CN102590510A

CN102590510A - 抗spag9抗体在肿瘤的早期辅助诊断中的用途

Info

Publication number: CN102590510A
Application number: CN2012100225877A
Authority: CN
Inventors: 任碧琼
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-02-02
Filing date: 2012-02-02
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明公开了抗SPAG9抗体在肿瘤的早期辅助诊断中的用途，所述的肿瘤来自于肺癌患者，肝癌患者及其他肿瘤患者；本发明可用于肺癌、肝癌及其他肿瘤的血清学诊断，在肿瘤发生的早期能对患者的肿瘤进行早期辅助诊断，尤其对于健康人群肿瘤风险预测有着良好的应用前景，在判断疾病进程和预后，以及对肿瘤的诊断和治疗具有较大的潜在价值。

Description

抗SPAG9抗体在肿瘤的早期辅助诊断中的用途

技术领域

本发明涉及抗体在肿瘤诊断中的用途，特别是涉及到抗体在肿瘤的早期辅助诊断中的用途。

背景技术

SPAG9（Sperm-Associated Antigen 9，SPAG9）蛋白特异性的定位于精子头部顶体的赤道板区，在精子附着到卵子上以及随后发生的受精过程中起着重要的作用，采用抗SPAG9自身抗体进行去透明带仓鼠卵穿透试验，发现人精子穿透明显的被抑制，考虑到顶体囊前部高浓度的SPAG9以及它的赤道定位，这种强烈的抑制精子结合的现象表明SPAG9作为一种精子表面相关抗原在精卵结合中发挥着重要作用。

正常情况下SPAG9只在睾丸的生殖细胞中表达，偶尔在胎盘中表达，在精子附着到卵子上以及随后发生的受精过程中起着重要的作用，2004年发现SPAG9是癌-睾丸抗原家族的新成员，作为一种支架蛋白与JNK（c-Jun-NH2-knase）结合，参与JNK信号通路，在细胞的生存、增殖、凋亡和肿瘤的发育等生理过程中扮演重要调节角色。2007年印度学者Manoj Garg等采用逆转录PCR、免疫组织化学、Western Blot以及Elisa等方法检测了SPAG9在mRNA和蛋白水平在上皮细胞卵巢癌（Epithelial Ovarian Cancer EOC）中的表达以及EOC患者血清中抗SPAG9抗体的表达。他们发现在mRNA和蛋白水平上皮细胞卵巢癌患者中有90%的患者癌症组织中有SPAG9的表达，其中67%的患者血清中有抗SPAG9的抗体存在。次年他们还发现SPAG9也在大多数肾细胞癌（RCC）患者组织中高表达，而且发现SPAG9与体外培养的RCC细胞的运动力、转移和入侵有关，另外体外细胞培养以及体内裸鼠实验也证明采用siRNA敲除SPAG9后有效的阻止了癌细胞（组织）的增殖和生长。2009年Deepika Kanojia等发现88%的乳腺癌患者在mRNA和蛋白水平有SPAG9的表达，同时有80%的患者血清中检测到SPAG9自身抗体；而且他们还发现各种水平的表达早期阳性检出率大大高于晚期。后来又有学者相继发现SPAG9在甲状腺癌、子宫颈癌患者早期以及恶性血液系统疾病等均有较强的表达，这意味着SPAG9有可能作为一种非特异性的广谱肿瘤早期标志物应用于临床肿瘤辅助诊断，尤其是体液免疫反应的存在，容易建立检测方法，将大幅度提高肿瘤检测的敏感性。血清标本比组织容易获得，而且在肿瘤从细胞的改变到实体瘤组织的形成需要一定的时间，如果在肿瘤发生的早期能从患者外周血中检出SPAG9的表达，对肿瘤的早期诊断无疑是有帮助的。目前世界上还未见有关于肝癌患者SPAG9的表达以及外周血抗SPAG9抗体的相关报道，也未见肺癌患者外周血抗SPAG9抗体的相关报道。而本实验室在实验中的发现是一个有价值的线索。

