KR100567606B1 - 항원단백질 및 그 단백질을 코드하는 핵산 - Google Patents

Abstract

캔디다·알비칸스를 포함하는 진균으로 인한 질환의 치료 및 진단에 유용한 신규한 항원단백질; 및 상기 항원단백질을 코드하는 핵산을 제공하는 것. 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 항원단백질 및 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 항원단백질을 코드하는 핵산.

캔디다 알비칸스, 항원단백질

Description

항원단백질 및 그 단백질을 코드하는 핵산 {ANTIGEN PROTEIN AND NUCLEIC ACID CODING FOR SAID PROTEIN}

본 발명은 진균으로 인한 감염증이나 알러지 질환의 예방, 치료, 진단에 유용한 캔디다·알비칸스 (Candida albicans) 항원단백질 및 그것을 코드하는 핵산에 관한 것이다. 또 본 발명은 그 핵산을 함유하여 이루어지는 벡터, 및 그 벡터에 의해 형질전환되어 이루어지는 형질전환체에 관한 것이다. 또 본 발명은 이러한 형질전환체를 배양하는 본 발명의 항원단백질의 생산방법에 관한 것이다. 또 본 발명은 본 발명의 항원단백질 또는 핵산을 함유하는 의약조성물 및 진단용 조성물에 관한 것이다.

캔디다·알비칸스는 인간의 상재균인데, 정상인은 통상 본균의 감염에 대하여 저항성을 나타내고, 전신적 감염증을 일으키는 일은 거의 없다. 그러나, 본균은 정상인이라도 부분적인 감염증을 일으키는 경우가 있으며, 여성 특히 임부에게는 질캔디다증을 일으키는 경우가 있다. 한편, 백혈병 등의 암을 치료하기 위하여 제암제의 투여를 받은 경우, 장기이식에 수반하는 면역억제제의 투여를 받은 경우, AIDS 감염을 일으킨 경우 등에 의해 면역적 이감염상태가 된 인간은 내장을 비롯한 전신적인 감염증을 일으키는 경우가 있다. 또 본균은 진균 중에서는 가장 빈도가 높은 알레르겐이며, 알러지 질환의 원인이기도 하다. 또한 대부분의 인간은 상재균인 캔디다·알비칸스의 면역감작상태에 있고, 캔디다·알비칸스의 구성성분에 대한 항체를 가지고 있으며, 또한 세포성면역을 획득하고 있다.

항원으로 되어 있는 것의 대부분은 세포표면의 만난 (mannan), 글루칸 (glucan) 등의 다당을 중심으로 하는 세포벽 구성성분이며, 특히 만난 및 그의 단백질과의 결합물이 많다. 또한 캔디다·알비칸스 감염환자 또는 알러지 질환환자의 혈청중에는 상기 세포벽 구성성분에 대한 항체 외에 세포내 성분인 에놀라제 (enolase), HSP90 (heat shock protein90), 포스포글리세레이트 키나아제 (phosphoglycerate kinase), 알코올데히드로게나아제 (alcohol dehydrogenase) 에 대한 항체 등이 검출되고 있다.

캔디다·알비칸스 이외의 캔디다속 진균, 예컨대 캔디다·트로피칼리스 (C. tropicalis), 캔디다·글라브라타 (C. glabrata) 등도 주로 면역적 이감염숙주에 감염증을 일으킨다. 캔디다속 진균 이외의 진균, 예컨대 아스페르길루스 (Aspergillus) 속, 페니실륨 (Penicillium) 속, 알터나리아 (Alternaria) 속 진균도 환경중에 넓게 존재하여 인간을 비롯한 포유류에게 매우 가까운 존재이다. 이들 진균의 세포증식형태는 효모상 혹은 균사상이지만, 그 세포구조는 기본적으로는 유사하며, 표층은 전부 두꺼운 세포벽으로 둘러싸여 있다. 세포벽 구성성분의 화학구조는 진균의 종류에 따라 어느 정도 다르지만 만난, 글루칸, 키틴 (chitin) 등의 다당을 주성분으로 하고 있다. 또한 세포벽에 둘러싸인 세포막, 세포질내의 단백질을 비롯한 구성성분도 기본적으로는 유사하다. 이들 진균도 대부분의 것이 면역적 이감염숙주에 감염증을 일으키거나, 알러지의 원인이 된다.

진균이 관여하는 질환의 병원인자 및 알레르겐으로서, 몇개의 진균유래의 항원분자가 단리동정되어 있다. 이들 항원분자의 단리동정에는 일반적으로 진균에 대하여 감작상태인 포유류의 혈청을 이용하고 있으며, 동정된 이들 항원분자로서는 진균의 표층을 둘러싼 세포벽 구성성분이 가장 일반적이다. 이 성분 이외에도 단리동정되어 있는 항원분자는 많이 있으며, 진단이나 치료를 목적으로 연구되고 있다. 그러나, 진균감작상태에 있어서 보유되어 있는 항체에 반응하는 항원이 모두 감염증이나 알러지 질환에 유효하게 작용하는 항원이라고는 할 수 없다.

본 발명의 목적은 캔디다·알비칸스를 비롯한 진균에 의한 질환의 치료 및 진단에 유용한 신규한 항원단백질을 제공하는 데 있다. 또한 본 발명의 목적은 이 항원단백질을 코드하는 핵산을 제공하는 데 있다. 또한 본 발명의 목적은 이 핵산을 함유하여 이루어지는 벡터 및 벡터에 의해 형질전환되어 이루어지는 형질전환체를 제공하는 데 있다. 또한 본 발명의 목적은 이러한 형질전환체를 배양하는 본 발명의 항원단백질의 생산방법을 제공하는 데 있다. 또한 본 발명의 목적은 본 발명의 항원단백질 또는 핵산을 함유하는 의약조성물 및 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

발명의 개시

본 발명자들은 마우스, 래트 등의 캔디다·알비칸스 감염에 감수성인 포유류에 대하여 캔디다·알비칸스 감염 저항성을 부여하는 방법에 대하여 검토하였다. 그 결과, 이들 포유류에 대하여 항원으로서 캔디다·알비칸스세포를 사용하여 불완 전 프로인트 아쥬반트의 아쥬반트와 섞어서 면역함으로써 강한 감염 저항성을 획득시킬 수 있음을 명확히 하였다. 그리고, 이 감염 저항성에 CD4 양성 T 세포가 중요한 작용을 하고 있음을 명확히 하였다. 또한 상기 감염 저항성을 획득한 면역감작상태에 있는 포유류로부터 얻어진 항혈청은 예컨대 시판의 항캔디다혈청인 인자혈청 No.1 (야트론 제조) 에 비하여 뜻밖에도 진균세포표층에 존재하는 세포벽유래성분에는 낮은 항체값을 나타내고, 세포벽을 제거한 진균의 프로토플라스트 세포 유래의 성분에 의해 높은 항체값을 나타낸다.

본 발명자들은 상기 감염 저항성을 나타내는 면역감작상태에 있는 포유류의 혈청중에는 진균감염증에 유효하게 작용하는 항체를 보다 많이 함유하는 것으로 생각하여, 이 혈청에 함유되는 항체에 주목하여 이 항혈청에 의해 인식되는 항원단백질을 탐색하였다. 즉, 캔디다·알비칸스의 cDNA 를 바탕으로 발현라이브러리를 제작하고, 이뮤노스크리닝에 의해 탐색하였다. 그 결과, 대장균의 재조합 단백질로서 8 종류의 항원단백질을 발견하고, 그 DNA 를 단리하여 염기서열을 결정함과 동시에 염기서열에서 아미노산 서열을 결정하여 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명의 요지는

[1] 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 항원단백질,

[2] 상기 [1] 에 기재된 항원단백질과 면역학적으로 동등한 항원단백질,

[3] 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 항원단백질을 코드하는 핵산,

[4] 상기 [3] 에 기재된 핵산을 함유하여 이루어지는 벡터,

[5] 상기 [4] 에 기재된 벡터에 의해 형질전환되어 이루어지는 형질전환체,

[6] 상기 [5] 에 기재된 형질전환체를 상기 [3] 에 기재된 핵산에 코드되는 항원단백질의 발현가능한 조건하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 항원단백질의 생산방법,

[7] 상기 [1] 혹은 [2] 에 기재된 항원단백질, 또는 상기 [6] 에 기재된 생산방법에 의해 얻어지는 항원단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 의약조성물,

[8] 상기 [1] 혹은 [2] 중 어느 하나에 기재된 항원단백질, 또는 상기 [6] 에 기재된 생산방법에 의해 얻어지는 항원단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물,

[9] 상기 [3] 에 기재된 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 의약조성물,

[10] 상기 [3] 에 기재된 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물,

[11] 상기 [1] 또는 [2] 중 어느 하나에 기재된 항원단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 및

[12] 상기 [3] 에 기재된 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산,

에 관한 것이다.

도 1 은 C. 알비칸스의 리실 tRNA 신테타제 호모로그 유전자와 TPI 호모로그 유전자 유래의 재조합단백질을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동한 결과를 나타내 는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

1. 본 발명의 항원단백질

본 발명의 항원단백질은 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 단백질이다.

본 명세서에서「캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류」란 캔디다·알비칸스 유래의 항원을 면역하여 감염 저항성을 획득시킨 포유류로서, 면역전의 치사량의 캔디다·알비칸스 세포 (정맥내 감염후 10 일 이내에 죽는 세포수) 를 투여해도 죽지 않게 된 상태의 포유류이다.

이러한 포유류는 예컨대 다음과 같은 방법으로 얻을 수 있다.

캔디다·알비칸스 감염 감수성의 동물, 예컨대 C57BL/6, BALB/c, DBA/2 등의마우스, 및 Sprague-Dawley, Wistar 등의 래트 등에 대하여 항원으로서 캔디다·알비칸스 생세포, 아쥬반트로서 세포성 면역을 강하게 유도하기 위하여 불완전 프로인트 아쥬반트 (IFA) 를 사용한 혼합물을 피하 또는 복강내에 1 내지 2 주 간격으로 2 회 이상 투여하여 면역한다. 이 같은 방법으로 면역되어 감염 저항성을 획득한 동물을 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류로 한다.

본 명세서에서「캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청」이란 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류에서 얻어지는 항혈청이다.

