ES2384379T3 - Anticuerpo monoclonal anti-IL-1R1 humano terapéutico - Google Patents

Abstract

n anticuerpo humano aislado que se une específicamente al receptor de tipo 1 de la interleucina 1 o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:a. gines estructurales de cadena pesada humana, una región CDR1 de la cadena pesada, en la que la CDR1comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 63; una región CDR2 de la cadena pesada, en la quela región CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 66; una región CDR3 de la cadenapesada, en la que la región CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 69; yb. ines estructurales de cadena ligera humana, una región CDR1 de la cadena ligera, en la que la región CDR1comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 71; una región CDR2 de la cadena ligera, en la que laregión CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 73; una región CDR3 de la cadena ligera,en la que la región CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 75.

Description

Anticuerpo monoclonal anti-IL-1R1 humano terapéutico

5 Esta solicitud está relacionada y reclama prioridad sobre el número de serie de solicitud provisional de EE.UU. 60/408.719 presentada el 6 de septiembre de 2002.

Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos que se unen a la proteína receptor de interleucina 1 de tipo También se proporcionan composiciones, particularmente composiciones farmacéuticas y procedimientos para trata enfermedades mediadas por la IL-1, tales como artritis reumatoide, osteoartritis y otras afecciones inflamatorias.

Antecedentes de la invención

15 Desarrollo de anticuerpos

La inflamación es la respuesta del cuerpo a lesiones causadas por daños mecánicos, infección o estimulación antigénica. Las reacciones inflamatorias a menudo se expresan de forma patológica. Dichas afecciones se producen cuando la inflamación se expresa de una manera exagerada, induce por un estímulo inapropiado o persiste después de la eliminación del agente lesivo.

La respuesta inflamatoria está mediada, entre otras, por las citocinas. Una de las citocinas inflamatorias más potentes descubierta es la interleucina 1 (IL-1). Un incremento de la señalización de la IL-1 produce inflamación

25 persistente asociada con varias enfermedades y se piensa que la IL-1 es un mediador clave en muchas enfermedades y afecciones médicas. Esta citocina se fabrica principalmente (aunque no exclusivamente) en células del linaje de macrófagos/monocitos y se puede producir de dos formas: IL-1 alfa (IL-1 a) e IL-1 beta (IL-1 p).

La IL-1 estimula las respuestas celulares interaccionando con un complejo de receptor heterodimérico compuesto por dos proteínas transmembrana, el receptor de IL-1 de tipo 1 (IL-1 R1) y la proteína accesoria del receptor de IL-1 (IL-1 RAcP). La IL-1 se une primero al IL-1R1; después se recluta la RAcP de IL-1 para este complejo Greenfeder et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:13757-13765; Yoon y Dinarello, 1998, J. Immunology 160:3170-3179; Cullinan et al., 1998, J. Immunology 161:5614-5620), seguido de transducción de señal que tiene como resultado la inducción de una respuesta celular.

35 Los estudios de unión basados en células sugieren que la RAcP de IL-1 estabiliza el complejo de señalización del IL1R ralentizando la constante de disociación del ligando (Wesche et al., 1998, FEBS Letters 429:303-306). Mientras que la interacción de la IL-1 con el IL-1R se ha caracterizado exhaustivamente, la interacción de RAcP de IL-1 con el receptor unido al ligando sigue sin estar bien definida. Dado que la RAcP de IL-1 no tiene una afinidad significativa por la IL-1 o el IL-1R1 por separado pero una elevada afinidad por el complejo, se deduce que el suceso de unión IL-1/IL-1R crea nuevos sitios de unión para RAcP de IL-1 que pueden incluso incluir contribuciones por residuos de IL-1 (Ettorre et al., 1997, Eur. Cytokine Netw. 8:161-171). Otra molécula, el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1ra) compite con IL-1a e IL-1 por la unión al receptor, pero no recluta la RAcP de IL-1, lo que tiene como resultado un receptor ocupado pero que no señaliza. La actividad de la IL-1 puede además contrarrestarse mediante el IL-1R de

45 tipo II, un receptor señuelo que se une al ligando pero que no participa en la señalización debido a que tiene un dominio intracelular truncado. El IL-1 ra y el IL-1 R de tipo II actúan reduciendo la gravedad y la duración de los acontecimientos inflamatorios mediados por la IL-1 (Wesche et al., 1998, FEBS Letters 429:303-306; Dripps et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:10331 -10336; Dripps et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:20331 -20335).

Los inhibidores de la interleucina 1 se pueden producir a partir de cualquier proteína capaz de prevenir específicamente la activación de los receptores celulares de la IL-1, que puede ser el resultado de una serie de mecanismos, Dichos mecanismos incluyen la regulación por disminución de la producción de IL-1, la unión de IL-1 libre, la interferencia con la unión de la IL-1 al IL-1R, la interferencia con la formación del complejo IL-1 R-IL-1 RAcP

o la interferencia con la modulación de la señalización de la IL-1 tras la unión a su receptor. Las clases de 55 inhibidores de IL-1 incluyen:

•

Antagonistas del receptor de la interleucina 1, tales como IL-1ra, como se describe más adelante;

•

Anticuerpos monoclonales anti-IL-1R (p. ej., como se divulga en la solicitud de patente europea publicada nº EP 623674, cuya divulgación se incorpora en el presente documento por referencia);

•

Proteínas de unión a IL-1, tales como receptores solubles de IL-1 (p. ej., como se divulga en las patentes de EE.UU. nº 5,492,888; 5,488,032; 5,464,937; 5,319,071; y 5,180,812

65 • Anticuerpos monoclonales anti-IL-1 (p. ej., como se divulga en las publicaciones de solicitudes de patentes internacionales nº WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, U.S. Pat. No. 4,935,343, EP 364778, EP 267611 y EP 220063,

• Proteínas accesorias al receptor de la IL-1 y anticuerpos de las mismas (p. ej., como se divulga en las 5 publicaciones de solicitudes de patente internacional nº WO 96/23067 y WO 99/37773; y

• Inhibidores de la enzima convertidora de la interleucina-1β (ICE) o la caspasa (p. ej., como se divulga en las publicaciones de solicitudes de patente internacional nº WO 99/46248, WO 99/47545, y WO 99/47154, que se pueden usar para inhibir la producción y secreción de IL-1β;

• inhibidores de la interleucina-1β proteasa; y

• otros compuestos y proteínas que bloquean la síntesis in vivo o la liberación extracelular de IL-1.

15 Ejemplos de inhibidores de la IL-1 se divulgan en las referencias siguientes: Las patentes de EE.UU. Nº 5,747,444; 5,359,032; 5,608,035; 5,843,905; 5,359,032; 5,866,576; 5,869,660; 5,869,315; 5,872,095; 5,955,480; y 5,965,564; las publicaciones de solicitud de patente internacional Nº W098/21957, W096/09323, W091/17184, W096/40907, W098/32733, W098/42325, W098/44940, W098/47892, W098/56377, W099/03837, W099/06426, W099/06042, W091/17249, W098/32733, W098/17661, W097/08174, W095/34326, W099/36426, y W099/36415; las publicaciones

20 de solicitud de patente europea Nº EP534978 y EP89479; y la solicitud de patente francesa nº FR 2762514. "Sims J.

E. et al. divulga anticuerpos conocidos contra los receptores de tipo I y de tipo II de la interleucina 1 (IL-1) y concluye que el receptor de tipo I (IL-1R1) es responsable de mediar en la transducción de señal tras la unión a la IL-1”.

El antagonista del receptor de la interleucina 1 (IL-1ra) es una proteína humana que actúa como inhibidor natural de

25 la interleucina 1 y es un miembro de la familia de la IL-1, que incluye IL-1 α e IL-1 β. Antagonistas preferidos del receptor (incluidos IL-1 ra y variantes y derivados de los mismos), así como procedimientos de fabricarlos y usarlos, se describen en la patente de EE.UU. nº 5,075,222; las publicaciones de solicitud de patente internacional Nº WO 91/08285; WO 91/17184; W092/16221; W093/21946; WO 94/06457; WO 94/21275; WO 94/21235; DE 4219626, WO 94/20517; WO 96/22793;WO 97/28828; y WO 99/36541, la solicitud de patente australiana nº AU9173636; y la

30 solicitud de patente francesa nº FR2706772; Las proteínas incluyen formas glicosiladas así como no glicosiladas de los antagonistas de receptor de la IL-1.

Específicamente se divulgan tres formas útiles del IL-1 ra y variantes del mismo y se describen en la patente de EE.UU. nº 5,075,222 ("la 'patente 222"). El IL-1 raα se ha caracterizado mediante SDS-PAGE como una molécula de 35 22-23 kD que tiene un punto isoeléctrico aproximado de 4,8, que eluye en una columna Mono Q FPLC en NaCl aproximadamente 52 mM en tampón Tris, pH 7,6. El IL-1 raβ se ha caracterizado como una proteína de 22-23 kD que eluye en una columna Mono Q en NaCl 48 mM. Tanto el IL-1 raα como el IL-1 raβ están glicosilados. El IL-1 ra se ha caracterizado como una proteína de 20 kD que eluye en una columna Mono Q en NaCl 48 mM y no está glicosilado. La patente ‘222 también divulga procedimientos para aislar los genes responsables de la codificación de

40 inhibidores, la clonación del gen en vectores adecuados y tipos celulares y la expresión del gen para producir los inhibidores. Aunque eficaz, el IL-1ra tiene una semivida relativamente corta. En el uso actual, el IL-1 ra se administra una vez al día. Por tanto, la técnica se beneficiaría de un antagonista del receptor de IL-2 con una semivida apreciablemente más larga.

45 La prevención de la señalización de la IL-1 inhibiendo la unión de la IL-1 al receptor de IL-1 es un atractivo enfoque terapéutico para tratar las enfermedades mediadas por la IL-1. En la técnica existe la necesidad de inhibidores clínicamente eficaces de la vía de señalización de la IL-1 que puedan atenuar los efectos de las enfermedades mediadas por la IL-1 y sean adecuados para su liberación en pacientes humanos. Un anticuerpo humano que bloquea la señalización de la IL-1 sería particularmente ventajoso a la hora de satisfacer esta necesidad y

50 proporcionaría una semivida más larga que la terapia disponible en la actualidad.

Sumario de la invención

La invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen al receptor de interleucina -1 de tipo I (IL-1 R1)

55 como se define en las reivindicaciones adjuntas. Preferentemente, los anticuerpos inhiben la señalización de la IL-1 compitiendo con la unión de IL-1β y de IL-1α al IL-1R1. La presente invención también proporciona líneas celulares de hibridoma que producen, y más preferentemente, secretan en el medio de cultivo celular los anticuerpos monoclonales de la invención. Los anticuerpos de la invención bloquean con éxito la señalización de la IL-1 en células humanas y, de este modo, son útiles en el tratamiento de pacientes con enfermedades mediadas por la IL-1.

60 También Se proporcionan proteínas de fusión que comprenden la secuencia de una región Fc de anticuerpo y una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEC ID Nº 10, la SEC ID Nº 12, la SEC ID Nº 14, la SEC ID Nº 16, la SEC ID Nº 18, la SEC ID Nº 20, la SEC ID Nº 22, la SEC ID Nº 24, la SEC ID Nº 26, la SEC ID Nº 28, la SEC ID Nº 30, la SEC ID Nº 32, la SEC ID Nº 34, la SEC ID Nº 36, la SEC ID Nº 38 y la SEC ID Nº: 40. Dichas moléculas se pueden preparar usando procedimientos como se describe en, por ejemplo, el documento WO

65 00/24782. Dichas moléculas se pueden expresar en, por ejemplo, células de mamífero (p. ej., células de ovario de hámster chino) o células bacterianas (p. ej., células de E. coli).

En ciertos aspectos, también se proporcionan anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales, más preferentemente anticuerpos humanos que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en los que la

5 cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos tal como se indica en cualquiera de las SEC ID Nº 2, la SEC ID Nº 6 o la SEC ID Nº 8, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos.

También se proporcionan anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales, más preferentemente anticuerpos humanos que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en los que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos tal como se indica en cualquiera de las SEC ID Nº 4, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos.

En ciertos aspectos, los anticuerpos comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en los que la región

15 variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos tal como se indica en cualquiera de las SEC ID Nº 10, la SEC ID Nº 14 o la SEC ID Nº 16, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos. En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la SEC ID Nº 12 o la SEC ID Nº 18, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos. En aspectos adicionales, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº 20, la SEC ID Nº 22, la SEC ID Nº 24, la SEC ID Nº 26, la SEC ID Nº 28, la SEC ID Nº 30, la SEC ID Nº 32, la SEC ID Nº 34 o la SEC ID Nº 36, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos. En otros aspectos adicionales, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº 38 o la SEC ID Nº 40, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a

25 antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos. Dichas cadenas de anticuerpos son útiles en la preparación de anticuerpos que se unen específicamente a IL-1 R1 y también en la preparación de anticuerpos biespecíficos en los que la molécula resultante se une a IL-1 R1 y/o a otra molécula diana (p. ej., TNF o un receptor del TNF).

También se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente al IL-1 R1, en los que la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID Nº 10, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos, y la cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 12, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos.

35 En ciertos aspectos, también se proporcionan anticuerpos que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en los que la cadena pesada comprende una primera región variable y en los que la primera región variable comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 90 %, más preferentemente de al menos 95 % y más preferentemente de aproximadamente 99 % con la secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID Nº 10 y en los que la cadena ligera comprende una segunda región variable y en los que la segunda región variable comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 90 %, más preferentemente de al menos 95 % y más preferentemente de aproximadamente 99% con la secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID Nº 12, en los que el anticuerpo interacciona con IL-1 R1.

45 También se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente al IL-1 R1, de modo que la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID Nº 14, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos, y la cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 12, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos.

También se proporcionan anticuerpos que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en los que la cadena pesada comprende una primera región variable y en los que la primera región variable comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 90 %, más preferentemente de al menos 95 % y más

55 preferentemente de aproximadamente 99% con la secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID Nº 14 y en los que la cadena ligera comprende una segunda región variable y en los que la segunda región variable comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 90 %, más preferentemente de al menos 95 % y más preferentemente de aproximadamente 99% con la secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID Nº 12, en los que el anticuerpo interacciona con IL-1 R1.

La invención también proporciona anticuerpos que se unen específicamente al IL-1 R1, en los que la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID Nº 16, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos, y la cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de

65 aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 18, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos.

En ciertos aspectos, la invención proporciona anticuerpos que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en los que la cadena pesada comprende una primera región variable y en los que la primera región variable comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 90 %, más preferentemente de al menos 95 % y más preferentemente de aproximadamente 99% con la secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID Nº 16

5 y en los que la cadena ligera comprende una segunda región variable y en los que la segunda región variable comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90 %, más preferentemente de al menos 95 % y más preferentemente de aproximadamente 99% con la secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID Nº 18, en los que el anticuerpo interacciona con IL-1 R1.

También se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente al IL-1 R1, en los que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID Nº 20, la SEC ID Nº 22, la SEC ID Nº 24, la SEC ID Nº 26, la SEC ID Nº 28 o la SEC ID Nº 30, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 38, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional

15 de los mismos.

La invención proporcionan adicionalmente anticuerpos que se unen específicamente al IL-1 R1, en los que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID Nº 32, la SEC ID Nº 34 o la SEC ID Nº 36, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 40, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos.

La invención también proporciona realizaciones de todos los anteriores que son anticuerpos de una cadena, anticuerpos Fv de una cadena, anticuerpos Fab, anticuerpos Fab' y anticuerpos (Fab')2.

25 En aspectos concretos, se proporciona una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº 38 o la SEC ID Nº 40, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos. Además, se proporciona una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº 20, la SEC ID Nº 22, la SEC ID Nº 24, la SEC ID Nº 26, la SEC ID Nº 28, la SEC ID Nº 30, la SEC ID Nº 32, la SEC ID Nº 34 o la SEC ID Nº 36, o un fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de los mismos.

La invención también se refiere a anticuerpos humanos aislados que se unen específicamente al IL-1R1, en los que

35 el anticuerpo comprende: (a) regiones armazón de la cadena pesada humana, una región CDR1 de cadena pesada humana, una región CDR2 de cadena pesada humana y una región CDR3 de cadena pesada humana; y (b) regiones armazón de la cadena ligera humana, una región CDR1 de cadena ligera humana, una región CDR2 de cadena ligera humana y una región CDR3 de cadena ligera humana. En ciertos aspectos, la región CDR1 de la cadena pesada humana puede ser la región CDR1 de la cadena pesada de 15C4, como se muestra en la Figura 10, y la región CDR1 de la cadena ligera humana puede ser la región CDR1 de la cadena ligera de 15C4 como se muestra en la Figura 11. En otros aspectos, la región CDR2 de la cadena ligera humana puede ser la región CDR2 de la cadena ligera humana de 15C4 como se muestra en la Figura 11. En otros aspectos más, la región CDR3 de la cadena pesada humana puede ser la región CDR3 de la cadena pesada de 15C4, como se muestra en la Figura 10 y la región CDR3 de la cadena ligera humana es la región CDR3 de la cadena ligera de 15C4 como se muestra en la

45 Figura 11.

Además, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, como se define en las reivindicaciones, que se une específicamente al receptor de tipo 1 de la interleucina 1 (IL-1 R1), que comprende: una región CDR1 de la cadena pesada humana, en la que la CDR1 de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 63; una región CDR2 de la cadena pesada humana, en la que la CDR2 de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 66; y/o una región CDR3 de la cadena pesada humana, en la que la CDR3 de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 69.

69. La invención también proporciona un anticuerpo humano aislado, como se define en las reivindicaciones, que se

55 une específicamente al receptor de tipo 1 de la interleucina 1 (IL-1 R1), que comprende: una región CDR1 de la cadena ligera humana, en la que la CDR1 de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 71; una región CDR2 de la cadena pesada humana, en la que la CDR2 de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 73; y/o una región CDR3 de la cadena pesada humana, en la que la CDR3 de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 75.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención se unen al tercer dominio de IL-1 R1, que se muestra en la Figura 17. Preferentemente, el epítopo para un anticuerpo de la invención consiste en la secuencia de aminoácidos YSV, que se denomina Epítopo 4 en el presente documento y se muestra en la Figura 24. Asimismo, se proporcionan proteínas de fusión y otras moléculas capaces de unirse al epítopo 4 (junto con los anticuerpos 65 mencionados anteriormente, en conjunto denominados en el presente documento “parejas de unión específica”), tal como se pueden preparar usando procedimientos tal como se describe en, por ejemplo, el documento WO 00/24782.

Estas moléculas se pueden expresar en, por ejemplo, células de mamífero (p. ej., células de ovario de hámster chino) o células bacterianas (p. ej., células de E. coli).

Además, se proporciona un procedimiento para mapear el epítopo de un antígeno seleccionado. En un aspecto, el

5 procedimiento comprende las etapas de: (a) generar un conjunto de proteínas de fusión, en las que cada proteína de fusión comprende (i) avidina y (ii) un fragmento de antígeno; (b) detección selectiva del conjunto de proteínas de fusión para la unión a uno o más parejas de unión específicas del antígeno; (c) aislar las proteínas de fusión en un medio que comprende biotina, de modo que la avidina se une a la biotina; y (d) analizar las proteínas de fusión unidas por la pareja o parejas de unión específica para determinar los sitios de unión sobre el antígeno por la pareja

o parejas de unión específica. En un aspecto concreto, las parejas de unión específica son anticuerpos.

En realizaciones adicionales, la invención proporciona procedimientos para tratar una enfermedad, afección o trastorno mediados por la IL-1, como se ha definido en las reivindicaciones que comprenden la etapa de administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de uno o una pluralidad de anticuerpos monoclonales de la invención o un

15 fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional a un individuo que lo necesita,

También se proporcionan procedimientos para detectar el nivel de IL-1R1 en una muestra biológica, que comprenden la etapa de poner en contacto la muestra con un anticuerpo monoclonal de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos anti-IL-1 R de la invención se pueden usar en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitivos, ensayos de tipo sándwich directos e indirecto, ensayos de inmunoprecipitación y ensayos de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) (véase, Sola, 1987, Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques, pág. 147-158, CRC Press, Inc.) para la detección y cuantificación de IL-1 R. .Los anticuerpos se pueden unir a IL-1 R con una afinidad que es adecuada para el procedimiento de ensayo que se esté empleando,

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1B representan una secuencia de ADNc (Fig. 1 A) que codifica una región constante de IgG1 de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 humano (SEC ID Nº 1) y la secuencia de aminoácidos (Fig. 1B) de una región constante de IgG1 de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 humano (SEC ID Nº 2).

Las Figuras 2A-2B representan una secuencia de ADNc (Fig. 2A) que codifica una región constante de la cadena kappa del anticuerpo anti-IL-1 R1 humano (SEC ID Nº 3) y la secuencia de aminoácidos (Fig. 2B) de

35 una región constante de la cadena kappa del anticuerpo anti-IL-1 R1 humano (SEC ID Nº 4).

Las Figuras 3A-3B representan una secuencia de ADNc (Fig. 3A) que codifica una región constante de IgG2 de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 humano (SEC ID Nº 5) y la secuencia de aminoácidos (Fig. 3B) de una región constante de IgG2 de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 humano (SEC ID Nº 6).

Las Figuras 4A-4B representan una secuencia de ADNc (Fig. 4A) que codifica una región constante de IgG4 de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 humano (SEC ID Nº 7) y la secuencia de aminoácidos (Fig. 4B) de una región constante de IgG4 de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 humano (SEC ID Nº

45 8).

Las Figuras 5A-5B representan una secuencia de ADNc (Fig. 5A) que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 26F5 (SEC ID Nº 9) y la secuencia de aminoácidos (Fig. 5B) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 26F5 (SEC ID Nº 10).

Las Figuras 6A-6B representan una secuencia de ADNc (Fig. 6A) que codifica la región variable de la cadena kappa del anticuerpo anti-IL-1 R1 26F5 (SEC ID Nº 11) y la secuencia de aminoácidos (Fig. 6B) de la región variable de la cadena kappa del anticuerpo anti-IL-1 R1 26F5 (SEC ID Nº 12).

55 Las Figuras 7A-7B representan una secuencia de ADNc (Fig. 7A) que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 27F2 (SEC ID Nº 13) y la secuencia de aminoácidos (Fig. 7B) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 27F2 (SEC ID Nº 14).

Las Figuras 8A-8B representan una secuencia de ADNc (Fig. 8A) que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 15C4 (SEC ID Nº 15) y la secuencia de aminoácidos (Fig. 8B) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-1 R1 15C4 (SEC ID Nº 16).

Las Figuras 9A-9B representan una secuencia de ADNc (Fig. 9A) que codifica la región variable de la cadena kappa del anticuerpo anti-IL-1 R1 15C4 (SEC ID Nº 17) y la secuencia de aminoácidos (Fig. 9B) de la región

65 variable de la cadena kappa del anticuerpo anti-IL-1 R1 15C4 (SEC ID Nº 18).

La Figura 10 muestra la alineación de una secuencia de aminoácidos de regiones variables de la cadena pesada (sin secuencia líder) de anticuerpos anti-IL-1R1 designados 15C4 (SEC ID Nº 80, 85), 27F2 (SEC ID Nº 82, 87) y 26F5 (SEC ID Nº 84, 89). Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) están subrayadas. La CDR1 para 26f5 está designada en la SEC ID Nº 61; para 27F2 está designada en la SEC ID Nº 62; para 15C4 está designada en la SEC ID Nº 63. La CDR2 para 26F5 está designada en la SEC ID Nº 64; para 27F2 está designada en la SEC ID Nº 65; para 15C4 está designada en la SEC ID Nº 66. La CDR3 para 26F5 está designada en la SEC ID Nº 67; para 27F2 está designada en la SEC ID Nº 68; para 15C4 está designada en la SEC ID Nº 69.

La Figura 11 muestra la alineación de una secuencia de aminoácidos de regiones variables de la cadena ligera (sin secuencia líder) de anticuerpos anti-IL-1R1-y designados 15C4 (SEC ID Nº 81, 86), 27F2 (SEC ID Nº 83, 88) y 26F5 (SEC ID Nº 83, 88). La CDR1 para 26F5/27F2 está designada en la SEC ID Nº 70; para 15C4 está designada en la SEC ID Nº 71. La CDR2 para 26F5/27F2 está designada en la SEC ID Nº 72; para 15C4 está designada en la SEC ID Nº 73. La CDR3 para 26F5/27F2 está designada en la SEC ID Nº 74; para 15C4 está designada en la SEC ID Nº 75.

La Figura 12 es un gráfico que ilustra el efecto inhibidor de los anticuerpos anti-IL1R1 sobre la formación del complejo IL-1 R/IL-1β/IL-1 RAcP.

