量的一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比至少有63％的保守性，并且该蛋白能刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素。

20．权利要求19中的方法，其中蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ IDNO:5的氨基酸序列相比至少有约68％，或约71％，或约73％，或约78％，或约83％，或约88％，或约93％，或约98％的保守性。

21．沿着哺乳动物的胃肠道刺激防卫素的表达的方法包括将胃肠道暴露于有效剂量的一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比至少有63％的保守性，并且该蛋白能刺激防卫素在牛上皮细胞中的表达。

22．权利要求21中的方法，其中蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ IDNO:5的氨基酸序列相比至少有约68％，或约71％，或约73％，或约78％，或约83％，或约88％，或约93％，或约98％的保守性。

23．沿着哺乳动物的呼吸道刺激防卫素的表达的方法包括将呼吸道暴露于有效剂量的一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比至少有63％的保守性，并且该蛋白能刺激防卫素在上皮细胞中的表达。

24．权利要求23中的方法，其中蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ IDNO:5的氨基酸序列相比至少有约68％，或约71％，或约73％，或约78％，或约83％，或约88％，或约93％，或约98％的保守性。

25．在哺乳动物的舌头上刺激防卫素表达的方法包括将舌头暴露于有效剂量的一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比至少有63％的保守性，并且该蛋白能刺激防卫素在上皮细胞中的表达。

26．权利要求25中的方法，其中蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ IDNO:5的氨基酸序列相比至少有约68％，或约71％，或约73％，或约78％，或约83％，或约88％，或约93％，或约98％的保守性。

27．在哺乳动物的小肠中刺激防卫素表达的方法包括将小肠暴露于有效剂量的一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比至少有63％的保守性，并且该蛋白能刺激防卫素在上皮细胞中的表达。

28．权利要求27中的方法，其中蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ IDNO:5的氨基酸序列相比至少有约68％，或约71％，或约73％，或约78％，或约83％，或约88％，或约93％，或约98％的保守性。

29．诱导需要治疗的哺乳动物的上皮细胞表达防卫素的方法，该方法包括施用有效剂量的一种蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比至少有63％的保守性，并且该蛋白能诱导防卫素在上皮细胞中的表达。

30．权利要求29中的方法，其中蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ IDNO:5的氨基酸序列相比至少有约68％，或约71％，或约73％，或约78％，或约83％，或约88％，或约93％，或约98％的保守性。

31．权利要求1到14中的任何一种方法，其中CD14或多肽部分或变体是重组的。

32．制备CD14浓缩物的方法，该方法包括：

提供含有乳腺分泌物蛋白的储存液

从上述溶液中分离含有内源性CD14的浓缩物；以及

确定浓缩物中的CD14浓度。

33．权利要求32中的方法，其中乳腺分泌物是乳汁。

34．权利要求33中的方法，其中乳腺分泌物是完全乳汁(wholemilk)或完全乳汁的含蛋白的部分。

35．权利要求32中的方法，其中的储存液含有初乳或初乳的含蛋白部分。

36．权利要求32到35中的方法，其中，如果该分泌物先前经过处理，那么处理步骤应该是足够温和的以允许保持CD14诱导或刺激防卫素产生的活性和/或刺激B细胞的活性。

37．权利要求32到36中的方法，其中的乳腺分泌物是人的。

38．权利要求32到36中的方法，其中的乳腺分泌物是牛的。

39．权利要求32到38中的方法，其中的溶液是一种液体溶液，并且分离步骤包括从该溶液中盐析蛋白。

40．权利要求32到39中的方法，其中CD14浓度的确定包括将从浓缩物得到的样品暴露于对CD14特异的第一抗体以形成抗体-CD14复合物，然后将该复合物暴露于对CD14特异的第二抗体，其中第二抗体包括报告分子。

41．权利要求32到39中的方法，其中CD14浓度的确定包括将从浓缩物得到的样品暴露于对CD14特异的第一抗体以形成抗体-CD14复合物，然后将该复合物暴露于对第一抗体特异的第二抗体，其中第二抗体包括报告分子。