이러한 항혈청으로는 예컨대 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류에 있어서, 최종면역후 1 내지 2 주후에 채혈한 것을 사용할 수 있다. 이 같은 항혈청은 바람직하게는 포유류로서 마우스, 더욱 바람직하게는 5 주령 이상의 C57BL/6, BALB/c 또는 DBA/2 를 사용하고, 이것에 예컨대 1 ×10⁵ 내지 1 ×10⁸ 개의 살아있는 세포를 IFA 와 섞고, 얻어진 혼합물을 사용하여 약 1 주 간격으로 2 회 이상 면역하고, 그 후 1 주 내지 1 개월 경화후에 얻어지는 항혈청이다. 본 발명에 사용되는 항혈청은 진균세포의 세포막성분 및 세포내분자에 대하여 높은 항체값을 나타내는 것이다. 이에 대하여 일반적으로 사용되는 항캔디다 항혈청은 감염 저항성 포유류 유래의 것은 아니며, 표층의 세포벽의 구성성분, 예컨대 만난이나 만난 단백질에 대하여 높은 항체값을 가지고 있어서 본 발명의 항혈청과는 다르다.

그리고 본 발명에 사용할 수 있는 캔디다·알비칸스 세포는 특별하게 국한되지 않지만 예컨대 캔디다·알비칸스 TIMM 1768 주, 캔디다·알비칸스 ATCC 10231 주 등을 들 수 있다.

본 명세서에서「항혈청에 의해 인식되는」이란 항혈청중에 포함되는 항체성분과 결합하는 것을 의미하고, 통상 이 결합을 측정하기 위하여 사용되는 이뮤노 블롯팅이나 ELISA, 면역침강법 등의 면역학적 수법으로 그 항원을 검출 및/또는 정량할 수 있다. 항원과 항체의 결합은 통상 4 ℃ 내지 실온에서 적당한 용액중이나 겔내 또는 항원고정화 플레이트 위에서 실시한다.

이들 항원단백질은 포유류에 있어서, 캔디다·알비칸스로 대표되는 캔디다균에 의한 감염이나 다른 진균감염에 대한 감염방어면역을 유도하기 위한 백신용 항원으로서, 또한 감염 유무 및 진행상태를 진단하기 위한 항원으로서 유용하다. 또한, 캔디다·알비칸스로 대표되는 진균을 원인으로 하는 알러지 질환의 예방, 치료 및 진단을 위한 항원으로서 유용하다. 또한, 캔디다·알비칸스는 인간의 상재균이기 때문에, 대부분의 인간의 면역세포 (림프구, 마크로파아지 등) 가 캔디다·알비칸스 유래의 항원단백질에 대하여 각종 사이토카인 유리, 면역세포의 활성화 등과 같은 면역반응을 일으킨다.

즉, 본 발명의 항원단백질은 인터페론 γ, 인터류킨 4 등의 유효한 면역조절물질을 유리시키거나, 활성화시키기 위한 항원으로서 유용하다. 또한 본 발명의 항원단백질은 생체내 진단의 목적으로 개체에 대하여 예컨대 흡입유발시험, 피부테스트, 코나 눈의 점막시험에 있어서의 항원성성분으로 사용할 수 있다. 또한 실험실진단, 예컨대 항원항체반응인 응집반응, 침강반응, 중화반응, 표지항체법을 이용한 진단법, 히스타민 유리시험, 림프구 유약화시험, 백혈구 유주 저지시험 등에 있어서의 항원성성분에도 사용할 수 있다.

본 발명의 항원단백질로는 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 단백질 또는 폴리펩티드라면 특별하게 국한되지 않는다. 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 예컨대 캔디다·알비칸스 cDNA 의 라이브러리 발현물에 대한 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청을 사용한 이뮤노 스크리닝에 의해 얻을 수 있다.

그리고 본 명세서에서「단백질」이란 생물체의 주요 구성성분을 의미하며, 폴리펩티드쇄로 이루어지는 것을 나타낸다. 또한 본 명세서에서 폴리펩티드란 복수의 아미노산이 펩티드결합에 의해 결합한 것을 의미하고, 구성 아미노산의 수는 특별하게 국한되지 않는다. 또한 본 명세서에 있어서의 폴리펩티드는 아미노산만으로 구성되는 단순 폴리펩티드 또는 아미노산 이외의 구성성분을 포함하는 복합폴리펩티드 중 어떤 것이라도 좋다. 또한 본 명세서에서「융합 단백질」이란 용어를 사용하는데 이것은 2 개 이상의 단백질의 일부 또는 전부가 결합한 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다.

본 발명의 항원단백질의 구체예로는 예컨대 다음의 폴리펩티드를 들 수 있다.

(A-1) 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는 폴리펩티드,

(A-2) 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나에 있어서, 1 개 이상, 예컨대 1 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,

(A-3) 서열번호 : 10 내지 18 로 나타내는 염기서열 중 어느 하나를 갖는 핵산에 코드되는 폴리펩티드,

(A-4) 서열번호 : 10 내지 18 로 나타내는 염기서열 중 어느 하나에 있어서 1 개 이상, 예컨대 1 혹은 복수개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기서열을 갖는 핵산에 코드되는 폴리펩티드,

또한 본 발명에 있어서는 상기 항원단백질과 면역학적으로 동등한 단백질도 포함한다.

여기서, 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 각각 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청을 사용한 이뮤노 스크리닝에 의해 얻어지는 캔디다·알비칸스 TIMM 1768 주의 cDNA 라이브러리 유래의 것이다. 또한, 이뮤노 스크리닝에서는 대장균을 숙주로 하는 발현 라이브러리를 사용한 경우, 폴리펩티드는 단순 폴리펩티드로서 발현되고 있다. 따라서, 항캔디다 혈청 중에 많이 포함되는 당쇄에 대한 항체의 영향을 제외하고, 폴리펩티드부분에 대한 항체에 의해 항원단백질을 스크리닝한 결과가 된다.

서열표의 서열번호 : 1 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 248 아미노산으로 이루어지고, 사카로미세스·세레비시에의 트리오스포스페이트 이소머라아제 (triosephosphate isomerase ; T. Alber and G. Kawasaki, Journal of Molecular and Applied Genetics, Vol. 1, 419-435 (1982)) 와 호모로지를 갖는다. 캔디다·알비칸스 배양균체에서 단리된 단백질의 N 말단 아미노산 서열 해석결과에 따르면 N 말단의 메티오닌은 탈리되어 있는 점에서, 항원단백질로 이용하기 쉬운 부분은 적어도 서열표의 서열번호 : 1 의 2 내지 248 번째의 영역 중에 존재하는 것으로 생각된다. 또한 호모로지 해석의 결과도 함께 고려하면 서열표의 서열번호 : 1 로 나타내는 폴리펩티드는 캔디다·알비칸스의 트리오스포스페이트 이소머라아제의 전장구조인 것으로 판단된다.

서열표의 서열번호 : 2 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 132 아미노산으로 이루어지고, 사카로미세스·세레비시에의 리실 tRNA 신타아제 (590 아미노산으로 이루어지는 ; M. Mirande and J. P. Walker, Journal of Biological Chemistry, Vol. 263, 18443-18451 (1988)) 의 N 말단 부근의 영역 (아미노산 번호 : 10 내지 137) 과 호모로지를 갖는다.

서열표의 서열번호 : 3 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 548 아미노산으로 이루어지고, 이 폴리펩티드의 260 내지 546 번째의 부분이 사카로미세스·세레비시에의 제 3 염색체의 YCR 030 C (870 아미노산으로 이루어지는 단백질을 코드하는 ; M. R. Red et al., Yeast, Vol.7, 533-538 (1991)) 의 서열번호 : 3 의 523 내지 868 번째의 영역과 호모로지를 갖는다.

서열표의 서열번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 175 아미노산으로 이루어지고, 사카로미세스·세레비시에의 EGD2 (174 아미노산으로 이루어지는 ; M. Johnston et al., Science, Vol. 265, 2077-2082 (1994)) 와 호모로지를 갖는다.

서열표의 서열번호 : 5 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 88 아미노산으로 이루어지고, 사카로미세스·세레비시에의 ATP 신타아제 델타쇄 (244 아미노산으로 이루어지는 ; J. Velours et al., European Journal of Biochemistry. Vol. 170, 637-642 (1988)) 의 C 말단 부근의 영역 (아미노산 번호 : 158 내지 242) 과 호모로지를 갖는다.

서열표의 서열번호 : 6 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 264 아미노산으로 이루어지고, 사카로미세스·세레비시에의 BMH 2 (272 아미노산으로 이루어지는 ; G. P. H von Heusden et al., European Journal of Biochemistry, Vol. 229, 45-53 (1995)) 와 호모로지를 갖는다.

서열표의 서열번호 : 7 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 224 아미노산으로 이루어지고, 사카로미세스·세리비시에의 리보솜 YL 8 단백질 (243 아미노산으로 이루어지는 ; K. Mizuta et al., Nucleic Acids Res., Vol. 20, 1011-1016 (1992)) 과 호모로지를 갖는다.

서열표의 서열번호 : 8 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 115 아미노산으로 이루어지고, 서열번호 : 8 의 46 번째 내지 C 말단 부분이 사카로미세스·세레비시에의 YNL 083 w (494 아미노산으로 이루어지는 ; A. Soler-Mira et al., Yeast, Vol. 12, 485-491 (1996)) 의 284 내지 353 번째의 부분과 호모로지를 갖는다.

서열표의 서열번호 : 9 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 공지된 HSP 70 SSB 타입의 폴리펩티드로서, 토끼 항캔디다 혈청에 의해 인식되는 항원단백질로서 발현된 것이다. 전장은 613 아미노산이고, 서열번호 : 9 의 280 번째 내지 C 말단 (333 아미노산) 으로 이루어지는 폴리펩티드가 항원단백질로서 얻어진다 [V. Maneu et al. Yeast, Vol. 13, 677-681, (1997)].

한편, 본 발명에서는 서열표의 서열번호 : 9 로 나타내는 아미노산 서열에 관한 cDNA 에 있어서, 발현물의 이뮤노 스크리닝의 결과가 양성의 cDNA 는 4 종류 얻어지고, 이들은 서열표의 서열번호 : 9 로 나타내는 아미노산 서열 중, 320 번째 내지 C 말단 (294 아미노산), 452 번째 내지 C 말단 (162 아미노산), 496 번째 내지 C 말단 (118 아미노산), 513 번째 내지 C 말단 (101 아미노산) 을 코드하는 것이다. 따라서, C 말단의 적어도 100 아미노산 길이의 폴리펩티드가 항원성의 발현에 중요하다고 생각된다. 이러한 점에서 상기 4 종의 단백질을 포함하여 C 말단측의 적어도 100 아미노산을 포함하는 약 100 내지 294 아미노산을 갖는 폴리펩티드는 본 발명의 항원단백질에 포함된다. 즉 본 발명의 서열표의 서열번호 : 9 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, N 말단에서 319 내지 512 아미노산 길이의 아미노산이 제거된 폴리펩티드도 본 발명에 있어서의 항원단백질에 포함된다.

