CN102183651A

CN102183651A - 半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒和应用

Info

Publication number: CN102183651A
Application number: CN2011100423479A
Authority: CN
Inventors: 吴春福; 杨静玉; 王立辉; 宫平
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2011-02-22
Filing date: 2011-02-22
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明公开了一种半胱天冬酶-3酶原（Procaspase-3）免疫组化诊断试剂盒及其检测方法。该试剂盒含有免疫组化染色剂，包含：与组织抗原连接的初始抗体、与初始抗体连接的第二抗体、酶、底物、显色剂、非特异性结合位点的阻断剂及缓冲液，它能够准确测定受试者组织中Procaspase-3抗原的表达水平和细胞定位情况，为以Procaspase-3蛋白为靶点的药物在临床上的应用提供指导，并为临床诊断恶性肿瘤、肝纤维化、肾损伤及神经退行性病变提供参考。本发明还公开了一种检测Procaspase-3蛋白表达水平的对照片，所述的对照片上具有Procaspase-3高表达对照区、Procaspase-3中表达对照区、Procaspase-3无表达（或低表达）对照区以及用于放置待检测组织的Procaspase-3检测区。本对照片为评定Procaspase-3的表达水平提供了准确的评价标准。

Description

半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及一种以半胱天冬酶-3酶原（Procaspase-3）单克隆抗体、生物素化二抗、显色液以及对照片为主要成分的SP法免疫组化试剂盒及应用。

背景技术

Procaspase-3是Caspase-3的前体酶原，在凋亡信号的传递过程中起着至关重要的作用。Procaspase-3不但接收外源性凋亡通路级联刺激，而且也被内源性凋亡通路所激活。Procaspase-3是整个凋亡通路的最下游分子，所以一旦它发生表达异常或功能变化，整个凋亡信号通路就会被阻断或激活。

目前，已有越来越多的文献报道细胞凋亡与许多疾病密切相关。现已证实神经退行性疾病的发病原因之一就是大脑内的某些核团的神经元发生凋亡，从而导致记忆减退和行为异常。此外，也有研究证实慢性肝炎和慢性肾炎患者的肝脏或肾脏组织中Procaspase-3表达增高，且其表达水平与病程进展密切相关，这说明Procaspase-3也是慢性肝炎和肾炎的生物学标志物。此外，癌症的发病原因也与凋亡密切相关。有研究表明，在结肠癌组织中Procaspase-3表达水平高于周围正常组织的六倍。此外，在神经母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、肝癌等恶性肿瘤也发现了Procaspase-3过度表达的现象，并发现其表达水平与某些恶性肿瘤患者的预后密切相关，这说明Procaspase-3也可以作为某些恶性肿瘤的生物学标志物和预后标志物。无论是神经退行性疾病、慢性肝炎和肾炎、还是恶性肿瘤都依然是临床上难以攻克的疾病，早诊断早治疗是这些疾病唯一的希望。本试剂盒可检测凋亡执行蛋白Procaspase-3，这会有助于这些疾病的早期诊断。

除了作为上述疾病的诊断生物学标志物外，Procaspase-3 也是肿瘤靶向治疗的理想靶点之一。最近，Putt等人报道他们发现一种Procaspase-3激活剂，即PAC-1，可以使Procaspase-3酶原转化成有活性的Caspase-3，且能迅速导致肿瘤细胞凋亡。荷瘤裸鼠和犬模型实验也证明PAC-1靶向性和高效性，显示了巨大的市场开发潜力。由于Procaspase-3 激活剂药物的适应症为Procaspase-3阳性的恶性肿瘤患者，因此在进行临床研究乃至今后临床应用时，需要确定备选患者肿瘤组织Procaspase-3抗原的表达情况。但是，目前在国内外市场上还未见Procaspase-3蛋白诊断试剂盒。因此，医学上迫切需要开发一种能够快速、便捷且准确地进行Procaspase-3蛋白表达检测的体外诊断用品。

