JP5670608B2 - 髄鞘再形成を誘導する能力を有するヒトＩｇＭ抗体、および、特に中枢神経系における、その診断使用及び治療使用 - Google Patents

髄鞘再形成を誘導する能力を有するヒトＩｇＭ抗体、および、特に中枢神経系における、その診断使用及び治療使用 Download PDF

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Description

本明細書に記載された発明は国立健康協会、援助金NS-24180及び国立多発性硬化症協会援助金RG-1878-B-2により全部又は一部支持された。米国政府は本発明に或る種の権利を有する。
発明の分野
本発明は一般に神経生物学の分野、更に特別には中枢神経系機能及び治療に役割を果たす自己抗体の同定に関する。また、本発明は、例として、医薬組成物、神経損傷と関連する疾患の治療方法、神経機能の再生方法及び回復方法、スクリーニングアッセイ並びにワクチンを含む、診断及び治療の物質及び方法に関する。
発明の背景
多発性硬化症(MS)は、初期の軸索損傷を通常生じない、原発性髄鞘脱落を病理学上特徴とする慢性の、頻繁に進行性の、炎症性中枢神経系(CNS)疾患である。MSの病因及び病原は知られていない。MSの幾つかの免疫学的特徴、及び或る種の主要組織適合性複合体対立遺伝子とのその適度の関連は、MSが免疫介在性疾患であるという推論を促していた。
自己免疫仮説は実験自己免疫（アレルギー性）脳脊髄炎(EAE)モデルにより支持され、この場合、遺伝的感受性動物への或る種のミエリン成分の注射がＴ細胞介在性CNS髄鞘脱落をもたらす。しかしながら、特異性自己抗原及び病的ミエリン反応性Ｔ細胞はMS患者のCNS中で明確には同定されておらず、又はMSはその他の自己免疫疾患を伴っていない。疫学的データに基づく、別の仮説は、環境因子、おそらく未同定ウイルスがCNS中の炎症反応に関与し、これが、おそらくは誘導された自己免疫成分と共に、直接又は間接の（“バイスタンダー”）ミエリン破壊をもたらす。この仮説はヒト及び動物の両方における幾つかの天然に生じるウイルス感染症が髄鞘脱落を生じ得るという証拠により支持される。一つの普通に利用される実験ウイルスモデルがマウス脳脊髄炎サイラーウイルス(TMEV)により誘導される（Dal Canto, M.C.及びLipton, H.L., Am. J. Path., 88:497-500 (1977)）。
MS及びその他の髄鞘脱落疾患の現行の治療効力に限界があることがこれらの疾患を改善するための新規治療の関心を刺激した。しかしながら、おそらくは環境因子及び自己免疫因子の両方を伴う、これらの疾患の明らかに複雑な病因のために、これらの髄鞘脱落障害の有効な治療に対する要望が依然として存する。
上記の先の関連特許出願において、中枢神経系中で活性を示すことが判明され、また髄鞘再形成の刺激と特に関連した自己抗体のグループが同定された。出願人らの目的の一つは抗体の活性の全範囲を研究すると同時に、このような活性を示すクラスのその他のメンバーを同定することであった。それ故、本発明が誘導されるのは以上の目的及びその他の目的の達成に関連する。
本明細書中の文献の引用はこれらの文献が本件出願の“従来技術”として利用し得ることを認めたものと見なされるべきではない。
発明の概要
本発明の第一局面において、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む、ヒト自己抗体が同定され、単離され、これらは中枢神経系中の神経細胞の促進、刺激、再生及び／又は髄鞘再形成に活性を示す。具体的な抗体が同定され、本明細書中で試験され、それ故、本発明はヒト自己抗体に及び、これらのヒト自己抗体はsHIgM22 (LIM 22)、sHIgM46、ebvHIgM MSI19D10及びCB2bG8により例示される。加えて、ヒト抗体は更にAKJR4、CB2iE12、CB2iE7及びMSI19E5により例示される。また、本発明は別の局面において、同様の治療活性を示し得るその他の抗体及び関連結合パートナー（ハプテン及びペプチド類似体を含む）のスクリーニングのためのアッセイを提供する。このような活性は神経損傷又は機能不全、例えば、多発性硬化症、ALS、卒中、パーキンソン病及びアルツハイマー病の治療又は予防を含むであろう。
本発明は別の局面において哺乳類の中枢神経系軸索の再生又は髄鞘再形成の促進又は刺激に関する。詳しくは、本発明はIgMサブタイプの抗体及びこれらのモノマー、特にヒト自己抗体、又はこれらの混合物及び／又は活性フラグメントを含む、自己抗体を使用する中枢神経系(CNS)軸索の髄鞘再形成の刺激方法に関するものであり、それらが中枢神経系中の構造及び細胞に結合することができることを特徴とする。また、本発明はヒト自己抗体の調製及び使用に及び、これらのヒト自己抗体はsHIgM22 (LIM 22)、sHIgM46、ebvHIgM MSI19D10及びCB2bG8により例示される。また、本発明はAKJR4、CB2iE12、CB2iE7及びMSI19E5により例示されるヒト自己抗体の調製及び使用に及ぶ。例示抗体のＨ鎖及びＬ鎖可変領域配列が以下のように図面に示される。LYM22が図17及び18（配列番号１、５、49及び50）に示され、MSI19D10が図19及び20（配列番号９及び11）に示され、CB2bG8が図27及び28（配列番号13及び15）に示され、AKJR4が図37及び38（配列番号23及び25）に示され、CB2iE12が図39及び40（配列番号27及び29）に示され、CB2iE７が図41及び42（配列番号31及び33）に示され、またMSI19E5のＬ鎖が図43（配列番号35）に示される。本発明は抗体及び相当する抗体タンパク質、並びに注目された図面に示された配列を有し、又は少なくともその一部に相当する小分子、例えば、ハプテンに及ぶ。
本発明はIg可変領域cDNA及び本明細書に記載された方法におけるそれらの実用性を確かめるためのこれらのmAbの、中枢神経系中の構造及び細胞（オリゴデンドロサイトを含むが、これらに限定されない）を結合する能力の分析を利用する。更に、この研究は自己抗体のこのグループが中枢神経系の髄鞘再形成を生じるのに有効であるとしてその一般的な有用性を確認するものである。
本発明の更なる実施態様によれば、また上記のように、抗体の広いクラスが同定され、本明細書に開示される。詳しくは、神経組織に関する一層大きいアフィニティー並びに診断能力及び治療能力の両方を与える、ヒトポリクローナル自己抗体及びモノクローナル自己抗体がまた開示され、それに従って調製される。更に、本発明は新たに同定された抗体が種々の目的、例えば、髄鞘再形成の促進、損傷された神経細胞の再生、神経細胞の保護、神経細胞外殖等に使用し得ることに及ぶ。
本発明の有意な特徴及び利点は抗体の起源にある。何とならば、それらが宿主又は患者から直接得て、一層安全な自己治療を促進するのに使用し得るからである。更に広範には、これらの内因性物質に基づいた合成抗体、組換え抗体、ペプチド、小分子等の開発の開発は、自己免疫反応のようなあり得る病因又は機能不全を、in vivo導入及び外来性物質の使用の結果として、排除しないとしても軽減するであろう。また、抗体が内因性起原であることは患者又は宿主中の修復プロセスを研究し、疾病の治療における作用の基礎となるメカニズムを潜在的に同定することが可能であり得ること、それ自体が更なる治療識見及び戦略を生じ得ることの点で更なる利点を与える。
更に、オリゴデンドロサイ(oligodendrocyte)における、Ca++ピークの誘導によるような、カルシウムシグナリングを促進する薬剤と注目された治療活性の開始及び／又は促進との間の関係の同定は、例えば、オリゴデンドロサイトにおけるカルシウムシグナリングの実証により治療薬剤の同定方法を与えるために意図されている。それ故、本発明はこの使用及び活性に同様に及ぶ。
本明細書に記載された抗体はペプチドライブラリー又はハプテンをスクリーニングするのに使用されてもよく、次にそれにより反応性ペプチド又はハプテンが単離され、髄鞘再形成、細胞増殖、分化、神経外殖、神経突起新芽形成及び／又はCa++シグナリングを誘導するそれらの能力について試験し得る。一旦単離され精製されると、このようなペプチドは髄鞘再形成、細胞増殖又は分化、神経外殖、神経突起新芽形成及び／又はCa++シグナリングを誘導し得るその他のポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体又はその他の分子についてスクリーニングするのにその後に使用でき、本明細書で注目される最後に挙げられたものはグリア細胞の増殖及び相当する活性に関係がある。特に、本発明の抗体に相当するペプチド、ハプテン、及びその他の分子はオリゴデンドロサイトに結合し、それにより神経リハビリテーション、例えば、髄鞘再形成、再生及び神経保護を誘導するそれらの能力により同定し得る。
また、本発明は広範には本明細書に記載された自己抗体に結合するペプチドに関するものであり、それによりこれらのペプチドはそれらの配列、三次元構造、又は抗体結合から生じるコンホメーションの変化のために、ペプチドワクチン中に使用でき、またそれ自体でペプチドワクチンとして使用し得る。本発明の更なる局面において、これらのペプチドは神経調節性及び／又は免疫調節性を有することがあり、神経細胞増殖応答、及び／又は神経保護、神経再生及び／又は髄鞘再形成の役割をこのような治療を要する哺乳類に誘導する方法を提供し得る。
同様に、本発明はペプチド、抗体及び／又はその他の関連基質に結合することがあり、かつ免疫性を有し得るハプテンを含み、その結果、それらはまた治療製剤（ワクチンをまた含む）中の活性成分として機能し得る。具体的な実施態様において、一種以上のハプテンがワクチン製剤中で、本発明のその他のペプチドと合わされてもよい。
本発明の更に別の局面において、これらのペプチドはタンパク質分解を防止するための安定剤とともに医薬組成物として製剤化でき、こうしてそれらの半減期を延長してこのような治療を要する哺乳類に経口、皮下、静脈内、鼻内、くも膜下投与され、又はリポソーム製剤として投与し得る。
また、本発明は本発明のモノクローナル抗体、又はその活性フラグメントを使用して、哺乳類の髄鞘脱落疾患、例えば、ヒトの多発性硬化症、並びにヒト及び家畜動物の中枢神経系のウイルス性疾患、例えば、感染後の脳脊髄炎を治療する方法、又はこれらの疾病における髄鞘脱落の開始又は進行を予防抑制する方法に関する。更に、本発明はグリア細胞、例えば、オリゴデンドロサイトの増殖を生じ、また刺激するin vitro方法、及び髄鞘脱落疾患を治療するためのこれらのグリア細胞の使用に関する。
更なる局面において、本発明は本明細書中で神経調節因子と称され、かつCNS中のそれらの治療活性に注目し得る分子のグループに及ぶ。それ故、本発明はCNS中に特別な有効性を有する神経調節因子に関するものであり、これらの薬剤は本発明の抗体からナル群から選ばれる物質を含み、それらには、IgMサブタイプの抗体、これらのモノマー、ペプチド類似体、ハプテン、これらの活性フラグメント、これらのアゴニスト、これらの模倣物、及びこれらの組み合わせが含まれる。神経調節因子は下記の特性を有する：それらは髄鞘再形成及び／又はグリア細胞の細胞増殖を誘導し、かつ／又はオリゴデンドロサイトにCa++シグナリングを誘発する。
更に特別には、本発明の神経調節因子の範囲内に含まれる抗体はmAb sHIgM22 (LYM 22)、sHIgM46、ebvHIgM MSI19D10、CB2bG8、これらの混合物、これらのモノマー、これらの活性フラグメント、並びにmAb sHIgM22 (LYM 22)、sHIgM46、ebvHIgM MSI19D10及びCB2bG8の特性を有する天然又は合成の自己抗体、特にヒト抗体からなる群から選ばれてもよい。本発明の神経調節因子は哺乳類細胞に由来してもよく、特別にはヒト細胞に由来してもよい。更に、神経調節因子は図17（配列番号1及び49）、図18（配列番号５及び50）、図19（配列番号９）、図20（配列番号11）、図27（配列番号13）、図28（配列番号15）及びこれらの活性フラグメントからなる群から選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。
加えて、本発明の神経調節因子の範囲内の抗体はmAb、その混合物、そのモノマー、その活性フラグメント、並びにmAb AKJR4、CB2iE12、CB2iE7、及びMSI19E5の特性を有する天然又は合成の自己抗体、特にヒト抗体からなる群から選ばれてもよい。本発明の神経調節因子は哺乳類細胞に由来してもよく、具体的にはヒト細胞に由来してもよい。更に、神経調節因子は図37（配列番号23）、図38（配列番号25）、図39（配列番号27）、図40（配列番号29）、図41（配列番号31）、図42（配列番号33）、図43（配列番号35）及びこれらの活性フラグメントからなる群から選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。
また、本発明は組換えDNA分子もしくはクローン化遺伝子、又はその縮重変異体に関するものであり、これは本明細書中で神経調節因子と称され、かつ本発明の抗体、特に図17-20、27、28及び37-43に示された配列に少なくとも一部相当する配列を有する抗体及びペプチド（これらは本発明の抗体に少なくとも一部相当してもよく、本明細書中で抗体ペプチドとも称される）、例えば、図17-20、27、28及び37-43に少なくとも一部相当する一つ以上の配列を有するペプチド並びにハプテンの如き小分子を含み、またこれらから選ばれてもよい分子のクラスをコードし、同じ配列又は相補配列を有する組換えDNA分子又はクローン化遺伝子を含む。
更に特別には、組換えDNA分子はDNA配列又はその縮重変異体を含み、これは抗体、そのペプチド類似体、それに相当するハプテン、又はその活性フラグメントをコードし、これは
(A) 図17（配列番号１、49）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(B) 図18（配列番号５、50）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
(C) 図19（配列番号９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(D) 図20（配列番号11）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(E) 図27（配列番号13）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(F) 図28（配列番号15）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(G) 図37（配列番号23）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(H) 図38（配列番号25）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(I) 図39（配列番号27）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(J) 図40（配列番号29）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(K) 図41（配列番号31）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(L) 図42（配列番号33）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(M) 図43（配列番号35）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、
(N) 通常のハイブリダイゼーション条件下で以上のDNA配列のいずれかにハイブリダイズするDNA配列、及び
(O) 以上のDNA配列のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を発現時にコードするDNA配列
からなる群から選ばれてもよい。
本発明はまた、本明細書で注目された活性を有するタンパク質に由来又は対応するタンパク質、またはそれらの断片若しくは誘導体であって、先に示され、記載され、図17-20、27、28及び37-43から選ばれたアミノ酸配列を示すタンパク質を含む。同様に、本発明はそれらのタンパク質又は抗体ペプチドと同じ活性を示し、治療組成物又はワクチン中の製剤化によるような、同様の様式で治療目的のために投与し得るハプテンに及ぶ。一実施態様において、ペプチド及びハプテンの両方を含む治療組成物又はワクチンを調製し得る。
本発明の更なる実施態様において、こうして決定された組換えDNA分子又はクローン化遺伝子の完全DNA配列は適当な宿主に導入し得る発現調節配列に機能し得る形で連結されてもよい。それ故、本発明は本発明の抗体ペプチドをコードするDNA配列を含むクローン化遺伝子又は組換えDNA分子で形質転換された単細胞宿主に及ぶ。
特定の実施態様において、本発明の抗体の可変領域DNA配列は一種以上の合成抗体を生じるのに利用し得る。特に、可変領域配列はその天然の、又は遺伝的に与えられた定常領域配列と合わされて合成抗体を与え得る。本発明は本発明の抗体のDNA配列、特に可変領域配列に由来し、それらの配列を含む合成抗体を生じるためのベクターを提供する。
本発明の或る好ましい実施態様のその他の好ましい特徴によれば、組換え発現系が提供されて生物学的に活性な動物又は特にヒトの抗体ペプチドが生産される。
本発明は本明細書に説明されたように既知の組換え技術を含む、自己抗体、ペプチド、相当するハプテン、又はこれらのその他の小分子類似体のクローンの調製のための幾つかの手段を含み、それ故、本発明はその範囲内にこのような合成調製物を含むことが意図されている。本明細書に開示されたcDNA及びアミノ酸配列の単離はこのような組換え技術による本発明の抗体又はそれらの類似体の再生を促進し、それ故、本発明は組換えDNA技術により宿主系中の発現のための開示されたDNA配列から調製された発現ベクター、及び得られる形質転換された宿主に及ぶ。
本発明は本発明の自己抗体又はそれらの類似体の活性を強化することにより標的哺乳類神経細胞の神経活性を調節するのに有効な潜在的薬物のスクリーニングのためのアッセイ系を含む。一例において、試験薬物が自己抗体の活性を抑制するリガンド、又は抑制された抗体を含む抽出物にとともに細胞サンプル投与されて、対照と比較することにより、化学サンプル（DNAを含む）又は試験薬物に対する自己抗体の結合活性に関するその効果を測定し得る。
より重要なことに、アッセイ系はペプチド、ハプテン、その他の因子又はタンパク質（細胞質、核その他に見られるかを問わない）を含む、自己抗体及び／又はそれらの標的に結合することができ、それにより、例えば、免疫応答、神経成長、神経保護及び髄鞘再形成を含む、抗体活性、並びに本明細書で注目された相当する治療活性を強化することができる薬物又はその他の実体を同定するのに適合させることができる。このようなアッセイはペプチド及びその他の小分子ライブラリー、血清、及びその他の関係のある体液の中からの薬物候補の同定、並びに特定の細胞活性の促進もしくは抑制に特異性であり、又は経時的もしくは活性レベルにおいてこのような活性を強化する薬物の開発に有益であろう。例えば、このような薬物は髄鞘再形成を促進し、又は、その他の病気又は損傷を治療する、例えば、再成長もしくは再生に携わることができ、もしくは更に良好に携わることができるCNS神経細胞をつくる際に使用し得る。
同様に、本発明は天然に生じた抗体及び組換え的に調製された抗体を含む、本発明の神経調節因子に相当する抗体の開発に及ぶ。例えば、本抗体は発現ライブラリーをスクリーニングして神経調節因子として機能し得るペプチド、また、例えば、ワクチン中で機能し得るペプチドをコードする一種以上の遺伝子を得るのに使用し得る。このような抗体として、既知の遺伝子技術により調製されたポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方、および、二重特異性（キメラ）抗体、および、その他の機能を持つ抗体であって、そのために本発明の神経調節因子の一部であるヒト自己抗体の活性をエミュレートできる、又はそれを調節することができるそれらの能力と関連した更なる診断用途に適切である抗体が挙げられる。
こうして、神経調節因子、それらの類似体、及びそれに対して生じられるアンタゴニスト又は抗体は、例えば、放射性付加、又は放射性ヨウ素化により標識された神経調節因子の抗体を使用して、イムノアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイを含む、種々の診断技術に関連して使用することができる。
