CN1280620A

CN1280620A - 抗原蛋白质及编码该蛋白的核酸

Info

Publication number: CN1280620A
Application number: CN98811595A
Authority: CN
Inventors: 竹迫一任; 水谷滋利; 远藤政博; 小川淳子; 大门尚志; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1997-10-01
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2001-01-17
Also published as: KR100567606B1; EP1026245A1; JPH11103862A; US7070793B1; WO1999016881A1; US20050276821A1; KR20010030880A; EP1026245A4

Abstract

提供一种新型抗原蛋白质,它能用于治疗和诊断包括白色假丝酵母的真菌所引起的疾病;并提供编码该抗原蛋白质的核酸。以被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类由来的抗血清所识别为特征的抗原蛋白质,以及编码这种被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别的抗原蛋白质的核酸。

Description

抗原蛋白质及编码该蛋白的核酸

技术领域

本发明涉及白色假丝酵母(Candida albicans)抗原蛋白质及编码该蛋白的核酸，它们利于真菌感染性疾病和变态反应疾病的预防、治疗和诊断。此外本发明涉及含有该核酸的载体以及用该载体进行转化所形成的转化体。本发明还涉及培养所得转化体来生产本发明的抗原蛋白质的方法。本发明还涉及含有本发明的抗原蛋白质或核酸的药用组合物及诊断组合物。

背景技术

白色假丝酵母是人体常存在的菌群，但是，健康人一般能抵抗该菌的感染，基本上不引起全身性的感染性疾病。但是，即使在健康人中有时该真菌也可引起局部性感染病，女性，尤其是在孕妇中可引起阴道假丝酵母病。另一方面，对于因治疗白血病等癌症施用抗癌剂、进行器官移植时施用免疫抑制剂、感染AIDS等所造成免疫易感染状态的人来讲，可引起以内脏为首的全身性感染疾病。再者，该菌是真菌中引起变态反应疾病的最普遍的变态原。另外，大部分人对常在菌-白色假丝酵母处于免疫感应状态，具有针对白色假丝酵母构成成分的抗体，还可获得细胞性免疫。

成为抗原的物质多是以细胞表面的甘露聚糖、葡聚糖等多糖为主的细胞壁构成成分，尤其是多数为甘露聚糖及其与蛋白质的连接物。另外，除上述细胞壁构成成分的抗体外，在白色假丝酵母感染患者或变态反应疾病患者的血清中还检测到细胞内成分烯醇化酶、HSP 90(热休克蛋白90)、磷酸甘油酸激酶、乙醇脱氢酶的抗体等。

白色假丝酵母之外的假丝酵母属真菌，如热带假丝酵母(C．tropicalis)和C．glabrata等也可引起以免疫易感染宿主为主的感染性疾病。假丝酵母属真菌以外的真菌，如曲霉(Aspergillus)属、青霉属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)真菌也在环境中广泛存在，紧密存在于以人为首的哺乳类中。这些真菌细胞的增殖形态为酵母状或菌丝状，其细胞结构基本上相似，表层均围绕着厚厚的细胞壁。细胞壁组成成分的化学结构因真菌种类的不同而存在某种程度的差异，但以甘露聚糖、葡聚糖、壳多糖(chitin)等多糖为主要成分。另外，围绕细胞壁的细胞膜、细胞质内的蛋白质等组成成分也基本相似。这些真菌多数可在免疫易感宿主中引发感染性疾病，成为变态反应的原因。

作为真菌相关疾病的致病因子和变态原，已分离、鉴定了几种真菌来源的抗原分子。可应用对普通真菌具有感应状态的哺乳类的血清来分离鉴定这些抗原分子，所鉴定出的抗原分子中最普遍的成分是围绕真菌表层的细胞壁组成成分。除该成分以外还分离鉴定出一些抗原分子，正以诊断和治疗为目的对此进行研究。但是，并不是所有与在真菌感应状态下保持的抗体进行反应的抗原在感染性疾病和变态反应疾病中均为有效抗原。

本发明的目的是提供新型的抗原蛋白质，它有利于白色假丝酵母等真菌所引发疾病的治疗和诊断。本发明的另一目的是提供编码该抗原蛋白质的核酸。本发明的另一目的是提供含有该核酸的载体以及该载体转化的转化体。本发明的另一目的是提供通过培养所得转化体来生产本发明的抗原蛋白质的方法。此外，本发明的目的是提供含有本发明的抗原蛋白质或核酸的药用组合物及诊断组合物。

发明公开

本发明人应用小鼠、大鼠等对白色假丝酵母感染敏感的哺乳类，对赋予白色假丝酵母感染抵抗性的方法进行了研究。结果表明，应用白色假丝酵母细胞作抗原，与不完全氟氏佐剂混合后免疫这些哺乳类，由此可获得强的感染抵抗性。并且表明，CD4阳性T细胞对这种感染抵抗性发挥主要作用。再者，由获得上述感染抵抗性的免疫感受态哺乳类得来的抗血清与市售的抗假丝酵母属血清，例如因子血清No．1(由IATRONLABORATORIES，INC生产)进行了比较，结果意外发现，对存在于真菌细胞表层的细胞壁来源的成分产生低抗体效价，对除去细胞壁的真菌原生质细胞来源的成分产生高抗体效价。

考虑到显示上述感染抵抗性的免疫感应状态的哺乳类血清中较多含有对真菌感染疾病有效的抗体，本发明人着眼于该血清中所包含的抗体，对该抗血清所识别的抗原蛋白质进行了筛选。即，在白色假丝酵母cDNA的基础上制作表达文库，通过免疫筛选法进行筛选。结果，作为大肠杆菌的重组蛋白质发现了8种抗原蛋白质，分离了其DNA并测定了碱基序列，从碱基序列测定出其氨基酸序列，从而完成本发明。也就是说，本发明的要旨是涉及：(1)抗原蛋白质，其特征在于，它被来源于白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别；(2)免疫学上与上述(1)中的抗原蛋白等同的抗原蛋白质；(3)编码抗原蛋白的核酸，而该抗原蛋白能被来源于白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别；(4)含有上述(3)中核酸的载体；(5)由上述(4)中的载体转化所形成的转化体；(6)被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别的抗原蛋白质的生产方法，其特征为，在上述(3)中的核酸编码的抗原蛋白可能表达的条件下培养上述(5)的转化体；(7)药用组合物，其特征为，它含有上述(1)或(2)中的抗原蛋白，或含有用上述(6)中的生产方法得到的抗原蛋白；(8)诊断组合物，其特征在于，它含有上述(1)或(2)任一项中的抗原蛋白，或含有用上述(6)的方法而得到的抗原蛋白质；(9)以含有上面(3)中核酸为特征的药用组合物；(10)以含有上面(3)中核酸为特征的诊断用组合物；(11)与上面(1)或(2)中任一抗原蛋白质进行特异结合的抗体或抗体片段，以及(12)与上面(3)中的核酸进行特异性结合的核酸。

附图简述

图1是白色假丝酵母的赖氨酸tRNA合成酶同源基因和TPI同源基因来源的重组蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。

本发明的最佳实施方案1．本发明的抗原蛋白质

本发明的抗原蛋白质是能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别的抗原蛋白。

本说明书中的“白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类”是指用来源于白色假丝酵母的抗原进行免疫而获得感染抵抗性的哺乳类，即使施予免疫前的致死量的白色假丝酵母细胞(静脉感染后10日内死亡的细胞数)也不出现死亡的哺乳类。