一直以来，血清中肿瘤相关抗原（Tumor-Associated Antigens，TAA）被认为是肿瘤早期诊断的血清学标志物，为了寻找TAA人们进行了大量的研究工作，但由于其量的微小以及容易降解或在一定时间内经血液循环清除使得能用于临床诊断的理想的TAA并不是很多。而TAA一旦被免疫系统识别引起了体液免疫反应即是一种放大了的信号，所以人们最近把注意力转向寻找抗TAA自身抗体作为生物学标志而不再是瞄准TAA本身，因为这种抗体在正常个体和非癌状态下不表达或者低表达，其在血清中存在的时间上的持续性及稳定性优于包括TAA在内的其他的标志物。但大多TAA是自身蛋白质，有可能免疫原性不强，所以，寻找能被自身免疫系统识别的TAA是关键。一般而言，肿瘤抗原刺激产生的自身抗体可以在肿瘤确诊前一年检出。比如HCC有一个特征就是肝硬化、肝炎是其前期改变，当血清中出现自身抗体时提示恶变，这种抗体反应是诱导癌变的细胞蛋白刺激机体的免疫系统产生的。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗SPAG9抗体在肿瘤的早期辅助诊断中的用途。

特别涉及到肺癌、肝癌患者的诊断。

本实验室对16例初诊肺癌、32例初诊肝癌和其他肿瘤患者外周血中IgG 型抗SPAG9自身抗体的表达进行了研究，同时检测健康对照组、肝炎、肝硬化患者组循环血中IgG 型抗SPAG9自身抗体的水平。发现未经过任何治疗措施处理的初诊肝癌和肺癌患者血清中抗SPAG9抗体阳性率高达68.8%，但经过各种手段治疗的癌症患者血清抗SPAG9抗体阳性率仅29.0%，肝炎患者血清抗SPAG9抗体阳性率为27.3%，肝硬化患者血清抗SPAG9抗体阳性率为25.0%，健康对照人群为8%。从OD值来分析，各组均有OD值很高的样本，如8例肝硬化患者中的2例阳性的OD值均大于1.0，这两例患者很有可能为高风险癌变患者，这说明由SPAG9引起的体液免疫反应在肿瘤发生的早期就已经存在，并可以通过检测抗SPAG9抗体来发现，便于及时跟踪观察。因此，该指标在肿瘤早期诊断中的意义是其他任何手段无法相提并论的。

本发明通过检测健康对照组、肝炎、肝硬化患者组、初诊肝癌、初诊肺癌、复诊肝癌、复诊肺癌循环血中IgG 型抗SPAG9自身抗体的水平，发现癌症患者血清以及癌前病变患者血清中抗SPAG9抗体阳性率高于健康人，且未经任何治疗措施处理的初诊肝癌和肺癌患者血清中抗SPAG9抗体阳性率远高于经过各种手段治疗的癌症患者血清抗SPAG9抗体阳性率。

因此本发明可用于肺癌、肝癌及其他肿瘤的早期血清学辅助诊断，在肿瘤发生的早期进行预测，尤其对于健康人群肿瘤风险预测有着良好的应用前景。本发明在肿瘤治疗中的作用有待进一步研究。

具体实施方式

下面给出一种根据本发明制备的用于抗SPAG9抗体在肿瘤的早期辅助诊断中的用途的非限定性的实施例。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均自生物试剂公司购买所得。

一、材料

血清标本：血清标本共270例，来源于湖南省脑科医院及湖南省肿瘤医院，男性201例，女性69例，年龄19岁～80岁,具体研究对象分布见表1。所有病例标本的诊断都经过临床病理学、影像学或血清学检查综合分析证实。

表1. 研究对象分布情况

二、方法

1.ELISA方法的建立。

1.1 SPAG9重组蛋白包被抗原最适工作浓度和血清最适稀释度的确定。

用包被缓冲液将SPAG9重组蛋白包被抗原稀释成3个浓度（0.5 μg/ml、1μg/ml 、2 μg/ml），用封闭液将癌症患者血清及正常体检者血清稀释成3个梯度（1: 10、1: 50、1:100），用96孔酶标板根据棋盘法原则滴定，每种均做重复孔，计算患者血清与正常人血清在不同抗原浓度下的A450/630的差值，根据空白对照A＜0.1，正常人血清A＜0.2，患者血清与正常人血清吸光值差值较大的血清稀释度为最佳稀释度，以此A450/630值对应的SPAG9重组蛋白的浓度为最佳包被量。

1.2 操作流程。

1.2.1 用1μg /ml的SPAG9重组蛋白包被抗原包被96孔酶标板，100 μl/孔，4℃ 22h。

1.2.2 洗涤缓冲液手工洗板, 3 min×3次。

1.2.3 封闭，200 μl/孔封闭液，37℃2 h。

1.2.4 洗涤缓冲液手工洗板, 3 min×3次。

1.2.5 加入血清标本，100 μl/孔, 37℃孵育1h。

1.2.6 洗涤缓冲液洗板机洗板, 3 min×3次。

1.2.7 加入抗人IgG二抗，100 μl/孔，37℃孵育1 h。

1.2.8 洗涤缓冲液洗板机洗板, 3 min×4次。

1.2.9 加入试剂盒现有的显色液，100 μl/孔，室温避光孵育30 min。

1.2.10 加入2 M H₂SO₄终止反应，50 μl/孔。

1.2.11 450 nm和630 nm波长测吸光度值。

2. 变异系数的计算：取阳性血清和空白对照（以稀释液代替血清）各1份，在同一块酶标板上每份标本测定5个孔，按公式计算批内变异系数；另取5次不同时间测定上述2份相同血清，计算批间变异系数。批内和批间变异系数小于10%则该ELISA方法重复性好。