由于目前国内外还未见Procaspase-3蛋白免疫组化诊断试剂盒，己有的检测组织中Procaspase-3蛋白方法操作程序烦琐，非特异性高，不能迅速、准确的判断患者肿瘤组织Procaspase-3 抗原的表达情况。

发明内容

本发明的目的是提供一种Procaspase-3蛋白免疫组织化学诊断试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种能够准确测定受试者组织中的Procaspase-3 抗原的表达情况的对照片。

本发明的第三个目的是提供一种检测受试者肿瘤组织中Procaspase-3 抗原表达水平的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种Procaspase-3蛋白免疫组化诊断试剂盒。

作为本发明的一个优选例，在所述的Procaspase-3蛋白免疫组化诊断试剂盒中，所述试剂盒中包含免疫组化染色试剂，所述免疫组化染色试剂包含：与组织抗原连接的初始抗体、与初始抗体连接的第二抗体、酶、底物、显色剂、非特异性结合位点的阻断剂及缓冲液。

作为本发明的一个优选例，在Procaspase-3蛋白免疫组化诊断试剂盒中，所述的初始抗体为抗Procaspase-3人源化单克隆抗体、鼠源抗Procaspase-3单克隆抗体、兔源抗Procaspase-3单克隆抗体，或上述初始抗体工作液；所述的第二抗体为生物素标记的抗人IgG、抗鼠IgG或抗兔IgG，或上述第二抗体工作液；所述的非特异性结合位点的阻断剂可选自：动物血清或白蛋白；所述的酶为辣根过氧化物酶；所述的底物为H₂O₂ ；或所述的显色剂选自：DAB-H₂O₂；所述的缓冲液为20倍磷酸盐缓冲液。

在本发明的第二方面，提供了一种检测组织中Procaspase-3蛋白表达的对照片，所述的对照片的一个主表面上具有以下区域：

（1） Procaspase-3 高表达对照区，所述的高表达对照区设有Procaspase-3 高表达的肿瘤组织切片；

（2）Procaspase-3 中表达对照区，所述的中表达对照区设有Procaspase-3 中表达的肿瘤组织切片；

（3） Procaspase-3 无表达对照区，所述的无表达对照区设有Procaspase-3 无表达的组织切片；（4） Procaspase-3 检测区，所述的检测区用于放置待检测的组织样本。

本发明的一个优选例，在所述的检测组织中Procaspase-3 表达的对照片中，所述Procaspase-3高表达的肿瘤组织切片选自： HL60或 Hep-G2肿瘤组织切片；所述Procaspase-3中表达的肿瘤组织切片选自：DU145或U87肿瘤组织切片；所述Procaspase-3无表达的肿瘤组织切片选自：MCF-7肿瘤组织切片。

作为本发明的一个优选例，在所述的检测组织中Procaspase-3 表达的测试片中，所述的组织切片为石蜡包埋的切片或冰冻组织切片。

在本发明的第三方面，提供了一种体外检测样品中Procaspase-3 抗原表达水平的检测和评定方法，所述的样品是肿瘤组织、肝组织、肾组织或脑组织，该方法包括步骤：

（1）将组织制成切片；

（2）将所述切片置于所述对照片中的Procaspase-3 检测区，按照实验实施例5的方法进行免疫组化染色检测；

（3）将样品的染色情况与对照片上Procaspase-3 高表达、中表达、无表达的组织切片的染色情况进行比较，结果判定如下：

染色情况≥Procaspase-3 高表达区，判为强阳性（+ + + ）；

染色情况介于Procaspase-3 中表达区和Procaspase-3 高表达区之间，判为中强阳性（++）；

染色情况介于Procaspase-3 低表达区和Procaspase-3 中表达区之间，判为弱阳性（+)；

染色情况≤Procaspase-3 低表达区，判为阴性（-）。

本发明中Procaspase-3蛋白方法操作程序简单，特异性高，能迅速、准确的判断患者肿瘤组织Procaspase-3 抗原的表达情况。

附图说明

图1显示了几种细胞呈现不同表达水平检测结果，从左向右分别表示：HL60细胞的结果，其Procaspase-3高表达；MCF-7细胞的结果，其Procaspase-3 无表达；HepG2细胞的结果，其Procaspase-3高表达；DU145细胞的结果，其Procaspase-3 中度表达；A549细胞的结果，其Procaspase-3 中高度表达；U87细胞的结果，其Procaspase-3 中度表达。

