ES2609494T3 - Anticuerpos IgM humanos con la capacidad de inducir remielinización y usos diagnósticos y terapéuticos de los mismos, particularmente en el sistema nervioso central - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humano, o una mezcla, monómero o fragmento activo del mismo que tiene: (i) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de la región CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 39, y un domino variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de la región CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 40. (ii) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de la región CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 41, y un domino variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de la región CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 42.

Description

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Anticuerpos IgM humanos con la capacidad de inducir remielinizacion y usos diagnosticos y terapeuticos de los mismos, particularmente en el sistema nervioso central

Descripcion

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere, en general, al campo de la neurobiologla, y, mas particularmente, a la identification de autoanticuerpos que desempenan un papel en la funcion y terapia del sistema nervioso central. La invencion tambien se refiere a materiales y procedimientos diagnosticos y terapeuticos, incluidos, a modo de ejemplo, composiciones farmaceuticas, autoanticuerpos para usar en procedimientos de tratamientos de enfermedades asociadas con la alteracion neurologica, autoanticuerpos para usar en procedimientos de regeneration y restauracion de la funcion neural, ensayos de detection selectiva y vacunas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La esclerosis multiple (EM) es una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central (SNC) cronica, con frecuencia progresiva, que se caracteriza patologicamente por desmielinizacion primaria, normalmente sin lesion axonal inicial. La etiologla y patogenia de la EM se desconocen. Varias caracterlsticas inmunologicas de la EM y su moderada asociacion con ciertos alelos del complejo mayor de histocompatibilidad ha urgido la especulacion de que la EM es una enfermedad mediada por el sistema inmunitario.

Una hipotesis de autoinmunidad esta avalada por el modelo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAR), en el que la inyeccion de ciertos componentes de mielina en animales geneticamente susceptibles conduce a la desmielinizacion del SNC mediada por linfocitos T. No obstante, en el SNC de los pacientes de EM no se han identificado definitivamente los autoantlgenos especlficos y linfocitos T reactivos a mielina patogenica ni la EM se asocia con otras enfermedades autoinmunitarias. Una hipotesis alternativa, en base a los datos epidemiologicos, es que un factor ambiental, quiza un virus no identificado, desencadena una respuesta inflamatoria en el SNC, que conduce a la destruction directa o indirecta (“espectador”) de mielina, potencialmente con un componente autoinmunitario inducido. Esta hipotesis viene avalada por las pruebas de que varias infecciones vlricas naturales, tanto en seres humanos como en animales, pueden producir desmielinizacion. Un modelo de virus experimental de uso habitual se induce con el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) (Dal Canto, M.C., y Lipton, H.L., Am. J. Path., 88:497-500 (1977)).

Kirschning y col. (J. Neuroimmunology 99:122-130) describe la estructura primaria de los dominios de union con antlgenos de un anticuerpo monoclonal de Igm reactivo con oligodendrocitos humanos derivado de un paciente con esclerosis multiple.

Asakura y col. (Neurology 54:Suppl 3 PP A126-127) describe que la IgM humana de donantes sanos potencio la remielinizacion del sistema nervioso central en un modelo de virus murino de esclerosis multiple.

Asakura y col. Neuroscience 18(19):7700-8 describe que dirigir anticuerpos IgMkappa a oligodendrocitos promueve la remielinizacion del SNC.

Miller y col. (1995) Journal of Immunology 154(5):2460-9 describe un anticuerpo monoclonal que promueve la remielinizacion del sistema nervioso central en un modelo de esclerosis multiple.

Sorensen y col. (1998) Neurology 50(5):1273-81 describe que la inmunoglobulina G intravenosa reduce la actividad de MRI en esclerosis multiple recurrente.

El documento US 5.591.629 describe anticuerpos monoclonales que promueven la remielinizacion del sistema nervioso central.

Vernino y col. (2000) Annals of Neurology 47(3):297-305 describe anticuerpo de celulas de Purkinje (PCA- 2), un marcador de autoinmunidad neurologica relacionada con el cancer de pulmon.

Greenlee y col. (1983) Annals of Neurology 14(6):609-613 describe anticuerpos para celulas de Purkinje cerebelosas en pacientes con degeneration cerebelosa paraneoplasica y carcinoma ovarico.

La limitada eficacia de los tratamientos actuales para la EM y otras enfermedades desmielinizantes ha estimulado el interes en nuevas terapias para aliviar estas enfermedades. No obstante, debido a la aparentemente compleja etiopatogenia de estas enfermedades que implican potencialmente a factores ambientales y autoinmunitarios, sigue existiendo la necesidad de un tratamiento eficaz de estos trastornos desmielinizantes.

Se sabe que un grupo de autoanticuerpos exhiben actividad en el sistema nervioso central y que estaba

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particularmente asociado con la estimulacion de la remielinizacion. Uno de los objetivos de los solicitantes ha sido investigar el amplio abanico de actividades de los anticuerpos y, de forma concomitante, identificar otros miembros de la clase que demuestran dichas actividades. En consecuencia, la presente invencion esta dirigida a la satisfaccion de estos y otros objetivos.

La mencion de cualquier referencia en el presente documento no debe interpretarse como admision de que dicha referencia esta disponible como “Tecnica anterior” a la presente solicitud.

SUMARIO DE LA INVENCION

En un primer aspecto, la presente invencion proporciona:

Un anticuerpo humano, o una mezcla, monomero o fragmento activo del mismo que tiene:

(i) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de la region CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 39, y un domino variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de la region CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 40.

(ii) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de la region CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 41, y un domino variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de la region CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 42.

Se han identificado y probado en la presente anticuerpos particulares, y la invencion por lo tanto se extiende a anticuerpos humanos, tales anticuerpos humanos se ejemplifican por CB2iE12 y CB2iE7.

En el presente documento se describe un ensayo para seleccionar otros anticuerpos y parejas de union relacionadas, incluidos haptenos y analogos peptldicos, que pueden exhibir una actividad terapeutica similar. Dichas actividades incluirlan el tratamiento o prevencion de lesiones o disfunciones neurologicas, tal como esclerosis multiple, ELA, ictus, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer.

La presente invencion se refiere, en otro aspecto, a la promocion o estimulacion de la regeneracion o remielinizacion de los axones del sistema nervioso central en un mamlfero. Especlficamente, la presente invencion se refiere a autoanticuerpos para usar en procedimientos de estimulacion de la remielinizacion de los axones sistema nervioso central (SNC), incluidos anticuerpos del subtipo IgM y monomeros de la misma, y, en particular, a autoanticuerpos humanos, o mezclas y/o fragmentos activos de los mismos, que se caracterizan por su capacidad para unirse a estructuras y celulas dentro del sistema nervioso central. La presente invencion tambien se extiende a la preparacion y uso de autoanticuerpos humanos, en el que son ejemplos de los autoanticuerpos humanos CB2iE12 y CB2iE7. Las secuencias de la region variable de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de ejemplo se exponen en las Figuras como sigue: CB2iE12 es expone en las Figuras 39 y 40 (SEC ID N° 27 y 29); y CB2iE7 se expone en las Figuras 41 y 42 (SEC ID N° 31 y 33). La invencion se extiende a anticuerpos y a las correspondientes protelnas de anticuerpos y a moleculas pequenas, tales como haptenos, que tienen, o corresponden al menos en parte a, las secuencias expuestas en las Figuras indicadas.

La presente invencion usa un analisis de las secuencias de ADNc de la region variable de la Ig y la capacidad de unirse a estructuras y celulas en el sistema nervioso central, incluidos, entre otros, oligondendrocitos, de estos AcMo para determinar su utilidad en los procedimientos descritos en el presente documento. Ademas, este trabajo proporciona confirmacion de la utilidad generica de este grupo de autoanticuerpos como eficaces en la produccion de la remielinizacion del sistema nervioso central

De acuerdo con una realizacion adicional de la divulgacion, y como se ha indicado anteriormente, se ha definido una clase mas amplia de anticuerpos y se divulga en el presente documento. Especlficamente, de acuerdo con el presente documento tambien se divulgan y preparan autoanticuerpos monoclonales y policlonales humanos que proporcionan mayor afinidad por tejido neural y capacidad tanto diagnostica como terapeutica. La invencion se extiende mas alla en cuanto a que los anticuerpos recien identificados se pueden usar para varios fines, tales como la estimulacion de la remielinizacion, regeneracion de celulas nerviosas danadas, proteccion neuronal, sobrecrecimiento neuronal y similares.

Una caracterlstica y ventaja significativa de la presente invencion reside en la fuente de anticuerpos, ya que pueden obtenerse directamente del huesped o paciente y usarse despues para estimular autoterapias mas seguras. Mas ampliamente, el desarrollo de anticuerpos sinteticos, anticuerpos recombinantes, peptidos, moleculas pequenas y similares, en base a estos materiales endogenos reduce, si no elimina, posibles enfermedades o disfunciones, tales como reacciones autoinmunitarias, que pueden ser el resultado de la introduccion in vivo y uso de materiales exogenos. Asimismo, el origen endogeno de los anticuerpos ofrece una ventaja adicional en cuanto a que es posible estudiar el proceso de reparacion en el paciente o huesped e identificar, potencialmente, un mecanismo de accion subyacente en el tratamiento de la afeccion, que en si misma puede proporcionar puntos de vista y estrategias

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terapeuticas adicionales.

Ademas, se contempla que la identificacion de la relacion entre agentes que estimulan la senalizacion del calcio, como mediante la induction de picos de Ca++, en los oligodendrocitos, y el inicio y/o estimulacion de las actividades terapeuticas indicadas, proporciona un procedimiento de identificar agentes terapeuticos mediante la demostracion de la senalizacion del calcio en, por ejemplo, oligodendrocitos. En consecuencia, la invention tambien se extiende a este uso y actividad.

Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para seleccionar bibliotecas peptldicas o haptenos, de modo que los peptidos reactivos o los haptenos se pueden aislar y analizar su capacidad para remielinizar, inducir proliferation celular, diferenciacion, sobrecrecimiento neural, brotes de neuritas y/o senalizacion de Ca++. Una vez aislados y purificados, dichos peptidos pueden usarse despues para seleccionar otros anticuerpos policlonales o monoclonales, otras moleculas que pueden inducir remielinizacion, proliferacion o diferenciacion celular, sobrecrecimiento neuronal, brotes de neuritas y/o senalizacion de Ca++, el ultimo mencionado, se cita en el presente documento que es relevante a la proliferacion y a la correspondiente actividad de las celulas gliales. Particularmente, los peptidos, haptenos y otras moleculas que corresponden a los anticuerpos de la invencion se pueden identificar por su capacidad para unirse a los oligodendrocitos y, de este modo, inducir rehabilitation neural, tal como remielinizacion, regeneration y neuroproteccion.

Asimismo, en el presente documento se describen peptidos que se unen a los autoanticuerpos descritos en el presente documento, de modo que estos peptidos, en virtud de su secuencia, estructura tridimensional o cambios conformacionales que surgen de la union del anticuerpo, pueden usarse en y o por si mismos como vacunas peptldicas.Estos peptidos pueden tener propiedades neuromoduladoras y/o inmunomoduladoras, y pueden proporcionar un procedimiento de induccion de una respuesta proliferativa de celulas neurales y/o un papel neuroprotector, neuroregenerativo y/o remielinizante en mamlferos que necesiten dicha terapia.

Asimismo, en el presente documento se describen haptenos que se pueden unir a los peptidos, los anticuerpos y/u otros sustratos relevantes que pueden poseer inmunogenicidad, de modo que tambien pueden funcionar como componentes activos en formulaciones terapeuticas, que incluyen tambien vacunas. Como se describe en el presente documento, se pueden combinar uno o mas haptenos con otros peptidos de la presente invencion, en una formulacion de vacuna.

Estos peptidos se pueden formular como composiciones farmaceuticas con estabilizantes para evitar la degradation proteolltica, de modo que se amplla su semivida para su administration por via oral, subcutanea, intravenosa, intranasal, intratecal o como preparaciones de liposomas a mamlferos que necesiten dicha terapia.

La presente invencion tambien se refiere a autoanticuerpos para usar en procedimientos de tratamiento de enfermedades desmielinizantes en mamlferos, tales como esclerosis multiple en seres humanos, y enfermedades virales del sistema nervioso central de seres humanos y animales domesticos, tales como encefalomielitis postinfecciosa, o inhibir profilacticamente la initiation o progresion de la desmielinizacion en estos estados patologicos, usando los anticuerpos monoclonales, o fragmentos activos de los mismos, de la presente invencion. La presente invencion se refiere ademas a procedimientos in vitro de production y estimulacion de la proliferacion de celulas gliales, tales como oligondendrocitos, y al uso de estas celulas gliales para tratar enfermedades desmielinizantes.

En un aspecto adicional, la invencion se extiende a un grupo de moleculas que se denominaran en el presente documento agentes neuromoduladores y que son notables en su actividad terapeutica en el SNC. En consecuencia, la invencion se refiere a agentes neuromoduladores con eficacia concreta en el SNC, en el que los agentes comprenden un material seleccionado del grupo consistente en un anticuerpo de la presente invencion, incluidos anticuerpos del subtipo IgM, monomeros de los mismos, un analogo peptldico, un hapteno, fragmentos activos de los mismos, agonistas de los mismos, mimeticos de los mismos y combinaciones de los mismos. Los agentes neuromoduladores tienen las caracterlsticas siguientes: inducen remielinizacion y/o proliferacion celular de celulas gliales; y/o evocan la senalizacion de Ca++ con oligodendrocitos.

Mas particularmente, los anticuerpos comprendidos dentro del alcance de los agentes neuromoduladores de la invencion se pueden seleccionar del grupo consistente en mAb, mezclas de los mismos, monomeros de los mismos, fragmentos activos de los mismos y autoanticuerpos naturales o sinteticos que tienen las caracterlsticas de las mAb CB2iE12 y CB2iE7, particularmente anticuerpos humanos. Los presentes agentes neuromoduladores pueden derivar de celulas de mamlfero y, especlficamente, pueden derivar de celulas humanas. Ademas, los agentes neuromoduladores pueden comprender un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en la FIGURA 39 (SEC ID N° 27), FIGURA 40 (SEC ID N° 29), FIGURA 41 (SEC ID N° 31), FIGURA 42 (SEC ID N° 33), y fragmentos activos de los mismos.

La presente invencion tambien se refiere a una molecula de ADN recombinante o gen clonado, o a una variante degenerada del mismo, que codifica una clase de moleculas que, en el presente documento, tambien se

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denominaran agentes neuromoduladores y que incluyen y se pueden seleccionar de los anticuerpos de la invention, y, particularmente, de los anticuerpos que tienen secuencias correspondientes, al menos en parte, a las secuencias presentadas en las FIGURAS 39-42, y peptidos que pueden corresponder al menos en parte a los anticuerpos de la presente invencion, que tambien se denominaran en el presente documento peptidos de anticuerpo y, por ejemplo, peptidos que tienen una o mas secuencias correspondientes, al menos en parte, a las FIGURAS 39-42, y moleculas pequenas, tales como haptenos; incluidas moleculas de ADN recombinante o genes clonados que tienen las mismas secuencias o secuencias complementarias.

Mas particularmente, la molecula de ADN recombinante comprende una secuencia de ADN o variante degenerada de la misma, que codifica un anticuerpo, un analogo peptldico del mismo, un hapteno correspondiente o un fragmento activo del mismo y que se puede seleccionar del grupo que consiste en:

(I) la secuencia de ADN que codifica una protelna que tiene una secuencia correspondiente a al menos una portion de la FIGURA 39 (SEC ID N° 27);

(J) la secuencia de ADN que codifica una protelna que tiene una secuencia correspondiente a al menos una porcion de la FIGURA 140(SEC ID N° 29);

(K) La secuencia de ADN que codifica una protelna que tiene una secuencia correspondiente a al menos una porcion de la FIGURA 41 (SEC ID N° 31);

(L) la secuencia de ADN que codifica una protelna que tiene una secuencia correspondiente a al menos una porcion de la FIGURA 42 (SEC ID N° 33);

(N) secuencias de ADN que hibridan con cualquiera de las secuencias de ADN anteriores en condiciones de hibridacion estandar; y

(O) secuencias de ADN que codifican la expresion de una secuencia de aminoacidos codificada por cualquiera de las secuencias de ADN anteriores.

La presente divulgation tambien incluye protelnas derivadas de, o correspondientes a, dichos anticuerpos, o fragmentos o derivados de los mismos, que tienen las actividades indicadas en el presente documento y que muestra las secuencias de aminoacidos indicadas y descritas con anterioridad y seleccionadas de las FIGURAS 3942. Asimismo, la presente invencion se extiende a haptenos que demuestran las mismas actividades que las protelnas o peptidos de anticuerpo, y que se pueden administrar para fines terapeuticos de un modo similar, como mediante formulation en una composition terapeutica o vacuna. En una realization, se puede preparar una composition terapeutica o vacuna que incluye tanto peptidos como haptenos.

En una realizacion adicional de la invencion, la secuencia completa de ADN de la molecula de ADN recombinante o gen clonado determinado de este modo puede estar unido operativamente a una secuencia de control de la expresion que se puede introducir en un huesped adecuado. De acuerdo con esto, la invencion se extiende a huespedes unicelulares transformados con el gen clonado o molecula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica los presentes peptidos de anticuerpo,

En una realizacion concreta, la secuencia de ADN de la region variable de un anticuerpo de la presente invencion se puede usar para generar anticuerpo(s) sintetico(s). En particular, la secuencia de la region variable se puede combinar con su secuencia de la region constante proporcionada geneticamente, para proporcionar un anticuerpo sintetico. La presente invencion proporciona vectores para generar anticuerpos sinteticos derivados de, y que comprende, las secuencias de ADN, en particular secuencias de la region variable, de los anticuerpos de la presente invencion.

De acuerdo con otras caracterlsticas preferidas de ciertas realizaciones preferidas de la presente invencion, se proporciona un sistema de expresion recombinante para producir peptidos de anticuerpo biologicamente activos animales o, particularmente, humanos.

La presente invencion incluye varios modos para la preparation de clones de los autoanticuerpos, peptidos, haptenos correspondientes u otros analogos de molecula pequena de los mismos, incluidos, como se ilustra en el presente documento, tecnicas recombinantes conocidas, y la invencion, en consecuencia, pretende abarcar dichas preparaciones sinteticas en su alcance. El aislamiento del ADNc y las secuencias de aminoacidos divulgadas en el presente documento facilitan la reproduction de los presentes anticuerpos o sus analogos mediante dichas tecnicas recombinantes y, de acuerdo con esto, la invencion se extiende a los vectores de expresion preparados a partir de las secuencias de ADN divulgadas para la expresion en sistemas del huesped mediante tecnicas de ADN recombinante y a los huespedes transformados resultantes.

La divulgacion incluye un sistema de ensayo para detection selectiva de potenciales farmacos eficaces para modular la actividad neurologica de las celulas neurales de mamlfero diana potenciando la actividad de los presentes autoanticuerpos o sus analogos. En un caso, el farmaco de ensayo se pudo administrar a una muestra celular con el ligando que suprime o inhibe la actividad de los autoanticuerpos, o un extracto que contiene los anticuerpos suprimidos, para determinar su efecto sobre la actividad de union de los autoanticuerpos a cualquier muestra qulmica (incluido ADN), o al farmaco de ensayo, mediante comparacion con un control.

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El sistema de ensayo podrla adaptarse para identificar farmacos u otras entidades capaces de unirse a los autoanticuerpos y/o sus dianas, incluidos peptidos, haptenos, otros factores o protelnas, se encuentren en el citoplasma, el nucleo o en cualquier otro lugar, de modo que potencian la actividad de anticuerpo, incluido, por ejemplo, la respuesta inmunitaria, el crecimiento neural, la neuroproteccion y la remielinizacion, y las correspondientes actividades terapeuticas indicadas en el presente documento. Dicho ensayo serla util en la identification de candidatos a farmaco de entre bibliotecas peptldicas y otras de moleculas pequenas, sueros y otros fluidos corporales relevantes, y en el desarrollo de farmacos que serlan especlficos bien en la estimulacion o bien en la inhibition de una actividad celular concreta, o que potenciarlan dicha actividad, en tiempo o en nivel de actividad. Por ejemplo, dichos farmacos podrlan usarse para estimular la remielinizacion o para tratar otras enfermedades o lesiones, como, por ejemplo, al hacer las neuronas del SNC capaces o con mejor capacidad para adaptarse en el recrecimiento o regeneration.

Asimismo, la presente invention se extiende al desarrollo de anticuerpos correspondientes a los agentes neuromoduladores de la invencion, incluidos los anticuerpos naturales y preparados de forma recombinante. Por 5 ejemplo, los anticuerpos podrlan usarse para la detection selectiva en bibliotecas de expresion para obtener el gen o genes que codifican los peptidos que pueden funcionar como agentes neuromoduladores y que podrlan funcionar en, por ejemplo, una vacuna. Dichos anticuerpos podrlan incluir anticuerpos tanto policlonales como monoclonales preparados mediante tecnicas geneticas conocidas, as! como anticuerpos biespeclficos (quimericos) y anticuerpos que incluyen otras funcionalidades que las hacen adecuadas para uso diagnostico adicional junto con su capacidad para emular o modular la actividad de los autoanticuerpos humanos que son parte de los agentes neuromoduladores de la presente invencion.

Por tanto, los agentes neuromoduladores, sus analogos y/o analogos, y cualquier antagonista o anticuerpo que se puede producir frente a ellos, se pueden usar en relation con varias tecnicas diagnosticas, incluidos inmunoensayos, tales como radioinmunoensayo, usando, por ejemplo, un anticuerpo frente a los agentes neuromoduladores que se ha marcado con adicion radioactiva o radioyodinacion.

En un inmunoensayo se puede preparar una cantidad control de los antagonistas o anticuerpos de los mismos, o similares, y marcar con una enzima, una pareja de union especlfica y/o un elemento radioactivo, y despues se puede introducir en una muestra celular. Despues de que el material marcado, o su(s) pareja(s) de union ha tenido la oportunidad de reaccionar con sitios dentro de la muestra, la masa resultante se puede analizar mediante tecnicas conocidas, que pueden variar con la naturaleza del marcador unido.

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En el caso en el que se use un marcador radioactivo, como los isotopos H, C, P, S, Cl, Cr, Co,

CQ CQ Q|-| A SJC A 0-1 A 1

Co, Fe, Y, I, I y Re, se pueden usar procedimientos de recuento conocidos disponibles en la actualidad. En el caso en el que el marcador es una enzima, la deteccion se puede conseguir mediante cualquiera de las tecnicas colorimetricas, espectrofotometricas, fluoroespectrofotometricas, amperometricas o gasometricas usadas en la actualidad conocidas en la materia.

La presente divulgation incluye un sistema de ensayo que se puede preparar en forma de un kit de ensayo para el analisis cuantitativo de la extension de la presencia de los agentes neuromoduladores o para identificar farmacos u otros agentes que pueden imitar o bloquear su actividad. El sistema o kit de ensayo puede comprende un componente marcado preparado mediante una de las tecnicas radioactivas y/o enzimaticas tratadas en el presente documento, acoplar un marcador a los agentes neuromoduladores, sus agonistas y/o antagonistas y uno o mas reactivos inmunoqulmicos adicionales, al menos uno de los cuales es un ligando libre o inmovilizado, capaces de unirse al componente marcado, a su pareja de union, a uno de los componentes que se va a determinar o a su(s) pareja(s) de union.

En una realization adicional, la presente invencion se refiere a autoanticuerpos para usar en ciertos procedimientos terapeuticos que se basarlan en la actividad de los agentes neuromoduladores, sus subunidades, o fragmentos activos de los mismos, equivalentes peptldicos de los mismos, analogos de los mismos, o en agentes u otros farmacos que se haya determinado que poseen la misma actividad. Un primer procedimientos terapeutico se asocia con la prevention de las manifestaciones de afecciones relacionadas causalmente o despues de la actividad de union de los anticuerpos o sus subunidades, y comprende administrar un agente capaz de estimular la produccion y/o actividad de los agentes neuromoduladores, los correspondientes autoanticuerpos, peptidos de anticuerpos, fragmentos activos o subunidades de los mismos, bien individualmente o mezclados entre si en una cantidad eficaz para prevenir o tratar el desarrollo de dichas afecciones en el huesped. Por ejemplo, se pueden administrar farmacos u otras parejas de union a los anticuerpos o sus fragmentos, o similares, para potenciar la actividad neuroregeneradora y/o neuroprotectora, o para estimular la remielinizacion como en el tratamiento de la esclerosis multiple.

Mas especlficamente, el procedimiento terapeutico al que en general se hace referencia en el presente documento podrla incluir el procedimiento para el tratamiento de varias enfermedades u otras disfunciones y desorganizaciones celulares, mediante la administration de composiciones farmaceuticas que pueden comprender

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inhibidores o potenciadores eficaces de la activacion de los agentes neuromoduladores u otros farmacos igualmente eficaces, por ejemplo, mediante un ensayo de deteccion selectiva de farmacos preparado y usado de acuerdo con un aspecto de la presente invencion tratado anteriormente. Por ejemplo, farmacos u otras parejas de union a los agentes neuromoduladores o protelnas similares, que tienen secuencias correspondientes, al menos en parte, a las secuencias representadas por la FIGURA 39 (SEC ID N° 27), FIGURA 40 (SEC ID N° 29), FIGURA 41 (SEC ID N° 31), FIGURA 42 (SEC ID N° 33) se pueden administrar para inhibir o potenciar la neuroregeneracion, neuroproteccion o remielinizacion, como en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson o esclerosis multiple. En particular, la protelna de CB2iE12 presentada en las FIGURAS 39 y 40, y/o las de CB2iE7 presentadas en las FIGURAS 41 y 42, sus anticuerpos, agonistas, antagonistas o fragmentos activos de los mismos, se podrlan preparar en formulaciones farmaceuticas, incluidas vacunas, para administrar en los casos en los que la terapia neuroregeneradora y/o neuroprotectora o desmielinizacion es adecuada, tal como para tratar la enfermedad de Alzheimer, ELA, EM, enfermedad de Parkinson o lesiones en la medula espinal. La presente invencion incluye combinaciones o mezclas de los anticuerpos proporcionados en el presente documento, en el que mas de uno de los anticuerpos, particularmente anticuerpos humanos, mas particularmente seleccionados del grupo de CB2iE12 y CB2iE7, se pueden preparar en composiciones o formulaciones farmaceuticas y terapeuticas. Ademas, la invencion proporciona combinaciones adicionales del(los) anticuerpo(s) como compuestos terapeuticos, farmacos o agentes utiles en dicha terapia neuroregeneradora y/o neuroprotectora o de remielinizacion. Por ejemplo, la formulacion o composicion de anticuerpo de la presente invencion se puede combinar con compuestos terapeuticos para el tratamiento de la esclerosis multiple, incluidos, entre otros, formulaciones con interferon beta ((Betaseron, etc.) y copollmero 1 (Copaxone).

De acuerdo con esto, es un objeto principal de la presente invencion proporcionar agentes neuromoduladores, incluidos autoanticuerpos humanos y los correspondientes peptidos de anticuerpo, haptenos, analogos y fragmentos activos de los mismos en forma purificada, que exhibe ciertas caracterlsticas y actividades asociadas con la estimulacion de la actividad neuroregeneradora y/o neuroprotectora.

Es otro objeto de la presente divulgacion proporcionar un procedimiento para detectar la presencia, la cantidad y la actividad de los autoanticuerpos en mamlferos en los que se sospecha que ha estados patologicos invasivos, espontaneos o idiopaticos.

Es otro objeto de la presente divulgacion proporcionar un procedimiento y un sistema de ensayo asociado para la deteccion selectiva de sustancias, tales como farmacos, agentes y similares, potencialmente eficaces en la simulacion de la actividad o para combatir cualquier efecto adverso de los autoanticuerpos y/o sus fragmentos, subunidades o similares, en mamlferos.

Por tanto, es un objeto de la presente invencion proporcionar procedimientos para tratar enfermedades desmielinizantes en mamlferos, tales como esclerosis multiple en seres humanos, y enfermedades virales del sistema nervioso central de seres humanos y animales domesticos, tales como encefalomielitis postinfecciosa, o inhibir profilacticamente la iniciacion o progresion de la desmielinizacion en estos estados patologicos, usando los autoanticuerpos monoclonales descritos, fragmentos activos de los mismos, u otros autoanticuerpos naturales o sinteticos que tienen las caracterlsticas de los anticuerpos humanos ejemplificados por CB2iE12 y CB2iE7.

Es un objeto adicional de la presente invencion proporcionar procedimientos in vitro de produccion y estimulacion de la proliferation de celulas gliales, tales como oligondendrocitos, y al uso de estas celulas gliales para tratar enfermedades desmielinizantes.

Es todavla un objeto adicional de la presente invencion proporcionar los presentes agentes neuromoduladores, y composiciones farmaceuticas, que incluyen vacunas que comprenden las mismas, para uso en procedimientos terapeuticos que comprenden, o se basan en, los presentes agentes neuromoduladores, y, particularmente, los autoanticuerpos humanos, fragmentos, incluidos fragmentos peptldicos, haptenos, subunidades, agonistas, pareja(s) de union, o en agentes o farmacos que controlan la produccion o que imitan o antagonizan las actividades de los agentes neuromoduladores.

Es todavla un objeto adicional de la presente divulgacion proporcionar procedimientos de ensayo que incluyen ensayos de selection, para la identification de farmacos y otras moleculas que imitan o antagonizan los agentes neuromoduladores de la invencion y que, en consecuencia, se pueden considerar para uso como agentes terapeuticos.

Otros objetos y ventajas seran evidentes para los expertos en la tecnica desde una revision de la description siguiente, que procede en referencia a las siguientes figuras ilustrativas.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La FIGURA 1 comprende fotograflas que muestran que los anticuerpos policlonales humanos y los

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anticuerpos IgM monoclonales humanos derivados de suero (sHIgMs) se unen con una especificidad alta a los antigenos de superficie sobre las celulas en laminas de cerebelo. Marcaje inmunofluorescencia indirecta de laminas sin fijar de cerebelo de rata posnatal. Los sHIgM muestran una variedad de especificidades por poblaciones y estructuras celulares dentro de una lamina de cerebro sin fijar. Esta propiedad se uso como uno de los criterios para seleccionar anticuerpos candidatos para analizar in vivo la capacidad para estimular la remielinizacion (vease la Tabla 1 y la Figura 12). La IgG policlonal humana se une muy debilmente a muchas estructuras dentro del cerebelo, incluida la sustancia blanca y las celulas de Purkinje (A), mientras que la IgM humana policlonal se une fuertemente a la mielina y los oligodendrocitos dentro de la sustancia blanca central de las hojas, los cuerpos de las celulas de Purkinje y muchas celulas pequenas dentro de la capa granular y molecular (B). sHIgM 22 (C) se une bien al citoesqueleto de los astrocitos danados sobre la sustancia blanca central de las hojas, celulas de Purkinje y sus arborizaciones dendriticas y a celulas redondas pequenas en la capa molecular. sHIgM 22 marca debilmente, pero uniformemente, marca la superficie de las celulas granulares. sHIgM 14 (D) se une bien a las celulas de la capa granular y las celulas de Purkinje localizadas en la superficie de la lamina, mientras que la sustancia blanca central de las hojas esta considerablemente desprovista de marcador. sHIgM 1 (E) marca el citoesqueleto de los astrocitos sobre la sustancia blanca central de las hojas. Las demas estructuras se identifican justo por encima de 10 los niveles de fondo. SHIgM2 (F) se une a las celulas de la capa granular y a las fibras que atraviesan la sustancia blanca central de las hojas. Aumento x.

La FIGURA 2 comprende fotografias que muestran que sHIgMs adicionales se unen con una especificidad elevada a las celulas en las laminas del cerebelo. Marcaje de inmunofluorescencia indirecta de laminas sin fijar de cerebelo de rata posnatal. Los sHIgM muestran una variedad de especificidades por poblaciones y estructuras celulares dentro de una lamina de cerebro sin fijar. sHIgM 12 (A) se une y da un aspecto esponjoso a la sustancia blanca central de las hojas y un marcaje uniforme sobre la capa molecular, reminiscente de una molecula de la matriz extracelular. Los astrocitos que se encuentran encima tambien estan bien definidos. sHIgM 29 (B) se une muy debilmente a muchas estructuras dentro del cerebelo, con una intensidad justo por encima de la de fondo, a excepcion de una poblacion pequena de neuronas en las capas granular y molecular. Las extensiones axonicas sobre 100 (m de longitud estan claramente delineadas. sHIgM 31 (C) y sHIgM 50 (F), cada uno, se unen predominantemente a la capa granular, con poca union a la sustancia blanca, celulas de Purkinje o astrocitos. El patron de union de sHIgM 50 es tambien reminiscente de una molecula de matriz extracelular. sHIgM 42 (D) se une en un patron fibroso a toda la hoja, las capas molecular y granular y a la sustancia blanca. sHIgM 46 (E) se une en un patron fibroso a la capa granular y a la sustancia blanca. Los cuerpos de las celulas de Purkinje estan bien definidos.

La FIGURA 3 comprende fotografias que muestran que sHIgM se unen con una especificidad elevada a las laminas sin fijar de sustancia blanca cortical humana de adulto. Marcaje de inmunofluorescencia indirecta de laminas sin fijar de sustancia blanca cortical humana de adulto. La sustancia blanca cortical humana se obtuvo en autopsia de un individuo sin infeccion ni traumatismo del SNC, La causa de la muerte fue otra no relacionada con el SNC. El tejido se mantuvo eh hielo y se mantuvo frio durante todo el procedimiento de marcaje con anticuerpo. sHIgM 2 (A) se une solo a unas pocas celulas dentro del campo de vision. En contraste, otras sHIgM se unen a la sustancia blanca humana bastante bien y con un grado alto de especificada. sHIgM 32 se une a las celulas de aspecto de astrocito de tipo 2 (C), mientras que sHIgM 31 se une a muchos cuerpos celulares redondos no identificados (B). sHIgM 26 se une a celulas de aspecto de oligodendrocitos y a sustancia blanca fibrosa (E). sHIgM 22 se une a la sustancia blanca cortical humana de un modo que sugiere una molecula unida a matriz extracelular (D). Aumento x.

La FIGURA 4 comprende fotografias que muestran que los anticuerpos IgM monoclonales derivados del clon de celulas B humanas inmortalizadas con EBV (ebvHIgM) se unen con una especificidad alta a los antigenos de superficie sobre las celulas en el cerebelo. Marcaje de inmunofluorescencia indirecta de laminas sin fijar de cerebelo de rata posnatal. Los ebvHIgM muestran una variedad de especificidades por poblaciones y estructuras celulares dentro de una lamina de cerebro de rata sin fijar. ebvHIgM MSI19E15 (A) se une a estructuras fibrosas dentro de la sustancia blanca y a las capas granular y molecular en un patron de casi confluencia. ebvHIgM AKJJR4 (B) se une casi exclusivamente a la capa granular. Las celulas pequenas dentro de la capa molecular tambien se identifican. ebvHIgMs MSI17A2 (C) y MSI20H10 (E) se unen a la sustancia blanca central las capas granular y molecular y las celulas de Purkinje con varios grados de intensidad. ebvHIgM MSI16E6 (D) demuestra una afinidad muy fuerte por las celulas de Purkinje y sus arboles dendriticos, mientras que la capa granular esta marcada mucho menos claramente. ebvHIgM MSI7E11 (F) se une de un modo puntual a solo unas pocas celulas de aspecto glial en la superficie de la lamina cerebral. Aumento x.

La FIGURA 5 muestra que ebvHIgM adicionales que se unen con una especificidad elevada a los antigenos de superficie sobre las celulas en las laminas del cerebelo. Marcaje inmunofluorescencia indirecta de laminas sin fijar de cerebelo de rata posnatal. Los ebvHIgM muestran una variedad de especificidades por poblaciones y estructuras celulares dentro de una lamina de cerebro sin fijar. Cada panel muestra el extremo terminal de una unica hoja cerebelar, incluida la sustancia blanca central, y las capas granular, de Purkinje y

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molecular. Los sobrenadantes que contienen ebvHIgM se incubaron a 1:1 con medio tamponado sobre laminas de cerebro. Muchos ebvHIgM se unen a la sustancia blanca, los cuerpos de las celulas de Purkinje y a celulas pequenas dentro de la capa molecular, pero con afinidades variables. ebvHIgM MSI19D10 (A) se une fuertemente a las celulas de la capa granular y a las celulas de Purkinje y a sus arboles dendrlticos, ademas de identificar debilmente la sustancia blanca y los astrocitos. ebvHIgM MSI19D10 se analizo segun su capacidad para estimular la remielinizacion in vivo (vease la Tabla 1 y la Fig. 13). Se han aislado otros ebvHIgMs, CB2bG8 (B), CB2eC2 (C), CB2iE12 (D), y MSI10E10 (F) de union en el cerebro y se requieren estudios adicionales, pero no se han analizado in vivo. CB2eC2 (E) es la intensidad tlpica de un sobrenadante no reactivo. Aumento x.

La FIGURA 6 muestra que la IgM humana policlonal se une a los oligodendrocitos en cultivo. Mediante inmunohistoqulmica, la IgM humana policlonal tine la superficie de una subpoblacion de oligodendrocitos. No se observo reactividad a los antlgenos de superficie de los oligodendrocitos con IgG humana policlonal u sueros de sHIgM 1 o SHIgM 2. Inmunocitoqulmica con IgM o IgG humana combinada en celulas fijadas y permeabilizadas mostro una tincion minima de las estructuras intracelulares.

La FIGURA 7 muestra que sHIgM se unen con una especificidad elevada a los antlgenos de superficie sobre las celulas gliales en cultivo. Marcaje de inmunofluorescencia indirecta de cultivos de celulas gliales mixtas primarias de ratas vivas a los nueves dlas del sembrado. sHIgM demuestran varias especificidades respecto a os tipos celulares unidos, as! como la etapa de diferenciacion celular identificada en los cultivos de celulas gliales. sHIgM 12 se une a grupos de posibles progenitores de oligodendrocitos (A, marcador verde) en la niebla de los oligodendrocitos OD4 + mas maduros (A, marcador rojo). sHIgM 22 se une a los oligodendrocitos en las etapas maduras (B) adherentes a la superficie del cultivo glial. sHIgM 46 se une fuertemente a las etapas maduras de los oligodendrocitos (C, centro de la figura) y a las etapas inmaduras de los oligodendrocitos con un marcador punteado mas debil (C, izquierda de la figura). sHIgM 42 (D) y sHIgM 51 (F) se unen ambas a las etapas maduras de los oligodendrocitos y debilmente, a los astrocitos subyacentes. sHIgM 30 se une a los cuerpos celulares de la mayorla de las celulas en cultivo, mientras que no se delinean extensiones del proceso (E).Aumento x.