42．获得CD14的方法，该方法包括：

提供含有乳腺分泌物蛋白的储存液；

从该储存溶液中沉淀含有CD14的蛋白级分；并且

从上清中分离蛋白级分。

43．权利要求42中的方法，其中沉淀步骤包括盐析出含有CD14的蛋白级分。

44．权利要求43中的方法，其中盐析步骤包括提高溶液中的盐浓度以得到一个离子强度，该离子强度至少和饱和硫酸铵水溶液与一定体积的上述乳腺分泌物混合后的离子强度一样高，硫酸铵溶液的体积为混合溶液总体积的65％。

45．权利要求42-44任何一项中的方法进而包括确定在分离步骤得到的CD14的量。

46．权利要求42-45中任何一项的方法，其中乳腺分泌物是初乳。

47．权利要求42-45中任何一项的方法，其中乳腺分泌物是乳汁。

48．权利要求42-45中任何一项的方法，其中的分泌物是牛的。

49．权利要求42-45中任何一项的方法，其中的分泌物是人的。

50．获得CD14的方法，该方法包括：

提供含有乳腺分泌物蛋白的储存液；

在饱和硫酸铵溶液和一定体积的上述乳腺分泌物混合时含有蛋白的级分不溶于乳腺分泌物，分离该级分，上述硫酸铵溶液的体积等于混合溶液总体积的65％。

51．权利要求50中的方法进而包括确定在分离步骤得到的CD14的量。

52．权利要求50或51中的方法，其中乳腺分泌物是初乳。

53．权利要求50或51中的方法，其中乳腺分泌物是乳汁。

54．权利要求50到53任何一项中的方法，其中分泌物是牛的。

55．权利要求50到53任何一项中的方法，其中分泌物是人的。

56．检测含有乳腺分泌物蛋白的组合物中CD14的存在的方法，该方法包括以下步骤：

将组合物暴露于对CD14特异的抗体；并

根据在暴露步骤形成的CD14-抗体复合物确定分泌物内源性CD14是否存在于样品中。

57．权利要求56中的方法，其中如果该分泌物先前经过处理，那么处理步骤应该是足够温和的以允许保持CD14诱导或刺激防卫素产生的活性和/或刺激B细胞的活性。

58．权利要求56或57中的方法进而包括确定样品中CD14浓度的步骤。

59．权利要求56到58任何一项中的方法，其中乳腺分泌物是初乳。

60．权利要求56到58任何一项中的方法，其中乳腺分泌物是乳汁。

61．权利要求56到60任何一项中的方法，其中分泌物是牛的。

62．权利要求56到60任何一项中的方法，其中分泌物是人的。

63．防止，减轻和治疗哺乳动物脓毒症症状方法包括对该哺乳动物施用有效剂量的从哺乳动物乳腺分泌物得到的CD14。

64．权利要求63中的方法，其中CD14是从牛乳汁得到的。

65．权利要求63或64中的方法，其中如果该分泌物先前经过处理，那么处理步骤应该是足够温和的以允许保持CD14诱导或刺激上皮细胞防卫素产生的活性。

66．权利要求63中的方法，其中CD14是包含在液体中的。

67．权利要求66中的方法，其中液体含有乳汁的富含上述CD14的级分。

68．权利要求63中的方法，其中上述CD14包含在可食用的产品中。

69．权利要求63到68中任何一项的方法，其中CD14的施用包括将胃肠道暴露于CD14。

70．权利要求63到69任何一项中的方法，包括将CD14对哺乳动物口服施用。

71．确定含有乳腺分泌物蛋白的组合物中所含有的内源性CD14的量的方法，该方法包括以下步骤：

提供该组合物；

将该组合物的样品暴露于对CD14特异的抗体；并

根据暴露步骤形成的CD14-抗体复合物确定样品中存在的分泌物内源CD14的量。

72．权利要求71中的方法，其中乳腺分泌物是初乳。

73．权利要求71中的方法，其中乳腺分泌物是乳汁。

74．权利要求71到73任何一项中的方法，其中分泌物是牛的。

75．权利要求71到73任何一项中的方法，其中分泌物是人的。

76．确定源自乳腺分泌物的产物是否适用于在哺乳动物中诱导或刺激防卫素的产生的方法，该方法包括以下步骤：

提供上述产物的样品；并

确定在上述样品中CD14的量。

77．权利要求76中的方法，其中，如果该分泌物先前经过处理，那么处理步骤应该是足够温和的以允许保持CD14诱导或刺激防卫素产生的活性。

78．权利要求76或77中的方法，其中确定样品中存在的CD14的量的方法包括将该样品暴露于对CD14特异性的抗体，并确认是否在暴露步骤形成抗体-CD14复合物。