图2 显示了强阳、阳和弱阳性的切片组织的一些照片，各样品均为细胞浆定位表达，其中，A为 (+)；B为(++)；C为(+++）。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，未详细说明的技术为常规技术。

实验实施例1 Procaspase-3蛋白免疫组化诊断试剂盒组成

表 1 40人份/盒产品组成及主要成分

	组成	装量	数量	主要成分
					1.	试剂1（P₁）	1.5-1.6ml	1瓶	兔抗人Procaspase-3单克隆抗体（即用型）
2.	试剂2（P₂）	3.0-3.2ml	1瓶	抗体稀释液
					3.	试剂3（P₃）	3.0-3.2ml	1瓶	封闭用小牛血清
4.	试剂4（P₄）	3.0-3.2ml	1瓶	生物素化二抗工作液
					5.	试剂5（P₅）	3.0-3.2ml	1瓶	辣根酶标记链霉素卵白素工作液
6.	试剂6（P₆）	3.0-3.2ml	1瓶	3%过氧化氢
					7.	试剂7（P₇）	10.0-10.50ml	1瓶	20倍磷酸缓冲液
8.	试剂8（P₈）	3.0-3.2ml	1瓶	色原底物溶液（DAB）
					9.	试剂9（P₉）	3.0-3.2ml	1瓶	色原底物缓冲液
10	对照片		1张（可增选）	对照片

实验实施例2 Procaspase-3 抗原呈不同表达水平的肿瘤细胞的选择

采用以下步骤进行肿瘤细胞的选择：

1）备选肿瘤细胞包括：

人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞系A549、人乳腺癌细胞系MCF-7、人胶质瘤细胞系U87、人前列腺癌细胞系DU145和人白血病细胞系HL-60（购ATCC）。体外培养至对数生长期，分别取各种细胞进行细胞技术。

2）蛋白提取

培养至10⁷细胞，1000rpm，5min离心收集各种细胞，以PBS清洗一次，再次离心，弃上清。每个细胞中加入预冷细胞裂解液100 μL在4℃下裂解样品30 min后，12000 rpm，离心15 min，取上清备用。-80°C保存。

3）工作液的配制

（1）丙烯酰胺和N, N-亚甲基双丙烯酰胺储存液。使用去离子水配制含有29%(W/V)丙烯酰胺和1%(W/V) N, N-亚甲基双丙烯酰胺储存液。

（2）用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液。制备这些缓冲液必须使用Tris碱。用Tris碱完全溶于去离子水后，用HCl调节溶液的pH值。

（3）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCI (pH 8.8)

（4）积层胶缓冲液：1.0 mol/L Tris-HCI (pH 6.8)

（5）十二烷基磺酸钠(SDS)。用去离子水配成10%的储存液室温备用。

（6）过硫酸铵。用去离子水配制少量的10% (W/V)的储备液保存于4℃，由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。

（7） Tris-甘氨酸电泳缓冲液。25 mmol/L Tris碱，250 mmol/L甘氨酸，0.1 % SDS。

（8）细胞裂解液（RIPA lysis buffer）。50 mM Tris-Cl pH 7.4，150 mM NaCl，0.1% SDS，1% NP-40，1% sodium-deoxycholate，100 mmol/L NaF，2 mmol/L正钒酸钠，1 mM EDTA，使用前加入1 mM PMSF， 1 μg/mL Pepstatin，1 μg/mL Leupeptin，1 μg / mL Aprotinin。

（9） 5×SDS加样缓冲液。0.5 mol/L Tris-HCl (pH 6.8) 2.5 mL，二巯基乙醇(2-ME) 250 μL，0.5 g SDS，0.025g溴酚蓝，2.5 mL甘油。