본 발명에서는 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 한, 서열표의 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 각각에 있어서, 1 개 이상, 예컨대 1 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 본 발명의 항원단백질에 포함된다. 여기서 복수개란 수개 내지 그 이상의 개수를 말한다. 예컨대 서열번호 : 1 및 서열번호 : 2 로 나타내는 항원단백질은 N 말단에는 T7 태그를 포함하는 펩티드가 부가된 융합단백질로서 얻어지고, 이 같은 항원성에 무관계한 펩티드가 부가된 단백질 또는 폴리펩티드도 본 발명의 항원단백질에 포함되지만 T7 태그 부분이 결실된 것도 본 발명의 항원단백질에 포함된다. 또한, 상기와 같이 서열번호 : 9 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, N 말단측에서 약 319 내지 512 아미노산을 결실시킨 폴리펩티드도 결실시킨 예로서 들 수 있는데, 이것도 본 발명에 있어서의 항원단백질에 포함된다.

또한, 본 발명에서는 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 한, 서열표의 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열의 일부로 이루어지는 폴리펩티드도 본 발명의 항원단백질에 포함된다. 또한 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 한, 그 일부로 이루어지는 아미노산 서열에 있어서 1 개 이상, 예컨대 1 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 본 발명의 항원단백질에 포함된다. 또한, 상술한 바와 같은 이들의 본 발명의 항원단백질에 항원성에 무관계한 펩티드가 부가된 단백질 또는 폴리펩티드도 본 발명의 항원단백질에 포함된다.

서열표의 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열의 일부로 이루어지는 폴리펩티드는 예컨대 서열표의 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항원단백질을 원료로 하여, 리실엔드펩티드다아제, 트립신 등의 프로테아제를 사용한 효소소화에 의한 절단후, 또는 브롬화 시안 등에 의한 화학적처리에 의한 절단후, 목적으로 하는 항원성을 갖는 펩티드 단편을 단백질의 정제에 있어서의 기지의 방법으로 단리정제하는 것 등에 의해 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법 등에 의해 얻어진 폴리펩티드의 화학구조에 관한 정보를 바탕으로 펩티드 합성기술을 이용한 화학합성에 의한 제조도 가능하다. 또한 이 펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 핵산을 사용하여 유전자공학적으로 제조할 수도 있다.

아미노산 서열에 있어서 1 개 이상, 예컨대 1 혹은 복수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 실시하는 수법으로는 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory in 1989, T. Maniatis et al. 편집)] 등에 기재되어 있는 여러 가지의 유전자공학적 수법을 사용하면 곤란한 일은 아니다.

서열표의 서열번호 : 10 내지 18 에 나타내는 염기서열은 각각 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코드하는 핵산의 서열의 예이다. 따라서, 본 발명에서는 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 단백질 또는 폴리펩티드로서, 서열표의 서열번호 : 10 내지 18 로 나타내는 염기서열의 각각으로 이루어지는 핵산에 코드되는 폴리펩티드를 본 발명의 항원단백질에 포함한다.

이 핵산은 발현 라이브러리의 이뮤노 스크리닝에 의해 얻어지는 항원단백질을 발현하는 cDNA 인데, 이 cDNA 는 유전자 전장 혹은 부분염기서열로 이루어진다. 예컨대 서열표의 서열번호 : 10 및 서열번호 : 15 로 나타내는 염기서열은 항원단백질 유전자의 전장이고, 서열표의 서열번호 : 11, 서열번호 : 12, 서열번호 : 13, 서열번호 : 14, 서열번호 : 16, 서열번호 : 17 및 서열번호 : 18 로 나타내는 염기서열은 항원단백질 유전자의 부분서열이다. 예컨대 서열번호 : 18 에 기재된 핵산에 코드되는 HSP 70 SSB 타입 유래의 항원단백질은 상기 가장 작은 항원단백질, 예컨대 서열표의 서열번호 : 9 로 나타내는 아미노산 서열의 513 번째 내지 C 말단의 101 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드의 경우, 서열번호 : 10 의 580 내지 882 번째의 염기서열에 의해 코드된다. 따라서, 항원성이 높은 부분을 코드하는 재조합 DNA 는 서열표의 서열번호 : 10 의 580 내지 882 번째의 염기서열을 함유하도록 설계하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명에서는 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 한, 서열표의 서열번호 : 10 내지 18 로 나타내는 염기서열의 각각에 있어서, 1 개 이상, 예컨대 1 혹은 복수개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부 가된 염기서열을 갖는 핵산에 코드되는 폴리펩티드도 본 발명의 항원단백질에 포함된다. 여기서 복수개란 수개 내지 그 이상의 개수를 말한다.

이 같이 염기서열에 있어서 1 개 이상, 예컨대 1 혹은 복수개의 염기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 실시하기 위하여는 공지된 여러 가지의 유전자공학적 수법, 예컨대 갭드·듀프렉스법 [Wilfried, K. et al., Nucleic Acids Research, Vol. 12, 9441-9456 (1984)], 델레이션법 [Celeste, Y.P. et al., Methods in Enzymology, Vol. 154, 367-382 (1987)], 우라실 DNA 법 [Thomas, A.K. et al., Gene, Vol. 34, 315-323 (1987)] 이나 카세트 변이법 [James, A.W., et al., Gene, Vol.34, 315-323 (1985)] 등을 이용하면 된다.

또한 캔디다·알비칸스의 변이주, 근연종 (예컨대 캔디다·트로피카리스 등의 캔디다 속 진균), 사카로미세스·세레비시에 이외의 다른 진균 유래의 단백질로서, 본 발명의 항원단백질과 면역학적으로 동등한 성질을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드도 본 발명의 항원단백질에 포함된다. 본 명세서에서「면역학적으로 동등한 성질을 갖는 단백질」이란 아미노산 서열 혹은 당쇄 등의 수식은 다르지만 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는 본 발명의 항원단백질에 의해 면역된 포유류 유래의 항혈청에 함유되는 항체로 인식되는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다.

그리고, 항원으로서의 안정성의 강화 및/또는 원하는 반응성의 강화, 즉 치료에 이용하는 경우, 개체방어면역능의 유도강화나 알러지 반응의 감약화 또는 효소활성의 소실을 목적으로, 또한 진단에 사용하는 경우, 항원과 항체의 특이적결합 의 강화를 목적으로, 본 발명의 항원단백질을 개변시켜 유도체로 해도 된다. 개변법으로는 예컨대 피리딜에틸화, 환원, 알킬화, 아실화, 적당한 물질로의 화학적 커플링, 온화한 포르말린 처리, 또는 염산 구아니딘 처리를 들 수 있다. 유도체의 제작법으로는 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 법 [Wie et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., Vol. 64, 84-99, (1981)] 을 사용하여 PEG 와 결합시켜도 된다.

2. 본 발명의 핵산

본 발명의 핵산은 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 항원단백질을 코드하는 핵산이다.

이러한 핵산은 예컨대 본 발명의 항원단백질과 동일하게 캔디다·알비칸스의 cDNA 발현 라이브러리를 제작하고, 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의한 이뮤노 스크리닝을 실시함으로써 얻을 수 있다. 또한 캔디다·알비칸스의 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 제작하고, 본 발명의 항원단백질의 아미노산 서열의 일부를 코드하는 것으로 추정되는 올리고뉴클레오티드를 프로브로 하는 이 라이브러리의 스크리닝에 의해 얻을 수도 있다.

본 발명의 핵산은 포유류에 있어서, 캔디다·알비칸스를 비롯한 캔디다균에 의한 감염이나 다른 진균감염에 대한 감염방어면역을 유도하기 위한 백신용 항원유전자로서, 또한 캔디다·알비칸스를 비롯한 진균을 원인으로 하는 알러지 질환의 예방, 치료 및 진단을 위한 항원유전자로서 유용하다.

본 발명의 핵산의 구체예로는 예컨대 다음과 같은 핵산을 들 수 있다.

(B-1) 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산,

(B-2) 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나에 있어서, 1 개 이상, 예컨대 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산,

(B-3) 서열번호 : 10 내지 18 로 나타내는 염기서열 중 어느 하나를 갖는 핵산,

(B-4) 서열번호 : 10 내지 18 로 나타내는 염기서열 중 어느 하나에 있어서, 1 개 이상, 예컨대 1 혹은 복수개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기서열을 갖는 핵산,

(B-5) (B-1) 내지 (B-4) 중 어느 하나에 기재된 핵산 또는 이 핵산에 상보적인 핵산에, 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산.

여기서 핵산으로는 DNA 또는 RNA 중 어떤 것이라도 좋다.

서열표의 서열번호 : 10 내지 18 로 나타내는 염기서열은 각각 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코드하는 핵산의 서열의 예이다.

그리고 유전자 상에서 아미노산을 지정하는 코돈 (3 개의 염기의 조합) 은 아미노산의 종류별로 1 내지 6 종류씩 존재함이 알려져 있다. 따라서, 어느 아미노산 서열을 코드하는 핵산에는 그의 아미노산 서열에 의하기도 하지만 다수의 종류가 존재할 수 있다. 핵산은 자연계에 있어서 결코 안정적으로 존재하는 것은 아니며, 그의 염기서열에 변이가 일어나는 일은 드믄 경우가 아니다. 핵산 상에 발생한 변이가 그곳에 코드되는 아미노산 서열에는 변화를 미치지 않는 경우 (사일런트 변이라고 불림) 도 있고, 이러한 변이를 갖는 핵산은 변이전의 핵산과 동일한 아미노산 서열을 코드하는 상이한 핵산이라고 할 수 있다. 따라서, 어느 특정한 아미노산 서열을 코드하는 핵산이 단리되어도 그것을 함유하는 생물이 계대되어 가는 중에 동일한 아미노산 서열을 코드하는 다종류의 핵산이 생성될 가능성은 부정할 수 없다. 또한 동일한 아미노산 서열을 코드하는 다종류의 핵산을 인위적으로 제작하는 것은 여러 가지의 유전자공학적 수법을 이용하면 어려운 일은 아니다.

예컨대 유전자공학적인 단백질의 생산에 있어서, 목적으로 하는 단백질을 코드하는 본래의 DNA 상에서 사용되고 있는 코돈이 숙주중에서는 사용빈도가 낮은 것인 경우에는 단백질의 발현량이 낮은 경우가 있다. 이 같은 경우에는 코드되어 있는 아미노산 서열에 변화를 주지 않고 코돈을 숙주에서의 사용빈도가 높은 것으로 인위적으로 변환시킴으로써 목적 단백질의 고발현을 도모하는 것이 행해지고 있다 (예컨대 일본 특허공보 평7-102146 호 등). 이 같이 특정한 아미노산 서열을 코드하는 다종류의 핵산은 인위적으로 작성할 수 있음은 물론이며 자연계에 있어서도 작성될 수 있는 것이다.