79．确定源自乳腺分泌物的产物是否适用于在哺乳动物中刺激B细胞的方法，该方法包括以下步骤：

提供上述产物的样品；并

确定在上述样品中内源CD14的量。

80．权利要求79中的方法，其中，如果该分泌物先前经过处理，那么处理步骤应该是足够温和的以允许保持CD14刺激B细胞的活性。

81．权利要求79或80中的方法，其中确定样品中存在的CD14的量的方法包括将该样品暴露于对CD14特异性的抗体，并确认是否在暴露步骤形成抗体-CD14复合物。

82．权利要求79,80或81中的方法，其中乳腺分泌物是初乳。

83．权利要求79,80或81中的方法，其中乳腺分泌物是乳汁。

84．权利要求79到83任何一项中的方法，其中分泌物是牛的。

85．权利要求79到83任何一项中的方法，其中分泌物是人的。

86．权利要求1到12中任何一项的方法，其中其中的复合物也能被特异性识别人CD14的抗体所特异性识别。

87．权利要求86中的方法，其中的抗体是mAb 3C10和/或识别的氨基酸序列和3C10相同的mAb。

88．权利要求1到12或86中任何一项的方法，其中CD14是人CD14。

89．权利要求1到12或86到88中任何一项的方法，包括口服施用该复合物。

90．权利要求89中的方法其中的复合物作为婴儿制剂的一个组分对婴儿施用。

91．权利要求1到12或86到87中的方法包括以气溶胶的形式施用该复合物。

92．CD14或权利要求1中的复合物在制备用于减轻脓毒症症状的药物中的应用。

93．CD14或权利要求2中的复合物在制备用于增强哺乳动物表达防卫素的药物中的应用。

94．CD14或权利要求4中的复合物在制备用于刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的药物中的应用。

95．CD14或权利要求5中的复合物在制备用于沿着哺乳动物的胃肠道刺激防卫素的表达的药物中的应用。

96．CD14或权利要求6中的复合物在制备用于沿着哺乳动物的呼吸道刺激防卫素的表达的药物中的应用。

97．CD14或权利要求7中的复合物在制备用于刺激哺乳动物的舌头表达防卫素的药物中的应用。

98．CD14或权利要求8中的复合物在制备用于刺激哺乳动物的小肠表达防卫素的药物中的应用。

99．CD14或权利要求9中的复合物在制备用于诱导哺乳动物的上皮细胞表达防卫素的药物中的应用。

100．权利要求13或14中的蛋白在制备用于减轻脓毒症的症状的药物中的应用。

101．权利要求15或16中的蛋白在制备用于预防脂多糖诱导的哺乳动物炎症反应的药物中的应用。

102．权利要求17或18中的蛋白在制备用于增强哺乳动物防卫素表达的药物中的应用。

103．权利要求19或20中的蛋白在制备用于刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的药物中的应用。

104．权利要求21或22中的蛋白在制备用于刺激防卫素沿着哺乳动物的胃肠道表达的药物中的应用。

105．权利要求23或24中的蛋白在制备用于刺激防卫素沿着哺乳动物的呼吸道表达的药物中的应用。

106．权利要求25或26中的蛋白在制备用于刺激防卫素在哺乳动物的舌头上表达的药物中的应用。

107．权利要求27或28中的蛋白在制备用于刺激哺乳动物小肠表达防卫素的药物中的应用。

108．权利要求29或30中的蛋白在制备用于刺激动物的上皮细胞表达防卫素的药物中的应用。

109．根据权利要求32到41中的方法得到的浓缩物在制备用于直接激活B细胞的药物中的应用。

110．根据权利要求32到41中的方法得到的浓缩物在制备用于直接刺激哺乳动物产生防卫素，尤其是刺激上皮细胞进行上述防卫素的产生，的药物中的应用。

111．根据权利要求42到55中的方法得到的CD14在制备用于直接激活B细胞的药物中的应用。

112．根据权利要求42到55中的方法得到的CD14在制备用于直接刺激哺乳动物产生防卫素，尤其是刺激上皮细胞进行上述防卫素的产生，的药物中的应用。

113．在需要治疗的哺乳动物中增强防卫素的表达的方法包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的重组多肽CD14，该重组多肽CD14由非天然存在的重组DNA分子编码，该DNA分子包括选自以下一组序列的第一DNA序列：