イムノアッセイにおいて、調節量のアンタゴニスト又はその抗体等が調製され、酵素、特異性結合パートナー及び／又は放射性元素で標識され、次いで細胞サンプルに導入し得る。標識された物質又はその一種以上の結合パートナーがサンプル内の部位と反応する機会を有した後、得られる物質は既知の技術（これらは付着された標識の性質により変化し得る）により調べることができる。
放射性標識、例えば、放射性同位元素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、及び186Reが使用される場合、既知の現在利用できるカウンティング操作が利用し得る。標識が酵素である場合、検出は当業界で知られている現在利用される比色技術、分光光度技術、蛍光分光光度技術、電流滴定技術又は気体定量技術のいずれかにより行ない得る。
本発明は神経調節因子の存在の程度の定量分析のために、又はそれらの活性を模倣もしくはブロックし得る薬物もしくはその他の薬剤を同定するために試験キットの形態で調製し得るアッセイ系を含む。その系又は試験キットは標識を神経調節因子、それらのアゴニスト及び／又はアンタゴニストに結合して、本明細書に説明された放射性技術及び／又は酵素技術の一つにより調製された標識された成分、及び一種以上の付加的な免疫化学試薬（これらの少なくとも一つは標識された成分、その結合パートナー、測定すべき成分の一種、又はそれらの一種以上の結合パートナーと結合することができる、遊離リガンド又は固定リガンドである）を含んでもよい。
更なる実施態様において、本発明は神経調節因子、それらのサブユニット、もしくはそれらの活性フラグメント、それらのペプチド均等物、それらの類似体の活性、又は同じ活性を有することが測定された薬剤もしくはその他の薬物に基づく或る種の治療方法に関する。第一の治療方法は抗体又はそれらのサブユニットの結合活性に原因的に関連し、又はそれからその後に生じる症状の発現の予防と関連し、神経調節因子、相当する自己抗体、抗体ペプチド、これらの活性フラグメント又はサブユニットの生成及び／又は活性を刺激することができる薬剤を宿主のこれらの症状の発生を予防又は治療するのに有効な量で個々に、又は互いに混合して投与することを含む。例えば、薬物又は抗体もしくはそれらのフラグメント等のその他の結合パートナーが投与されて神経再生活性及び／又は神経保護活性を強化し、又は多発性硬化症の治療のように髄鞘再形成を刺激し得る。
更に詳しくは、本明細書に一般に言及される治療方法は、神経調節因子の活性化の有効なインヒビターもしくはエンハンサー、又は、例えば、先に説明した本発明の側面に従って用意されて使用される薬物スクリーニングアッセイにより開発されたその他の同等に有効な薬物、を含み得る医薬組成物を投与することによる種々の病気又はその他の細胞機能不全及び障害の治療方法を含み得る。例えば、図17（配列番号1、49）、図18（配列番号５、50）、図19（配列番号９）、図20（配列番号11）、図27（配列番号13）、図28（配列番号15）、図37（配列番号23）、図38（配列番号25）、図39（配列番号27）、図40（配列番号29）、図41（配列番号31）、図42（配列番号33）、図43（配列番号35）により示された配列に少なくとも一部相当する配列を有する、薬物、又は神経調節因子若しくはその類似タンパク質に対する他の結合パートナーがパーキンソン病又は多発性硬化症の治療のように神経再生、神経保護、又は髄鞘再形成を抑制又は強化するのに投与し得る。特に、配列が図17及び18に示されるsHIgM46 (LYM22)のタンパク質、及び／又は図19及び20に示されるMSI19D10のタンパク質、及び／又は図27及び28に示されるCB2bG8のタンパク質、及び／又は図37及び38に示されるAKJR4のタンパク質、及び／又は図39及び40に示されるCB2iE12のタンパク質、及び／又は図41及び42に示されるCB2iE7のタンパク質、及び／又は図43に示されるMSI19E5のタンパク質、それらの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、又はこれらの活性フラグメントは、神経再生及び／又は神経保護療法又は髄鞘再形成が、例えば、アルツハイマー病、ALS、MS、パーキンソン病、又は脊髄損傷を治療するのに適当である場合の投与のために、ワクチンを含む医薬製剤として調製し得る。
本発明は本明細書に提供された抗体の組み合わせ又は混合物を含み、この場合、一種より多い抗体、特にヒト抗体、最も特にsHIgM22、sHIgM46、MSI19E10、CB2bG8、AKJR4、CB2iE12、CB2iE7及びMSI19E5から選ばれる抗体が、医薬及び治療の組成物又は製剤中で調製し得る。加えて、本発明は更にこのような神経再生及び／又は神経保護療法又は髄鞘再形成に有益な治療化合物、薬物又は薬剤との一種以上の抗体の組み合わせを提供する。例えば、本発明の抗体製剤又は組成物はβインターフェロン製剤（ベータセロン等）及びコプロイマー１（コパキソン）を含む多発性硬化症の治療用の治療化合物と組み合わされてもよいが、これらに限定されない。
それ故、本発明の主たる目的は、神経再生及び／又は神経保護活性の促進と関連する或る種の特性及び活性を示す精製形態のヒト自己抗体及び相当する抗体ペプチド、ハプテン、類似体及びこれらの活性フラグメントを含む、神経調節因子を提供することである。
本発明の更なる目的は、侵襲性、自発性、又は突発性の症状が存在すると疑われている哺乳類の自己抗体の存在、量及び活性の検出方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、哺乳類の自己抗体及び／又はそれらのフラグメント、サブユニット等の活性を模倣し、又はその副作用を治療するのに潜在的に有効な、薬物、薬剤等の如き物質のスクリーニング方法及び関連アッセイ系を提供することである。
こうして、本発明の目的は、記載されたモノクローナル自己抗体、これらの活性フラグメント、又はsHIgM22 (LIM22)、sHIgM46、ebvHIgM MSI19D10及びCB2bG8により例示されるヒト抗体の特性を有するその他の天然もしくは合成の自己抗体を使用する、哺乳類の髄鞘脱落疾患、例えば、ヒトの多発性硬化症、及びヒト及び家畜動物の中枢神経系のウイルス性疾患、例えば、後感染性脳脊髄炎を治療する方法、又はこれらの疾病において髄鞘脱落の開始又は進行を予防抑制する方法を提供することである。加えて、自己抗体、これらの活性フラグメント、又はAKJR4、CB2iE12、CB2iE7及びMSI19E5により例示されるヒト抗体の特性を有するその他の天然もしくは合成の自己抗体を使用するこのような方法が提供される。
更に、本発明の目的は、オリゴデンドロサイトの如きグリア細胞の増殖を生じさせ、刺激するin vitro方法、及び髄鞘脱落疾患を治療するためのこれらグリア細胞の使用を提供することである。
本発明の更に別の目的は、本発明の神経調節因子、特にヒト自己抗体、フラグメント（ペプチドフラグメントを含む）、ハプテン、サブユニット、アゴニスト、一種以上の結合パートナーを含み、もしくはこれらをベースとし、或いは神経調節因子の生成を調節し、又はその活性を模倣もしくは拮抗作用する薬剤又は薬物をベースとする治療方法に使用するための、本発明の神経調節因子、及びそれを含む医薬組成物（ワクチンを含む）を提供することである。
本発明の更に別の目的は本発明の神経調節因子を模倣又は拮抗作用し、従って治療薬としての使用について考えられる薬物及びその他の分子の同定のためのアッセイ方法（スクリーニングアッセイを含む）を提供することである。
その他の目的及び利点は下記の例示の図面を言及して進行する下記の記載に鑑みて当業者に明らかになるであろう。
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は哺乳類の中枢神経系軸索の促進、刺激、再生、保護、及び／又は髄鞘再形成に関する。具体的には、本発明は中枢神経系内の構造及び細胞を結合する能力を特徴とする、IgMサブタイプの抗体及びこれらのモノマー、又はこれらの活性フラグメントを含む、自己抗体、特にヒト自己抗体、又はこれらの天然もしくは合成の類似体を使用する中枢神経系(CNS)軸索の髄鞘再形成の刺激方法に関する。特定の実施態様において、本明細書で提供され、本発明の方法に利用される抗体はそれらがオリゴデンドロサイトに結合することができることを特徴とし、更に、特に、グリア細胞の増殖を刺激することができる。
本発明によれば、当業者に通常の分子生物学、微生物学、及び組換えDNA技術が使用し得る。このような技術は文献に充分に説明されている。例えば、Sambr0okら,“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”(1989);“Current Protocols in Molecular Biology”I-III巻〔Ausbel, R.M.編集(1994)〕；“Cell Biology: A Laboratory Handbook”I-III巻〔J.E. Celis編集(1994)〕；“Current Protocols in Immunology”I-III巻〔Coligan, J.E.編集(1994)〕；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J. Gait編集1984)；“Nucleic Acid Hybridization”〔B.D. Hames＆S.J. Higgins編集(1985)〕；“Transcription And Translation”〔B.D. Hames＆S.J. Higgins編集(1984)〕；“Animal Cell Culture”〔R.I. Freshney編集(1986)〕；“Immobilized Cells And Enzymes”〔IRL Press, (1986)〕；B. Perbal,“A Practical Guide To Molecular Cloning”(1984)を参照のこと。
それ故、本明細書に現れる場合、下記の用語は以下に示される定義を有するべきである。
本件出願及び特許請求の範囲中に単独で本明細書に使用される“神経調節因子”という用語は、神経突起の伸長、再生及び髄鞘再形成を促進するように機能し、CNS中で特別な利益及び効果を有する物質の広いクラスを表すことが意図され、それ故、IgMサブタイプの抗体及びこれらのモノマーを含む、本発明の抗体、特に表２及び３中を含む、本明細書に示され、最も特に本明細書中でsHIgM22 (LIM 22)、sHIgM46、ebvHIgM MSI19D10、CB2bG8、AKJR4、CB2iE12、CB2iE7、及びMSI19E5と称されるヒト自己抗体、ペプチド類似体、ハプテン、モノマー、これらの活性フラグメント、アゴニスト、模倣物その他を含み、図17-20、27、28及び37-43に示されたペプチド配列に少なくとも部分類似性を有し得るような物質を含む。
また、神経調節因子とは、本明細書に示された抗体（これらのモノマー又は活性フラグメントを含む）の一種より多くの組み合わせ又は混合物を含み、包含する。
また、“神経調節因子”、“自己抗体”、“抗体ペプチド”、“ペプチド”、“ハプテン”という用語及び具体的に列挙しないあらゆる別形は、それらが単一又は多種タンパク質を含むタンパク質様物質を全て表し、含み得るという程度で、本明細書中で互換可能に使用されてもよく、本明細書に示され、図17-20、27、28及び37-43（配列番号１、49、５、50、９、11、13、15、23、25、27、29、31、33及び35）に示されるアミノ酸配列と、本明細書及び特許請求の範囲に示される活性のプロフィールを含むタンパク質に及ぶ。それ故、実質的に均等な活性又は改変された活性を示すタンパク質（特に抗体、合成抗体、これらのモノマー及びこれらの活性フラグメント）が同様に意図されている。これらの改変は随意であってもよく、例えば、改変が部位誘導突然変異誘発により得られてもよく、又は偶発であってもよく、例えば、改変は複合体又はその指定されたサブユニットの生産体である宿主中の突然変異により得られてもよい。また、“神経調節因子”、“自己抗体”、“抗体ペプチド”、“ペプチド”、“ハプテン”という用語は、適当な場合に、本明細書中に具体的に言及されたタンパク質、および、全ての実質的に相同の類似体及び対立変化をそれらの範囲内に含むことが意図されている。
本明細書に記載されたアミノ酸残基は“Ｌ”異性体形態であることが好ましい。しかしながら、“Ｄ”異性体形態の残基は、免疫グロブリン結合の所望の機能性がポリペプチドにより保持される限り、あらゆるＬアミノ酸残基に代えて使用し得る。NH2はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を表す。COOHはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を表す。通常のポリペプチド命名法、J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969)に遵守して、アミノ酸残基の略号が下記の対応表に示される。
Figure 0005670608
全てのアミノ酸残基配列は左右方向がアミノ末端からカルボキシ末端への通常の方向である式により本明細書中で表されることを述べておかなければならない。更に、アミノ酸残基配列の最初又は最後にあるダッシュは一つ以上のアミノ酸残基の更なる配列へのペプチド結合を示すことを述べておかなければならない。上記表は本明細書中に二者択一的に現れ得る３文字表記法及び１文字表記法を相関関係付けるために示してある。
“レプリコン”はin vivoのDNA複製の自律単位として機能し、即ち、それ自体の制御のもとに複製することができるあらゆる遺伝子要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
“ベクター”は別のDNAセグメントを付加することができ、そのセグメントの複製を生じさせるようなレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ又はコスミドである。
“DNA分子”はその一本鎖形態、又は二本鎖らせんのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、又はシトシン）のポリマー形態を表す。この用語はその分子の一次構造及び二次構造のみを表し、それを特別な三次形態に限定しない。こうして、この用語は、とりわけ、線状DNA分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、及び染色体に見られる二本鎖DNAを含む。特定の二本鎖DNA分子の構造を説明する際に、配列はDNAの非転写ストランド（即ち、mRNAに相同の配列を有するストランド）に沿って5'から3'方向の配列のみを示すという慣習に従って本明細書に記載されるであろう。
“複製起点”はDNA合成に関与するDNA配列を表す。
DNA“コーディング配列”は適当な調節配列の制御のもとに置かれた場合にin vivoでポリペプチドに転写され、翻訳される二本鎖DNA配列である。コーディング配列の境界は5'（アミノ）末端にある開始コドン及び3'（カルボキシ）末端にある翻訳停止コドンにより決められる。コーディング配列として、原核生物配列、真核生物mRNAからのｃDNA、真核生物（例えば、哺乳類）DNAからのゲノムDNA配列、更には合成DNA配列が挙げられるが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は通常コーディング配列の3'に配置されるであろう。
転写調節配列及び翻訳調節配列は宿主細胞中でコーディング配列の発現を与えるＤＮＡ調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等である。
“プロモーター配列”は細胞中でRNAポリメラーゼを結合し、下流（3'方向）のコーディング配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。本発明を特定する目的のために、プロモーター配列は転写開始部位によりその3'末端で境界づけれられ、上流（5'方向）に延びてバックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又は要素を含む。プロモーター配列内に、転写開始部位（通常ヌクレアーゼS1でマッピングにより特定される）、および、RNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られるであろう。真核生物プロモーターは常にではないがしばしば“TATA”ボックス及び“CAT”ボックスを含むであろう。原核生物プロモーターは-10及び-35コンセンサス配列に加えてシャイン-ダルガーノ配列を含む。
“発現調節配列”は別のDNA配列の転写及び翻訳を制御し、調節するDNA配列である。コーディング配列はRNAポリメラーゼがコーディング配列をmRNA（これは次いでコーディング配列によりコードされたタンパク質に翻訳される）に転写する場合に細胞中で転写調節配列及び翻訳調節配列の“制御下”にある。
“シグナル配列”はコーディング配列の前に含まれることがある。この配列は宿主細胞と相互作用してポリペプチドを細胞表面に誘導し、又はポリペプチドを培地に分泌する、ポリペプチドのＮ末端側あるシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドはタンパク質が細胞から離れる前に宿主細胞により切り取られる。シグナル配列は原核生物及び真核生物の天然の種々のタンパク質と関連して見られる。
本発明のプローブを表すのに本明細書に使用される“オリゴヌクレオチド”という用語は、２種以上、好ましくは３種より多いリボヌクレオチドを含む分子と定義される。その正確なサイズは多くの因子に依存し、これらは次にはオリゴヌクレオチドの最終の機能及び用途に依存するであろう。
本明細書に使用される“プライマー”という用語は、プライマー伸長産物（これは核酸ストランドに相補性である）の合成が誘導される条件下、即ち、ヌクレオチド及び誘導剤、例えば、DNAポリメラーゼの存在下で好適な温度及びpHで置かれた場合に合成の開始の位置として作用することができるオリゴヌクレオチド（精製された制限消化産物のような天然に生じるものであるか、又は合成により生成されるかを問わない）を表す。プライマーは一本鎖又は二本鎖であってもよく、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成を開始するのに充分に長い必要がある。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの源及びその方法の使用を含む、多くの因子に依存するであろう。例えば、診断適用について、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には15-25又はそれ以上のヌクレオチドを含むが、それより少ないヌクレオチドを含んでもよい。
本明細書のプライマーは特別な標的DNA配列の異なるストランドに“実質的に”相補性であるように選ばれる。これはプライマーがそれらの夫々のストランドとハイブリダイズするのに充分に相補性である必要があることを意味する。それ故、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補性ヌクレオチドフラグメントがプライマーの5'末端に付着され、プライマー配列の残部はそのストランドに相補性であってもよい。また、非相補性塩基又は更に長い配列は、プライマー配列がそのストランドの配列と充分な相補性を有してそれとハイブリダイズし、それにより伸長産物の合成のための鋳型を形成することを条件として、プライマー中に散在してもよい。
本明細書に使用される“制限エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”という用語は、特定のヌクレオチド配列の付近で二本鎖DNAを切断する、細菌の酵素を表す。
細胞は外因性又は異種のDNAが細胞内に導入された場合にこのようなDNAにより“形質転換”されたという。形質転換DNAは細胞のゲノムを構成する染色体DNAに組み込まれて（共有結合されて）もよく、また組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、及び哺乳類において、形質転換DNAはプラスミドの如きエピソーム要素で維持されてもよい。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞とは、形質転換DNAが染色体に組み込まれるようになった細胞であり、その結果、それは染色体複製により娘細胞により遺伝される。この安定性は真核生物細胞が形質転換DNAを含む娘細胞の集団を含む細胞株又はクローンを樹立することができることによって実証される。“クローン”は有糸分裂により単細胞又は共通の祖先から誘導された細胞の集団である。“細胞株”は多くの世代にわたってin vitroで安定に成長することができる一次細胞のクローンである。