所讲哺乳类可如下得到。

应用白色假丝酵母感染感受性动物，例如C57BL／6、BALB／c、DBA／2等小鼠，以及Sprague-Dawley、Wistar等大鼠。以白色假丝酵母活细胞作抗原，为了诱导较强的细胞免疫以不完全氟氏佐剂(IFA)作佐剂，将抗原与佐剂混合后免疫动物，皮下或腹腔内施用，第1～2周至少施用2项。将如此免疫所获得的感染抵抗性动物叫做白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类。

本说明书中的“来源于白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清”是指从白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类得到的抗血清。

所讲的抗血清可应用，例如从最终免疫后1～2周后的白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类中采血而获得的抗血清。这种血清的获得是优选应用小鼠，更优选应用5周龄或以上的C57BL／6、BALB／c或DBA／2小鼠对之进行免疫，例如将1×10⁵～1×10⁸个活细胞与IFA混合，用所得混合物进行免疫，每间隔1周免疫2次以上，免疫1周～1个月以后获得抗血清。本发明中所应用的抗血清对真菌细胞的细胞膜成分和细胞内成分显示高抗体效价。与此相对，通常所用的抗假丝酵母属抗血清不是来源于感染抵抗性哺乳类，它对表层的细胞壁构成成分，如对甘露聚糖和甘露聚糖蛋白质有高抗体效价，这与本发明中的抗血清不同。

对本发明中可使用的白色假丝酵母属没有特殊限定，例如可应用白色假丝酵母TIMM 1786珠、白色假丝酵母ATCC 10231株等。

本说明书中“被抗血清所识别”是指与抗血清中所含的抗体成分结合，通常可应用测定该结合时应用的免疫印迹和ELISA、免疫沉淀法等免疫学方法来检测抗原和／或进行定量。抗原与抗体的结合通常于4℃～室温，在适当的溶液中或凝胶或固定了抗原的板上进行。

这种抗原蛋白质可在哺乳类中用作诱导对白色假丝酵母所代表的假丝酵母属感染和其它真菌感染产生感染防御免疫的疫苗的抗原，或用作诊断有无感染和感染进行状态的抗原。另外，可用作用于预防、治疗和诊断以白色假丝酵母为代表的真菌为病因的变态反应疾病的抗原。另外，因为白色假丝酵母为人的常在菌，大多数人的免疫细胞(淋巴细胞、巨噬细胞等)可对白色假丝酵母来源的抗原蛋白质产生各种免疫反应，如各种细胞因子释放、免疫细胞活化等。

也就是说，本发明的抗原蛋白质可用作促进IFN-γ、IL-4等有效免疫调节物质释放、活化的抗原。另外，本发明的抗原蛋白质可用作进行体内诊断时的抗原成分，如在个体内进行吸入诱发试验、皮肤试验、鼻和眼的粘膜试验中用作抗原成分。再者，在实验室诊断中也可用作抗原成分，如在应用抗原抗体反应的凝集反应、沉降反应、中和反应、标记抗体法的诊断方法，组胺释放试验，淋巴细胞胚细胞化试验，白细胞游走抑制试验等中使用。

本发明的抗原蛋白质只要是能被由白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类而来的血清所识别的蛋白质或多肤就无特别限定。所讲的蛋白质或多肽可这样得到，例如应用白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类来源的抗血清对白色假丝酵母cDNA文库的表达产物进行免疫筛选。

本说明书中的“蛋白质”意味着生物体的主要构成成分，表示是由多肽链构成的。另外，本说明书中的多肽是指多个氨基酸通过肽键结合而成的，构成氨基酸的数目没有特殊限定。另外，本说明书中的多肽，既可以是仅由氨基酸构成的单纯多肽，又可以是含有氨基酸以外构成成分的复合多肽。再者，本说明书中的“融合蛋白质”一词是指2种或以上的蛋白质的一部分或全部结合而成的蛋白质或多肽。

可例举以下多肽作为本发明的抗原蛋白质的具体例。(A-1)具有序列号1～9中任何一种氨基酸序列的多肽；(A-2)一种多肽，它具有的氨基酸序列是序列号1～9中任一氨基酸序列中有1个或多个，如1个或几个氨基酸发生缺失、置换、插入或添加的氨基酸序列；(A-3)一种多肽，它是由具有序列号10～18中任一种碱基序列的核酸所编码的；(A-4)一种多肽，编码它的核酸具有的碱基序列是序列10～18中任一碱基序列中有1个以上，如1个或多个碱基发生了缺失、置换、插入或添加的碱基序列。

另外，本发明中也包含免疫学上与前述的抗原蛋白质等同的蛋白质。

这里由序列号1～9中所示的氨基酸序列所构成的多肽分别是应用白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类由来的抗血清，通过免疫筛选，由白色假丝酵母TIMM 1786株的cDNA文库而来的。另外，在免疫筛选中应用大肠杆菌作宿主的表达文库时，多肽作为单纯多肽进行表达。因而，抗原蛋白质的筛选是除去抗假丝酵母血清中含有的大量糖链抗体的影响，用针对多肽部分的抗体进行的。

序列表序列号1中所示的氨基酸序列构成的多肽由248个氨基酸构成，与啤酒糖酵母的丙糖磷酸异构酶(T．Alber和G．Kawasaki，分子和应用遗传学杂志，1卷，419-434(1982))具有同源性。根据从白色假丝酵母培养的细胞分离出的蛋白质N末端氨基酸序列分析结果来看，因为N末端的甲硫氨酸脱离，所以考虑很容易作为抗原蛋白质利用的部分至少存在于序列表序列号1的第2-248位区域中。再结合同源性分析的结果来看，可判断序列表序列号1中的多肽为白色假丝酵母的丙糖磷酸异构酶的全长结构。

序列表的序列号2中所示的氨基酸序列所构成的多肽由132个氨基酸构成，与啤酒糖酵母的赖氨酸tRNA合成酶(由590个氨基酸构成；M．Mirande和J．P．Walker，生物学化学杂志，263卷，18443-18451(1988))N末端附近的区域(氨基酸序号：10～137)具有同源性。

由序列表序列号3中所示的氨基酸序列构成的多肽由548个氨基酸构成，该多肽的第260～546部分与啤酒糖酵母第3染色体YCR 030C(编码由870个氨基酸构成的蛋白质；M．R．Red等，酵母，7卷，533-538(1991))的序列号3的第523-868区域具有同源性。

序列表序列号4中所示氨基酸序列所构成的多肽由175个氨基酸构成，与啤酒糖酵母的EGD2(由174个氨基酸构成；M．Johnston等，科学，265卷，2077-2082(1994))具有同源性。

序列表序列号5中所示氨基酸序列所构成的多肽由88个氨基酸构成，与啤酒糖酵母的ATP合成酶δ链(由244个氨基酸构成；J．Velours等，欧洲生化学杂志，170卷，637-642(1988))C末端附近的区域(氨基酸序号：158-242)具有同源性。

序列表序列号6中所示氨基酸序列构成的多肽由264个氨基酸构成，与啤酒糖酵母的BMH2(由272个氨基酸组成；G．P．H．von Heusden等，欧洲生化学杂志，229卷，45-53(1995))同源。

序列表的序列号7所示的氨基酸序列所构成的多肽由224个氨基酸组成，它与啤酒糖酵母的核糖体YL8蛋白质(由243个氨基酸组成；K．Mizuta等，核酸研究，20卷，1011-1016(1992))同源。