La FIGURA 8 muestra que las sHIgM se unen a las celulas del linaje de los oligodendrocitos en laminas de cerebelo y cultivos de celulas gliales primarias mixtas. Las celulas identificadas por los sHIgM se marcan de forma conjunta con marcadores para el linaje de los oligodendrocitos. Las celulas que se unen a sHIgM 22 en una lamina sin fijar de cerebelo de rata neonata co- marcan el anticuerpo Rip, un marcador citoplasmatico para etapas maduras de los oligodendrocitos. Las imagenes confocales de doble marcador demuestran que las celulas positivas para sHIgM 22 (A) tambien son positivas para Rip (C). Las imagenes (A) y (C) se fusionan en (E). Las celulas que se unen a sHIgM 51 en cultivos de celulas gliales de rata primarias mixtas (B) tambien son positivos 04 (D). 04, una anti-sulfatida, es un marcador bien establecido para el linaje de oligodendrocitos que aparece antes del cese de la proliferacion y se mantiene en la vaina de mielina adulta. Las imagenes (B) y (D) se fusionan en (F). Aumento x.

La FIGURA 9 muestra que las sHIgM se unen a las celulas del linaje de los oligodendrocitos en laminas de cerebelo y cultivos de celulas gliales primarias mixtas. Las celulas identificadas por ebvHIgM MSI19E5 en una lamina sin fijar de cerebelo de rata neonata co-marcan el anticuerpo 04, una una anti-sulfatida y marcador de superficie celular para oligondendrocitos. Las imagenes confocales de doble marcador de celulas dentro de la sustancia blanca de las hojas demuestran que las celulas positivas demuestran celulas positivas para ebvHIgM MSI19E5 (A) que tambien son positivas para 04 (B), Las imagenes (A) y (B se fusionan en (C).

La FIGURA 10 presenta los resultados de la detection selectiva de sHIgM segun la union a los antlgenos del SNC encontrados en el homogeneizado de medula espinal. Los sHIgMs se sometieron a deteccion selectiva por su union al homogeneizado de medula espinal unido a placas de poliestireno. La mayoria de los antlgenos que se unen a la placa son lipidos y proteinas de la sustancia blanca de la medula espinal. Por tanto, la union fuerte al homogeneizado de SCH se puede interpretar como union a los componentes de la sustancia blanca. Solo 1 sHIgM se une al SCH con una DO superior a 1, sHIgM 22. Este anticuerpo tambien se une bien a laminas cerebrales, los oligodendrocitos en cultivo, y se ha analizado la capacidad de estimular la remielinizacion in vivo (vease la Tabla 1). Se ha demostrado que este sencillo ensayo es una potente herramienta en la prediction de la capacidad de un anticuerpo para estimular la remielinizacion in vivo. Otros SHIgM que se unen bien a SCH (tal como 38 y 49) se estan estudiando.

La FIGURA 11 muestra los resultados de la deteccion selectiva de ebvHIgM segun la union a los antlgenos del SNC encontrados en el homogeneizado de medula espinal. Los ebvHIgM se sometieron a deteccion selectiva por su union al homogeneizado de medula espinal unido a placas de poliestireno. Cuatro ebvHIgM se unieron al homogeneizado de SCH con una DO superior a 1. Uno de estos, MSI19D10 se ha analizado segun su capacidad para estimular la remielinizacion in vivo. (vease la Tabla 1). Tambien se ha analizado in vivo un anticuerpo de union baja, AKJR4 (vease la Tabla 1). Otro anticuerpo de union fuerte, AKJR8, se esta estudiando. Los clones CB2iH1 y CB1bD2, producen muy poco anticuerpo en cultivo. De nuevo, se ha

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demostrado que este sencillo ensayo es una potente herramienta para la detection selectiva de anticuerpos y en la prediction de la capacidad de un anticuerpo para estimular la remielinizacion in vivo.

La FIGURA 12 demuestra que los anticuerpos policlonales humanos y un sHIgM estimulan la remielinizacion en ratones infectados con TMEV. Fotomicrograflas opticas de regiones de patologla de la mielina en medulas espinales de ratones SJL/J infectados cronicamente con TMEV. Se observa extensa remielinizacion del SNC, caracterizada por vainas de mielina finas en relation con el diametro del axon, en ratones tras el tratamiento con IgG (A) policlonal humana, IgM (B) policlonal humana y sHIgM 22 (C). Se observo desmielinizacion sin remielinizacion significativa en ratones tratados con sHIgM 14 (D), sHIgM 1(E) y sHIgM 2. Secciones embebidas en radita se tineron con 1 % de p-fenilendiamina. Aumento x. Se ha demostrado que la IgM policlonal humana es superior en la capacidad de estimular la remielinizacion in vivo a la IgG policlonal humana (Tabla 1). Parece que la especificidad fuerte del SNC es uno de los requisitos para que un anticuerpo estimule la remielinizacion in vivo, pero sola no es suficiente para predecir la capacidad del anticuerpo para estimular la remielinizacion.

La FIGURA 13 muestra que un ebvHIgM puede estimular la remielinizacion en ratones infectados con TMEV. Fotomicrograflas opticas de regiones de patologla de la mielina en medulas espinales de ratones SJL/J infectados cronicamente con TMEV. Se observa extensa remielinizacion del SNC, caracterizada por vainas de mielina finas en relacion con el diametro del axon, en ratones tras el tratamiento con ebvHIgM MSI19D10 (A). Se observo desmielinizacion sin remielinizacion significativa en ratones tratados con ebvHIgM AKJR4 (B). Secciones embebidas en radita se tineron con 1 % de p-fenilendiamina. De nuevo, parece que la especificidad fuerte del SINC es uno de los requisitos para que un anticuerpo estimule la remielinizacion in vivo, pero sola no es suficiente para predecir la capacidad del anticuerpo para estimular la remielinizacion.

La FIGURA 14 presenta la cuantificacion de axones mielinados en lesiones de lisolecitina tratadas con IgM policlonal humana. Los axones remielinizados/mm2 en lesiones de lisolecitina tratadas frente a sin tratar. Hay un numero significativamente mayor de axones mielinados en lesiones de lisolecitina tratadas con IgM policlonal humana que los animales tratados con IgG policlonal humana (p<0,05). Un animal del grupo control con PBS remielinizo de forma espontanea y, por tanto, la diferencia entre los grupos tratados con anticuerpo humano y el grupo control no es estadlsticamente significativa (p> 0,05).

La FIGURA 15 demuestra que los anticuerpos humanos son polirreactivos a los haptenos qulmicos mediante ELISA. Las especificidades de union a antlgeno de las inmunoglobulinas se evaluaron mediante ELISA directo. Reactividades qulmicas de hapteno de IgM policlonal humana, IgG policlonal humana. Abreviaturas usadas en estas figuras: NP, (4-hidroxi-3-nitrofenil)acetilo; PhoX, feniloxazolona; TMA, azofeniltrimetilamonio; FITC, fluorescelna; PC, azofenilfosforil-colina; ARS, azofenilarsonato; TNP, trinitrofenil acetilo.

La FIGURA 16 muestra que los anticuerpos humanos son polirreactivos a la autoprotelna mediante ELISA. Las especificidades de union a antlgeno proteico de las inmunoglobulinas se evaluaron mediante ELISA directo. Abreviaturas usadas en estas figuras: MBP, protelna basica de la mielina; KLH, hemocianina de lapa californiana; HEL, lisozima de huevo de gallina; BSA, seroalbumina bovina; Rbt, conejo; Bo, bovino; Mo Hb, hemoglobina de raton.

La FIGURA 17 presenta las secuencias de la region variable de la cadena pesada de sHIgM 22. La secuencia esta alineada de acuerdo con el sistema de numeracion de las secuencias VH humanas en la publicacion: Sequences of Proteins of Immunological Interest, Vol I, Quina Edition (1991), Kabat E.A., Wu, T.T., Perry, H.M. Gottesman, K.S. y Foeller, C., NIH Publication. La VH de sHIgM 22 es un miembro del subgrupo III de VH. Los aminoacidos subrayados se han confirmado mediante secuenciacion de protelnas. La secuencia de aminoacidos corresponde a la secuencia de nucleotidos de sHIgM 22. Las secuencias de tipo A y B de VH de SHIgM 22 se representan solo con nucleotidos que difieren de las secuencias de la llnea germinal de IGHV3- 30/3-30-05*01, IGHJ4*02 y IGHD2- 21*02. Dos sustituciones de aminoacidos en la secuencia proteica de la VH de sHIgM 22 de tipo B estan impresas en negrita. Las secuencias de la VH de sHIgM 22 de tipo A y de tipo B coincidieron mas estrechamente con la secuencia de la llnea germinal de IGHV3-30/3-30-5*01 (homologla del 96 %). Referencias para las secuencias de la llnea germinal: IMGT, base de datos internacional ImMunoGeneTics [
http://imgt.cnusc.fr:8104]. (Iniciador y coordinador: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Francia)

La FIGURA 18 presenta las secuencias de la region variable de la cadena ligera de sHIgM 22. La secuencia esta alineada de acuerdo con el sistema de numeracion de las secuencias VH humanas en la publicacion: Sequences of Proteins of Immunological Interest, Vol I, Quina Edicion (1991), Kabat E.A., Wu, T.T., Perry, H.M. Gottesman, K.S. y Foeller, C., NIH Publication. VA de sHIgM 22 es un miembro del subgrupo lambda I. Los aminoacidos subrayados se han confirmado mediante secuenciacion proteica. La secuencia de aminoacidos corresponde a la secuencia de nucleotidos de sHIgM 22. Las secuencias de tipo I y II de VA de SHIgM 22 se representan solo con nucleotidos que difieren de las secuencias de la llnea germinal de IGLV1-

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51*01 y IGLJ3*01 . Dos sustituciones de aminoacidos en la secuencia proteica de la VA de sHIgM 22 de tipo II estan impresas en negrita. Las secuencias de de sHIgM 22 coincidlan mas estrechamente con la secuencia de la llnea germinal IGLV-51*01 (homologla del 97 %). Los dos genes difieren de su ancestro comun en un solo cambio de nucleotido. Referencias para las secuencias de la llnea germinal: IMGT, base de datos internacional ImMunoGeneTics [
http://imgt.cnusc.fr:8104]. (Iniciador y coordinador: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Francia)

La FIGURA 19 presenta las secuencias de la region variable de la cadena pesada de ebvHIgM MSI19D10.

La FIGURA 20 presenta las secuencias de la region variable de la cadena ligera de ebvHIgM MSI19D10.

La FIGURA 21 demuestra que los anticuerpos monoclonales que estimulan la remielinizacion producen un flujo de Ca2+ en las celulas gliales en cultivo. Los tres paneles demuestran las respuestas de Ca2+ de las celulas gliales a cuatro anticuerpos diferentes. Dos que estimulan la remielinizacion in vivo, sHIgM 22 (A) y SCH94.03 (B), y dos que no estimulan la remielinizacion, sHIgM 14 (panel C) y CH12 (C). Las celulas que respondieron exhiblan uno de dos tipos diferentes de contaminantes de calcio, un pico rapido inmediatamente tras la adicion del anticuerpo (A y B, trazas rojas) o un pico mas ancho que aparece con un retraso corto tras la adicion del anticuerpo (A y B, trazas negras). Los triangulos pequenos coloreados en el eje del tiempo representan el momento en el que se anadio el anticuerpo (o ionoforo). Los anticuerpos sHIgM 22 and SCH94.03 provocaron ambos tipos de respuestas, pero de diferentes subpoblaciones ce celulas gliales (paneles A y B). Los anticuerpos sHIgM14 y CH12, que no estimulan la remielinizacion in vivo, no se observo que causaran el flujo de calcio en cultivos de glia (panel C). Al final de cada experimento, el ionoforo de calcio Br-A23187 se anadio a cada cultivo como control de la integridad celular. La adicion del ionoforo a celulas viables produce una gran entrada de Ca2+ que es evidente en cada uno de los experimentos que se representan.

La FIGURA 22 demuestra que sHIgMs y ebvHIgMs se unen a neuronas primarias en cultivo. El marcaje con 15 inmunofluorescencia indirecta de celulas granulares de rata primarias vivas a los seis dlas en cultivo, sHIgM 12 se une a casi todos los axones y extensiones dendrlticas de celulas granulares cerebelares en cultivo (A). El patron de union es similar al observado con los anticuerpos anti-gangliosidos, tal como el anticuerpo A2B5 de raton. Se ha demostrado que A2B5 estimula la remielinizacion in vivo (Asakara y col., 1998). ebvHIgM CB2iE12 solo se une a cuerpos celulares granulares y a sus extensiones axonales proximales (B). El antlgeno reconocido por CB2iE12 esta regulado en el desarrollo, ya que celulas granulares en cultivo son negativas para la tincion con CB2iE12 hasta 4-5 dlas despues de la siembra en la placa. Aumento x.

La FIGURA 23 demuestra que el anticuerpo monoclonal de raton SCH94.03 se une a la superficie de las celulas granulares en cultivo. Marcaje con inmunofluorescencia indirecta y la imagen confocal en serie demuestra que el anticuerpo monoclonal de raton SCH94.03 se une a la superficie de las neuronas granulares en cultivo. La serie de imagenes se tomo separadas por 1 um y claramente muestran los anillos circulares concentricos previstos de un cuerpo celular esferico marcado externamente con extensiones del proceso.

La FIGURA 24 representa la metodologla usada para cuantificar la sustancia blanca, la patologla de la sustancia blanca y la remielinizacion en las medulas espinales de ratones infectados con TMEV. Fotomicrogaflas opticas de una seccion de medula espinal a nivel toracico de un raton SJL/J infectado cronicamente con TMEV y tratado con IgM policlonal humana (A). La sustancia blanca en la periferia se tine de forma mas oscura que la sustancia gris central mas clara. El area de sustancia blanca total esta trazada (indicada por las llneas rojas) con un aumento de 40x. Despues, las areas de patologla de la sustancia blanca estan trazadas (indicada por las llneas verdes) con un aumento de 100x. En este ejemplo, las areas de patologla de la sustancia blanca aparecen como areas mas ligeras en la periferia de la seccion. Por ultimo, a un aumento de 250x, las areas de remielinizacion de OL (indicadas por las llneas azules) y de remielinizacion de SC (indicadas por la llnea amarilla) estan trazadas. La remielinizacion de OL se caracteriza por vainas finas de mielina en relacion con el diametro del axon. El porcentaje de area de patologla de la sustancia blanca se calcula dividiendo el area de color verde por el area de color rojo x 100. El porcentaje de area de remielinizacion de OL se calcula dividiendo el area de color azul por el area de color verde x 100. Se trazan diez secciones transversales de medula espinal para cada animal considerado y las areas se combinan para calcular una puntuacion para dicho animal. En general, en cada grupo experimental se tratan 7-8 animales para contar con las muertes y con los animales que no contienen al menos un 5 % de patologla de sustancia blanca. Normalmente, 4-5 animales tratados cumplen los criterios de inclusion en el conjunto de datos final. Un campo de aumento alto de la sustancia blanca de la columna dorsal (B, del area indicada con el asterisco en A) demuestra una remielinizacion de OL significativa (flecha). Las barras a escala son 250 pm en A y 20 pm en B.

La FIGURA 25 tras tratamiento con Ac humanos, ratones infectados cronicamente con TMEV demuestra

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remielinizacion significativa de OL. Microfotograflas opticas de areas representativas de patologla de sustancia blanca de la medula espinal de diferentes grupos de tratamiento. El tratamiento con IVIg tuvo como resultado una significativa remielinizacion de OL (A). Se observo una remielinizacion casi completa, caracterizada por vainas de mielina finas densamente empaquetadas en relacion con el diametro del axon (B, punta de la flecha), en secciones de medula espinal de ratones tras el tratamiento con IgM policlonal humana (B) y AcMo humanos sHIgM 22 (F) y sHIgM46 (G). En contraste, tras el tratamiento con AcMo sHIgMI (C), sHIgM2 (D), sHIgM14 (E) o PBS (H), los ratones mostraron patologla de la sustancia blanca sin una remielinizacion significativa de OL. Tambien fueron evidentes las celulas inflamatorias infiltrantes y los macrofagos que ingieren los restos de mielina (A, punta de flecha), signos de destruccion activa de mielina. Secciones transversales de medula espinal en cuatro de ocho animales tratados con sHIgM22 y cinco de cinco animales tratados con sHIgM46 contenlan al menos un area de remielinizacion de OL casi confluente, un acontecimiento raro que indica significativa reparacion tisular. En contraste, las 10 secciones transversales de medula espinal de cada raton tratado con sHIgM1, sHIgM2, sHIgM14 o PBS no contenlan ninguna. La barra de escala es de 20 mm.

FIGURA 26 Los AcMo humanos aislados por su capacidad para unirse a OL de rata tambien se unen a la superficie de OL humanos en cultivo. sHIgM14 (A), que no estimularon la remielinizacion y sHIgM22 (B) y sHIgM46 (C), que estimularon la remielinizacion, se unieron al pericarion y elaboraron el proceso y las extensiones de membrana de los OL humanos positivos para sulfatida mantenidos en cultivo durante 3 semanas. sHIgM2 (D, canal verde) es un ejemplo de AcMo humano que no se unio a los OL humanos positivos para sulfatida (D, canal rojo). Los nucleos se marcan con color azul. IVIg, IgM policlonal humana y los AcMo humanos sHIgM1 y sHIgM2 no se unieron a la superficie de los OL humanos en ningun punto de tiempo analizado. La barra de escala es de 25 mm.

La FIGURA 27 presenta la secuencia de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo CB2b-G8 transformante con EBV.

La FIGURA 28 presenta la secuencia de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo CB2b-G8 transformante con EBV.

La FIGURA 29 Amplification del ARN de la cadena ligera y expresion de protelnas en celulas de hibridoma transfeccionadas mediante amplificacion con metotrexato de un plasmido de expresion que contiene dHfR. El plasmido de expresion que contiene la secuencia de codification para la cadena ligera kappa 94,03 humanizada bajo el control del promotor del MCV junto con un gen de dHfR unido bajo el control del promotor de SV40 se introdujo mediante electroporation en la llnea celular de hibridoma humano/de raton F3B6 negativa para inmunoglobulina. Las celulas bajo selection con metotrexato mlnimo (0,5 Qg/ml) y las que hablan sufrido una seleccion mas rigurosa (52,1 Qg/ml) se cultivaron para recoger el sobrenadante para evaluar la secrecion de la cadena ligera y ARN para evaluar la expresion del gen de la cadena ligera. El analisis de transferencia de tipo northern indica una amplificacion sustancial de la expresion de ARN en un clon (n° 5). La expresion proteica aumento tras la seleccion con metotrexato en el clon 4, pero no en el clon 5. Estos hallazgos indican que la amplificacion con metotrexato en ocasiones tiene como resultado la amplificacion del ARNm y de la expresion proteica mediante genes estrechamente unidos, pero, en otros casos, no se observa amplificacion de la transcription ni de la slntesis proteicas.

La FIGURA 30 Los vectores amplificables que codifican 94.03 humanizado y sHIgM 22. El panel superior es el vector prototipo que contiene la secuencia de codificacion de la cadena ligera 94.03 (k) y una construction genomica hlbrida que codifica la cadena pesada (p) 94.03. El panel inferior es una construccion similar que contiene las secuencias de codificacion derivadas de la secuencia de sHIgM 22.

La FIGURA 31 Cerebelo de rata posnatal tenido con 94.03 murino y humanizado. Secciones de cerebelo se tineron con 94.03 de raton y humanizado. El anticuerpo unido se localizo usando reactivo de anticuerpo secundario fluorescente especlfico de IgM de raton o humano, respectivamente. Ambos anticuerpos mostraron similares patrones de tincion a los de la sustancia blanca y los astrocitos del cerebelo.

La FIGURA 32 Aislamiento de una variante de IgG de 94.03. Una variante de desplazamiento natural de 94.03 se aislo del cultivo clasificando segun las celulas que expresan IgG en su superficie. Se muestran los perfiles de antes y despues de la clasificacion de los cultivos celulares. Las celulas IgG se aislaron de la poblacion posclasificacion mediante donation por dilution llmite. El anticuerpo producido se identifico como IgG1 usando anticuerpos especlficos de isotipo de IgG.

La FIGURA 33 Demostracion de que las celulas productoras de IgG1 eran, de hecho, una variante de 94.03. El ARN se aislo de las celulas que expresan IgG1. El ADNc se genero usando RT-PCR con cebadores especlficos de la region variable de 94.03 y la region constante del isotipo Q1. El ADN resultante se secuencio para demostrar la union de corte y empalme precisa prevista para una variante de desplazamiento espontaneo.

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La FIGURA 34 presenta la secuencia de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 09 de raton.

La FIGURA 35 presenta la secuencia de la region variable de la cadena ligera kappa 1 de la secuencia de la region variable de 09 de raton del anticuerpo 09 de raton.

La FIGURA 36 presenta la secuencia de la region variable de la cadena ligera kappa 2 del anticuerpo 09 de raton.

La FIGURA 37 de referencia presenta las secuencias de la region variable de la cadena pesada de AKJR4.

La FIGURA 38 de referencia presenta las secuencias de la region variable de la cadena ligera kappa de AKJR4.

La FIGURA 39 de referencia presenta las secuencias de la region variable de la cadena pesada de CB2iE12.

La FIGURA 40 de referencia presenta las secuencias de la region variable de la cadena ligera kappa de CB2iE12.

La FIGURA 41 de referencia presenta las secuencias de la region variable de la cadena pesada de CB2iE7.

La FIGURA 42 de referencia presenta las secuencias de la region variable de la cadena ligera kappa de CB2iE7.

La FIGURA 43 de referencia presenta las secuencias de la region variable de la cadena ligera kappa de MSI 19E5.

La FIGURA 44 presenta la cadena ligera kappa 2 del anticuerpo 04 de raton.

DESCRIPCION DETALLADA

La presente invencion se refiere a la estimulacion, regeneracion, proteccion y/o remielinizacion de los axones del sistema nervioso central en un mamlfero. Especlficamente, la presente invencion se refiere a autoanticuerpos para usar en procedimientos de estimulacion de la remielinizacion de los axones sistema nervioso central (SNC) usando un anticuerpo, particularmente un autoanticuerpo humano, incluidos anticuerpos del subtipo IgM y monomeros de la misma o un fragmento activos de los mismos, que se caracterizan por la capacidad para unirse a estructuras y celulas dentro del sistema nervioso central o un analogo sintetico o natural de los mismos. En una realizacion concreta, los anticuerpos proporcionados en el presente documento y usados en los procedimientos de la presente invencion se caracterizan por su capacidad para unirse a oligodendrocitos y, ademas, en particular, son capaces de estimular la proliferacion de celulas gliales.

De acuerdo con la presente invencion se pueden emplear tecnicas convencionales de biologla molecula, microbiologla y de ADN recombinante, dentro de la experiencia en la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la literatura. Vease, por ejemplo, Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumenes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumenes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Por tanto, si aparecen en el presente documento, los terminos siguientes tendran las definiciones que se indican a continuacion.

Con la expresion “agente(s) neuromodulador(es)”, como se usan en el presente documento de forma singular a lo largo de la presente solicitud y reivindicaciones, se quiere hacer referencia a una amplia clase de materiales que funcionan estimulando el sobrecrecimeinto de neuritas, la regeneracion y la remielinizacion con beneficios y efectos concretos sobre el SNC y, por tanto, incluye los anticuerpos de la presente invencion, incluyendo los anticuerpos del subtipo de IgM y monomeros de los mismos, y, particularmente, los autoanticuerpos humanos proporcionados en el presente documento, incluidos en las Tablas 2 y 3 en el presente documento, y, mas particularmente, en el presente documento se refiere a sHIgM22 (LIM 22), sHIgM46, ebvHIgM MSI19D10, y CB2bG8, analogos peptldicos, haptenos, monomeros, fragmentos activos de los mismos, agonistas, mimeticos y similares, incluyendo dichos materiales ya que pueden tener una similitud al menos parcial con las secuencias peptldicas indicadas en las FIGURAS 17-20, 27 y 28. Agente(s) neuromodulador(es) tambien incluye y abarca combinaciones o mezclas de mas de uno de los anticuerpos proporcionados en el presente documento, incluidos

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monomeros o fragmentos activos de los mismos.

Asimismo, las expresiones “agente neuromodulador”, “autoanticuerpo”, “peptido de anticuerpo”, “peptido”, “hapteno” y cualquier variante no indicada especlficamente, se pueden usar en el presente documento de forma intercambiable, en la medida en que pueden todos ellos hacer referencia e incluir material proteinaceo, incluidas protelnas sencillas o multiples, y se extiende a las protelnas que comprenden las secuencias de aminoacidos proporcionadas en el presente documento y presentadas en las FIGURAS 17-20, 27, 28 y 37-43 (SEC ID N° 1, 49, 5, 50, 9, 11, 13, 15, 23, 25, 27, 29, 31, 33 y 35), y el perfil de actividades indicadas en el presente documento y en las reivindicaciones. De acuerdo con eso, asimismo se contemplan las protelnas (particularmente anticuerpos, anticuerpos sinteticos, monomeros de los mismos y fragmentos activos de los mismos) que muestran una actividad sustancialmente equivalente o alterada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, como las modificaciones obtenidas mediante mutagenesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como las obtenidas mediante mutaciones en huespedes que producen el complejo o sus subunidades citadas. Asimismo, las expresiones "agente neuromodulador”, “autoanticuerpo”, “peptido de anticuerpo”, “peptido”, “hapteno” estan destinadas, cuando se adecuado, a incluir dentro de su alcance las protelnas especlficamente citadas en el presente documento, as! como todos los analogos sustancialmente homologos y variaciones alelicas.

Los residuos de aminoacidos descritos en el presente documento se prefiere que esten en la forma isomerica “L”. No obstante, los residuos en la forma isomerica “D” pueden estar sustituidos por cualquier residuo de L-aminoacido, siempre que el polipeptido conserve la propiedad funcional deseada de union a inmunoglobulina. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipeptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el extremo carboxi de un polipeptido. Manteniendo la nomenclatura estandar de polipeptidos, J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969), las abreviaturas para los residuos de aminoacidos se muestran en la siguiente Tabla de Correspondencia:

TABLA DE CORRESPONDENCIA

SIMBOLO

aminoAcido

1 letra

3 letras

Y

Tyr ti rosina

G

Gly glicina

F

Phe fenilalanina

M

Met metionina

A

Ala alanina

S

Ser serina

I

Ile isoleucina

L

Leu leucina

T

Thr treonina

V

Val valina

P

Pro Prolina

K

Lys lisina

H

His histidina

Q

Gln glutamina

E

Gln acido glutamico

W

Trp triptofano

R

Arg arginina

D

Asp acido aspartico

N

Asn aspargina

C

Cys cistelna

Cabe citar que todas las secuencias de residuos de aminoacidos se representan en la presente documento por formulas cuya orientacion a la izquierda o a la derecha esta en la direccion convencional del extremo amino al extremo carboxi. Ademas, cabe destacar que una barra inclinada al principio o final de una secuencia de residuos de

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aminoacidos indica un enlace peptldico a una secuencia posterior de uno o mas residuos de aminoacidos. La tabla anterior se presenta para correlacionar las notaciones de tres letras y de una letra que pueden aparecer alternativamente en el presente documento.

Un “replicon” es cualquier elemento genetico (p. ej., plasmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autonoma de replicacion de ADN un vivo, es decir capaz de replicarse bajo su propio control.

Un “vector” es un replicon, como un plasmido, fago o cosmido, al que se puede unir otro segmento de ADN de forma que se realiza la replicacion del segmento unido.

Una “molecula de ADN” se refiere a la forma polimerica de desoxirribonucleotidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma monocatenaria o una helice bicatenaria. Este termino solo se refiere a la estructura primaria y secundaria de la molecula, y no se limita a una forma terciaria concreta. Por tanto, este termino incluye ADN bicatenario que se encuentra, entre otros, en moleculas de ADN lineal (p. ej., fragmentos de restriccion), virus, plasmidos y cromosomas. Al tratar la estructura de las moleculas de ADN bicatenario concreto, las secuencias se pueden describir en el presente documento de acuerdo con la convencion normal de proporcionar unicamente la secuencia en la direccion 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de ADN (es decir, la hebra tiene una secuencia homologa al ARNm).

Un “origen de replicacion” se refiere a las secuencias de ADN que participan en la slntesis de ADN.

Una “secuencia codificadora” de ADN es una secuencia de ADN bicatenario que se transcribe y se traduce en un polipeptido in vivo cuando se introduce bajo el control de las secuencias reguladoras adecuadas. Los llmites de la secuencia codificadora estan determinados por un codon de iniciacion en el extremo 5' (amino) y un codon de finalizacion de la traduccion en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificadora puede incluir, entre otras, secuencias procarioticas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genomico de ADN eucariota (p. ej., de mamlfero) e incluso secuencias de ADN sinteticas. Una senal de poliadenilacion y una secuencia de terminacion de la transcripcion normalmente se localizaran en 3' de la secuencia de codificacion.

Las secuencias de control de la transcripcion y de la traduccion son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, senales de poliadenilacion, terminadores y similares, que proporcionan la expresion de una secuencia codificadora en una celula huesped.

Una “secuencia promotora” es una region reguladora de ADN capaz de unir la ARN polimerasa en una celula e iniciar la transcripcion de una secuencia codificadora (direccion 3') posterior. Para los fines de definir la presente invencion, la secuencia promotora se une a su extremo 3' mediante el sitio de inicio de la transcripcion y se extiende hacia arriba (en direccion 5') para incluir el numero mlnimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripcion a niveles detectables por encima del normal. Dentro de la secuencia promotora se encontrara un sitio de inicio de la transcripcion (convenientemente definido mediante mapeo con la nucleasa S1), as! como los dominios de union a protelna (secuencias consenso) responsables de la union de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas a menudo, aunque no siempre, contienen cajas “TATA” y cajas “CAT”. Los promotores eucariotas contienen secuencias de Shine-Dalgarno ademas de las secuencias consenso de -10 y -35.

Una “secuencia de control de la expresion” es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripcion y la traduccion de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificadora esta “bajo el control” de las secuencias de control de la transcripcion y la traduccion en una celula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificadora en ARNm, que a su vez se traduce en la protelna codificada por la secuencia codificadora.

Se puede incluir una “secuencia senal” antes de la secuencia codificadora. Esta secuencia codifica un peptido senal, N-terminal del polipeptido, que comunica a la celula huesped a dirigir el polipeptido a la superficie de la celula o a los organulos en el interior de la celula o a secretar el polipeptido en el medio y este peptido senal normalmente es escindido de la celula huesped antes de que la protelna salga de la celula. Las secuencias senal se pueden encontrar asociadas con una diversidad de protelnas nativas de procariotas y eucariotas.

El termino “oligonucleotido”, como se usa en el presente documento en referencia a las sondas de la presente invencion, se define como una molecula compuesta por dos o mas ribonucleotidos, preferentemente mas de tres. Si tamano exacto dependera de muchos factores que, a su vez, dependen de la funcion ultima y uso del oligonucleotido.

El termino “cebador”, como se usa en el presente documento se refiere a un oligonucleotido, natural como en un digesto de restriccion purificado o producido sinteticamente, que es capaz de actuar como punto de inicio de la slntesis cuando se introduce en las condiciones en las que la slntesis de un producto de extension del cebador, que es complementario a una hebra de acido nucleico, se induce, es decir, en presencia de nucleotidos y un agente inductor tal como una ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser monocatenario o bicatenario y debe ser lo bastante largo como para cebar la slntesis del producto de extension deseado en presencia

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del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependera de muchos factores, incluidos la temperatura, la fuente del cebador y el uso del procedimiento. Por ejemplo, para aplicaciones diagnosticas, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotldico normalmente contiene 15-25 o mas nucleotidos, aunque puede contener menos nucleotidos.

Los cebadores del presente documento se seleccionan de modo que sean “sustancialmente” complementarios a diferentes hebras de una secuencia de ADN diana concreta. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridar con sus respectivas hebras. Por tanto, la secuencia del cebador no tiene que reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento de nucleotido no complementario puede estar unido al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementaria a la hebra. Como alternativa, las bases no complementarias o secuencias mas largas pueden estar entrelazadas en el cebador, siempre que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la hebra para hibridar con ella y, de este modo, formar el molde para la slntesis del producto de extension.

Como se usa en el presente documento, las expresiones “endonucleasas de restriccion” y “enzimas de restriction” se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta el ADN bicatenario en o cerca de una secuencia de nucleotidos especlfica.

Una celula se ha “transformado” con ADN exogeno o heterologo cuando dicho ADN se ha introducido en el interior de la celula. El ADN transformante puede o no integrarse (unido de forma covalente) en el ADN cromosomico que compone el genoma de la celula. En procariotas, celulas de levadura o de mamlfero, por ejemplo, el ADN transformante se puede mantener en un elemento episomal, tal como un plasmido. Con respecto a las celulas eucariotas, una celula transformada de forma estable es una en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de modo que es heredada por las celulas hija a traves de la replication cromosomica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la celula eucariota para establecer llneas celulares o clones compuestos por una poblacion de celulas hija que contienen el ADN transformante. Un “clon” es una poblacion de celulas derivadas de una unica celula o ancestro comun mediante mitosis. Una “llnea celular” es un clon de una celula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro para muchas generaciones.

Dos secuencias de ADN son “sustancialmente homologas” cuando al menos aproximadamente el 75 % (preferentemente al menos aproximadamente el 80% y mas preferentemente al menos aproximadamente 90 o 95 %) de los nucleotidos coinciden con una longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homologas se pueden identificar comparando las secuencias usando un software estandar disponible en los bancos de datos de secuencia o en un experimento de hibridacion de tipo southern en, por ejemplo, condiciones estrictas tal y como se define para ese sistema concreto. La definition de las condiciones de hibridacion adecuadas esta dentro de la experiencia en la tecnica. Vease, por ejemplo, Maniatis y col., supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. En concreto, las secuencias de la region variable de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de la presente invention son sustancialmente homologas a una secuencia genica de llnea germinal correspondiente, que tiene una homologla de al menos aproximadamente un 90 % con una secuencia genica de llnea germinal correspondiente.

Debe apreciarse que dentro del alcance de la presente invencion tambien se encuentran las secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la invencion o un analogo peptldico, hapteno, o fragmento activo del mismo, que codifican un peptido que define en al menos una portion del mismo o tiene la misma secuencia de aminoacidos que se indica en las FIGURAS 17-20, 27 y 28 (SEC ID N° 1, 49, 5, 50, 9, 11, 13, 15, ), pero que son degeneradas para las mismas SEC ID NO° Por “degenerado con” se quiere decir que se usa un codon diferente de tres letras para especificar un aminoacido concreto. Es bien sabido en la tecnica que se pueden usar los codones siguientes de forma intercambiable para codificar cada aminoacido especlfico:

Fenilalanina (Phe o F) UUU

Leucina (Leu o L) UUA

Isoleucina (Ile o 1) AUU

Metionina (Met o M) AUG

Valina (Val o V) GUU

Serina (Ser o S) UCU

Prolina (Pro o P) CCU

Treonina (Thr o T) ACU

Alanina (Ala o A) GCU

Tirosina (Tyr o Y) UAU

Histidina (His o H) CAU

Glutamina (Gln o Q) CAA

Asparagina (Asn o N) AAU

Lisina (Lys o K) AAA

Acido aspartico (Asp o D) GAU

o UUC

o UUG o CUU o CUC o CUA o CUG o AUC o AUA

o GUC o GUA o GUG o UCC o UCA o UCG o AGU o AGC o CCC o CCA o CCG o ACC o ACA o ACG o GCG o GCA o GCG o UAC o CAC o CAG o AAC

o AAG

o GAC

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Acido glutamico (Glu o E) GAA o GAG Cistelna (Cys o C) UGU o UGC

Arginina (Arg o R) CGU o CGC o CGA o CGG o AGA o AGG Glicina (Gly o G) GGU o GGC o GGA o GGG

Triptofano (Trp o W) UGG

Codon de termination UAA (ocre) o UAG (ambar) o UGA (opalo)

Debe entenderse que los codones especificados anteriormente son para secuencias de ARN. Los codones correspondientes para ADN tiene T en lugar de U.

Se pueden realizar mutaciones en una secuencia o molecula de ADN concreta de modo que dicho codon concreto se cambia a un codon que codifica un aminoacido diferente. En general, dicha mutation se realiza haciendo los menos cambios nucleotldicos posibles. Una mutacion de sustitucion de este tipo se puede realizar para cambiar un aminoacido en la protelna resultante de un modo no conservador (es decir, cambiando el codon de un aminoacido perteneciente a un grupo de aminoacidos que tiene un tamano o caracterlstica concretos de un aminoacido perteneciente a otro grupo) o de un modo conservador (es decir, cambiando el codon de un aminoacido perteneciente a un grupo de aminoacidos que tiene un tamano o caracterlstica concretos un aminoacido perteneciente al mismo grupo). En general, dicho cambio conservador conduce a menos cambio en la estructura y la funcion de la protelna resultante. Un cambio no conservador es mas probable que altere la estructura, actividad y funcion de la protelna resultante. Debe considerarse que la presente invention incluye secuencias que contienen cambios conservadores que no alteran significativamente la actividad o las caracterlsticas de union de la protelna resultante.

A continuation se presenta un ejemplo de varios grupos de aminoacidos:

Aminoacidos con grupos R no polares

Alanina

Valina

Leucina

Isoleucina

Prolina

Fenilalanina

Triptofano

Metionina

Aminoacidos con grupos R polares sin carga

Glicina

Serina

Treonina

Cistelna

Tirosina

Asparagina

Glutamina

Aminoacidos con grupos R polares cargados (con carga negativa a pH 6,0)

Acido aspartico Acido glutamico

Aminoacidos basicos (con carga positiva a pH 6,0)

Lisina

Arginina

Histidina (a pH 6,0)

Otro grupo puede ser los aminoacidos con grupos fenilo:

Fenilalanina

Triptofano

Tirosina

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Otro grupo puede ser segun el peso molecular (es decir, el tamano de los grupos R):

Glicina

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Alanina

89

Serina

105

Prolina

115

Valina

117

Treonina

119

Cistelna

121

Leucina

131

Isoleucina

131

Asparagina

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Acido aspartico

133

Glutamina

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Lisina

146

Acido glutamico

147

Metionina

149

Histidina (a pH 6,0)

155

Fenilalanina

165

Arginina

174

Tirosina

181

Triptofano

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Sustituciones particularmente preferidas son:

- Lys por Arg y viceversa, de modo que se pueda mantener una carga positiva;

- Glu por Asp y viceversa, de modo que se pueda mantener una carga negativa;

- Ser por Thr de modo que se pueda mantener un -OH libre; y

- Gln por Asn de modo que se pueda mantener un -NH2 libre.

Las sustituciones de aminoacidos tambien se pueden introducir para sustituir un aminoacido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, se puede introducir una Cys con un posible sitio para puentes disulfuro con otra Cys. Se puede introducir una His como un sitio particularmente “catalltico” (es decir, la His puede actuar como acido o base y es el aminoacido mas frecuente en la catalisis bioqulmica). Se puede introducir Pro porque su estructura particularmente planar, que induce giros 13 en la estructura de la protelna.