２種のDNA配列はヌクレオチドの少なくとも約75％（好ましくは少なくとも約80％、最も好ましくは少なくとも約90％又は95％）がDNA配列の特定長さにわたってマッチする場合に“実質的に相同”であるという。実質的に相同である配列は配列データバンク中で利用できる通常のソフトウェアを使用して、又は、例えば、その特別な系について特定されたストリンジェント条件下のサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより同定し得る。適当なハイブリダイゼーション条件を特定することは当業者の能力範囲内にある。例えば、Maniatisらの上記文献；DNA Cloning, I巻及びII巻、上記文献；Nucleic Acid Hybridization、上記文献を参照のこと。特に、本発明の抗体の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列は相当する生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも約90％の相同性を有し、相当する生殖系列遺伝子配列に対し実質的に相同である。
また、本発明の抗体、又はそのペプチド類似体、ハプテン、もしくは活性フラグメントをコードするDNA配列は本発明の範囲内にあることが理解されるべきであり、これらはその少なくとも一部を規定するペプチド、又は図17-20、27、28及び37-43（配列番号１、49、５、50、９、11、13、15、23、25、27、29、31、33及び35）に示されたのと同じ配列を有するペプチドをコードするが、同じ配列番号に縮重したものである。“縮重している”は異なる３文字コドンが特定のアミノ酸を規定するのに使用されることを意味する。下記のコドンが夫々の特定アミノ酸をコードするのに互換可能に使用し得ることはこの技術分野で公知である。
フェニルアラニン(Phe又はＦ) UUU又はUUC
ロイシン（Leu又はＬ） UUA又はUUG又はCUU又はCUC
又はCUA又はCUG
イソロイシン（Ile又はＩ） AUU又はAUC又はAUA
メチオニン（Met又はＭ） AUG
バリン（Val又はＶ） GUU又はGUC又はGUA又はGUG
セリン（Ser又はＳ） UCU又はUCC又はUCA又はUCG
又はAGU又はAGC
プロリン（Pro又はＰ） CCU又はCCC又はCCA又はCCG
スレオニン（Thr又はＴ） ACU又はACC又はACA又はACG
アラニン（Ala又はＡ） GCU又はGCG又はGCA又はGCG
チロシン（Tyr又はＹ） UAU又はUAC
ヒスチジン（His又はＨ） CAU又はCAC
グルタミン（Gln又はＱ） CAA又はCAG
アスパラギン（Asn又はＮ） AAU又はAAC
リジン（Lys又はＫ） AAA又はAAG
アスパラギン酸（Asp又はＤ） GAU又はGAC
グルタミン酸（Glu又はＥ） GAA又はGAG
システイン（Cys又はＣ） UGU又はUGC
アルギニン（Arg又はＲ） CGU又はCGC又はCGA又はCGG
又はAGA又はAGG
グリシン（Gly又はＧ） GGU又はGGC又はGGA又はGGG
トリプトファン（Trp又はＷ） UGG
終止コドン UAA（オーカー）又はUAG（アンバ
ー）又はUGA（オパール）
上記コドンはRNA配列に関するものであることは言うまでもない。DNAに関する相当するコドンはＵに代えて置換されたＴを有する。
特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンに変化するような突然変異を特定のDNA配列又は分子中で行なうことができる。一般にこのような突然変異は、可能な最も少ないヌクレオチド変化をつくることにより行なわれる。この種の置換突然変異は、生じるタンパク質において非保存様式（即ち、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸からのコドンを別のグループに属するアミノ酸に変化することにより）又は保存様式（即ち、特定のサイズ又は特徃を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸からのコドンを同じグループに属するアミノ酸に変化することにより）でアミノ酸を変化するのに行ない得る。このような保存的変化は一般に得られるタンパク質の構造及び機能をあまり変化させない。非保存的変化はおそらく得られるタンパク質の構造、活性又は機能を変えるであろう。本発明は得られるタンパク質の活性又は結合特性を有意に変えない保存的変化を含む配列を含むと考えられるべきである。
下記の分類はアミノ酸の種々のグループの一例である。
非極性Ｒ基を有するアミノ酸
アラニン
バリン
ロイシン
イソロイシン
プロリン
フェニルアラニン
トリプトファン
メチオニン
電荷を持たない極性Ｒ基を有するアミノ酸
グリシン
セリン
スレオニン
システイン
チロシン
アスパラギン
グルタミン
電荷を持った極性Ｒ基を有するアミノ酸（pH 6.0で負に荷電される）
アスパラギン酸
グルタミン酸
塩基性アミノ酸（pH 6.0で正に荷電される）
リジン
アルギニン
ヒスチジン（pH 6.0で）
別のグループはフェニル基を有するアミノ酸であろう。
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
別のグループ分けは分子量（即ち、Ｒ基のサイズ）に従ってもよい。
グリシン 75
アラニン 89
セリン 105
プロリン 115
バリン 117
スレオニン 119
システイン 121
ロイシン 131
イソロイシン 131
アスパラギン 132
アスパラギン酸 133
グルタミン 146
リジン 146
グルタミン酸 147
メチオニン 149
ヒスチジン（ph 6.0で） 155
フェニルアラニン 165
アルギニン 174
チロシン 181
トリプトファン 204
特に好ましい置換は
−正の電荷が維持し得るようにArgに代えてLys及びその逆；
−負の電荷が維持し得るようにAspに代えてGlu及びその逆；
−遊離-OHが維持し得るようにThrに代えてSer；並びに
−遊離NH2が維持し得るようにAsnに代えてGln
である。
アミノ酸置換はまた、特に好ましい性質を有するアミノ酸を置換するのに導入されてもよい。例えば、Cysは別のCysとのジスルフィド架橋のための潜在的な部位を導入するであろう。Hisが特定の“触媒”部位として導入されてもよい（即ち、Hisは酸又は塩基として作用することができ、生化学的触媒作用に最も普通のアミノ酸である）。Proがは、特にその平面状構造のために導入されてもよく、これはタンパク質の構造中にβ-ターンを誘導する。
２種のアミノ酸はアミノ酸残基の少なくとも約70％（好ましくは少なくとも約80％、最も好ましくは少なくとも約90又は95％）が同じであり、又は保存置換に相当する場合に“実質的に相同”である。特に、本発明の抗体の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列は相当する生殖系列遺伝子アミノ酸配列に対し少なくとも約90％、好ましくは少なくとも約95％の相同性を有して、相当する生殖系列遺伝子アミノ酸配列に実質的に相同である。
DNA構築物の“異種”領域はとは、より大きな分子内部にある識別可能名DNA要素であって、その大きな分子と関連して見いだされない要素である。従って、異種領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、通常、その遺伝子は起原生物のゲノム中で哺乳類ゲノムDNAに隣接しないDNAにより隣接されるであろう。異種コーディング配列の別の例はコーディング配列それ自体が自然に見られない構築物（例えば、ゲノムコーディング配列が天然遺伝子とは異なるコドンを有するイントロン、又は合成配列を含むcDNA）である。対立遺伝子変化又は天然に生じる突然変異イベントは本明細書に特定されたDNAの異種領域を生じない。
本明細書に使用される“抗体”という用語は特異的エピトープを結合する、抗体及びこれらのフラグメントを含む、あらゆる免疫グロブリンである。この用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びキメラ抗体を含むことが意図されており、最後に挙げられた抗体は米国特許第4,816,397号及び同第4,816,567号に更に詳しく記載されている。このような抗体として、既知の一般的技術により調製されたポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方だけでなく、二重特異性（キメラ）抗体、並びに活性を調節するそれらの能力と関係する付加的な診断使用にそれらを好適にするその他の機能性を含む抗体、例えば、髄鞘再形成及び／又はCNS軸索の再生を刺激し、又は神経保護を与える抗体が挙げられる。“抗体結合部位”は抗原を特異的に結合する重鎖及び軽鎖の可変領域及び超可変領域を含む抗体分子のその構造部分である。本明細書に使用される種々の文法形態の“抗体分子”という表現は無傷の免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性部分を意図している。例示の抗体分子は無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子並びにFab、Fab'、F(ab')2及びF(v)として当業界で知られている部分を含む、パラトープを含む免疫グロブリン分子のこれらの部分である。
抗体分子のFab部分及びF(ab')2部分は公知である方法により実質的に無傷の抗体分子のパパイン及びペプシンタンパク質分解反応によりそれぞれ調製し得る。例えば、Theofilopolousらの米国特許第4,342,566号を参照のこと。Fab'抗体分子部分もまた公知であり、F(ab')2部分から続いてメルカプトエタノールによるように二つの重鎖部分を結合するジスルフィド結合の還元、続いてヨードアセトアミドの如き試薬による得られるタンパク質メルカプタンのアルキル化により生成し得る。
種々の文法形態の“モノクローナル抗体”という表現は特定の抗原と免疫反応することができる抗体結合部位の唯一種を有する抗体を表す。従って、モノクローナル抗体は典型的にはそれが免疫反応する抗原に対する単一の結合アフィニティーを示す。それ故、モノクローナル抗体は、それぞれが異なる抗原に対して異なる免疫特異な複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば、二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体を含んでもよい。
ハイブリドーマによりモノクローナル抗体をつくるための一般方法は公知である。また、不死の抗体産生細胞株が融合以外の技術、例えば、オンコジーンDNAによるＢリンパ球の直接形質転換、又はエプスタイン-バールウイルスによるトランスフェクションによりつくられる。例えば、M. Schreierら, “Hybridoma Techniques”(1980)；Hammerlingら, “Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridoma”(1981)；Kennettら, “Monoclonal Antibodies”(1980)を参照のこと。また、米国特許第4,341,761号；同第4,399,121号；同第4,427,783号；同第4,444,887号；同第4,451,570号；同第4,466,917号；同第4,472,500号；同第4,491,632号；同第4,493,890号を参照のこと。
神経調節因子ペプチド又は自己抗体ペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを種々の性質、即ち、イソタイプ、エピトープ、アフィニティー等についてスクリーニングすることができる。中枢神経系中の構造及び細胞に結合することができ、神経調節因子、特に本発明の自己抗体と同じ活性を示すモノクローナル抗体が特に興味深い。このような抗体は本明細書に示されかつ説明される結合アッセイ、染色アッセイ及び免疫細胞化学方法を含むアッセイで容易にスクリーニングされ、特性決定し得る。このようなモノクローナル抗体は活性アッセイ、例えば、本明細書に示され、説明されるサイラーウイルスモデル、EAEモデル及びリゾレシチンモデルで容易に同定し得る。高アフィニティー抗体も天然又は組換え自己抗体のイムノアフィニティー精製が可能である場合に有益である。
本発明の治療方法及び診断方法に使用される抗ペプチド抗体は好ましくはモノクローナル抗体(mAb)であり、最も好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体である。抗体はまた合成抗体であることが好ましい。加えて、本明細書に使用される抗ペプチド抗体分子は全抗体分子のFab部分、Fab'部分、F(ab')2部分又はF(v)部分の形態であることが好ましい。
先に示唆されたように、本発明の診断方法は有効量の抗体ペプチド／タンパク質のアンタゴニスト、例えば、抗ペプチド抗体、好ましくはアフィニティー精製ポリクローナル抗体、更に好ましくはmAbを含むアッセイにより細胞サンプル又は培地を試験することを含む。加えて、本明細書に使用される抗ペプチド抗体分子はFab部分、Fab'部分、F(ab')2部分もしくはF(v)部分又は全抗体分子の形態であることが好ましい。既に説明されたように、この方法から恩恵を受けることができる患者として、神経疾病状態、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ウイルス性感染その他の神経病的障害（肉体的トラウマから生じる損傷を含む）を患っている患者が挙げられる。ペプチドを単離し、抗ペプチド抗体を誘導する方法及び標的細胞の試験を助ける抗ペプチド抗体の能力を測定し、最適化する方法は全てこの技術分野で公知である。
ポリクローナル抗ポリペプチド抗体の産生方法はこの技術分野で公知である。Nestorらの米国特許第4,493,795号を参照のこと。典型的には有益な抗体分子のFab部分及び／又はF(ab')2部分を含む、モノクローナル抗体はAntibodies- A laboratory Manual, Harlow及びLane編集, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)（これは参考として本明細書に含まれる）に記載されたハイブリドーマ技術を使用して調製し得る。簡単に言えば、モノクローナル抗体組成物が産生されるハイブリドーマを生成するために、ミエローマ又はその他の自己永続化細胞株を、抗体ペプチド結合部分、又は抗体ペプチドもしくはフラグメント、或いはその起源特異的DNA結合部分で超免疫化された哺乳類の脾臓から得られたリンパ球と融合する。
脾臓細胞は典型的にはポリエチレングリコール(PEG)6000を使用してミエローマ細胞と融合される。融合したハイブリッドはHATに対するそれらの感受性により選択される。本発明を実施するのに有益なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは本発明の自己抗体と同じ様式で免疫反応するそれらの能力並びに標的細胞及び組織中で特定の活性を抑制又は促進するそれらの能力により同定される。
本発明を実施するのに有益なモノクローナル抗体は適当な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含む栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することにより産生し得る。培養物はハイブリドーマが抗体分子を培地に分泌するのに充分な条件下で充分な時間の期間にわたって維持される。次いで抗体を含む培地が回収される。次いで抗体分子を公知の技術により更に単離することができる。
これらの組成物の調製に有益な培地はこの技術分野で公知であり、市販されており、合成培地、同系交配マウス等を含む。例示の合成培地は4.5g/lのグルコース、20mMのグルタミン、及び20％の胎児ウシ血清を補給したダルベッコ最小必須培地（DMEM；Dulbeccoら, Virol. 8:396 (1959)）である。例示の同系交配マウス株はBalb/cである。
モノクローナル抗ペプチド抗体の産生方法はまたこの技術分野で公知である。Nimanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4949-4953 (1983)を参照のこと。典型的には、本発明の抗体ペプチド、又はペプチド類似体もしくはフラグメントが、抗ペプチドモノクローナル抗体を産生するための前記操作で免疫原として、単独で、又は免疫原性キャリヤーにつながれて使用される。ハイブリドーマが抗体ペプチド類似体と免疫反応し、それにより本発明の抗体と同様に反応する抗体を産生する能力についてスクリーニングされる。
本発明はまたヒト抗体sHIgM22、sHIgM46、ebvHIgM MSI19D10、CB2bG8、AKJR4、CB2iE12、CB2iE7、MSI19E5、これらのモノマー、ハプテンを含むこれらの類似体、これらの活性フラグメント、又はこれらの特性を有する単離され、もしくは合成の自己抗体を使用する、哺乳類の髄鞘脱落疾患、例えば、ヒトの多発性硬化症、並びにヒト及び家畜動物の中枢神経系のウイルス性疾患、例えば、後感染性脳脊髄炎の治療方法に関する。髄鞘脱落疾患の開始又は進行を抑制することを含む、これらのmAb、これらのモノマー、これらの活性フラグメント、又は同じ活性を有するその他の単離もしくは合成された自己抗体を使用する予防治療方法がまた本発明により含まれる。
中枢神経系(CNS)のミエリン形成細胞であるオリゴデンドロサイト(OL)は脳室下のゾーンの神経外胚葉細胞として生じ、次いで移動し、成熟してミエリンを生じる。OLの連続発生は良く特性決定された分化段階特異的マーカーにより同定される。オリゴデンドロサイト／３型星状細胞（0-2A）先祖と称される、増殖性かつ移動性の双極性前駆体はモノクローナル抗体(mAb)抗GD3及びA2B5により同定される〔Eisenbarthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76(1979), 4913-4917〕。多極性、後移動性かつ増殖性細胞を特徴とする次の発育段階はmAb 04により認識される〔Gardら, Neuron, 5(1990), 615-625; Sommerら, Dev. Biol., 83(1981), 311-327〕。更なる発育はmAb 01により認識される、ガラクトセレブロシドの細胞表面発現〔Schachner, J. Neurochem., 39(1982), 1-8; Sommerらの上記文献〕、及び2',3'-環状ヌクレオチド3'-ホスホヒドロラーゼの発現により特定される。最も成熟した細胞はミエリン塩基性タンパク質及びプロテオリピドタンパク質の如き末端分化マーカーを発現する。
OL発生の段階を特徴づけるのに使用されたmAb (A2B5、01、及び04)はBALB/cマウスをニワトリ胚網膜細胞又はウシ脳梁のホモジネートで免疫することによりつくられた〔Eisenbarthらの上記文献；Sommerらの上記文献〕。A2B5は0-2A前駆体だけでなく神経細胞も認識し、細胞表面ガングリオシドGQ1c〔Kasaiら, Brain Res., 277(1983), 155-158〕及びその他のガングリオシド〔Fredmanら, Arch. Biochem. Biophys., 233(1984), 661-666〕と反応する。04はスルファチド、セミノリピド及びコレステロールと反応し〔Bansalら, J. Neurosci. Res., 24(1989), 548-557〕、一方、01はガラクトセレブロシド、モノガラクトシル-ジグリセリド及びサイコシンと反応する〔Bansalらの上記文献〕。これらのmAbはIgM免疫グロブリン(Ig)サブクラスに属し、細胞質構造だけでなくOLの表面抗原を認識する〔Eisenbarthらの上記文献；Sommerらの上記文献〕。BALB/cマウスをHSB-2Tリンパ芽球様細胞の膜懸濁液で免疫することによりつくられたマウスmAb HNK-1 (抗Leu-7)は、最初、ナチュラルキラー細胞のマーカーとして報告された〔Aboら, J.Immunol., 127(1981), 1024-1029〕。その後、HNK-1は神経系と抗原決定基を共有することが示された〔Schuller-Petrovicら, Nature, 306(1983), 179-181〕。中枢及び末梢の髄鞘の両方中に見られる、ミエリン関連糖タンパク質の炭水化物エピトープはHNK-1と反応する神経組織の主要抗原であることが示された〔McGarryら, Nature, 306(1983), 376-378〕。しかしながら、神経組織中のその他の糖タンパク質がこのmAbと反応し、これらの幾つかは胚形成、分化、及びミエリン形成に重要である〔Keilhauerら, Nature, 316(1985), 728-730; Kruseら, Nature, 311(1984), 153-155; Kruseら, Nature, 316(1985), 146-148; McGarryら, J. Neuroimmnol., 10(1985), 101-114〕。興味深いことに、HNK-1はまた細胞質構造と反応し、IgM Igサブクラスに属する。