序列表序列号8所示的氨基酸序列构成的多肽由115个氨基酸组成，序列号8的第46～C末端部分与啤酒糖酵母的YNL 083W(由494个氨基酸组成；A．Soler-Mira等，酵母，12卷，485-491(1996))的第284～353氨基酸部分同源。

序列表中序列号9所示的氨基酸序列构成的多肽是众所周知的HSP70 SSB型多肽，是作为兔抗假丝酵母属血清所识别的抗原蛋白质而表达的。全长613个氨基酸，由序列号9的第280位～C末端(333个氨基酸)构成的多肽是作为抗原蛋白而获得的(V．Maneu等，酵母，13卷，677-681，(1997))。

另一方面，与本发明中序列表序列号9所示的氨基酸序列相关的cDNA中，对表达物进行免疫筛选的结果得到4种阳性cDNA，它们编码序列表序列号9中所示氨基酸序列中的第320位～C末端(294个氨基酸)、第452位～C末端(162个氨基酸)、第496位～C末端(118个氨基酸)、第513位～C末端(101个氨基酸)。因此认为C末端至少有100个氨基酸长度的多肽对抗原性的表达很重要。由以上可知，包含上述4种蛋白质在内的含有C末端至少100个氨基酸的约100～294个氨基酸的多肽包含在本发明的抗原蛋白质中。也就是说，本发明的序列表序列号9中所示氨基酸中从N末端开始除去319～512氨基酸长度的氨基酸的多肽也包含在本发明的抗原蛋白质中。

本发明中只要是能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类由来的抗血清所识别的具有以下氨基酸序列的多肽也包含在本发明的抗原蛋白质中，该多肽是序列表序列号1～9中所示氨基酸序列构成的多肽，其氨基酸序列中各有1个或多个，如1个或多个氨基酸发生缺失、置换、插入或添加的氨基酸序列。这里的几个是指数个乃至以上的个数。例如，向序列号1和序列号2所示的抗原蛋白质上加入N末端含有T7标记的肽获得融合蛋白质，象这样添加了与抗原性无关的肽的蛋白质或多肽也包含在本发明的抗原蛋白质中，而缺失T7部分的也包含在本发明的抗原蛋白质中。另外可以前面所讲缺失序列号9所示的氨基酸序列中从N末端开始319～512个氨基酸的多肽做缺失的例子，它也包含在本发明的抗原蛋白质中。

另外，本发明中只要是被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类由来的抗血清所识别的，由序列表的序列号1～9中所示氨基酸序列的一部分构成的多肽也包含在本发明的抗原蛋白中。而且，其部分氨基酸序列中有1个或多个，例如1个或数个氨基酸发生缺失、置换、插入或添加的氨基酸序列的多肽，只要它能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类由来的抗血清所识别，也包含在本发明的抗原蛋白中。另外，如前所述这些本发明的抗原蛋白中附加了与抗原性无关的肽的蛋白质或多肽也包含在本发明的抗原蛋白中。

以序列表序列号1～9所示氨基酸序列的一部分所构成的多肽可通过，例如以序列表序列号1～9所示氨基酸序列构成的抗原蛋白质为原料，用赖氨酸肽链内切酶或胰蛋白酶等蛋白酶通过酶消化后切断，或通过溴化氰等化学方法处理切断后，应用蛋白质纯化中已知的方法对含有目的抗原性的肽片段进行分离、纯化来获得。再者，在与用上述方法得到的多肽化学结构相关信息的基础上，也可利用肽合成技术进行化学合成。或者应用编码该多肽氨基酸序列的核酸进行遗传工程学制备。

作为氨基酸序列中1个或多个，如1个或数个氨基酸发生缺失、置换、插入或添加的实施方法，若应用分子克隆：实验指南第2版(1989年，冷泉港实验室发行，T．Maniatis等编著)中记载的各种遗传工程学方法则无困难。

序列表序列号10～18所示的碱基序列分别是编码由序列号1～9中所示氨基酸序列构成的多肽的核酸序列的例子。因此分别由序列表序列号10～18所示的碱基序列构成的核酸所编码的多肽，只要是能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类由来的抗血清所识别的蛋白质或多肽就包含在本发明的抗原蛋白中。

该核酸是表达通过表达文库的免疫筛选而得到的抗原蛋白质的cDNA，该cDNA是基因全长或其部分碱基序列。例如，序列表的序列号10及序列号15中的碱基序列为抗原蛋白质基因全长，序列号11、12、13、14、16、17和18中所示的碱基序列为抗原蛋白质基因的部分序列。例如，序列号18中的核酸编码的由HSP 70 SSB型而来的抗原蛋白质是上述最小的抗原蛋白质；例如，序列表序列号9中所示氨基酸序列的513位～C末端的101个氨基酸构成的多肽是序列号10的580～882位碱基的核苷酸序列编码的。因此，编码高抗原性部分的重组DNA的设计优选含有序列表序列号10中的580～882位碱基的核苷酸序列。

另外，本发明中碱基序列中含有序列表序列号10～18所示碱基序列中，分别有1个或以上，如1个或几个碱基发生缺失、置换、插入或添加的碱基序列的核酸编码的多肽只要能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类由来的抗血清所识别则包含在本发明的抗原蛋白质中。这里所讲的几个指数个乃至其上的个数。

为了实施核苷酸序列中1个或多个，如1个或数个碱基发生缺失、置换、插入或添加，可应用众所周知的各种遗传工程学方法，例如缺口组合法[Wilfried，K．等，核酸研究，12卷，9441-9456(1984)]、缺失法[Celeste，Y．P．等，酶学方法，154卷，367-382(1987)]、尿嘧啶DNA法[Thomas，A．K．等，基因，34卷，315-323(1987)]和盒式突变法[James，A．W．等，基因，34卷，315-323(1983)]等。

另外，由白色假丝酵母的突变株、近亲种(例如属于假丝酵母属的热带假丝酵母)、啤酒糖酵母以外的其它真菌而来的蛋白质，具有与本发明的抗原蛋白质在免疫学上等同性质的蛋白质或多肽也包含在本发明的抗原蛋白质中。本说明书中“免疫学上具有等同性质的蛋白质”指氨基酸序列或糖链等的修饰不同，但能被用具有序列表1～9中的任一氨基酸序列的抗原蛋白质免疫哺乳类而来的抗血清中含有的抗体所识别的蛋白质或多肽。

再者，为了强化作为抗原时的稳定性和／或增强所期望的反应性，即用于治疗时，以强化诱导个体防御免疫功能和减弱变态反应或使酶活性消失为目的，而用于诊断时，以增强抗原和抗体的特异性结合为目的，可改变本发明的抗原蛋白质制备其衍生物。作为改变方法，可例举：吡啶基乙基化、还原、烷基化、酰化、与适当的单体进行化学偶联、温和的甲醛处理、或盐酸胍处理。作为衍生物的制备方法，可应用聚乙二醇(PEG)法(Wie等，Int．Arch．Allergy Appl．Immunol．，64卷，84-99，(1981))使之与PEG结合。2．本发明的核酸

本发明的核酸是编码能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类由来的抗血清所识别的抗原蛋白质的核酸。

所讲核酸的获得是，例如与本发明的抗原蛋白质相同，制作白色假丝酵母的cDNA表达文库，用由白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类而来的抗血清进行免疫筛选而获得。另外可制作白色假丝酵母的基因组文库或cDNA文库，用推算出的编码本发明抗原蛋白质氨基酸序列一部分的寡核苷酸作探针对该文库进行筛选而获得。