Dos secuencias de aminoacidos son “sustancialmente homologas” cuando al menos aproximadamente el 70% de los residuos de aminoacidos (preferentemente al menos aproximadamente el 80% y mas preferentemente al menos aproximadamente 90 o 95%) son identicas o representan sustituciones conservadoras. En concreto, las secuencias de la region variable de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de la presente invencion son sustancialmente homologas a una secuencia de aminoacidos de llnea germinal correspondiente, que tiene una homologla de al menos aproximadamente un 90%, y preferentemente de al menos aproximadamente 95 %, con una secuencia de aminoacidos de llnea germinal correspondiente.

Una region “heterologa” de la construccion de ADN es un segmento identificable de ADN en una molecula de ADN mas grande que no se encuentra asociada con la molecula mas grande en la naturaleza. Por tanto, cuando la region heterologa codifica un gen de mamlfero, el gen normalmente estara flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genomico de mamlfero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una secuencia de codificacion heterologa es una construccion en la que la propia secuencia de codificacion no se encuentra en la naturaleza (p. ej., un ADN c en el que la secuencia de codificacion genomica contiene intrones o secuencias sinteticas que tienen codones diferentes a los del gen nativo). Las variaciones alelicas o acontecimientos mutacionales naturales no producen una region heterologa de ADN como se define en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo" es una inmunoglobulina, que incluye anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se une a un epltopo especlfico. Con el termino se pretende abarcar anticuerpos policlonales, monoclonales y quimericos, este ultimo mencionado se describe con mayor detalle en las patentes de EE.UU. n° 4.816.397 y 4.816.567. Dichos anticuerpos podrlan incluir anticuerpos tanto policlonales como monoclonales preparados mediante tecnicas geneticas conocidas, as! como anticuerpos biespeclficos (quimericos) y anticuerpos que incluyen otras funcionalidades que las hacen adecuadas para uso diagnostico adicional junto con su capacidad para modular la actividad , por ejemplo que estimula la remielinizacion y/o la regeneration de los axones del SNC o que proporciona neuroproteccion. Un “sitio de combination de anticuerpo” es la portion estructural de una molecula de anticuerpo compuesta por regiones variables e hipervariables de las cadenas pesada y ligera que se une especlficamente al antlgeno. La expresion “molecula de anticuerpo” en sus diversas formas gramaticales, como se usa en el presente documento, contempla molecula de inmunoglobulina intacta y una porcion inmunologicamente activa de una molecula de inmunoglobulina- Ejemplos de moleculas de

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anticuerpo son moleculas de inmunoglobulina intactas, moleculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y las porciones de una molecula de inmunoglobulina que contiene el paratope, incluidas las porciones conocidas en la tecnica como Fab, Fab', F(ab')2 y F(v).

Las porciones Fab y F(ab')2 de moleculas de anticuerpo se pueden preparar mediante la reaccion proteolltica de papalna y pepsina, respectivamente, sobre de moleculas de anticuerpo sustancialmente intactas mediante procedimientos bien conocidos. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 4.342.566 concedida a Theofilopolous y col.). Las porciones Fab' de moleculas de anticuerpo tambien son bien conocidas y se puede producir a partir de porciones F(ab')2, seguido de la reduccion de los puentes disulfuro que unen las dos porciones de cadenas pesadas, como con mercaptoetanol, y seguido de alquilacion de la protelna resultante mercaptan con un reactivo tal como yodoacetamida.

La expresion “anticuerpo monoclonal” en sus varias formas gramaticales hace referencia a un anticuerpo que solo tiene una especie de sitio de combination de anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un antlgeno concreto. Por tanto, un anticuerpo monoclonal normalmente muestra una afinidad de union sencilla por cualquier antlgeno con el que inmunorreaccione. Por tanto, un anticuerpo monoclonal puede contener una molecula de anticuerpo que tiene una pluralidad de sitios de combinacion de anticuerpo, cada uno inmunoespeclfico para un antlgeno diferente, por ejemplo un anticuerpo monoclonal biespeclfico (quimerico).

La metodologla general para fabricar anticuerpos monoclonales mediante hibridomas es bien conocida. Las llneas celulares productotas de anticuerpos inmortales tambien se pueden crear mediante tecnicas distintas a la fusion, tal como transformation directa de linfocitos B con ADN oncogenico o transfection con el virus de Epstein- Barr. Vease, por ejemplo, M. Schreier y col., "Hybridoma Techniques" (1980); Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies And T- cell Hybridomas" (1981); Kennettetal., "Monoclonal Antibodies" (1980); vease tambien las patentes de EE.UU. n° 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 4,493,890.

Paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra peptidos agentes neuromoduladores o peptidos de autoanticuerpos se pueden someter a detection selectiva para varias propiedades, es decir isotipo, epltopo, afinidad etc. De interes concreto son los anticuerpos monoclonales capaces de unirse a estructuras y celulas en el sistema nervioso central y que exhiben la misma actividad que los agentes neuromoduladores y, en particular, los presentes autoanticuerpos. Dichos anticuerpos se pueden someter facilmente a deteccion selectiva y caracterizarse en ensayos, incluidos procedimientos de union, tincion e inmunohistoqulmica presentados e ilustrados en el presente documento. Dichos monoclonales se pueden identificar con facilidad en ensayos de actividad, tal como los modelos del virus de Theilers, EAE e lisolecitina presentados e ilustrados en el presente documento. Los anticuerpos de alta afinidad tambien son utiles cuando es posible la purification de inmunoafinidad de los autoanticuerpos nativos o recombinantes.

Preferentemente, el anticuerpo anti-peptido usado en los procedimientos terapeuticos y diagnosticos de la presente invention es un anticuerpo monoclonal (AcMo), mas preferentemente un anticuerpo humano o humanizado. Preferentemente, el anticuerpo es tambien un anticuerpo sintetico. Ademas, es preferible que las moleculas de anticuerpo anti-peptido usadas esten en forma de las porciones Fab, Fab', F(ab')2 or F(v) de las moleculas de anticuerpo enteras.

Como se ha sugerido antes, el procedimiento diagnostico de la presente invencion comprende analizar una muestra o medio celular por medio de un ensayo que incluye una cantidad eficaz de un antagonista frente a un peptido de anticuerpo/protelna, tal como un anticuerpo anti-peptido, preferentemente un anticuerpo policlonal purificado por afinidad y, mas preferentemente, un AcMo. Ademas, es preferible que las moleculas de anticuerpo anti-peptido usadas esten en forma de las porciones Fab, Fab', F(ab')2 or F(v) de las moleculas de anticuerpo enteras. Como se ha tratado anteriormente, los pacientes capaces de beneficiarse de este procedimiento incluyen los que sufren una afeccion neurologica, tal como esclerosis multiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, una infection vlrica u otra desorganizacion neuropatologica, incluidos los danos resultantes de traumatismos flsicos. Procedimientos para aislar los peptidos e inducir anticuerpos anti-peptidos y para determinar y optimizar la capacidad de los anticuerpos anti-peptidos para ayudar en el analisis de las celulas diana son bien conocidos en la tecnica.

Los procedimientos para producir anticuerpos anti-polipeptldicos policlonales son bien conocidos en la tecnica. Vease la patente de EE.uU. n° de 4.493.795 a Nestor y col. Un anticuerpo monoclonal, que normalmente contiene las porciones Fab y/o F(ab')2 de moleculas de anticuerpo utiles, se puede preparar usando la tecnologla de hibridomas descrita en Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), que se incorpora en el presente documento por referencia. Brevemente, para formar el hibridoma a partir del cual se produce la composition de anticuerpo monoclonal, se fusiona un mieloma u otra llnea celular de autoperpetuacion con linfocitos obtenidos del bazo de un mamlfero hiperinmunizado con una portion de union del peptido de anticuerpo del mismo, o el peptido o fragmento de anticuerpo, o una porcion de union a ADN especlfico de origen del msimo.

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Normalmente los esplenocitos se fusionan con celulas de mieloma usando polietilenglicol (PEG) 6000. Los hlbridos fusionados se seleccionan segun su sensibilidad a HAT. Los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal util en la practica de la presente invencion se identifican por su capacidad para inmunorreaccionar del mismo modo que los presentes autoanticuerpos y su capacidad para estimular o inhibir la actividad especificada en las celulas y tejidos diana.

Un anticuerpo monoclonal util en la practica de la presente invencion se puede producir iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio de nutrientes que contiene un hibridoma que secreta moleculas de anticuerpo de la especificidad de antlgeno adecuada. El cultivo se mantiene en condiciones y durante un periodo de tiempo suficientes para que el hibridoma secrete las moleculas de anticuerpo al medio. El medio que contiene anticuerpo se recoge. Las moleculas de anticuerpo pueden aislarse despues mediante tecnicas bien conocidas.

Los medios utiles para la preparation de estas composiciones son bien conocidos en la tecnica y estan disponibles comercialmente e incluyen medios de cultivo sinteticos, ratones endogamicos y similares. Un ejemplo de medio sintetico es medio mlnimo esencial de Dulbecco (DMEM; Dulbecco y col., Virol. 8:396 (1959) suplementado con 4,5 gm/l de glucosa, glutamina 20 mm y 20 % de suero bovino fetal. Un ejemplo de cepa de raton endogamico Balb/c.

Los procedimientos para producir anticuerpos antipeptido monoclonales son bien conocidos en la tecnica, Vease Niman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4949-4953 (1983). Normalmente, los peptidos de anticuerpo presentes, o un analogo o fragmento peptldico, se usan solos o conjugados con un vehlculo inmunogenico, como inmunogeno, en el procedimiento descrito anteriormente para producir anticuerpos antipeptido monoclonales. Los hibridomas se someten a deteccion selectiva de la capacidad de producir un anticuerpo que inmunorreacciona como en analogo de peptido de anticuerpo y, de este modo, reacciona de un modo similar con los anticuerpos de la presente invencion.

La presente invencion tambien se refiere a autoanticuerpos para su uso en procedimietos para tratar enfermedades desmielinizantes en mamlferos, como esclerosis multiple en seres humanos, y enfermedades virales del sistema nervioso central de seres humanos y animales domesticos, como encefalomielitis postinfecciosa, como se ejemplifican por los anticuerpos humanos CB2iE12 y CB2iE7, monomeros de los mismos, analogos de los mismos incluyendo haptenos, fragmetnos activos de los mismos o un anticuerpo aislado o sintetico que tiene las caracterlsticas de los mismos. Los procedimientos de tratamiento profilactico usando estos AcMo, monomeros de los mismos, fragmentos activos de los mismos, u otros anticuerpos aislados o sinteticos que tienen las mismas caracterlsticas, incluyendo inhibir el inicio o progresion de enfermedades desmielinizantes tambien se abarcan por esta .invencion

Los oligodendrocitos (OL), las celulas formadoras de mielina del sistema nervioso central (SNC), se originan como celulas neuroectodermicas de las zonas subventricular y, despues, migran y maduran para producir mielina. El desarrollo secuencial de los OL se identifica mediante marcadores especlficos de la etapa de diferenciacion bien caracterizada. Los precursores bipolares proliferativos y migratorios, designados progenitores de oligodendrocito/astrosito de tipo 3 (O-2A) se identifican mediante anticuerpos monoclonales anti-GD3 y A2B5 [Eisenbarth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa, 76 (1979), 4913-4917]. La siguiente etapa de desarrollo, caracterizada por celulas multipolares, proliferativas y posmigratorias es reconocida por el AcMo 04 [Gard y col., Neuron, 5 (1990), 615-625; Sommer y col., Dev. Biol., 83, (1981), 311-327). El desarrollo adicional se define por la expresion en la superficie celular de galatocerebrosido, reconocido por el AcMo 01 [Schachner, J. Neurochem., 39 (1982), 1-8; Sommer et al., supra], y mediante la expresion del 2',3'-cllcico nucleotido 3'-fosfohidrolasa. La mayorla de las celulas maduras expresan marcadores de diferenciacion terminal, tal como la protelna basica de la mielina y la protelna proteolipldica.

Los AcMo (A2B5, O1, y 04) usados para caracterizar las etapas de desarrollo de los OL se prepararon inmunizando ratones BALB/c con celulas de retina de embrion de pollo u homogeneizado del cuerpo calloso bovino [Eisenbarth y col., supra; Sommer y col., supra]. A2B5 no solo reconoce los progenitores O-2A, sino que tambien las neuronas y reacciona con el gangliosido de superficie celular GQ1c [Kasai y col., Brain Res. , 277 (1983), 155-158] y otros gangliosidos [Predman y col., Arch. Biochem. Biophys., 233 (1984), 661-666]. 04 reacciona con sulfatada, seminollpido y colesterol [Bansal y col., J. Neurosci. Res., 24 (1989), 548-557], mientras que O1 reacciona con galactocerebrosido, monogalactosil-diglicerido yi psicosina [Bansal y col., supra]. Estos AcMo pertenecen a la subclase de inmunoglobulina (Ig) IgM y reconoce estructuras citoplasmaticas, as! como los antlgenos de superficie de los OL [Eisenbarth et al., supra; Sommer et al., supra]. El AcMo de raton HNK-1 (anti-Leu-7), preparado inmunizado ratones BALB/c con la suspension de la membrana de celulas linfoblastoides HSB-2 T, se dio a conocer primero como un marcador para celulas asesinas naturales [Abo et al., J. Immunol., 127 (1981), 1024-1029]. Mas tarde, se demostro que HNK-1 compartla determinantes antigenicos con el sistema nervioso [Schuller-Petrovic et al., Nature, 306 (1983), 179-181]. El epltopo del carbohidrato sobre la glicoprotelna asociada con la mielina, encontado en las vainas de mielina centrales y perifericas se demostro que era un antlgeno principal del tejido nervioso que reacciono con HNK-1 [McGarry et al., Nature, 306 (1983), 376-378]. No obstante, otras glicoprotelnas del tejido nervioso reaccionan con este AcMo, algunas d elas cuales son importantes en la embriogenesis,

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diferenciacion y mielinacion [Keilhauer et al., Nature, 316 (1985), 728-730; Kruse et al., Nature, 311 (1984), 153- 155; Kruse et al., Nature, 316 (1985), 146-148; McGarry et al., J. Neuroimmunol., 10 (1985), 101-114]. De interes, HNK-1 tambien reacciona con estructuras citoplasmaticas y pertenece a la subclase de Ig IgM.

Un anticuerpo monoclonal, divulgado y reivindicado en la patente de EE.UU. numero 5,591,629, presentada el 7 de enero de 1997, y designado SCH94.03, se encontro que estimula la remielinizacion del SNC en ratones infectados cronicamente por el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) [Miller et al., J. Neurosci., 14 (1994), 6230-6238]. SCH94.03 pertenece a la subclase de Ig IgM(x) Ig y reconce un antlgeno de superficie desconocida sobre los OL, pero antlgenos citoplasmaticos en todas las celulas (Asakura et al., Molecular Brain Research, in press). La polirreactividad de SCH94.03 mediante ELISA y las secuencias de la llnea germinal de la region variable de la Ig no mutada indicaron que SCH94.03 es un autoanticuerpo natural [Miller et al., J. Neurosci., 14 (1994), 6230-6238]. Un estudio cerrado de SCH94.03, y su comparacion con AcMo reactivos de OL bien conocidos A2B5, O1, 04, y HNK-1 produjeron la posibildad de que estos eran autoanticuerpos naturales. Un analisis posterior de las secuencias de ADNc de la region variable de la Ig y la polirreactividad de estos AcMo mediante ELISA confirmaron que este es un grupo generico de autoanticuerpos naturales que tienen utilidades similares.

La reactividad antigenica del anticuerpo monoclonal, el anticuerpo monoclonal IgM SCH 94.03 (tambien denominado SCH94.32) ySCH 79.08 (ambos preparados de un mamlfero inmunizado con homogeneizado de medula espinal de un mamlfero normal (es decir, no infectado con ninguna enfermedad desmielinizante)) se han caracterizado y descrito en la patente de EE.UU. mencionado anteriormente numero 5,591,629, presentada el 7 de enero de 1997, usando varios ensayos bioqulmicos y moleculares, inlcuidos inmunohostoqulmica, inmunocitoqulmica, transferencia Western, ensayos de inmunosocrcion ligado a enzima en fase solida (ELISA) y secuenciacion de la region variable de la Ig.

Autoanticuerpos naturales o fisiologicos normalmente estan presentes en el suero y se caracterizan porque son reactivos o capaces de unirse a autoestructuras, antlgenos o celulas. A menudo sn polirreactivos, con frecuencia son del subtipo IgM, y estan codificados por genes de llnea germinal sin mutar o son sustancialmente homologos a los genes de llnea germinal con pocas diferencias de secuencia. Mediante secuenciacion de los ADNc de inmunoglobulina (Ig) de los anticuerpos monoclonales reactivos con los oligodendrocitos O1, 04, A2B5, and HNK-1 IgM x y comparandolos con secuencias de llnea germinal publicadas, se determino que estos eran autoanticuerpos naturales. La Vh de 01 fue identica al transcrito A1 y A4 del segmento Vh, la Vh de 04 tenlan tres y la Vh de de HNK- 1 tenia seis diferencias de nucleotidos de VH de 01 de la linea germinal en la region de codificacion de VH. El segmento D de 01 derivo de la familia de genes Sp2 de linea germinal, JH 4, mientras que JH de O1 estaba codificada por la linea germinal JH 1 con un cambio de nucleotido silente. Las cadenas ligeras de O1 y O4 eran identicas al MOPC21 del mieloma a excepcion de un cambio de nucleotido silente. HNK-1 Vx fue identica a la linea germinal Vx41 a excepcion de dos cambios de nucleotidos silentes. O1Jx, O4Jx y HNK Jx estaban codificados por la linea germinal Jx2 sin mutar. En contraste la VH de A2B5 mostro siete diferencias de nucleotidos de la linea germinal V1, mientras qe no se identifico ninguna secuencia de llnea germinal que codifica A2B5 Vx. O1 y O4, pero no A2B5, eran polirreactivos contra multiples antlgenos mediante ELISA directo. Por tanto, las Ig O1, O4, y HNK-1 estan codificadas por los genes de la linea germinal y tienen el genotipo y el fenotipo de los autoanticuerpos naturales.

La identificacion y caracterizacion de una familia entera de autoanticuerpos, denominados autoanticuerpos “naturales” o “fisioloicos”, ha influido sobre la vision tradicional de la autoinmunidad y la autorreactividad. Los autoanticuerpos que se han estudiado ampliamente son, normalmente, IgM, aunque se han identificado otros isotipos, son reactivos frente a un amplio abanico de autoestructuras o antlgenos, incluidas proteinas citoesqueleticas, proteinas de superficie, acidos nucleicos, fosfollpidos, antlgenos bacterianos tales como lipopolisacaridos, y varios haptenos qulmicos (revisado por Avrameas y Ternynck, Mol. Immunol., 30:1133-1142 (1993)). Los autoanticuerpos naturales comparen una extensa reactividad cruzada idiotlpica o “conectividad”, que incluye la expresion de idiotipos similares, algunos de los cuales son expresados por autoanticuerpos patogenicos, as! como la reactividad frente a los idiotipos comunes expresados sobre otros anticuerpos. El analisis molecular ha demostrado que los autoanticuerpos naturales normalmente estan codificados por los genes de inmunoglobulina (Ig) de la llnea germinal sin mutar, o sustancialmente homologos a los mismos, con pocas mutaciones somaticas, y, por tanto, representan una fraccion sustancial del repertorio de Ig, especialmente en animales neonatos que no han estado expuestos de forma extensa a antlgenos exogenos.

La funcion de los autoanticuerpos naturales sigue siendo un enigma. Se han propuesto varias hipotesis en base a sus caracteristicas bioquimicas y moleculares. Estas incluyen: (1) eliminacion del tejido senescente o danado, (2) proporcionar una primera linea de defensa inmunologica en el periodo entre la exposicio al patogenoy una respuesta inmunitaria especifica del Ag, (3) enmascarar los autoantigenos de una respuesta autoinmunitaria potencialmente patogenica, (4) inmunomodulacion, incluida la conformacion del repertorio inmunologico neonato mediante una red idiotlpica y (5) particoipacion en la seleccio positiva de celulas B en la medula osea, similar al procedimiento propuesto para las celulas T en el timo.

Que determinados autoanticuerpos, ampliamente caracterizados como anticuerpos que reconocen antlgenos propios y que incluyen autoanticuerpos naturales, son capaces de estimular la remielinizacion en el

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sistema nervioso central sugiere una importante funcion fisiologica de los autoanticuerpos. Los autoanticuerpos que se producen durante la fisiologia normal o en respuesta a danos tisulares y la posterior liberacion de antigenos previamente secuestrados podrian participar activamente en la estimulacion de la reparacion del tejido danado. En linea con las funciones propuestas anteriormente de los autoanticuerpos, esta participacion activa podria ser para facilitar la eliminacion de tejido danado, enmascarar los autoantigenos de modo que se evita una respuesta autoinmunitaria patogenica energica, modular la respuesta inmunitaria que realmente diera lugar a la destruccion de tejido, de modo que se permite que se produzca la reparacion del tejido endogeno, o estimular directamente las celulas implicadas en el proceso de reparacion.

Los resultados y Ejempos que se proporcionan en el presente documento demuestran el aislamiento de los autoanticuerpos humanos, generados y seleccionados por su capacidad para unirse a los autoantigenos, particularmente capaces de unirse a estructuras y celulas en el sistema nervioso central. La capacidad de estos anticuerpos para estimular la remielinizacion del SNC tambien se demuestra. Los ratones infectados cronicamente con TMEV y tratados con AcMo IgM de hibridomas humanos, como ejemplos concretos sHIgM22 (LIM 22), sHIgM46, ebvHIgM MSI19D10, CB2bG8, tenian una reparacion del SNC significativamente mayor que los animales control, medido mediante una evauacion morfologica cuantitativa detallada de la remielinizacion del SNC.

Tratamiento de enfermedades desmielinizantes

Los resultados de los experimentos descritos en la presente memoria tienen aplicaciones practicas en la esclerosis multiple (EM), ELA y otros trastornos desmielinizantes del sistema nervioso central relacionados. Se encuentran raros ejemplos de remielinizacion del SNC de tipo espontaneo (“placas sombreadas”) en EM, y se encuentra remielinizacion de tipo ocasional en el sistema nervioso periferico (SNP) en placas de medula espinal desmielinizadas cerca de la zona de entrada de raiz. Los oligodendrocitos son infrecuentes en el centro de las placas cronicas en EM, pero parecen proliferar en la periferia de las placas, donde se asocian a remielinizacion abortiva. El proceso de remielinizacion puede correlacionarse con la remision espontanea y las mejoras observadas clinicamente en la EM. Estas observaciones clinicas indican que es posible la formacion de mielina nueva en EM. La remielinizacion que se ha estimulado en ratones con desmielinizacion inducida por TEMV utilizando un mAb puede ser prometedora para aplicacion terapeutica en esclerosis multiple.

Es de importancia clinica la pregunta de si la regeneracion morfologica de vainas de mielina finas contribuye a la recuperacion funcional. Las simulaciones informaticas indican que la formacion de mielina nueva incluso mediante vainas inapropiadamente finas mejora la conduccion de impulsos. Puesto que la membrana del axon de fibras mielinizadas normalmente esta altamente diferenciada, es necesario que esten presentes canales de sodio con alta densidad en el nodo de Ranvier para propagar la conduccion saltatoria. Las evidencias experimentales sugieren que los nodos recien formados desarrollan la alta densidad de canal de sodio necesaria como se demuestra por la union de saxitoxina. Los datos hasta la fecha sugieren que la remielinizacion incluso mediante mielina inapropiadamente fina mejora la conduccion en un axon previamente desmielinizado. Por lo tanto, cualquier estrategia para promover este fenomeno morfologico tiene el potencial de producir una recuperacion funcional.

El aislamiento y analisis de los autoanticuerpos humanos como se indica en el presente documento proporciona anticuerpos humanos particularmente adecuados y deseables para usar en seres humanos. Es importante el hecho de que el uso de anticuerpos humanos evita el potencial de una respuesta inmunitaria humana contra el anticuerpo terapeutico. Se ha demostrado que los anticuerpos terapeuticos derivados de animales no humanos generan una respuesta inmunitaria que puede ser significativa y perjudicial para el individuo. La IgM policlonal humana y la IgG policlonal humana se han analizado en dos modelos de desmielinizacion de medula espinal in vivo, un modelo de infeccion viral cronica y un modelo de toxicidad aguda. En ambos modelos, los animales tratados con IgM policlonal humana tenian una densidad significativamente mayor de axones recien mielinizados que los animales tratados con IgG policlonal humana. Tambien se ha identificado un panel de anticuerpos IgM monoclonales humanos en base a su reactividad con antigenos de superficie especificos del sistema nervioso central. Estos anticuerpos humanos estimulan significativamente mas remielinizacion del sistema nervioso central que la IgG policlonal humana cuando se administra a mamiferos con una enfermedad desmielinizante. Los anticuerpos monoclonales humanos son antogenicamente polirreactivos y reconocen determinantes sobre la superficie de los oligodendrocitos y poblaciones especificas de neuronas. Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo humano que estimula la remielinizacion se ha secuenciado parcialmente. Este anticuerpo puede inducir entradas de calcio en los oligodendrocitos en cultivo, lo que sugiere la union directa y serialization mediante las celulas glia. Estos anticuerpos humanos se unen a la sustancia blanca humana y pueden ser eficaces en la estimulacion de la remielinizacion en seres humanos. Los beneficios de un anticuerpo monoclonal para usar como agente terapeutico son 1) el anticuerpo puede crecer libre de posibles infecciones en el huesped y 2) el anticuerpo se puede alterar geneticamente vitro para cambiar su eficacia.

Por tanto, como resultado de los experimentos descritos en la presente memoria, los autoanticuerpos de la presente invention pueden usarse en procedimientos para tratar mamiferos, incluyendo seres humanos y animales

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domesticos, aquejados por trastornos desmielinizantes, y para estimular la remielinizacion de axones del SNC, as! como para ofrecer neuroproteccion. Como se describe en el presente documento, puede administrarse una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento peptldico, hapteno o equivalente mediante vlas de administracion convencionales y, en particular, mediante inyeccion intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.). Como se describe en el presente documento, se contemplan composiciones terapeuticas y vacunas, y se pueden preparar y administrar. Una cantidad eficaz de anticuerpo puede variar dependiendo del tamano del mamlfero que se este tratando, de la gravedad de la enfermedad, de la via de administracion, y del curso de tratamiento. Por ejemplo, cada dosis de AcMo administrada puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 400 mg/kg, con el intervalo preferido de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg. Es importante observar que una dosis del orden de 10 pg (0,5 mg/kg) era eficaz para promover la remielinizacion de axones del SNC en ratones. La dosis de AcMo dependera tambien de la via de administracion. Por ejemplo, una dosis i.v. administrada a ratones era de 0,5 mg/kg, y la dosis i.p. era de 5,0 mg/kg. El curso de tratamiento incluye la frecuencia de administracion del AcMo (por ejemplo diariamente, semanalmente, o bisemanalmente) y la duracion del tratamiento (por ejemplo de cuatro semanas a cuatro meses). Por tanto, por ejemplo, puede administrarse una cantidad mayor de AcMo diariamente durante cuatro a cinco semanas, en contraposicion con una cantidad menor de AcMo administrada durante cuatro meses.

La eficacia de la cantidad de anticuerpo monoclonal que se esta administrando puede evaluarse utilizando cualquier serie de criterios cllnicos, por ejemplo como se describe en el presente documento, incluyendo la apariencia global del mamlfero, la actividad del mamlfero y la extension de la paralisis del mamlfero. La eficacia de la cantidad de anticuerpo monoclonal necesaria para inducir la remielinizacion en seres humanos puede evaluarse tambien en un ensayo controlado de doble ciego. Pueden tratarse pacientes con deficit neurologicos fijos por enfermedad desmielinizante con anticuerpo monoclonal o controles. La mejora de la fuerza muscular isometrica detectada mediante ensayos musculares biomecanicos cuantitativos podrla utilizarse como criterio de valoracion terapeutico primario.

Los procedimientos ex vivo de estimular remielinizacion en axones del SNC estan tambien entran dentro la presente invencion. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal puede utilizarse in vitro para estimular la proliferacion y/o diferenciacion de celulas gliales, tales como oligodendrocitos. Estas celulas gliales exogenas pueden introducirse despues en el SNC de mamlferos utilizando tecnicas conocidas. La remielinizacion de axones del SNC aumentarla al aumentar el numero de celulas gliales endogenas presentes (las celulas gliales tales como oligodendrocitos desempenan un papel crltico en la produccion de mielina).

Los procedimientos in vitro de produccion de celulas gliales o de estimulacion de la proliferacion de celulas gliales de cultivo mixto (por ejemplo celula de nervio optico de rata o cultivos de celula cerebral de rata) estan tambien dentro de la presente invencion. Por ejemplo, se cultivan celulas obtenidas de nervio optico de rata o cerebro de rata que contienen celulas gliales en forma de un cultivo mixto en condiciones suficientes para promover el crecimiento de las celulas. Se anade despues una cantidad eficaz de mAb capaz de promover la remielinizacion de axones del SNC, tal como as sHIgM22 (LIM 22), sHIgM46, ebvHIgM MSI19D10, y CB2bG8, al cultivo mixto de celulas y se mantiene en condiciones suficientes para el crecimiento y la proliferacion de celulas. Ademas, se puede anadir una cantidad eficaz de AcMo, tales como AKJR4, CB2iE12, CB2iE7, o MSI19E5. En concreto, las mezclas o combinacion de mas de uno de los anticuerpos proporcionados en el presente documento se contemplan y proporcionan para usar en los procedimientos. El mAb estimula la proliferacion de celulas gliales cultivadas en presencia del AcMo aumenta, respecto a la proliferacion de celulas gliales crecidas en ausencia del mAb.

Como se ha indicado, los anticuerpos monoclonales humanos para usar en los procedimientos de la presente invencion pueden administrarse, y preferentemente se hace asl, como medicamentos, es decir composiciones farmaceuticas. Una cantidad eficaz de anticuerpo monoclonal puede combinarse, o diluirse, con un vehlculo apropiado farmaceuticamente aceptable, tal como un tampon fisiologico, o solucion salina. En particular, combinaciones o mezclas de mas de uno de los anticuerpos monoclonales en el presente documento pueden combinarse diluirse, con un vehlculo apropiado farmaceuticamente aceptable, tal como un tampon fisiologico, o solucion salina. En el caso en el que se vaya a preparar una vacuna, el anticuerpo monoclonal o sustancia activa equivalente de la invencion se puede preparar con un vehlculo o adyuvante apropiado farmaceuticamente aceptable y el protocolo para la administracion puede proceder de acuerdo con procedimientos estandar para inmunizacion conocidos para el experto en la practica.

Las composiciones farmaceuticas usadas en los procedimientos de la presente invencion para administrar a animales y seres humanos comprenden los anticuerpos monoclonales en combinacion con un vehlculo o excipiente farmaceutico. En una realizacion preferida, la composicion farmaceutica puede contener mas de uno, preferentemente dos, autoanticuerpos monoclonales de la presente invencion. Dichas composiciones son ventajosas en cuanto a que la presencia de mas de un autoanticuerpo monoclonal potenciara la actividad de otros en la misma composicion terapeutica o procedimiento.

El medicamento puede estar en forma de comprimidos (incluidas pastillas y granulos), grageas, capsulas, plldoras, ampollas o supositorios que comprenden el compuesto de la invencion.

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De forma ventajosa, las composiciones se formulan en unidades de dosificacion, estando cada unidad adaptada para suministrar una dosis fija de ingredientes activos. Comprimidos, comprimidos recubiertos, capsulas, ampollas y supositorios son ejemplos de formas de dosificacion preferidas de acuerdo con la invencion. Solo es necesario que el ingrediente activo constituta una cantidad eficaz, es decir de modo que una dosis eficaz adecuada sera consistente con la forma de dosificacion empleada en una o multiples dosis. Las dosis individuales exactas, as! como las dosis diarias, se determinaran de acuerdo con los principios medicos estandar bajo la direccion de un medico o veterinario.

Los anticuerpos monoclonales tambien se pueden administrar como suspensiones, soluciones y emulsiones del compuesto activo en diluyentes acuosos o no acuosos, jarabes, granulados o polvos.

Los diluyentes que se pueden usar en las composiciones farmaceuticas (p. ej., granulados) que contienen el compuesto activo adaptado para formar comprimidos, grageas, capsulas y plldoras incluyen los siguientes: (a) cargas y expansores, por ejemplo almidon, azucares, manitol y acido sillcico; (b) agentes de union,, por ejemplo carboximetilcelulosa y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona; (c) agentes hidratantes, por ejemplo glicerol; (d) agentes disgregantes, por ejemplo agar agar, carbonato calcico y bicarbonato sodico; (e) agentes para retrasar la disolucion, por ejemplo parafina; (f) aceleradores de la resorcion, por ejemplo compuestos de amonio cuaternario; (g) agentes de superfciei activa, por ejemplo alcohol cetllico, monoestearato de glicerol; (g) vehlculos de adosrcion, por ejemplo caolln y bentonita; (i) lubricantes, por ejemplo talco, estearato calcico y de magnesio y glicoles de polietileno solido.

Los comprimidos, grageas, capsulas y plldoras que comprenden el compuesto activo pueden tener los recubrimientos, cubiertas y matrices protectoras habituales, que pueden contener opacificantes. Pueden estar constituidos de modo que liberen el principio activo solo o, preferentemente, en una parte concreta del tracto intestinal, posiblemente en un periodo de tiempo. Los brimientos, cubiertas y matrices protectoras pueden estar hechos de, por ejemplo, sustancias polimericas o ceras.

Los diluyentes que se van a usar en las composiciones farmaceuticas adaptadas para convertirse en supositorios pueden, por ejemplo, ser los diluyentes hidrosolubles habituales, tales como polietilenglicoles y grasas (p. ej., aceite de cacao y esteres altos, [p. ej., alcohol C14 con acido graso C16] o mezclas de estos diluyentes.

Las composiciones farmaceuticas que son soluciones y emulsiones pueden contener, por ejemplo, los diluyentes habituales (con, por supuesto, la exclusion mencionada anteriormente de disolventes que tienen un peso molecular inferior a 200, a excepcion de la presencia de un agente de superficie activa), tales como disolventes, agentes de disolucion y emulsionantes. Ejemplos especlficos no limitantes de dichos diluyentes son agua, alcohol etllico, alcohol isopropllico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencllico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3- butilenglicol, dimetilformamida, aceites (por ejemplo, aceite de nuez molida, glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y esteres de acido grasos de sorbitol o mezclas de los mismos.

Para administration parenteral, las soluciones y suspensiones esteriles, por ejemplo agua o aceite de cacahuete, contenidas en ampollas y, en caso adecuado, son isotonicas con la sangre.

Las composiciones farmaceuticas que son suspensiones pueden contener los diluyentes habituales, tales como diluyentes llquidos, por ejemplo agua, agua, alcohol etllico, propilenglicol, agentes de superficie activa (p. ej., alcoholes de isoestearilo etoxilado, polioxietilensorbitol y esteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar-agar y goma de tragacanto, y mezclas de los mismos.

Las composiciones farmaceuticas pueden tambien contener agentes colorantes y conservantes, as! como perfumes y adiciones de aromas (p. ej., aroma de aceite de menta y de aceite de eucaliptos) y agentes edulcorantes (p. ej., sacarina y aspartamo).

Las composiciones farmaceuticas, generalmente, contendran de 0,5 a 90 % del ingrediente activo en peso de la composition total.

Ademas de los anticuerpos monoclonales, las composiciones farmaceuticas y los medicamentos tambien pueden contener otros compuestos farmaceuticamente activos, por ejemplo esteroides, agentes antiinflamatorios o similares.

Cualquier diluyente en los medicamentos de la presente invencion puede ser cualquiera de los mencionados anteriormente en relation con las composiciones farmaceuticas. Dichos medicamentos pueden incluir disolventes de peso molecular inferior a 200 como el unico diluyente.

Se ha previsto que los anticuerpos monoclonales se administren por via peroral, parenteral (por ejemplo, intramuscular, intraperitoneal, subcutanea, transdermica o intravenosa), rectal o localmente, preferentemente oral o

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parenteral, especialmente perilingual o intravenosa.

La tasa de la dosis administrada sera una funcion de la naturaleza y el peso corporal del sujeto humano o animal que se va a tratar, la reaccion individual de este sujeto al tratamiento, tipo de formulacion en el que el ingrediente activo se administra, el modo en el que la administracion se lleva a cabo y el punto en el progreso de la enfermedad o intervalo en e que se va a administrar. Por tanto, puede, en algunos casos, ser suficiente para usar menos que una tasa de dosificacion minima, mientras que en otros casos se debe superar el llmite superior para alcanzar los resultados deseados. Cuando se administran cantidades grandes, puede ser aconsejable dividirlas en varias administraciones individuales durante el curso del dla.

Los agentes neuromoduladores de la invention tambien se pueden preparar para administrar en forma de vacunas que pueden comprender, como ingrediente activo, los autoantiucuerpos citados en el presente documento, analogos peptldicos o haptenos, o, posiblemente, combinaciones de los mismos. Por tanto, la preparation de vacunas puede proceder de acuerdo con procedimientos conocidos y se contemplan vacunas monovalentes, as! como polivalentes. Asimismo, se pueden preparar subunidades de vacunas de ADN, en base a las moleculas de ADN de la invencion. Todas las vacunas se pueden administrar de acuerdo con practicas estandar del medico o cllnico, y dichos parametros se consideran dentro del alcance de la presente invencion.

Ademas, en el presente documento tambien se describe el tratamiento mediante terapia genica, en la que el agente neuromodulador adecuado se introduce en las celulas diana para tratamiento, causar o incrementar la expresion del agente correspondiente Por tanto, en una realization, el ADN o un gen que codifica el agente neuromodulador, autoanticuerpo, peptido de anticuerpo etc., o una protelna o dominio polipeptldico se introduce in vivo, ex vivo o in vitro usando un vector viral o mediante la introduction directa de aDn. La expresion en tejidos diana se puede efectuar mediante direction del vector transgenico a celulas especlficas, tal como con un vector viral o un ligando de receptor, o usando un promotor especlfico de tejido, o ambos.

Los vectores virales que normalmente se usa para los procedimientos dirigidos y de terapia in vivo o ex vivo son vectores basados en ADN y vectores retrovirales. Los procedimientos para construir y usar vectores virales se conocen en la tecnica [vease, por ejemplo, Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990 (1992)].