1997年１月７日に発行された米国特許第5,591,629号に開示され、特許請求され、SCH94.03と称されるモノクローナル抗体はマウス脳脊髄炎サイラーウイルス(TMEV)で慢性感染されたマウスでCNS髄鞘再形成を促進することがわかった〔Millerら, J. Neurosci., 14(1994), 6230-6238〕。SCH94.03はIgM（κ）Igサブクラスに属し、OLの未知の表面抗原を認識するが、あらゆる細胞中の細胞質抗原を認識する（Asakuraら, Molecular Brain Research, 印刷中）。ELISAによるSCH94.03の多反応性、及び未突然変異Ig可変領域生殖系列配列はSCH94.03が天然自己抗体であることを示した〔Millerら, J. Neurosci., 14(1994), 6230-6238〕。SCH94.03の精密な研究、及び公知のOL反応性mAb A2B5、01、04、及びHNK-1とのその比較はこれらが天然自己抗体である可能性を提起した。ELISAによるIg可変領域cDNA配列及びこれらのmAbの多反応性のその後の分析により、これらが同様の実用性を有する天然自己抗体の包括的グループであることが確認された。
モノクローナル抗体、IgMモノクローナル抗体SCH94.03（またSCH94.32と称される）及びSCH79.08（両方とも正常な哺乳類（即ち、髄鞘脱落疾患で感染されていない）からの脊髄ホモジネートで免疫された哺乳類から調製された）の抗原反応性が、免疫組織化学、免疫細胞化学、ウェスタンブロッティング、固相酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)、及びIg可変領域配列決定を含む、幾つかの生化学的アッセイ及び分子アッセイを使用して特性決定され、前記の1997年１月７日に発行された米国特許第5,591,629号（その教示が参考として本明細書に含まれる）に記載されていた。
天然又は生理的自己抗体は通常血清中に存在し、自己構造、抗原又は細胞と反応性であり、又はそれらに結合することができることにより特性決定される。それらはしばしば多反応性であり、頻度高くIgMサブタイプのものであり、突然変異していない生殖系列遺伝子によりコードされ、又は生殖系列遺伝子に実質的に相同で配列相違をほとんど有しない。オリゴデンドロサイト反応性01、04、A2B5、及びHNK-1 IgMκモノクローナル抗体の免疫グロブリン(Ig) cDNAを配列決定し、これらを公表された生殖系列配列と比較することにより、これらが天然自己抗体であることが決定された。01 VHは未再配列VHセグメント転写産物A1及びA4と同じであり、04 VHはVHコーディング領域中の生殖系列VH101からの三つのヌクレオチド相違を有し、HNK-1 VHは六つのヌクレオチド相違を有していた。01のＤセグメントは生殖系列SP2遺伝子ファミリー、JH4に由来し、一方、01 JHは有生殖系列JH1によりコードされ一つのサイレントヌクレオチド変化を有していた。01及び04軽鎖は一つのサイレントヌクレオチド変化以外はミエローマMOPC21と同じであった。HNK-1 Vκは二つのサイレントヌクレオチド変化以外は生殖系列Vκ41と同じであった。01 Jκ、04Jκ及びHNKJκは未突然変異生殖系列Jκ2によりコードされた。対照的に、A2B5 VHは生殖系列V1からの７ヌクレオチド相違を示し、一方、A2B5 Vκをコードする生殖系列配列は同定されなかった。A2B5ではなく、01及び04が直接ELISAにより多重抗原に対し多反応性であった。それ故、01、04及びHNK-1 Igは生殖系列遺伝子によりコードされ、天然自己抗体の遺伝子型及び表現型を有する。
“天然”自己抗体又は“生理的”自己抗体と称される、自己抗体の全ファミリーの同定及び特性決定は、自己免疫及び自己反応性についての従来の観点に影響を与えた。広範に研究された自己抗体は、他のイソタイプが同定されてはいるものの、典型的にはIgMであり、細胞骨格タンパク質、表面タンパク質、核酸、リン脂質、細菌抗原、例えば、リポ多糖、及び種々の化学ハプテンを含む、広範囲の自己構造又は抗原に対し反応性である（Avrameas及びTernynck, Mol. Immunol., 30:1133-1142 (1993)により総説される）。天然自己抗体は、類似のイディオタイプ（これらの幾つは病原性自己抗体により発現される）発現を含む広範なイディオタイプ交差反応性又は“結合性(connectivity)”を共有し、同様に他の抗体以上で発現されている共通のイディオタイプに対する反応性を共有する。分子分析により天然自己抗体が典型的には未突然変異生殖系列免疫グロブリン(Ig)遺伝子又は体細胞突然変異がほとんど無い実質的にそれら相同な遺伝子によりコードされ、それ故、特に、徹底的な外因性抗原暴露を受けなかった新生児動物では、Igレパートリーのかなりの画分を代表することが示された。
天然自己抗体の機能はなぞのままである。幾つかの仮説がそれらの生化学的特性及び分子特性に基づいて提案されていた。これらは、(1)老化又は損傷組織の排除、(2)病原体暴露とAg特異的免疫応答の間のラグ期間に最初の免疫防御線を提供すること、(3)潜在的に病原性の自己免疫応答から自己抗原をマスクすること、(4)イディオタイプネットワークによる新生児免疫レパートリーの造形を含む、免疫調節、及び(5)胸腺中のＴ細胞について提案されたプロセスと同様の、骨髄中のＢ細胞の陽性選択における関与を含む。
自己抗原を認識する抗体として広く特性決定され、天然自己抗体を含む、その或る種の自己抗体は、中枢神経系の髄鞘再形成を刺激することができ、自己抗体の重要な生理機能を示唆する。正常な生理機能中、又は組織損傷及びその後の隔絶抗原の放出に応答して産生される自己抗体は、損傷された組織の修復を促進するのに積極的に関与し得る。自己抗体の既に提案された機能に従って、この積極的な関与は損傷された組織の除去を促進し、自己抗原をマスクし、それにより激しい病原性自己免疫応答を防止し、組織破壊を実際にもたらした免疫応答を調節し、それにより正常な内因性組織修復が生じることを可能にし、又は修復プロセスに関係する細胞を直接刺激することであり得る。
ここで、本明細書に示された結果及び実施例は、作製され、それらの自己抗原結合能力についてスクリーニングされた、特に中枢神経系中の構造及び細胞を結合することができる、ヒト自己抗体の単離を明らかにする。また、CNS髄鞘再形成を促進するこれらの抗体の能力が実証される。TMEVで慢性感染され、、ヒトハイブリドーマからのIgM mAb、特にsHIgM22 (LIM 22)、sHlgM46、ebvHIgM MSI19D10、CB2bG8により例示されるひとIgM Abで治療されたマウスは、CNS髄鞘再形成の詳細な定量的形態評価によって測定したところ、対照マウスよりも有意に大きいCNS修復を有していた。
髄鞘脱落疾患の治療
本明細書に記載された実験の結果は多発性硬化症(MS)、EAE、及びその他の関連中枢神経系髄鞘脱落障害に対する実用的応用性を有する。自発性CNS型髄鞘再形成の稀な例（“シャドープラーク”）がMSに見られ、時折の末梢神経系(PNS)型髄鞘再形成が根部侵入ゾーン付近の髄鞘脱落した脊髄プラーク中に見られる。オリゴデンドロサイトはMSの慢性プラークの中央に稀に見られるが、それらはプラークの周辺で増殖するこようであり、そこでそれらは不完全な(abortive)髄鞘再形成と関連している。髄鞘再形成のプロセスはMS中に臨床的に上観察される自発性寛解及び改善と相関関係がありかもしれない。これらの臨床的観察は新しいミエリン形成がMSで可能であることを示す。mAbを使用することによりTMEV誘導髄鞘脱落を有するマウスにおいて髄鞘再形成が刺激されたことは多発性硬化症における治療応用の見込みを与えるものである。
薄いミエリン鞘の形態再生が機能回復に寄与するか否かの問題は臨床上重要である。コンピュータシミレーションは不適当に薄い鞘による新しいミエリン形成でさえインパルス伝導を改善することを示す。正常に髄鞘形成された繊維の軸索膜は高度に分化しているので、跳躍伝導を伝播するためにナトリウムチャンネルがランビエ節に高密度で存在することが必要である。実験的証拠により、新たに形成された節は、サキシトキシン結合により実証されるように、必要とされる高ナトリウムチャンネル密度を発生することが示唆される。現在までのデータは不適当に薄いミエリンによる髄鞘再形成でさえもが既に髄鞘脱落した軸索中の伝導を改善することを示唆している。それ故、この形態現象を促進するためのあらゆる戦略が機能回復を生じる可能性を有する。
本明細書に示されたヒト自己抗体の単離及び試験はヒト用に特に適し、かつ望ましいヒト抗体を与える。重要なことに、ヒト抗体の使用は治療抗体に対するヒト免疫応答の可能性を回避する。非ヒト動物に由来する治療抗体は免疫応答を生じることが示されており、これは個体にとって重大かつ有害であり得る。ポリクローナルヒトIgM及びポリクローナルヒトIgGがin vivo脊髄髄鞘脱落の二つのモデルで試験された：慢性ウイルス感染モデル、及び急性毒性モデル。両方のモデルにおいて、ポリクローナルヒトIgM治療動物はポリクローナルヒトIgGで治療された動物よりも新たに髄鞘形成された軸索の密度が有意に高かった。ヒトモノクローナル抗体のパネルがまた中枢神経系に特異性の表面抗原とのそれらの反応性に基づいて同定された。これらのヒト抗体は髄鞘脱落疾患を有する哺乳類に与えられた場合にポリクローナルヒトIgGよりも有意に大きい中枢神経系髄鞘再形成を促進する。ヒトモノクローナル抗体は抗原多反応性であり、オリゴデンドロサイト及び神経細胞の特定集団の表面上の決定基を認識する。髄鞘再形成を促進する或る種のヒト抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が部分配列決定された。この抗体は培養中のオリゴデンドロサイト中のカルシウムフラックスを誘導することができ、直接結合及びグリア細胞を通じたシグナリングを示唆する。これらのヒト抗体はヒト白質に結合し、ヒトの髄鞘再形成を促進するのに有効であり得る。治療薬としての使用についてのモノクローナル抗体の利益は1)抗体が可能な宿主感染なしに増殖でき、かつ2)抗体がその有効性を変化するためにin vitroで遺伝的に改変し得ることである。
こうして、本明細書に記載された実験の結果として、本発明の方法は髄鞘脱落障害で冒された、ヒト及び家畜動物を含む、哺乳類を治療し、髄鞘再形成及びCNS軸索の再生を刺激するだけでなく、神経保護を与えるのに使用し得る。本明細書に記載されたように、有効量のモノクローナル抗体又はペプチドフラグメント、ハプテン、もしくは均等物は、投与の通常の経路、特に静脈内(iv)又は腹腔内(ip)注射により投与し得る。本明細書に記載されたように、治療組成物及びワクチンが意図されており、調製され、投与し得る。抗体の有効量は治療される哺乳類のサイズ、疾患の重度、投与の経路、及び治療の過程に応じて変化し得る。例えば、投与されるmAbの夫々の用量は約0.5mg/kgから約400mg/kgまでの範囲であってもよく、好ましい範囲は約0.5mg/kgから約250mg/kgまでである。10μgと低い容量（0.5mg/kg）がマウスでCNS軸索の髄鞘再形成を促進するのに有効であったことに注目することは重要である。mAbの用量はまた投与の経路に依存するであろう。例えば、マウスに投与されるiv用量は0.5mg/kgであり、ip用量は5.0mg/kgであった。治療の過程はmAbの投与の頻度（例えば、毎日、毎週、又は２週毎）及び治療の期間（例えば、４週〜４ヶ月）を含む。こうして、例えば、４ヶ月にわたって与えられる少量のmAbとは反対に、多量のmAbを４〜５週にわたって毎日与えることができる。
投与されるモノクローナル抗体の量の有効性は、例えば、本明細書に記載されたように、哺乳類の総合の外観、哺乳類の活動及び哺乳類の麻痺の程度を含む、幾つかの数の臨床基準を使用して評価し得る。ヒトに髄鞘再形成を誘導するのに必要なモノクローナル抗体の量の有効性はまた二重盲検制御試験で評価し得る。髄鞘脱落疾患からの一定の神経欠陥を有する患者をモノクローナル抗体又は対照で処置することができる。定量的生体力学筋肉試験により検出される等尺性収縮筋肉強度(isometric muscle strenght)の改善が一次治療終点として使用し得る。
髄鞘再形成を促進するin vivo方法に加えて、CNS軸索中の髄鞘再形成を刺激するex vivo方法がまた本発明に含まれる。例えば、モノクローナル抗体をオリゴデンドロサイトの如きグリア細胞の増殖及び／又は分化を刺激するのにin vitroで使用することができる。次いでこれらの外因性グリア細胞を既知の技術を使用して哺乳類のCNSに導入することができる。CNS軸索の髄鞘再形成は存在する内因性グリア細胞の数を増加することにより増大されるであろう（オリゴデンドロサイトの如きグリア細胞がミエリンの生産に重要な役割を果たす）。
グリア細胞を生産し、又は混合培養物（例えば、ラット視神経細胞、又はラット脳細胞培養物）からのグリア細胞の増殖を刺激するin vitro方法も本発明に含まれる。例えば、グリア細胞を含む、ラット視神経、又は脳から得られた細胞を、細胞の増殖を促進するのに充分な条件下で混合培養物として培養する。その後に、CNS軸索の髄鞘再形成を促進することができる有効量のmAb、例えば、sHIgM22 (LIM 22)、sHIgM46、ebvHIgM MSI19D10、及びCB2bG8を細胞の混合培養物に添加し、細胞の成長及び増殖に充分な条件下で維持する。加えて、有効量のmAb、例えば、AKJR4、CB2iE12、CB2iE7、又はMSI19E5を添加してもよい。特に、本明細書に提供された一種より多い抗体の混合物又は組み合わせがこれらの方法における使用について意図されており、提供される。mAbは、mAbの非在下で増殖したグリア細胞の増殖に比べて、mAbの存在下で培養されたグリア細胞の増殖を刺激する。
上記のように、本発明の方法における使用のためのヒトモノクローナル抗体は薬剤、即ち、医薬組成物として投与でき、また投与されることが好ましい。こうして、有効量のモノクローナル抗体が適当な医薬上許されるキャリヤー、例えば、生理緩衝液、又は食塩溶液と合わされ、又はそれで希釈し得る。特に、本明細書に示されたモノクローナル抗体の一種より多くの組み合わせ又は混合物が適当な医薬上許されるキャリヤー、例えば、生理緩衝液、又は食塩溶液と合わされ、又はそれで希釈し得る。ワクチンが調製される場合、本発明のモノクローナル抗体又は活性な均等物が医薬上有効かつ好適なキャリヤー又はアジュバントと一緒に調製され、当業者に知られている免疫のための通常の操作に従って投与プロトコルを遂行することができる。
動物及びヒトへの投与のための本発明の方法に使用される医薬組成物は医薬キャリヤー又は、賦形剤と組み合わせたモノクローナル抗体を含む。好ましい実施態様において、医薬組成物は一種、好ましくは二種より多い本発明のモノクローナル自己抗体を含んでもよい。このような組成物は一種より多いモノクローナル自己抗体の存在は、同じ治療組成物又は方法中で他のものの活性を強化する点で有利である。
薬剤は本発明の化合物を含む錠剤（ロゼンジ及び顆粒を含む）、糖剤、カプセル、ピル、アンプル又は座薬の形態であってもよい。
有利には、組成物は投薬単位として製剤化され、夫々の単位は一定用量の活性成分を供給するのに適している。錠剤、被覆錠剤、カプセル、アンプル及び座薬が本発明の好ましい投薬形態の例である。活性成分が有効量を構成すること、即ち、好適な有効投薬量が単一単位投薬又は多重単位投薬で使用される投薬形態と合致することのみが必要である。正確な個々の用量だけでなく、毎日の用量が、勿論、医師又は獣医の指示のもとに通常の医療原理に従って決められるであろう。
モノクローナル抗体はまた水性又は非水性の希釈剤中の活性化合物の懸濁液、溶液及びエマルション、シロップ、顆粒又は粉末として投与することができる。
錠剤、糖剤、カプセル及びピルに形成されるのに適した活性化合物を含む医薬組成物（例えば、顆粒）中に使用し得る希釈剤は下記の成分：(a)充填剤及び増量剤、例えば、澱粉、糖、マンニトール及びケイ酸；(b)結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース及びその他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチン及びポリビニルピロリドン；(c)保湿剤、例えば、グリセロール；(d)崩壊剤、例えば、アガー-アガー、炭酸カルシウム及び重炭酸ナトリウム；(e)溶解を遅延するための薬剤、例えば、パラフィン；(f)吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物；(g)表面活性剤、例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアレート；(g)吸着性キャリヤー、例えば、カオリン及びベントナイト；(i)滑剤、例えば、ステアリン酸カルシウム及びステアリン酸マグネシウム並びに固体ポリエチレングリコールを含む。
活性化合物を含む錠剤、糖剤、カプセル及びピルは通例の被覆物、エンベロープ及び保護マトリックスを有することができ、これらは不透明剤を含んでもよい。それらはまたそれらがおそらく或る時間の期間にわたって活性成分のみを放出し、又は腸道の特別な部分中で放出するように構成し得る。被覆物、エンベロープ及び保護マトリックスは、例えば、ポリマー物質又はワックスからつくられてもよい。
座薬に形成されるのに適した医薬組成物中に使用される希釈剤は、例えば、通常の水溶性希釈剤、例えば、ポリエチレングリコール及び脂肪（例えば、ココア油及びハイエステル〔例えば、C16-脂肪酸とのC14-アルコール〕）又はこれらの希釈剤の混合物であってもよい。
溶液及びエマルションである医薬組成物は、例えば、通例の希釈剤（勿論、表面活性剤存在下を除いて、上述したように200未満の分子量を有する溶媒を除く）、例えば、溶媒、溶解剤及び乳化剤を含んでもよい。このような希釈剤の具体的な非限定例は水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（例えば、落花生油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビトールの脂肪酸エステル又はこれらの混合物である。
非経口投与について、溶液及び懸濁液は無菌、例えば、アンプル中に含まれた水又は落花生油であるべきであり、適当な場合には、血液等張性である。
懸濁液である医薬組成物は通常の希釈剤、例えば、液体希釈剤、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、表面活性剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル）、微結晶性セルロース、メタ水酸化アンモニウム、ベントナイト、アガー-アガー及びトラガカント、又はこれらの混合物を含んでもよい。
医薬組成物はまた着色剤及び防腐剤、および、香料及び風味添加剤（例えば、ペパーミント油及びユーカリ油）、及び甘味料（例えば、サッカリン及びアスパルテーム）を含んでもよい。
医薬組成物は一般に全組成物の0.5〜90質量％の活性成分を含むであろう。
モノクローナル抗体に加えて、医薬組成物及び薬剤はまたその他の医薬上活性な化合物、例えば、ステロイド、抗炎症剤等を含んでもよい。
本発明の薬剤中の希釈剤は医薬組成物に関して上記されたもののいれれかであってもよい。このような薬剤は唯一の希釈剤として200未満の分子量の溶媒を含んでもよい。
モノクローナル抗体は経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮又は静脈内）、直腸又は局所、好ましくは経口もしくは非経口、特に経舌、又は静脈内に投与されることが考えられる。
投与される投薬速度は治療を受けるヒト又は動物の性質及び体重、治療に対するこの被験者の個々の反応、活性成分が投与される製剤の型、投与が行なわれる様式及び疾患の進行の時点又はそれが投与される間隔の関数であろう。こうして、或る場合には最小投与速度より小さいものを使用することが充分であるかもしれず、一方、その他の場合には所望の結果を得るために上限を超えなければならないかもしれない。より多くの量が投与される場合、これらを日の経過にわたって幾つかの個々の投与にわけることが望ましいかもしれない。
