JP2008515871A - 新規ガン関連抗体及び抗原並びにガンの診断におけるそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の主な目的は、癌の検出に有用な新規の診断薬を提供することである。更なる目的として、癌の検出のためのキット及び方法の提供がある。
本発明者は、自身のある研究の間、精子関連抗原9(sperm associated antigen 9 (SPAG9))をコードする新規遺伝子[本明細書では配列番号1と称する]を、ヒト精巣cDNAライブラリーからクローニングすることで発見した。2523bpのcDNA[Shankar, Mohapatra and Suri (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 243, 561-565; Ace. No: X91879]は、5つのダイレクトリピート、3つのミラーリピート、3つの考えられるステムループ構造及び3つのパリンドロームモチーフを含んでいる。オープンリーディングフレームは、766アミノ酸のタンパク質をコードしている。推定のタンパク質の解析により、1)特徴的なロイシンジッパーモチーフ(LZ);2)広範なコイルドコイルドメイン(コイル)及び3)膜貫通ドメイン(T)、という複数の特徴が明らかとなった。SPAG9のアミノ酸配列(本明細書では配列番号2と称する)によって更にJNK結合ドメインに対するその一次配列の同一性が明らかとなった。その二次構造解析により、配列番号2がα−へリックス構造を有することが明らかとなった。CDスペクトル解析は更に配列番号2の支配的なα−へリックス構造を裏付けた。タンデム質量分析による組換え配列番号2のオリゴマー凝集体のマイクロシークエンシングにより、そのアミノ酸配列、及び83.9kDaという単一の原子量が確認された。この研究はまた、配列番号1及び2が精子と卵子の相互作用における役割を果たしていることを明らかにした。前記配列番号1は、特定の機能を有する精巣特異的遺伝子の新規ファミリーの一員として報告され、考えられる避妊の標的として考えられた。
従って、1つの観点において、本発明は、配列番号2、又はそのイソ型あるいは前記配列番号2を含んで成るポリペプチドについて特異性を有する新規抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。前記抗体は、配列番号2の前記ポリペプチドに対して特異性を有するIgG抗体又はIgM抗体あるいは前記抗体の一本鎖抗体又はフラグメントでありうる。
−配列番号2の精製したポリペプチドを準備し、又は配列番号1の核酸配列のクローニング及び適当な宿主における発現により、組換えによって前記ポリペプチドを合成する工程;
−配列番号2とアジュバントを混合して組成物を得る段階、
−当該組成物を動物に注入して免疫反応を起こす工程、及び
−血清を当該動物から回収して、生成したポリクローナル抗体を単離する工程、
を含んで成る方法、も提供する。
別の観点において、本発明は、癌の疑いがあるか、又は癌に罹患している対象の生体試料中の癌の検出に有用なキットを提供する。前記キットは、固体マトリックスとカップリングした本明細書に記載の配列番号2のポリペプチド配列又はそのイソ型あるいは前記配列番号2を含んで成るポリペプチド、及び取扱説明書、を含んで成る。本明細書で言及する固体マトリックスには、ニトロセルロースペーパー、スライドガラス、マイクロタイタープレート及びウェルが含まれうる。
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程;及び
−配列番号2又はそのイソ型あるいは配列番号2を含んで成るポリペプチドに対して生成した抗体の、前記試料中での存在であって、癌の指標となる存在を検出する工程、
を含んで成る方法、を提供する。
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程;
−前記試料と上述のキットとを接触させ、そして配列番号2又はそのイソ型あるいは前記配列番号2を含んで成るポリペプチドと、抗配列番号2抗体との結合が、前記生体試料中に存在している場合、検出可能なシグナルを通じて、癌の指標となる結合を決定する工程、
を含んで成る方法、を提供する。
抗原検出キットは、配列番号2を有するポリペプチド又はそのイソ型あるいは配列番号2を含んで成るポリペプチドと特異性を有する抗体を含んで成る。当該キットは癌の検出に有用である。
−癌の疑いのある対象の生体組織を準備する工程;
−配列番号2のポリペプチド又はそのイソ型あるいは前記配列番号2を含んで成るポリペプチドの、前記組織における存在であって、癌の指標となる存在を検出する段階、
を含んで成る方法を提供する。
−癌の疑いのある対象の生体組織を準備する工程;
−前記組織と前述の抗原検出キットとを接触させ、そして配列番号2[又はそのイソ型あるいは配列番号2を含んで成るポリペプチド]を有するポリペプチド配列と抗配列番号2抗体との結合であって、癌の指標となるものを、検出可能なシグナルを通じて、決定する工程、
を含んで成る方法を提供する。
出願人は、本発明の発見に基づいて複数の研究を行い、そしてこれまでに配列番号2ポリペプチドを同定した。これは以下のようなラージスケールの発現及び精製にとって適当なベクターにおいてクローニングした。
組換え配列番号2タンパク質(766アミノ酸をコードする完全なオープンリーディングフレーム)をpET28b(+)発現ベクターにおいてクローニングするのに成功した。要約すると、配列番号1の完全なオープンリーディングフレームをコードするcDNAを、適当なプライマーを用いて増幅した。生成物を制限酵素で消化し、そしてマルチクローニングサイトを含む消化したpET28b(+)(Novagen, Madison, USA)内に挿入することでpET28b−配列番号2が得られた。
コンピテント細胞を調製し、そしてpET28b−配列番号2で形質転換した。形質転換細胞を使用してE.コリ細胞培養のためのLB培地に接種した。組換え配列番号2の発現は、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)で誘導し、そしてその後精製した。