이 점에서 본 명세서에 있어서의 (B-1) 에 나타내는 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열의 각각으로 이루어지는 폴리펩티드를 코드하는 핵산은 (B-3) 으로 나타내는 서열번호 : 10 내지 18 에 나타내는 염기서열의 각각으로 이루어지는 핵산에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명에 있어서는 그 발현물이 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 한, 서열표의 서열번호 : 10 내지 18 로 나타내는 염기서열의 각각에 있어서, 1 개 이상, 예컨대 1 혹은 복수개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기서열을 갖는 핵산도 본 발명의 핵산에 포함된다. 여기서 복수개란 수개 내지 그 이상의 개수를 말한다.

예컨대 서열표의 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 각각의 항원단백질의 항원성을 유지한 채, 상기 단백질의 일부를 적당하게 탈리시킨 단백질, 및 N 말단 또는 C 말단에 예컨대 T7 파아지 유래의 단백질, 히스티딘 태그, 말토오스 결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, β-갈락토시다아제 등의 다른 폴리펩티드가 부가된 항원단백질의 융합단백질을 코드하는, 서열표의 서열번호 : 10 내지 18 로 나타내는 핵산의 유도체인 핵산도 본 발명의 핵산에 포함된다.

또한, (B-1) 내지 (B-4) 중 어느 하나에 나타내는 핵산 또는 이 핵산에 상보적인 핵산에, 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산으로서, 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 항원단백질을 코드하는 핵산 (즉, (B-5) 의 핵산) 도 본 발명의 핵산에 포함된다. 이러한 핵산은 다음과 같은 방법으로 검출할 수 있다.

즉, 대상이 되는 핵산을 고정시킨 멤브레인을 0.5 중량% SDS, 0.1 중량% 소 혈청 알부민 (BSA), 0.1 중량% 폴리비닐피롤리돈 0.1 중량% 피콜 400, 0.01 중량% 변성 연어정자 DNA 를 포함하는 6 ×SSC (1 ×SSC 는 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0 을 나타낸다.) 중에서 50 ℃ 에서 12 내지 20 시간, 프로브와 함 께 인큐베이트한다. 인큐베이션 종료후, 0.5 중량% SDS 를 포함하는 2 ×SSC 중, 37 ℃ 에서의 세정에서 시작하여 SSC 농도는 0.1 ×SSC 까지의 범위에서 또한 온도는 50 ℃ 까지의 범위에서 변화시키고, 고정된 핵산 유래의 시그널이 백그라운드와 구별할 수 있게 될 때 까지 멤브레인을 세정한 다음 프로브의 검출을 실시한다. 이 같은 조건으로 대상 핵산이 검출된 경우, 이 핵산을「엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산」이라 한다. 여기서 사용하는 프로브로는 (B-1) 내지 (B-4) 로 나타내는 핵산 또는 이 핵산에 상보적인 핵산의 일부이다.

이 같은 핵산에는 예컨대 캔디다·알비칸스의 변이주 및 근연주 (예컨대 캔디다·트로피카리스 등의 캔디다속 진균) 가 갖는 (B-1) 내지 (B-4) 로 나타내는 핵산 또는 이 핵산에 상보적인 핵산과 엄격한 조건하에서 혼성화 가능한 핵산으로서, 면역학적으로 동등한 항원성을 갖는 단백질을 코드하는 핵산 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산은 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산, 혹은 서열번호 : 1 내지 9 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나에 있어서, 1 개 이상, 예컨대 1 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산에 있어서, 그의 변이형, 대립유전자, 상동유전자, 코돈의 축중이 수반되는 핵산도, 그의 발현물이 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 한, 본 발명의 핵산에 포함된다.

또한 본 발명의 핵산으로는 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 항원단백질을 코드하는 핵산, 예컨대 (B-1) 내지 (B-5) 로 나타내는 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산도 들 수 있다. 여기서의 본 발명의 핵산은 공지된 형광물질이나 방사성물질에 의해 표지될 수도 있다. 이 핵산은 혼성화에 의한 캔디다·알비칸스 항원 단백질 유전자의 검출에 사용하는 프로브 및 DNA 폴리머라아제를 사용하는 DNA 증폭방법에 있어서의 프라이머로서 이용할 수 있다.

3. 본 발명의 벡터, 형질전환체

본 발명의 벡터는 본 발명의 핵산을 함유하여 이루어지는 벡터이다. 이 같은 벡터는 본 발명의 핵산을 대장균 등의 숙주에 안정적으로 유지시킬 수 있다. 이러한 벡터의 구축에 사용되는 벡터로는 예컨대 pUC118, pWH5, pTV118, pSCREEN-1b 등을 들 수 있는데, 본 발명의 핵산을 삽입할 수 있고, 발현가능한 벡터라면 특별하게 국한되지 않는다. 또한 적당한 발현벡터에 연결하여 발현용 재조합 DNA 로 할 수도 있다. 서열번호 : 10 내지 18 로 나타내는 염기서열을 갖는 핵산은 pSCREEN-1b 에 연결하여 발현용 재조합 DNA 로서 대장균에 도입시켜 본 발명에 사용된다. 핵산을 벡터에 삽입하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, T4 DNA 리가아제를 사용하는 방법 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 벡터에 의해 형질전환되어 이루어지는 것이다. 이 같은 형질전환체는 본 발명의 벡터를 숙주에 도입함으로써 얻어진다. 숙주로는 대장균, 바실루스속 등의 세균, 사카로미세스·세레비시에 등의 효모, 아스페르길루스속, 피키아·파스토리스 등의 진균 외에 곤충세포, COS-7, Vero 세포 등의 동물세포를 사용할 수 있다. 벡터를 숙주에 도입하는 방법으로는 예컨대 인 산칼슘법, CaCl₂ 법, DEAE 덱스트란법, 일렉트로포레이션법 등의 공지된 방법을 들 수 있다. 이러한 형질전환체는 예컨대 사용한 벡터의 선택 마커를 지표로 함으로써 선택할 수 있고, 또한 이 형질전환체에서 추출한 핵산과 본 발명의 핵산을 특이적으로 검출가능한 프로브를 사용한 혼성화에 의해 원하는 핵산이 도입되어 있는 것을 확인할 수 있다.

이 같은 형질전환체는 본 발명의 핵산을 제조할 때에, 및 본 발명의 항원단백질을 제조할 때에 이용할 수 있다.

4. 본 발명의 항원단백질의 생산방법

본 발명의 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 항원단백질의 생산방법은 본 발명의 형질전환체를 본 발명의 핵산에 의해 코드되는 항원단백질의 발현가능한 조건하에서 배양하는 것을 특징으로 한다.

배양조건은 특별히 한정되는 것은 아니지만 예컨대 벡터로서 랜덤 파아지 벡터 λSCREEN-1 과 Phage Maker^TM System Phage Pack Extract [모두 Novagen 사 제조] 을 사용하여 얻어지는 형질전환체의 경우, 선택압으로서의 암피실린을 포함하는 LB 배지에서 배양하고, 적당한 시기에 IPTG (이소프로필-티오-β-D-갈락토시드) 에 의한 발현유도를 가하면 된다. 다른 벡터 및 숙주를 사용하여 얻어진 형질전환체에 있어서도 적당한 선택압을 배지중에서 단백질의 발현 적합한 조건으로 배양하면 된다. 이 같이 배양하여 목적으로 하는 단백질을 발현시킨다.

발현된 단백질 또는 폴리펩티드는 당해 분야에서 알려진 공지된 단백질의 정 제방법으로 회수, 정제할 수 있다. 또한 얻어진 단백질 또는 폴리펩티드의 항원성의 유무는 예컨대 이뮤노 블롯팅법, ELISA 또는 면역침강법 등의 면역학적 수법으로 확인할 수 있다.

또한 본 발명의 항원단백질은 유전자공학적 수법을 사용하여 얻어지는 본 발명의 형질전환체로부터 생산해도 되고, 캔디다·알비칸스 배양물로부터 공지된 단백질 정제방법으로 얻어도 된다.

5. 본 발명의 의약조성물 및 진단용 조성물

본 발명의 의약조성물 및 진단용 조성물은 1) 본 발명의 항원단백질, 또는 본 발명의 생산방법으로 얻어지는 항원단백질을 함유하는 것, 및 2) 본 발명의 핵산을 함유하는 것이다.

1) 본 발명의 항원단백질, 또는 본 발명의 생산방법으로 얻어지는 항원단백질을 함유하는 의약조성물 및 진단용 조성물

본 발명의 의약조성물 및 진단용 조성물에는 포유류에 있어서 캔디다·알비칸스를 비롯한 캔디다균으로 인한 감염이나 진균감염에 대한 감염방어면역을 유도하기 위한 백신, 또한 감염 유무 및 진행상태를 판단하기 위한 진단용 조성물이 포함된다. 또한 캔디다·알비칸스를 비롯한 진균을 원인으로 하는 알러지 질환의 예방, 치료 및 진단에 사용되는 조성물이 포함된다. 또한, 캔디다·알비칸스는 인간의 상재균이기 때문에, 대부분의 인간의 면역세포 (림프구, 마크로파아지 등) 가 캔디다·알비칸스 유래의 항원단백질에 대하여 각종 사이토카인 유리, 면역세포의 활성화 등과 같은 면역반응을 일으킨다. 즉, 본 발명의 의약조성물 및 진단용 조성물에는 인터페론 γ, 인터로이킨 4 등의 유효한 면역조절물질을 유리시키거나, 활성화시키기 위한 조성물도 포함된다.

감염방어면역을 유도하기 위한 조성물은 보다 강한 체액성 및/또는 세포성면역을 얻기 위하여 본 발명의 항원단백질을 다음과 같은 아쥬반트를 포함하는 현탁액 또는 용액으로 한 제제로 사용되는 것이 일반적이다. 아쥬반트는 보통 항원성성분과 함께 투여되지만 항원성성분을 투여하기 전 또는 후에 부여해도 된다.

포유류의 백신접종에 적당한 아쥬반트로는 프로인트 (Freund's) 의 완전 또는 불완전 아쥬반트 ; 수산화알루미늄, 명반 등의 무기물겔 ; 리조레시틴, 디메틸옥타데실암모늄브로마이드 등의 계면활성제 ; 황산덱스트란, 폴리 IC 등의 폴리 음이온 ; 뮤라밀펩티드, 터프트신 등의 펩티드 ; Ribi 사 제조의 모노포스포릴리피드 A (MPL) ; 콜레라톡신의 B 서브유닛이 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 항원은 리포솜 또는 다른 마이크로 캐리어에 삽입시켜 투여할 수 있다. 물론 몇가지의 다른 항원단백질을 혼합하여 사용할 수도 있다.