本発明の神経調節因子はまたワクチンの形態で投与するために調製してもよく、これは活性成分として、本明細書に記載された自己抗体、ペプチド類似体、もしくはハプテン、又はおそらくこれらの組み合わせを含んでもよい。こうして、ワクチンの調製は既知の操作に従って行うことができ、１価ワクチンだけでなく、多価ワクチンが意図されている。また、本発明のDNA分子をベースとする、DNAサブユニットワクチンを調製してもよい。全てのワクチンは医師又は臨床医の通常の慣例に従って投与することができ、そのパラメーターは本発明の範囲内にあると考えられる。
更に、本発明は遺伝子治療による治療を意図しており、この場合、適当な神経調節因子が治療のために対応した標的細胞に導入されて、対応する薬剤の発現を生じ、又は増大する。こうして、一実施態様において、神経調節因子、自己抗体、抗体ペプチド等、又はこれらのタンパク質もしくはポリペプチドドメインフラグメントをコードするDNA又は遺伝子がウイルスベクターを使用して、又はDNAの直接導入によりin vivo、ex vivo、又はin vitroで導入される。標的組織中の発現は、例えば、ウイルスベクターもしくは受容体リガンドを用いて、トランスジェニックベクターを特定細胞にターゲッティングすることにより、又は組織特異性プロモーターを使用することにより、或いはその両方で行ない得る。
in vivo又はex vivoターゲッティング及び治療操作に普通使用されるウイルスベクターはDNAをベースとするベクター及びレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築し、使用する方法はこの技術分野で知られている〔例えば、Miller及びRosman, BioTechniques 7:980-990 (1992)を参照のこと〕。
DNAウイルスベクターとして、弱毒化DNAウイルス又は欠損DNAウイルス、例えば、ヘルペス単純ウイルス(HSV)、パピローマウイルス、エプスタインバールウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)等が挙げられるが、これらに限定されない。欠損ウイルス（これらはウイルス遺伝子を完全に、又は殆ど完全に欠いている）が好ましい。欠損ウイルスは細胞への導入後に感染性ではない。欠損ウイルスベクターの使用は、ベクターがその他の細胞を感染し得ることを気にしないで、特定の局所領域における細胞への投与を可能にする。こうして、脂肪組織を特異的に標的とすることができる。具体的なベクターの例として、欠損ヘルペスウイルス１(HSV1)ベクター〔Kaplittら, Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)〕、糖タンパク質Ｌ遺伝子を欠いている欠損ヘルペスウイルスベクター〔特許公開RD371005A〕、又はその他の欠損ヘルペスウイルスベクター〔1994年９月２９日に公開された国際特許公開番号WO 94/21807；1994年４月２日に公開された国際特許公開番号WO 92/05263〕；弱毒化アデノウイルスベクター、例えば、Stratford-Perricaudetら〔J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992); またLa Salleら, Science 259:988-990 (1993)を参照のこと〕により記載されたベクター；及び欠損アデノ関連ウイルスベクター〔Samulskiら, J. Virol. 61:3096-3101 (1987)； Samulskiら, J. Virol. 63:3822-3828 (1989)； Lebkowskiら, Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)〕が挙げられるが、これらに限定されない。
in vivo投与について、適当な免疫抑制治療がウイルスベクター、例えば、アデノウイルスと連係して使用されてウイルスベクター及びトランスフェクトされた細胞の免疫不活化を避けることが好ましい。例えば、免疫抑制サイトカイン、例えば、インターロイキン-12(IL-12)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、又は抗CD4抗体をウイルスベクターに対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答をブロックするために投与することができる〔例えば、Wilson, Nature Medicine (1995)を参照のこと〕。加えて、最少数の抗原を発現するように操作されたウイルスベクターを使用することが有利である。
別の実施態様において、DNA又は遺伝子を、例えば、Andersonらの米国特許第5,399,346号；Mannら, 1983, Cell 33:153；Teminらの米国特許第4,650,764号；Teminらの米国特許第4,980,289号；Markowitzら, 1988, J. Virol. 62:1120；Teminらの米国特許第5,124,263号；1995年３月16日に公開されたDoughertyらの国際特許公開番号WO 95/07358；及びKuoら, 1993, Blood 82:845に記載されたようなレトロウイルスベクターに導入することができる。レトロウイルスベクターは感染性粒子として機能するように、又は単一ラウンドのトランスフェクションを受けるように構築し得る。前者の場合、ウイルスはオンコジーン形質転換特性を担う遺伝子以外のその遺伝子の全てを保持し、異種遺伝子を発現するように改変される。非感染性ウイルスベクターはウイルスパッケージングシグナルを破壊するように調製されるが、異種遺伝子を含むように操作された同時導入ウイルスをパッケージするのに必要とされる構造遺伝子及びパッケージングシグナルを保持するように調製される。こうして、生産されるウイルス粒子は更なるウイルスを生産することができない。
標的化遺伝子デリバリーが1995年10月に公開された国際特許公開WO 95/28494に記載されている。
あるいは、ベクターはリポフェクションによりin vivo導入することができる。過去10年にわたって、in vitroの核酸被包及びトランスフェクションのためのリポソームの使用が増大している。リポソーム媒介トランスフェクションで見られる難点及び危険を制限するように設計された合成陽イオン脂質をマーカーをコードする遺伝子のin vivoトランスフェクション用リポソームを調製するために使用するこζができる〔Felgnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); Mackeyら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988); Ulmerら, Science 259:1745-1748 (1993)を参照のこと〕。陽イオン脂質の使用は負に荷電した核酸の被包を促進することができ、したがって、負に荷電した細胞膜との融合も促進することができる〔Felgner及びRingold, Science 337:387-388 (1989)〕。外因性遺伝子をin vivoで特定器官に導入するためのリポフェクションの使用は或る種の実用的な利点を有する。特定細胞へのリポソームの分子ターゲッティングは利益の一つの領域に相当する。特別な細胞型へトランスフェクションを指向させることは細胞不均一性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、及び脳中で特に有利であることが明らかである。脂質はターゲッティングの目的のためにその他の分子に化学カップリングされてもよい〔Mackeyらの上記文献を参照のこと〕。標的化ペプチド、例えば、ホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば、抗体、又は非ペプチド分子をリポソームに化学的にカップリングさせることができる。
ベクターを裸のDNAプラスミドとしてin vivo導入することも可能である。遺伝子治療のための裸のDNAベクターはこの技術分野で知られている方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はDNAベクタートランスポーターの使用により所望の宿主細胞に導入し得る〔例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992)； Wu及びWu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988)； 1990年３月15日に出願されたHartmutらのカナダ特許出願第2,012,311号；Williamsら, Proc. Matl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991)を参照のこと〕。受容体媒介DNAデリバリアプローチも使用することができる〔Curielら, Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992)； Wu及びWu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)〕。
本発明の好ましい実施態様において、上記の遺伝子治療ベクターは、例えば、本発明の自己抗体により認識されるDNAコンセンサス配列、即ち抗体結合部位、を含む転写調節配列（ベクター中に挿入された治療異種遺伝子と機能し得る形で結合している）を使用する。、抗体結合部位を使用する。即ち、本発明の特異的発現ベクターは遺伝子治療に使用することができる。
本発明は下記の非限定実施例の考慮により更に良く理解され、これらの実施例には物質、化合物及び組成物の調製並びに本発明の例示の方法の開発及び実施が記載される。物質及び方法のいずれについても、多くの改良がこの開示の目的及び意図から逸脱しないで実施し得ることが当業者に明らかであろう。下記の実施例は本発明の好ましい実施態様を更に充分に説明するために示され、また本発明の実施について知られているベストモードを提示するという出願人の義務の履行するために供されるものであり、決して本発明の広い範囲を限定するものと見なすべきではない。
（実施例）
以下の実施例は、ヒトポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製及び試験を示す。特に、ヒトポリクローナルIgM抗体を調製し、試験し、それによりCNS内の構造体及び細胞（例えば、オリゴデンドロサイトを含む）に神経組織に対する高い特異性をもって高アフィニティーで結合するそれらの能力、及び髄鞘再形成を増進する付随的能力を実証した。本明細書に以下に示されるように、サイラーウイルスモデル及びリゾレシチン誘導髄鞘脱落モデルにおいて髄鞘再形成を確かめた。
序論
髄鞘再形成の増進はCNSの炎症性髄鞘脱落障害、例えば、多発性硬化症(MS)における重要な治療目標である。急性MSのため死亡した何人かの患者、及び脳バイオプシーからの出願人の最近のデータにおいて広範囲に髄鞘再形成されたCNS病変が明らかにされたことは、疾患の早期段階で完全修復が可能かもしれないことを示唆する（Prineas及びConnell 1979; Prineasら， 1993; Rodriguez及びScheithauer 1994）。しかしながら、疾患が進行するにつれて、髄鞘再形成が制限され、主として病変の周辺で生じる。MS病変中で完全な髄鞘再形成ができないことについて多数の理由が提案されてきた（Ludwin 1981）。二つの重要な考察として、髄鞘再形成することができる細胞の枯渇、及び因子（これらはそれらの成長及び分化を持続する）の枯渇が挙げられる。このように、修復細胞を刺激し、又はミエリン修復を妨げる抑制因子を除去するための早期の介入が治療戦略の鍵であろう。
実験動物で髄鞘再形成を促進するための治療戦略として多数のアプローチが試験されてきた。予め髄鞘脱落した病巣へのオリゴデンドロサイト又は前駆グリア細胞の移植はCNS軸索の髄鞘再形成、及びより程度は低いが、髄鞘形成前駆体細胞の移動をもたらすことができる。中枢の髄鞘再形成が伝導を回復することが示されている。出願人により提案された別の戦略は内因性髄鞘再形成を増進することである（Miller, D.J.ら 1995b）。このアプローチは、髄鞘再形成することができる細胞及びそれらの成長又は分化を持続する因子が髄鞘脱落した病変中に存在するが、この応答を抑制し、従って完全な髄鞘再形成を防止するメカニズムがあることを暗示する。
内因性CNS髄鞘再形成の増進の最初の記載の一つは自己免疫脳脊髄炎(EAE) 実験モデルから生じた。ビヒクルとして不完全フロイントアジュバント(IFA)及び抗原としてミエリン成分を使用して、疾患誘導後に免疫するとEAEを有するモルモットにおいて構造及び機能の回復を促進した（Trautgottら， 1982）。EAEにおける内因性髄鞘再形成の促進に基づいて、同様の実験がマウス脳脊髄炎サイラーウイルス(TMEV)で慢性感染されたマウスで行なわれた（Lang, W.ら， 1984）。マウスの感受性系統のTMEV感染は、ウイルス存続という状況でMSの優れたモデルとして利用できる慢性炎症性髄鞘脱落をもたらす。IFA中の脊髄ホモジネート(SCH)で処置された慢性感染マウスはアジュバント単独を与えられた対照動物と較べてかなりのCNS髄鞘再形成を示した。この観察に続いて、SCH/IFAで免疫された未感染同系動物からの抗血清又は精製Igの受身伝達がTMEVで慢性感染させたマウスにおいて髄鞘再形成を促進することを実証する実験が行なわれた（Rodriguezら， 1987a; Rodriguez及びLennon 1990; Rodriguez 1991）。これらの実験は新規であり、液性免疫応答がCNS髄鞘脱落疾患に病因役割を果たすという古典的な考えとは対照的であった。これらの実験はIg、特に自己抗体がCNS髄鞘再形成を促進するのに有益な役割を果たし得ることを初めて実証したものである。
これらの観察に基づいて、生成が髄鞘脱落のサイラーモデルでCNS髄鞘再形成を促進するmAbから始められた。SCH/IFAを注射したSJLマウスからの脾臓を融合ハイブリドーマ生成のためのＢ細胞の供給源として使用した。これらのマウスの血清は慢性髄鞘脱落マウスで髄鞘再形成を促進することが既に示されていた。ハイブリドーマを作製し、抗原としてSCHを使用してELISAによりスクリーニングした。最初の融合後、95の生存ハイブリドーマのうちの二つがSCHに有意に結合する抗体を分泌した。これらのウェルからのハイブリドーマ細胞（SCH79及びSCH94と命名した）をサブクローニングし、SCH免疫反応性についてスクリーニングした。SCH79シリーズ中で、49クローンのうちの14のクローンが陽性であり、SCH94シリーズについて、32のうちの17が陽性であった。次いでこれらのハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体をサイラーモデル系において髄鞘再形成を促進する能力についてin vivo試験した。６〜８ヶ月慢性感染されたSJLマウスに４〜５週にわたって週に２回のmAbの腹腔内又は静脈内注射を0.5mg〜5.0mgの合計用量で施した。２種のmAb、SCH94.03及びSCH94.32はCNS髄鞘再形成の最大の増進を示した（Millerら, 1994）。可変重鎖及び軽鎖の配列はこれらの２種の抗体が同じであることを明らかにした。従って、その後にSCH94.03と称することにした（Miller及びRodriguez, 1995c）。
慢性TMEV誘導髄鞘脱落を有するSJLマウスのSH94.03治療は、一般にPBS治療対照動物においては５％未満であること較べて全髄鞘脱落領域の20-30％の髄鞘再形成をもたらす。これは対照に対して髄鞘再形成の4-6倍の増大に相当し、これがSCH94.03治療動物中の平均100,000の髄鞘再形成された軸索に相当することが軸索のカウントから推定される。完全髄鞘再形成された病変の電子顕微鏡分析は髄鞘再形成されていない軸索が残っていないことを明らかにし、これらの病変中の利用できる軸索の髄鞘再形成が100％に近いことを示唆する。
SCH94.03はIgMサブクラスに属し、細胞骨格タンパク質を含む既知及び未知のタンパク質抗原に対し高度に多反応性である。興味深いことに、それは変異していないＩｇ生殖系列遺伝子によりコードされ、SCH94.03が天然自己抗体であることを確認する。重要なことに、SCH94.03はオリゴデンドロサイト上の未同定表面抗原を認識し、このことはこの抗体の作用のメカニズムの潜在的な標的を提供する。
SCH94.03とCH12の間の生物学における相違がこの仮説の中心である。SCH94.03のIg遺伝子配列の同定の時点で、同じ生殖系列配列及び遺伝子組み合わせを有する別のマウスIgMk抗体があることが発見された。このIgM抗体（CH12と称する）はCD5+B細胞リンパ腫からのものであり、ホスファチジルコリン特異性である。SCH94.03及びCH12はVL領域で99.1％のアミノ酸同一性を有し、同じVH配列を有する。SCH94.03とCH12のわずかな相違はCDR3領域にあるＮ領域挿入のためである。CH12はオリゴデンドロサイトの表面を標識せず、サイラーモデル系で髄鞘再形成を促進せず、したがって髄鞘再形成の促進のメカニズムを説明するわずかな分子相違はCDR3領域内にあることが明白になる。この結論は、おそらくは髄鞘脱落した病変内の特異的抗原へのこれらのmAbの結合が髄鞘再形成の誘導に重要であるという仮説を支持する。
現在までに、髄鞘脱落疾患のTMEVモデルで髄鞘再形成を促進する６種の異なるマウスモノクローナル抗体が同定されている（Asakuraら, 1998）。６種の抗体の全てがIgMイソタイプのものであり、自己抗体のレミニセントである生殖系列配列を保持する（Miller及びRodriguez, 1995; Asakuraら, 1996）。夫々が広い抗原結合特異性を示すが、最も重要なことに、夫々がオリゴデンドロサイトの表面で発現されている抗原に結合する。これまでの研究でオリゴデンドロサイトに結合しなかったIgM抗体は髄鞘再形成を促進しなかった。このグループのプロトタイプメンバー、mAb SCH94.03は髄鞘脱落疾患の幾つかのマウスモデルで髄鞘再形成を促進することが示されていた。慢性ウイルス誘導(TMEV)髄鞘脱落を有するマウスでは、SCH94.03による治療は髄鞘再形成の4-6倍の増大をもたらす。SCH94.03治療はまたリゾレシチン注射後の化学誘導髄鞘脱落後に生じる自発性髄鞘再形成の速度を有意に増大することが示されている。
髄鞘再形成促進マウス抗体の単離及び特性決定に成功したので、マウスモノクローナルのヒト対応物の同定を抗原非依存性ストラテジーを使用して開始した。その原理はELISAアッセイによりマウス脊髄ホモジネートと反応し、CNS内の構造体及び細胞に高アフィニティーで結合するヒト抗体を同定することであった。次いでこれらの抗体をミエリン修復を促進する能力についてマウス髄鞘脱落モデルにおいて試験した。プールされたヒトIgM及びIgG、Mayo Hematologyクリニックの患者からの血清、並びにEBV不死化ヒトＢ細胞（結果に記載されたような種々の源から）からのモノクローナル抗体を特性決定し、マウスモデルで試験した。これらの実験の結果を以下に示す。
結果
ヒトポリクローナルIgMが培養中にラット脳切片及びオリゴデンドロサイトに結合するがIgGは結合しない
免疫組織化学により、ポリクローナルヒトIgMはオリゴデンドロサイトの亜集団の表面を染色し（図６）、ラット脳の切片中の構造及び細胞に高度に反応性である（図1B）。オリゴデンドロサイト表面抗原（図６）又はラット脳の切片（図1A）に対する反応性はポリクローナルヒトIgGでは観察されなかった。固定され、透過性にした混合グリア細胞についてポリクローナルヒトIgM又はIgGを利用する免疫組織化学は細胞内構造のごくわずかな染色を示した（データは示されていない）。
CNS構造及び細胞に対するポリクローナルヒトIgMの特異性及びオリゴデンドロサイトへの結合が顕著な髄鞘再形成潜在性を誘導するのかもしれない。対照的に、ポリクローナルヒトIgGは、対照レベルより高く髄鞘再形成を促進するが（表１を参照のこと）、CNSに結合せず、ポリクローナルヒトIgMとは異なるメカニズムにより機能するのであろう。
ヒトポリクローナルIgG及びIgMはTMEV感染マウスにおいてCNS髄鞘再形成を促進する
MSの原因は分かっていないが、疫学研究はその疾患が感染性病原因子により誘起されることがあることを示唆するが（Franklinら, 1991）、現在まで決定的な証拠がこの理論を証明してはいない。最近、６型ヘルペスウイルスが患者のサブセットで可能な病原因子として関心を集めていた（Grovesら, 1993）。再発と関連づけて研究された多種の疫学因子のうち、最近のウイルス感染のみが矛盾無く関連していた（Smithら, 1981）。加えて、MSの主要な確立された治療、IFN-βはウイルス複製の制御に重要なサイトカインである(14)