La Figura 13 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor de un anticuerpo monoclonal anti-IL1R1 como se describe en el presente documento y se designa 15C4 la formación del complejo IL-1 R/IL-1α/IL-1 RAcP.

La Figura 14 es un gráfico que representa la capacidad de los anticuerpos anti-IL-1 R1 para bloquear la unión de IL-1β sin interferir significativamente en la unión de IL-1ra en comparación con la IgG control.

La Figura 15A es un gráfico que muestra la inhibición de la producción de IL-6 en los condrocitos humanos primarios mediante anticuerpos anti-IL-1R1 identificados en el presente documento y designados 15C4, 26F5 y 27F2 en comparación con el IL-1 ra.

La Figura 15B es un gráfico que muestra la inhibición de la producción de IL-6 en los condrocitos humanos primarios mediante IL-1 ra y los anticuerpos monoclonales 15C4 y 27F2 en comparación con la clase de anticuerpos monoclonales representados por 10H7 y 24E12.

La Figura 16 es un gráfico que muestra la inhibición de la producción de IL-6 en sangre entera humana por los anticuerpos monoclonales anti-IL-1R1 designados 15C4, 26F5 y 27F2 en comparación con el IL-1 ra.

La Figura 17 representa las secuencias del 3er dominio de IL-1R1 de aminoácidos (SEC ID Nº 76) y nucleótidos (SEC ID Nº: 77) humanos y de nucleótidos (SEC ID Nº: 78) y aminoácidos (SEC ID Nº 79) de rata. Las barras numeradas encima de la secuencia humana indican los 15 sitios diferentes mutados para construir las 15 proteínas mutadas diferentes. Los residuos de rata introducidos mediante mutación se indican debajo de la secuencia de ácido nucleico de rata.

La Figura 18 muestra análisis de transferencia Western que demuestra reconocimiento del anticuerpo monoclonal anti-IL-1R1 de mutantes de IL-1 R1.

La Figura 19 es un dibujo que representa (I) la activación de la vía se señalización de IL-1, que se inicia con la unión de IL-1β a IL-1R1 y el reclutamiento de IL-1RacP y tres clases de anticuerpos anti-ILR1: (II) bloqueantes de IL-1 de epítopo del 3er dominio, (III) bloqueantes de RAcP del epítopo del 3er dominio y (IV) bloqueantes de IL-1 del epítopo del 1º/2º dominio.

La Figura 20 representa la estructura cristalina de 15C4 y 27F2 con la mutación 10 como se describe en el presente documento. Los residuos en gris indican los epítopos de 15C4 y 27F2.

La Figura 21 representa los epítopos de 15C4 en el tercer dominio del IL-1 R1 extracelular. La Figura 22 representa los epítopos de 24E12 en el tercer dominio del IL-1 R1 extracelular.

La Figura 23 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 59) de la proteína quimérica IL-1RA-FLAG humana-avidina de la invención.

La Figura 24 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 60) de una proteína quimérica IL-1R1-FLAG de cinomolgo-avidina. La avidina de pollo recombinante (en cursiva) se une al dominio extracelular maduro de IL-1E1 de cinomolgo (subrayado con la marca FLAG en el extremo C en negrita) a través de un ligador de 6 aminoácidos. Cuatro aminoácidos de IL-1R1 humano que se introdujeron solos y en combinación con la secuencia de cinomolgos están en negrita bajo la secuencia de cinomolgos. El epítopo 4 está en negrita, cursiva y subrayado.

La Figura 25A muestra un análisis de transferencia Western de la unión del anticuerpo anti-IL-1R1 humano (antihuIL-1R1) a IL-1R1. El * indica que los anticuerpos se usaron a 5 μg/ml, mientras que en los anticuerpos restantes se usaron a 1 μg/ml.

5 La Figura 25B muestra un resumen del análisis densitométrico de un conjunto duplicado de experimentos de transferencia de tipo Western.

La Figura 26 muestra gráficos que representan la unión de anticuerpos anti-huIL-1R1 a proteínas IL-1R1FLAG-avidina en un ensayo de unión multiplexado basado en perlas.

10 Descripción detallada de ciertas realizaciones preferidas

Los encabezados de sección usados en el presente documento son únicamente con motivos organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita.

15 Definiciones

Una enfermedad o afección médica se considera que es una "enfermedad mediada por interleucina-1 (IL-1)" si la enfermedad o afección médica natural o inducida experimentalmente está asociada con niveles elevados de IL-1 en 20 fluidos o tejidos corporales o si las células o tejidos tomados del cuerpo producen niveles elevados de IL-1 en cultivo. Niveles elevados de IL-1 pueden incluir, por ejemplo, niveles que superan los que normalmente se encuentran en una célula o tejido concreto, o puede ser cualquier nivel detectable de IL-1 en una célula p tejido que normalmente no expresa IL-1. En muchos casos, las enfermedades mediadas por IL-1 también se reconoce por las siguientes dos condiciones adicionales: (1) hallazgos patológicos asociadas con la enfermedad o afección médica pueden

25 simulares experimentalmente en animales mediante la administración de IL-1 o la regulación por aumento de la expresión de IL-1; y (2) una patología inducida en modelos animales experimentales de la enfermedad o afección médica se puede inhibir o anular mediante tratamiento con agentes que inhiben la acción de la IL-1. En la mayoría de las enfermedades mediadas por la IL-1 se cumplen al menos dos de las tres condiciones y en muchas enfermedades mediadas por la IL-1 se cumplen las tres condiciones.

30 Una lista no exclusiva de enfermedades mediadas por la IL-1 agudas y crónicas incluye, entre otras, las siguientes: pancreatitis aguda; esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer; caquexia/anorexia, incluida la caquexia inducida por SIDA, asma y otras enfermedades pulmonares, aterosclerosis, vasculitis autoinmunitaria, síndrome de fatiga crónica, enfermedades asociadas con clostridium, incluida la diarrea asociada con clostridium,

35 afecciones e indicaciones coronarias, incluida la insuficiencia congestiva cardíaca, restenosis coronaria, infarto de miocardio, disfunción miocárdica (p. ej., relacionada con sepsis) u derivación aortocoronaria; cáncer, tal como mieloma múltiple y leucemia mielógena (p. ej., LMA o LMC) y otras leucemias, así como metástasis tumorales; diabetes (por ejemplo, diabetes dependiente de insulina); endometriosis; fiebre; fibromialgia; glomerulonefritis; enfermedad del injerto contra el huésped/rechazo de transplante; shock hemorrágico; hiperalgesia, enfermedad

40 intestinal inflamatoria, afecciones inflamatorias de una articulación, incluyendo osteoartritis, artritis psoriásica y artritis reumatoide; enfermedad ocular inflamatoria, como la asociada con, por ejemplo, transplante de córnea; isquemia, incluyendo isquemia cerebral (por ejemplo, lesión cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia o ictus, cada uno de los cuales puede conducir a neurodegeneración); enfermedad de Kawasaki; alteración del aprendizaje; enfermedades pulmonares (por ejemplo, SDRA); esclerosis múltiple; miopatías (por ejemplo,

45 metabolismo de proteína del músculo, especialmente en septicemia); neurotoxicidad (p. ej., como la inducida por el VIH); osteoporosis; dolor, incluido el dolor relacionado con el cáncer; enfermedad de Parkinson, enfermedad periodontal; parto prematuro; psoriasis, lesión por reperfusión, shock séptico; efectos secundarios de la radioterapia, enfermedad de la articulación mandibular temporal, alteraciones del sueño; uveítis; o una afección inflamatoria que se produce por distensión, esguince, lesión de cartílago, traumatismo, cirugía ortopédica, infección u otros procesos

50 patológicos. Los procedimientos de la invención para tratar estas enfermedades agudas y crónicas mediadas por la IL-1, así como otras enfermedades y afecciones mediadas por la IL-1, se describen más adelante.

Se pueden usar técnicas convencionales para preparar ADN recombinante, realizar síntesis de oligonucleótidos, practicar cultivo y transformación de tejidos (p. ej., electroporación, transfección o lipofección). Se pueden realizar 55 reacciones enzimáticas y técnicas de purificación de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como normalmente se efectúan en la técnica o tal como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden realizarse, en general, de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y tratan a lo largo de la presente especificación. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning: A 60 Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usada en relación con la química analítica, la química orgánica sintética y la química medicinal y farmacéutica descritas en el presente documento y los procedimientos y técnicas de laboratorio descritos en el presente documento son los bien conocidos y usados habitualmente en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica,

65 formulación y liberación, y tratamiento de pacientes.

Como se usa de acuerdo con la presente divulgación, se entenderá que los términos siguientes, a menos que se indique lo contrario, tal como se han empleado anteriormente y a lo largo de la divulgación tienen los significados siguientes:

5 La expresión “polinucleótido aislado” significa que el polinucleótido sujeto (1) no está asociado (de forma covalente o no covalente) con todo o una porción de otros polinucleótidos con los que el polinucleótido sujeto está asociado en la naturaleza, (2) está asociado con una molécula con la que no está asociada en la naturaleza o (3) no se produce en la naturaleza en asociación con ningún otro polinucleótido. Dicho polinucleótido aislado puede ser ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético o cualquier combinación de los mismos.

La expresión “proteína aislada” se denomina en el presente documento significa que una proteína sujeto (1) carece de al menos algunas otras proteínas con las que normalmente se encontrarían, (2) carece esencialmente de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo de la misma especie, (3) se expresa en una célula de una especie

15 diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de los polinucleótidos lípidos, hidratos de carbono u otros materiales con los que está asociada en la naturaleza, (5) no está asociada (mediante interacción covalente o no covalente) con porciones de una proteína con la que la "proteína aislada" está asociada en la naturaleza, (6) está asociada operablemente (mediante interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociado en la naturaleza o (7) no se produce en la naturaleza. ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético o cualquier combinación de los mismos puede codificar dicha proteína aislada. Preferentemente, la proteína aislada carece sustancialmente de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que interferirían con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico, de investigación o de otro tipo.

25 Los términos “polipéptido” o “proteína” significan una o más cadenas de aminoácidos, en las que cada cadena comprende aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos y en las que dicho polipéptido o proteína puede comprender una pluralidad de cadenas unidas no covalentemente y/o covalentemente entre sí mediante enlaces peptídicos, que tienen la secuencia de proteínas nativas, es decir proteínas producidas por células naturales y específicamente no recombinantes o células sometidas a ingeniería genética o recombinantes, y comprenden moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen deleciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Los términos “polipéptido” y “proteína” abarcan específicamente anticuerpos anti-IL1 R1 o secuencias que tienen deleciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de un anticuerpo anti-IL1 R1. Por tanto, un “polipéptido” o una “proteína” puede comprender una (denominado “monómero”) o una pluralidad (denominado “multímero”) de cadenas de aminoácidos.

35 La expresión “fragmento polipeptídico” se refiere a un polipéptido que puede ser monomérico o multimérico, que tiene una deleción amino terminal, una deleción carboxilo terminal y/o una deleción o sustitución interna de un polipéptido natural o producido de forma recombinante. En ciertas realizaciones, un fragmento polipeptídico puede comprender una cadena de aminoácidos de al menos 5 a aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. Se apreciará que, en ciertas realizaciones, los fragmentos tienen una longitud de al menos 5, 6,8,10,14,20,50,70,100,110,150,200,250,300,350,400, o 450 aminoácidos. Fragmentos polipeptídicos particularmente útiles incluyen dominios funcionales, incluidos dominios de unión. En el caso de un anticuerpo anti-IL1R1, fragmentos útiles incluyen, entre otros: una región de CDR, especialmente una región CDR3 de la cadena pesada o ligera; un dominio variable de una cadena pesada o ligera; una porción de una cadena de anticuerpo o

45 solo su región variable, incluidas dos CDR; y similares.

La expresión “fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional”, como se usa en el presente documento, se refiere a un fragmento polipeptídico que contiene al menos los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina. Un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la invención puede unirse a un ligando, de modo que se evita la unión del ligando a su receptor, interrumpiendo la respuesta biológica que es el resultado de la unión del ligando al receptor, o cualquier combinación de los mismos. Preferentemente, un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la invención se une específicamente a IL-1R1.

Los términos "natural" y “nativo” significan que los materiales biológicos (moléculas, secuencias, complejos

55 proteicos, células y similares) a los que se aplican los términos se pueden encontrar en la naturaleza y no están manipulados por el ser humano. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluidos virus) que se pueden aislar de una fuente de la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el hombre es natural. Asimismo, los términos “no natural” o “no nativo” se refieren a un material que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado estructuralmente o ha sido sintetizado por el hombre.

La expresión “operablemente unido” significa que los componentes a los que el término se aplica están en una relación que les deja llevar a cabo las funciones inherentes en condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia control “operablemente unida” a una secuencia codificadora de proteína está unida a ella de tal modo que se

65 consigue la expresión de la secuencia codificadora de la proteína en condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias control.

La expresión “secuencia control” significa que la secuencia polinucleotídica sujeto puede efectuar la expresión y el procesamiento de las secuencias de codificación a las que está unida. La naturaleza de dichas secuencias control puede depender del organismo huésped. En realizaciones concretas, las secuencias control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de unión al ribosoma y secuencia de terminación de la transcripción. En otras

5 realizaciones concretas, las secuencias control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencias potenciadoras de la transcripción y secuencia de terminación de la transcripción. En ciertas realizaciones, “secuencias control” pueden incluir secuencias líder y/o secuencias pareja de fusión.

El término “polinucleótido” significa polímeros de ácido nucleico monocatenario o bicatenario de al menos 10 bases de longitud. En ciertas realizaciones, los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de las bases, tales como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de ribosa, tales como 2',3'-didesoxirribosa, y modificaciones de los enlaces internucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato,

15 fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato y fosforoamidato. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.

El término “oligonucleótido” significa un polinucleótido que comprende una longitud de 200 bases o menos. En realizaciones preferidas, los oligonucleótidos tienen una longitud de 10 a 60 bases. En realizaciones preferidas, los oligonucleótidos tienen una longitud de 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases. Los oligonucleótidos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, por ejemplo para usar en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido.

La expresión “nucleótidos naturales” incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. La expresión “nucleótidos

25 modificados” incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos o modificadas o sustituidos. La expresión “enlaces oligonucleotídicos" incluye enlaces tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche y col. (1986), Nucl. Acids Res. 14:9081; Stec et al. (1984), J. Am. Chem. Soc. 106:6077; Stein et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16:3209; Zon et al. (1991), Anti-Cancer Drug Design 6:539; Zon et al. (1991), Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, ed.), Oxford University Press, Oxford England; Stec et al., patente de EE.UU. nº 5,151,510; Uhlmann and Peyman (1990), Chemical Reviews 90:543 Un oligonucleótido de la invención puede incluir un marcador, incluido un radiomarcador, un marcador fluorescente, un hapteno o un marcador antigénico, para ensayos de detección.

35 El término “vector” significa cualquier molécula (p. ej., ácido nucleico, plásmido o virus) usada para transferir la información de codificación a una célula huésped.

La expresión “vector de expresión” o “construcción de expresión” se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula huésped y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan (junto con la célula huésped) la expresión de una o más regiones de codificación heterólogas unidas operativamente al mismo. Una construcción de expresión puede incluir, entre otros, secuencias que afectan o controlan la transcripción, la traducción y el corte y empalme del ARN, si hay intrones presentes, de una región de codificación unida operablemente a la misma.

45 La expresión “célula huésped” significa una célula que se ha transformado, o que es capaz de ser transformada, con una secuencia de ácido nucleico y, de este modo, expresa un gen de interés seleccionado. La expresión incluye la progenie de la célula parental, sea o no la progenie idéntica en cuanto a morfología o a la estructura genética a la célula parental original, siempre que esté presente el gen seleccionado.

El término “transducción” significa la transferencia de genes de una bacteria a otra, normalmente mediante un fago. “Transducción” también se refiere a la adquisición y la transferencia de secuencias celulares eucariotas por retrovirus.

El término “transfección” significa la captación de ADN extraño o exógeno por una célula y una célula se ha

55 “transfeccionado” cuando se ha introducido el ADN exógeno dentro de la membrana celular. En el presente documento se divulga una serie de técnicas de transfección que son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Id.; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; y Chu et al., 1981, Gene 13:197. Dichas técnicas se pueden usar para introducir uno o más restos de ADN exógeno en células huésped adecuadas.

El término “transformación” se refiere a un cambio en las características genéticas de la célula y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener ADN nuevo. Por ejemplo, una célula se transforma cuando está modificada genéticamente con respecto a su estado nativo mediante transfección, transducción u otras técnicas. Tras la transfección o la transducción, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula al 65 integrarse físicamente en un cromosoma de la célula o se puede mantener de forma transitoria como elemento episomal sin replicarse o se puede replicar de forma independiente como plásmido. Se considera que una célula se

ha “transformado de forma estable” cuando el ADN transformante se replica con la división de la célula.

El término “antígeno” se refiere a una molécula o una porción de una molécula a la que se puede unir un agente de unión selectivo, tal como un anticuerpo, y, además, puede usarse en un animal para producir anticuerpos capaces 5 de unirse a un epítopo de dicho antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos.

El término “epítopo” incluye cualquier determinante, preferentemente un determinante polipeptídico, capaz de unirse de forma específica a una inmunoglobulina o receptor de células T. En ciertas realizaciones, los determinantes epitópicos incluyen grupos de superficie químicamente de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo, orosulfonilo y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales, así como características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que está unido a un anticuerpo. En ciertas realizaciones, se dice que un anticuerpo está unido específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. En realizaciones preferidas, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de 15 disociación es menor o igual a aproximadamente 10 nM, más preferentemente cuando la constante de disociación es menor o igual a aproximadamente 100 pM y, más preferentemente, cuando la constante de disociación es menor

o igual a aproximadamente 10 pM.

El término “identidad” se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas polipeptídicas o dos o más moléculas de ácido nucleico, determinado comparando las secuencias. En la técnica, “identidad” también significa el grado de relación de la secuencia entre moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, como puede ser el caso determinado por la correspondencia entre secuencias de dos o más nucleótidos o dos o más aminoácidos. “Identidad” mide el porcentaje de correspondencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de hueco (si hay alguna) abordadas por un modelo matemático o programa informático concreto (es

25 decir, “algoritmos”).

El término “similitud” se usa en la técnica con respecto a un concepto relacionado; no obstante, en contraste con “identidad”, “similitud” se refiere a una medida de la relación que incluye correspondencias idénticas y correspondencias de sustitución conservadora. Si dos secuencias polipeptídicas tienen, por ejemplo, 10/20 aminoácidos idénticos y el resto son todos sustituciones no conservadoras, los porcentajes de identidad y similitud sería ambos del 50 %. Si en el mismo ejemplo hay cinco posiciones más cuando hay sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad sigue siendo el 50 %, pero el porcentaje de similitud sería 75 % (15/20). Por tanto, en los casos en los que hay sustituciones conservadoras, el porcentaje de similitud entre dos polipéptidos será mayor que el porcentaje de identidad entre dichos dos polipéptidos.

35 La identidad y similitud de los ácidos nucleicos y polipéptidos relacionados se pueden calcular fácilmente mediante procedimientos conocidos. Tales procedimientos incluyen, entre otros, los descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M. ed., Oxford University Press, New York; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed.), 1993, Academic Press, New York; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, (Grifffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, 1987, Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073; and Durbin et al., 1998, Biological Sequence Analysis, Cambridge University Press.

45 Se diseñan procedimientos preferidos para determinar la identidad para dar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad se codifican en programas informáticos disponibles para el público. Los procedimientos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, entre otros, el paquete del programa GCG, incluido GAP (Devereux, J., y col., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul y col., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). El programa BLASTX está públicamente disponible por el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information) (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul y col., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul y col., (1990, anteriormente). También se puede usar el algoritmo bien conocido de SmithWaterman para determinar la identidad.

55 Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado el apareamiento de sólo una región corta de las dos secuencias, y está región alineada pequeña puede tener una identidad de secuencia muy alta incluso si no existe una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. De acuerdo con esto, en ciertas realizaciones, el procedimiento de alineación seleccionado (programa GAP) tendrá como resultado una alineación que abarca al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido diana.

Por ejemplo, usando el algoritmo informático GAP (Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI), dos polipéptidos para los que va a determinarse el porcentaje de identidad de secuencia se alinean para obtener el apareamiento óptimo de sus respectivos aminoácidos (el “tramo apareado”, tal como se determina mediante el algoritmo). En ciertas realizaciones, una sanción por apertura de huecos (que se calcula normalmente 65 como tres veces la diagonal promedio; en la que la “diagonal promedio” es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que está usándose; la “diagonal” es la puntuación o número asignado a cada aminoácido perfecto

apareado mediante la matriz de comparación concreta) y una sanción por extensión de huecos (que es normalmente un décimo de la sanción de apertura de huecos), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan junto con el algoritmo En ciertas realizaciones, el algoritmo también usa una matriz de comparación convencional (véase Dayhoff y col, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(345)(1978) para la

5 matriz de comparación PAM 250Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:1091510919 para la matriz de comparación BLOSUM 62).

En ciertas realizaciones, los parámetros para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman et al. (1970), J. Mol. Biol. 48:443-453;

Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff y col., (1992) anteriormente;

Sanción por hueco: 12 15 Sanción de longitud de hueco: 4

Umbral de similitud: 0

El programa GAP puede ser útil con los parámetros anteriores. En ciertas realizaciones, los parámetrosmencionados anteriormente son los parámetros predeterminados para comparaciones de polipéptidos (junto con ausencia de sanción por huecos finales) usando el algoritmo GAP.

El término “natural”, como se usa para hacer referencia a los aminoácidos, se refiere a los veinte aminoácidos 25 convencionales. Véase Immunology -A Synthesis, 2ª Edición, (E.S. Golub y D. R. Gren, Eds.) Sinauer Associates: Sunderland, MA (1991)

Los análogos peptídicos se usan habitualmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan “miméticos peptídicos” o “peptidomiméticos”. Véase Fauchere (1986), Adv. Drug Res. 15:29; Veber & Freidinger, 1985, TINS p.392; y Evans et al. (1987), J. Med. Chem. 30:1229, que se incorpora en el presente documento por referencia para cualquier fin. Dichos compuestos a menudo se desarrollan con la ayuda de modelación molecular computerizada. Los miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares 35 a un péptido o polipéptido paradigma (es decir, un péptido o polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo constituido por: -CH2NH-, -CH2S-,-CH2-CH2-, CH=CH-(cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-y -CH2SO--, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo

(p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) también puede usarse en ciertas realizaciones para generar péptidos más estables. Además, se pueden generar péptidos constreñidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante procedimientos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992); por ejemplo, mediante la adición de residuos internos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

45 “Anticuerpo” o “péptido(s) de anticuerpo(s)” se refiere a un anticuerpo intacto o a un fragmento de unión del mismo que compite con el anticuerpo intacto para la unión específica e incluye anticuerpos biespecíficos quiméricos, humanizados y completamente humanos. En ciertas realizaciones, los fragmentos de unión se producen mediante técnicas de ADN recombinante. En realizaciones adicionales, los fragmentos de unión se producen mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv y anticuerpos de cadena sencilla.

La expresión “cadena pesada” incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad para IL-1R1. Una cadena pesada de 55 longitud completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de la región constante, CH1, CH2 y CH3. El dominio VH está en el extremo amino del polipéptido y el dominio CH3 está en el extremo carboxilo.

La expresión “cadena ligera” incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad para IL-1R1. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de la región variable, VL, y un dominio de la región constante, CL. Como la cadena pesada, el dominio de la región variable de la cadena ligera está en el extremo amino del polipéptido.

Un “fragmento Fab” está compuesto por una cadena ligera y las regiones CH1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un puente disulfuro con otra molécula de la cadena pesada. 65 Un “fragmento Fab'” contiene una cadena ligera y una cadena pesada que contiene más de la región constante,

entre los dominios de CH1 y CH2, de modo que se puede formar un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas para formar una molécula F(ab')2.

Un “fragmento F(ab')2” contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región

5 constante entre los dominios CH1 y CH2, de modo que se puede formar un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas. .

La “región Fv” comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, pero carece de las regiones constantes.

“Anticuerpos de cadena sencilla” son moléculas Fv en las que las regiones variables de la cadena pesada y ligera se han conectado mediante un ligador flexible para formar una cadena polipeptídica sencilla, que forma una región de unión a antígeno. Los Anticuerpos de cadena sencilla se tratan con detalle en la publicación de solicitud de patente

15 internacional nº WO 88/01649 y las patentes de EE.UU. nº 4.946.778 y 5.260.203,

Se entiende que un “anticuerpo bivalente” aparte de un anticuerpo “multiespecífico” o “multifuncional”, en ciertas realizaciones, comprende sitios de unión que tienen idéntica especificidad antigénica.