（10）转移缓冲液。5.8 g Tris碱，2.9 g甘氨酸，0.37 gSDS加入800 mL去离子水，溶解后加入200 mL甲醇。

（11）电泳缓冲液。3.03 g Tris碱，18.77 g甘氨酸，1 g SDS加入去离子水至1000 mL。

（12） TBST缓冲液。1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5) 10 ml，NaCl 8.8 g，20%吐温-20 2 mL，加入去离子水至1000 mL。

11) 封闭液。以TBST缓冲液配制5%脱脂奶粉。

4）蛋白质电泳

按照SDS加样缓冲液与蛋白1:5的比例加入5×SDS加样缓冲液，沸水煮5-10 min，冰上冷却，分装，-70℃保存。

（1）配制15%或12%的丙烯酰胺分离胶，依次混合各成分，一旦加入TEMED，马上开始聚合，立即快速旋转混合物灌制在电泳槽的两玻璃板之间，留出灌制积层胶所需的空间。在分离胶上覆盖一层正丙醇，将凝胶垂直放置在室温约30 min。

（2）分离胶完全聚合后，清除正丙醇用去离子水洗三次，用滤纸吸去水，配制积层胶，加入到电泳槽后立即插入干净的样品梳。

（3）积层胶聚合完全后，加足够的电泳缓冲液，将蛋白质Marker及样品按预定的顺序加到样品孔中开始电泳，样品在积层胶时电压为40 V，待样品泳到分离胶时将电压调至70 V。溴酚蓝前沿接近凝胶底部时，停止电泳。

5）免疫印迹

（1）准备2张海绵垫、6张Whatman 3MM滤纸和PVDF膜。将海绵垫和Whatman 3MM滤纸直接浸入转移缓冲液中，将PVDF膜先以纯甲醇激活，再浸入转移缓冲液中。0.45μmPVDF膜激活15秒，0.22μmPVDF膜激活时间延长至1分钟或更长，至整张膜呈均匀半透明状。

（2）将SDS聚丙烯酰胺凝胶取出后，将凝胶按叠成“三明治”状，插入转移池中，凝胶一面接阴极，4℃下300 mA 恒流转1.5 h。

（3）转移后的PVDF膜放入小盒中，加入封闭液，室温下摇床上摇动封闭1 h。

（4）将兔抗人Procaspase-3单克隆抗体用1%脱脂奶粉稀释至适当浓度，4℃孵育过夜。

（5）用TBST漂洗膜3次，每次10 min。

（6）将山羊抗兔二抗用1%脱脂奶粉稀释至适当浓度，室温孵育1 h。

（7）用TBST漂洗膜3次，每次10 min。

（8）暗室中将ECL试剂加到膜蛋白面上，反应1 min后，置于曝光暗盒中，盖X-光胶片，曝光一定时间。

（9）取出胶片放入显影液中，待出现条带后，以自来水漂洗，置于定影液中，最后用自来水冲洗，晾干，扫描图片保存。

通过与内参蛋白β-actin表达水平作对比，获得Procaspase-3 抗原呈高度表达的HL-60和Hep-G2； Procaspase-3呈中度表达的DU145和U87；Procaspase-3 无表达的MCF-7细胞。上述几种细胞呈现不同表达强度的免疫印记检测结果显示在图1中。

实验实施例3 Procaspase-3不同表达水平肿瘤组织的制备

1）选取实施例1中获得的Procaspase-3 分别呈现高度、中度、无表达的HepG2、DU145 及MCF-7三种肿瘤细胞，于含有10％胎牛血清的RPMI-1640 完全培养基中传代扩增；

2）对数生长期的三种细胞，PBS 洗涤，离心，弃上清，细胞沉淀重悬于PBS 中，计数，调整细胞密度至2x10⁷/mL ;

3）将肿瘤细胞悬液分别接种于BALB/C 裸鼠左右腋下，定期观察接种局部肿瘤生长情况；

4）待肿瘤长至300mm³ 左右大小（肿瘤体积计算公式为X²y/ 2 ，其中X为肿瘤长径，y为肿瘤短径），颈椎脱臼法处死受试动物，摘取肿瘤组织，固定于多聚甲醛。

实验实施例4 肿瘤组织病理切片的制备

1）多聚甲醛磷酸缓冲液的配制：多聚甲醛40g, 0.lmol/L pH7.4的PBS 500mL，两者混合加热至60 ℃ ，搅拌并滴加1N NaOH 至溶液清晰为止，冷却后加PBS 至总体积为1000mL 。