MSの研究のための一つの重要なマウスモデルはマウス脳脊髄炎サイラーウイルス(TMEV)である。ポジチブ鎖ピコルナウイルスは幾つかの利点を有する：(1)このウイルスはマウスの天然病原体であり、マウスはその免疫学及び遺伝学に関して広く知られている種である；(2)原発性髄鞘脱落（髄鞘の破壊）が慢性感染の主な肉体的症状である（Trautgottら, 1982）；(3)宿主遺伝学が慢性のウイルス存続性、髄鞘脱落及び神経疾患に対する感受性又は耐性を決めるのに重要な役割を果たす（Langら, 1996; Rodriguezら, 1987a, 1987b）；(4)MSのように、病因が免疫媒介されるものである（Rodriguez及びLennon, 1990; Rodriguez 1991; Millerら, 1994; Miller及びRodriguez 1995c）；(5)ウイルス複製及びウイルス集合の詳細を含む、分子ウイルス学に関する完全な情報がある；(6)慢性TMEV感染を有する感受性マウスの大半がMSと同様の神経疾患-肢の弱さ、痙性、失禁、低下された瞬時の活動及び最終的には麻痺を発生する（Asakuraら, 1996a; Asakuraら, 1998）。
MSと同様に、TMEV感染マウスは疾患表現型の広いスペクトルを示す（髄鞘脱落及び神経欠陥の両方として特定される）（Ludwin, 1997）。極端な一例では、ウイルスがCNS神経細胞中で複製する動物があり、ウイルスが免疫系により除かれず、ひどい脳脊髄炎及び死亡をもたらす（Asakuraら, 1996）。このパターンの病理学が新生児マウス又はひどい免疫不全を有するマウスで観察される。この激症疾患は、ウイルスをCNSから除くクラスＩ拘束Ｔ細胞により主として媒介される保護免疫応答を備えたマウスと対照的である。これらの動物は急性脳脊髄炎を発生し、その後にウイルスがその後の髄鞘脱落を生じさせずにCNSから除かれる（Blakemoreら, 1997; Jeffrey及びBlakemore, 1995）。これらの極端な例の間に、急性疾患を発生し消炎するが、進行性髄鞘脱落並びにオリゴデンドロサイト、星状細胞、及びミクログリア中のウイルス存続を特徴とする慢性期に入る動物がいる（Rivera-Quinonesら, 1998; Millerら, 1995a）。これらのマウスは死亡及び抗しがたい脳脊髄炎を防止する免疫応答を備えているが、白質からウイルスを除くことができないことが慢性の持続性炎症及び免疫媒介髄鞘脱落をもたらす。
抗ヒト免疫応答を避けるために、慢性感染マウス（TMEV感染の５〜６ヶ月後）を腹腔内の1mgのIgの単一ボーラス注射で治療した。Igの総用量は体重1kg当り約0.05gであり、これはヒトIV Ig治療に使用される総用量の1/8に相当する。治療グループ間にミエリン病態の領域に有意差はなかった（表１）。しかしながら、ポリクローナルヒトIgMで治療したマウスは顕著な髄鞘再形成を示した。ミエリン病態の全領域の約1/4がポリクローナルヒトIgMで治療されたマウスで修復された。髄鞘再形成の程度は、PBS治療した対照グループで観察された自発性髄鞘再形成よりも有意に高かったが(p<0.01)、またポリクローナルヒトIgGで治療されたマウスで観察されたものよりも高かった(p=0.05)。ポリクローナルヒトIgGで治療されたマウスはPBSで治療されたマウスよりも大きい髄鞘再形成を示した。髄鞘再形成された個々の病変は炎症性細胞又はマクロファージを殆ど伴わずに完全な修復を示した（図12A、B）。頻繁に500〜1000の髄鞘再形成された軸索がこの型の病変の夫々で観察された。対照的に、PBSで治療されたマウスの殆どの病変は髄鞘再形成された軸索をほとんど有せず、病変が活性ミエリン破壊の徴候である多くの炎症性細胞及びマクロファージを含んでいた。
ポリクローナルヒトIgMはリゾレシチン誘導髄鞘脱落において髄鞘再形成を増進する
脊髄へのリゾレシチン注射は化学誘導された脊髄損傷及び髄鞘脱落のために良く確立された方法である。注射により5-6週までに再現可能な髄鞘脱落病変が生じ、その病変は完全な自発性髄鞘再形成を受ける。本件出願人による先の研究は髄鞘再形成促進抗体による治療が内因性髄鞘再形成の速度を増大し、その結果、病変が３週までに実質的に修復されることを示した。リゾレシチン病変の単相性質、それらの迅速な自発性修復、及び病変動物における臨床欠陥の欠如は慢性TMEV誘導髄鞘脱落とは対照的であり、MSよりも良好な脊髄損傷の性質のモデルとなり得る。
リゾレシチン誘導脊髄病変を有する動物をポリクローナルヒトIgM及びIgGで治療した。病変領域の顕微鏡写真はポリクローナルヒトIgMを受けた動物が多くの髄鞘再形成された軸索を含み、一方、ポリクローナルヒトIgG又はPBSで治療された動物が髄鞘再形成された軸索をほとんど含まないことを示した（データは示されていない）。病変の面積当りの髄鞘再形成された軸索の数を定量するために、髄鞘再形成された軸索を３種の治療グループの病変から高倍率下でカウントした。ポリクローナルヒトIgGで治療された動物よりもポリクローナルヒトIgMで治療されたリゾレシチン病変中に有意に多くの髄鞘再形成された軸索があった(p<0.05)。
ポリクローナルヒト免疫グロブリンは多重自己抗原及び化学ハプテンと反応する
この研究に使用したIgの抗原特異性をELISAにより研究した。先の研究は髄鞘再形成を促進する抗体が多数のタンパク質及びハプテン抗原に対し広い反応性を示すことを示している（Millerら, 1995c）。ポリクローナルヒトIgG及びIgMの両方とも多数のタンパク質抗原及び化学ハプテンに結合した（図15及び16）。ポリクローナルヒトIgG及びIgMはTMEV抗原と反応しない
プールされたヒトIgMによる髄鞘再形成増強がTMEV抗原に対する特異性の結果であるという可能性を排除するため、精製TMEVを使用するウェスタンブロッティングを行なった。この研究に使用したAbのいずれもが既知のTMEVキャプシドタンパク質のいずれとも反応しなかった（データは示されていない）。対照的に、TMEVに対して産生されたウサギポリクローナル抗体はウイルスのVP1、VP2、VP3キャプシド抗原に対し強い反応性を示した。
CNS反応性モノクローナル抗体がヒト血清から同定し得る
天然自己抗体は正常なヒト集団中に存在するので、多数のヒトモノクローナルIgMクローンをスクリーニングすることによりヒト天然モノクローナル自己抗体を同定することが可能であるに違いない。未固定脳切片結合アッセイ系を利用する血清由来ヒトモノクローナル抗体の多反応性について最初のスクリーニングを設計した。陽性クローンは蛍光複合二次抗体単独のバックグラウンドレベルより有意に高い特定の脳構造体もしくは解剖学的層又は細胞集団に結合したサンプルである。
Robert A Kyle博士の指示のもとにMayo Clinic血液学部門から得られた患者の血清から精製されたヒトIgMの52のサンプルを脳切片結合アッセイでCNS特異性について試験した。32の抗体がバックグラウンドより高く結合することが測定された。種々の反応性を図１及び２に示す。また、50のヒト血清由来lgGを脳切片結合アッセイでCNS特異性について試験したが、バックグラウンドより高い特有の結合パターンは明らかにされなかった（データは示されていない）。このように、直ちに、ヒトモノクローナルIgMとIgGの間の主要な相違が明らかにされた。
更に、32の陽性抗体を脊髄ホモジネートELISA系によって結合に関して試験し（図10）、生きた及び固定した両方のラット混合一次グリア細胞培養物への結合（図７）について試験した。これらの抗体（HIgm＃抗体）の反応性の表を表２に示した。生物学的活性に関して抗体をin vivoで試験するための基準は、CNS特異性、培養中の固定されないオリゴデンドロサイトへの結合及びELISAによるSCHに対する有意な反応性とした。こうして、SHIgM 22及びsHIgM46が髄鞘再形成を促進すると同定された。幾つかのその他のsHIgM候補は慎重に研究すべく残っている。試験されたsHIgM抗体のオリゴデンドロサイトへ結合する能力を表３に示してある。
CNS反応性モノクローナル抗体がEBV不死化ヒトＢ細胞クローンの上清から同定された
３μg/mlより高い総IgM濃度を有する細胞クローンの上清を、CNS構造に結合するそれらの能力について脳切片アッセイ系において試験した。140のクローン上清を脳切片結合について試験した。15の抗体がバックグラウンドより高く結合することを測定した。これらの抗体(MSI#)の反応性の表を表２に示してある。ebvHIgM反応性の代表例を図４及び５に示してある。これらの抗体の或るもののオリゴデンドロサイトへの結合能を試験した。これらの結果を表３に表示する。
sHIgMはヒト皮質白質に結合する。
sHIgMがヒトCNSに結合することを確かめるために、ヒト皮質白質をラット脳切片アッセイと同様の系中で免疫標識した。図３はsHIgMのCNS特異性の幾つかを示す。４種の抗体がヒトCNSに良く結合し（図3B、Ｃ、Ｄ、Ｅ）、一方、図３Ａはバックグラウンドレベルよりわずかに高く結合するsHIgMを示す。
ヒトモノクローナル抗体は混合一次グリア培養物中で細胞の表面抗原に結合する
sHIgMの幾つかがラット一次混合グリア細胞培養物中の細胞に結合する。sHIgM 12が04陽性オリゴデンドロサイト領域でオリゴデンドロサイト前駆体と推定されるクラスターに結合する（図7A）。４種のその他のsHIgM（図7B、Ｃ、Ｄ、Ｆ）は形態的に成熟したオリゴデンドロサイトに結合する。sHIgM 30は培養物中の殆どの細胞（オリゴデンドロサイト、星状細胞、ミクログリア）に結合する（図7E）。
sHIgM及びebvHIgMはTMEV感染マウスのCNS髄鞘再形成を促進する
抗ヒト免疫応答を避けるために、慢性感染マウス（TMEV感染の５〜６ヶ月後）をヒトモノクローナル抗体0.5mgの単一腹腔内ボーラス注射で治療した。現在までin vivo試験したヒトモノクローナル抗体のうち、sHIgM 22、sHIgM46及びebvHIgM MSI19D19がその他の試験したヒトモノクローナルIgM（sHIgM 1、2、及び14）に対し髄鞘再形成を有意に促進した。治療グループ間でミエリン病理状態面積に相違はない（表１）。sHIgM 22及びsHIgM46で治療されたマウスは顕著な髄鞘再形成を示した。ミエリン病理状態の全面積の約1/5がsHIgM 22で治療されたマウスで修復された（表１）。髄鞘再形成の程度はPBS治療対照グループで観察された自発性髄鞘再形成よりも有意に高かった（p<0.05、表１）。個々の髄鞘再形成された病変は炎症性細胞又はマクロファージをほとんど伴わずに完全な修復を示した（図12）。頻繁に500〜1000の髄鞘再形成された軸索がこの型の病変の夫々中で観察された。対照的に、PBSで治療されたマウスの殆どの病変は髄鞘再形成された軸索をほとんど有せず、病変が多くの炎症性細胞及びマクロファージ（活性ミエリン破壊の兆候）を含んでいた。オリゴデンドロサイト反応性マウスモノクローナル抗体がin vivoで髄鞘再形成を促進し得ることを実証する先の研究（Asukaraら, 1998）と一致して、マウス対応物に対し同様の反応性を有するオリゴデンドロサイト反応性ヒト抗体が同様にin vivoで髄鞘再形成を促進し得る。
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［表６］表３．オリゴデンドロサイト結合
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［表７］表３．つづき
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髄鞘再形成を促進するモノクローナル抗体は培養中のグリア細胞中でCa 2+ フラックスを生じる。
髄鞘再形成促進抗体の生理濃度に対する培養グリア細胞の応答はこれらの抗体が細胞カルシウムフラックスの調節によりグリア細胞の生化学に直接の効果を有し得ることを示唆する。この効果は抗体誘導髄鞘再形成の分子メカニズムの重要な側面を表しているのかも知れない。図21は４種の異なる抗体に対するグリアのCa2+応答を示す。これらの抗体の２種、sHIgM 22及びSCH94.03はin vivoの髄鞘再形成を促進し、２種、sHIgM 14及びCH12が髄鞘再形成を促進しない。抗体に応答した細胞は、二つの異なる型のカルシウムスパイクの一つを示した。幾つかの細胞はパネルＡ及びＢ中の赤色のトレースにより示されるように持続時間の短い迅速な開始スパイクで応答した（速い応答）。細胞の別のサブセットはパネルＡ及びＢ中の黒色のトレースにより示されるようにより開始が遅く、より持続時間の長いスパイクで応答した（遅い応答）。抗体sHIgM 22及びSCH94.03は夫々両方の型の応答を誘発したが、常に異なる個々のグリア細胞からの応答であった。これらの定性的に異なる応答は細胞の異なるサブセットに対する作用の二つの異なる分子様式を明らかに示唆する。抗体に対する応答（速い応答又は遅い応答）はsHMab22による治療後に251のうちの30の細胞で観察され、またSCH94.03で処置した251の細胞のうちの36で観察された。in vivoの髄鞘再形成を促進しない抗体（sHIgM 14＆CH12）は培養グリア中でカルシウムフラックスを生じないことが観察された（パネルＣ）。合計203の細胞をこれらの抗体の夫々について試験した。
ヒトモノクローナル抗体が一次神経細胞に結合する。
sHIgM及びebvHIgMの多くが脳切片中の神経細胞集団に結合する。しかしながら、結合された神経細胞の多くは切片の表面にあり、抗体が損傷された神経細胞内の内部エピトープを結合し得る可能性を示す。陽性結合HIgMを培養中の生きたラット顆粒細胞への結合について試験した。図22は生きた神経細胞への２種のsHIgMの結合を示す。sHIgM 12は神経細胞の軸索伸長及び樹脂状伸長の両方に結合し（図22A）、一方、ebvHIgm CB2iE12は顆粒細胞膜の外部及び近位の軸索伸長に専ら結合する（図22B）。これらの反応性を抗神経フィラメント抗体および抗微小管関連タンパク質２抗体でヒト抗体陽性神経細胞をc-標識することにより二重標識免疫細胞化学により確かめた（データは示されていない）。
本発明者らの研究所にとって特に興味深いことは、髄鞘脱落が軸索を免疫媒介損傷及び相当する神経欠陥に受けやすくする可能性である。β２ミクログロブリン欠乏マウス（β2m-/-）の本発明者らの最近の分析では、本発明者らはクラスＩMHCの不在下でTMEV感染マウスが大きい髄鞘脱落病変を発生するが、臨床的欠陥を発生することができないことが明らかにされた。マウスはナトリウムチャンネル密度の増加した軸索の相対的保存及び脊髄白質の髄鞘再形成を示した。軸索の保存は神経機能の維持に必須であることが明らかである。ヒト抗体が神経細胞に特異的に結合し得るという観察はの抗体媒介修復に別の潜在的な手段に相当する。或る種の抗体は神経細胞に対する作用により髄鞘再形成を強化し得る。CNS病変の修復は多くの可能なシナリオ：1)神経細胞とオリゴデンドロサイトの間の接着結合の増大、2)栄養因子をアップレギュレートし、オリゴデンドロサイト先祖を裸の軸索の領域に吸引するための神経細胞の直接の細胞刺激、3)裸の軸索における漏出イオンチャンネルの抗体遮断による軸索の神経保護、4)活性化された破壊性免疫細胞による認識からの裸の軸索の保護によりモノクローナル抗体により強化し得る。
材料及び方法
Ａ．モノクローナル抗体産生、特性決定、スクリーニング及び精製：
Abの供給源及びAb精製
正常なヒトIgMを既に記載されたように（Hurezら, 1997）改良ドイチュ-キストラー-ニシュマンのエタノール分別操作、続いてオクタン酸沈殿及び二つの連続のイオン交換クロマトグラフィー工程により2,500以上の健康なドナーのプールされた血漿から精製した。IgMの純度はELISA及びSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により確認して90％以上であった。IVIgとして臨床使用された健康なドナーからのプールされたヒトIgGをミルズ社（エルクハート、IN）から購入した。サンプルをMayo ClinicのRobert A.博士の指示のもとにディスプロテイナーゼ診療所から得た。血清のサンプルはワルデンストロームマクログロブリン血症、多発性ミエローマ、リンパ腫、良性モノクローナルガンモパシーを含む、血清中のモノクローナルIgG又はIgMスパイクを特徴とする多種の症状を有する患者から得られた。
エプスタイン-バールウイルス(EBV)不死化Ｂ細胞株の作製
マーモセット細胞株B95-8をEBVの増殖及び単離のためにATCC（#CRL 1612）から得た。細胞を完全RPMI-10培地中に1x106細胞/mlで播き、続いて保湿された37℃の５％のCO2のインキュベーター中で３日インキュベートした。細胞を回収し、上澄みを10分間にわたって300xgで４℃で遠心分離によりきれいにする。EBVを含む上清を0.45μmのフィルターに通し、フロースルーを集め、-130℃で貯蔵する（液体窒素）。このEBVを含む上清は一般に102-103の形質転換単位/mlを含む。
不死化のための末梢Ｂ細胞を正常な成人(NA)、慢性関節リウマチを有する成人(AKJR)、多発性硬化症を有する成人(MS)の血液、及び胎児臍帯血(CB)から集めた。ヘパリン処理した血液(15ml)をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)中で1:2に希釈し、この希釈液12mlを50mlの遠心分離管中でフィコール-ハイペーク12mlに上層する。管を室温で８分間にわたって1500xgで遠心分離し、バフィーコート界面を取り出し、新しい50mlの遠心分離管に移す。細胞をPBS中で１回、次いでハンクス平衡生理食塩水(HBSS)中で２回遠心分離（15分間、300xg、室温）により洗浄した。次いで細胞を完全RPMI-10培地2-5ml中に再度懸濁させ、カウントする。
細胞を完全RPMI-10培地中で4x106の細胞/mlに希釈し、2.5ml（1x107の細胞）を50mlの遠心分離管に移し、EBV-上清2.5mlを添加する。管を37℃の水浴中で２時間インキュベートし、続いて１μg/mlのシクロスポリンＡを含む完全RPMI-10培地5mlを添加する。次いで細胞懸濁液10mlを25cm2の組織培養フラスコに移し、保湿された37℃の５％のCO2のインキュベーター中で３週間培養する。３週後に、培養物のアリコートを低温保存し、残部を拡張し、クローナル細胞株を制限希釈により単離する。
IgM抗体の精製
研究に使用したヒト血清サンプルは、Igクロマトグラム中の高いIgMピークの存在のみにより選択した。サンプルはMayo ClinicのRobert A.博士の指示のもとにディスプロテイナーゼ診療所から得た。血清のサンプルはワルデンストロームマクログロブリン血症、多発性ミエローマ、リンパ腫、良性モノクローナルガンモパシーを含む、血清中のモノクローナルIgG又はIgMスパイクを特徴とする多種の症状を有する患者から得た。患者血清を３日間脱イオン水に対し透析した。オイグロブリン沈殿を遠心分離（14000rpm/30分）により集め、PBSに溶解した。溶液を遠心分離（14000rpm/30分）により透明化し、PBSで平衡化したスペロース６カラム（ファーマシア、ウプサラ）でクロマトグラフィーにかけた。IgMに相当するフラクションをプールし、還元SDS PAGE（12％のゲル）により分析した。SDSゲルをシプロ・オレンジ（モレキュラー・プローブス、オイゲン）で染色し、続いてストーム840（モレキュラー・ダイナミクス）で走査することによりIgM濃度を測定した。モノクローナルIgM（シグマ、セントルイス）を濃度測定のための標準物質として使用した。IgM溶液を0.22μmのフィルターによる濾過により滅菌した。
抗原結合特異性の特性決定
髄鞘再形成を促進する能力に関するin vivo試験に先立ち、抗体の予備スクリーニングのためのアッセイとしてマウス脊髄ホモジネート(SCH)に対するELISAを使用した。選択された抗体の多反応性及び抗原特異性を更に特性決定するために、タンパク質及び化学抗原の標準パネルた対するELISA、および、切片化した神経組織中及び培養オリゴデンドロサイトにおける抗体染色パターンの分析を使用する。
ELISAアッセイ
抗体をマウス脊髄ホモジネート(SCH)に対する反応性についてスクリーニングした。SCHを0.1Mの炭酸塩緩衝液、pH 9.5中でポリスチレンミクロタイタプレートに18時間にわたって４℃で0.01mg/mlで被覆し、次いでPBSで３回洗浄した。被覆プレートを１時間にわたって室温で１％のBSAを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でブロックし、次いで2-24時間にわたって室温でブロッキング緩衝液中10μg/mlに希釈した抗体とともにインキュベートした。プレートをPBS/0.05％トウィーン20で３回洗浄し、次いで結合された抗体をビオチン化ヤギ抗IgM又はIgG、続いてストレプトアビジンに結合されたアルカリホスファターゼ、色素原の基質としてのp-ニトロフェニルホスフェートで検出する。反応の吸収を405nmで測定する。