알러지 질환의 예방, 치료 및 진단을 위한 조성물은 본 발명의 항원단백질을 적당한 염용액이나 현탁액의 형태로 하여 사용하면 된다. 경우에 따라 폴리에틸렌글리콜 및 페놀이 첨가될 수도 있다. 또한 상기와 같은 아쥬반트를 포함하는 현탁액 또는 용액으로 해도 된다. 아쥬반트는 보통 항원과 함께 투여되지만 항원 투여 전 또는 후에 부여해도 된다. 항원은 또한 리포솜 또는 다른 마이크로 캐리어에 삽입시켜 투여할 수 있다.

본 발명의 의약용 조성물은 원하는 바에 따라 첨가제를 배합해도 되고, 또한 그 제형도 여러 가지의 제형일 수 있다. 이러한 첨가제로는 원하는 제형을 형성하기 위한 조제용 첨가제류를 들 수 있다. 이들 첨가제류의 예로는 예컨대 아스코르빈산, 비오틴, 판토텐산칼슘, 나이아신 등의 영양제 ; 메타인산나트륨, 인산나트륨 (제 1, 제 2, 제 3 염), 피롤린산나트륨 등의 음폐제 ; 소르빈산 칼슘, 벤조산 등의 보존료, 아라비아고무, 트라간트, 알긴산나트륨, 만니톨, 소르비톨, 젖당, 과당, 가용성 전분, 아미노산류, 포도당, 사탕, 봉밀, 지방산에스테르 외의 첨가제류 또는 희석제류를 들 수 있다.

본 발명의 의약용 조성물은 경구 또는 비경구투여할 수 있고, 예컨대 산제, 과립, 펠릿 혹은 정제, 코팅제, 캡슐제, 액제, 시럽제 등의 경구투여에 적합한 제형 ; 주사제, 점적제, 좌제, 점안제, 점비제, 분무제 등의 비경구투여에 적합한 제형으로 할 수 있다.

본 발명의 의약조성물을 특히 백신으로 사용하는 경우, 안정제로서 적당한 농도의 인간 혈청 알부민, 젤라틴, 아미노산류 등, 방부제로서 적당한 농도의 페놀, 티메로살 등을 필요에 따라 첨가해도 된다. 또한, 이 의약조성물은 액상제제로서 사용해도 되고, 동결건조를 실시함으로써 건조제제로 사용해도 된다. 건조제제는 사용시에 적당한 용제, 예컨대 주사용 증류수 등으로 현탁하여 사용해도 된다.

의약조성물의 투여방법으로는 경구, 경점막 (코, 질 등), 경피 (피하 또는 피내) 적으로, 또는 정맥내에 투여하면 된다. 대표적인 투여량은 단백질량으로서 0.01 내지 5.0 ㎎/㎏ 체중의 범위가 바람직하고, 1 ㎍ 내지 100 ㎍/㎏ 체중의 범위 가 더욱 바람직하지만 필요에 따라 투여량을 증가시키거나 투여회수를 증대시켜도 된다.

생체내 진단의 목적으로 개체에 대하여 예컨대 흡입유발시험, 피부테스트, 코나 눈의 점막시험에서 사용하는 진단용 조성물은 본 발명의 항원단백질을 동결건조분말, 혹은 적당한 염용액이나 현탁액의 형태로 한 것을 들 수 있으며, 폴리에틸렌글리콜이나 페놀이 첨가될 수도 있다. 배치 테스트에는 백색 바셀린을 기제로 하여 라우릴황산나트륨 등의 계면활성제를 첨가한 것에 본 발명의 항원단백질을 혼합하면 된다. 또한, IgE 항체값 측정용 항원으로서 사용할 때에는 페이퍼 디스크, 셀룰로오스 스폰지, 마이크로 플레이트 등의 고상체에 상기 항원단백질을 고정화하여 사용할 수 있다.

2) 본 발명의 핵산을 함유하는 의약조성물 및 진단용 조성물

본 발명의 의약조성물 및 진단용 조성물은 포유류에 있어서, 캔디다·알비칸스를 비롯한 캔디다균에 의한 감염이나 다른 진균감염에 대한 감염방어면역을 유도하기 위한 백신, 또한 캔디다·알비칸스를 비롯한 진균을 원인으로 하는 알러지 질환의 예방, 치료 및 진단에 사용할 수 있다. 감염방어나 알러지 질환의 치료를 위하여 사용하는 경우, 본 발명의 핵산을 포유류 세포내에서 발현시킬 수 있도록 적당한 프로모터의 하류에 본 발명의 핵산을 함유하고 있는 플라스미드를 그대로 또는 레트로 바이러스나 아데노바이러스에 넣고 적당한 염용액이나 현탁액의 형태로 한다. 또한 본 발명의 핵산을 리포솜 또는 다른 마이크로 캐리어에 삽입하거나 적당한 폴리카티온계 지질에 혼합해도 된다.

상기 핵산은 세포내로의 이행성 또는 세포내에서의 안정성을 향상시킬 수 있는 화학적 수식을 포함하는 것을 사용해도 된다. 상기 화학수식으로는 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포트리에스테르, 알킬포스포네이트, 알킬포스포아미데이트 등의 유도체를 들 수 있다.

본 발명의 의약조성물의 투여방법으로는 근육내, 피하, 정맥내, 경구, 직장내, 경피, 경비, 설하, 복강내 등에 투여해도 된다. 대표적인 투여량은 핵산량으로서 0.01 ㎍ 내지 10 ㎎/㎏ 체중의 범위가 바람직하고, 1 ㎍ 내지 5 ㎎/㎏ 체중의 범위가 더욱 바람직하지만 필요에 따라 투여량을 증가시키거나 투여회수를 증대시키면 된다.

6. 본 발명의 항체 또는 항체 단편

본 발명의 항체는 본 발명의 항원단백질에 특이적으로 결합하는 항체이다. 여기서 항체로는 본 발명의 항원단백질에 특이적으로 결합하는 한, 항체 단편도 포함한다.

본 발명의 항체는 상법에 따라 얻을 수 있고, 폴리클로날 항체라도 모노클로날 항체의 어떤 것이라도 좋다. 또한 본 발명에서는 본 발명의 항원단백질에 특이적으로 결합하는 단쇄항체여도 좋다. 이 항체 또는 항체 단편은 캔디다·알비칸스 혹은 그의 밀접하게 연관된 균으로 인한 감염증에 있어서의 진균의 검출이나 캔디다·알비칸스 혹은 그의 밀접하게 연관된 균으로 인한 알러지 질환에 있어서의 알레르겐 동정 등에 이용할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편을 감염증에 있어서의 진균의 검출, 알러지 질환에 있어서의 알레르겐 동정 등에 사용하는 경우, 공지된 형광물질이나 방사성물질에 의해 표지될 수도 있다.

또한 본 발명의 항원단백질의 정제 등에 사용할 수도 있다. 이 경우, 예컨대 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 담체 등에 고정화함으로써 본 발명의 항원단백질의 정제를 한층 용이하게 정제할 수 있게 된다.

7. 본 발명의 항원단백질을 코드하는 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산

본 발명의 항원단백질을 코드하는 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산은 혼성화에 의한 본 발명의 항원단백질을 코드하는 핵산의 검출에 사용하는 프로브 및 DNA 폴리머라아제를 사용한 DNA 증폭방법에 의한 검출 등에 사용하는 프라이머로서 이용할 수 있다. 본 발명의 항원단백질을 코드하는 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산은 항원단백질을 코드하는 핵산의 센스측 또는 안티센스측 중 어느 한쪽에 결합하는 것이 포함된다. 이 핵산은 공지된 형광물질이나 방사성물질에 의해 표지될 수도 있다.

이하, 실시예를 들고 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하겠지만 본 발명은 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1 감염 저항성의 유도 및 CD4 양성 T 세포의 감염 저항성에 대한 관여

1) 감염 저항성의 유도

캔디다·알비칸스 (C. 알비칸스) TIMM 1768 을 서브로·덱스트로오스 배지에서 하룻밤 진탕배양하고, 세포를 원심으로 회수, 생리식염수로 세정한다. 얻어진 세포를 1 ×10⁶, 1 ×10⁷, 1 ×10⁸ 개/㎖ 가 되도록 생리식염수에 현탁한다. 각각의 현탁액에 등량의 IFA (프로인트의 불완전 아쥬반트) 를 첨가하여 혼합하고, 이 혼합물을 C57BL/6 마우스에 한마리 당 0.1 ㎖ 씩 피하접종하여 캔디다 생세포로 마우스를 면역한다. 일주일후 상기와 동일하게 제조한 캔디다 생세포를 동량씩 피하접종하고, 마우스를 더욱 면역한다. 즉 한마리의 마우스에 대하여 5 ×10⁴ 개, 5 ×10⁵ 개 또는 5 ×10⁶ 개의 캔디다 생세포로 2 회 면역한 것이 된다. 대조로서, 캔디다 생세포의 현탁액 대신에 생리식염수를 사용하여 이 생리식염수와 등량의 IFA 를 혼합한 것을 일주일 간격으로 2 회 피하접종에 의해 투여한다.

2 회째 면역의 일주일 후, 모든 면역 마우스 및 대조 마우스에 서브로·덱스트로오스 배지에서 배양하여 얻어진 C. 알비칸스 TIMM 1768 세포를 2.5 ×10⁵ 씩 정맥내에 투여하여 감염시킨다. 감염후, 30 일간 마우스의 생사를 관찰한다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

투여물	1 회 당 투여량 (개)	평균생존일수 ±표준편차	30 일후 생존수/사용한 마우스의 수
생리식염수 생균	- 5 ×104 5 ×105 5 ×106	4.0 ±1.4 16.8 ±6.3 19.6 ±9.0 ＞20.8 ±10.1	0/5 0/5 0/5 2/5

표 1 의 결과로부터 상기 투여량으로 대조 마우스(비면역 마우스)는 전부 10 일 이내에 사망하였지만 면역 마우스는 감염 저항성을 획득하였음을 알 수 있다.