Un anticuerpo “biespecífico” o “afuncional” es un anticuerpo híbrido que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante diversos procedimientos, incluidos, entre otros, fusión de hibridomas o unión del fragmento Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148:1547-1553.

25 Al evaluar la unión y especificidad del anticuerpo de acuerdo con la invención, un anticuerpo “inhibe sustancialmente” la adhesión de un ligando a un receptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor unido al contrarreceptor en al menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 85% o más (medido en un ensayo de unión competitiva in vitro),

El término “agente” significa un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto hecho de materiales biológicos.

Los términos “marcador” o “marcado” se refiere a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo mediante incorporación de un aminoácido radiomarcado o la fijación a un polipéptido de restos de biotina que se puede 35 detectar mediante avidina marcada (p. ej., estreptavidina que, preferentemente, comprende un marcador detectable tal como un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente o una actividad enzimática que se puede detectar mediante procedimientos ópticos o colorimétricos). En ciertas realizaciones, el marcador también puede ser terapéutico. En la técnica se conocen varios procedimientos de marcaje de polipéptidos y glicoproteínas y se pueden usar de forma ventajosa en los procedimientos divulgados en el presente documento. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, entre otros, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (p. ej., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99mTc,111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (p. ej., isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, fósforos lantánidos), marcadores enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, marcadores de hapteno tales como grupos de biotinilo y epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej., pares de secuencias en cremallera de leucina,

45 sitios de union para anticuerpos secundarios, dominios de union a metal, colas del epítopo). En ciertas realizaciones, los marcadores están unidos por brazos espaciadores (tales como (CH2)n, donde n < aproximadamente 20) de varias longitudes para reducir la potencial hidrancia estérica.

La expresión “muestra biológica” incluye, entre otros, cualquier cantidad de una sustancia de algo vivo o algo antes vivo. Dichos algos vivos incluyen, entre otros, seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. Dichas sustancias incluyen, entre otros, sangre, suero, orina, células, órganos, tejidos, hueso, médula ósea, linfa, ganglios linfáticos, tejido sinovial, condrocitos, macrófagos sinoviales, células endoteliales, tejido vascular (tejido vascular particularmente inflamado) y piel. Las expresiones “agente farmacéutico” y “fármaco” se refieren a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra

55 adecuadamente a un paciente.

El término “paciente” incluye sujetos humanos y veterinarios.

A menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluyen pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.

Aminoácidos

Los veinte aminoácidos naturales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology -A Synthesis,

65 2ª Edición, (E.S. Golub y D. R. Gren, Eds.) Sinauer Associates: Sunderland, MA (1991). Los estereoisómeros (p. ej., D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos α-, αdisustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetillisina, ε-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, Nformilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, σ-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (p. ej.,

5 4-hidroxiprolina). En la notación polipeptídica usada en la presente memoria descriptiva, la dirección izquierda es la dirección aminoterminal y la dirección derecha es la dirección carboxiterminal, de acuerdo con el uso estándar y la convención.

De forma similar, a menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótidos monocatenarias es el extremo 5’; la dirección izquierda de las secuencias de polinucleótidos bicatenarias se denomina la dirección 5’. La dirección de adición de 5’ a 3’ de los tránscritos de ARN naciente se denomina la dirección de transcripción; las regiones de la secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ADN y son 5’ al extremo 5’ del tránscrito de ARN se denominan “secuencias corriente arriba”; las regiones de la secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el tránscrito de ARN que están en 3’ del extremo

15 3’ del tránscrito de ARN se denominan “secuencias corriente abajo”.

Se apreciará que los residuos de aminoácidos naturales pueden dividirse en clases basándose en propiedades de cadena lateral comunes:

1) Hidrófobos: norleucina (Nor o Nle), Met, Ala, Val, Leu, lle;

2) Hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) Ácidos: Asp, Glu;

25 4) Básicos: His, Lys, Arg;

5) Residuos que influyen en la orientación de las cadenas: Gly, Pro; y

6) Aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones de aminoácidos no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases con un miembro de la misma clase. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden abarcar residuos de aminoácidos no naturales, que normalmente se incorporan mediante síntesis peptídica química en lugar

35 de síntesis en sistemas biológicos. Estas incluyen peptidomiméticos y otras formas reversas o invertidas de restos aminoácidos.

Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases con un miembro de otra clase. Dichos residuos sustituidos se pueden introducir, por ejemplo, en regiones de un anticuerpo humano que son homólogas con los anticuerpos no humanos o en las regiones no homólogas de la molécula.

Al realizar dichas sustituciones, de acuerdo con ciertas realizaciones, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de su hidrofobicidad y características de carga. Éstos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina

45 (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Generalmente, en la técnica se entiende la importancia del índice hidropático de los aminoácidos a la hora de conferir la función biológica interactiva sobre una proteína (véase, por ejemplo, Kyte y col., J. Mol. Biol., 157:105131). Se sabe que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y siguen conservando una actividad biológica similar. Al realizar cambios en base al índice hidropático, en ciertas realizaciones, se puede incluir la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están en ± 2. En ciertas realizaciones, se incluyen los que están dentro de ±1, y, en ciertas realizaciones, están incluidos

55 aquéllos dentro de ±0,5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar de forma eficaz sobre la base de la hidrofilicidad, particularmente cuando la proteína o péptido biológicamente funcional creado de este modo está destinado al uso en realizaciones inmunológicas, como se divulgan en el presente documento. En ciertas realizaiones, la hidrofilicidad promedio local mayor de un aproteína está dirigida por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigeneicidad, es decir con una propiedad biológica de la proteína.

A estos residuos de aminoácidos se les ha asignado los siguientes valores de hidrofilicidad: arginina (+3,0); lisina

65 (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Al realizar cambios en base a valores de hidrofilicidad similares, en ciertas realizaciones se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, en ciertas realizaciones se incluyen los que están dentro de ±1 y en ciertas realizaciones se incluyen aquéllos dentro de ± 0,5. También se pueden identificar epítopos de secuencias de aminoácidos primarias sobre la base de la hidrofilicidad. Estas regiones también se denominan “regones centrales epitópicas".

Ejemplos de sustituciones de aminoácidos se exponen en la Tabla 1.

Tabla 1

Sustituciones de aminoácidos

Residuos originales

Ejemplos de sustituciones Sustituciones preferidas

Ala

Val, Leu, lle Val

Arg

Lys, Gin, Asn Lys

Asn

Gin Gln

Asp

Glu Glu

Cys

Ser, Ala Ser

Gin

Asn Asn

Glu

Asp Asp

Gly

Pro, Ala Ala

His

Asn, Gin, Lys, Arg Arg

lie

Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucine Leu

Leu

Norleucina, lie, Val, Met, Ala, Phe lle

Lys

Arg, 1,4 ácido diamino-butírico, Gln, Asn Arg

Met

Leu, Phe, lle Leu

Phe

Leu, Val, lle, Ala, Tyr Leu

Pro

Ala Gly

Ser

Thr, Ala, Cys Thr

Thr

Ser Ser

Trp

Tyr, Phe Tyr

Tyr

Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val

lle, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu

10 Un experto en la técnica podrá determinar variantes adecuadas de los polipéptidos, tal como se expone en el presente documento, usando técnicas bien conocidas. En ciertas realizaciones, un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que se pueden cambiar sin destruir la actividad dirigiendo a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. En otras realizaciones, el experto en la técnica puede identificar

15 residuos o porciones de las moléculas que están conservados entre polipéptidos similares. En realizaciones adicionales, incluso las áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden estar sujetas a sustituciones conservadoras de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin afectar de forma adversa a la estructura del polipéptido.

20 Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar estudios de estructura-función identificando residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o la estructura. En vista de esta comparación, el experto en la técnica puede predecir la importancia de los residuos de aminoácidos en una proteína que corresponden a los residuos de aminoácidos que son importantes para la actividad o la estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para dichos residuos de

25 aminoácidos importantes predichos.

El experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con dicha estructura en polipéptidos similares. En vista de tal información, los expertos en la técnica pueden predecir la alineación de restos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura de tres dimensiones.

En ciertas realizaciones, un experto en la técnica pueden elegir no realizar cambios radicales em los residuos de aminoácidos predichos que están sobre la superficie de la proteína, ya que tales residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de ensayo que contienen una sola sustitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes

5 después se pueden seleccionar usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la técnica. Tales variantes se pueden usar para acumular información sobre variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un residuo de aminoácido particular dio como resultado la destrucción, reducción de manera no deseada, o no adecuada, de la actividad, las variantes con tal cambio se podrían evitar. En otras palabras, basándose en la información acumulada a partir de tales experimentos de rutina, el experto en la técnica puede fácilmente determinar los aminoácidos en los que se deben evitar las sustituciones, bien solas o en combinación con otras mutaciones.

Se han dedicado numerosas publicaciones científicas a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 15 113:211 -222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; and Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Además, actualmente se dispone de programas informáticos que ayudarán a predecir la estructura secundaria. Un procedimiento de predicción de la estructura secundaria se basa en la modelación de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia de más de 30%, o similitud mayor que 40% a menudo tienen topologías estructurales similares. El crecimiento reciente de la base de datos estructural de la proteína (PDB) ha proporcionado una capacidad de protección potenciada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos dentro de una estructura de los polipéptidos o proteínas. Véase Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Se ha sugerido (Brenner y col., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369 -376) que existe un número limitado de plegamientos en un polipéptido o proteína dados y que una vez que se ha resuelto un número crítico de estructuras, la predicción

25 estructural llegará a ser notablemente más precisa.

Procedimientos adicionales de predicción de la estructura secundaria incluyen el “enhebrado” (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19); el "análisis del perfil" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:43554358) y el “enlace de evolución” (véase, Holm, 1999, supra-, y Brenner, 1997, supra).

En ciertas realizaciones, las variantes de anticuerpos incluyen variantes de glicosilación en las que el número y/o tipo del sitio de glicosilación se han alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos del polipéptido parental. En ciertas realizaciones, las variantes de proteínas incluyen un número mayor o menor de sitios de 35 glicosilación unidos por N que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación unido a N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que el residuo de aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un posible sitio nuevo para la adición de una cadena de hidrato de carbono unida a N. Como alternativa, las sustituciones que eliminan está secuencia retirarán una cadena de hidrato de carbono unida a N existente. También se proporciona una reorganizacióm de cadenas de hidratos de carbono unidas a N, en las que se eliminan uno o más sitios de glicosilación unidos N (normalmente aquéllos que se producen de manera natural) y se crean uno o más sitios unidos a N nuevos. Variantes de anticuerpos adicionales preferidas incluyen variantes de cisteína en las que uno o más residuos de cisteína se delecionan o sustituyen por otro aminoácido (p. ej., serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos parental. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos se

45 deben volver a plegar en una conformación biológicamente activa, tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. En general, las variantes de cisteína tienen menos residuos de cisteína que la proteína nativa y normalmente tienen un número par para minimizar las interacciones resultantes de cisteínas no apareadas.

De acuerdo con ciertas realizaciones, las sustituciones aminoacídicas son aquéllas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión y/o (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos polipéptidos. De acuerdo con ciertas realizaciones, las sustituciones sencillas

o múltiples de aminoácidos (en ciertas realizaciones, sustituciones conservadoras de aminoácidos) pueden realizarse en la secuencia natural (en ciertas realizaciones en la porción del polipéptido fuera del(los) dominio(s) que

55 forman contactos intermoleculares). En realizaciones preferidas, una sustitución conservadora de aminoácido normalmente no cambia sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (p. ej., un reemplazo de aminoácido no debería tender a romper una hélice que se encuentre en la secuencia parental o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Ejemplos se estructuras polipeptídicas secundarias y terciarias reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and

J. Tooze, eds.) 1991, Garland Publishing, New York. N.Y. (1991 )); y Thornton y col. (1991), Nature 354:105 .

Preparación de anticuerpos

65 Las unidades estructurales de los anticuerpos naturales normalmente comprenden un tetrámero. Cada uno de estos tetrámeros normalmente está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, en el que cada par tiene una cadena ligera de longitud completa (normalmente de un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena pesada de longitud completa (normalmente de un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena normalmente incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que normalmente es responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de

5 cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas normalmente se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas normalmente se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. La IgG tiene varias subclases, incluidas, entre otras, gG1, lgG2, lgG3, e lgG4. La IgM tiene varias subclases, incluidas, entre otras, IgM 1 e lgM2. La IgA se subdivide de forma similar en subclases, incluidas, entre otras, IgA1 e lgA2. Dentro de las cadenas ligera y pesada de longitud completa, normalmente una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos une la región variable y las regiones constantes, la cadena pesada también incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, Ch. 7, 2nd ed., (Paul, W., ed.), 1989, Raven Press, N.Y. La combinación de las regiones varianles de cada par de cadena ligera/cadena pesada normalmente forma el sitio de unión a antígeno.

15 Las regiones variables de cada una de las cadenas pesadas y cadenas ligera normalmente exhibem la misma estructura general que comprende cuatro regiones estructuras (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la comlementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par normalmente están alineadas por las regiones estructurales, alineación que puede permitir la unión a un epítopo específico. Del extremo N al extremo C, las regiones variables de tanto las cadenas ligeras como las pesadas normalmente comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio normalmente se realiza de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901 -917, o Chothia et al., 1989, Nature

25 342:878-883).

Los anticuerpos pasaron a ser útiles y de interés como agentes farmacéuticos con el desarrollo de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se producen usando cualquier procedimiento que produce moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Ejemplos de procedimientos adecuados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen los procedimientos de hibridoma de Kohler et al. (1975, Nature 256:495-497) y el procedimientos de hibridoma de células B (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; y Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63).

Los anticuerpos monoclonales se pueden modificar para usar como terapéuticos. Un ejemplo es un anticuerpo

35 “quimérico” en el que una porción de la cadena pesada y/o la cadena ligera es idéntica u homóloga a una correspondiente secuencia en los anticuerpos derivados de una especie concreta o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo concreto, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es/son idénticas u homólogas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o pertenencientes a otra clase o subclase de anticuerpo. Otros ejemplos son fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. Véase, la patente de EE.UU. nº 4.816.567 y Morrison et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 6855. Un desarrollo relacionado es el anticuerpo “injertado en CDR”, en el que el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una especie concreta o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo concreto, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es/son idénticas u homólogas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o pertenencientes a otra clase o subclase de

45 anticuerpo.

Otro desarrollo es el anticuerpo “humanizado”. En la técnica se conocen procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos (Véanse las patentes de EE.UU. nº 5.585.089 y 5.693.762). En general, un anticuerpo humanizado se produce en un animal no humano y, después, ciertos residuos de aminoácidos, normalmente de porciones que no reconocen antígenos del anticuerpo, se modifica para que sea homólogo a dichos residuos en un anticuerpo humano del isotipo correspondiente. La humanización se puede realizar, por ejemplo, usando procedimientos descritos en la técnica (Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536), sustituyendo al menos una porción de una region variable de roedor para las regions correspondientes de un anticuerpo humano.

55 Más reciente y más prometedor es el desarrollo de anticuerpos humanos sin exposición del antígeno al ser humano (“anticuerpos completamente humanos”). Usando animales transgénicos (p. ej., ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina de ratón endógena, dichos anticuerpos se producen mediante inmunización con un antígeno (que normalmente tiene al menos 6 aminoácidos continguos), opcionalmente conjugado con un vehículo. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; and Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. En un ejemplo de estos procedimientos, los animales transgénicos se producen incapacitando los loci de inmunoglobulina de ratón endógena que codifica las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de ratón e insertando los loci que codifican las proteínas de las cadenas pesada y ligera humans en

65 el genoma del mismo. Animales parcialmente modificados, que tienen menos que el complemento completo de modificaciones, se cruzan para obtener un animal que tiene todas las modificaciones deseadas del sistema inmunitario. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos que son inmunoespecíficos de estos antígenos que tienen secuencias de aminoácidos humanas (en lugar de murinas), incluidas las regiones variables. Véanse las publicaciones PCT W096/33735 y W094/02602. Procedimientos adicionales se describen en la patente de EE.UU. nº 5,545,807, las publicaciones de PCT Nº W091/10741,

5 W090/04036, y en los documentos EP 546073B1 y EP 546073A1. Los anticuerpos humanos también se pueden producir mediante la expresión de ADN recombinante en células huésped o mediante la expresión en células de hibridoma, como se describe en el presente documento.

Los anticuerpos completamente humanos también se pueden producir a partir de bibliotecas de expresión en fagos

10 (como se divulga en Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Estos procesos simulan la selección inmunitaria a través de la expresión de repertorios de anticuerpos sobre la superficie de bacteriofagos filamentosos y la posterior selección de fagos mediante su unión a un antígeno de elección. Una de estas técnicas se describe en la publicación PCT nº W099/10494, que describe el aislamiento de anticuerpos de alta afinidad y agonistas funcionales para receptors de MPL, y msk, usando dicho abordaje.

15 Una vez que se han determinado las secuencias nucleotídicas que codifican dichos anticuerpos, los anticuerpos quiméricos, injertados en CDR, humanizados y completamente humanos también se pueden producir mediante procedimientos recombinantes. Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos se introducen en células huésped y se expresan usando materiales y procedimientos generalmente conocidos en la técnica.

20 La invención proporciona uno de una pluralidad de anticuerpos monoclonales completamente humanos contra IL1R1 humano. Preferentemente, los anticuerpos se unen al tercer dominio de IL-1 R1. En realizaciones preferidas, la invención proporciona secuencias nucleotídicas que codifican, y secuencias de aminoácidos que comprenden, moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, en particular secuencias que corresponden a las regiones

25 variables de las mismas. En realizaciones preferidas, se proporcionan las secuencias correspondientes a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), específicamente de CDR1 a CDR3. En realizaciones adicionales preferidas, la invención proporciona líneas celulares de hibridoma que expresan dichas moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos monoclonales producidos a partir de ellas, más preferentemente anticuerpos monoclonales humanos purificados contra IL-1R1 humano.

30 La capacidad para clonar y reconstruir loci humano de tamaño de megabases en cromosomas artificiales de levadura (YAC) y para introducirlos en la línea germinal de ratón proporciona un abordaje ventajoso para deducir los componentes funcionales de loci muy grandes mapeados, así como generar modelos útiles de enfermedad humana. Además, la utilización de esta tecnología para sustituir los loci de ratón con sus equivalentes humanos proporciona

35 información única sobre la expresión y regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas, y su implicación en la inducción y progresión de la enfermedad.

Una aplicación práctica importante de dicha estrategia es la “humanización” del sistema inmunitario humoral de ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina (Ig) humana en ratones en los que los genes de Ig endógena se

40 han inactivado ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos subyacentes a la expresión programada y el ensamblaje de los anticuerpos, así como su papel en el desarrollo de células B. Además, dicha estrategia proporciona una fuente para la producción de anticuerpos monoclonales (MAb) humanos, particularmente para usar como agentes terapéuticos. Cabe esperar que los anticuerpos completamente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a Mab de ratón o derivados de ratón y, de este modo, que incrementen la

45 eficacia y la seguridad de los anticuerpos administrados en aplicaciones terapéuticas. Los anticuerpos completamente humanos se pueden usar en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como osteoartritis, artritis reumatoide y otras afecciones inflamatorias, el tratamiento de las mismas requiere la administración repetida de anticuerpos.

50 Un experto en la técnia puede realizar ingeniería genética de cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con fragmentos grandes de los loci de Ig humana de modo que dichos ratones producen anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los fragmentos grandes de Ig humana pueden conservar la gran diversidad génica variable, así como la regulación adecuada de producción y expresión de anticuerpos. Explotando la maquinaria del ratón para diversificar y seleccionar anticuerpos y la falta de tolerancia

55 inmunológica a proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducidos en estas cepas de ratón da anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluidos antígenos humanos. Usando la tecnología del hibridoma, se pueden producir y seleccionar Mab humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada.

60 En ciertas realizaciones, el experto en la técnica puede usar regiones constantes de especies distintas a la humana junto con la(s) región(es) variable(s) humana(s) en dichos ratones para producir anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos de la invención se pueden producir inmunizando dichos animales con el IL-1 R1, formas solules de IL1R1, o un fragmento del mismo. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional WO 93/12227).

65 Las CDR de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos anti-IL-1 R1 de la invención se pueden injertar en las regions estructurales (FR) de la misma, u otra, especie. En ciertas realizaciones, los CDR de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos anti-IL-1 R1 se pueden injertar en FR humanos consenso. Para crear FR humanas consensi, las FR de varias secuencias de aminoácidos de la cadena

5 pesada o la cadena ligera humanas se alinean para identificar una secuencia de aminoácidos consenso. Las FR de la cadena pesada o la cadena ligera den anticuerpo anti-IL-1 R1 se pueden sustituir con las FR de una cadena pesada o cadena ligera diferente. Los aminoácidos raros en las FR de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-IL-1 R1 normalmente no se reemplazan, mientras que el resto de los aminoácidos de FR se pueden sustituir. Los aminoácidos raros son aminoácidos específicos que están en posiciones en las que normalmente no se encuentran en las FR. Las regiones variables injertadas de anticuerpos anti-IL-1 R1 de la invención s epueden usar con una region constante que es diferente de la region constante del anticuerpo anti-IL-1 R1. Como alternativa, las regiones variables injertadas son parte de un anticuerpo Fv de cadena sencilla. El injerto de CDR se describe en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089, y 5,530,101, .

15 En ciertas realizaciones, la invención proporciona anticuerpos anti-IL1-R1 que comprenden una reguón CDR1 de la cadena pesada humana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 63; una región CDR2 de la cadena pesada humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 66; y/o una región CDR3 de la cadena pesada humana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 69.

En otras realizaciones, la invención proporciona anticuerpos anti-IL1-R1 que comprenden una reguón CDR1 de la cadena ligera humana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 71; una región CDR2 de la cadena pesada humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 73; y/o una región CDR3 de la cadena pesada humana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 75.

25 Los anticuerpos de la invención se preparan, preferentemente, usando ratones transgénicos que tienen una porción sustancial del locus productor del anticuerpo humano insertado en las células productoras de anticuerpos de los ratones y que, además, se someten a ingeniería para que sean deficientes en la producción de anticuerpos murinos endógenos. Diichos ratones son capaces de producir moléculas de inmunoglobulina humana y anticuerpos humanos, y no producen o producen cantidades sustancialmente reducidas de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos. Las tecnologías usadas para alcanzar este resultado se divulgan en las patentes, solicitudes y referencias divulgadas en la especificación del presente documento. En realizaciones preferidas, el trabajador experto puede usar procedimientos tales como los divulgados en la publicación de la solicitud de patente internacional nº WO 98/24893. Véase también Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156.

35 Los anticuerpos monoclonales (Mab) de la invención se pueden producir mediante diversas técnicas, incluida la metodología de anticuerpos monoclonales convencionales, por ejemplo la técnica de hibridación de células somáticas estándar de Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495. Aunque se prefieren los procedimeintos de hibridación de células somáticas, en principio se pueden usar otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo transformación viral u oncogénica de linfocitos B.

En una realización preferida, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra IL-1 R1 se pueden generar usando ratones denominados ratones "HuMab”, contienen un minilocus del gen de inmunoglobulina humana que codifica las secuencias de inmunoglobulina de la cadena pesada (μ y γ) y la cadena ligera κ, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de las cadenas μ y κ. Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859. De 45 acuerdo con esto, los ratones exhiben menor expression de IgM o κ y en respuesta a la inmunización, los transgenes de la cadena pesada y ligera humanas sufren desplazamiento de clase y mutación somática para generar anticuerpos monclonales IgG κ humana de alta afinidad. Lonberg etal., supra; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546. La preparación de ratones HuMab se describe con detalle en Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberget al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al.,1994,I ternational Immunology 6:579-591; Lonberg & Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding & Lonberg, 1995,Ann.

N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851 . Véanse también las patentes de EE.UU. números 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318;

55 5,874,299; and 5,770,429; all to Lonberg y Kay, así como la patente de EE.UU. nº 5,545,807 de Surani etal.; las publicaciones de slicitud de patente internacional nº WO 93/1227, publicada el 24 de junio de 1993; el documento WO 92/22646, publicado el 23 de diciembre de 1992; y el documento WO 92/03918, publicado el 19 de marzo de1992, Como alternative, las cepas de ratones transgénicos HCo7 y HCo12 descritos en los Ejemlos siguientes se pueden usar para generar anticuerpos anti-IL-1 R1 humanos.