(a)根据SEQ ID NO:2编码CD14的cDNA序列

(b)能与(a)的非编码链特异性杂交并且编码一种能被特异性识别人CD14的抗体所特异性识别的多肽的DNA序列；以及

(c)编码的多肽和上文的(a)或(b)所编码的多肽相同的DNA序列；

其中(b)或(c)所编码的多肽能增强上述表达。

114．刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的方法包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的重组多肽CD14，该重组多肽CD14由非天然存在的重组DNA分子编码，该DNA分子包括选自以下一组序列的第一DNA序列：

(a)根据SEQ ID NO:2编码CD14的cDNA序列

(b)能与(a)的非编码链特异性杂交并且编码一种能被特异性识别人CD14的抗体所特异性识别的多肽的DNA序列；以及

(c)编码的多肽和上文的(a)或(b)所编码的多肽相同的DNA序列；

其中(b)或(c)所编码的多肽能刺激上述表达。

115．权利要求113或114中的方法，其中的多肽也能为特异性识别人CD14的抗体所特异性识别。

116．权利要求115中的方法，其中的抗体是mAb 3C10和/或识别的氨基酸序列和3C10相同的mAb。

117．权利要求113到116中的方法包括口服施用该多肽。

118．权利要求113到116中任何一项的方法，其中的多肽是作为婴儿制剂的一个组分对婴儿施用。

119．权利要求113到116中任何一项的方法包括以气溶胶施用的多肽。

120．权利要求113到116中任何一项的方法其中的多肽是含在浓缩的乳汁中。

121．权利要求113中的多肽在制备用于增强哺乳动物表达防卫素的药物中的应用。

122．权利要求114中的多肽在制备用于刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的药物中的应用。

123．权利要求1到55或111到118中任何一项中的方法，其中的复合物、多肽、蛋白浓缩物或CD14，根据具体情况，被作为添加剂添加到饮食中。

124．权利要求1到4,6,7,9到20,23到26或29或30中任何一项中的方法包括根据具体情况将气管的上皮细胞局部直接暴露于上述多肽、或蛋白。

125．权利要求1到4,13,14,17到20，或29或30中任何一项中的方法包括根将哺乳动物的表皮，特别是伤口局部直接暴露。

126．用于对人皮肤的伤口直接局部施用以减轻感染，尤其是细菌感染，的影响的药膏的制备方法，该方法包括在药膏中加入有效剂量的根据权利要求32到41中任何一项得到的浓缩物。

127．用于对人皮肤的伤口直接局部施用以减轻感染，尤其是细菌感染，的影响的药膏的制备方法，该方法包括在药膏中加入有效剂量的根据权利要求42到55中任何一项得到的浓缩物。

128．添加了乳汁产物的一个级分的饮食来源，如婴儿制剂、乳汁或其它液体，上述级分含有的CD14的浓度比未分离的乳汁产物中天然存在的CD14的浓度要高，其中上述乳汁产物未经能使其中含有的CD14变性的程度的处理，上述程度能CD14丧失其合乎需要的活性。

129．权利要求128中的饮食来源，其中CD14是从牛乳汁得到的。

130．将权利要求128或129中的饮食来源对人施用以防止、减轻或治疗人的脓毒症症状。

131．将权利要求128或129中的饮食来源对人施用以刺激人的B细胞。

132．将权利要求128或129中的饮食来源对人施用以增强人的防卫素的表达。

133．权利要求1到31和113到120中的方法，其中哺乳动物是人。

134．权利要求1到31和113到120中的方法，其中哺乳动物是需要抵抗微生物病原体的哺乳动物，上述微生物病原体选自病毒、细菌、真菌和酵母。

135．权利要求1到31和113到120中的方法，其中哺乳动物是免疫缺陷的人。

136．权利要求1到31,65,92,108或113到122任何一项中的方法，其中防卫素选自由RtNP1,RtNP2,RtNP3,RtNP4,HNP1,HNP2和HNP3组成的一组以及它们的任意组合，或选自HNP1,HNP2和HNP3组成的一组。