Los vectores virales de ADN incluyen un virus de ADN atenuado o defectuosos, tal como, entre otros, virus del herpes simple (HSV), papilomavirus, virus de , Epstein Barr (EBV), adenovirus, virus adenoasociados (AAV) y similares. Se prefieren virus defectuosos, que carecen completamente e o casi completamente, de genes virales. Los virus defectivos no son infecciosos tras su introduccion en una celula. El uso de vectores virales defectivos 15 permite la administracion a las celulas en un area localizada especlfica, sin tener que preocuparse de que el vector pueda infectar a otras celulas. Por tanto, el tejido adiposo puede ser una diana especlfca. Ejemplos de vectores concretos incluyen, entre otros, vector del virus del herpes 2 defectivo (HSV1) [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], vector del virus del herpes defectivo que carece del ge de la glicoprotelna L [publication de patente RD 371005 A], u otros vectores del virus del herpes defectivo [publication de patente internacional n° WO 20 94/21807, publicada el 29 de septiembre de 1994; shed publicacion de patente internacional n ° WO 92/05263, publicada el 2 de abril de 1994]; un vector adenovirus atenuado, yal como el vector descrito por Stratford- Perricaudet y col. [J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992); vease tambien La Salle et al., Science 259:988-990 (1993)]; y un vecor de virus adenoasociado defectivo [Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989); Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)].

Preferentemente, para la administracion in vivo, se emplea un tratamiento inmunosupresor apropiado junto con el vector viral, por ejemplo vector adnovirus, para evitar la inmunodesactivacion del vector viral y las celulas transfeccionadas. Por ejemplo, se pueden administrar citoquinas inmunosupresoras, como la interleuquina 12 (IL- 12), interferon-Y(IFN-Y), o anticuerpo anti-CD4, se pueden administrar para bloquear las respuestas humorales o celulares a los vectores virales [vease, p. ej,., Wilson, Nature Medicine (1995)]. Ademas, es ventajoso emplear un vector viral que se ha sometido a ingenierla para expresar un numero mlnimo de antlgenos.

En otra realizacion, el ADN o gen se puede introducir en un vector retroviral, por ejemplo como se describe en Anderson et al., Patente de EE.UU. n° 5,399,346; Mann y col., 1983, Cell 33:153; Temin y col., Patente de EE.UU. n° 4,650,764; Temin y col., Patente de EE.UU. n° 4,980,289; Markowitz y col., 1988, J. Virol. 62:1120; Temin y col., Patente de EE.UU. n° 5,124,263; publicacion de patente internacional n° WO 95/07358, publicado el 16 de marzo de 1995, de Dougherty y col.; y Kuo y col., 1993, Blood 82: 845. Los vectores retrovirales se pueden construir para que funcionen como partlculas infecciosas o sufran un unico ciclo de transfection. En el primer caso, el virus se modifica para que conserve todos sus genes, a excepcion de los responsables de las propiedades de transformacion oncogenica y que exprese el gen heterologo. Los vectores virales no infecciosos se preparan para destruir la senal de empaquetamiento viral, pero conservan los genes estructurales requeridos para empaquetar el virus introducido sometido a ingenierla para que contengan el gen heterologo y las senales de empaquetamiento. Por tanto, las partlculas virales que se producen no son capaces de producir virus adicionales.

La liberation genica dirigida se describe en la publicacion de patente internacional WO 95/28494 publicada

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en octubre de 1995.

Como alternativa, el vector se puede introducir in vivo mediante lipofeccion. Durante la ultima decada se ha producir un uso creciente de liposomas para encapsulacion y transfeccion de acidos nucleicos in vitro. Los llpidos cationicos sinteticos disenados para limitar las dificultades y peligros encontados con la transfeccion mediada por liposomas se pueden usar para preparar liposomas para la transfeccion in vivo o un gen que codifica un marcador Felgner, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); vease Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027- 8031 (1988); Ulmer et al., Science 259:1745-1748 (1993)]. El uso de llpidos cationicos puede estimular la encapsulacion de acidos nucleicos con carga negativa y tambien promueve la fusion con membranas celulares cargadas negativamente [Felgner and Ringold, Science 337:387-388 (1989)]. El uso de lipofeccion para introducir genes exogenos en los organos especlficos in vivo tiene ciertas ventajas practicas. Dirigir los liposomas a celulas especlficas representa un area de beneficio. Esta claro que dirigir la transfeccion a tipos celulares concretos serla particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, tal como pancreas, hlgado, rinon y cerebro. Los llpidos pueden acoplarse qulmicamente a otras moleculas con el fin de dirigir el tratamiento [vease Mackey, et. al., supra]. Los peptidos dirigidos, por ejemplo hormonas o neurotransmisores, y protelnas, como anticuerpos o moleculas no peptldicas, podrlan acoplarse a los liposomas qulmicamente.

Tambien es posible introducir el vector in vivo como un plasmido de ADN desnudo. Los vectores de ADN desnudo para terapia genica se pueden introducir en las celulas huesped deseadas mediante procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo transfeccion, electroporacion, microinyeccion, transduccion, fusion celular, dextrano DEAE, precipitacion en fosfato calcico, uso de una pistola genica o uso de un transportador de vector de ADN [vease, p.ej., Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., solicitud de patente canadiense N° 2,012,311, presentada el 15 de marzo de 1990; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991)]. La liberacion de ADN mediada por receptores tambien se pueden usar [Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)].

En una realizacion preferida de la presente invencion, un vector de terapia genica como se ha descrito anteriormente emplea una secuencia de control de la transcripcion que comprende la secuencia consenso de ADN reconocida por, por ejemplo, un autoanticuerpo de la invencion, es decir, un sitio de union a anticuerpo, asociado operablemente con un gen heterologo terapeutico insertado en el vector. Es decir, un vector de expresion especlfico de la invencion se puede usar en terapia genica.

La presente invencion se entendera mejor a partir de la consideracion de los ejemplos no limitantes siguientes, que describe la preparacion de materiales, compuestos y composiciones y el desarrollo y practica de procedimientos ilustrativos de la presente invencion, Los expertos en la tecnica apreciaran que se pueden realizar muchas modificaciones, tanto de materiales como de procedimientos, sin desviarse del fin y la intencion de la presente divulgacion. Los ejemplos siguientes se presentan con el fin de ilustrar mas completamente las realizaciones preferidas de la invencion y tambien sirven para finalizar la tarea de los solicitantes para presentar el mejor modo conocido para la practica de la invencion y, de ningun modo, se interpretara como limitante del amplio alcance de la presente invencion.

EJEMPLOS

Los ejemplos siguientes presentan la preparacion y analisis de anticuerpos monoclonales y policlonales humanos. En particular, los anticuerpos IgM policlonale shumanos se prepararon y analizaron, en los que su capacidad para unirse con afinidad alta a estructuras y celulas dentro del sNc, por ejemplo, e incluye oligodendrocitos, con una especificidada alta por tejido neural, y se demostro la capacidad concocmitante par apotenciar la remielinizacion. Como se presenta en el presente documento a continuacion, la remielinizacion se verifico en un modelo de desmielinizacion inducida por el virus de Thelier e inducida por lisolecitina.

Introduccion

La potenciacion de la remielinizacion es un importante objetivo terapeutico en los trastoirnos desmielinizantes inflamatorios del SNC, tal como esclerosis multiple (EM). La identificacion de lesiones del SNC extensamente remielinizadas en alginos pacientes que mueren de EM aguda y en los datos recientes de los solicitantes de biopsias cerebrales sugiere que puede ser posible la reparation completa en las primeras etapas de la enfermedad (Prineas and Connell 1979; Prineas, et al 1993; Rodriguez and Scheithauer 1994). No obstante, a medida que la enfermedad progresa, la remielinizacion se limita y se produce principalmente en la periferia de la lesion. Se han propuesto una serie de razones para que no se consiga alcanzar la remielinizacion compelta en las lesiones de eM (Ludwin 1981). Dos importantes consideraciones incluyen la depletion de celulas capaces de remielinizar y la deplecion de factores, que sostienen su crecimiento y diferenciacion. Por tanto, la intervention precoz para estimular las celulas de reparacion o para eliminar los factores inhibidores que impiden la reparacion de la mielina puede ser clave para una estrategia terapeutica.

Se han analizado una serie de enfoques como estrategias terapeuticas para estimular la remielinizacion

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en animales experimentales. El transplants d eoligondendrocitos o celulas gliales progenitoras en lesiones previamente desmielinziadas puede dar como resultado la remielinizacion de azones del SNC y, en menor medida, la migration de celulas precursoras de la mielinizacion. Se ha demostrado que la remielinizacion central restablece la conduction. Una estrategia alternativa propuesta por los solicitantes e spotenciar la remielinizacion endogena (Miller, D.J. et al. 1995b). Este abordaje implica que las celulas capaces de remielinizar y los factores que sostienen su crecimiento o diferenciacion estan presentes en las lesiones desmielinizadas, pero que hay mecanismos que inhiben esta respuesta y, por tanto, previenen la remielinizacion completa.

Una de las primeras descripciones de la potenciacion de la remielinizacion endogena del SNC procedio del modelo de endefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE). Usando coadyuvante incompleto de Freund (IFA) como vehlculo y los componentes de la mielina como antlgeno, la inmunizacion tras la induction de la enfermedad estimulo la recuperation estructural y funcional en cobayas con EAE (Trautgott y col., 1982). En base a la estimulacion de la remielinizacion endogena en EAE se realizaron experimentos similares en ratones infectados cronicamente con el virus de la encefalomielitis murina de Thelier (TMEV) (Lang, W. et al., 1984). La infection por TMEV de celas susceptibles de ratones da lugar a la desmielinizacion inflamatoria cronica en el contexto de persistencia del virus, que sirve como un excdelente modelo de EM. Los ratones infectados cronicmamente tratados con homogeneizado de medula espinal (SCH) EN ifa mostro una remielinizacion sustancial del SNC en comparacion con los animales control a los que solo se administro adyuvante. A esta observation le siguio experimentos que demostraron que la transferencia pasiva de antisuero o Ig purificada de animales singeneicos no infectados inmunizados con SCH/IFA estimula la remielinizacion en ratones infectados cronicamente con TMEV. (Rodriguez et al., 1987a; Rodriguez and Lennon 1990; Rodriguez 1991). Estos experimentos eran nuevos y contrastaban con la vision clasica de que la respuesta inmunitaria humoral desempena un papel patogenico en enfermedades desmielinizantes del SNC. Estos experimentos fueron los primeros en demostrar qu las IG, en particular los autoanticuerpos, podrlan desempenar un papel beneficioso en la estimulacion de la remielinizacion del SNC.

En base a estas observaciones comenzo la generation de AcMo que estimularon la remielinizacion del SNC en el modelo de desmielinizacion de Thelier. Se utilizaron bazos de ratones SJL en los que que se habla inyectado sch/IFA como fuente de celulas B para fusion y production de hibridoma. Previamente se habla demostrado que el suero de estos ratones estimulaba la remielinizacion en ratones cronicamente desmielinizados. Se generaron hibridomas y se seleccionaron mediante ELISA usando SCH como antigen. Tras la fusion inicial, dos de los 95 hibridomas viables secretaron anticuerpos que s eunieron significativamente a SCH. Las celulas de hibridoma de estos pocillos (denominados SCH79 y SCH94)) se subclonaron y seleccionaron segun la inmunorreactividad de SCH. En la serie SCH79, 14 de 49 clones fueron positivos y lara la serie SCH94 17 de 32 fueron positivos. Los anticuerpos monoclonales producidos por estos hibridomas se analizaron despues in vivo por su capacidad para estimular la remielinizacion en el sistema del modelo de Theiler. Ratones SJL/J de seis a ocho meses de edad infectados cronicamente recibioern inyeccion intraperitoneal o intravenosa de AcMo dos veces a la semana durante 4-5 semanas con una dosis de mAb total de 0,5 mg a 5,0 mg. Dos AcMo SCH94.03 and SCH94.32, mostraron la mayor potenciacion de la remilinizacion del NSC (Miller et al., 1994). La secuencia de las cadenas ligeSCH94.03 probo que estos dos anticuerpos eran identicos, por lo que mas tarde se denominaron SCH94.03 (Miller and Rodriguez 1995c).

El tratamiento con SH94.03 de ratones SLJ con desmielinizacion cronica inducida por TMEV en general tiene como resultado 20-30 % de remielinizacion del area desmielinizada total, en comparacion con menos del 5% en animals control tratados con PBS. Esto representa un incremento de 4-6 veces de la remielinizacion frente a los controles y, a partir de los recuentos axonales, se ha estimado que esto representa una media de 100.000 axones remielinizados en animales tratados con SCH94.03. El analisis por microscopia electronica de las lesiones completamente remielinizadas revela ninguna azo no remielinizado, lo que sugiere que la remielinizacion de los axones disponibles en estas lesiones es cercana al 100 %. SCH94.03 pertenece a la subclase de IgM y es altamente polirreactivo contra antlgenos proteicos conocidos y desconocidos, incluidas las protelnas del citoesqueleto. De interes es que esta codificado or los genes de la llmea germinal de Ig no mutada, lo que confirma que SCH94.03 es un anticuerpo natural. De importancia es que SCH94.03 reconoce un antlgeno de superficie sin identificar sobre los oligodendrocitos, lo que proporciona una potencial diana para los mecanismos de action de este anticuerpo.

Central para esta hipotesis son las diferencias en la biologia entre SCH94.03 y CH12. En el momento de la identififcacion de la secuencia genica de Ig de SCH94.03 se descubrio que habia otro anticuerpo IgMk de raton con una secuencia de la linea germinal identica y una combination genica. Este anticuerpo IgM, designado CH12, es de un linfoma de celulas B cd5+ y tiene una especificidad aparente fosfatidil clina. SCH94.03 y CH12 tienen una identidad de aminiacidos del 99,1 % en la region VL y tienen secuencias de VH identicas. Las unicas diferencias entre SCH94.03 and CH12 se encuentra en la region CDR3, debido a las inserciones en la region N. CH12 no marca la superfciei de los oligodendrocitos y no estimula la remielinizacion en el sistema del modelo de Theiler, por lo que establecer que la unica diferencia molecular que justifique el mecanismo de estimulacion de la remielinizacion reside dentro de la region CDR3. Esta conclusion avala la hiotess de que la union de estos AcMo a antigenos especificos, probablemente dentro de la lesion desmielinizada, es importante para la induccion de la remielinizacion.

Hasta la fecha se han identificado seis anticuerpos monoclonales diferentes de raton, que estimulan

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la remielinizacion en el modelo de TMEV para enfermedades desmielinizantes (Asakura et al., 1998). Los seis anticuerpos son del isotipo de IgM y conservan las secuencias de la Inea germinal que son reminiscentes de los autoanticuerpos (Miller and Rodriguez 1995; Asakura et al. , 1996). Cada une muestra una especificidad de union a antlgeno amplia, pero, lo mas importante, cada uno se une a los antlgenos expresados en las superficies de los oligodendrocitos. Los estudios realizados hasta ahora con anticuerpos IgM que no se unieron a los oligodendrocitos 55 no estimularon la remielinizacion. El miembro prototlpico de este grupo, AcMo SCH94.03, se ha demostrado que estimula la remielinizacion en varios modelos de raton para enfermedades desmmielinizantes. En ratones con desmielinizacion cronica inducida por virus (TMEV), el tratamiento con SCH94.03 tiene como resultado un incremento de 4-6 veces de la remielinizacion. El tratamiento con SCH94.03 tambien se ha mostrado que incrementa significativamente la tasa de remielinizacion espontanea que se produce tras la desmielinizacion qulmicamente inducida tras la inyeccion de lisolecitina.

Dado el exito del aislamiento y caracterizacion de los anticuerpos de raton que estimulan la remielinizacion, la identificacion de homologos humanos de los monoclonales de raton comenzo usando una estreategia independiente de antlgeno. La justificacion era identificar anticuerpos humanos que reaccionan con el homogeneizado de medula espinal de raton mediante ensayo ELISA y que se unen con una afinidad alta a las estructuras y celulas dentro del SNC. Estos anticuerpos se analizaron despues en los modelos de desmielinizacion de raton por su capacidad para estimula la reparacion de la mielina. Los sueros combinados de IgG e IgM humanas de pacientes de la cllnica Mayo Hematology y los anticuerpos monoclonales de celulas B humanas inmortalizadas con EBV (de varias fuentes, como se describe en los resultados) se caracterizaron y analizaron en los modelos de raton. Los resultados de estos experimentos se muestran a continuacion.

RESULTADOS

IgM policlonal humana, pero no IgG, se une a laminas cerebrales de rata y a oligodendrocitos en cultivo

Mediante inmunohistoqulmica, la IgM humana policlonal tine la superficie de una subpoblacion de ilogodendrocitos (Figura 6) y es altamante reactiva para las estructuras y celulas en una lamina de cerebro de rata (Figura 1B). Con la IgG pliclonal humana no se observo reactividad frente a los antlgenos de superficie de los oligodendrocitos (Figura 6) o a las laminas de cerebro de rata (Figura 1A). La inmunohistoqulmica usando IgM o IgG policlonal humana sobre celulas glials fijadas y permeabilizadas mostro una tincion minima de las estructuras intracelulares (datos no mostrados).

La especificidad de la IgM policlonal humana por las estructuras y celulas del SNC, y la union a los oligodendrocitos pueden dirigir el pronunicado potencial remielinizante. En contraste con ello, la IgG policlonal humana, aunque estimula la remielinizacion sobre los niveles control (vease la Tabla 1), no se une al SNC y puede funcionar a traves de un mecanismo diferente al de la IgM policlonal humana.

IgG e IgM policlonales humanas estimulan la remielinizacion del SNC en ratones infectados por TMEV

Aunque la cause de la EM se desconoce, en estudios epidemiologicos se ha sugerido que la enfermedad puede estar desencadenada por un agente infeccioso (Franklin y col. , 1991), aunque esta teoria no se ha probado con ninguna prueba concluyente. Mas recientemente, el virus del herpes de tipo 6 ha recibido atencion como posible agente etiologico en una subpoblacion de pacientes (Groves y col., 1993). De los multiples factores epidemiologicos estudiados que correlacionan con las exacerbaciones, solo se ha efectuado una asociacion consistente con una infeccion virica reciente (Smith y col., 1981). Ademas, el principal tratamiento establecido para la EM, IFN-13, es una citoquina crucial para el control de la replicacion del virus (14).

Un importante modelo murino para el estudio de la EM es el virus de la encefalomielitis murino de Thelier (TMEV). Este picornavirus de cadena positiva tiene una serie de ventajas. (1) El virus es un patogeno natural de los ratones, una especie de la que se sabe mucho sobre inmunologia y genetica; (2) la desmielinizacion primaria (destruccio de las vainas de mielina) es la manifestacion fisica principal de la infeccion cronica (Trautgott y coll., 1982); (3) la genetica del huesped desempena un papel crucial en la determinacion de la susceptibilidad o resistencia a la persistencia cronica del virus, desmielinizaci'n y enfermedad neurologica (Lang y coll., 1996; Rodriguez y col., 1987a, 1987b); (4) como en la EM, la patologia esta mediada por el sistema inmunitario (Rodriguez y Lennon, 1990; Rodriguez 1991; Miller y col., 1994; Miller y Rodriguez 1995c);(5) existe informacion completa sobre la virologia molecular, incluidos detalles de la replicacion del virus y del ensamblaje del virus; (6) la mayoria de los ratones susceptibles que alojan la infeccon por TMEV cronica desarrollan enfermedad neurologica similar a la EM: debilidad de las extremidaes, espasticidad, incontinencia, dismnucion de la actividad espontanea y, en ultima instancia, paralisis (Asakura y col. , 1996a; Askura y col., 1998).

De un modo similar a la EM, los ratones infectados por TMEV mostraron un amplio espectro de fenotipos de enfermedades (definidos como desmielinizacion y deficit neurologicos) (Ludwin, 1997). En un extremo estan los 45 animales en los que el virus se replica rapidamente en las neuronas del SNC, no es eliminado por el sistema inmunologico y tiene como resultado encefalitis grave y muerte (Asakura y col., 1996). Este patron de patologia se

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observa en ratones neonatos o ratones con inmunodeficiencia grave. Esta enfermedad fuliminante contrasta con los ratones que montan una respuesta inmunitaria protectora, mediada principalmente por los linfocitos T de restriction de clase I, que eliminan el virus del SNC. Estos animales desarrollan encefalitis aguda, tras lo cual el virus se elimina del SNC sin la consiguiente desmielinizacion (Blakemore y col., 1997; Jeffrey y Blakemore 1995). Entre estos dos extremos se encuentran los animales que desarrollan enfermedad aguda que se resuelve, pero entran en una fase cronica que se caracteriza por desmielinizacion progresiva y persistencia del virus en oligodendrocitos, astrocitos y microglia (Rivera-Quinones y col., 1998; Miller y col., 1995a). Aunque estos ratones montan una respuesta inmunitaria que impide la muerte y la encefalitis devastadora, la incapacidad para eliminar el virus de la sustancia blanca tiene como resultado una inflamacion persistente cronica y desmielinizacion mediada por el sistema inmunitario. Para evitar las respuestas inmunitarias anti-humano, se trato a los ratones cronicamente infectados (de 5 a 6 meses despues de la infection por TMEV) con una unica inyeccion en bolo de 1 mg de Ig por via intraperitoneal. La dosis total de Ig fue de aproximadamente 0,05 g/kg de peso corporal, que corresponde a un octavo de la dosis total usada para el tratamiento con IVIg humana. No s eprodujeron diferencias significativas en 5 las areas de patologla de la mielina entre los grupos de tratamiento (Tabla 1). No obstante, los ratones tratados con IgM policlonal humana mostraron una remielinizacion importante. Aproximadamente un cuarto del area total de la patologla de mielona se reparo en ratones tratados con IgM policlonal humana. La extension de la remielinizacion fue significativamente mayor que la remielinizacion espontanea observada en los grupos control tratados con PBS (p < 0,01), pero tambien fue superior a la obervada en los ratones tratados con IgG policlonal humana (p= 0,05). Los ratones tratados con IgG policlonal humana mostraron mas remielinizacion que los ratones tratados con PBS. Las lesiones individuales que se remielinizaron mostraron una reparation casi completa con pocas celulas inflamatorias o macrofagos (Figura 12A, B). Con frecuencia, en cada lesion de este tipo se observaron de 500 a 1000 axones remielinizados. En contraste, la mayorla de las lesiones en ratones tratados con PBS tenlan menos exones remielinizados y las lesiones contenlan muchas celulas inflamatorias y macrofagos, signos de destruction activa de la mielina.

La IgM policlonal humana potencia la remielinizacion en la desmielinizacion inducida por lisolecitina

La inyeccion de lisolecitina en la medula espinal es un procedimiento bien establecido para la lesion y desmielinizacion de la medula espinal qulmicamente inducidas. La inyeccion tiene como resultado lesiones desmielinizadas reproducibles que sufren remielinizacion espontanea a las 5-6 semanas. Trabajos previos realizados por los presentes solicitantes han mostrado que el tratamiento con anticuerpos que estimulan la remielinizacion incrementa la tasa de remielinizacion endogena de modo que las lesiones estan sustancialmente reparadas a las 3 semanas. La naturaleza monofasica de las lesiones por lisolecitina, su rapida reparacion espontanea y la ausencia de deficit cllnicos en los animales lesionados contrastan con la desmielinizacion cronica inducida por TMEV y puede modelar aspectos de la lesion en la medula espinal mejor que la EM.

Los animales con lesiones en la medula espinal inducidas con lisolecitina fueron tratados con IgM e IgG policlonal humana. Las microfotograflas de las areas de lesion mostraron que los animales que recibieron IgM policlonal humana contenlan muchos axones remeilinizados, mientras que los animales tratados con IgG policlonal humana o PBS contenian pocos axones remeilinizados (datos no mostrados). En un esfuerzo para cuantificar el numero de axones remielinizados por area de lesion, con un aumento alto se contaron los axones remielinizados de las lesiones de los 3 grupos de tratamiento. Habia un numero significativamente mayor de axones mielinados en lesiones de lisolecitina tratadas con IgM policlonal humana que los animales tratados con IgG policlonal humana (p<0,05).

Las inmunoglobulinas policlonales humanas reaccionan con multiples autoantigenos y haptenos quimicos

Las especificidades por antigeno de las Ig usadas en este estudio se analizaron mediante ELISA. En estudios previos se ha indicado que los anticuerpos que estimulan la remielinizacion muestran una reactividad amplia a multiples antigenos proteicos y de haptenos (Miller y col., 1995c). Tanto la IgG como la IgM policlonal humana se unieron a multples antigenos proteicos y haptenos quimicos (Figuras 15 y 16).

La IgG y la IgM policlonales humanas no reaccionan con antigenos de TMEV.

Para excluir la posibilidad de que la remielinizacion potenciada por IgM humana combinada era el resultado de la especificidad por antigenos de TMEV se realizo transferencia de tipo Western usando TMEV purificado. Ninguno de los AcMo usados en este estudio reacciono con ninguna de las proteinas de la capsice del TMEV conocidas (datos no mostrados). En contraste con ello, los anticuerpos policlonales de conjeo producidos contra TMEV mostraron una fuerte reactividad frente a los antigenos de la capside VP1, VP2, VP3 del virus.

Los anticuerpos monoclonales reactivos en el SNC se pueden identificar en suero humano.

Dado que los autoanticuerpos naturales existen en la poblacion humana normal, deberia ser posible identificar autoanticuerpos monoclonales naturales humanos mediante detection selectiva de un gran numero de clones de IgM monoclonal humana. Se diseno una deteccion selectiva inicial de polirreactividad de anticuerpos

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monoclonales humanos derivados de suero usando un sistema de ensayo de unln a laminas de cerebro sin fijar. Los clones positivos son las muestras que se unieron a estructuras especlficas del ceebro o a capas anatomicas o a poblaciones celulares significativamente por encima del nivel de fondo de un anticuerpo secundario conjugado con un marcador fluorescente solo.

En cincuenta y dos muestras de IgM humana, purificada de los sueros de los pacientes btenidos del departamento de hematologla de la cllnica Mayo, bajo la direccion del Dr. Robert A Kyle, se analizo la especificidad del SNC en un ensayo de union a laminas de cerebro. Se determino que treinta y dos anticuerpos se unlan por encima del nivel de fondo. En las Figuras 1 y 2 se presentan varias d elas reactividades. Tambien se analizaron cincuenta IgG derivadas de suero humano segun su especificidad del SNC en un ensayo de union a laminas de cerebro y se se identificaron patrones de union distintos por encima del nivel de fondo (datos no mostrados). Por tanto, inmediatamente se identifico una diferencia grande entre las IgM y las IgG monoclonales humanas.

Los 32 anticuerpos positivos se analizaron despues en funcion de la union a traves de un sistema de ELISA con homogeneizado de medula espinal (Figura 10) y de la union a cultivos de celulas gliales primarias mixtos de rata tanto fijadas como vivas (Figure 7). Una tabulacion de las reactividades de dichos anticuerpos (anticuerpos sHIgm #) se muestra en la Tabla 2. Los criterios para analizar un anticuerpo para actividad biologica in vivo fueron la especificidad del SNC, la union a oligodendrocitos no fijados en cultivo y una reactividad significativa frente al SCH mediante ELISA. Por tanto, se identifico a sHIgM 22 y a sHIgM46 como estimuladores de la remielinizacion. Otros varios candidatos a sHIgM quedan por estudior cuidadosamente. La capacidad de los anticuerpos sHIgM analizados para unirse a los oligodendrocitos se muesra en la Tabla 3.

Los anticuerpos monoclonales reactivos al SNC se identificaron a partir del sobrenadante de los clones de celulas B humanas inmortalizadas con EBV.

Los sobrenadantes de clones celulares que tenlan una concentration total de IgM superior a 3 ug/ml se analizaron en un sistema de ensayo de laminas de cerebro para determinar su capacidad para unirse a las estructuras del SNC. Se analizaron ciento cuarenta sobrenadantes de clones segun la union a las laminas de cerebro. Se determino que quincesanticuerpos se unlan por encima del nivel de fondo. En la Tabla 2 se muestra una tabulacion de las reactividades de estos anticuerpos (MSI N°). En las Figuras 4 y 5 se presenta una representation de las reactividades de ebvHIgM. Se analizo la capacidad de estos anticuerpos para unirse a los oligodendrocitos. Estos resultados se muestran en la tabla 3.

sHIgMs se unen a la sustancia blanca cortical humana.

Para confirmar que los sHIgM se unen al SNC humano, la sustancia blanca cortical humana se inmunomarco en un sistema analogo al ensayo con laminas de cerebro de rata. La Figura 3 presenta varias de las especificidades del SNC de los sHIgM. Cuatro anticuerpos se unen bien al SNC humano (Figura 3B,C,D,E), mientras que la Figura 3A muestra un SHIgM que se une ligeramente por encima del nivel de fondo.

Los anticuerpos monoclonales humanos se unen a los antigenos de superficie sobre las celulas en cultivos mixtos de celulas gliales primarias.

Varios de los sHIgM se unen a las celulas en cultivos mixtos de celulas gliales primarias de rata. sHIgM 12 se une a los supuestos grupos de progenitories de oligodendrocitos (Figura 7A) en un campo de oligodendrocitos positivos para 04. Otros cuatro sHIgM (Figuras 7B,C,D,F) se unen a los oligodendrocitos morfologicamente maduros. sHIgM 30 se une a la mayorla de las celulas (oligodendrocitos, astrocitos, microglia) en el cultivo (Figura 7E).

sHIgM y ebvHlgM estimulan la remielinizacion del SNC en ratones infectadas por TMEV.

Para evitar las respuestas inmunitarias anti-humano, se trato a los ratones cronicamente infectados (de 5 a 6 meses despues de la infection por TMEV) con una unica inyeccion en bolo de 0,5 mg del anticuerpo monoclonal humano por via intraperitoneal. De los anticuerpos monoclonales humanos analizados in vivo hasta la fecha, sHIgM 22, sHIgM46 and ebvHIgM MSI19D10 estimulares significativamente la remielinizacion sobre otras IgM monoclonales humanas analizadas (sHIgM 1,2 y 14). No se produjeron diferencias en las areas de patologla de la mielina entre los grupos de tratamiento (Tabla 1). Los ratones tratados con sHIgM 22 y sHIgM46 mostraron una remielinizacion importante. Aproximadamente un quinto del area total de la patologla de mielona se reparo en ratones tratados con sHIgM 22 (Tabla 1). La extension de la remielinizacion fue significativamente superior que la remielinizacion espontanea observada en los grupos control tratados con PBS (p<0,05, Tabla 1). Las lesiones individuales remielinizadas mostraron una reparation casi completa con pocas celulas inflamatorias o macrofagos (Figura 12). Con frecuencia, en cada lesion de este tipo se observaron de 500 a 1000 axones remielinizados. En contraste, la mayorla de las lesiones en ratones tratados con PBS tenlan menos exones remielinizados y las lesiones contenlan muchas celulas inflamatorias y macrofagos, signos de destruction activa de la mielina. Consistente con los trabajos previos que demostraban que los anticuerpos mononclonales de raton reactivos con los oligodendrocitos pueden estimular la remielinizacion in vivo (Asukara y col., 1998), los anticuerpos humanos

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reactivos con los oligodendrocitos con reactividades similares a las de sus homologos de raton pueden estimular la remielinizacion in vivo tambien.

Tabla 1. Remielinizacion del SNC por anticuerpos humanos

Tratamiento

N° de Area de Area de Area de Area de

ratones sustancia patologfa de la remielinizacion de remielinizacion de

blanca (mm2) mielina (mm2) tipo SNC (mm2) tipo SNC (%)

policlonal IgG humana

10 8,6 ± 0,52 0,86 ± 0,10 0,13 ± 0,02 14,15 ± 2,38*

policlonal IgM humana

13 9,70 ± 0,43 1,21 ± 0,21 0,24 ± 0,04 23,2 ± 3,26**

sHIgM 1

4 9,34 ± 1,93 0,68 ± 0,07 0,03 ± 0,01 8,35 ± 3,73

sHIgM 2

4 8,78 ± 0,70 0,87 ± 0,12 0,09 ± 0,01 11,37 ± 1,30

sHIgM 14

7 10,68 ± 0,24 0,98 ± 0,09 0,08 ± 0,03 8,57 ± 2,51

sHIgM 22

8 10,55 ± 0,41 1,16 ± 0,22 0,19 ± 0,05 17,06 ± 3,42*

sHIgM 46

5 9,44 ± 0,36 0,66 ± 0,06 0,18 ± 0,04 27,12 ± 4,01***

ebvHIgM

3 8,24 ± 0,40 0,90 ± 0,14 0,26 ± 0,07 26,47 ± 3,71***

MSI19D10

ebvHIgM AKJR4

4 8,70 ± 0,84 1,10 ± 0,15 0,05 ± 0,03 4,15 ± 1,98

PBS

7 9,78 ± 0,60 1,20 ± 0,22 0,06 ± 0,02 6,74 ± 1,80

Los valores representan la media ± SEM. Se usaron ANOVA de una via y una prueba t para comparar el porcentaje de area de remielinizacion de tipo SNC en ratones tratados con anticuerpos humanos con los ratones tratados con PBS. Dicho analisis revelo valores *p<0,05; fp<0,01, tp<0,001. La comparacion d elos ratones tratados con IgG policlonal humana con otros tratamientos revelo: IgM policlonal humana p= 0,05, , sHIgM 46 P<0,05. Ninguna de las demas comparaciones fue estadlsticamente significativa. No se observaron diferencias en la remielinizacion de tipo SNC entre IgM policlonal humana, sHIgM 22 y sHIgM 46. El area de remielinizacion de celulas de Schwann de tipo PNS vario de ) a 0,08 mm2. Esto correspondio a un porcentaje de area de 0,0 a 6,92 de remielinizacion de celulas de Schwann de tipo PNS como una funcion de la patologla de la mielina. No se observaron diferencias significativas en el area de la patologla de la mielina en los diversos grupos de tratamiento o en comparacion con el PBS o en la remielinizacion de celulas de Schwann de tipo PNS entre grupos.

TABLA 2

NOMBRE DEL CLON*

DESCRIPCION DE LA TINCION INMUNOFLUORESCENTE DE CEREBELO DE RATA NEONATA

CB2b-G8

Identifica cuerpos celulares neuronales grandes en la capa granular, cuerpos celulares redondos pequenos en la capa molecular, astrocitos fibrosos en la sustancia blanca central.

CB2e-C2

Marcaje debil de cuerpos de celulas de Purkinje; celulas pequenas procesadas de morfologla de oligodendrocitos y microglias, y astrocitos en la sustancia blanca central y la capa granular.

CB2i-E7

Marcaje de las celulas de Purkinje, celulas en la capa granular, sustancia blanca central en las hojas; citoesqueleto de oligodendrocitos y celulas gliales.

CB2i-E12

Fuerte marcaje de los cuerpos de las celulas de Purkinje, arboles dendrlticos y celulas redondas pequenas en la capa molecular, marcaje casi confluente de la capa granular, astroicitos fibrosos en la sustancia blanca central.

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NOMBRE DEL CLON*

DESCRIPCION DE LA TINCION INMUNOFLUORESCENTE DE CEREBELO DE RATA NEONATA

CB2i-G2

Fuerte marcaje de los astrocitos fibrosos en los tractos de la sustancia blanca central; indentifica cuerpos de las celulas de Purkinje; marcaje puntuado sobre la capa granular, cuerpos de celulas pequenas en la capa molecular.

CB2L-H1

Fuerte marcaje de los cuerpos de las celulas gliales en la sustancia blanca central y los cuerpos de celulas de Purkinje; marcaje mas debil de los arboles dendrlticos; cuerpos de celulas pequenas muy pronunciados en la capa molecular.

MSI 10-E10

Fuerte marcaje de los tractos de la sustancia blanca central fibrosos, similar al observado usando anticuerpos antiglicollpicos y anticuerpos anti-microglia.

MSI 16-E6

Marcaje fuerte de cuerpos de celulas de Purkinje, mas debil de los arboles dendrlticos; marcaje casi confluente de las celulas pequenas en la capa granular; sustancia blanca central casi sin marcar.

MSI 17-A2

Marcaje fuerte de celulas redondas pequenas en la capa molecular y de cuerpos de celulas de Purkinje; marcaje difuso de la capa granular, sustancia blanca central sin marcar.

MSI 19-C11

Aspecto fibrosos de la sustancia blanca central, con muchas celulas de la morfologla de los oligodendrocitos, marcaje puntuado en la superficie sobre la mayorla del tejido, pero concentrado sobre los presuntos cuerpos celulares.

MSI 19-ES

Marcaje de la capa molecular similar a la matriz extracelular, fuerte marcaje fibroso de la sustancia blanca central, que identifica muchas celulas gliales individuales.

AKJR4

Identifica todos los cuerpos celulares neuronales en la capa granular, cuerpos celulares redondos pequenos en la sustancia blanca central y en la capa molecular.

MSI 19D10

Se une fuertemente a las celulas de la capa granular y a las celulas de Purkinje y a sus arboles dendrlticos, ademas de identificar debilmente la sustancia blanca y los astrocitos.

MSI 20H10

Se une a la sustancia blanca central, a las capa granular y molecular, y a las celulas de Purkinje, con varios grados de intensidad.

MSI 17E11

Se une de un modo puntuado a solo unas pocas celulas de aspecto glial en la superficie de la lamina de cerebro.

sHIgM1

Se une al citoesqueleto de los astrocitos sobre la sustancia blanca central de las hojas.

sHIgM2

Se une a las celulas de la capa granular y a las fibras que atraviesan la sustancia blanca central de las hojas.

sHIgM12

Se une para dar un aspecto esponjoso a la sustancia blanca central de las hojas y un marcaje uniforme sobre a capa molecular, reminiscente de una molecula de la matriz extracelular.

sHIgM14

Se une bien a las celulas de la capa granular y a las celulas de Purkinje localizadas en la superficie de la lamina, mientras que la sustancia blanca central de las hojas esta en gran medida desprovista de marcaje.

sHIgM22

Se une bien al citoesqueleto de los astrocitos danados sobre la sustancia blanca central de las hojas, a las celulas de Purkinje y a sus arborizaciones dendrlticas, y a las celulas redondas pequenas en la capa molecular; marca debilmente la superficie de las celulas granulares.

sHIgM26

Se une a las celulas de aspecto de oligodendrocito y a la sustancia blanca fibrosa.

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NOMBRE DEL CLON*

DESCRIPCION DE LA TINCION INMUNOFLUORESCENTE DE CEREBELO DE RATA NEONATA

sHIgM29

Se une debilmente a muchas estructuras dentro del cerebelo, con una intensidad justo por encima de la de fondo, a excepcion de una poblacion pequena de neuronas en las capas granular y molecular. Las extensiones axonicas superiores a 100 pm estan claramente delimitadas.

sHIgM30

No se une al cerebelo sin fijar.

sHIgM31

Se une predominantemente a la capa granular, con poca union a la sustancia blanca, las celulas de Purkinje o los astrocitos.

sHIgM32

Se une a las celulas de aspecto de astrocito de tipo 2.

sHIgM42

Se une en un patron fibroso a toda la hija, las capas molecular y granular y a la sustancia blanca.

sHIgM46

Se une en un patron fibroso a toda la hija, la capa granular y a la sustancia blanca. Las celulas de Purkinje estan bien definidas.

sHIgM50

Se une predominantemente a la capa granular, con poca union a la sustancia blanca, las celulas de Purkinje o los astrocitos.

sHIgM51

Se une a celulas pequenas similares a la microglia en las capas molecular y granular.