本发明的核酸可作为用于诱导哺乳类对白色假丝酵母为代表的假丝酵母属感染和其它真菌感染的感染防御免疫的疫苗的抗原基因，另外可作为用于预防、治疗和诊断白色假丝酵母为代表的真菌为病因的变态反应疾病的抗原基因。

作为本发明核酸的具体例可例举以下的核酸，如：(B-1)一种核酸，它所编码的多肽具有序列号1～9所示的任何一种氨基酸序列；(B-2)一种核酸，它所编码的多肽具有的氨基酸序列是序列号1～9所示的任一氨基酸序列中有1个或多个，例如1个或数个的氨基酸发生了缺失、置换、插入或添加的氨基酸序列；(B-3)一种核酸，它具有序列号10～18中的任一种碱基序列；(B-4)一种核酸，其碱基序列为序列号10～18所示的任一碱基序列中有1个或多个，如1个或数个碱基发生了缺失、置换、插入或添加；(B-5)(B-1)～(B-4)任一项中的核酸或在严格条件下与该核酸互补核酸杂交的核酸。

这里所讲的核酸，既可是DNA，又可为RNA。

序列表的序列号10～18中所示的碱基序列分别是编码序列号1～9中氨基酸序列构成的多肽的核酸序列。

已知基因上确定氨基酸的密码子(3个碱基的组合)对于每一种氨基酸来说存在1-6种。因而对于编码某种氨基酸序列的核酸来讲，根据其氨基酸序列的不同存在多种类。自然界中核酸并不稳定存在，其碱基序列发生突变的情况并不少见。有时核酸上发生突变，但并未引起其所编码的氨基酸序列发生改变(叫做沉默突变)，具有这种突变的核酸可叫做与突变前的核酸编码同一氨基酸序列的不同核酸。因此不可否定，即使分离出编码某特定氨基酸序列的核酸，在含有该核酸的生物传代的过程中有可能出现多种编码同一氨基酸序列的核酸。而且，应用各种遗传工程学方法人工制备编码同一氨基酸得到的多种核酸也并不困难。

例如，在用基因工程学方法生产蛋白质的过程中，有时编码目的蛋白的原本DNA上使用的密码子在宿主中的使用频率低，此时蛋白质的表达量低。这种情况下，不用改变编码的氨基酸序列，可人为将密码子改变为在宿主中使用频率高的密码子，由此可实现高表达目的蛋白的目的(例如特公平7-102146号公报等)。如此，能人工制备编码特定氨基酸序列的多种核酸自不用说，也可在自然界中制备得到。

由此可知，本说明书中(B-1)所示的、编码序列号1～9中所示氨基酸序列构成的各种多肽的核酸，并不限定于(B-3)所示的由序列号10～18中的碱基序列构成的各种核酸。

因此，本发明中序列号10～18所示的各碱基序列中1个或多个，例如1个或数个碱基发生缺失、置换、插入或添加的核酸，只要其表达产物能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类由来的抗血清所识别就包含在本发明的核酸中。这里所指的数个指几个乃至数个以上。

例如，序列表的序列号10～18中所示的核酸衍生物也包含在本发明的核酸中，该核酸编码的蛋白质是保持具有序列表序列号1～9所示氨基酸序列的各抗原蛋白质的抗原性，而适当脱离了上述蛋白质一部分的蛋白质，以及N末端或C末端附加了其它多肽的抗原蛋白质的融合蛋白，如附加了来源于T7噬菌体的蛋白质、组胺酸标记、麦芽糖结合蛋白质、谷胱甘肽-S转移酶、β-半乳糖苷酶等。

再者，在严格条件下与(B-1)～(B-4)任一项中的核酸或与该核酸互补的核酸进行杂交的核酸，编码能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别的抗原蛋白质的核酸(即(B-5)的核酸)也包含在本发明的核酸中。这种核酸可如下检测。

即，将固定了目的核酸的膜在含有0．5％重量比SDS、0．1％重量比牛血清白蛋白(BSA)、0．1％重量比聚乙烯吡咯烷、0．1％重量比的Ficol 400、0．01％重量比变性鲑精DNA的6×SSC(1×SSC为：0．15M NaCl，0．015M柠檬酸钠，pH7．0)中，与探针一起于50℃孵育12～20小时。孵育终了后，在含有0．5％ SDS的2×SSC中洗膜，从37℃开始直到SSC的浓度达到0．1×SSC，或者温度变化到50℃左右，直到固定了的核酸的信号能与背景区别开来为止，之后进行探针的检测。在该条件下能被检测出的目的核酸叫做“在严格条件下进行杂交的核酸”。这里所应用的探针可以是(B-1)～(B-4)中任意一项的部分核酸或是与该核酸互补的核酸的一部分。

这样的核酸有，例如白色假丝酵母的变异株和亲缘菌(例如热带假丝酵母等假丝酵母属真菌)拥有的，在严格条件下能与(B-1)～(B-4)中任一项的核酸或其互补核酸进行杂交的核酸，且它编码免疫学上具有同等抗原性的蛋白质。

另外，本发明的核酸编码具有序列号1～9所示任一氨基酸序列的多肽的核酸，或其编码的多肽具有的氨基酸序列是序列号1～9所示的任一氨基酸序列中有1个或多个，如1个或数个氨基酸发生了缺失、置换、插入或添加了的核酸中如伴随其突变型、等位基因、同源基因、密码子简并，只要其表达产物能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别，它亦包含在本发明的核酸中。

另外，作为本发明的核酸，有编码被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别的抗原蛋白质的核酸，例如，与(B-1)～(B-5)的核酸特异性结合的核酸。这里，可用众所周知的荧光物质和放射性物质对本发明的核酸进行标记。

应用通过杂交检测白色假丝酵母抗原蛋白质基因时该核酸可用作探针和在用DNA聚合酶进行DNA扩增的方法中，该核酸可作为引物应用。3．本发明的载体、转化体

本发明的载体为含有本发明的核酸的载体。这种载体可使大肠杆菌等宿主稳定保持本发明的核酸。构建上述载体所应用的载体有，例如pUC118、pWH5、pTV118、pSCREEN-1b等，但只要是能插入本发明的核酸并能进行表达的载体就无特殊限定。另外本发明的DNA可与适当的表达载体连接而成为表达用重组DNA。具有序列号10～18所示核苷酸序列的核酸与pSCREEN-1b连接，可作为表达重组DNA导入大肠杆菌在本发明中使用。将核酸插入载体的方法没有特殊限定，可应用T4 DNA连接酶等众所周知的方法。

本发明的转化体是由本发明的载体转化形成的。可通过将本发明的载体导入宿主而获得该转化体。可应用大肠杆菌、芽孢杆菌属等细菌、啤酒糖酵母等酵母、曲霉属、巴斯德毕赤氏酵母等真菌，此外可应用昆虫细胞、COS-7、Vero细胞等动物细胞作宿主。将载体导入宿主的方法有，例如磷酸钙法、CaCl₂法、DEAE葡聚糖法、电穿孔法等众所周知的方法。上述转化体的筛选可通过，例如以所用载体的选择标记为指标进行。另外，确定所期望的核酸导入与否可通过，例如用可特异性检测出本发明核酸的探针与从该转化体中抽提出的核酸进行杂交。