また、抗体をタンパク質抗原（ヒト赤血球スペクトリン、ウシミオシンＨ鎖、マウスヘモグロビン、ウシトランスフェリン、ウシビメンチン、ニワトリ卵リゾチーム、ウサギアクチン、ウサギミエリン塩基性タンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン）及びウシ血清アルブミン(BSA)結合化学ハプテン（4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルアセチル(NP)、フェニルオキサゾロン（PhoX）、アキソフェニルトリメチルアンモニウム(TMA)、フルオレセイン(FL)、アゾフェニルホスホリル-コリン(PC)、アゾフェニルアルソネート(Ars)、トリニトロアセチル(TNP)）のパネルに対する反応性についても試験する。タンパク質を５μg/mlで使用し、BSA結合ハプテンを２μMのハプテン濃度で使用する。抗原をポリスチレンミクロタイタプレートに被覆し、抗体と反応させ、結合された抗体をSCH ELISAについて記載されたようにして検出する。
組織切片染色
ラットの子の小脳を抗体染色パターンの比較のための神経組織の源として使用する。新鮮な固定されていない組織を２％の低融点アガロースに埋め込み、Mcllwain組織チョッパーで300μMの矢状切片に切断する。切片を固定せず、残りの操作の間４℃又は氷で保つ。切片をHEPES緩衝アール平衡塩(E/H)中で48ウェル組織培養プレートに移し、５％のBSAを含むE/H中で30分間ブロックする。切片を2-12時間にわたって４℃で１％のBSAを含むE/H中で10μg/mlの一次抗体で染色する。切片をE/H中で３回洗浄し、２時間にわたって１％のBSAを含むE/H中で適当な蛍光二次抗体とともにインキュベートする。切片をE/H中で３回、PBS中で１回洗浄し、次いで30分間にわたって４％のパラホルムアルデヒドで後固定する。切片をPBSで３回洗浄し、2.5％の1,4-ジアザビシクロ〔2.2.2〕オクタンを含む90％のグリセリンに取り付けて光漂白を防止する。
培養オリゴデンドロサイト染色
脳半球をP0-P3 SDラットから切開し、髄膜及び血管を除去する。組織を細断し、カルシウム及びマグネシウムを含まないHEPES緩衝アール塩(E/H)中、脳当り最終容積10mlの0.25％トリプシン溶液に移す。組織を低rpmで37℃で30分間振とうし、次いで熱不活化ウシ胎仔血清を10％の最終濃度で添加してトリプシンを不活化する。MgSO4及びDNAse Iを添加し（夫々0.1％及び20μg/mlまで）、組織を更に５分間振とうする。細胞を遠心分離により洗浄し、DNase Iを含むE/H中で再度懸濁させ、ガラスピペットにより破砕して解離させる。大きい細胞残渣を沈降させ、上にある細胞上清をE/H中の４％のBSAクッションを通過させて洗浄する。細胞ペレットを培地中で再度懸濁させ、細胞をポリ-D-リジン培養プレートに1cm2当り2.5x105の細胞でプレーティングする。プレートを振とうして9-12日にオリゴデンドロサイト前駆体を単離する。この時点で培養物中にオリゴデンドロサイトの完全な表現型の広がりが存在し、最近分裂した細胞のクラスターとなって前駆細胞が上層に存在する。培養物を穏やかに振とうすることによりオリゴデンドロサイト前駆体を単離し、ポリ-リジン被覆カバースリップに再度プレーティングし、培地から成長因子を除去することにより刺激して分化させる。
PBS及び５％のBSAでブロッキングした後、生きた表面染色を固定されない細胞について４℃で15分間行なう。細胞内染色を４％のパラホルムアルデヒドによる固定及び0.1％のトリトンX-100による透過後に行なう。一次抗体をフルオレセイン結合二次抗体で検出する。カバースリップを2.5％の1,4-ジアザビシクロ〔2.2.2〕オクタンを含む90％のグリセリン中で取り付けて光漂白を防止し、エピ蛍光顕微鏡で見る。
ウェスタンブロッティング
精製TMEV（Njengaら, 1996）を15％のアクリルアミドゲルによるSDS-PAGEにより分離した。タンパク質をエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜に移した。膜を２時間にわたって室温で５％の無脂肪乾燥ミルク及び0.05％のトウィーン20を含むトリス緩衝生理食塩水でブロックした。膜をプールしたヒトIgM、プールしたヒトIgG、ワルデンストロームのマクログロブリン血症を有する２人の患者からのIgM、及びウサギポリクローナル抗TMEV Ab (1:2000) (Njeng包ら, 1996)とともに４時間にわたって室温でインキュベートした。全てのヒトIgを同じ濃度（10μg/ml）で使用した。結合したIgを5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウム(BCIP/NBT)を使用してビオチン化ヤギ抗ヒトabs又はビオチン化ヤギ抗ウサギabs（両方ともジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリィズ社、ウェスト・グルーブ、PAから）及びアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンで検出した。
Ｂ．ヒトモノクローナル抗体を使用する髄鞘再形成の促進
TMEV誘導髄鞘脱落−TMEM誘導髄鞘脱落の生成のために、脳内ウイルス注射をメトファンで軽く麻酔した生後4-6週の動物について行なう。TMEVのダニエル株の2x105 PFUを含む10μl容積を送出するハミルトンシリンジで27ゲージのニードルを使用してウイルスを注射する。脳内注射は髄鞘脱落を伴う慢性ウイルス感染の98％より大きい発生率をもたらす。髄鞘再形成実験のための慢性感染した動物は一般に感染後6-8ヶ月である。
抗体治療プロトコル
慢性髄鞘脱落を有する動物にリン酸緩衝生理食塩水中の精製抗体の腹腔内(IP)注射をする。TMEV感染動物について、注射スケジュールは100ml中の50μgの週２回の注射からなる。抗体治療の期間は５週（合計用量500μg）である。次いで動物を犠牲にし、脊髄組織を以下に記載されるような形態学的評価のために処理する。夫々の異なる抗体治療について、９匹の慢性感染した雌のSJL/Jマウスに抗体を注射する。治療期間の終了時に、６匹の動物を潅流し、髄鞘脱落／髄鞘再形成の形態計測定量のために処理し、３匹を軸索保全の評価に使用する凍結組織のために犠牲にする。所定の抗体について再現性のある一致した結果を伴う三つの別々の治療試験が、データを有意と考える前に必要とされる。PBS及びイソタイプ対照グループが夫々の新しい抗体治療実験のための陰性対照として含まれる。
髄鞘脱落／髄鞘再形成の形態学的評価
夫々の実験の終了時に、夫々の動物の脊髄が組織学的に評価されるであろう。マウスをペントバルビタールで麻酔し、固定剤（１％のグルタルアルデヒドを含むリン酸塩緩衝４％のホルムアルデヒド、pH 7.4）の心臓内投与により潅流する。脊髄を取り出し、1mmのブロックに冠状切開し、オスミウムで後定着し、アラルダイトに埋め込む。厚さ１ミクロンの断画を夫々のブロックから切断し、４％のパラフェニルジアミンで染色する。
この技術は再現性があり、脊髄白質中の髄鞘の一致した視覚化を可能にする。
ツァイスデジタル分析システム（ZIDAS）及びカメラルシダを使用して、髄鞘脱落及び髄鞘再形成を定量する。夫々のマウスについて、索全体を頸部から近位尾骨脊柱領域までスパンする10の脊髄断片を試験する。白質の全領域、髄鞘脱落の面積、及び髄鞘再形成の面積を夫々の切片について測定し、特定マウスについて分析される全ての10の切片からの面積を加えて夫々のマウスについて全面積を得る。髄鞘脱落の領域は多量のミエリンデブリ、マクロファージを吸込んだデブリ、細胞浸潤及び裸の軸索によって特徴づけられる。オリゴデンドロサイト髄鞘再形成は異常に薄い髄鞘を有する軸索の領域及びシュバン細胞の不在によって形成の程度の統計的比較を行なう。
リゾレシチン誘導髄鞘脱落
これらの実験のため、生後12週のSJL/Jマウスをナトリウムペントバルビトールで麻酔し、背側ラミネクトミーを脊髄の上部胸領域で行なう。ハミルトンシリンジに取り付けられた34ゲージのニードルを使用してリゾレシチンの１％溶液１μmlを索の背外側面に直接注射する。動物を注射後の21日に殺し、脊髄の注射領域を除去し、形態学的評価のために処理する。
髄鞘脱落の第二モデルとして、リゾレシチンの脊髄内注射を使用した。生後12週のSJL/Jマウスをナトリウムペントバルビトール（0.08mg/g）の腹腔内注射により麻酔した。背側ラミネクトミーを脊髄の上部胸領域で行ない、リゾレシチン（L-a-リゾホスファチジルコリン）（シグマ、セントルイス、MO）を既に記載されたようにして注射した（Pavelkoら, 1998）。簡単に言えば、ステレオタクチック(stereotactic)ミクロマヌピュレーターに取り付けられたハミルトンシリンジに取り付けられた34ゲージのニードルを使用してマーカーとして添加されたエバンスブルーを含む無菌PBS（pH 7.4）中のリゾレシチンの１％溶液を注射した。ニードルを脊髄の背外側部分に挿入し、リゾレシチン溶液１μlを注射し、次いでニードルを徐々に抜き取った。傷を二つの層中で縫合し、マウスを回復させた。リゾレシチン注射の日を０日と称した。
リゾレシチン注射の７日後に、マウスをヒトIgM又はヒトIgG（1mg/注射毎）のボーラス腹腔内注射で治療した。対照マウスをPBSのボーラス腹腔内注射で処置した。リゾレシチン注射の３週後及び５週後に、マウスを犠牲にし、厚さ１(mの切片を前節に記載されたようにして調製した。最大のリゾレシチン誘導髄鞘脱落病変を示すアラルダイトブロックを定量分析に使用した。ツァイスインターラクティブデジタル分析システムを使用して病変の全面積を定量した。ニコン顕微鏡／コンピュータ分析システムを使用して髄鞘再形成した繊維の合計数を定量した。データを髄鞘再形成された軸索の数／病変1mm2として表した。
リゾレシチン処理マウスにリゾレシチン注射後０日、３日、７日、10日、14日、及び17日に抗体の50μgのIP注射を施す。動物をリゾレシチン注射後の21日に殺す。本発明者らは10匹の動物の実験治療グループで統計上有意な治療効果をルーチンで見出す。PBS対照グループ及びイソタイプ対照グループが陰性対照として利用できる。
Ｃ．髄鞘再形成促進ヒトモノクローナル抗体の作用機序
Ca2+放射蛍光分析
生後2-4日のラットの子からの混合一次グリア培養物をポリ-D-リジン被覆カバースリップに播き、分析の前に5-7日培養する。Fura-2-AM及びプルロニックF-127を1:1で混合し、DMEM（無血清）に添加して溶液中4mMのFura-2（Fura-2ローディング培地）を生じる。
細胞を含むカバースリップをDMEMで１回洗浄し、次いで60分間にわたって37℃でFura-2ローディング培地中でインキュベートする。次いで細胞をDMEM中で４回洗浄する。コンピュータ制御データ取得システムに連結された、二つの異なる励起波長：340nm及び380nmにおける510nmの蛍光放出のデジタル像を捕捉する倒立蛍光顕微鏡上の記録チャンバー内にカバースリップを取り付ける。夫々の記録について、デジタル像を10秒間隔で600-800秒にわたって個々の細胞から捕捉する。相対的内部Ca2+濃度を340nm/380nmの蛍光の比として計算する。全ての記録はDMEM 1ml中で37℃で行なう。
濃縮した（PBS中60mg/ml）抗体原液50mlを記録チャンバーに添加することにより試験抗体を導入し、3mg/mlの最終濃度とする。試験抗体の添加の効果を記録した後、カルシウムイオノホア原液（PBS中200mMのBr-A23187）50mlをチャンバーに添加して10mMの最終濃度を生じる。
考察
静脈内投与された正常なヒト免疫グロブリン(Ig)、特にIgG（IVIg）はギラン-バレー症候群（van der Mechら, 1992）、慢性イディオパシー髄鞘脱落神経障害（van Doornら, 1991）、多病巣運動神経障害（Chaudhryら, 1993）、多発性筋炎（Cherinら, 1991）、及び重症筋無力症（Edan及びLandgraf, 1994）を含む種々の自己免疫神経疾患を治療するのに有効であることが示されていた。投与されたIgの作用機序は明らかではない。幾人かの研究者らはこの治療がＴ細胞媒介自己免疫CNS疾患、例えば、多発性硬化症(MS)に有効であり得ることを示唆していた（van Engelenら, 1992; Achironら, 1992; Fazekasら, 1997; Achironら, 1998; Sorensenら, 1998）。
本発明者らはMSの新規治療を開発するためのモデルとしてマウス脳脊髄炎サイラーウイルス(TMEV)誘導髄鞘脱落を使用した。このピコルナウイルスをマウスの感受性系統の脳内に接種する場合、TMEVはMSに臨床上かつ病理学上類似する免疫媒介進行性CNS髄鞘脱落を誘導する。本発明者らは正常なCNS抗原に対し誘導されるマウスIgM（モノクローナル抗体(mAb)がTMEV誘導髄鞘脱落後にCNS髄鞘再形成を促進することを既に示した（Millerら, 1994; Asakuraら, 1998）。またSCH94.03と称されるプロトタイプ抗体がリゾレシチン誘導髄鞘脱落後に自発性CNS髄鞘再形成の速度を増進することが示され（Pavelkoら, 1998）、実験自己免疫脳脊髄炎(EAE)の再発モデルで重篤度及び再発の頻度を減少することが示された。これらの髄鞘再形成促進IgM mAbの共通の特徴はそれらがオリゴデンドロサイトの表面抗原に反応し、天然自己抗体の表現型の特徴及び遺伝子型の特徴を有することである（Miller及びRodriguez, 1995; Asakuraら, 1998）。天然自己抗体は自己抗原及び非自己抗原との広い反応性スペクトルを有する。これらの抗体は正常な循環IgMレパートリーの主要なフラクションを代表する。それらの生理機能は知られていないが、天然自己抗体の有益な効果が重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、及び非肥満糖尿病を含む種々の自己免疫疾患モデルで報告されていた（Sundbladら, 1989; Hentatiら, 1994; Anderssonら, 1991, 1994）。
IVIgは3000〜10000の健康なドナーのヒト血漿プールから精製され、95％より多いIgG及び無視できる量のIgMを含む（Dalakas, 1997）。本発明者らの先の観察に基づいて、本発明者らは健康なドナーからのヒトIgM（これは天然自己抗体中に濃縮される）が通常のIVIgよりも髄鞘脱落疾患の有効な治療であろうと仮定した。この仮説を試験するために、本発明者らは慢性TMEV感染マウスを2,500以上の健康なドナーから得られたプールされたヒトIgMで治療し、CNS髄鞘再形成について調べた。
この研究において、本発明者らは健康なドナーからプールされたヒトIgMによる治療がプールされたヒトIgG、又はPBSによる治療と較べてTMEV感染マウスでオリゴデンドロサイトによる有意に増進された髄鞘再形成をもたらすことを実証した。本発明者らはプールされたヒトIgMがタンパク質及びハプテンに対する多反応性天然自己抗体の集団を含むことをELISA及び免疫組織化学により確認した。これはポリクローナルヒトIgMが髄鞘脱落疾患のモデルでCNS髄鞘再形成を促進し、従って健康なドナーからのIgMが通常のプールされたヒトIgGよりもヒト炎症性髄鞘脱落疾患を治療するのに有効であり得る可能性を生じることの最初の実証である。
本発明者らが知る限り、プールされたヒトIgMは、それが安全であり、ひどい感染症及び免疫不全に有効であることが示されていにもかかわらず、MSには試験されていなかった。
天然自己抗体はIgMレパートリーの主要な画分である。マウスでは天然自己抗体は専らIgMであるが、ヒトでは天然抗体はまた頻度は少ないがIgGイソタイプのものもある。現在まで、髄鞘再形成を増進することが示された唯一のmAbはオリゴデンドロサイト反応性IgM（天然自己抗体の遺伝子型及び表現型の特徴を有する、mAb）であった（Asakuraら, 1998）。
結論すると、本発明者らは論理的スクリーニング技術が髄鞘脱落のモデル系において髄鞘再形成を促進する可能性を有するヒトモノクローナル抗体を同定するのに使用し得ることを実証した。抗体の性質、例えば、CNS特異性、オリゴデンドロサイトに存在する抗原を認識する能力及び脊髄ホモジネートへの強い結合は、それらを組み合わせて、どの抗体がin vivoの髄鞘再形成について試験するのに最良の候補であるのかを予測することができる。これらのモノクローナル抗体の多くがヒトCNSに良く結合し、このことは幾つかがヒト疾患を成功裏に治療するための療法として有益であり得ると希望する理由を与える。
以下はこの実施例に引用された文献のアルファベット順のリストである。
参考文献
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実施例２
自己抗体によるエピトープ模倣ペプチドのスクリーニング
この実施例において、本発明の自己抗体に相当する、認識された抗原、又はこれらの部分を模倣するペプチドの同定及び調製が記載される。本明細書に先に記載されたように、このようなペプチドは、増大された循環レベルの抗体に有利に応答性であることが示された疾病状態に対する増進された免疫応答を誘発するためのワクチンとして利用し得る。
ペプチド模倣物の同定のための例示的戦略は、髄鞘再形成を誘導することができると実証されたマウス自己抗体、例えば、HNK-1抗体、に特異的に結合するペプチドについて検索することであろう。HNK-1エピトープ抗原は炭水化物である。HNK-1エピトープは神経組織からの糖脂質及び糖タンパク質上に主として発現される（McGarryら (1983) Nature 306:376-378; Ilyasら (1984) Biochem. Biophys. Res. Comm. 122:1206-1211; Kruseら (1984) Nature 311:153-155; Yuenら (1997) J. Biol. Chem. 272:8924-8931）。HNK-1抗体と反応する構造がヒト末梢神経中に存在する主要抗原糖脂質についてChou及びJungalwalaにより最初に記載された。その組成、糖連鎖、立体配置及びスルフェート基の位置は、SGGL-1についてスルフェート-3 GlcAβ (1-3) Galβ (1-4) GlcNAcβ(1-3) GalNAcβ (1-3) Galβ (1-4) Glcβ(1-1)-セラミドとして、またSGGL-2についてスルフェート-3 GlcAβ (1-3) Galβ (1-4) GlcNAcβ (1-3) Galβ (1-4) GlcNAcβ (1-3) Galβ (1-4) Glcβ (1-1)-セラミドとして特性決定された（Chouら, 1986）。
ファージディスプレイされたランダムペプチドライブラリーのスクリーニングは分子多様性の豊富な源を与え、注目する受容体分子に結合するペプチドリガンドを同定する強力な手段に相当する。結合ペプチドを発現するファージは注目する標的を用いてアフィニティー精製により選択される。この系は多数のファージを一度にスクリーニングすることを可能にする。夫々の感染性ファージはその表面で発現されたランダム配列をコードするので、特定のファージをアフィニティーマトリックスから回収して、感染の別のラウンドにより増幅することができる。こうして、固体担体に固定された選択分子をそれらに結合するペプチドを選択するのに使用し得る。この操作は、選択分子に結合し、しばしば共通のコンセンサスアミノ酸配列を提示する幾つかのペプチドを明らかにする。選択したライブラリーメンバーの生物学的増幅及び配列決定により、一種以上のペプチドの一次構造決定が可能になる。
ファージディスプレイにより同定されたペプチドリガンドは頻度高く標的分子の一つ以上の天然結合部位と反応示し、しばしば一つ以上の標的の天然リガンドに似ている。この系は抗体により認識されるペプチドエピトープを同定するのにしばしば使用されてきたが、それはまた炭水化物分子のペプチド模倣物を見出すのに成功裏に使用されてきた。炭水化物抗原に代えてペプチド模倣物を使用することに関する研究がKieber-Emmonsら, 1998により総説されていた。炭水化物決定基を模倣するペプチドの実証された能力は、この模倣が糖に代えてアミノ酸を使用して行なわれてはいても、特異性パターンを再現できることを示している。