De forma ventajosa, los anticuerpos monoclonales completamente humanos específicos de IL-1 R1 se producen del siguiente modo. Los ratones transgénicos que contienen genes de inmunoglobulina humana se inmunizan con el antígeno relacionado con IL-1 R1 de interés. Se obtienen células linfáticas (tales como los linfocitos B) de los ratones que expresan anticuerpos. Dichas células recuperadas se fusionan con una línea celular de tipo mieloide para 65 preparar líneas celulares de hibridoma inmortales y dichas líneas celulares de hibridoma se someten a detección selectiva y se seleccionan para identificar las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos del

antígeno de interés. En ciertas realizaciones, se proporciona la producción de una línea celular de hibridoma que produce anticuerpos específicos de IL-1 R1.

En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la invención son producidos por líneas de hibridoma. En estas

5 realizaciones, los anticuerpos de la invención se unen al IL-1 R1 con una constante de disociación (Kd) de entre aproximadamente 4 pM y 100 pM. En ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos se unen al IL-1 R1 con una Kd inferior a aproximadamente 20 pM. En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención se unen al tercer dominio de IL-1 R1. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos del terder dominio de IL1 -R1 humano y de rata se muestran en la Figura 17.

En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la invención son del isotipo lgG1, lgG2 o lgG4, siendo el isotipo lgG2 más preferido. En realizaciones preferidas de la invención, los anticuerpos comprenden una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgG 1, lgG2 o lgG4. En realizaciones concretas, las regiones variables de los anticuerpos está ligadas a una región constante distinta a la región constante del isotipo lgG1, lgG2 o lgG4. En

15 ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención se han clonado para expresión en células de mamífero.

En ciertas realizaciones, las sustituciones conservadoras de aminoácidos en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-IL-1 R1 (y las correspondientes modificaciones en los nucleótidos codificadores) produciran anticuerpos anti-IL-1 R1 que tienen características funcionales y químicas similares a las del anticuerpo anti-IL-1 R1. En contraste con esto se pueden realizar modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas del anticuerpo anti-IL-1 R1 seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura del armazín molecular en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación en lámina o en hélic, (b) de la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) del grueso de la cadena lateral.

25 Por ejemplo, una “sustitución de aminoácido conservadora” puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo, de modo que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del residuo de aminoácido en dicha posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido se puede sustituir también con alanina, como se ha descrito anteriormente para "mutagénesis que abarca alanina" (Wells, 1991, Methods Enzymol. 202:390 (ed. J.J. Langone), Academic Press, London).

Los expertos en la técnica pueden determinar sustituciones de aminoácidos deseadas (conservadoras o no conservadoras) en el momento en el que se deseen dichas sustituciones. En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos se pueden usar para identificar residuos importantes de anticuerpos anti-IL-1 R1 o incrementar o

35 disminuir la afinidad de los anticuerpos anti-IL-1 R1 descritos en el presente documento.

En realizaciones alternativas, los anticuerpos de la invención se pueden expresar en líneas celulares distintas a las líneas celulares de hibridoma. En estas realizaciones, se pueden usar las secuencias que codifican anticuerpos concretos para la transformación de una célula huésped de mamífero adecuada. De acuerdo con estas realizaciones, la transformación se puede conseguir usando cualquier procedimiento cnocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluidos, por ejemplo, envasado del polinucleótido en un viruos (o en un vector viral) y transduccionedo una célula huésped con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica. Dichos procedimientos se ejemplifican en las patentes de EE.UU. nº 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, y 4,959,455. En general, el procedimiento de transformación usado puede depender del huésped que se

45 va a transformar. En la técnica se conocen bien procedimientos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero e incluyen, entre otros, transfección mediada por dextrano, precipitación en fosfato cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del(los) polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos.

De acuerdo con ciertas realizaciones de los procedimientos de la invención, una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una región constante de la cadena pesada, una región variable de la cadena pesada, una región constante de la cadena ligera o una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-IL-1R1 de la invención se inserta en un vector de expresión adecuado usando técnicas de unión estándar. En una realización preferida, la región constante de la cadena pesada o ligera de IL-1R1 se une al extremo C de la

55 región variable adecuada y se liga en un vector de expresión. Normalmente, el vector se selecciona de modo que sea funcional en la célula huésped concreta empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped de un modo tal que se puede producir la amplificación del gen y/o la expresión del gen). Para una revision de los vectores de expression, véase, Goeddel (ed.), 1990, Meth. Enzymol. Vol. 185, Academic Press. N.Y.

Normlamente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células huésped contendrán secuencias para mantenimiento de plásmidos y para clonación y expresión de secuencias nucleotídicas exógenas. Dichas secuencias, en conjunto denominadas “secuencias flanqueantes”, en ciertas realizaciones, normalmente incluirán una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un 65 origen de replicación, una secuencia de terminación de la transcripción, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de corte y empalme donante y aceptora, una secuencia que codifica una secuencia líder para la

secreción de polipéptidos, un sitio de unión a ribosoma, una secuenca de poliadenilación, una región poliligadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se va a expresar y un elemento marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se trata más adelante.

5 Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia que codifica una “marca”, es decir una molécula de oligonucleótido localizada en el extremo 5' o 3’ de la secuencia que codifica el polipéptido IL-1R1; la secuencia de oligonucleótido codifica poliHis (tal como hexaHis) u otra “marca”, tal como FLAG, HA (virus de la hemaglutinina influenza) o myc para los que existen anticuerpos comercialmente disponibles. Esta marca normalmente de condensa con el polipéptido tras la expresión del polipéptido y puede servir como medio para purificiación por afinidad o detección del anticuerpo de IL-1 R1 de la célula huésped. La purificiación por afinidad se puede conseguir mediante, por ejemplo, cromatografía en columna usando anticuerpos contra la marca como matriz de afinidad. Opcionalmente, la marca puede eliminarse después del polipéptido IL-1 R1 purificado por varios medios, tal como usando ciertas peptidasas para escisión.

15 Las secuencias flanqueantes pueden ser homólogas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heterólogas (es decir, de una especie dsitinta a la especie o cepa de la célula huésped, híbridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), sintéticas o nativas. Como tal, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en la maquinaria de la célula huésped y pueda ser activada por éste.

Las secuencias flanqueantes útiles e los vectores de la presente invención se pueden obtener mediante varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Normalmente, las secuencias flanqueantes útiles en la presente invención se han identificado previamente mediante mapeo y/o mediante digestión con endonucleasas de restricción

25 y, por tanto, se pueden aislar de la fuente de tejido adecuada usando las endonucleasas de restricción adecuadas. En algunos casos, se puede conocer la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia flanqueante. Aquí, la secuencia flanqueante se puede sintetizar usando los procedimientos descritos en el presente documento para síntesis de ácido nucleico o clonación.

Cuando se conoce toda, o sola una porción, de la secuencia flanqueante, se puede obtener usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o mediante detección selectiva de una biblioteca genómica con una sonda adecuada tal como un oligonucleótido y/o fragmento de secuencia flanqueante de la misma u otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, se puede aislar un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante de una pieza de ADN más grande que puede contener, por ejemplo, una secuencia de codificación o

35 incluso otro gen o genes. El aislamiento se puede conseguir mediante digestión con endonucleasas de restricción para producir el fragmento de ADN adecuado, seguido de aislamiento usando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna Qiagen® (Chatsworth, CA) u otros procedimientos conocidos para el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para conseguir este fin será evidente para los expertos en la técnica.

Normalmente, un origen de replicación es parte de los vectores de expresión procariotas adquiridos comercialmente y el origen ayuda en la amplificación del vector en la célula huésped. Si el vector de elección no contiene un origen de replicación, se puede sintetizar químicamente uno en base a una secuencia conocida y se puede ligar en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias gramnegativas y varios orígenes virales (p. ej., SV40, polioma, adenovirus, virus de

45 la estomatitis vesicular (VSV) o virus del papiloma, tal como HPV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamífero. En general, el componente origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión en mamífero (por ejemplo, el origen de SV40 a menudo se usa únicamente porque también contiene el promotor temprano del virus).

Normalmente, una secuencia de terminación de la transcripción se localiza en 3’ hasta el final de una región de codificación del polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Habitualmente, una secuencia de terminación de la transcripción en células procariotas es un fragmento rico en G-C, seguido de una secuencia de poli-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente a partir de una biblioteca, o incluso adquirirse comercialmente como parte de un vector, también se puede sintetizar fácilmente usando procedimientos para la síntesis de ácidos nucleicos,

55 tales como las descritas en el presente documento.

Un gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula huésped cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, tetraciclina o kanamicina para las células huésped procariotas, (b) complementan deficiencias auxótrofas de la célula o (c) suministran nutrientes cruciales no disponibles en el medio complejo o el definido. Marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina. También se puede usar un gen de resistencia a neomicina para la selección en células huésped procariotas y eucariotas.

65 Otros genes seleccionables se pueden usar para amplificar el gen que se va a expresar. La amplificación es el proceso en el cual los genes que tienen mayor demanda para la producción de una proteína crucial para el crecimiento o la supervivencia celular se repiten, en general en tándem, con los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidina quinasa sin promotor. Los transformantes celulares de mamífero se colocan bajo presión de selección, de modo que solo los transformantes son adaptados.

5 para sobrevivir en virtud del gen seleccionable presente en el vector. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio aumenta sucesivamente, de modo que lleva a la amplificación del gen seleccionable y del ADN que codifica otro gen, tal como el polipéptido IL-1R1 que comprende el vector. Como resultado se sintetizan mayores cantidades de un polipéptido, tal como el polipéptido IL-1R1 a partir del AND amplificado.

Normalmente se necesita un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción del ARNm y se caracteriza por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia de Kozak (eucariotas). Normalmente el elemento se localiza en 3' del promotor y en 5' de la secuencia de codificación del polipéptido que se va a expresar.

15 En algunos casos, tal como cuando se desea glicosilación en un sistema de expresión de células huésped eucarióticas, se pueden manipular varias pre o prosecuencias para mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de escisión de la peptidasa de un péptido señal concreto o añadir prosecuencias, que también pueden afectar a la glicosilación. El producto proteico final puede tener, en la posición -1 (respecto al primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales que inciden sobre la expresión, que pueden no haberse eliminado del todo. Por ejemplo, el producto proteico final puede tener uno o dos residuos de aminoácidos encontrados en el sitio de escisión de la peptidasa unidos al extremo amino. Como alternativa, el uso de algunos sitios de escisión enzimática puede dar lugar a una forma ligeramente truncada del polipéptido deseado, si la enzima corta en dicha área dentro del polipéptido maduro.

25 La expresión y los vectores de clonación de la invención contendrán normalmente un promotor reconocido por el organismo huésped y operablemente unido a la molécula que codifica el anticuerpo anti-IL-1 R1. Los promotores son secuencias no traducidas localizada cadena arriba (es decir, en 5’) del codón de inicio de un gen estructural (generalmente en el intervalo de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controla la transcripción del gen estructural. Los promotores se pueden agrupar convenientemente en una de dos clases: Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Un promotor inducible inicia niveles aumentados de transcripción de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Por el contrario, los promotores constitutivos inician la producción continua del producto génico; es decir, hay poco o ningún control sobre la expresión génica. Se conoce bien un gran número de promotores, reconocidos por una diversidad de células huésped potenciales. Un promotor adecuado está unido

35 operativamente al ADN que codifica la cadena pesada o la cadena ligera que comprende un anticuerpo anti-IL-1 R1 de la invención eliminando el promotor del ADN fuente por digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora deseada en el vector.

Los promotores adecuados para el uso con levaduras huésped también son bien conocidos en la técnica. Los potenciadores de levaduras se usan de forma ventajosa con promotores de levadura. Los promotores adecuados para usar con células huésped de mamífero son bien conocidos e incluyen, entre otros, los obtenidos de los genomas de virus tales como el virus de l polioma, el virus de la viruela, adenovirus (tal como Adenovirus 2), papilomavirus bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis-B y, más preferentemente, el virus 40 de simio (SV40). Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores de

45 mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores del shock térmico y el promotor de actina.

Promotores adicionales que pueden ser de interés incluyen, entre otros: La región promotora temprana del SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-10); el promotor del CMV; el promotor contenido en la repetición larga en el extremo 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-97); el promotor de la timidina quinasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad Sci USA 78:1444-45); las secuencias reguladoras del gen de la metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión procariota, tal como el promotor de la beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-31); o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25). También de interés son las siguientes regiones de control de la transcripción, que exhiben especificidad de tejido y que se han usado en animales transgénicos. la región de control 55 del gen I de la elastasa que es activo en células acinares pancreáticas ((Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control del gen de la insulina que está activo en las células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); la región de control del gen de la inmunoglobulina que está activa en las células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:143644); la región de control del virus del tumor de mama de ratón que está activa en las células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-95); la región de control del gen de la albúmina que está activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel 1:268-76); la región de control del gen de la alfa-feto-proteína que está activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:5358); la región de control del gen de la alfa-1-antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and 65 Devel. 1:161-71); la región de control del gen de la beta-globina que está activa en las células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen de la proteína básica de

la mielina que está activa en las células oligodendrocitos del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); la región de control del gen de la cadena ligera 2 de la miosina que está activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-86); y la región de control del gen de la hormona liberadora de la gonadotropina que está activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-78).

5 Una secuencia potenciadora se puede insertar en el vector para incrementar la transcripción del ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada, que comprende un anticuerpo anti-IL-1 R1 de la invención por los eucariotas superiores. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente de una longitud de aproximadamente 10-300 pb, que actúan sobre el promotor para aumentar la trascripción. Los potenciadores son

10 relativamente independientes de la orientación y la posición. Se han encontrado en 5’ y 3’ de la unidad de transcripción. Se conocen varias secuencias potenciadoras de genes de mamífero (p. ej., de globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina). No obstante, normalmente se usa un potenciador es un virus, El potenciador de SV40, el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma y potenciadores de adenovirus son elementos potenciadores ilustrativos para la activación de promotores eucariotas. Aunque un

15 potenciador se puede empalmar en un vector en una posición 5’ ó 3’ de una molécula de ácido nucleico, se localiza típicamente en un sitio 5’ del promotor.

Los vectores de expresión de la invención pueden construirse a partir de un vector de partida, tal como un vector disponible comercialmente. Dichos vectores pueden o no contener todas las secuencias flanqueantes deseadas.

20 Cuando en el vector ya no está presente una o más de las secuencias flanqueantes descritas en el presente documento, pueden obtenerse individualmente y ligarse en el vector. Los procedimientos para obtener cada una de las secuencias flanqueantes son bien conocidos para los expertos en la técnica.

Una vez que se ha construido el vector y que se ha insertado una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena

25 ligera o la cadena pesada o cadena ligera y cadena pesada que comprenden un anticuerpo anti-IL-1 R1 en el sitio adecuado del vector, el vector completo se puede insertar en una célula huésped adecuada para amplificación y/o expresión polipeptídica. La transformación de un vector de expresión para un anticuerpo anti-IL-1 R1 en una célula huésped seleccionada se puede conseguir mediante procedimientos bien conocidos, incluidos transfección, infección, coprecipitación en fosfato cálcico, electroporación, microinyección, lipofección, transfección mediada por

30 dextrano-DEAE u otras técnicas conocidas. El procedimiento seleccionado será parte de una función del tipo de célula huésped que se va a usar. Los expertos en la técnica conocen bien estos procedimientos y otros procedimientos adecuados y, son como se indica en, por ejemplo, Sambrook et al., supra.

La célula huésped, cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, sintetiza un anticuerpo anti-IL-1 R1 que,

35 después, se puede recoger del medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta al medio) o directamente desde la célula huésped que lo produce (si no se secreta). La selección de una célula huésped adecuada dependerá de varios factores, tales como niveles de expresión deseados, modificaciones polipeptídicas que son deseables o necesarias para la actividad (tales como glicosilación o fosforilación) y la facilidad de plegamiento en una molécula biológicamente activa.

40 En la técnica se conocen numerosas líneas celulares de mamífero como huéspedes para expresión e incluyen, entre otras, muchas líneas de células inmortalizadas disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), tales como, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), además de

45 otras. En ciertas realizaciones se pueden seleccionar líneas celulares determinando qué líneas celulares tienen niveles de expresión elevados y producir anticuerpos con propiedades de unión de IL-1 R1 constitutivas. En otra realización se puede seleccionar una línea celular del linaje de las células B que no fabrica sus propios anticuerpos pero que tiene capacidad para fabricar y secretar un anticuerpo heterólogo (p. ej., líneas de células de mieloma de ratón NSO y SP2/0).

50 Los anticuerpos de la invención son útiles para detectar IL-1 R1 en muestras biológicas y la identificación de células

o tejidos que producen la proteína IL-1 R1. Dichos anticuerpos que se unen a IL-1 R1 y bloquean la interacción con otros compuestos de unión tienen uso terapéutico en la modulación de las enfermedades mediadas por la IL-1. En realizaciones preferidas, los anticuerpos frente a IL-1R1 pueden bloquear la unión de IL-1 R1 a IL-1|3 o IL-1 α, que

55 puede tener como resultado la alteración de la cascada de la transducción de señal de la IL-1.

Los anticuerpos de la invención que se unen específicamente a IL-1 R1 pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades mediadas por la IL-1, como se trata más adelante. Dichos anticuerpos se pueden usar en los ensayos de unión para detectar la unión de IL-1 R1 y su capacidad para inhibir la formación del IL-1 R1 de un complejo con

60 IL-1|3 y la proteína accesorio de IL-1 R (IL-1 RAcP) o con IL-1 a y IL-1 RacP.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona procedimientos para tratar trastornos médicos asociados con reacciones inflamatorias mediadas por la IL-1 o reacciones inmunorreguladoras mediadas por la IL-1. Los procedimientos de la invención incluyen administrar un anticuerpo anti-IL1 R1 de la invención a un individuo que esté

65 afectado con una enfermedad inflamatoria o inmunorreguladora que está mediada por la IL-1. Como se usa en el presente documento, los términos “enfermedad”, “malestar”, “afección médica” o “afección anormal” se usan de forma intercambiable con el término “trastorno médico”.

En una realización concreta, los procedimientos de la invención implican administrar a un paciente un anticuerpo 5 anti-IL1 R1 de la invención, de modo que se previene la unión de la IL-1 a su receptor de superficie celular (IL-1 R1).

Para tratar un trastorno médico caracterizado por la expresión anormal o en exceso de IL-2 o señalización anormal o en exceso de IL-1, una molécula que comprende un anticuerpo del IL-1R de tipo 1 de la presente invención se administra al paciente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora sostenida en al menos un indicador que refleja la gravedad del trastorno. Una mejora se considera “sostenida” si el paciente exhibe la mejora al menos dos veces separadas por de una a cuatro semanas. El grado de mejora se determina en base a los signos o síntomas y también se pueden emplear cuestionarios que se administran al paciente, tales como cuestionarios de la calidad de vida.

15 Varios indicadores que reflejan la extensión de la enfermedad del paciente se pueden evaluar para determinar si la cantidad y el tiempo de tratamiento es suficiente, El valor basal para el indicador o indicadores escogidos se establece mediante examen del paciente antes de la administración de la primera dosis del anticuerpo. Preferentemente, el examen basal se realiza en aproximadamente 60 días de administración de la primera dosis. Si el anticuerpo IL-1 R se está administrando para tratar los síntomas agudos, tales como, por ejemplo, para tratar lesiones traumáticas (lesión traumática de la rodilla, ictus, lesión en la cabeza etc.), la primera dosis se administra lo antes posible después de que se produzca la lesión o el acontecimiento.

La mejora se induce administrando repetidamente una dosis del anticuerpo hasta que el paciente manifieste una mejora sobre la situación basal para el indicador o indicadores escogidos. Al tratar las afecciones crónicas, este 25 grado de mejora se obtiene administrando repetidamente este medicamento durante un periodo de al menos un mes

o más, por ejemplo durante uno, dos o tres meses o más, o indefinidamente. Un periodo de uno a seis meses, o incluso una sola dosis, a menudo es suficiente para tratar las afecciones agudas.

Aunque la extensión de la enfermedad del paciente tras el tratamiento puede parecer que ha mejorado de acuerdo con una o más indicadores, el tratamiento puede continuar indefinidamente al mismo nivel o a una dosis o frecuencia reducida. Una vez que se ha reducido o interrumpido el tratamiento, más adelante se puede retomar al nivel original si los síntomas reaparecen.

Cualquier vía de administración eficaz se puede usar para administrar terapéuticamente el anticuerpo. El anticuerpo 35 se puede inyectar vía intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal, intracraneal, inhalatoria

o subcutánea, mediante inyección en bolo o mediante infusión continua. Por ejemplo, las enfermedades pulmonares pueden implicar procedimientos intranasales e inhalatorios. Otros medios adecuados de administración incluyen la liberación sostenida de implantes, inhalación por aerosol, gotas oculares, preparaciones orales, incluidas píldoras, jarabes, pastillas o masticables, y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, pulverizadores, pomadas u otras técnicas adecuadas. La administración mediante inhalación es particularmente beneficiosa cuando se tratan enfermedades asociadas con trastornos pulmonares.

En una realización de la invención se puede administrar un anticuerpo anti-IL-1 R1 de la invención una vez al mes. En otra realización, el anticuerpo se administra una vez cada dos semanas o una vez a la semana para tratar los 45 diversos trastornos médicos divulgados en el presente documento. En otra realización más, el anticuerpo se administra al menos dos veces a la semana y en otra realización se administra al menos una vez al día. Un paciente adulto es una persona que tiene 18 o más años de edad. Si se inyecta, la cantidad eficaz por dosis de adulto varía de 1 -200 mg/m2, o de 1 -40 mg/m2 o de aproximadamente 5-25 mg/m2. Como alternativa se puede administrar una dosis única cuya cantidad puede variar de 2-400 mg/dosis, 2-100 mg/dosis o de aproximadamente 10-80 mg/dosis. Si la dosis se va a administrar más de una vez a la semana, una dosis de ejemplo está en el mismo intervalo que los intervalos de dosis descritos anteriormente o menor. En una realización de la invención, las diversas indicaciones que se describen más adelante se tratan administrando una preparación aceptable para inyección que contiene el receptor de IL-1 a 80-100 mg/dosis o, como alternativa, que contiene 80 mg por dosis. La dosis se administra repetidamente. Si se usa una vía de administración distinta a la inyección, la dosis se ajusta adecuadamente de

55 acuerdo con las prácticas médicas estándar. Por ejemplo, si la vía de administración es inhalación, la dosis puede ser de una a siete veces a la semana a intervalos de dosis de 10 mg/dosis a 50 mg por dosis.

En realizaciones preferidas, la invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o una pluralidad de los anticuerpos de la invención junto con un diluyente, vehículo, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, los materiales aceptables para formulación son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleados. En realizaciones preferidas, se proporcionan las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpos anti-IL-1 R1.

65 En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar. por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la transparencia, el color, la isotonicidad, el

olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción o penetración de la composición. En dichas realizaciones, los materiales de formulación adecuados incluyen, entre otros, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); agentes antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, 5 citratos, fosfatos, otros ácidos orgánicos); agentes de carga (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); agentes de formación de complejos (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacáridos; disacáridos y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes; agentes aromatizantes y de dilución; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones de formación de sal (tal como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polisorbatos

15 tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metal alcalino (preferentemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol); vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (A.R Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica óptima la determinará un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración pretendida, el formato de liberación y la dosificación deseada. Véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, ant. En ciertas realizaciones, dichas composiciones pueden influir sobre el estado físico, la estabilidad, la velocidad de la liberación in vivo y la velocidad del aclaramiento in vivo de los

25 anticuerpos de la invención.

En ciertas realizaciones, el vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales habituales en composiciones para la administración parenteral. Otros ejemplos de vehículos son solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica. En realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,08,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En ciertas realizaciones de la invención, pueden prepararse composiciones de anticuerpos anti-IL-1R1

35 para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, ant) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en ciertas realizaciones, el producto anticuerpo anti-IL-1 R1 puede formularse como liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden seleccionarse para administración parenteral. Las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o liberación a través del tracto digestivo, tal como por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de los conocimientos de la técnica.

45 Los componentes de formulación están presentes, preferentemente, en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En ciertas realizaciones se usan tampones para mantener la composición a pH fisiológico o a pH ligeramente inferior, normalmente dentro de un intervalo de pH de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8.