2) CD 4 양성 T 세포에 의한 감염 저항성의 획득

5 ×10⁶ 개의 캔디다·알비칸스 생세포를 사용하여 상기 1) 과 동일한 방법으로 일주일 간격으로 2 회 면역된 BALB/c 마우스에 대하여 최종면역후 23 일째, 26 일째, 및 29 일째의 계 3 회, 항 CD4 항체 (ATCC TIB 207 로부터 제조) 또는 항 CD 8 항체 (ATCC TIB 105 로부터 제조) 를 한마리 당 0.3 ㎎ 씩 복강내에 투여한다. 최종면역후 29 일째에 서브로·덱스트로오스 배지에서 배양하여 얻어진 C. 알비칸스 TIMM 0136 세포를 1 ×10⁵ 개씩 정맥내에 투여한다. 대조로서, 비면역 마우스, 및 면역을 하지만 항체를 투여하지 않은 마우스를 준비하여 이것들에게도 동일하게 C. 알비칸스 TIMM 0136 세포를 1 ×10⁵ 개씩 정맥내에 투여한다. 투여후 7 일째에 신장내의 살아남은 C. 알비칸스 세포수를 측정한다.

항 CD4 항체 및 항 CD8 항체는 상법에 따라 하이브리도마를 scid 마우스 복강에 주사하고 하이브리도마를 증식시킨 복수로 정제한다. 또한 얻어진 항체는 플로사이토미터 (올소다이아구노스틱사 제조) 에 의해 각 세포가 제거되어 있음을 확인하였다.

그 결과, 항 CD4 항체의 투여에 의해 신장내의 균수의 억제가 유의하게 저해되고, 감염 저항성에 CD4 양성 T 세포가 중요한 역할을 하고 있음이 판명되었다.

실시예 2 감염 저항성 포유류의 혈청의 채취와 그 성질, 및 각종 흡수혈청의 제작

1) 감염 저항성 포유류의 혈청의 채취

실시예 1-2) 와 동일한 방법으로 아쥬반트에 CFA (프로인트의 완전 아쥬반 트) 5 ×10⁶ 개의 C. 알비칸스 TIMM 1768 생세포로 3 일간 면역된 BALB/c 마우스로부터 최종면역후 7 일째에 상법에 의해 혈청을 채취한다. 이 것을 항캔디다 혈청으로 한다.

2) 감염 저항성 포유류의 혈청의 성질

실시예 2-1) 에서 얻어진 항캔디다 혈청의 성질을 검토한다.

먼저 항원성분으로서 C.알비칸스 세포벽분획 (CW), 세포질분획 (HSS), 세포막분획 (LSP) 을 제조한다.

C. 알비칸스 TIMM 1768 의 서브로 한천사면배양물의 일백금이분을 5 ㎖ 의 YPD 배지 (이스트엑스트락토 1 중량%, 폴리펩톤 2 중량% 글루코스 2 중량%) 를 넣은 시험관에 식균한다. 30 ℃ 에서 24 시간 진탕배양후, 그 배양액 50 ㎕ 를 YPD 배지 500 ㎖ 를 넣은 2 ℓ용량 삼각 플라스크에 식균하고, 35 ℃ 에서 하룻밤 진탕배양한다. 이 2 ℓ용량 삼각 플라스크를 합계 4 개 사용하여 배양한다.

얻어진 약 2 ℓ 의 배양액 (약 7 ×10⁷ 세포/㎖) 으로부터 2,000 ×g, 10 분간 원심에 의해 세포를 모은다. 세포를 500 ㎖ 의 멸균수로 2 회 세정후, 500 ㎖ 의 SSB 용액 (0.8 M 솔비톨 첨가 50 ㎜ 인산완충액 (pH 7.5)) 으로 1 회 세정한다. 세포를 약 500 ㎖ 의 SSB 용액에 현탁후, 100 ㎜ EDTA 첨가 SSB 용액을 70 ㎖, 그리고 2-메르캅토에탄올을 1 ㎖ 첨가하고, 천천히 진탕한다. 계속하여 이 현탁액에 1 ㎖ 당 3.3 ㎎ 의 자이모리에이스 20 T (세이가가꾸고오교사 제조) 를 함유하는 SSB 용액을 70 ㎖ 첨가하여 35 ℃ 에서 1 시간 천천히 진탕한다. 또한 1 ㎖ 당 12 ㎎ 의 토리코델마·라이징엔자임 (시그마사 제조) 을 함유하는 SSB 용액을 70 ㎖ 첨가하고, 35 ℃ 에서 1 시간 천천히 진탕한다. 얻어진 현탁액을 2,000 ×g, 10 분간의 원심에 가하여 프로토플라스트 세포를 모음과 동시에 상청을 세포벽분획 (CW) 으로 한다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 프로토플라스트 세포에 멸균생리식염수를 140 ㎖ 첨가하고 (이 현탁액 1 ㎖ 당 프로토플라스트 세포는 약 1 ×10⁹ 개), 충분히 교반한후, 빙상에 10 분간 정치한다. 프로토플라스트 세포가 파열된 것을 확인후, 10,000 ×g, 30 분간 원심하고, 얻어진 침전을 불용성 분획 (LSP 라고 함) 으로 한다. 원심상청을 100,000 ×g, 60 분간 더 원심하고, 그 결과 얻어진 원심상청을 가용성분획 (HSS 라고 함) 으로 한다. LSP 를 140 ㎖ 의 생리식염수에 현탁후, 초음파처리하고, 나아가 비등수욕하, 5 분간 가열처리하여 살균하고, 막단백질 등을 함유하는 LSP 항원액으로 한다. 또한 CW 에 대하여도 동일한 초음파처리, 가열처리를 실시하여 CW 항원액을 얻는다. 그리고 HSS 에 대하여는 그대로의 액을 HSS 항원액으로 한다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 LSP 항원액의 단백질 농도는 2.3 ㎎/㎖, HSS 항원액의 단백질농도는 3.5 ㎎/㎖, CW 항원액의 단백질농도는 2.1 ㎎/㎖ 이다 (단백질량은 BSA 를 표준으로 하여 비신코닌산 (BCA) 시약에 의해 정량한다.).

항원성분으로 얻어진 CW 항원액, LSP 항원액, HSS 항원액을 각각의 단백질농도가 10 ㎍/㎖ 가 되도록 PBS 로 희석후, 이뮤노·모듈 [Nunc 사 제조] 에 50 ㎕ 씩 첨가하고, 4 ℃ 로 하루밤 방치하고, 각 이뮤노·모듈을 각각의 항원으로 코팅한다. 1 중량% 소 혈청 알부민을 넣은 PBS 용액으로 코팅된 이뮤노·모듈의 블로킹처리를 실시한다. 이어서, 60 배로 희석한 항캔디다혈청 또는 컨트롤 혈청을 이뮤노·모듈에 50 ㎕ 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트한 후, 퍼옥시다아제 표지 항마우스 IgG 항체 (2000 배 희석) 와 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트한다. 인큐베이트 후, PBS 로 세정하고, 이어서 기질용액을 첨가한다. 15 분후, 405 ㎚ 에서의 흡광도를 측정한다. 이 흡광도가 높을수록 항원을 인식하는 항체량이 많은, 즉 항원에 대한 항체값이 높은 것을 나타낸다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다. 그리고, 상기 컨트롤 혈청은 생균 대신에 생리식염수를 사용하여 이 생리식염수와 등량의 CFA 를 혼합한 것을 1 주 간격으로 3 회 피하접종에 의해 투여한 마우스의 혈청으로부터 제조한다.

항원분획	흡광도
	항캔디다 혈청	컨트롤 혈청
CW LSP HSS	0.013 0.051 0.237	0.006 0.006 0.006

표 2 로 알 수 있는 바와 같이 항캔디다 혈청은 HSS 에 대한 항체값이 가장 높은데, LSP 에 대하여도 항체값을 가지고 있음을 알 수 있다. CW 에 대한 항체값은 낮다.

실시예 3 C. 알비칸스 cDNA 발현 라이브러리에 의한 항원단백질의 스크리닝

1) C. 알비칸스의 cDNA 발현 라이브러리의 제작

C. 알비칸스 TIMM 1768 주의 cDNA 발현 라이브러리를 제작하기 위하여 균체 에서 전 RNA 를 추출하여 정제한다. 즉, 상기 균을 200 ㎖ YPD 배지에서 35 ℃ 로 배양한 후, 원심 (2000 rpm, 5 분간) 에 의해 균체를 회수하고, 한번 증류수로 세정한다. 균체를 액체질소에 의해 급속동결하고, 막자를 이용하여 동결균체를 분말상으로 파쇄한다. 이 균체분말로부터, RNA 추출 키트 [Pharmacia 사 제조] 를 사용하여 전 RNA 를 회수, 정제한다. 이 전 RNA 로부터 올리고텍스-dT30 <수퍼> (타카라슈조사 제조) 을 사용하여 폴리(A)^＋RNA 를 제조한다. cDNA 합성 키트 (타카라슈조사 제조) 를 사용하여 폴리(A)^＋RNA 5 ㎍ 로부터 cDNA 를 합성한다. 합성된 cDNA 를 랜덤 퍼지 벡터 λSCREEN-1 [Novagen 사 제조] 과 연결한 후, Phage Maker^TM System PhagePack Extract [Novagen 사 제조] 에 의해 인비트로 패키징을 실시하여 cDNA 라이브러리를 구축한다.

2) C. 알비칸스 생세포면역에 의한 항캔디다혈청과 인식하는 항원단백질의 이뮤노 스크리닝

C. 알비칸스 생세포면역에 의한 항혈청과 반응하는 단백질을 발현하고 있는 파아지 클론을 이뮤노스크리닝에 의해 검출한다. 그리고, 파아지 벡터 λSCREEN-1 을 사용하여 작성된 cDNA 라이브에 있어서, 그 cDNA 는 T7 태그서열등을 포함하는 펩티드와의 융합단백질 또는 cDNA 내의 번역개시 코돈으로부터 시작되는 폴리펩티드로서 발현한다.

즉, cDNA 라이브러리를 숙주대장균 BL21 (DE3)pLysE 주에 접종하고, 톱아가로스 (0.7 중량% 아가로스를 함유하는 LB 배지) 와 혼합한 후, 2 ×YT (1.6 중량% 박토트립톤, 1 중량% 이스트엑스트랙트, 0.5 중량% NaCl) 플레이트 위에 중층하고, 37 ℃, 6 시간 배양함으로써 파아지 플라크를 형성시킨다. 형성된 플라크 위에 나일론멤브레인 [Hybond-N, Amersham 사 제조] 을 포개고 4 ℃ 에서 하룻밤 정치한 후, 37 ℃ 에서 4 시간 보온한다. 멤브레인을 플레이트에서 벗기고, PBST (조성은 100 ㎜ NaCl, 10 ㎜ 인산 버퍼 pH 7.5, 0.1 % Tween 20) 에서 10 분간 세정한 후, 그 멤브레인을 적당량의 블록에이스 (다이닛뽕세이야꾸사 제조) 에 담금으로써 블로킹한다. 하룻밤 실온에서 방치한 후, 이 멤브레인을 실시예 2-1) 에서 제조한 항캔디다 혈청 (500 배 희석액) 과 3 시간 실온에서 인큐베이트한다. 인큐베이트후 세정하고, 이어서 퍼옥시다아제 표지 항마우스 IgG 항체 (1000 배 희석) 와 1 시간 실온에서 인큐베이트한다. 인큐베이트후 세정하고, 이어서 Super Signal Substrate Western Blotting [Pierce 사 제조] 에 의해 발광시키고, 항캔디다 혈청과 반응하는 퍼지 플라크를 검출한다.