137．权利要求1到31,65,92,108或113到122任何一项中的方法，其中蛋白或多肽，根据具体情况，施用的剂量为约250Tg到约2500Tg每千克哺乳动物的体重每天，或者为约300Tg到1mg每千克体重每天。

138．权利要求113或114中的方法，其中具有DNA序列(b)的核酸分子和(a)的非编码链在严紧的条件下杂交。

139．用可溶性多肽直接激活B细胞的方法，该方法通过对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的上述多肽；上述多肽的氨基酸序列选自leu-leu-leu-leu-leu-leu-pro-ser、leu-leu-leu-leu-leu-leu-pro-leu和leu-leu-leu-leu-leu-leu-val-his，并且为单克隆抗体3C10所特异性识别，并且能激活B细胞。

140．权利要求139中的方法，其中的氨基酸序列含有选自SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列，或者它们的能激活B细胞的保守替代变体，或它们的能激活B细胞的片断，或上述片断的能激活B细胞的保守替代变体。

141．在其基因组中引入了一种核酸序列的转基因哺乳动物，该序列编码具有标识为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽，或编码上述多肽的能直接激活B细胞的片断；或编码上述多肽的能直接激活B细胞的变体；或该多肽的保守替代变体；或上述直接激活B细胞的片断或变体的缀合物；其中上述核酸序列处于哺乳动物内源CD14启动子的控制之下，并且该核酸序列被添加到哺乳动物天然存在的核酸序列中。

142．权利要求141中的转基因哺乳动物，其中的核酸序列编码的多肽具有标识为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或该多肽的直接激活B细胞的片断；或该多肽的保守替代变体。

143．权利要求142中的转基因哺乳动物，其中的核酸序列编码的多肽具有标识为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列或该多肽的保守替代变体。

144．权利要求143中的转基因哺乳动物，其中的核酸序列编码的多肽具有标识为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

145．权利要求144中的转基因哺乳动物，其中的核酸序列编码的多肽具有标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

146．权利要求145中的转基因哺乳动物，其中的核酸序列具有标识为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列。

147．在基因组中引入了核酸序列的转基因哺乳动物，该核酸序列编码权利要求139或140中的蛋白，其中的核酸序列是处于哺乳动物内源CD14启动子的控制之下，并且该核酸序列被添加到哺乳动物天然存在的核酸序列中。

148．在基因组中引入了核酸序列的转基因哺乳动物，该核酸序列编码权利要求1到31,65,92到108或133或122中的蛋白，其中的核酸序列是处于哺乳动物内源CD14启动子的控制之下，并且该核酸序列被添加到哺乳动物天然存在的核酸序列中。

149．权利要求141到148任何一项中的转基因哺乳动物，其中核酸序列是外源序列。

150．权利要求141到149任何一项中的转基因哺乳动物，其中核酸序列通过重组技术被引入到该哺乳动物或该哺乳动物的祖代中。

151．权利要求150中的转基因哺乳动物，其中核酸序列通过重组技术被引入到该哺乳动物。

152．权利要求141到151中的转基因哺乳动物，其中CD14启动子是牛的启动子。

153．权利要求141到151中的转基因哺乳动物，其中的哺乳动物是牛。

154．在基因组中引入了标识为SEQ ID NO:8的核酸序列的的转基因哺乳动物，其中该核酸序列被添加到哺乳动物天然存在的核酸序列中。

155．权利要求154中的哺乳动物，其中核酸序列通过重组技术被引入哺乳动物或其祖代中。

156．权利要求154中的哺乳动物，其中核酸序列通过重组技术被引入到该哺乳动物。

157．权利要求154到156中的转基因哺乳动物，其中的哺乳动物是牛。

158．用根据权利要求32到55中任何一项得到的CD14直接激活B细胞的方法。

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