De los 96 clones de celulas B humanas de EBV generados, 60 produjeron anticuerpo IgM a una concentracion de 2 pg/ml o mayor. De estos, se descubrio que 11 se unlan fuertemente al cerebelo murino de forma consistente. Otros 10 se unieron al cerebelo murino debilmente o de forma inconsistente, mientras que 39 no se unieron. Se incluyen las imagenes de la tincion inmunofluorescente de los anticuerpos de tincion fuerte de forma consistente indicados anteriormente, as! como cuatro clones negativos representativos (CB2g-E10, CB2g-F11, CB2IF10, MSI24-D6). *CB: Clones generados a partir de sangre de cordon umbilical humano; MSI: clones generados a partir de sangre periferica de pacientes de esclerosis multiple; AKJR: clones generados a partir de sangre periferica de pacientes de artritis reumatoide.

TABLA 3

Union a oligodendrocitos

Anticuerpo

Union a oligodendrocitos

MSI 17 A.2

Negativa

MSI 19C11

Negativa

MSI 19E5

Mara oligodendrocitos de morfologla madura

AKJR 4

Negativa

MSI 19010

Marca algunos oligodendrocitos de morfologla madura

MSI 20H10

No analizado

MSI 17E11

No analizado

SH1gm 1

Sin reactividad contra los antlgenos de superficie

SH1gm2

Sin reactividad contra los antlgenos de superficie

SH1gm 12

Presuntos progenitores de oligodendrocitos antes de la expresion de sulfortido

SH1gm 14

Marca oligodendrocitos maduros multiprocesados

SH1gm 22

Marca estadios maduros de los oligodendrocitos y extensiones del proceso

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Union a oligodendrocitos

Anticuerpo

Union a oligodendrocitos

SH1gm 26

Sin reactividad contra los antlgenos de superficie

SH1gm 29

Sin reactividad contra los antlgenos de superficie

SH1gm 30

Sin reactividad contra los antlgenos de superficie

poly hIgG

Negativo en la superficie

poly hIgm

Subpoblacion de oligodendrocitos maduros

CB2b G8

Marca oligodendrocitos (humanos) de morfologla madura

CB2e C2

Negativa

CB2iE7

Marca oligodendrocitos de morfologla madura

CB2i E12

Negativa

CB2i G2

Negativa

CB2L H1

Negativa

MSI 10E10

Negativa

MSI 16E6

Negativa

sHIgM31

No hay union a oligodendrocitos

sHIgM32

No hay union a oligodendrocitos

sHIgM42

Se une a los estadios maduros de los oligodendrocitos y debilmente a los astrocitos subyacentes

sHIgM46

Se une fuertemente a los estadios maduros e inmaduros de los oligodendrocitos con marcaje puntuado.

sHIgM50

Debil marcaje puntuado de la subpoblacion de estadios maduros de los oligodendrocitos

sHIgM51

Se une a los estadios maduros de los oligodendrocitos y debilmente a los astrocitos subyacentes.

Anticuerpos monoclonales que estimulan la remienilizacion producer) un flujo de Ca2+ en las celulas gliales en cultivo.

La respuesta de las celulas gliales cultivadas a las concentraciones fisiologicas de los anticuerpos que estimulan la remielinizacion sugiere que estoas anticuerpos pueden tener efectos directos sobre la bioqulmica de las celulas gliales a traves de la regulacion del flujo de calcio celular. Este efecto puede representar un aspecto importante del mecanismo molecular de la remielinizacion inducida por anticuerpos. La Figura 21 demuestra las respuestas de Ca2+ de las celulas gliales a cuatro anticuerpos diferentes. Dos de estos anticuerpos, sHIgM 22 ySCH94.03, estimulan la remielinizacion in vivo y dos sHIgM 14 y CH12 no estimulan la remielinizacion. Las celulas que respondieron al anticuerpos exhibieron uno de dos tipos diferentes de picos de calcio. Algunas celulas respondieron con un pico de inicio rapido de corta duracion (respuesta rapida), como muestran los trazados rojos en los paneles A y B. Una subpoblacion distinta de celulas respondio con un pico de inicio mas lento de duracion mas larga (respuesta lenta) como demuestra la ausencia de trazados negros en los paneles A y B. Los anticuerpos sHIgM 22 y SCH94.03 provocaron cada uno ambos tipos de respuestas, pero siempre de diferentes celulas gliales individuales. Estas respuestas cualitativamente diferentes sugieren claramente dos modos de accion moleculares distintos sobre diferentes subpoblaciones de celulas. Una respuesta de anticuerpo (la respuesta rapida o la lenta) se observo en 30 de 251 celulas tras el tratamiento con sHMab22 y en 36 de 251 celulas tratadas con SCH 94.03. Los anticuerpos que no estimulan la remielinizacion in vivo (sHIgM14 y CH12) no se observo que causaran el flujo de calcio en cultivos de glia (panel C). Para cada uno de estos anticuerpos se analizo un total de 203 celulas.

Los anticuerpos monoclonales humanos se unen a las neuronas primarias.

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Muchos de los sHIgMs y ebvHIgMs se unen a poblaciones neuronales en laminas de cerebro. No obstante muchas de las aneuronas unidas estan en la superficie de la lamina, lo que plantea la posibilidad de que los anticuerpos se puedan unir a epltopos internos dentro de las neuronas danadas. Las Higo de union positivas se analizaron para determinar la union a celulas granulares de rata viva en cultivo. La Figura 22 demuestra la union de dos sHIgMs a neuronas vivas. sHIgM 12 se une a las extensiones axonales y dendrlticas de las neuronas (Fig. 22A), mientras que ebvHIgm CB2iE12 se une exclusivamente al exterior de la membrana de las celulas granulares y las extensiones axonicas proximales (Figura 22B). Estas reactividades se verificaron mediante inmunohistoqulmica de marcaje doble mediante marcaje c de neuronas ositivas a anticuerpos humanos con anticuerpos de protelna 2 asociados anti-neurofilamento y anti-microtubulos (datos no mostrados).

De interes particular para nuestro laboratorio es la posibilidad de que la desmielinizacion predisponga a los axones a lesiones inmunomediadas y a los correspondientes deficit neurologicos. En nuestro analisis reciente de ratones deficientes en microglobulina p2 (132m -/-), los inventores demostraron que, en ausencia de MHC de clase I, los ratones infectados con TMEV desarrollan lesiones de desmielinizacion grandes pero no desarrollan deficits cllnicos. Los ratone smostarron una conservacion relativa de axones con mayores densidades de los canales de calcio y remielinizacion de la sustancia blanca de la medula espinal. La conservacion de los exones parece ser esencial para el mantenimiento de la funcion neurologica. La observacion de que los anticuerpos humanos s epueden unir especlficamente a las neuronas presenta otra posible via para la participacion de los anticuerpos en la reparacion del SNC. Ciertos anticuerpos pueden ser capaces de potenciar la remielinizacion a traves de su accion sobre las neuronas. La reparacion de las lesiones en el SNC se pueden potenciar con anticuerpos monoclonales a traves de muchas situaciones posibles. 1) incrementar las uniones adhesivas entre neuronas y oligodendrocitos. 2) estimulacion celular directa de las neuronas ara regular por incremento los factores troficos y atraer a los 20 progenitores de los oligodendrocitos al area de los axones desnudos. 3) neuroproteccion de los axones mediante bloqueo de los canales ionicos con perdidas sobre los axones desnudos. 4) proteccion de los axones desnudos del reconocimiento por las celulas inmunitarias activadas y destructoras.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

A. Produccion de anticuerpos monoclonales, caracterizacion, deteccion selectiva y purificacion:

Fuentes de Ac y purificacion de Ac.

IgM humana normal se purifico de plasma combinado de mas de 2.500 donantes sanos mediante el procedimiento de fraccionamiento en etanol de Deutsch-Kistler-Nitschmann, seguido de precipitation en acido octanoico y dos etapas sucesivas de cromatografla de intercambio ionico como previamente se ha descrito (Hurez y col., 1997). La pureza de la IgM fue superior al 90 %, confirmado mediante ELISA y electroforesis en gel de SDS- poliacrilamida (PAGE). La IgG humana combinada de donantes sanos usada cllnicamente como IVIg se adquirio en Miles Inc. (Elkhart, IN). Las muestras se obtuvieron de la cllnica de disproteinasa bajo la direction del Dr. Robert A. Kyle, Cllnica Mayo. Las muestras de suero procedieron de pacientes con una amplia variedad de afecciones caracterizadas por picos de IgG o IgM monoclonales en suero, incluidas macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma multiple, linfoma, gammapatla monoclonal benigna.

Generation de lineas de celulas B inmortalizadas con el virus de Epstein-Barr (EBV)

La llnea celular de tit! B95-8 de la ATCC (N° CRL 1612) para el crecimiento y aislamiento del EBV. Las celulas se siembran a 1 x 106 celulas/ml en medio completo RPMI-10, seguido de 3 dlas de incubation en un incubador humidificado, a 37 °C, 5% de CO2 . Las celulas se recogen y el sobrenadante se elimina mediante centrifugation durante 10 minutos a 300 x g y a 4 °C. El sobrenadante que contiene el EBV se pasa a traves de un filtro de 0,45 40 pm y el flujo pasante se recoge y almacena a -130 °C (nitrogeno llquido). Este sobrenadante con EBV contiene, en general, 102-103 unidades transformantes/ml.

Las celulas B perifericas para inmortalizacion se recogieron de la sangre de adultos normales (NA), adultos con artritis reumatoide (AKJR), adultos con esclerosis multiple (EM) y de sangre de cordon umbilical (CB). La sangre heparinizada (15 ml) se diluye a 1:2 en solution salina tamponada con fosfato (PBS) y 12 ml de esta dilution se introducen por debajo de la capa con 12 ml de Ficoll-Hypaque en un tubo de centrlfuga de 50 ml. El tubo se centrifuga durante 8 minutos a 1500 x g, a temperatura ambiente, y la intefaz leucocitaria se elimina y s etransfiere a un nuevo tubo de centrlfuga de 50 ml. Las celulas se lavan mediante centrifugacion (15 minutos, 300 x g, temperatura ambiente), una vez en PBS y, despues, dos veces en solucion salina equilibrada de Hank (HBSS). Despues, las celulas se resuspenden en 2-5 ml de medio completo RPMI-10 y se contaron.

Las celulas se diluyen a 4x106 celulas/ml en medio completo RPMI-10 , 2,5 ml (1x107 celulas) se transfieren a un tubo de centrlfuga de 50 ml y se anaden 2,5 ml de sobrenadante con EBV. El tubo se incuba durante dos horas en un bano de agua a 37 °C, seguido de la adicion de 5 ml de medio completo RPMI-10 que contiene 1 pg/ml de ciclosporina A. Los 10 ml de suspension celular se transfieren despues a un matraz de cultivo tisular de 25 cm2 y se cultivan durante 3 semanas en un incubador humidificado, a 37 °C, 5% de CO2. Tras 3 semanas, un

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allcuota del cultivo se crioconserva y el resto se expande y se alslan las llneas de celulas clonales mediante dilucion llmite.

Purificacion de anticuerpos IgM

Se escogieron muestras de suero humano para estudiar unicamente por la presencia de un pico alto de IgM en el cromatograma de Ig. Las muestras se obtuvieron de la cllnica de disproteinasa bajo la direccion del Dr. Robert A. Kyle, Cllnica Mayo. Las muestras de suero procedieron de pacientes con una amplia variedad de afecciones caracterizadas por picos de IgG o IgM monoclonales en suero, incluidas macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma multiple, linfoma, gammapatla monoclonal benigna. Los sueros de los pacientes se dializaron contra agua desionizada durante tres dlas. Los precipitados euglobullnicos se recogieron mediante centrifugacion (1400 rpm/30 minutos) y se disolvieron en PBS. Las soluciones se eliminaron mediante centrifugacion (1400 rpm/30 minutos) y se sometieron a cromatografla en una columna de Superosa 6 (Pharmacia, Upsalla) equilibrada con PBS. Las fracciones correspondientes a IgM se combinaron y analizaron mediante SDS-PAGE reductora (12 % de gel). Las concentraciones de IgM se determinaron mediante tincion de los geles de SDS con Cypro Orange (Molecular Probes, Eugene) y el posterior barrido en Storm 840 (Molecular Dynamics). Las IgM monoclonales (Sigma, St Louis) se uso como patron para la medicion de la concentracion. Las soluciones de IgM se esterilizaron mediante filtracion a traves de filtros de 0,22 pm.

Caracterizacion de la especificidad de union a antigeno

Como ensayo para la deteccion selectiva preliminar de anticuerpos antes del analisis in vivo de la capacidad para producir remilelinizacion se uso ELISA contra homogeneizado de medula espinal (SCH) de raton. Para caracterizar adicionalmente la polirreactividad y la especificidad antigenica de anticuerpos seleccionados, se uso un ELISA contra el panel estandar de protelnas y antlgenos qulmicos, as! como analisis de los patrones de tincion del anticuerpo en tejidos neurales seccionados y sobre oligodendrocitos cultivados.

Ensayo ELISA

Se realizo deteccion selectiva de los anticuerpos segun su reactividad al homogeneizado de medula espinal (SCH) de raton. SCH a una concentracion de 0,01 mg/ml se introdujo en placas de microtitulacion de poliestireno en tampon carbonato 0,1M, a pH 9,5, durante 18 horas a 4 °C y despues se lavaron 3 veces con PBS. Las placas revestidas se bloquearon con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) + 1% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpo diluido a 10 Qg/ml en tampon de bloqueo durante 2-24 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas tres veces con PBS/0,05% de Tween 20 y el anticuerpo anadido se detecto con anti-IgM o IgG de cabra biotinilada, seguida de fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina, con p- nitrofenilfosfato como sustrato cromogenico. La absorbancia de la reaccion se mide a 405 nm.

Tambien se analiza la reactividad de los anticuerpos frente a un panel de antlgenos proteicos (espectrina eritrocitaria humana, cadena pesada de miosina bovina, hemoglobina de raton, transferrina bovina, vimentina bovina, lisozima de huevo de pollo, actina de conejo, protelna basica de la mielina de conejo, hemocianina de lapa californiana) y haptenos qulmicos acoplados a seroalbumina bovina (BSA) (4-hidrozi-3-nitrofenilacetilo (NP), feniloxazolona (PhoX), axofeniltrimetilamonio (TMA), fluorescelna (FL), azofenilfosforil-colina (PC), azofenilarsonato (Ars), trinitrofenil acetilo (TNP)). Las protelnas s eusan a 5 pg/ml y haptenos acoplados a BSA se usan a una concentracion de hapteno 2 pM. Los antlgenos se introducen en las placas de microtitulacion de poliestireno, reaccionaron con anticuerpo y los anticuerpos unidos se detectan como se ha descrito para ELISA con SCH.

Tincion de seccion tisular

Como fuente de tejido neural se usa cerebelo de rata neonata para la comparacion de patrones de tincion de anticuerpos. Tejido fresco sin fijar se incluye en agarosa al 2% de bajo punto de fusion y se corta en secciones sagitales de 300 Qm en un triturador de tejido McIlwain Tissue Chopper. Las secciones no se fijan y se conservan a 4 °C o en hielo a lo largo del resto del procedimiento. Las laminas se transfieren a placas de cultivo tisular de 48 pocillos en sales equilibradas de Earles tamponadas con HEPES ((E/H) y se bloquearon durante 30 minutos en E/H con 5% de BSA. Las secciones se tinen con anticuerpo primario a 10 Qg/ml en E/H con 1% de BSA durante 2-12 horas a 4 °C. Las seciones se lavan 3 veces en E/H y se incuban con un anticuerpo secundario fluorescente adecuado en E/H con 1 % de BSA durante 2 horas. Las secciones se lavan 3 veces en e/h, 1 vez en PBS y despues sefijan con 4% de paraformaldehldo durante 30 minutos. Las secciones se lavan 3 veces con PBS y se montan en 90 % de glicerina con 2,5 % de 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano para prevenir el fotoblanqueo.

Tincion de oligodendrocitos cultivados

Se diseccionan los hemisferios cerebrales de ratas Sprague-Dawley P0-P3 y se retiran las meninges y vasos sangulneos. El tejido se tritura y se transfiere a una solucion de tripsina al 0,25% en sales equilibradas de Earles tamponadas con HEPES (E/H) sin calcio ni magnesio, hasta un volumen final de 10 ml por cerebro. El tejido

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se agita a rpm baja a 37 °C durante 30 minutos y, despues, se anade suero bovino fetal inactivado con calor hasta una concentracion final del 10 % para inactivar la tripsina. Se anaden MgSO4 y ADNasa (hasta 0,1 % y 20 pg/ml, respectivamente) y el tejido se agita durante 5 minutos adicionales. Las celulas se lavan mediante centrifugacion y se resuspenden en E/H con ADNasa I y se disocian mediante trituracion a traves de una pipeta de vidrio. Los residuos grandes se dejan sedimentar y el sobrenadante celular superior se lava mediante centrifugacion a traves de una almohada de 4% de BSA en E/H. El sedimento celular se resuspende en medio de cultivo y las celulas se siembran a 2,5 x 105 celulas por cm2 en placas de cultivo de poli-D-lisina. Las placas se agitan para aislar los progenitores de oligodendrocitos el dla 9-12. En este momento hay una diseminacion fenotlpica completa de oligodendrocitos en el cultivo con progenitores presentes en la capa superior en grupos de celulas recientemente divididas. Los progenotires de oligodendrocitos se alslan mediante agitacion suave los cultivos, se vuelven a sembaren placas sobre cubiertas revestidas con polilisina y se estimularon para diferenciar mediante la eliminacion d elos factores de crecimiento del medio de cultivo.

La tincion de la superficie viva se realiz a 4 °C durante 15 mintuos sobre celulas no fijadas despues de bloquear con PBS y 5% de BSA. La tincion intracelular se realiza tras fijacion con 4% de paraformaldehldo y permeabilizacion con 0,1 % de Triton-X-100. Los anticuerpos primarios se detectan con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescelna. Los cubreobjetos se montan en 90 % de glicerina con 2,5 % de 1,4- diazabiciclo[2.2.2]octano para prevenir el fotoblanqueo y se ven en un microscopio de epifluorescencia.

Transferencia de tipo western

El TMEV purificado (Njenga y col., 1996) se separo mediante SDS-PAGE sobre geles de acrilamida al 15 %. Las protelnas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante electrotransferencia. La membrana se bloqueo con solucion salina tamponada con Tris que contiene 5% de leche seca desgrasada y 0,05 % de Tween 20 durante 2 horas a temperatura ambiente. La membrana se incubo con IgM humana combinada, IgG humana combinada, IgM de dos apcientes con macroglobulinemia de Waldenstrom y Ac anti-TMEV policlonal de conejo (1:2000) (Njenga y col., 1996) durante 4 horas a temperatura ambiente. Todas las Ig humanas se usaron a la misma concentracion (10 ug/ml). Las Ig unidas se detectaron con anticuerpos anti-humanos de cabra biotinilados o anticuerpos anti-conejo de cabra biotinilados (ambos de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) y estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina usando 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato y azul de nitro- tetrazolio (BCIP/NBT).

B. Estimulacion de la remielinizacion usando anticuerpos monoclonales humanos:

Desmielinizacion inducida por TMEV - Para la production de la desmielinizacion inducida por TMEV se realiza inyeccion de virus intracerebral en animales de 4-6 semanas de edad ligeramente anestesiados con metofano. El virus se inyecta usando una aguja de 37 gauge con una jeringuilla de Hamilton que libera un volumen de 10 pl que contiene 2 x 105 UFP de la cepa de Daniel de TMEV. La inyeccion intracerebral tiene como resultado una incidencia superior al 98 % de infection viral cronica con desmielinizacion. Los animales cronicamente infectados para los experimentos de remielinizacion son, en general, de 6-8 meses tras la infeccion.

Protocolo del tratamiento con anticuerpos

Los animales con desmielinizacion cronica reciben inyecciones intraperitoneales (IP) de anticuerpos purificados en solucion salina tamponada con fosfato. Para los animales infectados por TMEV, el programa d einyeccion consiste en inyecciones dos veces a la semana de 50 Qg en 100 ml. La duration del tratamiento con anticuerpos es de cinco semanas (500 pg de dosis total). Despues, se sacrifico a los animales y el tejido de medula espinal se procesa para su evaluation morfologica tal como se describe mas adelante. Para cada tratamiento con un anticuerpo diferente, en nueve ratones SJL/J hembra cronicamente infectados se inyecta el anticuerpo. Al final del periodo de tratamiento, seis de los animales se perfunden y procesan para la cuantificacion morfometrica de desmielinizacion/remielinizacion y se sacrifico a tres para obtener tejido congelado que se usa para la evaluacion de la integridad del axon. Para cualquier anticuerpo dado se requieren tres ensayos de tratamiento por separado, con resultados reproducibles y consistentes, antes de que los datos se consideren significativos. Como controles negativos se incluyen grupos control con PBS y con isotipo, para cada nuevo experimento de tratamiento con anticuerpo.

Evaluacion morfologica de la remielinizacion/remielinizacion

Al final de cada experimento, la medula espinal de cada animal se evaluara histologicamente. Se anestesio a los ratones con pentobarbital y se perfundieron mediante administration intracardlaca de agente de fijacion (formaldehldo al 4% tamponado con fosfato con glutaraldehldo al 1 %, pH 7,4). Se retiran las medulas espinales y se seccionan coronalmente en bloques de 1mm, se fijan despues con osmio y se incluyen en araldita. De cada bloque se cortan secciones transversales de un micrometro de espesor y se tinen con parafenilendiamina al 4 %.

Esta tecnica es reproducible y permite la visualization constante de las vainas de mielina en la sustancia

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blanca de la medula espinal.

La desmielinizacion y remielinizacion se cuantifican usando un sistema de analisis digital interactive Zeiss (ZIDAS) y una camara lucida. Para cada raton se analizan diez secciones transversales de medula esponal que atraviesan toda la medula, desde las regiones de la columna cervical a la espinal porximal cocclgea. El area total de la sustancia blanca, el area de desmielinizacion y el area de remielinizacion se determinan para cada seccion y las areas de las diez secciones analizadas para un raton especlfico se anaden para proporcionar las areas totales para cada raton. Las areas de desmielinizacion se caracterizan por cantidades grandes de residuos de meilina, residuos que tragan los macrofagos, infiltracion celular y axones desnudos. La remielinizacion de los oligodendrocitos se caracteriza por areas de axones con vainas de mielina anormalmente finas y ausencia de celulas de Schwann. La comparacion estadlstica de la extension de la desmielinizacion y de la remielinizacion se realiza usando la prueba t de Student.

Desmielinizacion inducida por lisolecitina

Para estos experimentos, se anestesio a ratones SJL/J de 12 semanas de edad con pentobarbitol sodico y se realiza una laminectomla dorsal en la region toracia superior de la medula espinal. Se usa una aguja de 34 gauge unida a una jeringuilla Hamilton para inectar 1 Ql de una solucion al 1 % de lisolecitina directamente en el lado dorsolateral de la medula. Se sacrifica a los animales a los 21 dlas de la inyeccion y la region de la medula espinal en la que se realizo la inyeccion se elimina y procesa para su evaluacion morfologica.

Como segundo modelo de desmielinizacion se uso la inyeccion intraespinal de lisolecitina. Ratones SJL/J de 12 semanas de edad fuero anestesiados mediante inyeccion intraperitoneal de pentobarbital sodico (0,08 mg/g). Se realizaron laminectomlas dorsales sobre la regon toracica superior de la medula espinal y se inyecto lisolecitina (L-a-lisofosfatidilcolina) (Sigma, St. Louis, MO) como se ha descrito previamente (Pavelko y col., 1998). Brevemente, se uso una aguja de 34 gauge unida a una jeringuilla de Hamilton montada sobre un micromanpulador estereotactivo para inyectar una solucion al 1 % de lisolecitina en PBS esteril (pH 7,4) con azul de evan anadido como marcador. La aguja se inserto en la parte dorsolateral de la medula espinal, se inyecto 1 ul de lisolecitina y, despues, se retiro lentamente la aguja. La herida se suturo en dos capas y los ratones se recuperaron. El dla de la inyeccion de lisolecitina se denomino dla 0.

Siete dlas despues de la inyeccion de lisolecitina, se trato a los ratones con una inyeccion en bolo intraperitoneal de IgM humana o IgG humana (1 mg/cada inyeccion). Se trato a los ratones control con una inyeccion en bolo intraperitoneal de PBS. Trees semanas y cinco semanas despues de la inyeccion de lisolecitina, se sacrifico a los ratones y se prepararon secciones de un Qm de espesor como se ha descrito en la seccion anterior. El bloque de araldita que mostraba la lesion de desmielinizaicon inducida con lisolecitina mas grande se uso para el analisis cuantitativo. El area total de la lesion se cuantifico usando un sistema de analisis digital Zeiss. El numero total de las fibras remielinizadas se cuantifico usando un sistema de analisis informatico/microscopio Nikon. Los datos se expresaron en forma del numero de azones remielinizados/mm2 de la lesion.

Los ratones tratados con lisolecitina recibieron inyecciones IP de 50 pig del anticuerpo los dlas 0, 3, 7, 10, 14, y 17 tras la inyeccion de lisolecitina. Se sacrifica a los animales el dla 21 despues de la inyeccion de lisolecitina. Los inventores encontraron de forma rutinaria efectos del tratamiento estadlsticamente significativos con grupos de tratamiento experimental de diez animales. Los grupos control con PBS y de isotipo sirvieron como controles negativos.

C. Mecanismo de accion de los anticuerpos monoclonales humanos que estimulan la remielinizacion:

Analisis fluorescentes ratiometricos de Ca2+

Los cultivos mixtos de gllas primarias, desde el dla 2-4 tras el nacimiento de los cachorros de rata,, se siembran sobre subreobjetos revestidos con poli-D-lisina y se cultivan durante 5-7 dlas antes del analisis. Fura-2-AM y Pluronic F-127 se mezclan a 1:1 y se anaden a DMEM (sin suero) para dar Fura-2 4 mM en solucion (medio de carga Fura-2).

Los cubreobjetos con celulas se lavan una vez con DMEM y despues se incuban en medio de carga Fura-2 durante 60 minutos a 37 °C. Despues, las celulas se lavan 4 veces en DMEM. El cubreobjetos se monta en una camara de registro en un microscopio de fluorescencia nvertido conectado a un sistema de adquisicion de datos controlado por ordenador, que captura imagenes digitales de emision de fluorescencia a 510 nm, a dos longitudes de onda de excitacion diferentes: 340 nm y 380 nm. Para cada registro, las imagenes digitales se capturan de una celula individual, a ntervalos de 10 segundos durante 600-800 segundos. La concentracion relativa interna de Ca2+ se calcula como la proporcion de 340 nm/380 nm de fluorescencia. Todos los registros se realizan a 37 °C en 1 ml DMEM.

El anticuerpo de ensayo se introduce anadiendo 50 ml de la solucion madre de anticuerpo concentrado (60

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mg/ml en PBS) a la camara de registro para dar una concentracion final de 3 mg/ml. Despues de registrar los efectos de la adicion de los anticuerpos de ensayo, se anaden 50 ml de una reserva de ionoforo de calcio (Br-A23187 20 mM en PBS), para dar una concentracion final de 10 mM.

DISCUSION

Se ha demostrado que la inmunoglobulina (Ig) humana nornal, especialmente la IgG, administrada por via intravenosa (IVIg) es eficaz en el tratamiento de varias enfermedades neurologicas autoinmunitarias, incluido el slndrome de Guillain-Barre (van der Mech y col., 1992), neuropatlas desmielinizantes idiomaticas cronicas (van Doom y col., 1991), neuropatla motora multifocal (Chaudhry y col., 1993), polimiositis (Cherin y col., 1991), y miasthenia gravis (Edan y Landgraf, 1994). Los mecanismos mediante los que actua la Ig no estan claros. Algunos investigadores tambien han sugerido que esta terapia puede ser eficaz en las enfermedades del SNC autoinmunitarias mediadas por linfocitos T, tal como esclerosis multiple (EM) (van Engelen y col., 1992; Achiron y col., 1992; Fazekas y col. , 1997; Achiron y col., 1998; Sorensen y col. , 1998).

Los inventores han usado la desmielinizacion inducida por el virus de la encefalomielitis murina de Thelier (TMEV) como modelo para desarrollar nuevos tratamientos para la EM. Cuando este picornavirus se inocula por via intracerebral en cepas susceptibles de ratones, el TMEV induce desmielinizacion del SNC progresiva mediada por el sistema inmunitario que es cllnica y patologicamente similar a la EM. Los inventores han probado que multiples IgM de raton (anticuerpos monoclonales (AcMo) dirigidos contra antlgenos del SNC normal estimulan la remielinizacion del SNC tras desmielinizacion inducida por TMEV (Miller y col., 1994; Asakura y col., 1998). Tambien se demostro que el anticuerpo prototlpico, denominado SCH94.03, potenciaba la tasa de remielinizacion espontanea del SNC tras desmielinizacion inducida con lisolecitina (Pavelko, y col., 1998) y disminucion de la gravedad y la frecuencia de las recaldas en un modelo de recalda de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE). Las caracterlsticas frecuentes de estos AcMo IgM que estimulan la remielinizacion son que reaccionan a antlgenos de superficie sobre los oligodendrocitos y tienen caracterlsticas fenotlpicas y genotlpicas de los autoanticuerpos naturales (Miller y Rodriguez, 1995; Asakura y col., 1998). Los autoanticuerpos naturals tienen un amplio espectro de reactividades con antlgenos propios y no propios. Estos anticuerpos representan una fraccion principal del repertorio de IgM circulantes normales. Aunqe su function fisiologica se desconoce, los efectos beneficiosos de los autoanticuerpos naturals se han comunicado en varios modelos de enfermedades autoinmunitarias, incluidas miastenia gravis, lupus eritematoso sistemico y diabetes no obesa (Sundblad y col., 1989; Hentati y col., 1994; Andersson y col., 1991, 1994).

La IVIg se purifica a partir de grupos de plasma humano de 3.000 a 10.000 donantes sanos y contiene mas del 95% de IgG y cantidades insignificantes de IgM (Dalakas, 1997). En base a las observaciones previas de los inventores, estos postularon la hipotesis de que la IgM humana de donantes sanos, que esta enriquecida en autoanticuerpos naturales, serua un tratamiento mas eficaz para la enfermedad desmielinizante que la IVIg convencional. Para analizar esta hipotesis,, los inventores tratarin cronicamente a los ratones infectados por TMEV con IgM humnana combinada obtenida de mas de 2.500 donantes sanos y se analizo la remielinizacion del SNC.

En este studio, los inventores demostraron que el tratamiento con IgM humnana combinada de donantes sanos tuvo como resultado una remielinizacion significativamente potenciada por los oligodendrocitos en ratones infectados por TMEV en comparacion con el tratamiento con IgG humana combinada o PBS. Los inventors confirmaron mediante ELISA e inmunohistoqulmica que la IgM humnana combinada contiene una poblacion de autoanticuerpos naturales polirreactivos a protelnas y haptenos. Esta es la primera demostracion de que la IgM policlonal humana estimula la remielinizacion del SNC en modelos de enfermedad desmielinizante, lo que plantea la posibilidad de que la IgM de donantes sanos puede ser mas eficaz para tratar enfermedades desmielinizantes inflamatorias humanas que la IgG humana combinada convencional.

Que se sepa, la IgM humana combinada nunca se ha analizado en la EM, aunque se ha demostrado que es segura y eficaz en las infecciones graves e inmunodeiciencia.

Los autoanticuerpos naturales son una fraccion principal del repertorio de IgM. En autoanticuerpos naturales de ratones son, exclusivamente IgM, mientras que en autoanticuerpos naturales de seres humanos son tambien de los isotipos de IgG aunque con mucho menos frecuencia. Hasta la fecha, los unicos AcMo que se ha demostrado que potencian la remielinizacion han sido IgM reactiva frente a oligodendrocitos (AcMo), que tienen caracterlsticas genotlpicas y fenotlpicas de autoanticuerpos naturales (Asakura y col. 1998).

En conclusion, los inventores han demostrado que una tecnica de detection selectiva logica se puede usar para identificar anticuerpos monoclonales humanos que tienen el potencial de estimular la remielinizacion en sistemas modelos de desmielinizacion. Las propiedades del anticuerpo, tal como la especificidad del SNC, la capacidad de reconocer los antlgenos presentes en los oligodendrocitos y una fuerte union al homogeneizado de medula espinal, combinados, se puede predecir que anticuerpos son los mejores candidatos para analizar la remielinizacion in vivo. Muchos de estos anticuerpos monoclonales se unen bien al SNC humana, lo que proporciona un motivo para esperar que algunos pueden ser utiles como terapia para tratar con exito la enfermedad humana.

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A continuacion se presenta una lista alfabetica de las referencias citadas en este Ejemplo.

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Ejemplo 2

DETECCION SELECTIVA DE PEPTIDOS MIMETICOS DE EPITOPO CON UN AUTOANTICUERPO

En este ejemplo se describe la identificacion y preparacion de peptidos que imitan los antlgenos reconocidos, o porciones de los mismos, correspondientes a los autoanticuerpos de la invencion. Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, dichos peptidos pudieron servir como vacunas para producir una respuesta inmunitaria potenciada a las afecciones indicadas que responde de forma favorable a mayores niveles circulantes de anticuerpos.

Un ejemplo de estrategia para la identificacion de mimeticos peptldicos serla buscar peptidos que se unen especlficamente a, por ejemplo, el anticuerpo HNK-1, un autoanticuerpo de raton demostro que podia inducir demielinizacion. El antlgeno del epltopo de HNK-1 es un hidrato de carbono. El epltopo de HNK-1 se expresa principalmente en los glicollpidos y las glicoprotelnas del tejido nervioso (McGarry y col., (1983) Nature 306:376378; Ilyas y col., (1984) Biochem. Biophys. Res. Comm. 122:1206-1211; Kruse y col., (1984) Nature 311:153-155; 35 Yuen y col., (1997) J. Biol. Chem. 272:8924-8931). La estructura que reacciona con el anticuerpo HNK-1 fue descrita por primera vez por Chou y Jungalwala para el glicollpiod antigenico mayoritario presente en los nervos perifericos humanos. La composicion, enlace del azucar, confuiguracion y posicion del grupo sulfato se caracterizaron como sulfato-3 GlcAU (1-3) GalU (1-4) GlcNAcU (1-3) GalNAcU (1-3) GalU (1-4) GlcU(1-1)-ceramida para SGGL-1 y como sulfato-3 GlcAU (1-3) GalU (1-4) GlcNAcU (1-3) GalU (1-4) GlcNAcU (1-3) GalU (1-4) GlcU (1-1)-ceramida para SGGL-2. (Chou y col., 1986).

La deteccion selectiva en bibliotecas de peptidos aleatorios expresados en fagos ofrece una fuente rica de diversida molecular y representa un potente medio de identificar ligandos peptldicos que se unen a una molecula

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receptora de interes. Los fagos que expresan peptidos de union se seleccionan mediante purificacion por afinidad con la diana de interes. Este sistema permite un gran numero de fagos que se van a someter a deteccion selectiva a la vez. Dado que cada fago infeccioso codifica una secuencia aleatoria expresada sobre su superficie, un fago concreto, cuando se recupera de una matriz de afinidad, se puede amplificar mediante otro ciclo de infeccion. Por tanto, las moleculas selectoras inmovilizadas sobre un soporte solido se pueden usar para seleccionar los peptidos que se unen a ellas. Este procedimeinto revela un numero de peptidos que se unen al selector y que a menudo muestran una secuencia de aminoacidos consenso habitual. La amplificacion biologica de miembros seleccionados de la biblioteca y la secuenciacion permite la determination de la estructura primaria del(los) peptido(s).

El ligando peptldico identificado mediante expression en fagos con frecuencia interaccionan con sitio(s) de union natural sobre la molecula diana y a menudo se asemejan al (los) ligando(s) natural(es) de la diana. Aunque este sistema a menudo se ha usado para identificar epltopos peptldicos reconocidos por los anticuerpos, tambien se ha usado con exito para encontrar imitadores peptldicos de las moleculas de hidrato de carbono. El trabajo dirigido hacia el uso de imitadores peptldicos en lugar de antlgenos de hidratos de carbono ha sido revisado por Kieber- Emmons et al, 1998). La capacidad demostrada de un peptido para imitar un determinante de hidrato de c arbono indica que, aumque la imitation se consigue usando aminoacidos en lugar de azucares, se puede reproducir el patron de especificidad.

Se realizo una primera deteccion selectiva con la biblioteca de partida amplificada de peptidos de 15 unidades. Se encontraron varios clones positivos en la union al anticuerpo HNK-1. En la deteccion selective inicial con HNK-1, los fagos unidos se eluyeron mediante desplazamiento de pH, de modo que no hubo diferenciacion entre el fago unido especlficamente y no especlficamente. Por tanto, se realizo una deteccion selectiva en la que el anticuerpo HBK-1 se biotinila con un agente de acoplamiento que incorpora un puente disulfuro. El anticuerpo biotinilado se reacciona previamente con el tubo revestido con estreptavidina, se elimina el anticuerpo no unido mediante lavado y el inmunotubo se usa para la deteccion selectiva. Como alternative, los fagos reaccionan con el anticuerpo biotinilado en solution y, despues, el complejo biotinilado se deja reaccionar con un inmunotubo revestido con estreptavidina. En cualquier caso, despues de eliminar el fago no unido mediante lavado, el fago unido se eluye mediante la adicion de diiotreitol, que libera el anticuerpo y el fago unido (Griffiths y col, 1994). Ademas, estas detecciones selectivas se realizaron en presencia de suero de raton (12,5 %). Esto proporciona un gran exceso de IgM de raton sobre el anticuerpo HNK-1, de modo quese deberla suprimir la union no especlfica al anticuerpo HNK- 1.