该转化体可在制备本发明的核酸时应用，以及在制备本发明的抗原蛋白质时应用。4．本发明的抗原蛋白质的生产方法

本发明生产被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别的抗原蛋白质的方法以在本发明的核酸编码的抗原蛋白质可能表达的条件下培养本发明的转化体为特征。

对培养条件无特殊限定，例如，在用λ噬菌体载体λSCREEN-1和Phage Maker^TM System Phage Extract[均由Novagen公司生产]获得转化体的情况下，可应用含有氨苄西林作选择压力的LB培养基进行培养，适当的时候加入IPTG(异丙基-硫代β-D-半乳糖苷)诱导表达。应用其它载体和宿主所得到的转化体，可在加入适当选择压力的培养基中在适于蛋白质表达的条件下进行培养。经过培养可使目的蛋白质表达。

可用该领域中众所周知的蛋白质纯化方法对所表达的蛋白质或多肽进行回收、纯化。另外，所得蛋白质或多肤有无抗原性可通过免疫学方法进行确认，如应用免疫印迹法、ELISA或免疫沉降法等。

另外，本发明的抗原蛋白质也可由用基因工程学方法得到的本发明的转化体来生产，也可用已知的蛋白质纯化方法从白色假丝酵母的培养物中获得。5．本发明的药用组合物及诊断组合物

本发明的药用组合物及诊断组合物为：1)包含本发明的抗原蛋白质，或包含用本发明的生产方法而得到的抗原蛋白质；以及2)包含本发明的核酸。1)含有本发明的抗原蛋白质或用本发明的方法而得到的抗原蛋白质的药用组合物及诊断组合物

本发明的药用组合物及诊断组合物包含用于诱导哺乳类对白色假丝酵母为代表的假丝酵母属感染和其它真菌感染产生感染防御免疫的疫苗，或包含用于判断有无感染或感染进行状态的诊断组合物。再者，包含用于预防、治疗和诊断以白色假丝酵母为代表的真菌为病因的变态反应性疾病的组合物。另外，由于白色假丝酵母为人的常在菌，大部分人的免疫细胞(淋巴细胞、巨噬细胞等)可对来自白色假丝酵母的抗原蛋白质产生释放各种细胞因子、活化免疫细胞等免疫反应。即，本发明的药用组合物及诊断组合物也包含能使IFN-γ、IL-4等有效免疫调节物质释放、活化的组合物。

为了获得更强的体液和／或细胞免疫，由于诱导感染防御免疫的组合物通常是将本发明的抗原蛋白质制备成含有以下佐剂的悬浮液或溶液作为制剂应用。通常佐剂与抗原性成分同时施用，也可在施用抗原成分前或后施用。

给哺乳类接种疫苗时的适宜佐剂有氟氏(Freund′s)完全或不完全佐剂；氢氧化铝、明矾等无机胶；溶血卵磷脂、二甲基十八烷基溴化铵等表面活性剂，硫酸化葡聚糖、和poly-IC等聚阴离子；胞壁酰肽和吞噬作用激素等肽；Ribi公司的单磷酰脂A(MPL)；霍乱毒素的B亚基，但并不限于此。抗原可与脂质体或其它微载体一起应用。当然，也可几种不同的抗原蛋白质混合使用。

用于预防、治疗和诊断变态反应疾病的组合物可将本发明的抗原蛋白质以适当的盐溶液和悬浮液的形式应用。某些情况下也可添加聚乙二醇和酚。再者也可是含有上述佐剂的悬浮液或溶液。通常佐剂与抗原同时施用，也可在施用抗原前或后施用佐剂。抗原可与脂质体或其它微载体一起施用。

本发明的药用组合物可依照期望配合各种添加剂施用，或者其剂型可是多种不同的剂型。作为上述添加剂可根据所期望的剂型而添加适宜的添加剂。这些添加剂的例子有，如抗坏血酸、生物素、泛酸钙、烟酸等营养剂；偏磷酸钠、磷酸钠(1、2、3盐)、焦磷酸钠等覆盖剂；山梨酸酯钙、安息香酸等防腐剂；阿拉伯胶、traganth、藻酸钠、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、果糖、可溶性淀粉、氨基酸类、葡萄糖、蔗糖、蜂蜜、脂肪酸酯等添加剂或稀释剂。

本发明的药用组合物可经口或非经口途径施用，例如适于经口施用的剂型，如散剂、颗粒、丸剂或片剂、包衣剂、胶囊、溶液、糖浆等；适于非经口施用的剂型，如注射剂、点滴剂、栓剂、点眼剂、滴鼻剂和喷雾剂等。

当本发明的药用组合物作为特殊疫苗使用时，必要情况下可添加稳定剂，如适当浓度的人血清白蛋白、明胶、氨基酸类等，添加防腐剂，如适当浓度的酚、硫柳汞等。另外，该药用组合物可作为液体制剂应用，也可通过冷冻干燥而制成干燥制剂应用。使用干燥制剂时，可用适当的溶剂，如用注射用的蒸馏水将之悬浮。

药用组合物的施用方法可经口、经粘膜(鼻、阴道等)、经皮(皮下或皮内)、或静脉内施用。作为蛋白质的量，其代表性的施用量是优选0．01～5．0mg／kg体重，更优选1μg～100μg／kg体重，必要时可增加施用量或增加施用次数。

在个体内用于体内诊断的组合物，例如用于吸入诱发试验、皮肤试验、鼻和眼部粘膜试验的诊断组合物包括将本发明的抗原蛋白质制备成冷冻干燥粉或适当的盐溶液和悬浮液形式的组合物，其中也可添加聚乙二醇和酚。在斑片试验中本发明的抗原蛋白质可与添加了十二烷基磺酸钠等表面活性剂的作为基质的白色凡士林混合。另外，作为测定IgE抗体效价的抗原应用时，可将上述抗原蛋白质固定到纸板、纤维素海棉、微量板等固相体上。2)含有本发明的核酸的药用组合物及诊断组合物

本发明的药用组合物及诊断组合物可作为用于诱导哺乳类对以白色假丝酵母为代表的假丝酵母属感染和其它真菌感染产生感染防御免疫的疫苗，或者用于预防、诊断和治疗以白色假丝酵母为首的真菌为病因而引起的变态反应疾病。用于感染防御和变态反应疾病的治疗时，可在哺乳类细胞内表达本发明的核酸，为此可直接应用在适宜的启动子下游包含了本发明的核酸的质粒，或插入到逆转录病毒或腺病毒后制备成适当的盐溶液和悬浮液形式。另外，可将本发明的核酸与脂质体或其它微载体一起施用，或与适当的聚阳离子脂类混合。

前述核酸也可应用含有化学修饰的，化学修饰可提高其向细胞内的移走性或细胞内的稳定性。上述化学修饰包括，例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，烷基磷酸三酯，烷基膦酸酯，烷基磷酸胺酯等衍生物。

本发明的药用组合物的施用方法有肌肉内、皮下、静脉内、经口、直肠内、经皮、经鼻、舌下、腹腔内施用等。代表性的施用量为，核酸量优选0．01μg～10mg／kg体重，更优选1μg～5mg／kg体重，但必要时可增加施用量或增加施用次数。6．本发明的抗体或抗体片段