2）摘取肿瘤组织后，尽快处理取材的组织，力求保持组织新鲜，不干燥，组织块不可过大或过厚，尤其厚度不要超过1cm 。

3）取材的组织固定于多聚甲醛磷酸缓冲液，固定液量要充足，至少20倍于组织的量，否则会造成固定液浓度降低，固定时间以完全浸透组织为宜（48 小时），固定时间过久可能会影响染色效果。

4）组织的脱水、透明、浸蜡：整个操作过程中要掌握的原则是脱水透明要够而不过，浸蜡的温度不宜超过64℃，否则可能使抗原活性下降，降低检出率，或是造成组织焦脆，切片困难。

5）从蜡缸拿出后用石蜡进行包埋。

6）载玻片的预处理：载玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤，本发明采用多聚左旋赖氨酸处理载玻片。

切片：用石蜡切片机将包埋有组织的蜡块切成薄片，切片厚度4μm , 45℃ 水温展片，要尽量展平，否则皱褶处易出现非特异染色。55℃温箱烤片2小时，防水密封，低温保存备用。

实验实施例5 组织切片Procaspase-3蛋白表达的测定

1）对于石蜡包埋组织标本可进行系列脱水脱蜡及抗原修复；对于冰冻组织切片需进行系列脱水。

2） 3%过氧化氢孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗，3分钟×3次。

3）滴加封闭用正常牛血清工作液，37度孵育40分钟，倾去，误洗。

4）滴加一抗（抗体稀释液稀释200倍），每片50uL，37℃孵育2h。PBS冲洗，3分钟×3次。

5）滴加二抗工作液，每片50uL，37℃孵育1h。PBS冲洗，3分钟×3次。

6）滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液，每片50uL，37℃孵育20min。PBS冲洗，3分钟×3次。

7） DAB显色。室温，1mlPBS中加色原底物溶液和色原底物缓冲液各1滴，混匀后滴于切片上，每片120ul，作用2min。

8）终止反应，用PBS洗去DAB。

9）镜检，拍照。

将制备的病理组织切片抽样检测，染色结果证实：HepG2、DU145 及MCF- 7 肿瘤组织经如上所述的免疫组化染色法检测，其Procaspase-3 抗原的表达水平分别呈高、中及无不同的水平，即显色呈强阳性、弱阳性及阴性。不同切片位置的组织染色结果均匀，表明肿瘤细胞在接种动物体内形成的肿瘤组织具有良好的均质性。因此，该试剂盒可用于检测肿瘤患者肿瘤组织Procaspase-3 抗原的表达水平。

实施例6 肿瘤患者肿瘤组织Procaspase-3 抗原表达水平的检测

获取10 位胃癌肿瘤患者手术切除的肿瘤组织或活检获得的肿瘤组织，经与前述相同的方法固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，将切片贴附于已制备好的检测用对照切片载片的另一端，而后利用相同的方法进行免疫组化的染色检测。

结果判断：

Hep-G2、DU145 及MCF- 7肿瘤组织染色情况须为强阳性、弱阳性及阴性，实验结果有效，按下述步骤进行判断，否则实验无效；

患者肿瘤组织染色情况与Hep-G2、DU145 及MCF- 7 肿瘤组织染色情况进行比对，染色情况≤MCF-7 ，判为阴性(-) ；染色情况介于MCF-7 、DU145之间，判为弱阳性（+ ) ；染色情况介于DU145 、Hep-G2之间，判为中强阳性（++) ；染色情况≥Hep-G2，判为强阳性（+++) ，代表性结果见图2 。

应理解，在阅读了本发明的上述公开内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请的权利要求书所限定的范围。