En algunos casos, cuando el fago en solucion se dejo reaccionar con anticuerpo “pre-inmovilizado” se obtuvo un incremento del numero de fagos unidos tras la tercera o la cuarta ronda de selection. Los clones analizados se unieron tambien a la IgM de raton total. En un experimento final, varios procedimientos se compararon en paralelo. Se dejo que los fagos se unieran al inmunotubo revestido con HNK-1 o a HNK-1 biotinilado en solucion y en presencia o ausencia de suero de raton. Se observo un enriquecimiento usando el anticuerpo pre-revesitod, pero los clones seleccionados s eunieron, de nuevo, a IgM de raton total, aunque tambien se unieron a HNK-1. Es interesenta destacar que el fago seleccionado tambien fue reactivo al anticuerpo L2-412, que reconoce el mismo hidrato de carbono que HNK-1, aunque HNK-1, requiere un grupo sulfato terminal, mientras que el anticuerpo L2- 412 reconoce el hidrato de carbono con o sin un grupo sulfato.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Materiales

Se puede usar una biblioteca de peptidos de 15 unidades y celulas E.coli K91 Kan. La biblioteca de 15 unidades se construyo en el vector fUSE5, un derivado del fago filamentoso fd-tet (Scott y col., 1990). Este vector porta un gen de resistencia a tetraciclina para permitir la seleccion. Los fagos filamentosos no matan a sus huespedes; por tanto, las celulas infectadas se convierten en resistentes a tetraciclina, siguen creciedo y secretan partlculas progenie. La cepa K91Kan de E.coli es un derivado de lambfa de K38 (Lyons et al, 1972), tiene un genotipo cromosomico thi y porta un gen de resistencia a kanamicina (mkh) (Smith y col., 1993; Yu y col., 1996). Los peptidos y el peptido (10 mg) acoplado a BSA activada con SPDP (60 mg) mediante una cistelna en C-terminal se puede obtener de, por ejemplo, ANAWA AG, 8602 Wangen, Suiza. La tetraciclina y la kanamicina se pueden adquirir en Sigma. B. Becker purifico en el laboratorio de los inventores los glicollpidos L2/HNK-1 de la cola de caballo de vaca. Los azucares sulfatados, SO3 -Glc-AGal-alilo, fueron proporcionados amablemente por el N. Nifant'ev, Zelinsky Institutre of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscu.

Anticuerpos

La caracterizacion y purificacion del anticuerpo monoclonal (AcMo L2-412) producido en ratas y que reconoce el hidrato de carbono HNK-1 han sido descritos por Noronha, A. y col., Brain Res. 385, 237-244 (1986)). El anticuerpo L2-412 se ha depositado en el DSMZ - Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, segun los terminos del Tratado de Budapest, y se le ha dado

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el nombre de anticuerpo HNK-1 y esta disponible como TIB200 en la American Type Culture Collection (ATCC). La IgG policlonal de rata y HRP-estreptavidina se obtuvieron en Sigma (EE.UU.). El anticuerpo policlonal anti-M13/HRP se adquirio en Pharmacia Biotech. El anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano (HRP dirigido contra IgG de rata se obtuvo de Jackson Immunoresearch.

Amplification de la biblioteca de partida

La biblioteca primaria que codifica los peptidos de 15 unidades se amplifico en base al procedimiento de Smith (Smith y col, 1992) del siguiente modo:

La noche antes de necesitar las celulas, se inocularon 2 ml de medio LB (L Bacto-Triptona, 5 g/l de NACl, 5 g/l de extracto de levadura), que contiene 100 Qg/ml de kanamicina, con celulas K91Kan y se agitaron durante la noche a 37 °C. Se preparo un matraz de 1 l que contiene 100 ml de caldo Terrific (12 g de Bacto-Triptona, 24 g de extracto de levadura, 5,04 g de glicerol (4 ml) se anadieron a 900 ml de agua y se sometieron a autoclave en porciones de 90 ml; a cada portion de 90 ml se anadieron antes de usar 10 ml de tampon de fosfato potasico (KH2 PO4 0,17M, KH2 PO4 0,72M, no se requiere ajuste de pH).

En 100 ml de caldo Terrific se inoculo 1 ml del cultivo durante la noche de celulas K91kan y se agito energicamente hasta que la DO600 de una dilution a 1:10 alcanzo 0,2. Despues, la agitation se ralentico durante 10 minutos para permitie la regeneration F-pili y al matraz se anadieron 10 Ql de la biblioteca de partida; la agitacion lenta continuo para permitir la adsorcion. Despues, el cultivo se transfirio a 1 l de LB que contiene 0,22 pg/ml de tetraciclina y se dejo agitar energicamente durante 35 minutos a 37 °C. La concentration de tetraciclina se ahisto a 20 pg/ml y se tomo un allcuota para determinar el tltulo. Los fagos se titularon (tltulo recuperado) sembrando las celulas infectadas sobre el medio de tetraciclina y contando el numero de colonias resistentes a tetraciclina. Una unidad infecciosa definida de este modo se denomina unidad transformante (UT) y la infectividad es la proportion del numero de UT a un numero de partlculas flsicas. Normalmente se elimino un allcuota de 50 pl del cultivo y se diluyo con LB que contiene 0,2 pg/ml de tetraciclina (intervalo de dilucion fue 103-105). Una allcuota de 200 pl de cada dilucion se extendio sobre una palca de agar que contenla 40 pg/ml de tetraciclina y 100 pg/ml de kanamicina, se incubo durante la noche a 37 °C. Las colonias se contaron al dla siguiente. En esta etapa, el tltulo de colonias resistentes a tetraciclina debera ser de aproximadamente 107/ml. El resto del cultivo se agito energicamente durante la noche.

A la siguiente manana, el sobrenadante diblemente aclarado obtenido tras 2 etapas de centrifugation (4.000 x g, 10 min, 4 °C y 10.500 x g, GSA, 10 min, 4 °C) se precipito durante la noche a 4 °C anadiendo 0,15 volumenes de solution de PEG/NaCl (polietilenglicol al 16,7 % en solution de NaCl 3,3M). Los fagos precipitados recogidos tras la centrifugacion (10,500 x g, GSA, 40 min, 4 °C) se disolvieron en 10 ml de TBS (Tris-HCl 50 mM, pH7,5, NaCl 150 mM) y se realizo una segunda precipitation anadiendo ,15 volumenes de solucion de PEG/NaCl a la suspension de fagos e incubando durante 1 hora en hielo. En esta etapa deberla se revidente un precipitado pesado.

El sedimento obtenido tras la centrifugacion (14.500 x g, SA600, 10 min, 4 °C) se volvio a disolver en 10 ml de TBS y se transfirio a un vaso Tadeo con 4,83 g de CsCl. El vaso se volvio a tarar y se anadio TBS a un peso neto de 10,75 g. Esto deberla dar 12 ml de una solucion al 31 % w/v de CsCl (densidad 1,30 g/ml); la solucion se centrifugo 48 horas a 150.000 x g a 5 °C en un rotor SW41 (Beckman). Con la ayuda de una fuente de luz visible fuerte se pudo ver una banda no floculenta de color azulado claro (que contiene los fagos amplificados) sobre una banda estrecha blanca opaca floculenta (que probablemente deriva de PEG). La banda del fago se recogio aspirando primero lentamente el fluido sobre la banda del fago y, despues, usando una pipeta, la banda del fago se retiro evitando lo mas posible la banda floculenta debajo. Despues, la banda del fago se libero a un frasco de centrlfiuga de policarbonato, que se cargo hasta el cuello con TBS y se centrifugo en un rotor Ti70 (279'000 x g, 4h, 5°C) y se resuspendio en 2 ml de TBS por 1 l de cultivo. Los fagos se pueden almacenar de forma estable en esta forma en un refrigerador.

Despues, la biblioteca amplificada se titulo (tltulo final) del siguiente modo: Se prepararon varias diluciones del fago en TBS/gelatina (0,1 g de gelatina en 100 ml de TBS) que cubren el intervalo de dilucion de 107 a 1010. A continuation, se usaron 10 pl de cada una de estas diluciones para infectar 10 pl de celulas K91kan preparadas como se ha descrito al principio de esta section y cada mezcla de dilucion se incubo 15 minutos a temperatura ambiente (TA) para dejar que el fago infecte las celulas concentradas. Se anadio un ml de LB que contiene 0,2 pg/ml de tetraciclona y se incubo durante 30 minutos a 37 °C en un agitador-incubador. Despues, las celulas infectadas se extendieron (200 pl) sobre una placa de agar que contiene 40 pg/ml de tetraciclina y 100 pg/ml de kanamicina como se ha descrito anteriormente (tltulo recuperado).

Procedimiento de detection selectiva

A. Union directa

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La biblioteca de fagos se barrio usando inmunotubos ((Nunc., Maxisorb) revestidos con mAbL2-412. Los tubos se revistieron incubando durante la noche a 4 °C con el anticuerpo L2-412 A 10 pg/ml de protelna en PBS (1 ml de volumen total) para la primera ronda y 1 pg/ml para la segunda y tercera ronda de deteccion selectiva. Despues de bloquear 2 horas con Blotto (5 % de leche seca sin grasa, 0,05 % (v/v) Tween 20 en PBS) A 4 °c. 1011 unidades transformantes (en un volumen de 250 pl) de la bilioteca de fagos por inmunotubo se jaron unir 1 hora a 37 °C en una camara rotatoria. Para las rondas segunda y tercera, los facgos se preincubaron 1 hora con 100 pg/ml de IgG de rata antes de anadirlos al inmunotubo, con el fin de disminuir el numero de aglutinantes no especlficos. Despues de la recuperacion de los fagos no unidos (de los que se eligio el fago control negativo), los tubos se lavaron 10 veces con PBS-0,05% (v/v) Tween 20 y eluyeron con glicina 0,1M a pH 2,2 (0,5-1 ml de volumen total), 1° in a 4 °C. Los fagos eluidos se neutralizaron con Tris 1,5M a pH 9 y despues se usaron para infectar 0,5-1 ml de celulas E. coli K91 Kan en fase log 15 minutos a temperatura ambiente. Las bacterias infectadas se transfirieron a 20 ml de LB que contiene 0,2 pg/ml de tetraciclina y, despues de extraer un allcuota para la determinacion del tltulo (tltulo recuperado), se dejaron crecer durante la noche como se ha descrito en la seccion anterior. Despues, el eluado amplificado se centrifugo dos veces (10 min, 3660 x g, 10 min, 14.500 x g, SA600) y el sobrenadante final se precipito con 0,15 volumenes de PEG/NaCl durante la noche a 4 °C. El fago se sedimento (15 min, 14,500 x g, SA600) y se disolvio en 1 ml de PBS pipeteando y agitando en vortex, se microcentrifugo 1 minuto para sedimentar la materia insoluble y se precipito en PEG de nuevo durante al menos 1 hora a 4 °C. En esta etapa se deberla ver un precipitado pesado. El sedimento obtenido tras 10 minutos, la microcentrifugacion se disolvio por ultimo en 200 pl de PBS que contienen 0,02 % de azida. Este eluato amplificado se puede almacenar y guardar a 4 °C. La biblioteca se sometio a tres rondas de amplificacion y selection.

El mismo procedimiento se uso para la deteccion selectiva de HNK-1 con el anticuerpo HNK-1, a exception de que se incluyo un exceso de 100 veces de la IgM de raton para disminuir la union inespeclfica.

Los fagos se titularon (tltulo final) como se ha descrito. Las colonias se contaron al dla siguiente y el rendimiento de la deteccion selectiva se calculo dividiendo el tltulo recuperado por el tltulo (entrante) de la ronda anterior.

B. Deteccion selectiva con anticuerpo biotinilado

Para realizar esta deteccion selectiva se usaron dos procedimientos, ambos siguiendo los protocolos de G. Smith (protocolos no publicados). El anticuerpo HNK-1 se biotinilo como se describe mas adelante usando NHS-SS- biotina. NHS-SS-biotina une la biotina a la protelna a traves de un puente disulfuro, con el fin de dejar que el grupo de biotina se elimine despues mediante incubation con ditiotreitol (DTT). El anticuerpo L2-412 se biotinilo de forma similar como se describe mas adelante. En el procedimiento A, primero se deja que el anticuerpo biotinilado se una al inmunotubo revestido con estreptavidina, que despues se usa para barrer el fago entrante. En el procedimiento B, el anticuerpo biotinilado se preincubac on el fago en solution y la mezcla de reaction se deja unir (unos pocos minutos) al inmunotubo revestido con estreptavidina.

En el procedimiento A, los inmunotubos se revistieron con 10 Qg/ml de estreptavidina en PBS, 1 ml de volumen total (se humidifico la totalidad de la superficie del tubo), durante la noche a 4 °C en un rotador. Se descarto la estreptavidina y el tubo se cargo con solucion de bloqueo, PBS que contiene 0,5 % de BSA (p/v), durante 2 horas a 4 °C. Despues de lavar 6 veces con PBS-0,05 % (v/v) de Tween 20 (PBST), se anadio el anticuerpo biotinilado. Normalmente, se anadieron 3 Qg del HNK-1 biotinilado o 5 pg del anticuerpo L2-412 biotinilado en 400 pl de la solucion de bloqueo. Se dejo que el anticuerpo se uniera durante al menos 2 horas (o durante la noche) a 4 °C en el rotador. Despues de lavar 6 veces con PBS-T, 1010 fagos de la biblioteca de partida de 15 unidades, en 400 pl de solucion de bloqueo se dejaron unir al correspondiente inmunotubo revestido con anticuerpo durante 4 horas a 4 °C en el rotador. En el procedimiento B, durante el revestimiento de los inmunotubos, 1010 fagos se preincubaron durante la noche con 3 o 5 pg de HNK1 o L2-412 biotinilado, respectivamente. Despues, se dejo que el anticuerpo biotinilado se uniera al inmunotubo revestido durante 10 minutos a 4 °C en el rotador. En ambos procedimientos los tubos se lavaron 10 veces, despues se eluyeron los complejos fago-anticuerpo con DTT 20 Mm (0,5 ml de volumen) en PBS 1-5 minutos, a temperatura ambiente. La amplificacion y la titulacion se realizaron como se ha descrito en lo que antecede. La biblioteca se sometio a cuatro rondas de amplificacion y seleccion.

Deteccion selectiva con ELISA

A. Union directa para la deteccion de clones positivos

Colonias individuales resistentes a tetraciclina y kanamicina se cultivaron en LB con 20 Qg/ml de tetraciclina en placas de 96 pocillos (Nunc) durante la noche a 37 °C (300 pl/pocillo), despues se centrifugaron 10 minutos a 3000 rpm en centrlfuga de Jouan y el sobrenadante (100 pl) se incubo durante 2 horas en otra placa de 96 pocillos previamente revestida con mAbL2 -412 (100 pl, pg/ml durante la noiche a 4 °C) y se bloqueo mediante incubacion durante 2 horas con PBS-0,5 % (p/v) de BSA. Despues de lavar 5 veces, la union de los fagos se detecto mediante incubacion con anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP ((Pharmacia, Biotech.) durante 1 hora a una dilution de 1:2000. La reacion de la peroxidasa se inicio mediante la adicion de 100 Ql de desarrollador que contiene 0,01 % de

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peroxido de hidrogeno y 0,1 % (p/v) de acido zino-bis(3-etilbentiazolin-6-sulf6nico)-sal diamonio (ABTS, Boehringer Mannheim) en tampon HRP (acetato sodico 0,1m, NaH2 PO4 , 0,05M, Ph ajustado a 4,2 con acido acetico). La absorbancia del producto de reaccion coloreado se determino a 405 nm en un Multiscan TitertekPlus (Flow, Suiza). En paralelo, cada clon se analizo tambien en placas de 96 pocillos revestidas con IgG de rata (100 pl, 1 pg/ml en PBS y se bloquearon de forma identica durante 2 horas). Las bacterias productotas de los clones d eunion seleccionados (es decir, los fagos positivos), que eran ligantes positivos para el mAbL2-412 pero que no s eunlan a la IgG de rata se sembraron en placas con agar que contenlan medio LB con 40 pg/ml de tetraciclina y 100 pg/ml de kanamicina. Se escogieron dos colonias individuales y se volvioa analizar la positividad hacia el mAb L2-412. Las colonias positivas unicas se almacenaron en 40 % de glicerol a -80 °C.

B. Union competitiva

Las placas de microtitulacion (Nunc) se revistieron con los glicollpidos L2/HNK-1 (50 pl, 1 pg/ml, disueltos en EtOH) y se dejaron secar durante la noche. Bloquenado los pocillos durante 2 horas con 0,5 % (p/v) de BSA sin acdos grasos en PBS, una concentration limitante de L2-412, previamente determinada, se preincubo con diluciones por 2 sucesivas del inhibidor, comenzando a una concentracion de 2,2 mM para el peptido libre, 5 mM para el azucar SO3 1012 fagos positivos y negativos (los fagos negativos se clonaron a partir de la fraction no unida de la primera ronda de detection selectiva). Despues, la mezcla preincubada se anadio al pocillo en 100 pl y se incubo durante 1 hora a TA. Despues d elavar 5 veces con PBS-0,05 % (V/V) de Tween 20, la union del AcMo L2-412 se detecto mediante incubation con IgG anti-rata de cabra conjugada con HRP durante 1 hora, seguido de la reaccion de color descrita anteriormente. El porcentaje de inhibition de la union del AcMo L2-412 al sustrato en presencia del inhibidor se calculo con referencia al valor control obtenido en ausencia de inhibidor (0 % de inhibicion).

C. Inhibicion de la union

Las placas de microtitulacion se revistieron durante la noche a 4 °C con laminina (Gibco/BRL), (10 pg/ml, 100 pl), o mAbL2-412 (1 pg/ml, 100 pl) en PBS. Todas las etapas de reaccion posteriores se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Dspues de bloquear con PBS + 0,5 % (P/V) de BSA, se anadieron 50 pl de diluciones por 2 sucesivas del peptido acoplado a BSA ((ANAWA Ag, Suiza) comenzanco a una concentracion de 30 pM durante 1-2 horas a TA. Despues se anadio un numero limitante de fagos portadores del peptido de interes, previamente determinado, y se incubo durnate otra hora. Los fagos unidos se detectaron con el anticuerpo antiM13/HRP como se ha descrito en la section de deteccion selectiva con ELISA. El experimento analogo se realizo con L2-412 inmovilizada en lugar de laminina, el peptido acoplado a BSA que compite con la union de los fagos positivos al anticuerpo L2-412.

D. Union dircta a laminina

Las placas de microtitulacion se con 100 pl del AcMo L2-412 o con laminita, como se ha descrito anteriormente, y se anadieron 100 pl del peptido biotinilado acoplado a BSA comenzando a una concentracion de 30 pM, se incubaron 2 horas a temperatura ambiente y se detectaron con HRP-estreptavidina.

Secuenciacion de ADN

Los clones positivos, escogidos de las reservas congeladas en glicerol, se cultivaron durante la noche a 37 °C en medio LB que contiene 20 Qg/ml de tetraciclina. El ADN monocatenario se purifico como describe G. Smith (1992) usando el procedimiento de doble giro, se secuencio con el kit de secuenciacion de ciclos Thermo Sequenase (Amersham y se cargo sobre un secuenciador automatico (B10 Genetic Analyzer, Applied Biosystems Inc.).

Biotinilacion

La biotinilacion del anticuerpo HNK-1, BSA y el peptido acoplado a BSA se realizo usando Sulfo-NHS- biotina (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se uso una proportion molar de 10 a 1 para el anticuerpo y de 5 a 1 para BSA o los peptidos acoplados a BSA. El producto biotinilado se dializo durante la noche contra PBS a 4 °C.

Experimentos de sobrecrecimiento de neuritas y cultivo Preparation de neuronas motoras

Los cubreobjetos se esterilizaron cociendolos durante la noche a 160 °C y se revistieron mediante una incubacion durante la noche con poliornitina (Sigma, 1,5 pg/ml en aguua) a 4°C. Despues, los cubreobjetos se lavaron 3 veces con agua y despues se revistieron con sustancias de ensayo del siguiente modo: 1) los conjugados BSA-peptido se disolvieron a 100 Qg/ml en PBS, se sonicaron 1 minuto con un sonicador de sobremesa y se centrifugaron en una microfuga durante 20 minutos a velocidad maxima. La concentracion proteica del sobrenadante se determino cada vez con el metodo de Bradford (Bradford y col., 1976). Despues, 120 pl del

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complejo se mezclaron con 280 pi de solucion de colageno (20 pg/ml de colageno en PBS) y se aplicaron 100 pi sobre cada cubreobjetos durante la noche a 4 °C; 2). Como control negativo, el BSA sin tratar se uso en lugar del complejo peptido-BSA; 3) los glicollpidos portadores del hidrato de carbono L2/HNK-1 se disolvieron en etanol a una concentracion de 10 pg/ml y a 1 ml de la solucion de colageno descrita anteriormente se anadieron 80 pl. Para el revestimiento se uso un volumen de 100 pl. Los cubreobjetos se colocaron por cuadruplicado en una placa de 24 pocillos (NUNC) y, por ultimo, se lavaron 3 veces antes de sembrar las celulas en placas (los cubreobjetos nunca se dejaron secar).

Las celulas neuronales motoras se prepararon como describen Arakawa (1990) a partir de medula espinal de embriones de pollo de 6 dlas de edad disociados en 1 ml de solucion helada que contiene 0,05 % de ADNasa 1 (Sigma), 0,1 % de BSA en medio L-15 (Life Technologies). Las celulas se colocaron en capas sobre 2 ml de metrizamida 6,8 % (Fluka) en L-15 y se centrifugaron 15 minutos a 500 x g, 4 °C. Las celulas recogidas de la interfaz metrizamida/medio se diluyeron en 5 ml de L-15 y se cargaron sobre una almohada de 4 ml de BSA (4 % de BSA en IL-15) y se centrifugaron 10 minutos a 300 x g a 4 °C. El sedimento se resuspendio en 0,5-1 ml de medio completo (NaHCO3 22 mM, glucosa 22 mM, 1 % de penicilina y estreptomicina (Gibco) en L-15 suplementado con suplemento de 1 % de N2 (Gibco) y 15 pg/ml de extracto muscular de pollo (3,5 mg/ml). 30.000 celulas se sembraron en placas sobre cubreobjetos revestidas con poliornitina/colageno en presencia o ausencia del peptido acoplado a BSA y se incubaron en una camara humidificada a 37 °C y 5 % de CO2 . La longitud y el numero de neuritas se midieron y se contaron las neuronas aisladas que no estaban en contacto con otras celulas y con al menos un proceso tan largo como el diametro del cuerpo celular tras 24 horas de cultivo.

Preparacion y cultivo de neuronas ganglionares de la raiz dorsal

Los cubreobjetos se prepararon de forma identica que para los experimentos con neuronas motoras. Las neuronas ganglionares de la ralz dorsal se aislaron de huevos de pollo de 11 dlas embrionario. Los ganglios se transfirieron en 1 ml de solucion de digestion (0,05 % de tripsina, 0,01 % de ADNasa 1 en medio HBSS) y se incubaron 15 minutos a 37 °C con resuspension cada 2-5 minutos. Los ganglios se disociaron despues en 1 ml de solucion de disociacion helada (0,05 % de ADNasa 1, 0,1 % de BSA en medio L15), se cargaron en 3 ml de una almohada de 4% de BSA en un tubo Falcon de 15 ml y se centrifugaron a 4 °C, 600 x g durante 20 minutos. Las celulas se resuspendieron en 0,5 ml del medio completo descrito en la seccion anterior. 20.000 celulas se anadieron a los pocillos que contienen un cubreobjetos y se dejaron crecer durante 18 horas en una camara humidificada a 37 °C y 5% de CO2 , la fijacion y el analisis del sobrecrecimiento de neuritas se realizo como se ha descrito en la seccion precedente.

Inmunohistologia e inmunocitologia

Inmunohistologia

Se usaron criosecciones de nervio femoral de un raton de 4 meses para buscar la union del complejo peptido-BSA. Las secciones se trataron durante 1 h con 1% de H2 O2 , 0,5 % de seroalbumina bovina (BSA) y 10 % de suero de cabra en PBS con el fin de reducir la actividad de peroxidasa endogena. Despues, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con complejo peptido-BSA o BSA (1 mg/ml en PBS, 150 Ql/cubreobjetos) y despues se lavaron 4 veces con PBS-0,01 % de Tween 20. Para la deteccion, se anadio anticuerpo anti-BSA (Sigma, dilucion 1:16, 150 pl/cubreobjetos) y se incubo durante la noche a 4 °C. S anadio suero anti-conejo de cabra acoplado a HRP (1:2000) durante 1 hora en un volumen de 150 pl por cubreobjetos. La reaccion de color se desarrollo usando una dilucion al 5 % de una solucion madre de 4 mg/ml de 9-amino-3-etilcarbazol (AEC, Fluka) en N,N'- dimetilformamida en tampon acetato sodico 0,1M, pH 4,8, que contiene 0,1 % de H2O2 . Para el control positivo se uso el anticuerpo L2-412 y el anticuerpo anti-rata de cabra acoplado a HRP. Se realizo un experimento similar usando el conjugado BSA-peptido biotinilado. Se uso una concentracion de 50 pg/ml para la incubacion durante la noche y se anadio estreptavidina acoplada a HRP (1:2000) durante 1 hora. La reaccion de color se desarrollo como se ha descrito en lo que antecede.

Inmunocitologia

Los cubreobjetos se revistieron con poliornitina (1,5 Qg/ml), despues con colageno (20 Qg/ml) y 40.000 celulas se dejaron cultivar durante 40 horas a 37 °C en CO2 al 5 % como se ha descrito anteriormente. Los cubreobjetos fijos se bloquearon despues en 5 % de polvo de leche seca sin grasa en PBS durante 2 horas. Despues de un extenso lavado con PBS-0,05 % de Tween-20, se anadio el conjugado BSA-peptido biotinilado a una concentracion de 50 pg/ml durante 4 horas. Despues de otras seis etapas de lavado, la deteccion se realizo usando estreptavidina acoplada a HRP, 1:500, durante 1 hora. La deteccion del color fue como se ha descrito anteriormente para la inmunohistologia. Las neuronas fijadas se fotografiaron a un aumento de 40 X. Las imagenes presentadas se procesaron para la rendicion potenciada del color usando Adobe Photoshop.

A continuacion se presenta una lista alfabetica de las referencias citadas en este Ejemplo.

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Chou, D., y Jungalwala, F. J. Biol. Chem. 268, 21727-21733 (1993). Chou, D.K., y col., J. Biol. Chem. 261, 11717-25 (1986).

Griffiths, A. y col. (1994) EMBO J. 13:3245-3260.

Kieber-Emmons, T. Immunologic Research 17, 95-108 (1998). Lyons, L. y Zinder, N. (1972) Virology 49:45-60.

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Smith G.P. y Smith, J.K. (1993) Methods Enzymol. 217:228-257.

Yu, J. and Smith, G. (1996) Methods Enzymol. 267:3-27.

EJEMPLO 3

ANTICUERPOS _ MONOCLONALES HUMANOS REACTIVOS A OLIGODENDROCITOS ESTIMULAN LA REMIELINIZACION EN UN MODELO DE ESCLEROSIS MULTIPLE

La estimulacion de la remielinizacion, un objetivo principal de un tratamiento eficaz para las enfermedades desmielinizantes, tiene el potencial de proteger los axones vulnerables, incrementar la velocidad de conduccion y mejorar los deficit neurologicos. Las estrategias para estimular la remielinizacion se han centrado en el transplante de oligodendrocitos (OL) o reclutar celulas mielinizantes endogenas con factores troficos. Las terapias basadas en inmunoglobulina (Ig) usadas de forma rutinaria para tratar diversas enfermedades neurologicas y autoinmunitarias, subraya nuestro enfoque para potenciar la remielinizacion. Los inventores han aislado dos anticuerpos monoclonales (AcMo) dirigidos contra antlgenos de superficie de OL que estimularon una remielinizacion significativa en un modelo mediado por virus de esclerosis multiple (EM). Cuatro AcMo humanos adicionales de union a OL no estimularon la remielinizacion. Los AcMo humanos fueron tan eficaces como la inmunoglobulina intravenosa humana (IVIC), un tratamiento que se ha demostrado que tiene eficacia en la EM, y se unieron a la superficie de los OL humanos, lo que sugiere un efecto directo de los AcMo sobre las celulas responsables de la mielinizacion. Como alternativa, dirigir los AcMo humanos a areas de patologla del sistema nervioso central (SNC) puede facilitar la opsonizacion de los residuos de mielina que permite que progrese la reparacion. Los AcMo humanos se aislaron de los sueros de individuos con una forma de gammapatla monoclonal. Estos individuos portan un nivel elevado de protelna monoclonal en sangre sin detrimento, que proporciona soporte a la creencia de que la administration de estos AcMo como terapia es segura. Los resultados de los inventores son 1) consistentes con la hipotesis de que los AcMo reactivos al SNC, parte del repertorio de Ig normal en seres humanos, pueden ayudar a reparar y proteger al SNC de lesiones inmunitarias patogenicas y 2) retar mas alla la premisa de que los Ac se unen a los OL son necesariamente patogenicos.

INTRODUCCION

La potenciacion de la remielinizacion y la protection de la lesion axonal son importantes objetivos terapeuticos en el tratamiento de trastornos inflamatorios desmielinizantes del SNC, tal como la EM. Se puede producir remielinizacion en las placas de EM, pero es limitada (1,2) incluso cuando haya progenitores de OL presentes en el adulto (3,4). Se han analizado una serie de estrategias terapeuticas para estimular la remielinizacion en animales experimentales. El transplante de OL (5) o sus progenitores (6) en tejido desmielinizado produce mielina nueva. Los progenitores de OL transplantados tambien pueden remielinizar las lesiones desmielinizadas en el SNC adulto (7) y migran hacia un area de dano cuando se colocan en las proximidades de la lesion (8). Sigue habiendo problemas sin resolver concernientes a la supervivencia de los progenitores de OL transplantados en el SNC intacto de adulto y su capacidad para dirigirlos a areas de patologla de la mielina (9). No obstante, si las lesiones del SNC se pueden abordar quirurgicamente y los axones siguen intactos, el transplante de celulas gliales puede ser una terapia viable para mejorar el rendimiento funcional (10).

La administracion in vitro de factores de crecimiento o troficos induce la expansion de los progenitores de OL (11, 12) o estimula los OL maduros para desdiferenciar y, posteriormente, reiniciar un programa de mielinizacion (13, 14). La administracion in vivo de factores troficos mediante fibroblastos sometidos a ingenierla genetica al SNC danado estimula la formation de brotes axonales y la proliferation de OL (15). Sigue habiendo obstaculos para la terapia con factor trofico in vivo, especlficamente en la determination de la concentration del factor local biologicamente relevante y el potencial de los papeles pleiotropicos de la mayorla de los factores troficos administrados a concentraciones altas.

Como alternativa, el laboratorio de los inventores propone reparar la patologla del SNC y potenciar la remielinizacion endogena usando Ig de union a SNC (16), generando una respuesta reparadora natural que ya puede regularse por incremento tras la desmielinizacion. La terapia con Ig puede adaptarse rapidamente y analizarse como tratamiento para la enfermedad desmielinizante humana (17,18). La premisa de nuestro enfoque es que las celulas capaces de remielinizacion y los factores necesarios para sostener su crecimiento y diferenciacion estan presentes en el SNC desmielinizado, pero su capacidad para producir la mielina es limitada. La heterogeneidad emergente de la patologla y la diseminacion de los OL en la poblacion de EM (19) sugiere que, en la practica, el tratamiento de la enfermedad desmielinizante humana puede requerir combinaciones de varios abordajes

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terapeuticos basados en requisitos individuales.

Los inventores han usado un modelo mediado por virus de desmielinizacion para desarrollar una terapia basada en Ig. Cuando el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) se inocula intracerebralmente en cepas susceptibles de ratones, el TMEV induce la desmielinizacion del SNC progresiva inmunomediada cllnica y patologicamente similar a la EM (20). La eficacia de las terapias en la EM humana es similar a la observada en el modelo de TMEV (21), lo que la convierte en una plataforma importante para el diseno de ensayos cllnicos. Un AcMo de raton contra el homogeneizado de la medula espinal, denominado SCH94.03, potencia la remielinizacion en el modelo de TMEV (22). SCH94.03 es un AcMo de IgMk de raton polirreactivo que se une a la superficie de los OL (23). SCH94.03 tambien potencia la tasa de remielinizacion espontanea del SNC tras la desmielinizacion inducida por lisolecitina (24) y disminuye la recalda en la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) (25). Los AcMo de IgMk de raton adicionales de union a OL, varios de los cuales son marcadores de rutina para el linaje de OL, tambien estimulan la remielinizacion del SNC (26).

Dado que los AcMo IgM de raton estimulan la remielinizacion, los inventores han postulado la hipotesis de que la IgM policlonal humana serla un tratamiento mas eficaz de enfermedad desmielinizante que la IVIg una terapia establecida para los trastornos mediados por el sistema inmunitario (27). El tratamiento de los ratones infectados cronicamente con TMEV con IgM policlonal humana dio como resultado la potenciacion de la remielinizacion en comparacion con la IVIg Tambien se identificaron dos AcMo IgM humanos, usando una estrategia independiente del antlgeno, que estimulan la remielinizacion hasta un grado equivalente o superior que la IgM policlonal humana. Los inventores sugieren que los AcMo que estimulan la remielinizacion pueden ser una terapia eficaz de aplicacion sencilla para enfermedades desmielinizantes humanas. Los AcMo humanos se pueden aplicar facilmente a ensayos cllnicos, se pueden producir sin agentes infecciosos y pueden aliviar la escasez nacional y los elevados costes de la IVIg. Un AcMo humano eficaz que estimula la remielinizacion tambien puede simplificar la investigation del mecanismo de accion de las terapias inmunomoduladoras.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Anticuerpos humanos y su aislamiento

La IgM humana normal purificada del plasma combinado de mas de 2500 donantes sanos se obtuvo de S. V. Kaveri (28). La pureza de IgM fue superior al 90 % confirmado mediante SDS-PAGE. La IgG humana combinada de donantes sanos denominada cllnicamente IVIg se adquirio en Miles Inc. (Elkhart, IN).

Las muestras de suero humano se obtuvieron de la cllnica de disproteinemia bajo la direction del Dr. Robert A. Kyle, Mayo Clinic, y se escogieron unicamente por la presencia de un pico clonal de Ig superior a 20 mg/ml. Los sueros procedieron de 102 pacientes con una amplia variedad de afecciones caracterizadas por picos de IgG o IgM monoclonales en suero, incluidas macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma multiple, linfoma, gammapatla monoclonal de significado no determinado. Los sueros se dializaron frente a agua, los precipitados recogidos mediante centrifugation (14.000 rpm/30 minutos) y se disolvieron en PBS. Las soluciones se centrifugaron y se sometieron a cromatografla en columna de Superosa-6 (Pharmacia, Upsalla, Suecia). Las fracciones de IgM se combinaron y analizaron mediante SDS-PAGE. Las concentraciones se determinaron mediante tincion en gel con densitometrla Sypro Orange (Molecular Probes, Eugene, OR). Las soluciones de IgM se esterilizaron mediante filtracion a la crioconservaron.

Cultivo de celulas OL e inmunocitoauimica

Se prepararon hemisferios cerebrales de ratas Sprague-Dawley Holtzman P0-P2 para cultivos mixtos de celulas gliales primarias como se ha descrito (29) y se cultivaron durante 9 dlas in vitro. Los progenitores de OL de rata se aislaron como se ha descrito (30). Los OL humanos adultos se prepararon a partir de biopsias del lobulo temporal obtenidas de pacientes sometidos a resection terapeutica por epilepsia intratable. El tejido no contenla el foco epileptico y tenia una citoarquitectura normal cuando se analizo por el Departamento de Patologia Quirurgica. Las celulas gliales adultas aisladas como se ha descrito (31) y se sembraron en cubreobjetos de multiples pocillos de plastico (Becton Dickenson) revestido con poliornitina (Sigma) y laminina (Life Technologies) o de vidrio (Fisher Scientific) en un medio definido de DMEM/F12 suplementado con biotina (0,01 mg/ml), triyodotironina (15 nM), BAS al 0,5 % (todos de Sigma), N2, 1 % de pen/estrept. (ambos de Life Technologies) de PDGF AA humano recombinante (R & D Systems, Minneapolis, MN). La tincion de la superficie celular se realizo a 4 °C durante 12 minutos sobre celulas no fijadas despues de bloquear con EBSS tamponado con HEPES (E/H) con 5% de BSA. Todos los Ac humanos se usaron a 10 mg/ml. La tincion intracelular para la proteina basica de la mielina usando antisueros policlonales de raton (Boehringer Mannheim) se realizo a temperatura ambiente tras la fijacion con 4 % de paraformaldehido y permeabilizacion durante 5 minutos con 0,05 % de saponina. Los Ac primarios se detectaron usando Ac secundarios conjugados de forma fluorescente (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Las monocapas celulares se montaron en glicerina al 90 %/PBS con 2,5 % de 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano para prevenir la desaparicion y 0,1 pg/ml de bisbenzimida (ambos de Sigma) y se vieron con un microscopio epifluorescente Olympus Provis equipado con una camara digital SPOT (Diagnostic Instruments Inc, Sterling

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Heights, MI).

Virus y Animales

La cepa Daniel de TMEV se uso para estos experimentos y se preparo como se ha descrito (32). Ratones SJL/J hembra de los Jackson Laboratories se usaron despues de aclimatacion de 1 semana. Se inyecto a los ratones de 4 a 6 semanas de edad por via intracerebral 2 x 105 unidades formadoras de placas de TMEV en un volumen de 10 ml tiene como resultado una incidencia superior al 98 % de infeccion viral cronica. Los animales usados en este estudio se emplearon de 5 a 8 meses despues de la infeccion y recibieron una unica inyeccion intraperitoneal de Ig o PBS. Las dosis fueron 1,0 mg de iVlC o IgM policlonal humana o 0,5 mg de los AcMo humanos. Se sacrifico a los animales a las 5 semanas despues del tratamiento con Ac para la evaluacion morfologica; escogidos porque los estudios en modelos toxicos de desmielinizacion indican que la remielinizacion del SNC esta casi completa en este momento (33). Se cortaron secciones de medula espinal incluidas en plastico mediante una instalacion de microscopia centralizada y se retornaron al laboratorio marcado con un codigo numerico. De este modo, las laminas se graduan para la remielinizacion de una forma enmascarada.

Transferencia de tipo western

El TMEV purificado (34) se separo mediante SDS-PAGE y las protelnas se transfirieron a nitrocelulosa. Despues de bloquear con solucion salina tamponada con Tris que contiene 5% de leche seca desgrasada y 0,05% de Tween 20 durante 2 horas a temperatura ambiente, la membrana se incubo con Ig humana (10 Qg/ml) o Ac anti- TMEV policlonal de conejo (1:2000) durante 4 horas. Las Ig unidas se detectaron con AcMo anti-humanos de cabra biotinilados o anticuerpos anti-conejo de cabra biotinilados (ambos de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) y estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina usando 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato y azul de nitro-tetrazolio (BCiP/NBT, KPL, Gaithersburg, MD).

Cuantificacion de la desmielinizacion/remielinizacion de medula espinal

Los inventores han desarrollado procedimientos para cuantificar la cantidad de desmielinizacion de medula espinal, remielinizacion y atrofia en ratones susceptibles usando secciones transversales incluidas en plastico tenidas con 4% de parafenilendiamina (PPD) para visualizar la mielina (3 5, Figura 24A). Para obtener una muestra representativa de toda la medula espinal se cortaron secciones transversales de 1 mm de espesor de cada tercer bloque en serie de 1 mm, generando de 10 a 12 secciones transversales que representan la medula espinal entera. De cada seccion transversal, el area de la sustancia blanca, la patologla de la sustancia blanca, la remielinizacion de OL y la remielinizacion de las celulas Schwann (SC) se calcularon usando el sistema de analisis digital interactivo Zeiss (ZIDAS) y una camara lucida unida a un fotomicroscopio de Zeiss (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY). La sustancia blanca se trazo a un aumento de 40x. Las areas de la patologla de la sustancia blanca, definida como regiones de sustancia blanca con desmielinizacion o remielinizacion, se trazaron despues a un aumento de 100x. Las regiones de la patologla de la sustancia blanca a menudo contenlan infiltracion de macrofagos, inflamacion y poca o ninguna tincion PPD (Figura 25 C, D, H). La suma de las areas de la patologla que contenla desmielinizacion primaria con o sin remielinizacion se determino como medida de desmielinizacion total.