Cuando se considera la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para su uso en la presente invención pueden proporcionarse en forma de una solución acuosa, parenteralmente aceptable, libre de pirógenos, que comprende el anticuerpo anti-IL-1 R1 deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que el anticuerpo anti-IL-1 R1 se formula como una solución isotónica, estéril, conservada de manera apropiada. En ciertas realizaciones, otra

55 preparación más puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tal como ácido poliláctico), ácido poliglicólico)), perlas o liposomas, que puede proporcionar la liberación controlada o sostenida del producto que, por tanto, puede administrarse por medio de una inyección de liberación lenta. En ciertas realizaciones, también puede usarse ácido hialurónico y esto puede tener el efecto de estimular la duración sostenida en la circulación. En ciertas realizaciones, se pueden usar dispositivos implantables de liberación de fármaco para introducir la molécula de anticuerpo deseada.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse para inhalación. En estas realizaciones, los anticuerpos anti-IL-1R1 se formulan en forma de polvo seco para inhalación. En realizaciones preferidas pueden 65 formularse soluciones para inhalación de anticuerpo anti-IL-1 R1 con un agente propelente para la liberación de aerosol En ciertas realizaciones, pueden nebulizarse soluciones. Se describe además la administración pulmonar y

los procedimientos de formulación se describen además en la publicación de patente internacional n W094/20069, que describe la liberación de proteínas químicamente modificadas.

También se contempla que ciertas formulaciones pueden administrarse por vía oral. Se pueden formular

5 anticuerpos Anti-IL-1 R1 que se administran de este modo con o sin los vehículos usados normalmente en la composición de formas de dosificación sólidas, tales como comprimidos y cápsulas. En ciertas realizaciones, una cápsula para liberar la parte activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal en el que se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción del anticuerpo anti-IL-1 R1. También pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de disgregación de comprimidos y aglutinantes.

Una composición farmacéutica de la invención se proporciona, preferentemente, para comprender una cantidad eficaz de uno de una pluralidad de anticuerpos anti-IL-1 R1 en una mezcla con excipientes no tóxicos que son

15 adecuados para la fabricación de comprimidos. Mediante la disolución de los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, entre otros, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que implican moléculas de anticuerpos anti-IL-1 R1 en formulaciones de liberación sostenida o controlada. Los expertos en la técnica conocen también técnicas para formular una variedad de otros medios de liberación sostenida o controlada, tales como vehículos de liposoma, micropartículas bioerosionables o perlas

25 porosas e inyecciones de liberación lenta. Véase por ejemplo, la publicación de patente internacional nº W093/15722, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la liberación de composiciones farmacéuticas. Preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices de polímero semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (como se divulga en la patente de EE.UU. 3,773,919 y la publicación de solicitud de patente europea nº EP 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato [Sidman y col, Biopolymers, 22:547-556 (1983)], poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) [Langer y col, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277, y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etilenvinilacetato ( Langer et al., supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (publicación de solicitud de patente europea Nº EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida también incluyen liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de

35 varios procedimientos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Eppstein y 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; publicación de solicitud de patente europea nº EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949..

Las composiciones farmacéuticas usadas para administración in vivo normalmente se proporcionan como preparaciones estériles. La esterilización puede realizarse mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición está liofilizada, la esterilización usando este procedimiento puede realizarse o bien antes de o bien tras la liofilización y reconstitución. Las composiciones para la administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en solución. Las composiciones parenterales se colocan generalmente en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, un vial o bolsa de disolución intravenosa que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

45 Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles como solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden almacenarse o bien en forma lista para su uso o bien en forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere la reconstitución antes de la administración.

La invención también proporciona kit para producir una unidad de administración de una sola dosis. Los kits de la invención pueden contener cada uno tanto un primer recipiente que tiene una proteína secada como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. En ciertas realizaciones de la presente invención se proporcionan kits pueden contener jeringas precargadas de una única cámara o múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas de líquidos y

55 liojeringas). Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que contiene anticuerpo anti-IL-1 R1 que va a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos y contexto terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán, por tanto, dependiendo , en parte, de la molécula liberada, la indicación para la que está usándose el anticuerpo anti-IL-1 R1 , la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y estado (la edad y salud general) del paciente. En ciertas realizaciones, el médico puede valorar la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente100 mg/kg o más, en función de los factores mencionados anteriormente. En realizaciones preferidas, la dosificación puede variar desde 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; más preferentemente

65 de 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg; o incluso más preferentemente de 5 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.

La frecuencia de la dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del anticuerpo anti-IL-1 R1 concreto en la formulación usada. Normalmente, un médico administra la composición hasta que se alcanza una dosificación que logra el efecto deseado. Por tanto, la composición puede administrarse como dosis única, o como dos o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de la molécula deseada) en el tiempo o como infusión continua

5 mediante un dispositivo de implantación o catéter. El perfeccionamiento adicional de la dosis adecuada lo realizan de forma rutinaria los expertos en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas realizadas rutinariamente por ellos. Pueden comprobarse dosificaciones apropiadas mediante el uso de datos de respuesta a la dosis apropiados.

La vía de administración de la composición farmacéutica ss según los procedimientos conocidos, por ejemplo por vía oral, a través de inyección por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, intralesional, mediante sistemas de liberación sostenida o mediante dispositivos de implantación. En ciertas realizaciones, las composiciones pueden administrarse mediante inyección en bolo o de manera continua mediante infusión, o mediante dispositivo de implantación.

15 La composición puede administrarse por vía local por medio de implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. En ciertas realizaciones, cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de la molécula deseada puede ser por medio de difusión, bolo de liberación gradual o administración continua.

También puede ser deseable usar composiciones farmacéuticas con el anticuerpo anti-IL-1 R1 de acuerdo con la invención ex vivo. En tales casos, las células, los tejidos u órganos que se han extraído del paciente se exponen a las composiciones farmacéuticas con el anticuerpo anti-IL-1R1 tras lo cual las células, los tejidos y/u órganos se

25 implantan posteriormente de nuevo en el paciente.

En concreto, los anticuerpos anti-IL-1 R1 pueden liberarse mediante la implantación de ciertas células que se han modificado mediante ingeniería genética, usando procedimientos tales como los descritos en el presente documento, para expresar y secretar el polipéptido. En ciertas realizaciones, tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogénicas. En ciertas realizaciones, las células pueden inmortalizarse. En otras realizaciones, con el fin de reducir la probabilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de tejidos circundantes. En realizaciones adicionales, los materiales de encapsulación son, normalmente, membranas o envolturas poliméricas, semipermeables, biocompatibles que permiten la liberación del (de los) producto(s) de proteína pero evitan la destrucción de las

35 células mediante el sistema inmunitario del paciente o mediante otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

En ciertas realizaciones, la invención abarca además la administración de un anticuerpo anti-IL-1 R1 o la composición farmacéutica de la invención de forma concurrente con uno o más fármacos que se administran al mismo paciente, administrándose cada fármaco de acuerdo con un régimen adecuado para dicho medicamento. Esto abarca pretratamiento, tratamiento simultáneo, tratamiento secuencial y regímenes alternativos. Ejemplos de dichos fármacos incluyen, entre otros, antivirales, antibióticos, analgésicos, corticosteroides, antagonistas de citocinas inflamatorias, fármacos antireumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD) y antiinflamatorios no esteroideos.

45 En otras realizaciones, un anticuerpo anti-IL-1 R1 o composición farmacéutica de la invención se puede administrar en combinación con otros inhibidores de citocinas, incluidos los antagonistas, por ejemplo RANKL, TGF-3, IFNy, IL-6

o IL-8 y TNF, particularmente TNFα. En combinación con IL-6, un anticuerpo de la presente invención se puede usar para tratar y prevenir la recurrencia de convulsiones, incluidas las convulsiones inducidas por antagonismo del receptor del GABA, las convulsiones asociadas con episodios de ictus en EEG y convulsiones límbicos motoras que se producen durante el estado epiléptico. En combinación con el inhibidor del IFNy, un anticuerpo de la presente invención es útil en el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática y la fibrosis quística. La combinación de un anticuerpo del receptor de IL1 e inhibidores de RANKL , por ejemplo anticuerpo RANKL es útil para prevenir la destrucción ósea en varios contextos, incluidos, entre otros, varios trastornos reumáticos, osteoporosis, mieloma

55 múltiple u otras neoplasias malignas que producen degeneración ósea, o terapia antitumoral dirigida a la prevención de las metástasis óseas o destrucción ósea asociada con residuos por desgaste de prótesis o con periodontitis. Además, los anticuerpos de la invención se pueden administrar en combinación con inhibidores de la IL-17 tales como formas solubles de un receptor de IL-17 (tal como IL-17R:Fc) o un anticuerpo de IL-17 o un anticuerpo IL-17R, proteína de unión a la IL-18, formas solubles de los receptores IL-18 y anticuerpos frente a IL-18, anticuerpos frente a los receptores de IL-18 o anticuerpos contra el ligando-CD30 o contra CD4.

La invención abarca además procedimientos para usar un anticuerpo anti-IL1 R1 o composición farmacéutica de la invención en el tratamiento de trastornos médicos divulgados en el presente documento en combinación con un inhibidor de TNF, preferentemente TNFR: Fc (ENBREL®) y cualquier combinación de las citocinas descritas o 65 inhibidores de citocinas que son agentes activos en terapias de combinación. Por ejemplo, de acuerdo con la presente invención, los procedimientos de terapia de combinación se pueden usar para tratar artritis reumatoide,

ictus, asma, psoriasis, etc.

Las afecciones tratadas de forma eficaz con un anticuerpo anti-IL-1 R1 o composición farmacéutica descrita en el presente documento incluyen enfermedades pulmonares, tales como asma, enfermedad pulmonar obstructiva 5 crónica, proteinosis alveolar pulmonar, neumopatía inducida por bleomicina y fibrosis, fibrosis pulmonar inducida por radiación, fibrosis quística, acumulación de colágeno en los pulmones y SDRA, todas ellas se pueden tratar con combinaciones de un anticuerpo frente a IL-1 R y un inhibidor de IL-4 y/o un inhibidor de IL-13, por ejemplo un anticuerpo frente a IL-4R que inhibe la actividad de IL-13 e IL-4. Los anticuerpos divulgados y las composiciones farmacéuticas de la invención también son útiles para tratar la displasia broncopulmonar (DBP), enfermedades 10 pulmonares obstructivas crónicas (p. ej., enfisema y bronquitis crónica) y enfermedad pulmonar fibrótica crónica de lactantes prematuros. Además, los compuestos, composiciones y terapias de combinación de la invención se usan para tratar enfermedades pulmonares ocupacionales, incluidas asbestosis, neumoconiosis del trabajador del carbón, silicosis o afecciones similares asociadas con la exposición a largo plazo a partículas finas. En otros aspectos de la invención, los compuestos, composiciones y terapias de combinación divulgados se usan para tratar la neumonía de

15 organización bronquioliterans, fibrosis pulmonar, incluidas fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis pulmonar inducida por radiación, sarcoidosis pulmonar y alergias, incluidas rinitis alérgica, dermatitis de contacto, dermatitis atópica y asma.

Dichas combinaciones son útiles también para tratar pacientes que sufren varios trastornos cutáneos, incluidos,

20 entre otros, dermatitis herpetiforme (enfermedad de Duhring), dermatitis atópica , dermatitis de contacto, urticaria (incluida la urticaria idiopática crónica) y enfermedades ampollosas autoinmunitarias, incluidos el pénfigo vulgar y el penfigoide ampolloso. Otras enfermedades que se pueden tratar con la combinación de un anticuerpo IL-1R y un inhibidor de IL-4 y/o IL-13 incluyen miastenia gravis, sarcoidosis, incluida la sarcoidosis pulmonar, esclerodermia, artritis reactiva, síndrome de hiper IgE, esclerosis múltiple y síndrome hipereosinófilo idiopático. La combinación se

25 usa también para tratar reacciones alérgicas a la medicación y como adyuvante para la inmunoterapia de la alergia.

Los anticuerpos frente al receptor de IL-1 y las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento son útiles para tratar enfermedades de protozoos, incluidas malaria y esquistosomiasis, y para tratar el eritema nodoso leproso; la meningitis bacteriana o vírica, la tuberculosis, incluida la tuberculosis pulmonar, y la neumonitis

30 secundaria a una infección vírica o bacteriana, incluyendo la infección de gripe y la mononucleosis infecciosa.

Las enfermedades y lesiones cardiovasculares son tratables y/o prevenibles con las composiciones farmacéuticas divulgadas o anticuerpos anti-IL1 -R1 solos o en combinación con otros inhibidores de las citocinas. Los trastornos cardiovasculares tratables incluyen aneurismas aórticos, incluidos aneurismas aórticos abdominales, síndrome 35 coronario agudo, arteritis, oclusión vascular, incluida la oclusión arterial cerebral; complicaciones de la cirugía de derivación coronaria, isquemia/reperfusión, enfermedad cardíaca, incluida la enfermedad cardíaca aterosclerótica, miocarditis, incluida la miocarditis autoinmunitaria crónica y la miocarditis vírica, insuficiencia cardíaca, incluida la insuficiencia cardíaca crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, caquexia de insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, reestenosis y/o aterosclerosis tras cirugía cardíaca o tras procedimientos angioplásticos con globo de la

40 arteria carótida, isquemia miocárdica silente, disfunción de la bomba ventricular izquierda, complicaciones postimplantación de los dispositivos de ayuda del ventrículo izquierdo, fenómeno de Raynaud, tromboflebitis, vasculitis, vasculitis de Kawasaki, enfermedad venooclusiva, arteritis de células gigantes, granulomatosis de Wegener, confusión mental tras cirugía de derivación cardiopulmonar y púrpura de Schoenlein-Henoch.

45 En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-IL-1 R1 y las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden usar para tratar afecciones de dolor crónico, tales como dolor pélvico crónico, incluyendo prostatitis crónica/síndrome del dolor pélvico y dolor postherpético.

Los trastornos del sistema endocrino, incluidos diabetes de inicio juvenil (incluye la diabetes mellitus autoinmunitarua

50 y los tipos de diabetes dependiente de insulina) y diabetes de inicio en la madurez (incluye la diabetes no dependiente de insulina y mediada por obesidad) también se pueden tratar con anticuerpos anti-IL-1 R1 o composiciones farmacéuticas de la invención. Dicho tratamiento incluye afecciones secundarias asociadas con la diabetes, tales como retinopatía diabética, rechazo de transplante renal en pacientes diabéticos, resistencia a la insulina mediada por obesidad e insuficiencia renal, que, en sí misma, se puede asociar con proteinuria e

55 hipertensión. Otros tratamientos endocrinos también se pueden tratar con estos compuestos e incluyen enfermedad de ovario poliquístico, adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X, hipotiroidismo y tiroiditis, incluida la tiroiditis de Hashimoto (es decir tiroiditis autoinmunitaria), disfunción de células tiroideas, incluido el síndrome del enfermo eutiroideo.

60 Las afecciones del sistema gastrointestinal se pueden tratar y prevenir con anticuerpos anti-IL-1 R1 o composiciones farmacéuticas de la invención, solos o en combinación con otras terapéuticas. Estas afecciones incluyen enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, gastroparesia idiopática, pancreatitis, incluidas pancreatitis crónica, pancreatitis aguda, enfermedad intestinal inflamatoria y úlceras, incluidas las úlceras gástricas y duodenales.

65 Los trastornos del sistema genitourinaria también se pueden tratar o prevenir con anticuerpos anti-IL-1 R1 o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. Dichos trastornos incluyen glomerulonefritis, incluyendo glomerulonefritis autoinmunitaria, glomerulonefritis debido a la exposición a toxinas o glomerulonefritis secundaria a infecciones con estreptococos hemolíticos u otros agentes infecciosos. También se pueden tratar con

5 compuestos, composiciones y terapias de combinación de la invención el síndrome urémico y sus complicaciones clínicas (por ejemplo, insuficiencia renal, anemia y miocardiopatía hipertrófica), incluido el síndrome urémico asociado con la exposición a toxinas ambientales, fármacos u otras causas. Las complicaciones que surgen por la inflamación de la pared de la vesícula biliar que conduce a la alteración de la función de absorción se pueden tratar o prevenir con anticuerpos de la presente invención. En dichas complicaciones se incluyen colelitiasis (cálculos) y coliedocolelitiasis (cálculos en el conducto biliar) y la recurrencia de colelitiasis y coliedocolelitiasis. Otras afecciones tratables con los compuestos, composiciones y terapias de combinación de la invención son complicaciones de la hemodiálisis; afecciones prostáticas, incluidas hipertrofia prostática benigna, prostatitis no bacteriana y prostatitis crónica; y complicaciones de la hemodiálisis.

15 En el presente documento también se proporcionan procedimientos para usar anticuerpos anti-IL-1 R1 de la invención, composiciones y terapias de combinación para tratar varios trastornos hematológicos y oncológicos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-1 R1, solos o en combinación con otros inhibidores de citocinas u otros agentes activos, como se ha descrito anteriormente, se pueden usar para tratar varias formas de cáncer, incluidos leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, carcinoma nasofaríngeo positivo para el virus de Epstein-Barr, glioma, cánceres de colon, estómago, próstata, de células renales, cervical y ovárico, cáncer de pulmón (SCLC y SNCLC), incluyendo caquexia asociada con cáncer, fatiga, astenia, síndrome paraneoplásico de caquexia e hipercalcemia. Los tumores sólidos, incluyendo sarcoma, osteosarcoma, y carcinoma, tal como adenocarcinoma (por ejemplo cáncer de mama) y carcinoma de células escamosas también se pueden tratar. Otros cánceres tratables incluyen cáncer de esófago, gástrico, carcinoma de vesícula biliar, leucemia, incluidas leucemia mielógena aguda,

25 leucemia mielógena crónica, leucemia mieloide, leucemia linfoblástica aguda o crónica y leucemia de células peludas. Otras neoplasias malignas con potencial metastático invasivo, incluido el mieloma múltiple, se pueden tratar con los compuestos, composiciones y terapias de combinación objeto.

Además, los anticuerpos anti-IL1R1 divulgados se pueden usar para tratar anemias y trastornos hematológicos, incluidos neutropenia idiopática crónica, anemia de enfermedad crónica, anemia aplásica, incluida la anemia aplásica de Fanconi, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica, síndromes mielodisplásicos (incluidos anemia refractaria, anemia refractaria con sideroblastos en anillo, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia refractaria con exceso de blastos en transformación), mielofibrosis/ metaplasia mieloide y crisis vasooclusiva de drepanocitos.

35 Varios trastornos linfoproliferativos también se pueden tratar con anticuerpos anti-IL-1 R1 de la invención, incluidos síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (SLPA), leucemia linfoblástica crónica, leucemia de células peludas, leucemia linfática crónica, linfoma de células T periféricas, linfoma linfocítica pequeña, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células T positivas para el virus de Epstein-Barr, linfoma histiocítico, enfermedad de Hodgkin, linfoma agresivo difuso, leucemias linfáticas agudas, enfermedad linfoproliferativa gamma de células T, linfoma cutáneo de células B, linfoma cutáneo de células T (es decir, fungoides micosis) y síndrome de Sezary.

Las afecciones hereditarias, tales como enfermedad de Gaucher, enfermedad de Huntington, enfermedad de IgA 45 lineal y distrofia muscular se pueden tratar con los anticuerpos de la presente invención.

Otras afecciones que se pueden tratar o prevenir con los anticuerpos anti receptor de IL-1 divulgados o las composiciones farmacéuticas incluyen las resultantes de lesiones en la cabeza o la médula espinal, incluyendo hematoma subdural debido al traumatismo en la cabeza. En relación con esta terapia, las composiciones y combinaciones descritas son adecuadas para prevenir los daños neurológicos craneales y prevenir y tratar los dolores de cabeza cervicogénicos. Las composiciones y combinaciones descritas son además adecuadas para tratar los efectos secundarios neurológicos asociados con la irradiación cerebral.

Los anticuerpos Anti-IL-1 R1 y la composición farmacéutica de la invención son también útiles para tratar afecciones

55 del hígado, tales como hepatitis, incluidas hepatitis alcohólica aguda, hepatitis aguda viral o inducida por fármaco, hepatitis A, B y C, colangitis esclerosante, epitelio sinusoide hepático e inflamación hepática por causas desconocidas.

Trastornos que implican pérdida de audición y que están asociados con la expresión anormal de la IL-1 se pueden tratar con los anticuerpos anti-IL-1 R1 o las composiciones farmacéuticas de la invención. Dichos trastornos incluyen pérdida de audición asociada con el nervio coclear que se piensa que es el resultado de un proceso autoinmunitario, es decir pérdida de audición autoinmunitaria. También se pueden tratar o prevenir con los anticuerpos anti-IL-1 R1 o las composiciones farmacéuticas de la invención el síndrome de Meniere y el colesteatoma, un trastorno del oído medio a menudo asociado con la pérdida de audición.

65 Los trastornos no artríticos de los huesos y las articulaciones también se pueden tratar con los anticuerpos descritos en el presente documento. Esto abarca trastornos de los osteoclastos que conducen a la pérdida de hueso, tales como, entre otros, osteoporosis, incluida la osteoporosis posmenopáusica, osteoartritis, periodontitis resultante de la pérdida o aflojamiento de dientes, y aflojamiento de prótesis tras sustitución articular (generalmente en asociación con una respuesta inflamatoria a los residuos por desgaste). Esta última afección también se denomina “osteólisis

5 del implante ortopédico”. Otra afección que se puede tratar con los compuestos, composiciones y terapias de combinación de la invención es la disfunción articular mandibular (TMJ).

Los anticuerpos anti-IL-1 R1 o las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden usar para tratar trastornos reumáticos, incluyendo artritis reumática adulta y juvenil, esclerodermia, lupus eritematoso sistémico, gota, osteoartritis, polimialgia reumática, espondiloartropatías seronegativas, incluyendo la espondilitis anquilosante, y la enfermedad de Reiter, artritis psoriásica y artritis crónica de Lyme. Los anticuerpos de la presente invención también son útiles para tratar la inflamación del músculo voluntario y otros músculos, incluidos dermatomiositis, miositis de cuerpos de inclusión, polimiositis y linfanfioleiomiomatosis.

15 Otro uso para los anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de la invención es el tratamiento y/o prevención de la amiloidosis primaria y la amiloidosis secundaria que es característica de varias afecciones, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, amiloidosis reactiva secundaria, síndrome de Down y amiloidosis asociada con diálisis. También se pueden tratar con los anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de la invención son los síndromes de fiebre periódica hereditaria, incluyendo la fiebre mediterránea familiar, hiperinmunoglobulina D y síndrome de fiebre periódica y síndromes periódicos asociados con el receptor del TNF (TRAPS).

En otras realizaciones, los anticuerpos o las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden usar para tratar trastornos que afectan a la piel o a las membranas mucosas. Estos trastornos incluyen enfermedades acantolíticas, incluyendo enfermedad de Darier, queratosis folicular y pénfigo vulgar. Otros trastornos de piel que se pueden tratar

25 usando los anticuerpos de la invención incluyen acné, acné rosáceo, alopecia areata, estomatitis aftosa, penfigoide ampolloso, quemaduras, eccema, eritema, incluido eritema multiforme y eritema multiforme ampolloso (síndrome de Stevens-Johnson), enfermedad cutánea inflamatoria, liquen plano, enfermedad ampollosa por IgA lineal (dermatosis ampollosa crónica de la infancia), pérdida de elasticidad de la piel, úlceras en la superficie mucosa, incluidas úlceras gástricas, dermatitis neutrofílica (síndrome de Sweet), dermatomiositis, pitiriasis rubra pilaris, psoriasis, pioderma gangrenoso, reticulohistiocitosis multicéntrica y necrólisis epidérmica tóxica. Otras afecciones relacionadas con la piel que se pueden tratar con las terapias y terapias de combinación de la presente invención incluyen dermatitis herpetiforme.

Trastornos adicionales que se pueden tratar con los anticuerpos o las composiciones farmacéuticas de la invención

35 incluyen la enfermedad del injerto contra el huésped y complicaciones resultantes de transplantes de órganos sólidos, tales como transplantes de corazón, hígado, piel, riñón, pulmón (obstrucción de las vías respiratorias tras transplante de pulmón) u otros transplantes, incluidos los transplantes de médula ósea.

Los trastornos oculares también se pueden tratar o prevenir con los anticuerpos anti-IL-1 R1 o las composiciones farmacéuticas divulgados, incluidos desprendimiento de retinaregmatógena y enfermedad ocular inflamatoria, incluida la enfermedad ocular inflamatoria asociada con el tabaquismo y la degeneración macular.

Los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la invención, como se describe en el presente documento, son útiles para tratar trastornos que afectan al sistema reproductor femenino. Ejemplos incluyen, entre otros, insuficiencia

45 múltiple de implantes/infertilidad, síndrome de pérdida fetal o pérdida del embrión IV (aborto espontáneo), embarazos preeclámsicos o eclampsia, endometriosis, cervicitis crónica y parto prematuro.