本发明的抗体是与本发明的抗原蛋白质特异性结合的抗体。这里，作为抗体，只要是与本发明的抗原蛋白质特异性结合，也包含抗体片段。

应用常规方法可得到本发明的抗体，多克隆抗体或单克隆抗体均可。另外，在本发明中，与本发明的抗原蛋白质特异结合的单链抗体亦可。该抗体或抗体片段在白色假丝酵母或其相关真菌引起的感染症中可用于真菌的检测，在由白色假丝酵母或其相关菌引起的变态反应疾病中可用于变态原的鉴定。

在感染症中真菌的检测、变态反应性疾病中变态原的鉴定等场合应用本发明的抗体或抗体片段时，可用众所周知的荧光物质和放射性物质进行标记。

另外，可在本发明的抗原蛋白质的纯化中使用抗体。此时，例如将本发明的抗体或抗体片段固化到载体等上，可更容易地纯化本发明的抗原蛋白质。7．与编码本发明的抗原蛋白质的核酸特异性结合的核酸

与编码本发明的抗原蛋白质的核酸特异结合的核酸在通过杂交检测编码本发明的抗原蛋白质的核酸时可用作探针，通过应用DNA聚合酶进行DNA扩增的方法来进行检测时，可用作引物。与编码本发明的抗原蛋白质的核酸特异结合的核酸包含与编码抗原蛋白质的核酸有义侧或无意侧任一侧相结合的核酸。可用已知的荧光物质和放射性物质对该核酸进行标记。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限于这些

实施例。实施例1．感染抵抗性的诱导及CD4阳性T细胞在感染抵抗性中的涉及1)感染抵抗性的诱导

在Sabouraud葡萄糖培养基中将白色假丝酵母(C．albicans)TIMM 1768振荡培养一晚，离心，回收细胞，用生理盐水洗涤。将所得细胞悬浮到生理盐水中，使之达1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸个每毫升。向各悬浮液中加入等体积的IFA(氟氏不完全佐剂)，混合，将该混合物接种到C57BL／6小鼠的皮下，每只0．1ml，用假丝酵母属活细胞免疫小鼠。一周后，将与上述同样制备的假丝酵母属活细胞以同等量接种到皮下，对小鼠进行再次免疫。即，用5×10⁴个、5×10⁵个、或5×10⁶个假丝酵母属活细胞对一只小鼠进行2次免疫。用生理盐水代替假丝酵母活细胞的悬浮液以作为对照，该生理盐水与等量的IFA混合，每隔一周，将混合物接种到皮下2次。

第2次免疫一周后，将用Sabouraud葡萄糖培养基培养的白色假丝酵母TIMM 1768细胞，以每只2．5×10⁵个静脉内施用给全部的免疫小鼠和对照小鼠，使之感染。感染后观察30天内小鼠的生死。结果如表1所示。

表1

施用药	1次的施用量(个)	平均存活日期±标准差	30天后生存数／使用小鼠数
施用药	1次的施用量(个)	平均存活日期±标准差	30天后生存数／使用小鼠数	生理盐水	-	4．0±1．4	0／5
活细胞	5×10⁴5×10⁵5×10⁶	16．8±6．319．6±9．0＞20．8±10．1	0／50．52／5	生理盐水	-	4．0±1．4	0／5

由表1可以看出，用上述施用量，对照小鼠(非免疫小鼠)全部在10日以内死亡，而免疫小鼠获得明显地感染抵抗性。2)CD4阳性T细胞对感染抵抗性的获得

对应用5×10⁶个白色假丝酵母活细胞，按与上面1)相同的方法在一周的间隔内免疫2次的BALB／c小鼠，在最终免疫后第23天、第26天和第29天共3次，以每只0．3mg腹腔内施用抗CD4抗体(从ATCC TIB207制备)或抗CD8抗体(从ATCC TIB105制备)。最终免疫后第29天，将用Sabouraud-葡萄糖培养基培养的白色假丝酵母TIMM 0136细胞以每只1×10⁵个静脉内施用给小鼠。对照是指非免疫小鼠以及接受免疫但未施用抗体的小鼠，同样将白色假丝酵母TIMM 0136细胞以每只1×10⁵个静脉内施用给这些小鼠。施用后第7日测定肾脏内残存的白色假丝酵母的细胞数。

抗CD4抗体和抗CD8抗体是按照常法将杂交瘤注射到scid小鼠腹腔内，使杂交瘤增殖，从腹水中进行纯化。通过流式细胞仪(OrthoDiagnostic生产)可以确认所得抗体可除去各细胞。

其结果显示施用抗CD4抗体后肾脏内的假丝酵母属细胞数受到明显抑制，这表明CD4阳性T细胞对感染抵抗性起到重要作用。实施例2．感染抵抗性哺乳类血清的采集和其性质，及其各种吸收血清的制作1)感染抵抗性哺乳类血清的收集

用与实施例1-2)相同的方法，用与CFA(氟氏完全佐剂)佐剂混合的5×10⁶个白色假丝酵母TIMM 1768活细胞免疫3次BALB／c小鼠，最终免疫后第7天按常规方法从BALB／c小鼠中收集血清。将之称作抗假丝酵母属血清。2)感染抵抗性哺乳类血清的性质

研究实施例2-1)中所得抗假丝酵母属血清的性质。

首先制备作为抗原成分的白色假丝酵母属细胞壁部分(CW)、胞质部分(HSS)、细胞膜部分(LSP)。

将一白金环的白色假丝酵母TIMM 1768的Sabouraud琼脂斜面培养物转入含有5ml YPD培养基(1％重量的酵母提取物，2％重量的多蛋白胨，2％重量的葡萄糖)的试管中。30℃振荡培养24小时后，将其培养液50μl加入到含有500ml YPD培养基的2L体积的三角烧瓶中，35℃振荡培养一晚，共用4个2L三角烧瓶进行培养。

从所得大约2L的培养液(约7×10⁷细胞／ml)中，通过2,000×g离心10分钟来收集细胞。用500ml的灭菌水将细胞洗涤2次后，用500ml的SSB溶液(加入0．8M山梨糖醇的50mM磷酸缓冲液(pH 7．5))洗涤1次。将细胞悬浮到大约500ml的SSB溶液中，加入含100mMEDTA的SSB溶液70ml，1ml 2-巯基乙醇，缓慢振荡。接着，向该悬液中加入含有每1ml相当于3．3mg ZYMOLYASE 20T(生化学工业公司)的SSB溶液70ml，35℃缓慢振荡1小时。加入70ml含有每ml 12mg木霉属裂解酶(Sigma生产)的SSB溶液，35℃缓慢振荡1小时。将所得悬浮液于2，000×g离心10分钟，收集原生质细胞，同时上清作为细胞壁成分(CW)。

向如上得到的原生质细胞中加入140ml灭菌生理盐水(该悬液中每1ml大约有1×10⁹个原生质细胞)，充分搅拌后，冰浴中放置10分钟。确认原生质细胞破裂后10，000×g离心30分钟，所得沉淀作为不溶性部分(叫做LSP)。再将离心上清于100，000 × g离心60分钟，将得到的离心上清叫做可溶性部分(叫做HSS)。将LSP悬浮到140ml生理盐水中，超声波处理后再在沸腾的水浴中加热处理5分钟灭菌，作为含有膜蛋白质等的LSP抗原液。另外，对CW进行同样地超声波处理，加热处理后作为CW抗原液。而对于HSS，其原液为HSS抗原液。

如上所得的LSP抗原液的蛋白质浓度为2．3 mg／ml，HSS抗原液的蛋白质浓度为3．5 mg／ml，CW抗原液的蛋白质浓度为2．1mg／ml(蛋白质质量是以BSA作标准用双辛可宁酸(BCA)进行定量的)。