5 ×10⁴ 개의 플라크를 스크리닝한 결과, 항혈청과 반응하는 파아지 플라크는 100 내지 150 개 존재한다. 이들 중에서 특히 강하게 반응한 플라크에 주목하여 더욱 클로닝을 실시한다. 클로닝된 퍼지를 숙주대장균 BM 25.8 주에 접종함으로써 대장균내에서 오토매틱 서브 클로닝이 일어나고, 퍼지 DNA 에 존재하는 cDNA 를 포함하는 영역이 플라스미드 DNA 로 자동적으로 서브 클로닝된다. 이 플라스미드를 포함하는 대장균으로부터 플라스미드를 정제하고, cDNA 의 염기서열을 결정한다. 염기서열을 해석한 결과, 2 클론은 사카로미세스·세레비시에 (S. 세레비 시에) 의 트리오스포스페이트 이소머라아제 (triosephosphate isomerase) 와 호모로지를 갖는 신규유전자이고, 전장의 cDNA 를 가지고 있다. 또한, S. 세레비시에의 리실 tRNA 신테타제 (lysyl-tRNA synthetase) 와 S. 세레비시에의 제 3 염색체의 DNA 98 과 호모로지를 갖는 신규유전자도 각각 1 클론 존재한다. 이들 cDNA 는 각각의 유전자의 일부분을 포함하며, 이 영역내에 항혈청과 반응하는 항원결정기가 존재하고 있음이 판명되었다.

상기 신규유전자인 S. 세레비시에의 트리오스포스페이트 이소머라아제 호모로그 유전자, S. 세레비시에 리실 tRNA 신테타제 호모로그 유전자 및 S. 세레비시에 제 3 염색체의 DNA 98 의 호모로그 유전자의 염기서열은 각각 서열표의 서열번호 : 10, 서열번호 : 11, 서열번호 : 12 에 나타내는 바와 같으며, 이 염기서열로부터 이들 핵산은 각각 서열표의 서열번호 : 1, 서열번호 : 2, 서열번호 : 3 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하고 있다.

3) 흡수 항캔디다 혈청에 의한 C. 알비칸스 항원단백질의 스크리닝

C. 알비칸스 생세포 면역 혈청 유래의 흡수 항혈청을 사용하여 상기 1) 에 기재된 cDNA 라이브러리로부터 C. 알비칸스 항원단백질의 이뮤노 스크리닝을 실시한다. 즉, 항캔디다 혈청과 HSS 와 CW 를 1 : 1 : 1 (v/v/v) 로 혼합한 용액을 제작하여 이것을 흡수항혈청으로 한다.

이 흡수항혈청을 사용하여 실시예 3-2) 와 동일한 방법으로 항원분자의 스크리닝을 실시한다. 사용한 항혈청은 흡수항혈청의 500 배 희석액이다. 이 항혈청과 반응하는 퍼지 플라크에 대하여 더욱 클로닝을 실시한다. 클로닝된 cDNA 의 염기서열을 해석한 결과, 1 클론은 S. 세레비시에의 EGD 2 유전자와 호모로지를 갖는 신규유전자를 거의 전장 포함하고 있으며, 1 클론은 ATP 신타아제 델타쇄 (ATP synthase delta chain) 와 호모로지를 갖는 신규유전자의 일부분인 것이 판명되었다. 얻어진 염기서열정보를 각각 서열표의 서열번호 : 13, 서열번호 : 14 에 나타낸다. 또한, 이 염기서열은 각각 서열표의 서열번호 : 4, 서열번호 : 5 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하고 있다.

또한, 기지의 HSP 70 SSB 타입의 cDNA 의 일부분을 포함하는 클론이 4 클론 얻어지고, 각각 C 말단의 294 아미노산, 162 아미노산, 118 아미노산, 101 아미노산을 코드하고 있는 cDNA 이다. 그 결과, HSP 70 SSB 타입 항원은 C 말단측의 118 아미노산의 영역내에 항혈청과 반응하는 항원결정기가 존재하고 있음이 판명되었다. 가장 긴 294 아미노산을 코드하는 HSP 70 SSB 타입 유전자의 염기서열, 및 이 염기서열로부터 추정되는 아미노산 서열은 각각 서열번호 : 18, 서열번호 : 9 에 나타내는 바와 같다.

다음에, HSS 를 첨가하여 얻어진 흡수항혈청에 대하여는 양성이나 HSS 와 CW 를 첨가하여 얻어진 상기 흡수항혈청에 대하여는 음성인 파아지 플라크가 존재하고 있었으므로, 이들 플라크의 cDNA 를 상기 2) 와 동일한 방법으로 해석한다. 2 클론이 S. 세리비시에의 BMH 2 유전자와 호모로지를 갖는 신규유전자를 전장 포함하고 있으며, 1 클론은 S. 세레비시에의 리보솜 단백질의 L7 유전자와 호모로지를 갖는 신규유전자를 거의 전장 포함하고 있다. 1 클론은 S. 세레비시에의 YNL 083 W 와 호모로지를 갖는 신규유전자의 일부분 (115 아미노산) 을 포함하고 있다.

이들 신규유전자인 S. 세레비시에의 BMH 2 호모로그 유전자, S. 세레비시에의 리보솜 L7 단백질 호모로그 유전자, SL 세레비시에의 YNL 083 W 호모로그 유전자의 염기서열은 각각 서열표의 서열번호 : 15, 서열번호 : 16, 서열번호 : 17 에 나타내는 바와 같으며, 이 염기서열로부터 이들 유전자는 각각 서열표의 서열번호 : 6, 서열번호 : 7, 서열번호 : 8 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하고 있다.

실시예 4 C. 알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 인식되는 항원단백질의 제조

실시예 3-2) 및 3-3) 에 있어서 얻어진 cDNA 는 S. 세레비시에의 YNL 083 W 와 호모로지를 갖는 유전자 이외에는 모두 융합단백질로서 발현하고 있다. YNL 083 W 와 호모로지를 갖는 유전자는 cDNA 내의 개시 코돈 (ATG) 에서 폴리펩티드를 발현하고 있다. 융합단백질의 발현을 나타내는 일례로서 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 와 호모로지를 갖는 유전자와, 리실 tRNA 신테타제와 호모로지를 갖는 유전자로부터 발현되는 폴리펩티드를 명확히 하였다.

즉, 실시예 3-2) 에서 얻어진 TPI 와 호모로지를 갖는 유전자를 포함하는 플라스미드, 및 리실 tRNA 신테타제와 호모로지를 갖는 유전자를 포함하는 플라스미드를, 각각 대장균 BL21 (DE 3) pLysS 로 형질전환시켜 형질전환체를 얻는다. 이들 형질전환체를 앰피실린을 포함하는 LB 배지에 식균하고, 37 ℃ 에서 3.5 시간 배양한다. IPTG (이소프로필-1-티오-β-D-갈락토시드) 를 최종농도 1 ㎜ 가 되도록 첨가하고, 2.5 시간 배양을 더 계속한다. 배양액을 원심하고 균체를 회수, 세정후, 균체를 30 ㎕ 의 1 ×SDS 샘플 버퍼에 현탁한다. 100 ℃ 에서 5 분간 가열처리한 후, 원심하고, 그 상청의 일부분을 SDS-폴리아크릴아미드겔 (12.5 % 겔) 전기영동에 제공하여 폴리펩티드의 발현을 확인한다.

발현하는 융합단백질의 예상분자량은 TPI 호모로그가 63 kDa (TPI 호모로그 27 kDA ＋ T7 태그영역 36 kDa) 이고, 리실 tRNA 신테타제 호모로그는 50 kDa (리실 tRNA 신테타제 호모로그 14 kDa ＋ T7 태그영역 36 kDa) 이다. 이들 융합단백질은 예상된 분자량의 폴리펩티드로서 발현하고 있음이 도 1 에 의해 판명되었다.

도 1 의 레인 1 에 있어서의 샘플은 리실 tRNA 신테타제 호모로그 유전자를 도입한 형질전환체의 발현유도전 (IPTG 첨가전), 레인 2 에 있어서의 샘플은 유도후 (IPTG 첨가후) 에 얻어진 폴리펩티드이다. 레인 3 에 있어서의 샘플은 TPI 호모로그 유전자를 도입한 형질전환체의 발현유도전, 레인 4 에 있어서의 샘플은 유도후에 얻어진 폴리펩티드이다.

본 발명의 항원단백질은 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 인식되는 항원으로서, 캔디다·알비칸스 감염의 치료 및 진단에 유용하다. 또한, 본 발명의 핵산은 본 발명의 항원단백질을 코드하는 것으로서, 캔디다·알비칸스 감염의 치료 및 진단에 유용하다.