配列番号2を発現しているE.コリ培養物を採集し、ウレアを含むソニケーションバッファーを用いて洗浄して超音波処理した。超音波処理した上精を、硫酸ニッケルを充填したアガロースビーズカラム上に載せた。当該カラムを洗浄バッファーで洗浄し、そして溶出液を、溶出緩衝液を用いて回収した。精製した配列番号2の組換えタンパク質は、質量分析計でアミノ酸配列について解析した。アミノ酸配列解析により、組換え配列番号2タンパク質が公開されている推定のアミノ酸配列(EMBL Acc. No. 91879, Shankar et al., 1998).として発現したことが明らかとなった。
固体マトリックスと結合した配列番号2を含んで成る抗体検出キットを以下の通り調製する:
抗配列番号2抗体の生体試料中での存在はまた、組換えタンパク質をSDS−PAGE上で流し、そしてニトロセルロースマトリックス上にトランスファーするというウェスタンブロット手順で検出することができる。
更に、生体試料中の抗SPAGEE9抗体の存在も以下の通りELISA技術によって検出することができる:
抗配列番号2抗体の調製:組換え配列番号2タンパク質によるラットの免疫化
抗配列番号2抗体を生成するために、成体の雌性ラットを利用した。ラットを最初で且つ2回のブースター注射により異なる間隔で、配列番号2タンパク質で免疫化した。最初の免疫化は、アジュバントと混合した配列番号2で行った。次のブースター注射を隔週で実施し、ラットを出血させ、そして血清を取り出した。
前記血清は直接使用することもでき、又はプロテインビーズを利用したアフィニティークロマトグラフィー等の種々の方法によって使用前に精製することもできる。プロテインAビーズを含むカラムにラットの血清を載せ、そしてシェーカー上で一晩維持した。カラムを延伸し、そしてフロースルーを回収した。続いて、カラムを結合バッファーで洗浄し、そして最終的に溶出液を遠心後に回収した。抗体の濃度は、280nmのODを採ることで算出した。
複数の癌組織を配列番号2のタンパク質の発現について試験した結果を以下に記載する:
Claims (17)
- 配列番号2又はそのイソ型あるいは配列番号2を含んで成るポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに対し特異性を有する抗体。
- モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体又は組換え抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号2又はそのイソ型あるいは配列番号2を含んで成るポリペプチドのアミノ酸配列から成るポリペプチドに対し特異性を有する抗体のフラグメント。
- 請求項3に記載の抗体フラグメントの一本鎖。
- IgG抗体又はIgM抗体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体。
- 癌の疑いがあるか、又は癌に罹患している対象の生体試料中の癌の検出のためのキットであって、固体マトリックスと任意にカップリングした配列番号2又はそのイソ型あるいは前記配列番号2を含んで成るポリペプチドを有するポリペプチド配列、及び取扱説明書、を含んで成るキット。
- 固体マトリックスがニトロセルロースペーパー、スライドガラス、マイクロタイタープレート及びウェルを含んで成る、請求項6に記載のキット。
- 癌の疑いがあるか、又は癌に罹患している対象の生体試料中の癌の検出のためのキットであって、請求項1及び3に記載の抗体又はフラグメントを含んで成るキット。
- 前記抗体が標識抗体である、請求項8に記載のキット。
- 癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって:
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程;及び
−配列番号2又はそのイソ型あるいは配列番号2を含んで成るポリペプチドに対して生成した抗体の、前記試料中での存在を検出する工程、
を含んで成り、
前記抗体の存在が癌の指標となる、方法。 - 癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって:
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程;及び
当該試料中の配列番号2のポリペプチド又はイソ型あるいは配列番号2を含んで成るポリペプチド配列の存在を検出する工程、
を含んで成る方法。 - 癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって:
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程;
−前記試料と請求項6に記載のキットとを接触する工程、
−配列番号2又はそのイソ型あるいは前記配列番号2を含んで成るポリペプチドと抗体との結合を、癌の指標となる検出可能なシグナルを通じて決定する工程、
を含んで成る方法。 - 癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって:
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程;
−前記組織と請求項8に記載のキットとを接触させる工程及び
−配列番号2又はそのイソ型あるいは配列番号2を含んで成るポリペプチド配列と、前記ポリペプチドに対して生成した抗体との結合を、癌の指標となる検出可能なシグナルを通じて決定する工程、
を含んで成る方法。 - 前記癌が外胚葉、内胚葉又は中胚葉起源の癌である、請求項1〜13のいずれか1項に記載のキット。
- 前記癌が、肺癌、乳癌、胃癌、食道癌、結腸癌、卵巣癌、精巣癌、頸癌、皮膚癌、前立腺癌、口腔癌、膀胱癌、肝癌、子宮内膜癌、腎癌、脳癌、外陰癌、膣癌、胆嚢癌、眼癌及び骨癌のいずれかである、請求項1〜14のいずれか1項に記載のキット。
- 対象が哺乳類である、請求項10、11、12又は13のいずれか1項に記載の方法。
- 実質的に本明細書に記載し、そして例示した癌の検出のための抗配列番号2抗体、抗体及び抗原検出キット並びに癌の検出のための方法。
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