将用为抗原成分而得到的CW抗原液、LSP抗原液、HSS抗原液用PBS稀释为各蛋白质浓度为10μg／ml，然后各加入50μl的Immuno-Module[Nunc公司生产]4℃放置一晚，用各抗原使各Immuno-Module包被。用含有1％牛血清白蛋白的PBS溶液封闭包被了的Immuno-Module。接着向Immuno-Module中加入50μl稀释了60倍的抗假丝酵母属血清或对照血清，37℃孵育1小时后，与过氧化酶标记的小鼠IgG抗体(2000倍稀释)孵育37℃ 1小时。之后用PBS洗涤，然后加入基质溶液。15分钟后，于405nm处测定吸光度。该吸光度越高识别抗原的抗体量越多，即表明与抗原相对的抗体效价高。其结果如表2所示。上述对照血清的制备是，用生理盐水取代活细胞，将该生理盐水与等体积的CFA混合，用混合物皮下接种小鼠，每隔1周免疫3次，从这样的小鼠血清中制备出对照血清。

表2

抗原部分	吸光度
	吸光度		抗假丝酵母血清	对照血清
	CWLSPHSS	0．0130．0510．237	抗假丝酵母血清	对照血清	0．0060．0060．006

如表2所示，抗假丝酵母属血清对HSS的抗体效价最高，但对LSP也具有抗体效价。对CW的抗体效价低。实施例3．由白色假丝酵母cDNA表达文库对抗原蛋白质的筛选1)白色假丝酵母cDNA表达文库的制作

为了制作白色假丝酵母TIMM 1768株的cDNA表达文库，从细胞中提取、纯化总RNA。即，在200ml YPD培养基中将上述菌35℃培养后，离心(2000 rpm，5分钟)，回收细胞，用蒸馏水洗涤一次。在液氮中将菌体速冻后，用乳钵将冻结菌体破碎成粉末状。用RNA提取试剂盒[Pharmacia生产]从菌体粉末中回收、纯化总RNA。应用Oligotex-dT30<Super>(宝酒造)从总RNA制备poly(A)⁺RNA。应用cDNA合成试剂盒(宝酒造)从5μg poly(A)⁺RNA合成cDNA。将合成的cDNA与λ噬菌体载体-λSCREEN-1[Novagen生产]连接后，应用PhageMaker^TM System Phage Extract(Novagen生产)进行体外包装，构建成cDNA文库。2)被白色假丝酵母活细胞免疫所得抗假丝酵母属血清识别的抗原蛋白质的免疫筛选

通过免疫筛选检测出表达与白色假丝酵母属活细胞免疫的抗血清进行反应的蛋白质的噬菌体克隆。应用噬菌体载体λSCREEN-1制成的cDNA文库中，其cDNA以含有T7标记序列的融合蛋白质的方式表达，或作为cDNA内从翻译起始密码子开始的多肽表达。

即，将cDNA文库接种到宿主大肠杆菌BL21(DE3)pLysE株中，与顶级琼脂糖(含有0．7％重量的琼脂糖的LB培养基)混合后，涂到2×YT(1．6％重量的Bacto-tripton、1％重量的酵母提取物、0．5％重量的NaCl)平皿上，37℃培养6小时，形成噬菌体斑。将尼龙膜[Hybond N，Amersham生产]重叠到所生噬斑上，4℃静置一夜后，37℃保温4小时。将膜从平皿上剥离，用PBST(组成为100mM NaCl，10mM磷酸缓冲液pH7．5，0．1％吐温20)洗涤10分钟后，将膜浸入到适量的Block Ace(大日本制药公司)中进行封闭。室温放置一夜后，将该膜与在实施例2-1)中制备的抗假丝酵母属血清(500倍稀释液)于室温孵育3小时。孵育后洗涤，然后与过氧化酶标记的小鼠IgG抗体(1000倍稀释)于室温孵育1小时。孵育后洗涤，然后用SuperSignalSubstrate Western Blotting[Pierce生产]进行发光，检测出与抗假丝酵母属血清进行反应的噬菌斑。

对5×10⁴个噬菌斑进行筛选的结果是存在100-150个与抗血清进行反应的噬菌斑。这其中关注进行特别强反应的噬菌斑，再进行克隆。将克隆的噬菌体接种到宿主大肠杆菌BM25．8株中，可在大肠杆菌内进行自动亚克隆，存在于噬菌体DNA中的包含cDNA的区域可自动的亚克隆到质粒DNA中。从包含该质粒的大肠杆菌中纯化质粒，测定cDNA的核苷酸序列。核苷酸序列分析的结果是2克隆是与啤酒糖酵母(S．cerevisiae)的丙糖磷酸异构酶具有同源性的新基因，有全长cDNA。另外，各存在一克隆，它们具有与啤酒糖酵母的赖氨酰tRNA合成酶和啤酒糖酵母第3染色体的DNA 98同源的新基因。这些cDNA包含每种基因的一部分，这表明该区域内存在与抗血清反应的抗原决定簇。

上述新型基因，即啤酒糖酵母的丙糖磷酸异构酶同源基因、啤酒糖酵母赖氨酰tRNA合成酶同源基因，啤酒糖酵母第3染色体DNA 98的同源基因的核苷酸序列分别显示于序列表的序列号10、11、12中，由此可知这些核酸所编码的多肽分别具有序列表序列号1、2、3中所示的氨基酸序列。3)通过吸收抗假丝酵母属血清筛选白色假丝酵母的抗原蛋白质

应用白色假丝酵母活细胞免疫血清而来的吸收抗血清，从上述1)的cDNA文库中进行白色假丝酵母抗原蛋白质的免疫筛选。即，制备抗假丝酵母属血清与HSS和CW以1∶1∶1(v／v／v)混合的溶液，称之为吸收抗血清。

应用该吸收抗血清，用与实施例3-2)同样的方法进行抗原分子的筛选。所用抗血清是吸收抗血清的500倍稀释液。对与该抗血清进行反应的噬菌斑再进行克隆。克隆出的cDNA碱基序列分析的结果为：1个克隆几乎含有全长的与啤酒糖酵母的EGD2基因同源的新基因，1克隆是与ATP合成酶δ链同源的新基因的一部分。所得碱基序列的信息分别显示于序列表的序列号13、14中。另外，这些碱基序列编码的多肽分别具有序列表的序列号4、5所示的氨基酸序列。

另外，含有已知的HSP 70 SSB型cDNA一部分的克隆有4个，分别是编码C末端294个氨基酸、162个氨基酸、118个氨基酸、101个氨基酸的cDNA。该结果表明HSP 70 SSB型抗原在C末端的118个氨基酸区域内存在与抗血清进行反应的抗原决定簇。编码最长的294个氨基酸的HSP 70 SSB型基因的碱基序列以及由该碱基序列所推定的氨基酸序列分别显示于序列号18、19中。

其次，存在对加入HSS而得的吸收抗血清反应阳性的噬菌斑，但也存在对加入HSS和CW而得的吸收抗血清反应阴性的噬菌斑，用与上述2)同样的方法对这些菌斑cDNA进行分析。2克隆含有与啤酒糖酵母的BMH 2基因同源的新基因的全长，1克隆几乎含有与啤酒糖酵母核糖体蛋白质的L7基因同源的新基因的全长。1克隆包含与啤酒糖酵母的YNL 083W同源的新基因的一部分(115个氨基酸)。