Además, los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la invención, son útiles para tratar y/o prevenir la ciática, los síntomas del envejecimiento, las reacciones farmacológicas graves (por ejemplo, toxicidad por IL-2 o neumopatía inducida por bleomicina y fibrosis) o para suprimir la respuesta inflamatoria antes, durante o después de la transfusión de glóbulos rojos alogénicos en cirugía cardíaca o de otro tipo o en el tratamiento de lesiones no traumáticas de una extremidad o articulación, tal como la lesión traumática de la rodilla. Otros diversos trastornos médicos que se pueden tratar con los anticuerpos anti-IL-1 R1 o las composiciones farmacéuticas incluyen esclerosis múltiple, síndrome de Behcet, síndrome de Sjogren, anemia hemolítica autoinmunitaria, beta talasemia,

55 esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de Parkinson y tenosinovitis de causa desconocida, así como varios trastornos autoinmunitarios o enfermedades asociadas con deficiencias hereditarias, incluido el retraso mental ligado al cromosoma X.

Además, los anticuerpos anti-IL-1 R1 o las composiciones farmacéuticas de la invención son útiles para tratar lesiones del sistema nervioso central (SNC), incluidos los efectos de los neurotransmisores neurotóxicos liberados durante la excitación de la inflamación en el sistema nervioso central y para inhibir o prevenir el desarrollo de cicatrices gliales en sitios de lesiones del sistema nervioso central. En relación con la epilepsia y el tratamiento de las convulsiones, reducción de la gravedad y el número de convulsiones recurrentes y reducción de la gravedad de los efectos perjudiciales de las convulsiones, reducción de la pérdida neuronal, degeneración neuronal y gliosis

65 asociada con convulsiones .

Usos adicionales para los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, entre otros, tratar la polineuropatía y miopatía de enfermedad crítica (CIPNM), polineuropatía aguda, anorexia nerviosa, parálisis de Bell, síndrome de fatiga crónica, demencia transmisible, incluida la enfermedad de Creutzfeld-Jacob, neuropatía desmielinizante, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de disco vertebral, síndrome de la guerra del golfo,

5 polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, miastenia gravis, isquemia cerebral silente, trastornos del sueño, incluido narcolepsia y apnea del sueño, degeneración neuronal crónica e ictus, incluidas las enfermedades isquémicas cerebrales. Otros usos adicionales para los anticuerpos de la invención son anorexia y/o trastornos anoréxicos, peritonitis, endotoxemia y shock séptico, formación de granuloma, ictus cardíaco, síndrome de Churg-Strauss, inflamación crónica tras infecciones agudas tales como tuberculosis y lepra, esclerosis sistémica y cicatrización hipertrófica.

En otras realizaciones, las proteínas de fusión con avidina que comprenden una secuencia de aminoácidos de uno de los anticuerpos IL-1 R1 de la invención se pueden construir para varios fines. Las proteínas de fusión con avidina se pueden generar usando, por ejemplo, un vector de expresión en mamíferos que contienen la secuencia de ADNc

15 que codifica la avidina de pollo recombinante adyacente a un sitio de clonación múltiple para inserción de una pareja de fusión génica diana específica. El vector puede incluir una secuencia de avidina con su secuencia señal endógena para permitir la secreción de parejas génicas de fusión pequeñas que no contienen secuencias señal de forma natural. La proteína de fusión expresada por el vector tiene una marca de la proteína avidina en la porción N de la pareja de fusión. La estrategia de fusión como se ha descrito en el presente documento tiene la capacidad de secretar proteínas que se expresan normalmente intracelularmente, tal como genes de transducción de señal o receptores de hormonas nucleares.

Como alternativa, se puede usar un vector que codifica avidina sin su secuencia señal endógena, que tendrá como resultado una marca en C terminal de las parejas de proteínas de fusión. Una fusión de avidina en el extremo C

25 permite la secreción de proteínas en base a la secuencia señal endógena de la pareja de fusión. Esta estrategia se puede aplicar para permitir el correcto procesamiento y plegamiento de la proteína o para determinar la validez de una secuencia señal propuesta. Adicionalmente, el vector puede comprender una secuencia nucleotídica corta que codifica una secuencia de aminoácidos que puede actuar como sustrato específico escindible por enzima, entre la avidina y las secuencias de la pareja de fusión. Dichas secuencias escindibles por enzimas permiten la separación de la pareja de fusión de la avidina para la purificación o con fines de liberación de la proteína.

Las proteínas de fusión con avidina de la invención se pueden usar en por ejemplo, detección selectiva de anticuerpos, caracterización funcional (determinación de la utilidad de un anticuerpo como agonista o antagonista, agente neutralizante etc.), mapeo de epítopos o estrategias de inmunización. Las fusiones con avidina de una

35 proteína diana también se pueden usar en formatos de ensayos farmacocinéticos, de eficacia o estándar de otro tipo diseñados para analizar las muestras preclínicas o las muestras de pacientes clínicos por la presencia del anticuerpo terapéutico en sangre, orina u otras muestras de tejido. Las parejas de proteínas de fusión con avidina se pueden preparar como secuencias de longitud completa o truncadas, dominios estructurales aislados específicos o como secuencias quiméricas con otros homólogos de la pareja de fusión de otras especies.

Las proteínas de fusión con avidina se pueden expresar usando medios estándar de introducir genes en células, como se ha descrito en el presente documento y como se conoce en la técnica. Las proteínas se pueden expresar en, por ejemplo, células 293 o CHO transfeccionando las células con una construcción de la fusión de avidina en una solución de lípidos, tal como en Lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA).

45 Los medios acondicionados y/o lisados celulares de células que expresan las proteínas de fusión se pueden recoger y aplicar a un sustrato de ensayo, tal como perlas de poliestireno recubiertas con biotina o placas de ELISA revestidos con biotina. La recolección del medio acondicionado y/o el lisado celular se puede realizar en un punto de tiempo que permita la expresión óptima de la proteína de fusión. Los expertos en la técnica pueden determinar experimentalmente el punto de tiempo, pero normalmente es de aproximadamente 48 horas tras la transfección. Las proteínas de fusión también se pueden analizar en la membrana celular o intracelularmente para la expresión y funcionalidad en la unión de ligandos, receptores o anticuerpos conocidos.

Las proteínas de fusión de avidina de la invención se pueden analizar mediante cualquier procedimiento conocido o

55 previamente caracterizado que usa interacciones biotina-avidina. Dichos procedimientos incluyen, entre otros, citometría de flujo y pruebas de imagen fluorescente/microscopia. Por ejemplo, las proteínas de fusión de avidina expresadas en medios o lisados celulares se pueden aplicar a perlas recubiertas con biotina y teñir con anticuerpos anti-avidina marcados con fluorescencia para indicar el nivel de expresión. Asimismo, se pueden aplicar anticuerpos fluorescentes que reconocen la pareja de la proteína de fusión específica en un formato de ensayo multicolorimétrico. Adicionalmente, los anticuerpos no marcados específicos de la pareja de la proteína de fusión se pueden aplicar de forma simultánea con anticuerpos marcados con fluorescencia en un ensayo de competición.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona procedimientos para mapear los epítopos usando proteínas de fusión con avidina. Más adelante se proporciona un ejemplo de un procedimiento para mapear los epítopos de la 65 invención con respecto al mapeo de epítopos para anticuerpos anti-IL-1R1. No obstante, un experto en la técnica reconocerá que dichos procedimientos se pueden aplicar fácilmente para mapear los epítopos para cualquier

anticuerpo y no está limitado a los anticuerpos anti-IL-1R1. Por ejemplo, el ADNc que codifica avidina de pollo (con secuencia señal endógena) se puede unir con el extremo 5’ de ADNc que codifican una proteína de interés (es decir, una proteína reconocida por los anticuerpos para los cuales se desea determinar un epítopo) condensada a una secuencia marcadora FLAG en el extremo 3'. Los genes de fusión marcados con FLAG se pueden ensamblar en un

5 vector de expresión usando técnicas moleculares convencionales. Un panel de proteínas mutantes marcadas con avidina-FLAG en las que se han sustituido ciertos aminoácidos (p. ej., con los correspondientes residuos de aminoácidos de otras especies animales) se pueden generar usando técnicas convencionales. Las proteínas mutantes y silvestres se pueden expresar en células huésped y la unión de las proteínas mutantes y silvestres con un anticuerpo de interés se puede detectar usando, por ejemplo, análisis de transferencia Western o ensayos de unión basados en perlas, como se describe en el presente documento. Por tanto, un epítopo se puede definir determinando qué sustituciones en las proteínas mutantes destruyen la unión al anticuerpo de interés.

Ejemplos

15 Los ejemplos siguientes, incluidos los experimentos realizados y los resultados alcanzados, se proporcionan con fines ilustrativos únicamente y no deben interpretarse como limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1

Producción de anticuerpos monoclonales humanos contra el receptor tipo 1 de la interleucina 1 (IL-1R1)

Ratones HuMab transgénicos

Los anticuerpos monoclonales completamente humanos frente al receptor de tipo 1 de IL-1 (IL-1R1) se prepararon

25 usando la cepa HCo7 de ratones transgénicos, que expresan genes de anticuerpos humanos. En cada una de estas cepas de ratones, el gen endógeno de la cadena ligera kappa de ratón se ha alterado de forma homocigota como se describe en Chen et al. (1993, EMBO J. 12:811 -820) y el gen endógeno de la cadena pesada de ratón se ha alterado de forma homocigota como se describe en el Ejemplo 1 de la publicación de solicitud de patente internacional nº WO 01/09187. Cada una de estas cepas de ratón porta un transgen de la cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild et al. (1996, Nature Biotechnology 14:845-851). La cepa HCo7 porta el transgen de la cadena pesada humana de HCo7 como se describe en las Patentes de EE.UU. Nº 5.545.806; 5.625.825; y 5.545.807. La cepa HCo7 se denomina en el presente documento ratón HuMab.

Inmunizaciones con HuMab

35 Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos frente al IL-1 R1 se inmunizó a los ratones HuMab con IL-1 R1 recombinante purificado derivado de células de insecto o de mamífero (por ejemplo, células CHO) como antígeno. Los esquemas de inmunización general para ratones HuMab se describen en Lonberg et al. (1994, Nature 368:856-859; Fishwild et at., supra; y la publicación de solicitud de patente internacional nº WO 98/24884, las enseñanzas de cada una de las cuales se incorporan como referencia). Los ratones tenían 6-16 semanas de edad tras la primera infusión del antígeno. Una preparación recombinante purificada (25-50 μg) del antígeno IL-1 R1 (p. ej., purificada de células de insecto o de mamífero transfeccionadas que expresan IL-1 R1) se usó para inmunizar los ratones HuMab por vía intraperitoneal (IP) o subcutánea (SC).

45 Las inmunizaciones de ratones HuMab transgénicos se realizaron usando antígeno en adyuvante completo de Freund y dos inyecciones, seguido de 2-4 semanas de inmunización IP (hasta un total de 11 inmunizaciones) con el antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Varias docenas de ratones se inmunizaron para cada antígeno. Se inmunizó un total de 149 ratones de la cepa HCo7 con IL-1 R1. La respuesta inmunitaria se monitorizó mediante sangrados retroorbitales.

Para seleccionar los ratones HuMab productores de anticuerpos que se unieron a IL-1R1 se analizaron los sueros de ratones inmunizados mediante ELISA tal como describen Fishwild et al., supra. En resumen, placas de microtitulación se revistieron con IL-1R1 recombinante purificado de células de insecto o de mamífero a 1-2 μg/ml en PBS y 50 μl/pocillo incubadas a 4 ºC durante la noche, después se bloquearon con 200 μl/pocillo de suero de pollo al

55 5 % en PBS/Tween (0,05 %). A cada pocillo se añadieron diluciones de plasma de ratones inmunizados con IL-1 R1 y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y después se incubaron con reactivo policlonal específico de Fc de IgG ANTI-humana de cabra conjugado con peroxidada de rábano (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y después se incubaron con reactivo policlonal específico de Fc de IgG ANTI-humana de cabra conjugado con peroxidada de rábano (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar, las placas se desarrollaron con sustrato ABTS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Catalog No. A-1888, 0,22 mg/mL) y se analizaron espectrofotométricamente a un DO de 415-495. Los ratones con títulos sudicientes de inmunoglobulina humana antiIL-1 R1 se usaron para producir anticuerpos monoclonales como se describe más adelante.

65 Generación de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos frente a IL-1 R1 Los ratones se prepararon para la producción de anticuerpos monoclonales reforzando con antígeno por vía intravenosa 2 días antes del sacrificio y, después, se extrajeron los bazos. Los esplenocitos de ratón se aislaron de ratones HuMab y se condensaron con PEG a una línea celular de mieloma de ratón usando protocolos estándar. Normalmente se realizaron 20-30 fusiones para cada antígeno.

5 En resumen, suspensiones celulares simples de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se condensaron a un cuarto del número de P3X63-Ag8.653 células de mieloma de ratón no secretor (nº de registro en la A.T.C.C., CRL 1580) o células de mieloma de ratón no secretor SP2/0 (A.T.C.C., CRL 1581) con 50% de PEG (Sigma). Las células se sembraron a aproximadamente 1x105/ pocillo en placas de microtitulación de fondo plano, seguido de

10 aproximadamente una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene 10 % de suero bovino fetal, 10% de medio condicionado P388D1 (nº de registro en la A.T.C.C., CRLTIB-63), 3-5% origen (IGEN) en DMEM (Mediatech, Nº de catálogo CRL 10013, con alto contenido en glucosa, L-glutamina y piruvato sódico) más HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 mg/ml de gentamicina y Ix HAT (Sigma, nº de catálogo CRL P-7185). Tras 1-2 semanas se cultivaron las células en medio en el que HAT se había sustituido por HT.

15 Los hibridomas resultantes se sometieron a detección selectiva para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Los pocillos individuales se sometieron a detección selectiva mediante ELISA (descrito anteriormente) para anticuerpos IgG monoclonales anti-IL-1 R1 humanos. Una vez producido un crecimiento extenso del hibridoma, el medio normalmente se monitorizó tras 10-14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpos se volvieron a sembrar,

20 se volvieron a someter a detección selectiva y, si siguen siendo positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales anti-IL-1 R1 se subclonaron al menos dos veces mediante dilución límite. Los subclones estables se cultivaron después in Vitro para generar cantidades pequeñas de anticuerpo en medio de cultivo tisular para caracterizar. Selección de anticuerpos monoclonales anti-IL-1 R1 humanos

25 Para la detección selectiva de hibridomas que mostraron reactividad positiva con el inmunógeno IL-1 R1 se usó un ensayo ELISA como se ha descrito antes. Los hibridomas secretores de un anticuerpo monoclonal unido con avidez elevada a IL-1R1 se subclonaron y después se caracterizaron. Un clon de cada hibridoma, que retuvo la reactividad de las células parentales (determinado por ELISA) se escogió para hace un banco celular de 5-10 viales almacenado

30 en nitrógeno líquido.

Se realizó un ELISA específico de isotipo para determinar el isotipo de los anticuerpos monoclonales producidos como se divulga en el presente documento. En estos experimentos, los pocillos de las placas de microtitulación se revistieron con 50 μl/pocillo de una solución de 1 μg/ml de la cadena ligera kappa anti-humana de ratón en PBS y se

35 incubaron a 4 ºC durante la noche. Después de bloquear con 5% de suero de pollo, las placas reaccionaron con sobrenadante de cada anticuerpo monoclonal analizado y un isotipo control purificado. Las placas se incubaron durante a temperatura ambiente durante 1-2 horas. Después, los pocillos se hicieron reaccionar con antisuero policlonal anti-humano de cabra conjugado con peroxidada de rábano específico de IgG 1, lgG2 o lgG4 humanas y las placas se desarrollaron y analizaron como se describe más adelante.

40 Los anticuerpos monoclonales purificados de los sobrenadantes de hibridoma que mostraron una unión significativa a IL-1R1 detectado mediante ELISA se analizaron después según su actividad biológica usando ensayos de unión in vitro y ensayos basados en células de sangre entera y condrocitos humanos. Se diseñaron los anticuerpos que mostraron la mejor actividad 15C4, 26F5, 27F2, 24E12, y 10H7. Los anticuerpos se sometieron a un experimento

45 preliminar de clasificación de epítopos. Las placas de ELISA se revistieron con slL-1 R1 humano (dominio 1+2+3), slL-1 R1 humano truncado (dominio 1+2), slL-1 R1 de rata, slL-1 R1 de tipo II humano y ovoalbúmina (control negativo). La unión del anticuerpo se detectó con un anticuerpo Fc anti-humano conjugado con peroxidada de rábano (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Los resultados se resumen en la Tabla 2. Una marca de comprobación (√) en la Tabla 2 representa un resultado positivo para la unión; “X” representa un resultado negativo. Los

50 anticuerpos 15C4, 26F5, 27F2 y 24E12 solo se unen a la proteína IL-1 R1 que tiene los tres dominios extracelulares, lo que indica que los epítopos para cada uno entran dentro del tercer dominio. El anticuerpo 10H7 se une al dominio extracelular de longitud completa IL-1 R1 y también una proteína truncada que solo tiene los dominios 1 y 2, que demuestra que el epítopo para este anticuerpo están dentro del dominio 1 o 2. Ninguno de los anticuerpos analizados tiene reactividad cruzada con el receptor de tipo II humano o IL-1 R1 de rata.

Tabla 2

OA (Control negativo)

Hu slL-1 R1 (Dominio 1+2+3) Hu slL-1 R1 (Dominio 1+2) Hu slL-1 R1 (Dominio 1+2+3) Rata slL-1 R1 (Dominio 1+2+3)

Anticuerpo

15C4

X √ X X X

26F5

X √ X X X

OA (Control negativo)

Hu slL-1 R1 (Dominio 1+2+3) Hu slL-1 R1 (Dominio 1+2) Hu slL-1 R1 (Dominio 1+2+3) Rata slL-1 R1 (Dominio 1+2+3)

Anticuerpo

27F2

X √ X X X

24E12

X √ X X X

10H7

X √ √ X X

Ejemplo 2

5 Inhibición in Vitro de la formación del complejo del receptor de IL-1 de tipo I por anticuerpos anti-IL-1 R1

La capacidad de los anticuerpos para inhibir los acontecimientos de unión extracelular requeridos para la señalización de IL-1 se evaluó con proteínas recombinantes in vitro en un ensayo en el que la unión de IL-1 a IL-1 R da lugar a la formación de un sitio de unión de alta afinidad para IL-1RAcP. La unión de IL-1RAcP a IL-1 unida a IL-1 10 R (denominado “formación de complejo”) se mide del siguiente modo. Las proteínas recombinantes se incubaron en ensayos de unión en placas de microtitulación en ausencia (control) o presencia de anticuerpos. Los valores de CI50 derivaron de las comparaciones de los valores control con los valores obtenidos en presencia del anticuerpo a concentraciones entre 10 fM y1 μM. En resumen, el ensayo se realizó del siguiente modo: IL-1R1 biotinilado y perlas recubiertas con estreptavidina (Dynal, Dynabeads M-28) se dispensaron en placas de microtitulación. Después se 15 añadió anticuerpo a los pocillos adecuados en una dilución en serie que cubre un amplio abanico de concentraciones. Se añadió IL-1β o IL-1α a una concentración de 1 nM y se añadió IL1 RAcP marcado con rutenio (preparado con NHS-Tag (IGEN) de acuerdo con los protocolos IGEN) a una concentración final de 5 nM. Tras incubar 1 hora a temperatura ambiente, la reacción de unión se analizó con un instrumento ORIGEN™ 1.5 o M8 (IGEN International Inc.). La unión de IL-1 RAcP a IL-1 unida a IL-1R1 se determinó detectando la señal de

20 electroquimioluminiscencia asociada con las perlas unidas a IL-1 R1. La reducción de la señal resultante de la competición del anticuerpo de la unión de IL-1 o IL-1 RAcP se calculó como un porcentaje de la señal ECL para la unión máxima (sin competición).

Se estableció la curva de respuesta de inhibición para cada anticuerpo en estos ensayos de unión y las CI50 se

25 obtuvieron usando el software PRISM™. Los resultados de la inhibición de IL-1 (3 acontecimientos de unión inducida se representan en el gráfico en la Figura 12. Los valores de CI50 para la inhibición de la formación del complejo se muestran en la tabla 3 a continuación. Los anticuerpos 15C4, 26F5, 27F2, y 24E12 inhiben fuertemente la formación del complejo. Estos anticuerpos son todos ellos ligandos del tercer dominio de IL-1 R1, como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo 10H7 pertenece a una clase de anticuerpos que se une a una construcción del IL-1 R

30 que carece del tercer dominio. 10H7 es un inhibidor menos potente de la unión dirigida por IL-1 de IL-1 RAcP que los ligandos del tercer dominio. La inhibición de la formación del complejo por los anticuerpos de la invención se comparó con la inhibición por IL-1 ra. Los ligandos del tercer dominio demostraron una capacidad similar o ligeramente superior para inhibir la formación del complejo mediante comparación con IL-1 ra.

35 La Figura 13 representa la capacidad del anticuerpo 15C4 para inhibir la formación del complejo IL-1 R1/IL-1a/RAcP. La CI50 para la formación del complejo IL-1 R1/IL-1a/RAcP fue 43 pM.

Tabla 3

Anti-IL1-R1 humano

15C4

26F5 27F2 24E12 10H7 rll-1 ra

CI50

96 pM 160 pM 333 pM 348 pM 5.3 nM 555 pM

Límites intervalo confianza 95 %

del de del 71 pM a 129 pM 118 pM a 219 pM 214 pM a 517 pM 223 pM a 542 pM 3.6 nM a 7.5 nM414pM a 743 pM

40 Ejemplo 3 Anticuerpos Anti-IL-1 R1 inhiben la unión de IL-1β E il-1ra al receptor La capacidad de los anticuerpos anti-IL-1 R1 para inhibir la IL-1 β o el IL-1 ra a IL-1 R1 se evaluó en un ensayo con

45 proteínas recombinantes. La mezcla de reacción contenía 0,1 mg/ml de Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal) y IL1 R1 biotinilado 1 nM. Los anticuerpos se añadieron a concentraciones de 320 nM a 0,3 nM. La adición de IL-1β (5 nM) o IL-1 ra (1 nM) marcados con rutenio inició la unión que procedió durante 1 hora a temperatura ambiente. Las mezclas de reacción se midieron como antes usando un instrumento ORIGEN™ 1.5 o M8 (IGEN International Inc.). La competición se calculó como el porcentaje de la señal ECL para la unión máxima (sin competición). Los anticuerpos 15C4, 26F5, y 27F2, los anticuerpos más potentes, bloquean la unión del ligando (IL-1β) al receptor,

5 pero no interfieren significativamente con la unión de IL-1 ra en comparación con l IgG control. En contraste, el anticuerpo 24E12 se une al receptor pero no bloquea la unión de IL-1β o de IL-1 ra al receptor. Por tanto, el anticuerpo 24E12 representa una clase única de ligandos del tercer dominio distintos de la clase representada por 15C4, 26F5, y 27F2. El anticuerpo 10H7 inhibe la unión de IL-1β y de IL-1 ra al receptor. Los resultados se resumen en la Figura 14.

Ejemplo 4

Ensayos en condrocitos y sangre entera humana

15 Condrocitos humanos primarios (Cell Applications Inc., San Diego, CA) se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células/pocillo en medio DMEM que contiene FBS al 1 % y Pen Strep al 1% (GIBCO). Se dejó que las células se recuperaran durante la noche antes de la adición de anticuerpos anti-IL1-RI a concentraciones que varían de nM a 0,1 pM durante 20 minutos. Se añadió IL-1β a una concentración de 1 pM (~CE50) y los sobrenadantes de los cultivos se recogieron tras 16 horas de incubación a 37°C. Los niveles de IL-6 en el

20 sobrenadante se midieron usando un ELISA (Pierce-Endogen, Rockford, IL, nº de cat. EH2IL-65) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se estableció la curva de respuesta de inhibición para cada anticuerpo de la invención en los ensayos basados en células y los valores de CI50 se obtuvieron usando el software PRISM™. Los anticuerpos 15C4,26F5, y 27F2 son potentes inhibidores de la señalización de IL-1 en comparación con IL-1 ra (Figura 15A). Los anticuerpos 24E12 y 10H7 son marcadamente menos potentes que 15C4 y 27F2 (Figura 15B). Los

25 valores de CI50 para la inhibición de la producción de IL-6 inducida por IL-1β en condrocitos humanos se muestran en las Tablas 4A y 4B.