3. 临床血清标本的检测：收集空腹静脉血液，3000 rpm离心5 min，无菌分离血清，-80℃冻存至检测。用建立的ELISA方法复孔检测每个血清标本，以吸光值确定标本血清的SPAG9抗体水平，并且对数据进行统计学分析。

三、结果

1．SPAG9重组蛋白包被抗原最适工作浓度和血清最适稀释度的确定：对棋盘法获得的复孔吸光值均值进行分析，当SPAG9重组蛋白包被抗原浓度为1μg /ml，血清稀释度为1:10时，患者血清与正常人血清吸光度值差值最大（见表2）。

表2. SPAG9重组蛋白包被抗原最适工作浓度和血清抗体最适稀释度的确定

2．变异系数：任意取阳性血清、空白对照各1份，在同一块酶标板上每份血清测定5个孔，计算批内变异系数；每隔1天连续5次测定上述2份相同血清，计算批间变异系数。该方法批内变异和批间变异系数均低于10%，所建立的ELISA方法稳定性好（见表3）。

表3. 批间变异系数和批内变异系数

3．临床标本的检测：

将所有标本分成4个组（对照组、炎症组、癌症初治组和癌症复治组）进行观察，应用统计学软件SPSS11.5对资料进行分析，计数资料采用c²检验，计量资料采用样本均数方差分析，癌症患者血清中SPAG9抗体水平与炎症患者及健康者的差异存在统计学意义（见表4、5）。37例健康体检者血清SPAG9抗体吸光度值，S=0.124，以健康体检者血清SPAG9抗体吸光度平均值加2倍标准差作为阳性判断标准(`x+2S)，即OD＞0.431者为阳性。结果8.1%（3/37）健康体检者和26.8%（11/41）炎症患者血清SPAG9抗体升高；癌症患者血清SPAG9抗体升高，癌症初治组肺癌与肝癌的阳性率均为68.8%（11/16、22/32）；癌症复治组肺癌的阳性率为27.4%（26/95），复治组肝癌的阳性率均为20.0%（2/10），仅初治组与对照组、炎症组、复治组阳性率有显著差异。

表4. 血清SPAG9抗体水平的检测

注：样本均数方差分析，P<0.05，说明与对照组比较有显著性差异。

表5. 血清SPAG9抗体检测阳性率的比较（c2检验）

注：根据人民卫生出版社孙振球主编《医学统计学》第二版P150分析，本次以P＜0.0071为差异显著。

结果表明，本实验室对16例初诊肺癌、32例初诊肝癌和其他肿瘤患者外周血中IgG 型抗SPAG9自身抗体的表达进行了研究，同时检测健康对照组、肝炎、肝硬化患者组循环血中IgG 型抗SPAG9自身抗体的水平。发现未经过任何治疗措施处理的初诊肝癌和肺癌患者血清中抗SPAG9抗体阳性率高达68.8%，但经过各种手段治疗的癌症患者血清抗SPAG9抗体阳性率仅29.0%，肝炎患者血清抗SPAG9抗体阳性率为27.3%，肝硬化患者血清抗SPAG9抗体阳性率为25.0%，健康对照人群为8%。从OD值来分析，各组均有OD值很高的样本，如8例肝硬化患者中的2例阳性的OD值均大于1.0，这两例患者很有可能为高风险癌变患者，这说明由SPAG9引起的体液免疫反应在肿瘤发生的早期就已经存在，并可以通过检测抗SPAG9抗体来发现，便于及时跟踪观察。因此，该指标在肿瘤早期诊断中的意义是其他任何手段无法相提并论的。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims

1.抗SPAG9抗体在肿瘤的早期辅助诊断中的用途。

2.根据权利要求1所述的抗SPAG9抗体在肿瘤的早期辅助诊断中的用途，所述的肿瘤来自于肺癌患者。

3.根据权利要求1所述的抗SPAG9抗体在肿瘤的早期辅助诊断中的用途，所述的肿瘤来自于肝癌患者。