这些新基因，即啤酒糖酵母的BMH 2同源基因、啤酒糖酵母核糖体L7蛋白质同源基因、啤酒糖酵母YNL 083W同源基因的核苷酸序列分别显示于序列表的序列号15、16、17中，这些基因所编码的多肽分别具有序列表的序列号6、7、8中所示的氨基酸序列。实施例4．被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别的抗原蛋白质的制备

实施例3-2)及3-3)中所得的cDNA除与啤酒糖酵母的YNL083W同源的基因外，均以融合蛋白的方式表达。与YNL 083W同源的基因从cDNA内的起始密码子(ATG)开始表达多肽。作为表达融合蛋白的一例，与丙糖磷酸异构酶(TPI)同源的基因和与赖氨酰tRNA合成酶同源的基因所表达的多肽可表明这一点。

即，用含有与实施例3-2)中得到的TPI同源的基因的质粒，及含有与赖氨酰tRNA合成酶同源基因的质粒分别转化大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS，得到转化体。将所得转化体接种到含有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养3．5小时。添加终浓度为1mM的IPTG(异丙基-硫代β-D-半乳糖苷)，再继续培养2．5小时。将培养液离心回收菌体，洗涤后将菌体悬浮到30μg 1×SDS样品缓冲液中。100℃加热处理5分钟后，离心，将其上清中的一部分进行SDS-聚丙烯酰胺(12．5％胶)电泳，确认多肽的表达。

所预想的表达的融合蛋白的分子量为：TPI同源体63kDa(TPI同源体27kDa+T7标记区36kDa)，赖氨酰tRNA合成酶同源体50kDa(赖氨酰tRNA合成酶同源体14kDa+T7标记区域36kDa)。由图1可知这些融合蛋白作为具有预想分子量的多肽表达。

图1中1泳道中的样品是导入了赖氨酰tRNA合成酶同源基因的转化体表达诱导前(添加IPTG前)得到的多肽，2泳道的样品是诱导后(添加IPTG后)得到的多肽。3泳道的样品是导入了TPI同源基因的转化体表达诱导前获得的多肽，4泳道的样品是诱导后得到的多肽。

工业实用性

本发明的抗原蛋白质是能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类由来的抗血清所识别的抗原，它有利于白色假丝酵母感染的治疗和诊断。另外，本发明的核酸是编码本发明的抗原蛋白质的核酸，它有利于白色假丝酵母感染的治疗和诊断。

序列表<110>Takara Shuzo Co．，Ltd．<120>一种抗原蛋白和编码该蛋白的核酸<130>98-038-PCT<150>JP 9／269087<151>1997-10-1<160>18<210>1<211>248<212>蛋白质<213>白色假丝酵母<400>Met Ala Arg Gln Phe Phe Val Gly Gly Asn Phe Lys Ala Asn Gly

1 5 10 15Thr Lys Gln Gln Ile Thr Ser Ile Ile Asp Asn Leu Asn Lys Ala

20 25 30Asp Leu Pro Lys Asp Val Glu Val Val Ile Cys Pro Pro Ala Leu

35 40 45Tyr Leu Gly Leu Ala Val Glu Gln Asn Lys Gln Pro Thr Val Ala

50 55 60Ile Gly Ala Gln Asn Val Phe Asp Lys Ser Cys Gly Ala Phe Thr

65 70 75Gly Glu Thr Cys Ala Ser Gln Ile Leu Asp Val Gly Ala Ser Trp

80 85 90Thr Leu Thr Gly His Ser Glu Arg Arg Thr Ile Ile Lys Glu Ser

95 l00 105Asp Glu Phe Ile Ala Glu Lys Thr Lys Phe Ala Leu Asp Thr Gly

110 115 120Val Lys Val Ile Leu Cys Ile Gly Glu Thr Leu Glu Glu Arg Lys

125 130 135Gly Gly Val Thr Leu Asp Val Cys Ala Arg Gln Leu Asp Ala Val

140 145 150Ser Lys Ile Val Ser Asp Trp Ser Asn Ile Val Val Ala Tyr Glu

155 160 165Pro Val Trp Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala Thr Pro Glu Asp

170 175 180Ala Glu Glu Thr His Lys Gly Ile Arg Ala His Leu Ala Lys Thr

185 190 195Ile Gly Ala Glu Gln Ala Glu Lys Thr Arg Ile Leu Tyr Gly Gly

200 205 210Ser Val Asn Gly Lys Asn Ala Lys Asp Phe Lys Asp Lys Ala Asn

215 220 225Val Asp Gly Phe Leu Val Gly Gly Ala Ser Leu Lys Pro Glu Phe

230 235 240Val Asp Ile Ile Lys Ser Arg Leu

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Claims

1．一种抗原蛋白质，其特征在于，它能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类由来的抗血清所识别。

2．权利要求1的抗原蛋白质，其中抗原蛋白质为

(A-1)一种多肽，它具有序列号1～9所示任一种氨基酸序列；

(A-2)一种多肽，它具有的氨基酸序列是序列表1～9所示的任一种氨基序列中有1个或多个的氨基酸发生缺失、置换、插入或添加了的氨基酸序列；

(A-3)一种多肽，它是由具有序列号10～18中任一碱基序列的核酸所编码的；或

(A-4)一种多肽，编码它的核酸具有这样的碱基序列：序列号10～18所示的任一碱基序列中有1个或多个碱基发生了缺失、置换、插入或添加。

3．免疫学上与权利要求1或2的抗原蛋白等价的抗原蛋白质。

4．一种核酸，它编码能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别的抗原蛋白质。

5．权利要求4的核酸，其中的核酸为：

(B-1)一种核酸，它编码的多肽具有序列号1～9所示的任一种氨基酸序列；

(B-2)一种核酸，它编码的多肽具有这样的氨基酸序列：序列号1～9所示的任一种氨基酸序列中有1个或多个的氨基酸发生了缺失、置换、插入或添加的序列；

(B-3)一种核酸，它具有序列号10～18所示的任一种碱基序列；

(B-4)一种核酸，它具有的碱基序列是序列号10～18所示的碱基序列中有1个或多个的碱基发生缺失、置换、插入或添加的序列；或

(B-5)一种核酸，在严格条件下，它能与(B-1)至(B-4)任一权项中的核酸或其互补核酸进行杂交。

6．一种载体，它含有权利要求4或5的核酸。

7．一种转化体，它是用权利要求6的载体进行转化而形成的。

8．一种能被白色假丝酵母感染抵抗性哺乳类的抗血清所识别的抗原蛋白质的生产方法，其特征在于，在权利要求4或5的核酸所编码的抗原蛋白质可以表达的条件下培养权利要求7的转化体。

9．一种药用组合物，其特征在于，它含有权利要求1～3任一权项中的抗原蛋白质，或含有用权利要求8的生产方法而得到的抗原蛋白质。

10．一种诊断组合物，其特征在于，它包含权利要求1～3任一权项中的抗原蛋白质，或包含用权利要求8的生产方法得到的抗原蛋白质。

11．一种药用组合物，其特征在于，它含有权利要求4或5的核酸。

12．一种诊断组合物，其特征在于，它包含权利要求4或5的核酸。

13．一种抗体或抗体片段，它能与权利要求1～3任一项中的抗原蛋白质特异结合。

14．一种核酸，它与权利要求4或5的核酸特异结合。