Los anticuerpos monoclonales Anti-IL-1 R1 15C4,26F5, y 27F2 se preincubaron 40-60 minutos con sangre entera humana obtenida de voluntarios sanos en vacutainers con heparina sódica. Los ensayos se realizaron como se 30 indica a continuación. 100 μl de sangre recién aislada se alicataron en pocillos de una placa de 96 pocillos. 50 μl del anticuerpo se añadieron en medio RPMi que contiene suero AB humano al 10 %. Después se añadió IL-1β a una concentración de 30 pM (CE50). Los sobrenadantes del cultivo se recogieron tras 18 horas y se midieron los niveles de IL-6 en el sobrenadante usando un ELISA. Como control, el IL-1ra se preincubó 40-60 minutos con sangre entera y la producción de IL-6 se midió como se ha indicado antes. Los tres anticuerpos anti-IL-1 R1 bloquearon la actividad

35 de IL-1 con una potencia comparable a la de IL-1 ra (Figura 16). Los valores de CI50 para la inhibición de la producción de IL-6 inducida por IL-1 en sangre entera se muestran en la Tabla 5.

Tabla 4A

Anticuerpos anti-IL-1 R1 humanos

15C4

27F2 26F5 rlL-1ra

CI50

16 pM 32 pM 26 pM 32 pM

Límites de confianza del 95 %

15 pM a 18 pM 21 pM a 49 pM 19pM a 36pM 22 pM a 46 pM

Tabla 4B

Anticuerpos anti-IL-1 R1 humanos

15C4

27F2 10H7 24E12 rIL-ra

CI50

7pM 28 pM 7,5 pM NA 20 pM

Límites de confianza del 95 %

5,8pM a 7,9pM 22pM a 35 pM 5,6 nM a 10 nM NA 17 pM a 23 pM

Tabla 5

Donante

Parámetros de análisis 15C4 26F5 27F2 IL-1ra

1047

CI50 126 pM 410 pM 249 pM 241 pM

Límites de confianza del 95 %

47Pm a 339 pM 213 pM a 790 pM 88 pM a 703 pM 124pM a 471 pM

1319

CI50 111 pM 174 pM 579 pM 381 pM

Límites de confianza del 95 %

59pM a 208pM 60 pM a 501 pM 249 pM a 1,3 nM 167 pM a 875 pM

Compuesto

CI50 126 pM 372 pM 387 pM 264 pM

(Datos combinados)

Límites de confianza del 95 % 62pM a 255 pM 187 pM a 739 pM 202pM a 748 pM 134pM a517pM

Ejemplo 5

Mutagénesis y mapeo de epítopos

La mutagénesis dirigida a sitio (Altered Sites® In Vitro Mutagenesis System, Promega, Madison Wl) de IL-1 R1 se usó para preparar un panel de proteínas mutantes ("muteínas") Se construyeron quince plásmidos mutados 10 diferentes (véanse las barras numeradas en la Figura 17). Los plásmidos que codifican estas proteínas sustituidas y el IL-1 R1 parental se transfeccionaron de forma transitoria en células CHO. Los transfectantes simulados se generaron como controles negativos. El medio acondicionado (CM) de esttas células se concentró po 20 usando las columnas de concentración Centriprep 10 (Amicon) La expresión de las luteínas se evaluó mediante SDS-PAGE y transferencia Western. Se expresaron trece proteínas mutantes a niveles que permitieron la evaluación de la unión 15 del anticuerpo. Las proteínas se cargaron en un gel, se sometieron a electroforesis y se transfirieron a membranas. Las membranas se bbloquearon en 1 % de leceh en PBS, Tween-20 al 0,1 % y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos anti-IL-1 R 15C4, 27F2, or 24E12 a 0,5 ug/mL e PBS, Tween-20 al 0,1 %. Tras lavar, las membranas se incubaron con IgG-Fc-HRP anti-humana de cabra. La señal se deetctó usando sustrato de quimioluminiscencia (ECL) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Las secuencias específicas humanas

20 críticas para la unión de anticuerpo se identificaron como aquéllos que, cuando se sustituyeron con secuencias de rata, redujeron o eliminaron la señal ECL. El reconocimiento de 15C4 de los mutantes 1, 2, 4 y 10 se añteró cuando se comparó con 24E12 (Figura 18, panel superior). De forma similar, la unión de 27F2 de los mutantes 1, 2 y 4 se alteró (Figura 18, panel central). 27F2 no tuvo ninguna unión significativa a los mutantes 12, 13, 14 y 15 (Figura 18, panel inferior).

25 El aislamiento y caracterización de los anticuerpos anti-IL-1 R1 han identificado tres clases distintas de anticuerpos competitivos (Figura 19). Los inhibidores más fuertes de la actividad biológica de IL-1, como se demuestra en bioensayos basados en células, son los anticuerpos que se unen al tercer dominio de IL-1R1 y previenen la asociación de IL-1β. Los experimentos de mapeo del epítopo usando un panel de proteínas mutantes en el tercer

30 dominio han demostrado que esta clase de anticuerpos, que incluye 15C4, 27F2 and 26F5, comparte un epítopo conformacional solapante pero no idéntico. Las Figuras 20 y 21 ilustran la posición de los epítopos de 15C4 en el tercer dominio del receptor de IL-1, en un diagrama de lazo de un receptor de IL-1 unido a IL-1 ra (Schreuder et al., 1997, Nature 386:194-200). Los residuos del receptor de IL-1 que definen la unión de la clase más potente de anticuerpos se ilustran en gris. Estos anticuerpos han demostrado una potencia superior y, por tanto, estos epítopos

35 definen sitios de unión para anticuerpos de una clase superior. Los sitios de unión de 15C4 y 27F2 son solapantes, pero no idénticos, determinado por el análisis mutacional de los 15 sitios diferentes dentro del IL-1 R1 descrito anteriormente, Los sitios se representan en la Figura 17 como las barras numeradas encima de la secuencia de la proteína. Los sitios de interacción críticos parecen estar dentro de las mutaciones en los siitos 1 (LSDIA; SEC ID Nº 41) 2, (VIDE; SEC ID Nº 42), 4, (YSV) Y 10 (TCFA; SEC ID Nº 43). Los sitios de unión de 15C4 y 27F2 están

40 comrendidos dentro de los sitios 1 y 2, ya que la sustitución de los residuos de rata para los residuos humanos en cualquiera de los sitios anula la unión. 27F2 difiere de 15C4 en que los cambios en el sitio 4 anulan completamente su unión, mientras que la unión de a15C4 se reduce pero no se elimina completamente. La mutación 10 también reduce la unión de 15C4, pero 27F2 no tienen ninguna interacción obvia con este sitio. El examen de la estructura cristalina revela que estos residuos definen una cara del tercer dominio que está orientada hacia el espacio ocupado por el ligando unido (Figuras 20 y 21) (Vigers et al., 1997, Nature 386:190-194).

La segunda clase de anticuerpos identificados, representados por 10H7, no requiere el tercer dominio de unión y, al 5 contrartio que la clase preferida, inhibe la unión del IL-1 ra. Esta clase es activa en bioensayos, pero es menos potente que la clase preferida.

En contraste con la fuerte inhibición de los bioensayos de IL-1 con la clase preferida de anticuerpos, 24E12 es un inhibidor ineficaz en bioensayos. El anticuerpo 24E12 inhibe la unión de IL-1 RAcP con IL-1 unida IL-1R. El epítopo

10 para esta clase de anticuerpos, definido por los mutantes 12, 13, 14 and 15, está proximal al dominio transmembrana de IL-1R1 y está en una región no implicada directamente en IL-1 o en la unión del IL-1 ra (Figura 22).

Ejemplo 6

Clonación de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-IL1-R1

Clonación de la cadena ligera del MAb 15C4 anti-IL1-R1

20 Las cadenas ligeras de diez hibridomas que expresan los anticuerpos monoclonales de unión a alL1-RI, 15C4, 27F2, y 26F5, se clonaron el el vector de expresión de células de mamífero pDSRa19 (véase la publicación de solicitud internacional nº WO 90/14363. La construcción del plásmido que codifica la cadena ligera kappa de 15C4 se describe explícitamente en el presente documento; la clonación de la otra especie de cadena ligera se realizó usando procedimientos similares. La región variable de la cadena ligera kappa de alL-1 R1 15C4 se obtuvo usando

25 amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la primera hebra del ADNc preparado del ARN total del hibridoma all_1-RI de 15C4 preparado usando el reactivo TRIzol® (Invitrogen). La primera hebra de ADNc se sintetizó usando un cebador aleatorio con un adaptador de extensión 5'-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT -3'; SEC ID Nº 44) y un 5' RACE (amplificación rápida de los extremos del ADNc) se realizó usando el kit GeneRacer™ (Invitrogen). Para la cadena ligera completa, el cebador directo fue el cebador anidado GeneRacer™

30 (5' GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA -3'; SEC ID Nº 45) y el cebador inverso fue 5'-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG -3' (SEC ID Nº 46). Los productos de RACE se clonaron en pCR4-TOPO (Invitrogen) y se determinaron las secuencias de ADN. La secuencia del ADN consenso de la cadena kappa de 15C4 se usó para diseñar cebadores para la amplificación por PCR del anticuerpo de longitud completo. El cebador de PCR de la cadena kappa 5’ codificó el extremo amino de la secuencia señal y un sitio para la enzima de restricción Xbal y una

35 secuenia Kozak optimizada ((5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GTC GCC ATC ACA ACT CAT TGG G 3'; SEC ID Nº 47). El cebador 3’ codificó el extremo carboxilo y el codón de terminación, así como el sitio de restricción Sa/I (5'-CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C -3; SEC ID Nº 48).

cebador de la cadena kappa 3'alL-1 R1 15C4 (SEC ID Nº 48):

45 El clon de la cadena kappa de longitud completa de alL-1 R1 15C4 se obtuvo usando el clon pCR4:15C4 cadena kappa mediante amplificación con PCR con los ceabdores de la cadena kappa de 15C4 de alL-1 R1 5' y 3'. La reacción de PCR generó un producto de 733 pares de bases que codifican los 233 residuos de aminoácidos (incluida la secuencia señal de la cadena kappa de 19 aminoácidos) de la región variable de la cadena kappa de alL-1 R1

50 15C4. El producto de la amplificación con PCR se purificaron usando un kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen Nº de catálogo 28104), se cortó con Xba\ and Sa/I, se aisló en gel y se purificó usando un kit de extracción QIAquick Gel (Qiagen nº de catálogo 28704). Este fragmento de PCR que contiene la cadena kappa completa aE-1 R1 15C4 se ligó después en el vector de expresión de mamíferos pDSRal 9. El clon de expresión de la cadena kappa de 15C4 se secuenció para confirmar que codificaba el mismo péptido que se identificó en el hibridoma 15C4. El vector de expresión final, pDSRa19:15C4 lgG1, cadena kappa, tiene 5468 paresde bases y contiene las siete regiones funcionales que se describen en la Tabla 6.

Tabla 6

Número de pares de bases del plásmido

2 a 881

Una señal de poliadenilación/terminación de la transcripción de la subunidad α de la hormona glicoproteica de la hipófisis bovina (α-FSH) (Goodwin et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de registro en Genbank X00004)

882 a 2027

Un minigen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón que contiene el promotor de DHFR endógeno de ratón, las secuencias de codificación de ADNc y las señales de poliadenilación/terminación de la transcripción (Gasser et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19: 355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 2307-14)

2031 a 3947

Secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador de resistencia a ampicilina y el origen de replicación del plásmido en E. coli (Número de registro en Genbank J01749)

3949 a 4292

Un promotor temprano de SV40, potenciador y origen de replicación (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8: 466:-72; Número de registro en Genbank J02400)

4299 a 4565

Un elemento potenciador de la traducción del dominio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80:3618-22, Número de registro en Genbank J02029)

4574 a 4730

Intrón de SV40 16S, 19S, señales de corte y empalme de donante/aceptor (Okayama and Berg, 1983. Mol. Cell Biol. 3:280-9; Número de registro en Genbank J02400)

4755 a 5468

El ADNc de IgG1, cadena ligera de 15C4, entre los sitios Xbal y Sa/I

Construcción de pDSR19:hlgG1CH

Se construyó un plásmido de expresión pDSRa19:región variable de rata/región constante humana lgG1 (rVh/hCh1)

10 MAb como resultado de una unión de tres piezas del producto de la PCR de la región variable de anticuerpos de rata terminada con Xba\ and BsmB, la región constante de IgG1 humana (dominios CH1, hinge, CH2 and CH3) derivada por escisión con Sa/I y aislamiento en gel del fragmento de SsmBI and Sa/I del plásmido lineal pDSRal 9:hlgG1 CH (extremos H/'nc/l 11 y SsmBI) y un pDSRal 9 linealizado con extremos Xba\ y Sa/I (véase la solicitud de patente provisional de EE.UU. de propiedad conjunta y pendiente de tramitación nº 60/370,407, presentada el 5 de abril de

15 2002, "Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies As Selective OPGL Pathway Inhibitors,". El vector de expresión final, pDSRal 9:región variable de rata/Región constante humana lgG1 (rVh/hCh1), tiente 6158 paresde bases y contiene las siete regiones funcionales que se describen en la Tabla 7.

Tabla 7

20 El plásmido lineal pDSRa19:hlgG1CH se preparó digiriendo el plásmido pDSR19:región variable de rata/región constante humana lgG1 con las enzimas de restricción Xbal y BsmBl para eliminar la región variable de rata y

Número de pares de bases del plásmido

2 a 881

Una señal de poliadenilación/terminación de la transcripción de la subunidad α de la hormona glicoproteica de la hipófisis bovina (α-FSH) (Goodwin et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de registro en Genbank X00004)

882 a 2027

Un minigen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón que contiene el promotor de DHFR endógeno de ratón, las secuencias de codificación de ADNc y las señales de poliadenilación/terminación de la transcripción (Gasser et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19: 355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 2307-14)

2031 a 3947

Secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador de resistencia a ampicilina y el origen de replicación del plásmido en E. coli (Número de registro en Genbank J01749)

3949 a 4292

Un promotor temprano de SV40, potenciador y origen de replicación (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8: 466:-72; Número de registro en Genbank J02400)

Número de pares de bases del plásmido

2 a 4565

Un elemento potenciador de la traducción del dominio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80:3618-22, Número de registro en Genbank J02029)

4574 a 4730

Intrón de SV40 16S, 19S, señales de corte y empalme de donante/aceptor (Okayama and Berg, 1983. Mol. Cell Biol. 3:280-9; Número de registro en Genbank J02400)

4755 a 6158

El ADNc de la cadena pesada de hVh/hCh1 , entre los sitios Xbal y Sa/I La secuenca de este fragmento de la cadea pesada, más adelante (SEC ID Nº 51) con lassecuencias de los sitios de restricción subrayados:

5 purificar usando el kit de extracción QIAquick Gel Extraction kit. El plásmido lineal pDSRa19:hlgG1CH que contiene el dominio de la región constante de IgG14 humana de 1kpb se usó para aceptar el hibridoma derivado de las regiones variables del anticuerpo anti-IL-1R1.

Clonación de la cadena pesada del MAb 15C4 anti-IL1-R1

10 Las cadenas pesadas de diez hibridomas que expresan los anticuerpos monoclonales de unión a alL1-RI, 15C4, 27F2, y 26F5, se clonaron el el vector de expresión de células de mamífero pDSRa19. La construcción del plásmido

que codifica la cadena pesada de 15C4 se describe explícitamente; la clonación de la otra especie de cadena pesada se realizó usando procedimientos similares. La región variable de la cadena pesada de alL-1 R1 15C4 se obtuvo usando procedimientos de amplificación por PCR de la primera hebra del ADNc preparado del ARN total del hibridoma all_1-RI de 15C4 preparado usando el reactivo TRIzol®. La primera hebra de ADNc se sintetizó usando 5 un cebador aleatorio con un adaptador de extensión 5'-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT -3'; SEC ID Nº 44) y un 5' RACE (amplificación rápida de los extremis del ADNc) se realizó usando el kit GeneRacer™. Para la cadena pesada de longitud parcial, el cebador directo fue el cebador anidado GeneRacer™ (5' GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA -3'; SEC ID Nº 45) y el cebador inverso fue 5'-TGA GGA CGC TGA CCA CAC G -3' (SEC ID Nº 52). Los productos de RACE se clonaron en pCR4-TOPO y se determinaron las secuencias de ADN. La 10 secuencia del ADN consenso de la región variable de la cadena pesada de 15C4 se usó para diseñar cebadores para la amplificación por PCR de la región variable de la cadena pesada. El cebador de PCR de la cadena pesada 5’ codificó el extremo amino de la secuencia señal y un sitio para la enzima de restricción Xbal y una secuenia Kozak optimizada (5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGG GTC AAC CGC CAT CCT CG-3'; SEC ID Nº 53). El cebador 3’ codificó el extremo carboxilo de la región variable, incluida un sitio para BsmB en la hebra sentido natural

15 (5'-GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTG ACC AGG GTT CC-3'; SEC ID Nº 54).

cebador de la cadena pesada 5'alL-1 R1 15C4 (SEC ID Nº 53):

cebador de la cadena pesada de 3'alL-1 R1 15C4 (SEC ID Nº 54):

25 Construcción del clon de expresión de la cadena pesada de IgG1 anti-IL1-R1

El clon de la cadena pesada de longitud completa de alL-1 R1 15C4 se obtuvo del clon pCR4:15C4 cadena pesada mediante amplificación con PCR con los ceabdores de la cadena peada de 15C4 de alL-1 R1 5' y 3'. La reacción de PCR generó un producto de 442 pares de bases que codifican los 137 residuos de aminoácidos (incluida la 30 secuencia señal de la cadena pesada de 19 aminoácidos) de la región variable de la cadena pesada de alL-1 R1 15C4. El producto de la PCR se purificó usando un kit de purificación QIAquick PCR y después se digirió con Xba\ and SsmBI, se aisló en gel y se purificó usando un kit de extración en gel QIAquick. Este fragmento que contiente la región variable de la cadena pesada de alL-1 R1 15C4 completa se ligó después en el vector de expresión en mamíferos pDSRal 9:hlgG1CH. El clon de expresión de IgG1 cadena pesada de 15C4 se secuenció su ADN para

35 confirmár que codificadba el mismo péptido de la región variable de la cadena pesada que se identificó en el hibridoma 15C4. El vector de expresión final, pDSRa19:15C4 lgG1, cadena pesada, tenía 6173 paresde bases y contenía las siete regiones funcionales que se describen en la Tabla 8.

Tabla 8

Número de pares de bases del plásmido

2 a 881

Una señal de poliadenilación/terminación de la transcripción de la subunidad α de la hormona glicoproteica de la hipófisis bovina (α-FSH) (Goodwin et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de registro en Genbank X00004)

882 a 2027

Un minigen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón que contiene el promotor de DHFR endógeno de ratón, las secuencias de codificación de ADNc y las señales de poliadenilación/terminación de la transcripción (Gasser et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19: 355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 2307-14)

Número de pares de bases del plásmido

2031 a 3947

Secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador de resistencia a ampicilina y el origen de replicación del plásmido en E. coli (Número de registro en Genbank J01749)

3949 a 4292

Un promotor temprano de SV40, potenciador y origen de replicación (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8: 466:-72; Número de registro en Genbank J02400)

4299 a 4565

Un elemento potenciador de la traducción del dominio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80:3618-22, Número de registro en Genbank J02029)

4574 a 4730

Intrón de SV40 16S, 19S, señales de corte y empalme de donante/aceptor (Okayama and Berg, 1983. Mol. Cell Biol. 3:280-9; Número de registro en Genbank J02400)

4755 a 6173

El ADNc de IgG1, cadena pesada de 15C4, entre los sitios Xbal y Sa/I

Construcción de pDSR19:hlgG2CH

5 Se construyó un plásmido de expresión pDSR1a9:región variable humana/región constante humana IgG2 ((hVh/hCh2) Mab como resultado de una unión de tres piezas del producto de PCR de la región variable del anticuerpo humano digerido con Xba\ y BsmBI, un gel aisló la región constante de IgG2 humana digerida con BsmBI y BsmB (dominios CH2, bisagra, CH2 y CH3). y un producto pDSRal 9 linealizado. El vector de expresión final, pDSRal 9:región variable humana/región constante

10 humana lgG1 (hVh/hCh2) (véase la solicitud de patente provisional de EE.UU. de propiedad conjunta y pendiente de tramitación nº 60/370,407, presentada e5 5 de abril de 2002, "Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies As Selective OPGL Pathway Inhibitors"), tienen 6164 pares dde bases y contiene las 7 regiones funcionales descritas en la tabla 9.

15 Tabla 9

Número de pares de bases del plásmido

2 a 881

Una señal de poliadenilación/terminación de la transcripción de la subunidad α de la hormona glicoproteica de la hipófisis bovina (α-FSH) (Goodwin et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de registro en Genbank X00004)

882 a 2027

Un minigen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón que contiene el promotor de DHFR endógeno de ratón, las secuencias de codificación de ADNc y las señales de poliadenilación/terminación de la transcripción (Gasser et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19:355-64; Setzeret al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:230714)

2031 a 3947

Secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador de resistencia a ampicilina y el origen de replicación del plásmido en E. coli (Número de registro en Genbank J01749)

3949 a 4292

Un promotor temprano de SV40, potenciador y origen de replicación (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-72; Número de registro en Genbank J02400)

4299 a 4565

Un elemento potenciador de la traducción del dominio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80:3618-22, Número de registro en Genbank J02029)

4574 a 4730

Intrón de SV40 16S, 19S, señales de corte y empalme de donante/aceptor (Okayama and Berg, 1983. Mol. Cell Biol. 3:280-9; Número de registro en Genbank J02400)

4755 a 6164

El ADNc de la cadena pesada de hVh/hCh2 , entre los sitios Xbal y Sa/I La secuenca de este fragmento de la cadea pesada, más adelante (SEC ID Nº 57) con los sitios de restricción subrayados. Xbal

El plásmido lineal pDSRal 9:hlgG4CH se preparó digiriendo el plásmido pDSR19:región variable humana/región constante humana lgG2 con las enzimas de restricción Xbal y BsmBl para eliminar la región variable humana y

5 purificar usando el kit de extracción QIAquick Gel Extraction kit. El plásmido lineal pDSRal 9:hlgG2CH que contiene el dominio de la región constante de IgG2 humana de 1kpb se usó para aceptar el hibridoma derivado de las regiones variables del anticuerpo anti-IL-1R1. Construcción del clon de expresión de la cadena pesada de IgG2 anti-IL1-RI

10 El fragmento de la región variable de la cadena pesada de alL-1 R1 15C4, descrito anteriormente, se ligó en el vector de expresión en mamíferos pDSRal 9:hlgG2CH. El clon de expresión de IgG2 cadena pesada de 15C4 se secuenció su ADN para confirmár que codificadba el mismo péptido de la región variable de la cadena pesada que se identificó en el hibridoma 15C4. El vector de expresión final, pDSRal 9:15C4 lgG2, cadena pesada, tenía 6161 paresde bases y contenía las siete regiones funcionales que se describen en la Tabla 10.

Tabla 10

Número de pares de bases del plásmido

2 a 881

Una señal de poliadenilación/terminación de la transcripción de la subunidad α de la hormona glicoproteica de la hipófisis bovina (α-FSH) (Goodwin et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de registro en Genbank X00004)

882 a 2027

Un minigen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón que contiene el promotor de DHFR endógeno de ratón, las secuencias de codificación de ADNc y las señales de poliadenilación/terminación de la transcripción (Gasser et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19: 355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 2307-14)

2031 a 3947

Secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador de resistencia a ampicilina y el origen de replicación del plásmido en E. coli (Número de registro en Genbank J01749)

3949 a 4292

Un promotor temprano de SV40, potenciador y origen de replicación (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8: 466:-72; Número de registro en Genbank J02400)

4299 a 4565

Un elemento potenciador de la traducción del dominio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80:3618-22, Número de registro en Genbank J02029)

4574 a 4730

Intrón de SV40 16S, 19S, señales de corte y empalme de donante/aceptor (Okayama and Berg, 1983. Mol. Cell Biol. 3:2809; Número de registro en Genbank J02400)

4755 a 6161

The 15C4 heavy chain lgG2 cDNA between the Xba\ and Sa/I sites

Construcción de pDSR19:hlgG4CH

5 Se construyó un plásmido de expresión pDSRal9:región variable humana/región constante humana IgG4 ((hVh/hCh4) Mab como resultado de una unión de tres piezas del producto de PCR de la región variable del anticuerpo humano digerido con Xba\ y BsmBI, un gel aisló la región constante de IgG4 humana digerida con BsmBI y Sail (dominios CH2, bisagra, CH2 y CH3) y un pDSRal 9 linealizado. El vector de expresión final, pDSRal 9:región

10 variable humana/región constante humana lgG4 (hVh/hCh4) (véase la solicitud de patente provisional de EE.UU. de propiedad conjunta y pendiente de tramitación nº 60/370,407, presentada e5 5 de abril de 2002, "Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies As Selective OPGL Pathway Inhibitors"), tienen 6167 pares de bases y contiene las 7 regiones funcionales descritas en la tabla 11.