<110> TAKARA SHUZO CO., LTD. <120> ANTIGEN PROTEIN AND NUCLEIC ACID CODING FOR SAID PROTEIN <150> JP 97-269087 <151> 1997-10-01 <160> 18 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 248 <212> PRT <213> Candida albicans <400> 1 Met Ala Arg Gln Phe Phe Val Gly Gly Asn Phe Lys Ala Asn Gly Thr 1 5 10 15 Lys Gln Gln Ile Thr Ser Ile Ile Asp Asn Leu Asn Lys Ala Asp Leu 20 25 30 Pro Lys Asp Val Glu Val Val Ile Cys Pro Pro Ala Leu Tyr Leu Gly 35 40 45 Leu Ala Val Glu Gln Asn Lys Gln Pro Thr Val Ala Ile Gly Ala Gln 50 55 60 Asn Val Phe Asp Lys Ser Cys Gly Ala Phe Thr Gly Glu Thr Cys Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ile Leu Asp Val Gly Ala Ser Trp Thr Leu Thr Gly His Ser 85 90 95 Glu Arg Arg Thr Ile Ile Lys Glu Ser Asp Glu Phe Ile Ala Glu Lys 100 105 110 Thr Lys Phe Ala Leu Asp Thr Gly Val Lys Val Ile Leu Cys Ile Gly 115 120 125 Glu Thr Leu Glu Glu Arg Lys Gly Gly Val Thr Leu Asp Val Cys Ala 130 135 140 Arg Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Ile Val Ser Asp Trp Ser Asn Ile 145 150 155 160 Val Val Ala Tyr Glu Pro Val Trp Ala 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attaaaaact atatgcctat 780 agaatttagc atgttgttgt gaatttgtaa tgaatctata aaaatgtgct catgaaa 837 <210> 11 <211> 396 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 11 gttgccgaac aagttcaaaa aacctatttg gacgatgtca ccggtgaaca agtttccaaa 60 accgaattga aaaaaagaca aaaacaaaga gcaattgaag ctaagaaagc tgctaaagct 120 gctgccactc cagccaaaac taccaccaaa aagaaagatg aattggctga tttgaatcca 180 aatcaatttt tcgaaatcag atctcgtcaa atttctgaat taagagagaa aaacaatgct 240 gatccatcag ctttcaaccc ataccctcac aaattcaatg ttaccaccaa aattcccgaa 300 tttgttgaaa aatacgccca tttgcaaaga ggggaaactt tgaaagatgt caccgtttcc 360 gttagtggta gaataatgac caaaagagaa tcagga 396 <210> 12 <211> 1700 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 12 ctaaagtcca aagttggttc aatttttggc agaaaaaaga agaaggaaaa attcactgga 60 gctgattcaa ttgctgaaga tgaatcatta tctgaggttt ctttgccacc tacaagaact 120 aggaattcat cggtgttgtc tcgcagtaac tcaactagaa gatcttttat tgaccgcttc 180 catagagatg agtctagcac tggcattagc agacaacatg agcagcacca gcagcctttg 240 agtgatcctt tgcctcacgc agagaagcct caaccggaaa ttccccaatc accagaagct 300 ccacaggcca aatcactaga gcctgtatca gaagtactaa aagaactgtt cccacctatg 360 caaaacgggt ccgaaaggaa aggtgaaaat cagcagtcga gagttgatgt atcctctcaa 420 accttgtcac cagttactcc tactcacgat ggatttggtg gttctgttaa accattacca 480 gaacctgttg attctccaaa tgtgattaaa tacaatgact cggacgactc ttctacagaa 540 gaacgtagag gctcgttact tgaaaaacac aatttagaag tacaacctgt atcttcccca 600 ttcactactc aaccgccagc acctgtgcca caagaatcca gatctagaca aagcagtgat 660 ggcatttact cgtttgaagc gggtgatgat tccaacccaa tctcggctac tccaagatcc 720 gagcaaaatg tgtttggaca gatgccagac ccaaatttgt ctcctgaaaa gactcttgct 780 ccaccaccac caccttcgag aaaagttttg caccatgaag aaccaactgt aagggattca 840 gctcttttcc acaatttacc tgctgcctcc cattctggaa gagattcggt aatggctcca 900 ttagcaagtc aagacagggg tcattcgttg ttgaaaaatg atttcaaaca cgaaaacttg 960 gcatccaccc tcggattgag ctcttctatt gctgaagtca tcaatgccag ctttaaggat 1020 ggacagttga ttaaatcaca agtagttggt gaagtggcct tcaattataa tggtaatgct 1080 tccgatccac ttgtggtcac tattcctaat agtttcgata aagtactcgt gaacaagact 1140 tttattgagg atttaggtca aagcaagtat aaagtgaacc caacttcaat tacgtctaaa 1200 actcttggtg ggttgaaata tcttttgaaa ccaacacagg taccagtgat aattcaacaa 1260 atatggaaat ttgaacctca tcagtcaagt ttgatggtta gcattcgttc aactacacct 1320 ttggtattgg aaaattttgt tgtctctgta gctttgaatc aagacattga agcaacatct 1380 gcttcctcaa agcctcaagg tgcgtttaat aaagagaaaa acagaataac atggagatat 1440 ccacagtccc tcgcattgaa tggtgtagag cgtttgatag ctagatttat gactaatgga 1500 ttgggttccg aacatgagtc tggtgtgcag attaaatttc aagttaagga tccacaagtc 1560 aagtactgta gtatttacag tgagaatggc gaagagattc ctacgtttag aaatttggtt 1620 agcggtagtt atagtggtca tctttaagtt atctgttttg agattagtct cttgttgaat 1680 tgaaaaaaaa aaaaacgtga 1700 <210> 13 <211> 585 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 13 gaagaaatcc cacaaggtgc tgacgttaat gtcattccaa aaaacgaaaa gaaagctaga 60 gaattgatca agaagttaaa cttgaaacaa atcaaaggta tttccagagt cactttcaaa 120 caaagaggaa acttgattta tgccattgat tccccggatg tctacagatc tgctgctggt 180 acttatgttg tctttggtga agctaaagtt 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gccagcctcc cgtgaagatt ccgtttacct tgctaaatta 60 gccgaacaag cagaacgtta tgaagaaatg gttgaaaaca tgaaagccgt tgcttcctct 120 ggccaagaat tgtctgttga agaacgtaat ttattatctg ttgcttacaa gaatgtcatt 180 ggtgctcgtc gtgcttcttg gagaattgtt tcatcaattg aacaaaaaga agaagccaaa 240 ggaaatgaga gccaagttgc tttgatcaga gattaccgtg ccaagattga agctgaattg 300 tctaaaattt gtgaagatat tctctctgtg ttgagcgacc atttaattac atctgcccaa 360 actggtgaat caaaagtatt ttactacaag atgaaaggtg attaccacag atacttggct 420 gaatttgcta tcgctgaaaa acgtaaggaa gctgctgatt tatcattaga ggcttataaa 480 gctgcttctg acgttgctgt gaccgagttg ccaccaaccc atccaatcag attaggttta 540 gcattgaact tctctgtttt ctactatgaa attttgaact ccccagatag agcttgtcat 600 ttagctaaac aagctttcga tgatgctgtt gctgatttag aaaccttatc tgaagattca 660 tacaaggatt caactttgat tatgcaatta ttgagagata acttgacttt atggaccgat 720 ttatctgaag ccccagctgc cactgaagaa caacaacaat ccagtcaagc tccagctgct 780 caaccaacag aaggtaaggc tgatcaagaa tagattgtat gtaaagtttt agttatattt 840 cttgtgtgaa tttaatttag tttattgtat tgtattcaaa 880 <210> 16 <211> 721 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 16 caaaaaactg ctgaagaaag agctgctgcc aagaaggtca gaaaagctgc caacaaagaa 60 aagagaaagg ttatctttga cagagctgct gcttaccaaa aggaatacac tgaagctgaa 120 agatctgtca tcaaagccaa gagagatgct aaagcttcta actcttacta cgttgatgct 180 caaccaaaat tggttttcgt tgtcagaatc aagggtatta acaagattcc accaaagcca 240 agaaaggtct tgcaattatt aagattgacc caaatcaatg ctggtgtttt cgtcagattg 300 actaaagcca cctctgaatt gatcaaattg gctgaaccat acgttgctta cggttaccca 360 tctttgtcta ccatcagaca attagtttac aagagaggtt tcggtaaggt caacaagcaa 420 agaattgctt tgtccgacaa tgccatcatt gaagccaact tgggtaaatt caatatcttg 480 tctattgaag atttgattca cgaaatttac actgttggtc caaacttcaa acaagtcagc 540 aacttcttgt ggccattcaa attatccaat ccaaacggtg gtttcagagc cagaaaattc 600 caacacttta tccaaggtgg tgacaccggt aacagagaac aattcattaa cgctttggtc 660 aaacaaatga actaagttta atgtatcatt tcaaacttac cttatctacc tactacacct 720 c 721 <210> 17 <211> 345 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 17 aaaaaattag cacatgcaga 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480 gccatttttg aagttgatgc taacggtatc ttgaaggtca ctgctgttga aaaatccact 540 ggtagatctg ctaacatcac catctccaac tccattggta gattgtcaac tgaagaaatc 600 gaaaaaatga tctctgatgc tgaaaaattc aaatcatccg atgatgcttt cgccaagaga 660 cacgaacaaa aacaaaaatt agaagcttac gttgcttccg ttgaatctac tgtcactgac 720 ccagtcttgt ctgctaaatt gaagaaatct gccaaggaca agatcgaagc tgctttgtct 780 gatgctttgc aaactttgga aattgaagaa tcttctgctg acgactacag aaaagctgaa 840 ttagctttga agagagctgt caccaaaggt atggctaccc gttaagtaaa ctagatgttg 900 aatgtcattt gttttacgcc atattttttt tttcccttta acatcattca cccctccccc 960 ttactatgtg tgtatattta gtatagtcat ccactaatac agaaagtaaa aataaatttg 1020 attaaa 1026

Claims (14)

1. 캔디다·알비칸스 생세포를 사용한 면역에 의해 제작된 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 항원단백질로서, 상기 항원단백질이

   (A-1) 서열번호 : 1 내지 8 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는 폴리펩티드, 또는

   (A-2) 서열번호 : 10 내지 17 로 나타내는 염기서열 중 어느 하나를 가지는 핵산으로 코드되는 폴리펩티드인 항원단백질.
2. 삭제
3. 삭제
4. 캔디다·알비칸스 생세포를 사용한 면역에 의해 제작된 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 항원단백질을 코드하는 핵산으로서, 상기 핵산이

   (B-1) 서열번호 : 1 내지 8 로 나타내는 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산, 또는

   (B-2) 서열번호 : 10 내지 17 로 나타내는 염기서열 중 어느 하나를 갖는 핵산.
5. 삭제
6. 제 4 항에 기재된 핵산을 함유하여 이루어지는 벡터.
7. 제 6 항에 기재된 벡터에 의해 형질전환되어 이루어지는 형질전환체.
8. 제 7 항에 기재된 형질전환체를 제 4 항에 기재된 핵산에 의해 코드되는 항원단백질의 발현가능한 조건하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 캔디다·알비칸스 감염 저항성 포유류 유래의 항혈청에 의해 인식되는 항원단백질의 생산방법.
9. 제 1 항에 기재된 항원단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는, 진균 감염에 대한 감염 방어 면역을 유도하기 위한 의약조성물.
10. 제 1 항에 기재된 항원단백질, 또는 제 8 항에 기재된 생산방법에 의해 얻어지는 항원단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
11. 제 1 항에 기재된 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는, 진균 감염에 대한 감염 방어 면역을 유도하기 위한 의약조성물.
12. 제 4 항에 기재된 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
13. 제 1 항에 기재된 항원단백질에 특이적으로 결합하는 항체.
14. 삭제

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