Las areas de remielinizacion, bien OL o SC, se trazaron a un aumento de 250x. Los OL pueden remielinizar multiples fibras axonicas y, por tanto, la remielinizacion de OL en vainas de mielina densamente empaquetadas, aunque finas, en comparacion con los axones mielinados normalmente. Los SC pueden remielinizar solo una unica fibra axonica, lo que tiene como resultado vainas de mielina mas espesar y un incremento del espacio entre las fibras axonicas en comparacion con la remielinizacion de los OL. Los cuerpos y los nucleos de las SC se pueden observar adyacentes a los axones que han remielinizado. Las areas totales se calcularon para cada raton sumando todas las areas trazadas desde cada uno de 10 a 12 secciones de la medula espinal por raton.

El porcentaje de area de patologla de la sustancia blanca de la medula espinal por raton se obtuvo dividiendo el area total de la patologla de la sustancia blanca por el area total de la muestra de sustancia blanca. El porcentaje de area de remielinizacion por raton se obtuvo dividiendo el area de la remielinizacion de OL o SC por el area total de la patologla de la sustancia blanca. Las medidas repetidas de la patologla de la sustancia blanca y la reparacion extensa de la mielina revelaron valores comparables que solo difieren en un 1,5 %. Para determinar la validez del uso de 10 secciones transversales como representation de la remielinizacion a traves de la medula espinal, se realizo una comparacion usando 10 secciones transversales frente a las 32 secciones transversales de un unico raton infectado cronicamente. El analisis de 10 secciones transversales tuvo como resultado un valor de remielinizacion del area en porcentaje de 47,7 %, mientras que los datos de las 32 secciones transversales tuvieron como resultado un valor del 40,0 %. Cualquier valor habrla indicado una remielinizacion significativa en nuestro ensayo.

RESULTADOS

IVIg humana y la IgM policlonal humana estimulan la remielinizacion del SNC en ratones infectados por TMEV

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Los estudios cllnicos en EM indican que IVIg puede ser parcialmente eficaz en la estabilizacion del curso de la enfermedad (18,36,37). Para determinar si la IVIC humana podrla estimular la remielinizacion en el modelo de TMEV de EM, los ratones cronicamente infectados se trataron con una unica inyeccion intraperitoneal de 1 mg de IVIg. Se administro una unica dosis para evitar provocar una respuesta inmunitaria a la Ig extrana. La dosis total de Ig humana fue de aproximadamente 0,05 g/kg de peso corporal, un cuatro de la dosis total usada para el tratamiento con IVIg humana (18). Ratones adicionales se trataron con un unico bolo de 1 mg de IgM policlonal humano. Tras el analisis de las medulas espinales, el porcentaje de area de remielinizacion de OL en ratones tratados con IVIg o IgM policlonal humana (Tabla 4, 14,15 % y 23,19 %, respectivamente) fue significativamente mayor que la remielinizacion OL espontanea observada en el grupo tratado con PBS (6,74%, p<0,05 para IgG, p<0,01 para IgM). No se observaron diferencias estadlsticamente significativas en las areas de sustancia blanca o las areas de patologla de la sustancia blanca entre cualquier grupo de tratamiento o el grupo control con PBS. Los datos describe dos experimentos independientes de tratamiento de los grupos de 7 y 9 ratones con IVIg y los grupos de 7 y 10 ratones tratados con IgM policlonal humana. Los valores finales de la Tabla 4 incluyen solo los animales que contenlan al menos un 5 % de patologla de la sustancia blanca.

Tabla 4. Remielinizacion del SNC en ratones tras tratamiento con Ac humanos

Tratamiento

N° de Area de Area de patologla Area de Area de

ratones sustancia de la mielina, remielinizacion de remielinizacion de

blanca, mm2 mm2 tipo SNC, mm2 tipo SNC, %

IVIg

10 8,60 ± 0,52 0,8 ± 0,10 0,13 ± 0,02 14,15 ± 2,38*

IgM humana

14 9,70 ± 0,43 1,21 ± 0,21 0,24 ± 0,04 23,19 ± 3,26t

sHIgM 1

4 9,34 ± 1,93 0,68 ± 0,07 0,03 ± 0,01 8,35 ± 3,73

sHIgM2

4 8,78 ± 0,70 0,87 ± 0,12 0,10 ± 0,01 11,37 ± 1,30

sHIgM 14

7 11,01 ± 0,60 1,13 ± 0,18 0,08 ± 0,03 8,41 ± 2,59

sHIgM 22

8 10,55 ± 0,41 1,16 ± 0,22 0,19 ± 0,05 17,06 ± 3,42*

sHIgM46

5 9,44 ± 0,36 0,66 ± 0,06 0,18 ± 0,04 27,12 ± 4,01 1

PBS

7 9,78 ± 0,60 1,20 ± 0,22 0,06 ± 0,02 6,74 ± 1,80

Los valores representan la media ± SEM. Se usaron ANOVA de una via y una prueba t para comparar el porcentaje de area de remielinizacion de tipo SNC en ratones tratados con anticuerpos humanos con los ratones tratados con PBS. Dichos analisis revelaron *P < 0,05; fP < 0,01, fP < 0,001. La comparacion de los ratones tratados con otros tratamientos revelo IgM policlonal humana P= 0,05; sHIgm 46 P < 0,05. Ninguna de las demas comparaciones fue estadlsticamente significativa. No se observaron diferencias en la remielinizacion de tipo SNC entre IgM policlonal humana, sHIgM 22 y sHIgM 46. El area de remielinizacion de SC de tipo de sistema nervioso periferico vario de 0 a 0,08 mm2. Esto correspondio a un porcentaje de area de 0,0 a 6,92 de remielinizacion de SC de tipo sistema nervioso periferico como una funcion de la patologla de la mielina. No se observaron diferencias significativas en el area de la patologla de la mielina en los diversos grupos de tratamiento o en comparacion con el PBS o en la remielinizacion de SC de tipo sistema nervioso periferico entre grupos.

El tratamiento con IgM humano policlonal tuvo como resultado mas remielinizacion de OL que la observada en ratones tratados con IVIg (p= 0,05, Figura 25 A, B). Aproximadamente un cuarto del area total de la patologla de mieloma se remielinizo en ratones tratados con IgM policlonal humana, que representa miles de axones envainados. De media, 1 mm2 dentro de las areas de patologla remielinizadas en confluencia (Figura 25B) correspondla a 46.000 a 125.000 axones remielinizados. Por tanto, la remielinizacion del SNC tras el tratamiento con Ig humana fue extensa. Habla pocas celulas inflamatorias o macrofagos. En contraste, en ratones tratados con 25 PBS, las areas de patologla de la mielina contenlan pocos axones remielinizados (Figura 25H). Habla signos de destruccion activa de mielina, como remolinos de mielina, celulas inflamatorias y macrofagos.

Como procedimiento adicional mas rapido para juzgar la eficacia de un tratamiento para estimular la remielinizacion, las 10 secciones de medula espinal representativas de un animal se analizaron para detectar la presencia de areas de patologla de la sustancia blanca que mostraron una reparacion casi completa. Los inventores han definido la reparacion completa como un area de patologla de la sustancia blanca con axones remielinizados casi confluentes y sin celulas inflamatorias ni macrofagos (como en la Figura 25 B, F, G), un acontecimiento muy raro en la remielinizacion espontanea. Se observo a menos un area de reparacion completa en cuatro animales tratados a menudo con IVIg y en diez de catorce animales tratados con IgM policlonal humana. Los inventores han concluido que tanto la IVIg como la IgM policlonal humana estimulan la remielinizacion en comparacion con el tratamiento con PBS y que la IgM policlonal humana es superior a la IVIg en cuanto a su

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capacidad para estimular la remielinizacion del SNC.

Los Ac humanos que se unen a los OL estimulan la remielinizacion del SNC en ratones infectados por TMEV. Todos los AcMo de raton previamente identificados que estimulan la remielinizacion del SNC se unen a los OL (23, 26). Para detectar AcMo humanos para analizar en el modelo de TMEV, en los AcMo humanos se analizo la 40 capacidad de unirse a la superficie de los OL de rata en cultivos mixtos de celulas glia primarias sin fijar. Los cultivos primarios establecidos a partir de cerebro de rata neonata contienen OL en varios estadios de diferenciacion a los 9 dlas n vitro (38). Las fuentes de los inventores de los AcMo eran IgM monoclonales humanas derivadas de suero (sHIgMs) e IgG monoclonales humanas derivadas de suero (sHIgGs). Ninguno de 50 sHIgG se unio a OL de rata sin fijar, pero seis de 52 sHIgM se unieron a la superficie de los OL de rata marcados de forma conjunta con el AcMo anti-sulfatida 04 (39).

Los seis sHIgM de union a OL se usaron para tratar los ratones infectados por TMEV. Los grupos de cinco animales recibieron, cada uno, una unica inyeccion de 0,5 mg de AcMo humano. El porcentaje de area medio de remielinizacion de OL tras el tratamiento con sHIgM22 y sHIgM46 (Figura 25 F, G) estuvo, en ambos, significativamente por encima de los niveles de fondo atribuibles a remielinizacion espontanea. Los otros cuatro sHIgM de union a OL estimularon la remielinizacion a niveles comparables o por debajo del nivel observado tras el tratamiento con PBS. Un segundo grupo de animales fue tratado con sHIgM22, sHIgM46 o PBS para confirmar las observaciones iniciales. SHIgM14 tambien se repitio como ejemplo de un AcMo humano que se unio a los OL, pero no estimulo la remielinizacion. Los datos combinados se presentan en la Tabla 1. Solo los animales que contenlan al menos un 5 % de patologla de la sustancia blanca total se incluyeron en el analisis estadlstico.

El porcentaje del area mas elevado de remielinizacion de OL se observo en los animales tratados con sHIgM46 (27,%), seguido de los animales tratados con sHIgM22 (17,%). El porcentaje del area de remielinizacion tras el tratamiento con sHIgM14 (8,41%) fue similar al observado tras tratamiento con PBS (6,74 %). Para analizar si cualquier sHIgM, con independencia de la especificidad antigenica, podrla estimular la remielinizacion, los inventores estudiaron dos AcMo in vivo, que demostro ausencia de inmunorreactividad a los OL en cultivos primarios mixtos, sHIgM1 y sHIgM2 (Figura 25 C, D). El porcentaje del area de remielinizacion tras el tratamiento con sHIgM1 (8,3%), sHIgM2 (11,4%) no fue significativamente diferente de los grupos de tratamiento sHIgM14 o PBS (11,4%). En todos los grupos, las areas de sustancia blanca y las areas de patologla de la sustancia blanca no fueron estadlsticamente diferentes. En comparacion con la remielinizacion observada en el grupo tratado con PBS, el porcentaje de area de remielinizacion tras el tratamiento con sHIgM46 o sHIgM22 tuvo como resultado valores p<0,001 y <0,05, respectivamente. El area de remielinizacion de SC de tipo del sistema nervioso periferico vario en los grupos de tratamiento de 0 a 0,08 mm2. Esto correspondio a valores de porcentaje de area de 0,0 a 6,92 de remielinizacion de SC como una funcion de la patologla de la mielina. No se produjeron diferencias estadlsticas en el porcentaje de area de remielinizacion de SC entre cualquier grupo de tratamiento.

Comparando el porcentaje del area de remielinizacion de OL observada tras el tratamiento con cualquier preparacion policlonal o monoclonal humana revelo que sHIgM46 era estadlsticamente superior a IVIg (p< 0,05), pero no a IgM policlonal humana. El porcentaje del area de remielinizacion de OL observada tras el tratamiento con sHIgM22 no fue diferente del observado tras tratamiento con IVIg, IgM policlonal humana o sHIgM46.

Cuando se analizaron las areas de patologla de la sustancia blanca con reparacion completa, se observo al menos un area en cuatro de ocho animales tratados con sHIgM22 y en cinco de cinco animales tratados con sHIgM46. En contraste con esto, ninguno de los animales tratados con sHIgM1, sHIgM2, sHIgM14 o PBS contenla una unica area de reparacion completa.

Los AcMo humanos, pero no las Ig policlonales humanas, se unen a los OL humanos de rata.

Si los AcMo humanos van a ser una potencial terapia para estimula la remielinizacion en seres humanos, una reactividad frente a los antlgenos de superficie sobre los OL humanos puede ser importante para apuntar a areas de patologla del SNC humano. Por tanto, los inventores han determinado si los AcMo de estimulacion de la remielinizacion humana podrlan unirse a los OL obtenidos del cerebro humano adulto. Los cultivos de celulas gliales humanas se establecieron a partir de biopsias del lobulo temporal adulto y se inmunomarcaron con los AcMo humanos en varios puntos de tiempo en el cultivo.

Tres de los seis sHIgM que se unieron a la superficie de los OL en nuestra detection selectiva inicial tambien se unieron a OL humanos. Tras una semana en cultivo, los OL humanos positivos para sulfatada inmaduros morfologicamente se marcaron con sHIgM14 y sHIgM46, pero no con sHIgM22. A las 3 semanas en cultivo, los OL humanos positivos para sulfatida inmaduros morfologicamente se marcaron con sHIgM14, sHIgM22 y sHIgM46 (Figura 26 A, B, C). Tras 4 semanas en cultivo, casi todos los OL humanos positivos para MBP tambien se unieron a sHIgM22 y sHIgM46, pero la union de sHIgM14 se redujo considerablemente (datos no mostrados).

Ni la IVIg ni la IgM policlonal humana se unio a la superficie de OL humanos en cultivo a ninguno de los tiempos analizados. No obstante, la IgM policlonal humana se unio con fuerza a los tractos de la sustancia blanca y

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varias de las poblaciones neuronales cuando se incubaron con laminas sin fijar frescas de SNC de roedores. La IVIg era completamente negativa en este ensayo de union (datos no mostrados). SHIgM22 y sHIgM46, ambos estimularon la remielinizacion, y sHIgM14, que no estimulo la remielinizacion, tambien se unieron a la superficie de OL de rata positivos para la protelna basica de la mielina purificada (datos no mostrados).

Los inventores concluyeron que puede ser necesaria una afinidad por antlgenos de OL, pero no es suficiente para que un AcMo humano estimule la remielinizacion. El hecho de que ambos AcMo humanos que estimulan una remielinizacion significativa se unen a OL humanos maduros diferenciados destaca el posible requisito de que los AcMo sean dirigidos c los OL adultos supervivientes para la funcion in vivo.

Para excluir la posibilidad de que las Ig o los AcMo humanos estimulen la remielinizacion neutralizando virus, en cada preparacion se analizo la reactividad frente a antlgenos de TMEV purificados mediante transferencia Western (34). Ninguna de las preparaciones de Ac humanos reaccionaron con las protelnas de TMEV; no obstante, la Ig policlonal de conejo producida contra el TMEV reacciono fuertemente a cuatro protelnas de capside viral (datos no mostrados).

Las celulas B perifericas se obtuvieron del individuo en el que se identifico sHIgM22. Se determinaron las secuencias de los dominios variables, cadena ligera y pesada, de sHIgM22. La region variable de la cadena ligera de sHIgM22 (numero de registro en GenBank AF212992) pertenece al subgrupo I de las regiones variables de la cadena ligera humana. La region variable de la cadena pesada de sHIgM22 (numero de registro en GenBank AF212993) pertenece al subgrupo III de las regiones variables de la cadena pesada humana. Se observaron diferencias significativas entre los dominios variables de sHIgM22 y la secuencia del dominio variable de la llnea germinal humana mas conocida (40).

DISCUSION

En esta serie de experimentos, los inventores han demostrado que los Ac humanos pueden estimular la remielinizacion del SNC. Se observo una remielinizacion mas extensa en las medulas espinales de ratones infectados por TMEV tras tratamiento con IgM policlonal humana que el tratamiento con IVIg humana. Ademas, los inventores han identificado dos IgM monoclonales humanas que potenciaron de forma consistente la remielinizacion. Ambos AcMo se aislaron de los sueros de pacientes con macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), una clase de linfoma caracterizado por la expansion clonal maligna de una unica celula B en el ultimo estadio de maduracion que inunda el suero con IgM monoclonal (41). El nivel alto de estos AcMo no parece ser perjudicial. En pacientes con WM, la IgM dominante reconoce normalmente los antlgenos que son reconocidos por el repertorio de IgM presentes en individuos sanos (42). La capacidad de los inventores para identificar facilmente y aislar AcMo de union a antlgeno de OL que estimulan la remielinizacion de la poblacion humana proporciona soporte al concepto de que estos Ac son comunes entre el repertorio de celulas B y pueden funcionar como modificadores en respuesta a la lesion del SNC.

Los AcMo estimuladores de la remielinizacion se pueden producir en los sueros de individuos cuando se confrontan con danos en el SNC.

Aunque tanto la IVIg como la IgM policlonal humana estimulaban la remielinizacion, ninguna se unio a los OL de rata o humanos en cultivo. En contraste con ello, ambos AcMo humanos que estimulaban la remielinizacion se unieron a los antlgenos de superficie de OL de rata y de seres humanos. La mayor eficacia de los AcMo humanos para estimular la remielinizacion puede deberse a la orientacion eficaz hacia los OL adultos en el area danada. Stangel notifico que IVIg no tenia ningun efecto sobre la diferenciacion, migration o proliferation de los progenitores de OL en cultivo, no obstante, la union de IVIg a los progenitores de OL no se evaluo (43). La ausencia de afinidad de IVIg por los OL es probable que explique la falta de cualquier afeccion discernible en los progenitores de OOL. No obstante, el hecho de que IVIC no se une a los OL implica que el mecanismo de action en la estimulacion de la remielinizacion puede ser distinto del de los AcMo humanos.

La misma preparacion de IgM policlonal humana usada en este estudio se ha demostrado que neutraliza los autoanticuerpos (28) y altera la expresion de citocinas en EAE (44) y que es beneficiosa en un modelo de raton de miastenia gravis (45). La IgM policlonal humana, pero no la IVIg, se une a los tractos mielinizados en laminas no fijadas de cerebro de roedor. Ninguna preparacion policlonal se unio a la sustancia blanca humana fresca. La IgM policlonal humana puede estimular una remielinizacion significativa en el raton mediante una combination de inmunorregulacion general, union a anticuerpos patogenicas y opsonizacion de residuos de mielina.

El mecanismo por el cual las Ig estimulan la remielinizacion todavia no se ha aclarado. Dado que muchos de los AcMo que estimulan la remielinizacion se unen a los OL y/o la mielina, es razonable postular la hipotesis de un efecto directo sobre las celulas reconocidas. Existen ejemplos de AcMo que se unen y alteran la biologia de los OL en cultivo (46-48). No obstante, dado que los AcMo que estimulan la remielinizacion tienen varias especificidades (23, 26), es improbable que cada AcMo funcione directamente a traves de un antigeno o receptor frecuente. Una 50 molecula polivalente como una IgM podria acercar las moleculas de serialization normalmente alejadas a las

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proximidades de la membrana plasmatica con la posterior activacion (49). Dado que la mayorla de los AcMo que estimulan la remielinizacion parecen unirse a llpidos (26), la union de estas IgM a la superficie celular podrla reorganizar la membrana plasmatica y facilitar una via de senalizacion. Cuando se anade SCH94.03 a cultivos mixtos de celulas gliales primarias se observa un incremento de 2-23 veces en la captacion de timidina tritiada Rodriguez, observaciones no publicadas).

Otro posible mecanismo por el cual los AcMo que estimulan la remielinizacion pueden funcionar es dirigiendo a los residuos de mielina o a los OL danados. La union a los OL o a la mielina puede potenciar la eliminacion de residuos celulares de las areas danadas, lo que permite que progrese el proceso normal de reparacion del SNC espontaneo. Quiza el mecanismo de accion de las Ig policlonales humanas es, principalmente, a traves de inmunomodulacion mediante una inhibicion de la diferenciacion de celulas B o una alteracion de la expresion de citoquinas y la red antiidiotlpica (27, 50), mientras que la accion de los AcMo humanos se produce mediante la orientacion directa a los antlgenos de OL y/o mielina. Ninguna caracterlstica fue completamente predictiva de la capacidad de un Ac para estimula la remielinizacion. De hecho, un AcMo humano analizado en ratones infectados por TMEV cronicamente para suprimir la remielinizacion por debajo del nivel de remielinizacion espontanea, lo que sugiere que ciertos AcMo humanos de union a OL pueden inhibir la remielinizacion in vivo o pueden exacerbar la desmielinizacion. Esto es consistente con la observacion de que AcMo especlficos reactivos frente a los antlgenos de OL (es decir, glicoprotelna de oligodendrocitos de la mielina, 51) potencian la desmielinizacion en EAE (52). En ultima instancia, la prueba de un potencial de remielinizacion de Ac y la ausencia de patogenicidad requiere pruebas in vitro.

En varios ensayos doble ciego u controlados con placebo con IVIg humana se ha demostrado alguna eficacia en la EM (18,36,37). La IgM policlonal humana, sHIgM22 y sHIgM46 potenciaron todos ellos la remielinizacion del SNC en el modelo de TMEV, as! como la IVIg, lo que sugiere que estos Ac pueden ser tan eficaces en la EM. Los AcMo humanos que se unen a los OL pueden tener el beneficio adicional de la estimulacion directa de los OL. Los AcMo se pueden producir libres de posible infeccion por patogenos y se pueden alterar estructuralmente para aumentar su eficacia e inmunogenicidad. En contraste con los AcMo de raton, o AcMo de raton “humanizados”, los AcMo humanos deberan tener como resultado una respuesta inmunitaria minima y son aplicables facilmente a ensayos humanos. Dado que los AcMo humanos estimulaban la remielinizacion en animales paralizados cronicamente, ello proporciona esperanza que se pueden desarrollar terapias satisfactorias para pacientes con discapacidades de larga data.

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EJEMPLO 4

Como se ha descrito en los Ejemplos anteriores, los inventores han usado dos enfoques para identificar anticuerpos monoclonales humanos que inducen un patron similar de remielinizacion en el modelo de virus de Thelier de enfermedad desmielinizante. El primer abordaje fue transformar las celulas B humanas con el virus de Epstein Barr (EBV) para generar clones de celulas B secretores de inmunoglobulina. Las llneas celulares resultantes se sometieron a deteccion selectiva para identificar cultivos que expresaban niveles altos de anticuerpos y la estabilidad de los anticuerpos producidos para unirse a antlgenos del SNC, con enfasis concreto sobre aquellos que se unlan a oligodendrocitos. El segundo abordaje fue realizar una deteccion selectiva similar de la union al SNC de suero de pacientes diagnosticados con una gammapatla monoclonal, tal como MUGUS, linfoma o slndrome de Waldenstrom. En el caso de las celulas transformada por EBV, las propias celulas podrlan proporcionar una fuente de anticuerpo para generar cantidades suficientes de anticuerpos de calidad GMP para ensayos cllnicos. Ademas, los anticuerpos identificados de cualquier fuente podrlan producirse mas optimamente en un sistema productor de anticuerpos artificiales usando genes del anticuerpo sinteticos que codifican los anticuerpos de interes. Los inventores preven que las llneas celulares de hibridoma transfeccionadas con un casete de expresion de anticuerpo que codifican el anticuerpo de interes proporcionaran suficiente anticuerpo de interes para el analisis in vivo y en ensayos cllnicos.

En el curso de los estudios de deteccion selectiva, los inventores han identificado un grupo de anticuerpos IgM monoclonales humanos que inducen remielinizacion estadlsticamente significativa en su modelo de virus de Thelier in vivo de enfermedad desmielinizante (TABLA 5). Cada uno de estos anticuerpos imitaron la respuesta de remielinizacion descrita originalmente con el anticuerpo monoclonal murino prototipo SCH 94.03. Entre estos anticuerpos humanos son dos derivadas de llneas de celulas B transformadas con EBV, denominados MSI 19D10 y CB2bG8, y dos anticuerpos, denominados sHIgM 22 y sHIgM 46, identificados entre un pan de anticuerpos de mas de 50 pacientes que expresan niveles altos de IgM monoclonal en su suero.

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TABLA 5. Remielinizacion inducida por anticuerpos monoclonales humanos en ratones SJL/J

infectados cronicamente con el virus de Theiler.

Tratamiento

% Remielinizacion Evaluation estadlstica

Comparacion 1

PBS (n=7)

6,74 (+/-1,80)

sHIgM 22 (n=8)

17,6 (+/-3,42) P<0,05

sHIgM 46 (n=5)

27,12 (+/-4,01) P<0,001

Comparacion 2

PBS (n=12)

8,25 (+/-1,44)

MSI 19-D10 (n+13)

24,38 (+/-2,91) P<0,001

CB2b-G8 (n=12)

23,51 (+/-3,13) P<0,001

Los animales se infectaron cronicamente con la cepa DA del virus de Theiler durante mas de 9 meses antes del tratamiento con una unica inyeccion ip de 0,5 mg de anticuerpo IgM aislado del suero del paciente (sHIgM22 y sHIgM 46) o llneas celulares transformadas con EBV (MSI 19-D10 o CB2b-G8). Cinco semanas despues, los ratones fueron perfundidos con agente de fijacion y medulas espinales para analisis histologico. Las areas de desmielinizacion y remielinizacion se evaluaron directamente mediante microscopia. El porcentaje de area de remielinizacion se determino mediante la formula area remielinizada/area

desmielinizada X 100.

Los efectos del tratamiento se evaluaron mediante comparacion estadlstica con los

grupos de animales que recibieron inyecciones de PBS en lugar de anticuerpo,

Los animales se infectaron cronicamente con la cepa DA del virus de Theiler durante mas de 9 meses antes del tratamiento con una unica inyeccion ip de 0,5 mg de anticuerpo IgM aislado del suero del paciente (sHIgM22 y sHIgM 46) o llneas celulares transformadas con EBV (MSI 19-D10 o CB2b-G8). Cinco semanas despues, los ratones fueron perfundidos con agente de fijacion y medulas espinales para analisis histologico. Las areas de desmielinizacion y remielinizacion se evaluaron directamente mediante microscopia. El porcentaje de area de remielinizacion se determino mediante la formula area remielinizada/area desmielinizada X 100. Los efectos del tratamiento se evaluaron mediante comparacion estadlstica con los grupos de animales que recibieron inyecciones de PBS en lugar de anticuerpo,

Las estructuras de las cadenas ligera y pesada de la IgM para ambos anticuerpos derivaron de los transformantes con EBV se han determinado mediante analisis de ADNc generado a partir del ARNm de inmunoglobulina aislado de las celulas. Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de MSI 19D10 y sHIgM 22 se proporcionan en las Figuras 19 y 20 (SEC ID N° 9 y 11) y las Figuras 17 y 18 (SEC ID N° 1, 49, 5 y 50), respectivamente. Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de CB2bG8 se proporcionan en las Figuras 27 y 28 (SEC ID N° 13 y 15). Las propias secuencias no son destacables en otro sentido aparte de que difieren algo con respecto a las secuencias de inmunoglobulina de la llnea germinal conocida. Por tanto, pueden ser los productos de la diversificacion somatica durante el curso de las respuestas inmunitarias contra antlgenos no identificados. El valor de las secuencias es que proporcionan una impresion azul para la construccion de vectores de expresion para la produccion de la inmunoglobulina en conducciones controladas.

De forma similar, las estructuras de las cadenas pesada y ligera del suero de uno de los pacientes productores de IgM se determinaron mediante analisis de la secuencia de protelnas, seguido de clonacion y analisis de la secuencia de ADNc de celulas mononucleares de sangre periferica aisladas del paciente. En el suero del paciente se identificaron dos cadenas pesada y ligera estrechamente relacionadas, denominadas sHIgM22 (Figuras 17 y 18). Las dos cadenas ligera y pesada estaban presentes en las poblaciones de ADNc aislado en una proportion de 60:40. Ambos anticuerpos comparten una reorganization P-VDJ comun y una reorganization -VJ, lo que indica que derivan de un precursor de celulas B comun. Despues, han divergido como resultado de la acumulacion de mutaciones que han alterado las estructuras de sus regiones variables. Los inventores han concluido que los anticuerpos se expresan en el suero del paciente porque los peptidos de los anticuerpos se caracterizaron a partir de la protelna aislada de suero. No obstante, las dos combinaciones distintas de cadenas variable y ligera no se 15 observaron directamente, dejando abierta la posibilidad de que otras combinaciones de las cadenas alfa pueden estar realmente presentes. En base a las posiciones de las sustituciones de aminoacidos observadas, los inventores sospechan que los anticuerpos tienen patrones de reactividad muy similares.

EJEMPLO 5

DESARROLLO DE UN SISTEMA DE TRANSFECCION PARA LA EXPRESION DE GENES DE ANTICUERPOS

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EN CULTIVO CELULAR

Con el fin de generar un suministro renovable de tltuios elevados de anticuerpos de los anticuerpos humanos, los inventores han desarrollado un sistema de expresion basado en la transfeccion. Las celulas de hibridoma que se han seleccionado por la perdida de produccion de ARNm de inmunoglobulina endogena se pueden transfeccionar con genes de anticuerpos recombinantes para generar celulas que expresan los anticuerpos de interes.

Los inventores han explorado el uso de una serie de sistemas vectores basados en genoma y ADNc para expresar los genes de anticuerpo clonados en cultivo celular. Los inventores han expresado con exito la protelna de cadena ligera usando genes genomicos o basados en ADNc. Los inventores han conseguido la expresion de la cadena pesada usando un vector de la cadena pesada basado en el genoma PAG 4026 (amablemente proporcionado por la Dra. Sherie Morison de la UCLA). No obstante, el rendimiento de anticuerpo con este sistema de vector es demasiado bajo para su uso practico in vivo. El objetivo de los inventores ha sido desarrollar un vector nuevo que dara de forma rutinaria clones de hibridoma transfeccionados que producen un tltulo alto de anticuerpos. La estrategia actual de los inventores es ensamblar el vector a partir de componentes e individualmente se ha demostrado que funcionan bien en sus manos.

Los inventores han mostrado que un vector que expresa dHfR y el ADN de la cadena ligera de inmunoglobulina bajo el control del promotor de CMV expresa la cadena ligera y que esta expresion se puede amplificar cultivando las celulas productoras de inmunoglobulina transfeccionadas en concentraciones crecientes de metotrexato (Figura 29). A continuacion, los inventores clonan esta unidad funcional, que expresa la cadena ligera de inmunoglobulina y dHfr, en el vector que expresa el gen de la cadena pesada genomica que codifica la cadena complementaria. El primer vector que han creado los inventores en este sentido, codifica 94.03 quimerico de raton/humano 94.03 y se muestra en el panel superior de la Figura 30. El vector se ha introducido en celulas de hibridoma negativas a anticuerpo y clones que expresan cantidades pequenas de anticuerpo funcional. El anticuerpo tine el tenido del SNC de un modo identico al que usa el anticuerpo 94.03 nativo de raton (Figura 3.1)- Estos clones productores de anticuerpos sufren seleccion con cantidades crecientes de metotrexato para expandir la cantidad de anticuerpo que se esta produciendo. Dado que los inventores han identificado dos cadenas pesada y dos ligeras en el suero humano de SHIGM 22, las cuatro permutaciones de la cadena pesada y ligera se tienen que evaluar. Los vectores que expresan tres de las cuatro posibles combinaciones de sl-ngm 22 identificados en nuestro estudio de secuencia y actualmente se introdujeron en las celulas de hibridoma negativos para inmunoglobulina. El vector prototipo se muestra en el panel inferior de la figura 30.

PROCEDIMIENTOS

Construction de los vectores de expresion para expresar 94.03 (M1) quimerico de raton/de rata y el anticuerpo sHIgM-22:

Ensamblaje del sistema de expresion para 94.03 quimerico de raton/de rata

El vector ensamblado consta de dos unidades. El primero codifica la cadena pesada de la inmunoglobulina que esta codificada por un gen de inmunoglobulina derivado de ADN genomico. El vector es, en parte, un derivado de un vector armazon (PAG 4026) obtenido del laboratorio de la Dra. Sherrie Morrison de UCLA. El vector PAG 4026 codificado por una cadena pesada de IgM que expresa una region variable irrelevante. No se disponla de sitios de donation comodos para la sustitucion de regiones variables de interes. Por tanto, los inventores obtuvieron la ingenierla mediante deletion de las secuencias de cadena pesada irrelevantes y reconstitution de las regiones que flanquean la region variable con sitios de restriction unicos (Rsr II en el extremo 5' y Pac I en el extremo 3'. Dado que la secuencia del vector PAG no se conocla, los inventores han determinado que encimas de restriccion serlan unicas por el metodo de prueba y error, cuando enzimas que reconecen secuencias con porca frecuencia presentes en el ADN de mamlfero.

La region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal IgM de raton 94.03 se aislo a partir de ADNc mediante PCR usando el cebador RsrII

ACTCCCAAGTCGGCTCGCTTTCTCTTCAGTGACAAACACAGACATAGAACA TCACCATGGGATGGAGCTGT- ATCACT (SEC ID N°: 39) para introducir el sitio RsrII antes en la cadena de la secuencia llder y el cebador PAcl ACTGACTCTCTTAATTAAGACTCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT (SEC ID N° 40) para introducir el sitio Pacl manteniendo la correcta union de corte y empalme en el extremo 3' del bloque de codification de la region variable.

La segunda parte del vector de expresion deriva de multiples plasmidos. La construccion terminada contiene sitios EagI en ambos extremos, la secuencia de codificacion DHFR (dihidrofolato reductasa) bajo el control regulador del promotor de SV40 y un bloque de codificacion de ADNc de cadena ligera kappa humana/quimerico de raton bajo el control regulador del promotor sdl CMV. Esta portion del vector se ensamblo de un modo por etapas, comenzando con tres plasmidos (pCIneo (Promega Corporation), pUC18 (New England Biolabs), and pFR400

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(Simonsen and Levinson, Proc Natl Acad Sci USA 80:2495: 1983)) que proporciono sitios de clonacion adecuados, regiones promotoras, senales de poliadenilacion y/o el bloque de codificacion DHFR, Despues de una serie de modificaciones que incluyo la introduction de regiones de union sinteticas y, por tanto, los sitios de endonucleasa de restriction no deseables, el casete de expresion de metotrexato mediante un casete de luz., se ensamblo. EL casete incluye sitios para endonucleasa de restriccion unicas (Nhe I y Xho I) que flanquea el bloque de ADN c del gen de la cadena ligera.

El gen de la cadena ligera quimerica se ensamblo a partir de dos secuencias de ADN usando el corte y empalme de PCR mediante la tecnica de extension de solapamiento (Horton y col.) Gene 77:61:1989). Los cebadores que flanquean las regiones fusionadas del ADNc quimerico (que contenlan las secuencias de reconocimiento enzimatico para las endonucleasas Xho I y Nhe I. El cebador en 5' usado para amplificar el producto del gen fusionado fue TTGGCGCGCCAAAGACTCAGCCTGGACATGATGTCCTCTGCTCAGTTC (SEC ID N° 41); el cebador en 3 ' fue ATAGTTTAGCGGCCGCATTCTTATCTAACACTCTCCCCTGTTG (SEC ID N° 42). El bloque de codificacion de ADNc se inserto en el vector del casete de la cadena ligera usando estos sitios.

Una vez ensamblado, el casete se escindio usando la endonucleasa Eag I y se inserto en el sitio Eag I unico en el vector que contiene el gen de la cadena pesada. La construction resultante contiene las secuencias de codificacion para los componentes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo quimerico de raton/humano para 94.03 “humanizado”. La cadena pesada se expresa mediante el promotor de IgH humano y la cadena ligera se expresa mediante el promotor del CMV. El gen de dHFR proporciona un marcador de amplification y se expresa mediante el promotor del SV40. Cada uno de estos genes contiene senales de poliadenilacion en los extremos 3'. Otras caracterlsticas importantes del vector incluyen un origen bacteriano de replication y un gen expresado en bacterias que codifica resistencia a ampicilina. Los bloques de codificacion de ADN de la region variable de las cadenas ligera y pesada estan flanqueados por sitios unicos de endonucleasas de restriccion que se pueden usar para sustituir nuevas secuencias de inmunoglobulina aisladas de ARNm de cualquier celula productora de anticuerpo o genes de inmunogloblulina sinteticos.

Insertion de las secuencias de sl-HgM.22 en el sistema del vector de expresion

El ADNc del ARNm que codifica las cadenas pesada y ligera de sHIgM.22 se preparo mediante amplificacion por PCR del ARN de sangre periferica usando cebadores en 5' deducidos de la information sobre la secuencia de aminoacidos y secuencias en las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera respectivamente. El bloque de codificacion de la region variable de la cadena pesada, la secuencia llder y la union de corte y empalme del donante, junto con los sitios flanqueantes de RsrII y Pac I se ensamblaron usando PCR para anadir la region 5' GACTCGGTCCGCCCAGCCACTGGAAGTCGCCGGTGTTTCCATTCGGTGATCATCACTGAACACAGAGG- ACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTC CTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGC- AGCTGGTGGAGTCT GG (SEC ID N° 43) y las secuencias en 3'

CCTTAATTAAGACCTGGAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACCAG GGTTC (SEC ID N° 44). La molecula de ADN resultante se digirio con Rsr II y Pac I, y despues se clono en el vector de expresion, sustituyendo la secuencia de la region variable deseada para la secuencia irrelevante en el vector.

La secuencia de la cadena ligera se ensamblo en dos etapas. La region constante lambda se aislo del ARNm mediante PCR-RT usando el cebador en 5' CTAGCTAGCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCC (SEC ID N° 45)y el cebador en 3 ' ATAGTTTAGCGGCCGCACCTATGAACATTCTGTAGG (SEC ID N° 46). Este fragmento se clono usando un unico sitio AvrII y un sitio en 3' Not I en el vector pClneo.

La region variable de sHIgM.22 se genero mediante PCR-RT usando el cebador en 5' CTAGCTAGCCCGAATTTCGGGACAATCTTCATCATGACCTGCTCCCCTCTC CTCCTCACCCTTCTCATT- CACT GCACAGGGTCCT GGGCCCAGT CT GT GTT G ACGCAGCCG (SEC ID N° 47) con el fin de introducir la necesidad del sitio Nhe I y la secuencia llder sobre el ADN. El cebador en 3'

GGGCAGCCTTGGGCTGAGCTAGGACGGTCAGC (SEC ID N° 48) se uso para introducir un sitio AvrII de modo que este fragmento podrla unirse con la pieza de la region constante. El bloque de codificacion resultante que contiene una senal llder funcional estaba flanqueado por los sitios NheI y Xho I necesarios para clonar en el casete de la cadena dHFRnigh, que despues se ensamblo con el plasmido de la cadena pesada para generar el producto final que contiene las secuencias de codificacion tanto de la cadena pesada como de la ligera y los promotores necesarios para la expresion en celulas de mamlfero.