Claims

1.半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒是采用免疫组化方法，其中包含免疫组化染色剂。

2.根据权利要求1所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，所述免疫组化染色剂包含：与组织抗原连接的初始抗体、与初始抗体连接的第二抗体、酶、底物、显色剂、非特异性结合位点的阻断剂及缓冲液。

3.根据权利要求2所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，所述的初始抗体为抗半胱天冬酶-3酶原人源化单克隆抗体或鼠源抗半胱天冬酶-3酶原单克隆抗体，或上述初始抗体工作液；所述的第二抗体为生物素标记的抗人IgG或抗鼠IgG，或上述第二抗体工作液；所述的非特异性结合位点的阻断剂可选自：动物血清，白蛋白；所述的酶为辣根过氧化物酶：所述的底物为H₂O₂ ；所述的显色剂选自：DAB-H₂O₂或AEC-H₂O₂；所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含阳性对照片。

5.根据权利要求4所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，所述的对照片的一个主表面上具有以下区域：

（1）半胱天冬酶-3酶原高表达对照区，所述的高表达对照区设有半胱天冬酶-3酶原高表达的肿瘤组织切片；

（2）半胱天冬酶-3酶原中表达对照区，所述的中表达对照区设有半胱天冬酶-3酶原中度表达的肿瘤组织切片；

（3）半胱天冬酶-3酶原无表达对照区，所述的无表达对照区设有半胱天冬酶-3酶原无表达的肿瘤组织切片；

（4）半胱天冬酶-3酶原检测区，所述的检测区用于放置待检的组织。

6.根据权利要求5所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，所述半胱天冬酶-3酶原高表达的肿瘤组织切片选自：HL60或 Hep-G2肿瘤组织切片；所述半胱天冬酶-3酶原中表达的肿瘤组织切片选自：DU145或U87肿瘤组织切片；所述半胱天冬酶-3酶原无表达的肿瘤组织切片选自：MCF-7肿瘤组织切片。

7.根据权利要求5-6中任一所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，检测组织中半胱天冬酶-3酶原表达的对照片中所述的组织切片为石蜡包埋的切片或冰冻组织切片。

8.权利要求1-7中任何一项所述的半胱天冬酶-3酶原蛋白免疫组化诊断试剂盒在药物靶标检测，体外检测组织中半胱天冬酶-3酶原抗原表达水平的评定及恶性肿瘤进展程度、神经退行性病变、肝脏纤维化和肾损伤程度的诊断方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，体外检测组织中半胱天冬酶-3酶原抗原表达水平的评定的步骤如下：

（1）组织切片样本染色

a 对于石蜡包埋组织标本可进行系列脱水脱蜡及抗原修复；对于冰冻组织切片需进行系列脱水；

b 3%过氧化氢孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，3分钟×3次；

c 滴加封闭用正常牛血清工作液，37度孵育40分钟，倾去，误洗；

d 滴加一抗（抗体稀释液稀释200倍），每片50uL，37℃孵育2h；PBS冲洗，3分钟×3次,

e 滴加二抗工作液，每片50uL，37℃孵育1h；PBS冲洗，3分钟×3次,

f 滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液，每片50uL，37℃孵育20min；PBS冲洗，3分钟×3次；

g DAB显色：室温，1mlPBS中加色原底物溶液和色原底物缓冲液各1滴，混匀后滴于切片上，每片120ul，作用2min；

h 终止反应，用PBS洗去DAB；

i 镜检，拍照；

（2）将样品的染色情况与对照片上半胱天冬酶-3酶原高表达、中表达、无表达的组织切片的染色情况进行比对，结果判定如下：

A. 染色情况≥半胱天冬酶-3酶原高表达区，判为强阳性（+++）；

B. 染色情况介于半胱天冬酶-3酶原中表达区和半胱天冬酶-3酶原高表达区之间，判为中强阳性阴性（++）；

C. 染色情况介于半胱天冬酶-3酶原无表达区和半胱天冬酶-3酶原中表达区之间，判为弱阴性（+）；

D. 染色情况≤半胱天冬酶-3酶原无表达区，判为阴性（-）。