15 Tabla 11

Número de pares de bases del plásmido

2 a 881

Una señal de poliadenilación/terminación de la transcripción de la subunidad α de la hormona glicoproteica de la hipófisis bovina (α-FSH) (Goodwin et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de registro en Genbank X00004)

882 a 2027

Un minigen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón que contiene el promotor de DHFR endógeno de ratón, las secuencias de codificación de ADNc y las señales de poliadenilación/terminación de la transcripción (Gasser et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19: 355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 2307-14)

2031 a 3947

Secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador de resistencia a ampicilina y el origen de replicación del plásmido en E. coli (Número de registro en Genbank J01749)

3949 a 4292

Un promotor temprano de SV40, potenciador y origen de replicación (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8: 466:-72; Número de registro en Genbank J02400)

4299 a 4565

Un elemento potenciador de la traducción del dominio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80:3618-22, Número de registro en Genbank J02029)

4574 a 4730

Intrón de SV40 16S, 19S, señales de corte y empalme de donante/aceptor (Okayama and Berg, 1983. Mol. Cell Biol. 3:2809; Número de registro en Genbank J02400)

Número de pares de bases del plásmido

4755 a 6167

El ADNc de la cadena pesada de hVh/hCh4 , entre los sitios Xbal y Sa/I La secuenca de este fragmento de la cadea pesada, más adelante (SEC ID Nº 58) con los sitios de restricción subrayados:

El plásmido lineal pDSRal 9:hlgG4CH se preparó digiriendo el plásmido pDSR19:región variable humana/región constante humana lgG4 con las enzimas de restricción Xbal y BsmBl para eliminar la región variable humana y

5 purificar usando el kit de extracción QIAquick Gel Extraction kit. El plásmido lineal pDSRal 9:hlgG4CH que contiene el dominio de la región constante de IgG4 humana de 1kpb se usó para aceptar el hibridoma derivado de las regiones variables del anticuerpo anti-IL-1R1.

El fragmento de la región variable de la cadena pesada de alL-1 R1 15C4, descrito anteriormente, se ligó en el

10 vector de expresión en mamíferos pDSRal 9:hlgG4CH. El clon de expresión de IgG4 cadena pesada de 15C4 se secuenció su ADN para confirmár que codificaba el mismo péptido de la región variable de la cadena pesada que se identificó en el hibridoma 15C4. El vector de expresión final, pDSRal 9:15C4 lgG4, cadena pesada, tenía 6164 paresde bases y contenía las siete regiones funcionales que se describen en la Tabla 12.

Tabla 12

Número de pares de bases del plásmido

2 a 881

Una señal de poliadenilación/terminación de la transcripción de la subunidad α de la hormona glicoproteica de la hipófisis bovina (α-FSH) (Goodwin et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:6873-82; Número de registro en Genbank X00004)

882 a 2027

Un minigen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón que contiene el promotor de DHFR endógeno de ratón, las secuencias de codificación de ADNc y las señales de poliadenilación/terminación de la transcripción (Gasser et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19: 355-64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 2307-14)

2031 a 3947

Secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador de resistencia a ampicilina y el origen de replicación del plásmido en E. coli (Número de registro en Genbank J01749)

3949 a 4292

Un promotor temprano de SV40, potenciador y origen de replicación (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8: 466:-72; Número de registro en Genbank J02400)

4299 a 4565

Un elemento potenciador de la traducción del dominio LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80:3618-22, Número de registro en Genbank J02029)

4574 a 4730

Intrón de SV40 16S, 19S, señales de corte y empalme de donante/aceptor (Okayama and Berg, 1983. Mol. Cell Biol. 3:2809; Número de registro en Genbank J02400)

4755 a 6164

El ADNc de IgG2, cadena pesada de 15C4, entre los sitios Xbal y Sa/I

Ejemplo 7

Expresión de anticuerpos anti-IL-1 R1 en células de ovario de hámster chino (CHO)

Los anticuerpos anti-IL-1 R1 recombinantes se generan en células de ovario de hámster chino, específicamente CHO AM-1/D, como se divulga en la patente de EE.UU. nº . 6,210,924. En resument, las secuencias de ADN que 10 codifican las cadenas pesada o ligera completas de cada anticuerpo anti-IL-1 R1 de la invención se clonan en vectores de expresión. Las células CHO AM-1/D se co-transfeccionan con un vector de expresión capaz de exresar una cadena pesada completa y un vector de expresión que expresa la cadena ligera completa del anticuerpo anti-IL1 R1 adecuado. Por ejemplo, para generar el anticuerpo 26F5, las células se co-transfeccionan con un vector capaz de expresar una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID 15 Nº 38 y un vector capaz de expresar una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº 20, la SEC ID Nº 22 o la SEC ID Nº 24. Para generar el el anticuerpo 27F2, las células se co-transfeccionan con un vector capaz de expresar una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº 38; y un vector capaz de expresar una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID NºID Nº 26, la SEC ID Nº 28 o 20 la SEC ID Nº 30. Para generar el el anticuerpo 15C4, las células se co-transfeccionan con un vector capaz de expresar una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº 40; y un vector capaz de expresar una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID NºID Nº 32, la SEC ID Nº 34 o la SEC ID Nº 36. En la Tabla 13 se resumen las cadenas ligera y pesada completas para los diversos anticuerpos de IL-1 R1. La designación ".../lgG_" describe la secuencia

25 de la región constante del anticuerpo concreto.

Tabla 13

Anticuerpo

Región variable de la cadena pesada + región constante de la cadena pesada Cadena pesada completa

26F5/lgG1 (nucleótido)

SEC ID Nº 9 +SEC ID Nº 1 SEC ID Nº 19

26F5/lgG1 (aminoácido)

SEC ID Nº 10 +SEC ID Nº 2 SEC ID Nº 20

26F5/lgG2 (nucleótido)

SEC ID Nº 9 +SEC ID Nº 5 SEC ID Nº 21

26F5/lgG2 (aminoácido)

SEC ID Nº 10 +SEC ID Nº 6 SEC ID Nº 22

26F5/lgG4 (nucleótido)

SEC ID Nº 9 +SEC ID Nº 7 SEC ID Nº 23

Anticuerpo

Región variable de la cadena pesada + región constante de la cadena pesada Cadena pesada completa

26F5/lgG4 (aminoácido)

SEC ID Nº 10 +SEC ID Nº 8 SEC ID Nº 24

27F2/lgG1 (nucleótido)

SEC ID Nº 13 +SEC ID Nº 1 SEC ID Nº 25

27F2/lgG1 (aminoácido)

SEC ID Nº 14 +SEC ID Nº 2 SEC ID Nº 26

27F2/lgG2 (nucleótido)

SEC ID Nº 13 +SEC ID Nº 5 SEC ID Nº 27

27F2/lgG2 (aminoácido)

SEC ID Nº 14 +SEC ID Nº 6 SEC ID Nº 28

27F2/lgG4 (nucleótido)

SEC ID Nº 13 +SEC ID Nº 7 SEC ID Nº 29

27F2/lgG4 (aminoácido)

SEC ID Nº 14 +SEC ID Nº 8 SEC ID Nº 30

15C4/lgG1 (nucleótido)

SEC ID Nº 15 +SEC ID Nº 1 SEC ID Nº 31

15C4/lgG1 (aminoácido)

SEC ID Nº 16 +SEC ID Nº 2 SEC ID Nº 32

15C4/lgG2 (nucleótido)

SEC ID Nº 15 +SEC ID Nº 5 SEC ID Nº 33

15C4/lgG2 (aminoácido)

SEC ID Nº 16 +SEC ID Nº 6 SEC ID Nº 34

15C4/lgG4 (nucleótido)

SEC ID Nº15 + SEC ID Nº 7 SEC ID Nº 35

15C4/lgG4 (aminoácido)

SEC ID Nº 16 + SEQIDNO:8 SEC ID Nº 36

Anticuerpo

Región variable de la cadena ligera + región constante de la cadena ligera Cadena ligera completa

26F5/27F2 (nucleótido)

SEC ID Nº 11 + SEC ID Nº3 SEC ID Nº37

26F5/27F2 (aminoácido)

SEC ID Nº12 + SEC ID Nº 4 SEC ID Nº38

15C4 (nucleótido)

SEC ID Nº17 + SEC ID Nº 3 SEC ID Nº 39

15C4 (aminoácido)

SEC ID Nº18 + SEC ID Nº 4 SEC ID Nº 40

La expresión estable de anticuerpos anti-IL-1 R1 se consigue contransfeccionado células CHO AM-1/D deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) con los vectores de expresión. Las transfecciones se llevan a cabo usando

5 técnicas estándar (coprecipitación en fosfato cálcico) y selección de DHFR. Las colonias transfeccionadas se aislan y cultivan hasta confluencia en placas de 24 pocillos. Los anticuerpos producidos por las células transfeccionadas se analizan para determinar su plegamiento adecuado y la actividad neutralizante Se seleccionan los clones hiperproductores de anticuerpos anti-IL-1 R1 adecuadamente plegados de los isotipos lgG1, lgG2, e lgG4 y los anticuerpos se purifican como se describe más adelante.

Ejemplo 8

Producción de anticuerpo anti-IL-1 R1

15 Los anticuerpos anti-IL-1 R1 se producen mediante expresión en una línea clonal de células CHO. Para cada ciclo de producción, las células de un solo vial se descongelan en medios de cultivo celular sin suero. Las células se cultivan inicialmente en un matraz T y se expanden en serie a través de una serie de matraces giratorios hsta que se ha generado suficiente inóculo para sembrar un biorreactor de 20 l. Tras cultivar durante 5-10 días, el cultivo se usa después para inocular un biorreactor de 300 l. Tras cultivar durante 5-10 días adicionales, el cultivo se usa para

20 inocular un biorreactor de 2000 l. La producción se lleva a cabo en un biorreactor de 2000 l usando un cultivo discontinuo en el que se añade un alimento nutriente que contiene componentes de medio concentrado para mantener el crecimiento celular y la viabilidad del cultivo. La producción dura aproximadamente dos semanas, durante las cuales las células producen anticuerpo anti-IL1-R1 de forma constitutiva y lo secretan al medio de cultivo celular.

25 El reactor de producción está controlado a un pH y temperatuda fjados y a un nivel de oxígeno disuelto. El Ph se controla con gas dióxido de carbono y con la adición de carbonato sódico; el oxígeno disuelto se controla con flujos de aire, nitrógeno y oxígeno.

30 Al final de la producción, el caldo celular se introduce en una centrífuga de apliamiento de discos y el sobrenadante del cultivo se separa de las células. El concentrado se aclara después a través de un filtro en profundidad, seguido de un filtro de 0,2 μm. El medio acondicionado aclarado se concentra después mediante ultrafiltración de flujo tangencial. El medio acondicionado se concentra por 15-30. El medio acondicionado concentrado resultante se procesa mediante purificación o se congela para purificación posterior.

5 Ejemplo 9

Mapeo del epítopo usando proteínas de fusión con avidina

Para generar proteínas de fusión con avidina, el ADNc que codifica avidina de pollo (con secuencia señal endógena)

10 se unió con el extremo 5’ de ADNc que codifican los dominios extracelulares maduros de IL-1 R1 humanos o de cinomolgos condensados a una secuencia marcadora FLAG en el extremo 3'. Los genes de fusión marcados con FLAG se ensamblaron en un vector pALTERMAX usando técnicas moleculares convencionales. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión IL-1R1 humana-avidina se muestra en la Figura 23 (SEC ID Nº 59). La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión IL-1R1 de cinomolgos-avidina se muestra en la Figura 24 (SEC

15 ID Nº 60). Un panel de proteínas cynolL-1R1-FLAG-avidina en las que los aminoácids humanos s ehabían sustiudio para los residuos correspondientes de cinomolgos se generó usando el sistema de mutagénesis Altered Sites II Mammalian In Vitro Mutagenesis System (Promega Corp.). Las mutaciones se ilustran en la figura 24.

Los plásmidos que codifican las proteínas mutantes y silvestres avidina-cynolL-1 R así como la proteína avidina

20 hulL-1 RI-FLAG se transfeccionaron de forma transitoria en células 293T usando el reactivo de transfección Cytofectine (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Los transfectantes simulados se usaron como controles negativos. La unión del anticuerpo monoclonal (MAb) anti-hulL-1 Rl a estas proteínas se evaluó mediante transferencia Western y ensayos de unión con perlas usando medio acondicionado (CM) recogido de las células transfeccionadas.

25 Para el análisis de transferencia Western, el CM se diluyó 1:3 en tampón de muestra de SDS no reductor, se llevó a ebullición durante 5-10 minutos y se cargó en geles de Tris al 10 %-glicina. Tras SDS-PAGE y transferencia Western, las membranas se bloquearon cn BSA al 3 %/ovoalbúmina al 1 % en PBS/Tween-20 al 0,1% (PBST) y se tiñern con los Mab anti-hulL-1 Rl. Para la detección secundaria se usó un anticuerpo IgG-Fc-H RP anti-humano de cabra (Pierce Chemical Co.) diluido a 1:15.000 en PBST. La detección de anti-FLAG se usó para normalizar la carga

30 de proteínas. La captura de imágenes y la densitometría se realizaro usnado un sistema de imágenes digital FluorChem 8000 (Alpha Innotech Corp.). Las intensidades de la señal para los MAb anti-hulL-1 Rl se normalizaron frente a los valores para el anticuerpo nti-FLAG para contar la variación de la carga de proteínas. La unión del anticuerpo se expresión como un porcentaje de la unión al IL-1 R1 humano-avidina-FLAG.

35 Los resultados de la transferencia Western se muestran en la Figura 25A. La Figura 25B muestra el análisis densitométrico de un conjunto duplicado de experimentos de transferencia de tipo Western. Los residuos humanos críticos para la unión del anticuerpo sin aquéllos que restablecen la señal cuando se sustituyen en cyno-lL-1 R1. En general, las mutaciones 1 y 2 (ilustradas en la Figura 25), solas o en combinación, restablecieorn la unión a muchos de los anticuerpos (15C4/lgG2, 5B8, 1C2, 24H2, 16E9, 26E4 y 20G1) mientras que las mutaciones 10.1 and 10.2 no

40 lo hicieron. Ninguno de estos anticuerpos se encontró que era el cynolL-1 R1 silvestre. Dos anticuerpos (27F2 and 19C8) se unieron de forma consistente a las proteínas mutantes, así como a cynolL-1 R1 silvestre. Esto sugirió que el epítopo 4 (residuos Y279-V281 de cynolL-1 R1), identificado en las proteínas parálogas de rata/humanas y que no variaba en cynolL-1 R1 de cinomolgo era el epítopo dominante para estos anticuerpos. El epítopo 4 está en negrita y subrayado en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 24.

45 En los ensayos de unión multiplexados basados en perias, las proteínas de fusión de avidina se capturaron mediante incubación del CM con perlas fluorescentes revestidas con biotina, un conjunto de perlas por proteína de perfusión (Beadlyte Multi-Biotin 10plex Bead Kit; Upstate Biotechnologies). Las perlas se lavaron y combinaron en PBST y se alicuotaron en los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo con filtro (Millipore Corp.). Los anticuerpos (anti-hulL

50 1 Rl o anti-FLAG MAb) se añadieron a 25 μg/ml y se incubaron durante 1 hora. Las perlas se lavaron de nuevo y una mezcla de anticuerpo IgG anti-ratón conjugada con ficoertirina e IgG ((Fab')2 anti-humana se usó para detectar la unión del anticuerpo. Tras 1 hora de incubación, las perlas se lavaron y resuspendieron en PBST. Las intenstidades medias de fluorescencia (IMF) se midieron usando un Luminex 100 (Luminex Corp). Los datos se normalizaron usando los valores de IMF para la unión de Mab Anti-FLAG para representar la variación en la carga proteica. La

55 unión del anticuerpo se expreó como un porcentaje de la unión al IL-1 R1 humano-avidina-FLAG (Figura 26). El patrón de unión de los anticuerpos anti-IL-1R1 a las proteínas avidina-cynolLI R1 -FLAG mutadas con residuos humanos, así como las proteínas de IL-1 R1 silvestres humanas y de cinomolgos fue consistente con el análisis de inmunotransferencia en la Figura 25.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Varnum, Brian Witte, Alison

5 Vezina, Chris Wong, Lu Min Qian, Xueming

<120> Anticuerpo monoclonal anti-IL-1R humano terapéutico 10

<130> 01.1554

<160> 79

15 <170> Patentln versión 3.0

<210> 1

<211> 990

<212> ADN 20 <213> Homo Sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30

<400> 2

<210> 3

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 3

10 <210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 4

<210> 5 20 <211> 978

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5 25

<210> 6

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 981

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 327

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 8

<210> 9

<211> 417

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 9

10 <210> 10

<211> 139

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 10

<210> 11 20 <211> 384

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 11 25

<210> 12

<211> 128 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 417

<212> ADN 15 <213> Homo Sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 139 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 411

<212> ADN 15 <213> Homo Sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 137 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 378

<212> ADN 15 <213> Homo Sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 126 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 1407

<212> ADN 15 <213> Homo Sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 469

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 1395

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 21 <210> 22

<211> 465

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 1398

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 23 <210> 24

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 1407

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 25 <210> 26

<211> 469

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 1395

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>

28 10

<210> 29

<211> 1398

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 1401

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 467

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 1389

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 463

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 1392

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 464

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 705

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 235

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 699

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 233

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>

41 10

<210> 42

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para PCR

<220>

<221> misc_feature

<222> (18).. (23)

<223> n es a, c, t o g

<400> 44 ggccggatag gcctccannn nnnt 24

<210> 45

<211> 26

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 45 ggacactgac atggactgaa ggagta 26

<210> 46

<211> 26

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 46 ggacactgac atggactgaa ggagta 26

<210> 47

<211> 46

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 47 cagcagaagc ttctagacca ccatgtcgcc atcacaactc attggg 46

<210> 48

<211> 34

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 48 cttgtcgact caacactctc ccctgttgaa gctc 34

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> secuencias de aminoácidos codificada por cebador 5' de kappa anti-IL-1R 15C4

<400> 49

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> secuencias de aminoácidos codificada por cebador 3' de kappa anti-IL-1R 15C4

<400> 50

<210> 51

<211> 1409

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 51

<210> 52

<211> 19 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para PCR 10

<400> 52 tgaggacgct gaccacacg 19

<210> 53 15 <211> 44

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 53 cagcagaagc ttctagacca ccatggggtc aaccgccatc ctcg 44

<210> 54

<211> 32

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 54 gtggaggcac tagagacggt gaccagggtt cc 32

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> secuencias de aminoácidos codificada por cebador 5' de cadena pesada de anti-IL-1R 15C4

<400> 55

<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> secuencias de aminoácidos codificada por cebador 3' de cadena pesada de anti-IL-1R 15C4

<400> 56

<210> 57

<211> 1415

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 1418

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 58 <210> 59

<211> 485

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 485 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> proteína quimérica avidina-IL-1R1 cynomolgus-FLAG 10

<400> 60

<210> 61

<211> 5 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 8

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 62

5 <210> 63

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 63

<210> 64 15 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64 20

<210> 65

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 17

<212>

PRT 35 <213> Homo sapiens

<400> 66

<210> 67

<211> 11

<212>

PRT 45 <213> Homo sapiens

<400> 67

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

<210> 69

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

<210> 70

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 70

<210> 71

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 71

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72

<210> 73

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

<210> 74 5 <211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74 10

<210> 75

<211> 9 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

<210> 76

<211> 111

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 76

<210> 77

<211> 350

<212> ADN

<213> Homo sapiens 35

<400> 77

<210> 78

<211> 350

<212> ADN

<213> Rattus sp.

<400> 78

<210> 79

<211> 111

<212> PRT 15 <213> Rattus sp.

<400> 79

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES

   1. n anticuerpo humano aislado que se une específicamente al receptor de tipo 1 de la interleucina 1 o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:

   a.

   gines estructurales de cadena pesada humana, una región CDR1 de la cadena pesada, en la que la CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 63; una región CDR2 de la cadena pesada, en la que la región CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 66; una región CDR3 de la cadena pesada, en la que la región CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 69; y

   b.

   ines estructurales de cadena ligera humana, una región CDR1 de la cadena ligera, en la que la región CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 71; una región CDR2 de la cadena ligera, en la que la región CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 73; una región CDR3 de la cadena ligera, en la que la región CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 75.

2. 2.

   l anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 16, y una cadena ligera que comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 18.

3. 3.

   l anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº 16 y en la que la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la SEC ID Nº 18.

4. 4.

   l anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende:

   a.

   na cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la SEC ID Nº 40; y

   b.

   na cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la SEC ID Nº 32, la SEC ID Nº 34 o la SEC ID Nº 36, en la que el fragmento de unión a antígeno tiene una deleción aminoterminal o una deleción carboxilo-teminal, y/o una deleción o sustitución interna.

5. 5.

   l anticuerpo de la reivindicación 4, en el que el fragmento de unión a antígeno de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 32, y el fragmento de unión a antígeno de la cadenaligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 40.

6. 6.

   l anticuerpo de la reivindicación 5, en el que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº 32 y en la que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la SEC ID Nº 40.

7. 7.

   l anticuerpo de la reivindicación 4, en el que el fragmento de unión a antígeno de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 34, y el fragmento de unión a antígeno de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 40.

8. 8.

   l anticuerpo de la reivindicación 7, en el que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº 34 y en la que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la SEC ID Nº 40.

9. 9.

   l anticuerpo de la reivindicación 4, en el que el fragmento de unión a antígeno de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 36, y el fragmento de unión a antígeno de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº 40.

10. 10.

    l anticuerpo de la reivindicación 9, en el que la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº 36 y en la que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la SEC ID Nº 40.

11. 11.

    l anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cadena pesada comprende una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos EVQLMQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFS FHWIAWVRQM PGKGLEW-MGI IHPGASDTRY SPSFQGQVTI SADNSNSATY LQWSSLKASD TAMYFCARQR ELDYFDYWGQ GTLVTVSS.

12. 12.

    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cadena ligera comprende una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos EIVLTQSPDF QSVTPKEKVTITCRASQSIG SSLHWYQQKP DQSPKLLIKY ASQSFSGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDAAAYYCHQ SSSLPLTFGG GTKVEIK.

13. 13.

    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos EVQLMQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFS FHWIAWVRQM PGKGLEWMGI IHPGASDTRY SPSFQGQVTI SADNSNSATY LQWSSLKASD TAMYFCARQR ELDYFDYWGQ GTLVTVSS, en el que la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos EIVLTQSPDF QSVTPKEKVT ITCRASQSIG SSLHWYQQKP DQSPKLLIKY ASQSFSGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDAAAYYCHQ SSSLPLTFGG GTKVEIK.

14. 14.

    Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. 15.

    Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 14.

16. 16.

    La célula huésped que contiene el vector de expresión de la reivindicación 15.

17. 17.

    El anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 13, en el que las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera están conectadas por un ligador flexible para formar un anticuerpo de una cadena.

18. 18.

    El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 17, que es un anticuerpo Fv de una cadena.

19. 19.

    El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que es un anticuerpo Fab.

20. 20.

    El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que es un anticuerpo Fab’.

21. 21.

    El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que es un anticuerpo (Fab')2.

22. 22.

    El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.

23. 23.

    El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 17 a 21, que es un anticuerpo lgG2.

24. 24.

    El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 6, 8, 10, que se une específicamente al polipéptido de la SEC ID 76.

25. 25.

    El anticuerpo de la reivindicación 24, que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos YSV.

26. 26.

    Uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad mediada por la IL-1 en un paciente, en el que la enfermedad mediada por la IL-1 se selecciona de enfermedades pulmonares, enfermedad pulmonar obstructiva crónica o EPOC, proteinosis alveolar pulmonar, neuropatía inducida por bleomicina, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis pulmonar inducida por radiación, fibrosis quística, acumulación de colágeno en los pulmones, síndrome de dificultad respiratoria aguda o SDRA, displasia broncopulmonar o DBP, enfermedades pulmonar obstructivas crónicas seleccionadas de enfisema, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar fibrótica crónica, asbestosis, neumoconiosis del trabajador del carbón, silicosis, neunomía organizadora por bronquiliterans, sarcoidosis pulmonar, rinitis alérgica, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, diabetes, enfermedad intestinal inflamatoria, artritis reumatoide y asma.

27. 27.

    Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.