EJEMPLO 6

ANTICUERPO 94.03 DE ISOTIPO IgG

Una estrategia para determinar la importancia del isotipo en la capacidad del anticuerpo de raton 94.03 para inducir remielinizacion es generar un anticuerpo recombinante que expresa la region variable de 94.03 con un isotipo IgG. Como estrategia alternativa, los inventores han buscado identificar una variante de desplazamiento del isotipo natural dentro de la poblacion de las celulas productoras de 94.03 en cultivo. Se sabe que las variantes de

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desplazamiento espontaneo aparecen en los cultivos de este tipo. Tras clasificaciones sucesivas en FACS de las celulas tenidas para la IgG de superfine celular, los inventores capaces de aislar una llnea de celulas clonales que secretan 94.03 portadoras del isotipo IgG1 (Figura 32). La estructura del anticuerpo producida por estas celulas se confirmo mediante ELISA, caracterizacion de las protelnas producidas en geles de SDS y mediante clonacion del ADNc. El analisis directo de la secuencia como se indica en la Figura 33 produjo datos definitivos que indicaban que los inventores han descubierto una variante de IgG del anticuerpo 94,03.

EJEMPLO 7

ANTICUERPO 09 DE RATON ANTI-OLIGODENDROCITOS DE ISOTIPO IGG3.

El anticuerpo 09 de raton se aislo como anticuerpo anti-oligodendrocito y es del subtipo IgG3 (Kuhlmann- Krieg, S., Sammer, 1. y Shachner M. (1988) Devel Brain Res 39:269-280). El anticuerpo 09 se une fuertemente y especlficamente a la sustancia blanda en el SNC. Los inventores han analizado y demostrado la capacidad del anticuerpo 09 para estimular la remielinizacion en el modelo de TMEV (datos no mostrados). La secuencia de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 09 se proporciona en la Figura 34 (SEC ID N° 17). La secuencia de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 09 se proporciona en la Figura 35 (SEC ID N° 19). La secuencia de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 09 se proporciona en la Figura 36 (SEC ID N° 21).

EJEMPLO 8

LOS MONOMEROS DE IgM INDUCEN REMIELINIZACION

Otro abordaje para descifrar la importancia de las caracterlsticas estructurales de los anticuerpos IgM para la induccion de remielinizacion es fraccionar el anticuerpo bioqulmicamente y evaluar la capacidad de los fragmentos de anticuerpo para inducir la remielinizacion in vivo. Una posibilidad es que los anticuerpos identificados tengan una afinidad baja por las estructuras del SNC, y, por tanto, la decavalencia de la IgM puede ser crucial para remielinizar la atividda porque los multiples sitios de union proporcionan suficiente avidez por los anticuerpos de modo que interaccionan con las estructuras diana en el SnC, Para abordar esta cuestion, los inventores han generado monomeros de IgM mediante reduccion de los puentes disulfuro que sujetan las moleculas de inmunoglobulina pentamerica. Los monomeros resultantes son divalentes. Los monomeros no se unen al os oligodendrocitos n vitro y no tinen secciones cerebrales en el patron observado con el anticuerpo nativo intacto. No obstante, los anticuerpos monomericos conservan la capacidad para inducir la remielinizacion (Tabla 6). Este fue un resultado sorprendente a la luz de la ausencia de tincion observada en nuestros ensayos in vitro. Una posibilidad es que los ensayos in vitro que controlan la union no son tan sensibles como el bioensayo de remielinizacion . Dado que hay una correlation tan fuerte entre la union y la induccion de remielinizacion, los inventores creen que la especificidad de estos anticuerpos por las estructuras del SNC es importante a pesar de nuestra incapacidad para seguir la union con los monomeros.

Tabla 6. Remielinizacion inducida por fragmentos monomer5icos de AcMo de IgM 94.023.

Tratamiento

% Remielinizacion Evaluation estadlstica

PBS (n=7)

6,74 (+/-1,80)

94,03 monomerico (n= 8)

17,32 (+/-2,67) P<0,01

94,03 pentamerico (N= 5)

18,1 (+/-5,76) P<0,01

Los anticuerpos IgM se redujeron en condiciones suaves y se alquilaron. Este tratamiento rompio la estructura pentamerica de los anticuerpos y permitio aislar los monomeros divalentes mediante cromatografla en columna. Ratones SJL/J cronicamente infectados recibieron un total de 0,5 mg de anticuerpo administrado ip dos veces a la semana durante el periodo de tratamiento de cinco semanas. Cinco semanas despues, los animales fueron perfundidos con agente de fijacion y las medulas espinales se extrajeron para analisis histologico. El porcentaje de area de remielinizacion se determino microscopicamente mediante comparacion de las lesiones remielinizadas y el area desmielinizado total como se indica en la Tabla 5. Los grupos de tratamiento individual se compararon con los animales que recibieron inyecciones de PBS en lugar de anticuerpo.

Ademas, el anticuerpo se fracciono generando (Fab')2 Fab, y fragmentos de Fv del anticuerpo. Ratones SJL infectados cronicamente con el virus de Theiler con estos fragmentos de anticuerpo para determinar si los fragmentos divalentes ausentes en la portion de Fc o fragmentos de anticuerpo monovalentes o de anticuerpos.

Un analisis paralelo del anticuerpo monoclonal humano sHIgM 22 se realiza para determinar si los fragmentos de anticuerpo de esta IgM humana se comportan de forma similar. Se puede determinar que un solo dominio de union pequeno puede inducir remielinizacion, esta information puede ser importante para determinar el

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mecanismo de reparacion, as! como para proporcionar una via para el desarrollo de un analogo farmacologico. EJEMPLO 9

EL ANTICUERPO sHIgM 46 INDUCE REPARACION DE LA MIELINA

Nuestros estudios iniciales sugieren que la induction de la reparacion de la mielina por sHIgM 46 puede ser cualitativamente superior a la reparacion observada con sHIgM 22. Tras el analisis histologico de las secciones de ratones SJL cronicamente infectados por TMEV, se observaron areas mas pequenas de desmielinizacion tras el tratamiento con sHIgM 46 que con otros anticuerpos monoclonales (Tabla 7). Esta observation fue altamente estadlsticamente significativa. Este resultado es notable por el tratamiento con el anticuerpos no comienza hasta que las lesiones desmielinizadas estan bien establecidas y han alcanzado un tamano maximo en animales infectados cronicamente. La interpretation de los inventores de este resultado es que la reparacion de la mielina es tan completa en algunas areas de la medula espinal que no se estan distinguiendo de areas normales de la medula durante nuestro analisis histologico estandar. Las lesiones en ratones tratados con sHIgM 46 se analizan mediante microscopia electronica para confirmar si las lesiones reparadas contienen numeros de envueltas de mielina mas altos que en otros grupos de tratamiento

Tabla 7. Diferencias cualitativas en la reparacion de la mielina por el anticuerpo humano sHIgM 46

Tratamiento

% de sustancia blanca desmielinizada Evaluation estadlstica

sHIgM46 (n=15)

4,07 (+/-2,52)

Los demas anticuerpos (n= 70)

10,41 (+/-6,26) P<0,001

Los ratones SJL/J cronicamente infectados con el virus de Theiler durante mas de 9 meses se dividieron en grupos y cada grupo individual recibio una unica inyeccion ip de 0,,5 mg de una de una baterla de anticuerpos monoclonales. Cinco semanas despues, los animales fueron perfundidos con agente de fijacion y las medulas espinales se aislaron para su analisis histologico. El area de desmielinizacion se determino midiendo el area total de la medula ocupada por sustancia blanca y el area de desmielinizacion visualizada mediante microscopia optica usando una optica de 25 X. Los datos estan compuestos por los de los ratones de tres experimentos independientes. Los anticuerpos usados para tratar a los animales en el grupo de tratamiento combinado (“todos los demas anticuerpos”) fueron IgM sHIgM 12,'14, 22, 47, 50, AKJR8, MSI 10E10, 2B2GE7, NA8FE4 monoclonales humanos, y los anticuerpos 06, 09, RIP, y MOG de raton. El conjunto de datos paso las pruebas de normalidad y se analizaron mediante ANOVA.

EJEMPLO 10

Se determinaron las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos humanos AKJR44, CB2iE12 y CB2iE7, y la region variable de la cadena ligera de MSI19E5. Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de AKJR4 se muestran en las Figuras 37 y 38, respectivamente (SEC ID N° 23 y 25). Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de CB2iE12 se muestran en las Figuras 39 y 40, respectivamente (SEC ID N° 27 y 29). Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de CB2iE7 se muestran en las Figuras 41 y 42, respectivamente (SEC ID N° 31 y 33. La secuencia de la region variable de la cadena ligera de MSII9E5 se muestra en la Figura 43, respectivamente (SEC ID N° 35).

LISTADO DE SECUENCIAS -CORRECCION

<110> MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION AND RESEARCH

<120> ANTICUERPOS IGM HUMANOS Y USOS DIAGNOSTICOS Y TERAPEUTICOS DE LOS MISMOS PARTICULARMENTE EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

<130> P055698EP <140> EP 00948498.1 <141 > 2000-05-30

<160> 50

<170> PatentIn Ver. 2.0

<210> 1 <211> 119 <212> PRT

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<213> Homo sapiens

<400> 1 Gin 1

Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Val Val Gin Pro Gly Arg 15

Ser

Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30

Ser

Ser

Gly

Met His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val

Ala

Val 50 lie Ser Tyr Asp Gly 55 Ser Arg Lys Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val

Lys 65

Gly Arg Phe Thr He 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80

Leu

Gin Met Asn Ser 85 Leu Thr Ala Asp Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys

Ala

Lys Gly Val 100 Thr Gly Ser Pro Thr 105 Leu Asp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly

Thr

Leu Val 115 Thr Val Ser Ser

<210>2 <211>357 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400>2

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagaggtg 300

actgctattc cctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210>3 <211>357 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400>3

caggtgcagc tggtggagtc tggggggggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctctggca tgcactgggt ccgccaagct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttcatatg atggaagtag gaaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa cactctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgac ggctgacgac acggctgtgt attattgtgc gaaaggagtg 300

actggtagtc cgacgcttga ctactggggc cagggagccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210>4 <211>357 <212> ADN <213> Homo sapiens

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caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctctggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaatc atttcatatg atggaagtac gaaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa cactctctat 240

ctgcaaatga acagcctgac agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggagtg 300

actggtagtc cgacgcttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcg 357

<210>5 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>5

Gin Ser 1

Lys Val

Phe Val

lie Tyr 50

Gly Ser 65

Thr Gly

Ser Ala

Pro Lys

<210>6 <211>337 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400>6

cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgtg tggtattcgg 300 cggagggacc aagctgaccg tcctaggtca gcccaag 337

Val

Leu Thr 5 Gin Pro Pro Ser

Thr

He 20 Ser Cys Ser Gly Ser 25

Ser 35

Trp Tyr Gin Gin Leu 40 Pro

Asp

lie Thr Lys Arg 55 Pro Ser

Lys

Ser Gly Thr 70 Ser Ala Thr

Asp

Glu Ala 85 Asp Tyr Tyr Cys

Val

Val 100 Phe Gly Gly Gly Thr 105

Val 10

Ser Ala Ala Pro Gly 15 Gin

Ser

Ser

Asn lie Gly 30 Asn Asn

Gly

Thr Ala Pro 45 Arg Leu Leu

Gly

He Pro 60 Asp Arg Phe Ser

Leu

Gly 75 lie Thr Gly Leu Gin 80

Gly 90

Thr Trp Asp Ser Ser 95 Leu

Lys

Leu Thr Val Leu HQ Gly Gin

<210>7 <211>342 <212> ADN <213> Homo sapiens

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20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

cagtctgtgt

tcctgctctg

ccaggaacag

gaccgattct

actggggacg

ttcggcgggg

tgacggagcc

gaagcagctc

cccccagact

ctggctccaa

aggccgatta

ggaccaagct

gccttcagtg

caacattggc

cctcatttat

gtctggcacg

ttactgcgga

gaccgtccta

tctgctgccc

aataattttg

gacattacta

tcagccaccc

acatgggata

ggtcagccca

caggacagaa

tatcctggta

agcgaccctc

tgggcatcac

gcagcctgag

ag

<210>8 <211>342 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400>8

cagtctgtgt

tcctgctctg

ccaggaacag

gaccgattct

actggggacg

ttcggcgggg

tgacggagcc

gaagcagctc

cccccaaact

ctggctccaa

aggccgatta

ggaccaagct

gccttcagtg

caacattggc

cctcatttat

gtctggcacg

ttactgcgaa

gaccgtccta

tctgctgccc

aataattttg

gacattacta

tcagccaccc

acatgggata

ggtcagccca

caggacagaa

tatcctggta

agcgaccctc

tgggcatcac

gcagcctgag

ag

<210>9 <211>121 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400>9

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 1 5 10

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie 20 25 " ”

Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro ~ 50 55 60

Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin 65 70 75

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 90

Arg Ser Ala Gin Gin Gin Leu Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr 100 105

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 115 120

<210> 10 <211> 370 <212> ADN <213> Homo sapiens

ggtcaccatc 60 ccagcaactc 120 agggattcct 180 cggactccag 240 tgctgtggta 300 342

ggtcaccatc 60 ccagcaactc 120 agggattcct 180 cggactccag 240 tgctgtggta 300 342

Pro

Ser 15 Glu

Ser 30

Ser Tyr

Glu

Trp He

Ser

Leu Lys

Phe

Ser Leu 80

Tyr

Cys 95 Ala

Trp 110

Gly Gin

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

caggtgcagc

acctgcactg

ccagggaagg

ccctccctca

ctgaagctga

gcacagcagc

ctcctcaggg

tgcaggagtc

tctctggtgg

gactggagtg

agagtcgagt

gctctgtgac

agctggtata

gggcccagga

ctccatcagt

gattgggtat

caccatatca

cgctgcggac

ctacdtttga

ctggtgaagc

agttactact

atctattaca

gtagacacgt

acggccabcg

ctactggggc

cttcggagac

ggagctggat

gtgggagcac

ccaagaacab

tgtattactg

cagggaaccc

<210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 11

Asp 1

lie Val Met Thr 5 Gin

Glu

Arg Ala Thr 20 lie Asn

Ser

Asn Asn 35 Lys Asn Tyr

Pro

Pro 50 Lys Leu Leu lie

Pro 65

Asp Arg Phe Ser Gly 70

He

Ser Ser Leu Gin 85 Ala

Tyr

Tyr

Ser Thr 100 Pro Leu

Lys

Arg Thr 115 Val Ala Ala

<210> 12 <211> 357 <212> ADN <213> Homo sapiens

Ser

Pro Asp Ser 10 Leu Ala Val

Cys

Lys Ser 25 Ser Gin Ser Val

Leu

Ala 40 Trp Tyr Gin Gin Lys 45

Tyr 55

Trp Ala Ser Thr Arg 60 Glu

Ser

Gly Ser Gly Thr 75 Asp Phe

Glu

Asp Val Ala 90 Val Tyr Tyr

Thr Pro

Phe Gly 105 Pro Gly Thr Lys

<400> 12

gacatcgtga

atcaactgca

tggtaccagc

gaatccgggg

atcagcagcc

cctctcactt

tgacccagtc

agtccagcca

agaaaccagg

tccctgaccg

tgcaggctga

tcggccctgg

tccagactcc

gagtgtttta

acagcctcct

attcagtggc

agatgtggca

gaccaaagtg

ctggctgtgt

tacagctcca

aagctgctca

agcgggtctg

gtttattact

gatatcaaac

ctctgggcga

acaataagaa

tttactgggc

ggacagattt

gtcagcaata

gaactgtggc

cctgtccctc 60 ccggcagccc 120 caactacaac 180 ccagttctcc 240 tgcgaggtcg 300 tggtcaccgt 360 370

Ser Leu Gly 15

Leu Tyr Ser 30

Pro Gly Gin

Ser Gly Val

Thr Leu Thr 80

Cys Gin Gin “ 95

Val Asp lie 110 '

gagggccacc 60 ctacttagct 120 atctacccgg 180 cactctcacc 240 ttatagtact 300 tgcacca 357

<210> 13 <211>122 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> no seguro <222> 1-10

<223> "Xaa"s en la secuencia representan aminoacidos desconocidos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Xaa 1

Xaa Xaa Xaa Xaa 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 10 Ala Val Val Gin Pro 15 Gly

Arg

Ser Leu Arg 20 Leu Ser Cys Ala Ala 25 Ser Gly Phe lie Phe 30 Ser Ser

Tyr

Gly Met 35 His Trp Val Arg Gin 40 Val Pro Gly Lys Gly 45 Leu Glu Trp

Val

Ala 50 Val He Trp Tyr Asp 55 Gly Ser Asp Lys Tyr 60 Tyr Val Asp Ser

Val 65

Lys Gly Arg Phe Thr 70 lie Ser Arg Asp Asn 75 Ser Lys Asn Thr Leu 80

Tyr

Leu Gin Met Asn 85 Ser Leu Arg Ala Glu 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95

Tyr

Cys

Ala Arg Asp 100 Arg Ser Ser Gly Trp 105 Tyr Trp Ser Cys Asp 110 Ser Trp

Gly

Gin Gly 115 Thr Leu Val lie Val 120 Ser Ser

<210> 14 <211> 366 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> no seguro <222> 1-25

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocido.

<220>

<221> no seguro <222> 28-30

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocido.

<400> 14

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnagnnn gccgtggtcc agcctgggag gtccctgaga 60

ctctcctgtg cagcgtctgg attcattttc agtagctatg gcatgcactg ggtccgccag 120

gttccaggca aggggctgga gtgggtggca gttatatggt atgatggaag tgataaatac 180

tatgtagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaattctaa aaacacgctc 240

tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggctg tgtattactg tgcgagagat 300

cgcagcagtg gctggtactg gtcctgcgac tcctggggcc agggaaccct ggtcattgtc 360

tcctca 366

<210> 15 <211>127 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> no seguro <222> 1-8

<223> Todas las "Xaa"s en la secuencia representan aminoacidos desconocidos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<221> no seguro <222> 10

<223> Todas las "Xaa"s en la secuencia representan aminoacidos desconocidos. <220>

<221> no seguro <222> 127

<223> Todas las "Xaa"s en la secuencia representan aminoacidos desconocidos. <400> 15

Xaa 1

Xaa Xaa Xaa Xaa 5 Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 10 Leu Ser Gly Ser Pro 15 Gly

Gin

Ser He Thr 20 lie Ser Cys Thr Gly 25 Thr Ser Ser Asp Val 30 Gly Gly

Tyr

Asn Tyr 35 Val Ser Trp Tyr Gin 40 Gin His Pro Gly Lys 45 Ala Pro Lys

Leu

Met 50 lie Tyr Asp Val Ser 55 Asp Arg Pro Ser Gly 60 Val Ser Asn Arg

Phe 65

Ser Gly Ser Lys Ser 70 Gly Asn Thr Ala Ser 75 Leu Thr lie Ser Gly 80

Leu

Gin Ala Glu Asp 85 Glu Ala Asp Tyr Tyr 90 Cys Ser Ser Tyr Thr 95 Ser

Ser

Ser

Ser

Val 100 Val Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Leu Thr Val 110 Leu Gly

Gin

Pro Lys 115 Ala Ala Pro Ser Val 120 Thr Leu Phe Pro Pro 125 Pro Xaa

<210> 16 <211> 382 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> no seguro <222> 1-19

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos. <220>

<221> no seguro <222> 22

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos. <220>

<221> no seguro <222> 28-30

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos. <220>

<221> no seguro <222> 380

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos. <400> 16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tngcctcnnn ctgtctgggt ctcctggaca gtcgatcacc 60

atctccctga ctggaaccag cagtgacgtt ggtggttata actatgtctc ctggtaccaa 120

cagcacccag gcaaagcccc caaactcatg atttatgatg tcagtgatcg gccctcaggg 180

gtttctaatc gcttctctgg ctccaagtct ggcaacacgg cctccctgac catctctggg 240

ctccaggctg aggacgaggc tgattattac tgcagctcat atacaagcag cagctctgtg 300

gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctgttcc cgcctccaan gg 382

<210> 17 <211>120 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 17

Gin 1

Asp His Leu Gin 5 Gin Ser Gly Pro Glu 10 Leu Val Lys Pro Gly Ala 15

Phe

Val Lys lie 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Asn Tyr

Asp

Leu Asn 35 Trp Val Arg Gin Arg 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp lie

Gly

Trp 50 He Tyr Pro Gly Asn 55 Asp Asn Thr Lys Tyr 60 Asn Glu Lys Phe

Lys 65

Gly Leu Ala Ser Leu 70 Thr Ala Asp Lys Ser 75 Ser Thr Thr Ala Tyr 80

Leu

His Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Ser 90 Ser Ala Val Tyr Phe 95 Cys

Ala

Arg Gly Leu 100 Pro Arg Gly Trp Tyr 105 Phe Asp Val Trp Gly 110 Ala Gly

Thr

Thr

Val 115 Thr Val Ser Ser Ala 120

<210> 18 <211> 360 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 18

caggatcacc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttt tgtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta caccttcaca aactacgatc taaactgggt gaggcagagg 120

cctggacagg gccttgagtg gattggatgg atttatcctg gaaatgataa tactaagtac 180

aatgagaagt tcaagggcct ggcctcactg actgcagaca agtcctccac cacagcctac 240

ttgcatctca gcagcctgac ttctgagagc tctgcagtct atttctgtgc aagagggtta 300

cctaggggct ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctcagct 360

<210> 19 <211> 101 <212> PRT <213> Mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Asn 1

He Val Met Thr 5 Gin Ser Pro Lys Ser 10 Met Ser Met Ser Val 15 Gly

Glu

Arg Val Thr 20 Leu Thr Cys Lys Ala 25 Ser Glu Asn Val Val 30 Thr Tyr

Val

Ser Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Glu Gin Ser Pro Lys 45 Leu Leu lie

Tyr

Gly 50 Ala Ser Asn Arg Tyr 55 Thr Gly Val Pro Asp 60 Arg Phe Thr Gly

Ser 65

Gly Ser Ala Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr He 75 Ser Ser Val Gin Ala 80

Glu

Asp Leu Ala Asp 85 Tyr His Cys Gly Gin 90 Gly Tyr Ser Tyr Pro 95 Tyr

Thr

Phe Gly Gly 100 Gly

<210> 20 <211> 303 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 20

aacattgtaa

ttgacctgca

gagcagtctc

cgcttcacag

gaagaccttg

ggg

tgacccaatc

aggccagtga

ctaaactgct

gcagtggatc

cagattatca

tcccaaatcc

gaatgtggtt

gatatacggg

tgcaacagat

ctgtggacag

atgtccatgt

acttatgttt

gcatccaacc

ttcactctga

ggttacagct

cagtaggaga

cctggtatca

ggtacactgg

ccatcagcag

atccgtacac

gagggtcacc

acagaaacca

ggtccccgat

tgtgcaggct

gttcggaggg

<210> 21 <211> 101 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 21

Asp 1

Val Gin lie Thr 5 Gin Ser Pro Ser Tyr 10 Leu Ala Ala Phe Pro 15 Gly

Glu

Thr lie Thr 20 lie Asn Cys Arg Ala 25 Ser Lys Ser lie Ser 30 Lys Tyr

Leu

Ala Trp 35 Tyr Gin Glu Arg Pro 40 Gly Lys Thr Asn Lys 45 Leu Leu lie

Tyr

Ser 50 Gly Ser Thr Leu Gin 55 Ser Gly He Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly

Ser 65

Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr He 75 Ser Ser Leu Glu Pro 80

Glu

Asp Phe Ala Met 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 His Asn Glu Tyr Pro 95 Tyr

Thr

Phe Gly Gly 100 Gly

60

120

180

240

300

303

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 22 <211> 303 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 22

gatgtccaga taacccagtc tccatcttat cttgctgcat ttcctggaga aaccattact 60

attaattgta gggcaagtaa gagcattagt aaatatttag cctggtatca agagagacct 120

ggaaaaacta ataagcttct tatctactct ggatccactt tgcaatctgg aattccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct 240

gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgaat acccgtatac gttcggaggg 300

ggg 303

<210> 23 <211>124 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 23

Glu

Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

1

5 10 15

Ser

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe lie Asp Tyr

20 25 30

Ala

Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser

Ser

Leu Ser Gly Asp Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys

Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Phe

65

70 75 80

Leu

Gin Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala

Gin Glu Thr Gly Pro Gin Arg Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr

Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu

115 120

<210> 24 <211>372 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 24

gaggtgcaac tattggaatc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cagctttatc gactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gactggagtg ggtctcaagt cttagtggtg atagtggtag ttcatattat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagag cacggtgttt 240

ctgcaactga gcagcctgag agccgaggac acggccatat attactgtgc gcaggagacc 300

ggtccccagc gtcgctgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagg gagtgcatcc 360

gccccaaccc tt 372

<210> 25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 25

Asp lie Gin Met. The GLn See Pea See The Leu See Ala Ser Val Gly

15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Trp

” " 20 25 30 ^

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie

35 40 45

Tyr Lys Ala Phe Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 ’

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro

65 70 75 80

Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp lie Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe

115

<210> 26 <211>348 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 26

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatetataag gcgtttaatt tagaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagag gcagtggctc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgattetg caacttatta ctgccagcag tatagtagtt accccctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggacattaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttc 348

<210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> no seguro <222> 1-8

<223> Todas las "Xaa"s en la secuencia representan aminoacidos desconocidos.

<220>

<221> no seguro <222> 10-13

<223> Todas las "Xaa"s en la secuencia representan aminoacidos desconocidos.

<220>

<221> no seguro <222> 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<223> Todas las "Xaa"s en la secuencia representan aminoacidos desconocidos. <400> 27

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Glu

15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly

20 25 30

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp

" 35 40 45

Met Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys

50 55 60

Phe Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala 65 70 75 80

Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

“ 85 90 95 ”

Cys Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Pro Gly Arg Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 115

<210> 28 <211>357 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> no seguro <222> 1-22

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos.

<220>

<221> no seguro <222> 28-31

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos.

<220>

<221> no seguro <222> 34

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos.

<220>

<221> no seguro <222> 36

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos.

<220>

<221> no seguro <222> 38

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos.

<220>

<221> no seguro <222> 43

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos.

<400> 28

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnccaggnnn nagnananga aancggaggc ctcagtgaag 60

gtctcctgca aggcttctgg atacaccttc accggctact atatgcactg ggtgcgacag 120

gcccctggac aagggcttga gtggatggga tggatcaacc ctaacagtgg tggcacaaac 180

tatgcacaga agtttcaggg cagggtcacc atgaccaggg acacgtccat cagcacagcc 240

tacatggagc tgagcaggct gagatctgac gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300

cgatcgtatc cgggaaggaa ctactttgac tactggggcc agggaaccct ggtcacc 357

<210> 29 <211>101 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 29

Glu 1

lie Val Leu Thr 5 Gin

Glu

Arg Ala Thr 20 Leu Ser

Tyr

Leu Ala 35 Trp Tyr Gin

He

Tyr 50 Gly Ala Ser Ser

Gly 65

Ser Gly Ser Gly Thr 70

Pro

Glu Asp Phe Ala 85 Val

Thr

Phe Gly Gin 100 Gly

Ser

Pro Gly Thr 10 Leu

Ser

Cys

Arg Ala 25 Ser Gin Ser

Gin

Lys 40 Pro Gly Gin Ala

Arg 55

Ala Thr Gly He Pro 60

Asp

Phe Thr Leu Thr 75 lie

Tyr

Tyr

Cys Gin 90 Gin

Tyr

Leu Ser Pro Gly 15

Val Ser Ser Ser 30

Pro Arg Leu Leu 45

Asp Arg Phe Ser

Ser Arg Leu Glu 80

Gly Ser Ser His " 95

<210> 30 <211>303 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 30

60 120 180 240 300 303

gaaattgtgt tgacgcagtc ctctcctgca gggccagtca cctggccagg ctcccaggct gacaggttca gtggcagtgg cctgaagatt ttgcagtgta

ggg

tccaggcacc ctgtctttgt gagtgttagc agcagctact cctcatctat ggtgcatcca gtctgggaca gacttcactc ttactgtcag cagtatggta

ctccagggga aagagccacc tagcctggta ccagcagaaa gcagggccac tggcatccca tcaccatcag cagactggag gctctcacac ttttggccag

<210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> no seguro <222> 1-10

<223> Todas las "Xaa"s en la secuencia representan aminoacidos desconocidos. <400> 31

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Gly Leu Val Lys Pro Gly

1

5 10 15

Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp

20 25 30

Tyr

Tyr

Met Ser Trp He Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

imagen1

Val

Ser 50 Tyr He Ser Ser Ser 55 Ser

Val 65

Lys Gly Arg Phe Thr 70 lie Ser

Tyr

Leu Gin Met Asn 85 Ser Leu Arg

Cys

Ala Arg Asp 100 Arg Ser Ser Ser

Met

Asp Val Trp Gly Gin Gly

Ser

Tyr Thr Asn 60 Tyr Ala Asp

Ser

Arg

Asp Asn 75 Ala Lys Asn Ser Leu 80

Ala

Glu 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 Tyr

Ser 105

Trp Tyr Tyr Tyr Tyr 110 Tyr Gly

115

<210> 32 <211> 357 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> no seguro <222> 1-25

<223> Todas las "n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos. <220>

<221> no seguro <222> 28-30

<223> Todas las "'n"s en la secuencia representan nucleotido desconocidos. <400> 32

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngannn ggcttggtca agcctggagg gtccctgaga 60

ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttc agtgactact acatgagctg gatccgccag 120

gctccaggga aggggctgga gtgggtttca tacattagta gtagtagtag ttacacaaac 180

tacgcagact ctgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaactcactg 240

tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggctg tgtattactg tgcgagagat 300

cggtcgagca gcagctggta ctactactac tacggtatgg acgtctgggg ccaaggg 357

<210> 33 <211>102 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 33

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Asp 1

He Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu

Asp

Arg Val Thr 20 lie Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin

Leu

Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Val

Tyr

Ala 50 Ala Ser Thr Leu Gin 55 Ser Gly Val Pro

Ser 65

Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr He 75

Glu

Asp Val Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Lys 90 Tyr

Ser

Ala

Ser

Gly

lie Ser 30

Pro

Lys 45 Leu

Ser 60

Arg Phe

Ser

Ser

Leu

Asn

Lys Cys

imagen2

Val Gly 15

Asn Tyr

Leu lie

Asn Gly

Gin Pro 80

Pro Ser 95

<210> 34 <211> 306 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 34

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagttc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180

cggttcaatg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaacct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaag tataacaagt gcccctctca ctttcggggg 300

agggac 306

<210> 35 <211>105 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 35

Asp 1

lie Ala Met Thr 5 Gin Ser Pro Asp Ser 10 Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly

Glu

Arg Ala Thr 20 lie Asn Cys Lys Ser 25 Ser Arg Ser Val Leu 30 Phe Ser

Ser

Asn Asn 35 Asn Asn Tyr Leu Ala 40 Trp Tyr Gin Gin Lys 45 Pro Gly Gin

Pro

Pro 50 Lys Leu Leu lie Tyr 55 Trp Ala Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Val

Pro 65

Asp Arg Phe Ser Gly 70 Ser Gly Ser Gly Thr 75 Asp Phe Thr Leu Thr 80

lie

Ser Ser Leu Gin 85 Ala Glu Asp Val Ala 90 Val Tyr Tyr Cys Gin 95 Gin

Tyr

Tyr

Ser Thr 100 Pro lie Thr Phe Gly 105

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 36 <211> 315 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 36

gacatcgcga tgacccagtc tccagactcc ctggcagtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcaactgca agtccagccg gagtgtttta ttcagctcca acaataacaa ctacttagct 120

tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctactca tttactgggc atctacccgg 180

gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300

ccaatcacct tcggc 315

<210> 37 <211> 101 <212> PRT <213> Mus musculus

<4Q0> 37 Asp lie Val 1

Met Thr 5 Gin Ser His Lys Phe 10 Met Ser Thr Ser Val 15 Gly

Asp

Arg Val Ser 20 He Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gin Asp Val Ser 30 Thr Ala

Val

Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Gin Ser Pro Lys 45 Leu Leu lie

Tyr

Ser 50 Ala Ser Tyr Arg Tyr 55 Thr Gly Val Pro Asp 60 Arg Phe Thr Gly

Ser 65

Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Phe Thr lie 75 Ser Ser Val Gin Ala 80

Glu

Asp Leu Ala Val 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 His Tyr Thr Thr Pro 95 Leu

Thr

Phe Gly Ala Gly

100

<210> 38 <211>303 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 38

gacatcgtaa tgacgcagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta ctccgctcac gttcggtgct 300

ggg 303

<210> 39 <211> 78 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: Cebador. <400> 39

actcccaagt cggctcgctt tctcttcagt gacaaacaca gacatagaac attcaccatg 60 ggatggagct gtatcact 78

<210> 40 <211> 47 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: Cebador.

<400> 40

actgactctc ttaattaaga ctcacctgag gagactgtga gagtggt 47

<210> 41 <211> 48 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: Cebador.

<400> 41

ttggcgcgcc aaagactcag cctggacatg atgtcctctg ctcagttc 48

<210> 42 <211> 43 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: Cebador.

<400> 42

atagtttagc ggccgcattc ttatctaaca ctctcccctg ttg 43

<210> 43 <211>155 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: Cebador.

<400> 43

gactcggtcc gcccagccac tggaagtcgc cggtgtttcc attcggtgat catcactgaa 60 cacagaggac tcaccatgga gtttgggctg agctgggttt tcctcgttgc tcttttaaga 120 ggtgtccagt gtcaggtgca gctggtggag tctgg 155

<210> 44 <211> 56 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: Cebador.

<400> 44

ccttaattaa gacctggaga ggccattctt acctgaggag acggtgacca gggttc 56

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 45 <211> 36 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: Cebador. <400> 45

ctagctagcg tcctaggtca gcccaaggct gccccc 36

<210> 46 <211> 36 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: Cebador. <400> 46

atagtttagc ggccgcacct atgaacattc tgtagg 36

<210> 47 <211> 111 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: Cebador. <400> 47

ctagctagcc cgaatttcgg gacaatcttc cttctcattc actgcacagg gtcctgggcc

<210> 48 <211> 32 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: Cebador. <400> 48

gggcagcctt gggctgagct aggacggtca gc 32

<210> 49 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 49

atcatgacct gctcccctct cctcctcacc 60 cagtctgtgt tgacgcagcc g 111

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Gin 1

Val Gin Leu Val 5 Glu

Ser

Leu Arg Leu 20 Ser Cys

Gly

Met His 35 Trp Val Arg

Ala

He 50 lie Ser Tyr Asp

Lys 65

Gly Arg Phe Thr He 70

Leu

Gin Met Asn Ser 85

Leu

Ala

Lys Gly Val 100 Thr Gly

Thr

Leu Val 115 Thr Val Ser

<210> 50 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 50

Gin Ser Val Leu Thr Gin 1 5

Lys Val Thr lie Ser Cys

* 20

Phe Val Ser Trp Tyr Gin

35

lie Tyr Asp lie Thr Lys 50 "

Gly Ser Lys Ser Gly Thr 65 70

Thr Gly Asp Glu Ala Asp ’ 85 ^

Ser Ala Val Val Phe Gly 100

Pro Lys

Ser Gly Gly Gly * 10

Ala Ala Ser Gly

25

Gin Ala Pro Gly 40

Gly Ser Arg Lys 55

Ser Arg Asp Asn

Thr Ala Glu Asp 90

Ser Pro Thr Leu 105

Ser

Pro Pro Ser Val 10

Ser Gly Ser Ser 25

Gin Leu Pro Gly 40

Arg Pro Ser Gly 55

Ser Ala Thr Leu

Tyr Tyr Cys Glu “ ' 90

Gly Gly Thr Lys 105

Val

Val

Gin Pro Gly Arg 15

Phe

Thr Phe Ser 30 Ser Ser

Lys

Gly Leu 45 Glu Trp Val

Tyr

Tyr 60 Ala Asp Ser Val

Ser 75

Lys Asn Thr Leu Tyr 80

Thr

Ala Val Tyr Tyr 95 Cys

Asp

Tyr Trp Gly 110 Gin Gly

Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15

Ser Asn lie Gly Asn Asn 30

Thr Ala Pro Lys Leu Leu 45

lie Pro Asp Arg Phe Ser 60

Gly lie Thr Gly Leu Gin 75 80

Thr Trp Asp Ser Ser Leu ^ 95

Leu Thr Val Leu Gly Gin 110 ”

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   Reivindicaciones

   1. Un anticuerpo humano, o una mezcla, monomero o fragmento activo del mismo que tiene:

   (i) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de la region CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 39, y un domino variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de la region CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 40.

   (ii) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de la region CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 41, y un domino variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de la region CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en la Figura 42.
2. 2. Un anticuerpo humano, o una mezcla, monomero o fragmento activo del mismo que tiene:

   (i) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de CB2iE12 como se expone en la Figura 39, y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de cB2iE12 como se expone en la Figura 40; o

   (ii) un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de CB2iE7702 como se expone en la Figura 41, y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de cB2iE7como se expone en la Figura 42.
3. 3. Una composition farmaceutica que comprende, como el ingrediente activo, un anticuerpo humano, o una mezcla, monomero o fragmento activo del mismo, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.
4. 4. Un agente neuromodulador que comprende un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que funciona para promover el sobrecrecimiento, regeneration o remielinizacion de neuritas.
5. 5. Una secuencia de acidos nucleicos aislada o una variante degenerada de la misma, que codifica un anticuerpo humano, un fragmento activo del mismo, o un monomero, o un anticuerpo sintetico derivado del mismo, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.
6. 6. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 5.
7. 7. Un sistema vector del huesped para la production de un polipeptido que comprende el vector de la reivindicacion 6 en una celula huesped adecuada.
8. 8. Un procedimiento para obtener un polipeptido en forma purificada que comprende:

   (i) cultivar un sistema vector del huesped de la reivindicacion 7 para producir un polipeptido;

   (ii) recuperar el polipeptido producido en el paso (i); y

   (iii) purificar el polipeptido recuperado en el paso (ii).
9. 9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para su uso en prevenir y/o tratar debilitaciones, trastornos, disfunciones celulares y/o estado de enfermedad en mamlferos incluyendo humanos, opcionalmente en el que las debilitaciones, trastornos, disfunciones celulares y/o estados de enfermedad son condiciones del SNC donde los nervios estan danados por traumas o una enfermedad desmielinizante vlrica, o una enfermedad postneural del sistema nervioso central.
10. 10. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que es monoclonal.

    FIG. 1A FIG. 1B

    imagen1

    FIG. 1C

    FIG. 1D

    imagen2

    FIG. 1E FIG. 1F

    imagen3