15merペプチドの増幅された開始ライブラリーを用いて、第一スクリーニングを行なった。HNK-1抗体への結合に関して陽性の幾つかのクローンを見出した。HNK-1を用いる初期スクリーニングにおいて、結合されたファージをpHシフトにより遊離させたが、その結果、特異的に結合されたファージと非特異的に結合されたファージの間に差別がなかった。それ故、HNK-1抗体がジスルフィドブリッジを含むカップリング剤でビオチン化されているスクリーニングを行なった。ビオチン化抗体をストレプトアビジン被覆チューブと前もって反応させ、結合しなかった抗体を洗浄して除き、免疫チューブをスクリーニングに使用する。あるいは、ファージを溶液中でビオチン化抗体と反応させ、次いでビオチン化複合体をストレプトアビジンで被覆された免疫チューブと反応させる。いずれの場合にも、結合しなかったファージを洗浄して除いた後、結合したファージをジチオスレイトール（これは抗体及び付着されたファージを放出する）（Griffithsら, 1994）)の添加により溶離する。更に、これらのスクリーニングをマウス血清（12.5％）の存在下で行なった。これはHNK-1抗体に対し大過剰のマウスIgMを供給し、その結果、HNK-1抗体への非特異的結合が抑制されるはずである。
或る例では、溶液中のファージを“前もって固定された”抗体と反応させる場合、選択の第三又は第四ラウンド後に結合するファージの数の上昇が得られた。試験したクローンは全マウスIgMに同様に結合した。最後の実験において、種々の操作を並行して比較した：ファージをマウス血清の存在下又は不在下でHNK-1被覆免疫チューブ又は溶液中のビオチン化HNK-1に結合させた。前もって被覆された抗体を使用して濃縮が観察されたが、選択されたクローンはHNK-1に結合したが、やはり全マウスIgMにも結合した。選択されたファージはまたL2-412抗体（これはHNK-1と同じ炭水化物を認識する）に反応性であったが、HNK-1は末端硫酸基を必要としるが、一方、L2-412抗体は硫酸基を有する、又は有しない炭水化物を認識することは興味深い。
材料及び方法
材料
15-merペプチドライブラリー及び大腸菌 K91 Kan細胞を使用することができる。15-merライブラリーを繊維状ファージfd-tet（Scottら, 1990）の誘導体であるベクターfUSE5中で構築した。このベクターは選択を可能にするテトラサイクリン耐性遺伝子を有する。繊維状ファージはそれらの宿主を殺さない。こうして、感染細胞はテトラサイクリン耐性になり、増殖し続け、子孫粒子を分泌する。大腸菌株K91KanはK38（Lyonsら, 1972）のλ-誘導体であり、染色体遺伝子型thiを有し、カナマイシン耐性遺伝子(mkh)（Smithら, 1993; Yuら, 1996）を有する。ペプチド及びＣ末端システインを介してSPDP活性化BSA（60mg）を結合させたペプチド（10mg）が、例えば、ANAWA AG（8602 Wangen、スイス）から得られる。テトラサイクリン及びカナマイシンはシグマから購入し得る。L2/HNK-1糖脂質を本発明者らの研究所でウシ馬尾からB. Beckerにより精製した。硫酸化糖、SO3-GlcA-Gal-アリルは有機化学のゼリンスキー協会（ロシア科学アカデミィ、モスクワ）のN. Nifant'evにより親切に提供された。
抗体
ラット中で生じさせた、HNK-1炭水化物を認識するモノクローナル抗体（mAb L2-412）の特性決定及び精製がNoronha, A.ら, Brain Res. 385, 237-244 (1986)により記載されていた。L2-412抗体はブダペスト条約のもとにDSMZ−Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, ドイツ)に寄託され、 と称される。HNK-1抗体はATCCからTIB200として入手し得る。ポリクローナルラットIgG及びHRP-ストレプトアビジンをシグマ（米国）から得た。HRP／抗M13ポリクローナル抗体をファーマシア・バイオテクから購入した。ラットIgGに対し誘導されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体をジャクソン・イムノリサーチから得た。
開始ライブラリーの増幅
15merペプチドをコードする一次ライブラリーを以下のようにスミス操作（Smithら, 1992）に基づいて増幅した。
細胞が必要となる前の夜に、100μg/mlのカナマイシンを含む、LB培地（g/Lバクト-トリプトン、5g/Ｌ NAcl、5g/L 酵母エキス）2mlにK91Kan細胞を接種し、37℃で一夜振とうした。テリフィック・ブロース100mlを含む1Lのフラスコを調製した（バクト-トリプトン12g、酵母エキス24g、グリセロール(4ml)5.04gを水900mlに添加し、90mlづつオートクレーブ処理した；リン酸カリウム緩衝液（0.17M KH2PO4、0.72M K2HPO4、pH調節を必要としない）を使用前に夫々に90mlに添加した）。
テリフィック・ブロース100mlにK91kan細胞の一夜培養液1mlを接種し、1：10希釈液のOD600が0.2に達するまで激しく振とうした。次いで振とうを10分間にわたって遅くしてF-ピリを再生させ、開始ライブラリー10μlをフラスコに添加した。遅い振とうを続けて吸着を可能にした。次いで培養液を0.22μg/mlのテトラサイクリンを含むLB1Lに移し、35分間にわたって37℃で激しく振とうした。テトラサイクリン濃度を20μg/mlに調節し、アリコートを力価の測定のために採取した。感染細胞をテトラサイクリン培地に塗布し、テトラサイクリン耐性コロニーの数をカウントすることによりファージを力価測定した（回収力価）。この方法で定義した感染性単位を形質転換単位(TU)と称し、感染性は物理的粒子の数に対するTUの数の比である。典型的には、培養液50μlのアリコートを除去し、0.2μg/mlのテトラサイクリンを含むLBで希釈した（希釈範囲は103-105であった）。夫々の希釈液200μlのアリコートを40μg/mlのテトラサイクリン及び100μg/mlのカナマイシンを含む寒天プレートに塗布し、37℃で一夜インキュベートした。コロニーを翌日にカウントした。この段階で、テトラサイクリン耐性コロニーの力価は約107/mlであるべきである。培養液の残部を一夜激しく振とうした。
翌朝、遠心分離の２工程（4000xg、10分間、４℃及び10,500xg、GSA、10分間、４℃）の後に得られた二重にきれいにされた上清を0.15倍容のPEG/NaCl溶液（3.3M NaCl溶液中16.7％のポリエチレングリコール）を添加することにより４℃にて一晩沈殿させた。遠心分離（10,500xg、GSA、40分間、４℃）後に集められた沈殿したファージをTBS（50 mM トリス-HCl pH 7.5、150 mM NaCl）10mlに溶解し、0.15倍容のPEG/NaCl溶液をファージ懸濁液に添加し、氷の上で１時間インキュベートすることにより第二の沈殿を行なった。この段階で、大きな沈殿が明らかな筈である。
遠心分離（14,500xg、SA600、10分間、４℃）後に得られたペレットをTBS10mlに再度溶解し、CsCl 4.83gを含む、風袋を量っておいた容器に移した。容器の風袋を再度量り、TBSを10.75gの正味の重量まで添加した。これはCsClの31％w/vの溶液（密度1.30g/ml）12mlを生じる筈ある。その溶液を150,000xgで５℃にてSW41ローター（ベックマン）中で48時間遠心分離した。強い可視光源の助けにより、淡青色の非綿状バンド（増幅したファージを含む）が狭い綿状の不透明な白色バンド（おそらくPEGに由来する）の上に見えた。最初にファージバンドの上にある液体を徐々に吸引し、次いでピペットを使用して、下の綿状バンドをできるだけ多く回避しつつファージバンドを抜き取ることによりファージバンドを回収した。次いでファージバンドを26mlのポリカーボネート遠心分離ボトル（これはショルダーまでTBSで満たされていた）に送出し、Ti70ローター（279,000xg、４時間、５℃）中で遠心分離し、培養液1L当り2mlのTBS中に再度懸濁させた。ファージはこの形態で冷蔵庫中に安定に貯蔵することができる。
次いで増幅されたライブラリーを以下のようにして力価測定した（最終力価）。107から1010までの希釈範囲をカバーするファージの幾つかの希釈液をTBS/ゼラチン（TBS100ml中ゼラチン0.1g）中で調製した。次いでこれらの希釈液の夫々10μlを使用してこの節の最初に記載されたようにして調製されたK91kan細胞10μlを感染させ、夫々の希釈混合物を室温(RT)で15分間インキュベートしてファージを濃縮した細胞に感染させた。0.2μg/mlのテトラサイクリンを含むLB 1mlを添加し、振盪-インキュベーター中で37℃で30分間インキュベートした。次いで感染細胞を上記のように40μg/mlのテトラサイクリン及び100μg/mlのカナマイシンを含む寒天プレートにプレーティングした（200μl）（回収力価）。
スクリーニング操作
Ａ．直接結合
mAbL2-412で被覆された免疫チューブ（ヌンク、マキシソーブ）を使用してファージライブラリーをパンニングした。チューブを一夜にわたって４℃にて、スクリーニングの第一ラウンドについてはPBS（合計容積1ml）中10μg/mlのタンパク質とインキュベーションし、そしてスクリーニングの第２および第3ラウンドについては１μg/mlの抗体L2-412とともにインキュベートすることにより被覆した。ブロット（PBS中５％の無脂肪乾燥ミルク、0.05％(v/v)のトゥイーン20）で４℃にて２時間ブロックした後、免疫チューブ当りファージライブラリーの1011の形質転換単位（250μlの容積中）を回転チャンバー中で37℃で１時間結合させた。第二ラウンド及び第三ラウンドについて、非特異的結合物の数を減少するために、ファージを免疫チューブに添加する前に100μg/mlのラットIgGとともに１時間プレインキュベートした。未結合ファージ（それから陰性対照ファージが選ばれた）の回収後に、チューブをPBS-0.05％(v/v)トゥイーン20で10回洗浄し、４℃で0.1MのグリシンpH 2.2（合計容積0.5-1ml）で10分間溶離した。溶離したファージを1.5MのトリスpH 9で中和し、次いで室温で15分間にわたって対数期大腸菌 K91 Kan細胞0.5-1mlを感染するのに使用した。
感染させた細菌を0.2μg/mlのテトラサイクリンを含むLB20mlに移し、力価（回収力価）の測定のためのアリコートを除去した後、前節に記載されたようにして一夜増殖させた。次いで増幅された溶離物を２回遠心分離し（10分間、3600xgそして10分間、14,500xg、SA600）、最終上清を一夜にわたって４℃で0.15倍容のPEG/NaClで沈殿させた。ファージをペレットにし（15分間、14,500xg、SA600）、ピペット操作及び撹拌によりPBS 1mlに溶解し、１分間微量遠心分離して不溶物をペレットにし、再度少なくとも１時間にわたって４℃でPEGにより沈殿させた。大きな沈殿がこの段階で見えるべきである。10分間の微量遠心分離後に得られたペレットを最後に0.02％のアジドを含むPBS 200μlに溶解した。この増幅された溶離物は４℃で保存および維持することができる。ライブラリーを３回増幅及び選択した。
100倍過剰のマウスIgMを入れて非特異的結合を減少させた以外は同じ操作をHNK-1抗体を用いるHNK-1スクリーニングに使用した。
ファージを記載されたようにして力価測定した（最終力価）。コロニーを翌日にカウントし、回収力価を先のラウンドの力価（インプット）で割ることによりスクリーニングの収率を計算した。
Ｂ．ビオチン化抗体を用いるスクリーニング
二つの操作を使用してこのスクリーニングを行なった。両方ともG. Smithのプロトコル（未公表のプロトコル）に従った。NHS-SS-ビオチンを使用してHNK-1抗体を以下に記載されるようにしてビオチン化した。NHS-SS-ビオチンは、ビオチン基が続いてジチオスレイトール(DTT)と一緒のインキュベーションにより除去されることを可能にするために、ビオチンをジスルフィドブリッジを介してタンパク質に連結してある。L2-412抗体を以下に記載されるようにして同様にビオチン化した。操作Ａでは、ビオチン化抗体を最初にストレプトアビジン被覆免疫チューブに結合させ、続いてこれを使用してファージインプットをパンニングする。操作Ｂにおいては、ビオチン化抗体を溶液中でファージとともにプレインキュベートし、その反応混合物をストレプトアビジン被覆免疫チューブに結合させる（数分間）。
操作Ａにおいて、免疫チューブを一夜にわたって４℃でローターにて、合計容積1ml（チューブの全表面を湿潤させる）の、PBS中の10μg/mlのストレプトアビジンで被覆した。ストレプトアビジンを捨て、チューブにブロッキング溶液、0.5％(w/v)BSAを含むPBSで４℃にて２時間にわたって満たした。PBS-0.05％(v/v)のトゥイーン20（PBS-T）で６回洗浄した後、ビオチン化抗体を添加した。典型的には、ブロッキング溶液400μl中のビオチン化HNK-1 3μg、又はビオチン化L2-412抗体５μgを添加した。抗体を少なくとも２時間（又は一夜）にわたって４℃にてローター上で結合させた。PBS-Tで６回洗浄した後、ブロッキング溶液400μl中の、15-mer開始ライブラリーからの1010のファアージを４時間にわたって４℃にてローター上で夫々の抗体被覆免疫チューブに結合させた。操作Ｂにおいて、免疫チューブの被覆の際に、1010のファージを一夜にわたって夫々ビオチン化HNK-1又はL2-412 3又は５μgとともにプレインキュベートした。次いでビオチン化抗体を10分間にわたって４℃にてローター上で被覆免疫チューブに結合させた。どちらの操作においても、チューブをその後に10回洗浄し、次いでファージ-抗体複合体を1-5分間、室温にてPBS中の20 mM DTT（容積0.5ml）で溶離した。増幅及び力価測定を上記のようにして行なった。ライブラリーを４回の増幅及び選択にかけた。
ELISAスクリーニング
Ａ．陽性クローンの検出のための直接結合
テトラサイクリン及びカナマイシン耐性の個々のコロニーを96ウェルプレート（ヌンク）中で20μg/mlのテトラサイクリンを含むLB中で一夜にわたって37℃にて増殖させ（300μl/ウェル）、次いでジュアン遠心分離機中で10分間にわたって3000rpmで遠心分離し、上清（100μl）を既にmAbL-2-412 (100μl、μg/ml、一夜、４℃)で被覆された別の96ウェルプレート中で２時間インキュベートし、PBS-0.5％(w/v) BSAと一緒のインキュベーションにより２時間にわたってブロックした。５回洗浄した後、ファージの結合を１時間にわたって1:2000の希釈でHRP結合抗M13抗体（ファーマシア、バイオテク）と一緒のインキュベーションにより検出した。ペルオキシダーゼ反応をHRP緩衝液（0.1Mの酢酸ナトリウム、0.05MのNaH2PO4、酢酸で4.2に調節されたpH）中に0.01％の過酸化水素及び0.1％(w/v)の2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)-ジアンモニウム塩（ABTS、ベーリンガー・マンハイム）を含む現像剤100μlの添加により開始した。着色反応生成物の吸収をマルチスキャン・タイターテクプラス（フロー、スイス）中で405nmで測定した。並行して、夫々のクローンをまたラットIgG（100μl、PBS中１μg/ml；同じく２時間にわたってブロックした）で被覆された96ウェルプレートで試験した。選択された結合クローン（陽性ファージという）（これらはmAbL-2-412の陽性結合物であったが、ラットIgGに結合しなかった）を生じる細菌を40μg/mlのテトラサイクリン及び100μg/mlのカナマイシンを含むLB培地を含む寒天プレートに線状に塗った。二つの独立コロニーを採取し、mAb L2-412に対する陽性について再度アッセイした。陽性の単一コロニーを40％のグリセロール中で-80℃にて貯蔵した。
Ｂ．競合結合
ミクロタイタープレート（ヌンク）をL2/HNK-1糖脂質（50μl、１μg/ml、EtOHに溶解した）で被覆し、一夜乾燥させた。ウェルを２時間にわたってPBS中の0.5％(w/v)の脂肪酸を含まないBSAでブロックしながら、予め測定した限界濃度のL-2-412を、遊離ペプチドについては2.2 mMの濃度、SO3糖について5mMの濃度で開始する、インヒビターの連続２倍希釈列並びに1012の陽性ファージ及び陰性ファージ（陰性ファージはスクリーニングの第一ラウンドの未結合フラクションからクローン化された）とともにプレインキュベートした。次いでプレインキュベートした混合物を100μlでウェルに添加し、RTで１時間インキュベートした。PBS-0/05％(v/v)トゥイーン20で５回洗浄した後、mAb L2-412の結合を１時間のHRP-結合ヤギ抗ラットIgGと一緒のインキュベーション、続いて先に記載された着色反応により検出した。インヒビター存在下の基質へのmAb L2-412の結合の抑制のパーセンテージをインヒビター非存在下で得られた対照値（抑制の０％）を基準にして計算した。
Ｃ．結合の抑制
ミクロタイタープレートを一夜にわたって４℃でPBS中のラミニン（ギブコ/BRL）（10μg/ml、100μl）、又はmAbL-2-412（１μg/ml、100μl）で被覆した。全ての以下の反応工程を室温で行なった。PBS＋0.5％(w/v)BSAでブロックした後、30μMの濃度で開始してBSAにカップリングされたペプチド（ANAWA Ag、スイス）の連続２倍希釈系列50μlを1-2時間にわたってRTで添加した。次いで既に測定された、関係するペプチドを有する限界数のファージを添加し、更に１時間インキュベートした。結合しれたファージをELISAスクリーニング節に記載されたようにしてHRP/抗M13抗体で検出した。ラミニンに代えて、固定化L2-412、抗体L2-412への陽性ファージの結合と競合する、BSAにカップリングしたペプチド、を用いて類似の実験を行った。
Ｄ．ラミニンへの直接結合
ミクロタイタープレートを上記のようにして100μlのmAb L2-412又はラミニンで被覆し、BSAにカップリングさせたビオチン化ペプチド100μlを30μMの濃度で開始して添加し、室温で２時間インキュベートし、HRP-ストレプトアビジンで検出した。
DNA配列決定
凍結されたグリセロール原液から爪楊枝で陽性クローンを採取して20μg/mlのテトラサイクリンを含むLB中で一夜にわたって37℃で増殖させた。ダブルスピン法を使用して、一本鎖DNAをG. Smith (1992)により記載されたようにして精製し、サーモ・シーケナーゼ・サイクルシーケンシングキット（アマシャム）で配列決定し、自動化シーケンサー（B10ゼネティック・アナライザー、アプライド・バイオシステムズ社）にかけた。
ビオチン化
製造業者の指示に従ってスルホ-NHS-ビオチン（ピアス）を使用してHNK-1抗体、BSA及びBSAにカップリングさせたペプチドのビオチン化を行なった。抗体については10:1のモル比を使用し、BSA又はBSAにカップリングさせたペプチドについてはモル比5:1を使用した。ビオチン化生成物を一夜にわたってPBSに対し４℃で透析した。
神経突起外殖実験及び培養
運動神経細胞の調整
カバースリップを160℃で一夜ベーキングすることによりそれらを滅菌し、４℃でポリオルニチン（シグマ、水中1.5μg/ml）と一緒に一晩インキュベーションして被覆した。次いでカバースリップを３回水洗し、更に以下のように試験物質で被覆した。1)BSA-ペプチドコンジュゲートをPBSに100μg/mlで溶解し、卓上ソニケーターで１分間音波処理し、最高速度で微量遠心分離機中で20分間遠心分離した。上清のタンパク質濃度をBradfordの方法（Bradfordら, 1976）により毎回測定した。次いで複合体120μlをコラーゲン溶液（PBS中20μg/mlのコラーゲン）280μlと混合し、100μlを一夜にわたって４℃にて夫々のカバースリップ上に塗布した。2)陰性対照として、未処理のBSAをペプチド-BSA結合体に代えて使用した。3)L2/HNK-1炭水化物を有する糖脂質を10μg/mlの濃度でエタノールに溶解し、80μlを上記コラーゲン溶液1mlに添加した。100μlの容積を被覆のために使用した。カバースリップを四重に24ウェルプレート（ヌンク）に入れ、最後に３回洗浄し、その後に細胞を塗布した（カバースリップは決して乾燥させなかった）。
運動神経細胞をArakawa（1990）により記載されたようにL-15培地（ライフ・テクノロジィズ）中に0.05%のDNAse 1(シグマ)、0.1％のBSAを含む氷冷溶液1ml中で生後６日のニワトリ胚の脊髄を解離させて調製した。細胞をL-15中の6.8％のメトリザミド（フルカ）2mlに上層し、500xg、４℃で15分間遠心分離した。メトリザミド／培地界面から回収した細胞をL-15 5ml中で希釈し、BSA（L-15中４％のBSA）の4mlのクッションの上に乗せ、300xg、４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを１％のN2補充物（ギブコ）及び15μg/mlのニワトリ筋肉抽出物（3.5mg/ml）を補充した完全培地（L-15中の22 mM NaHCO3、22 mM グルコース、１％のペニシリン及びストレプトマイシン（ギブコ））0.5-1ml中に再度懸濁させた。30,000の細胞をBSAにカップリングさせたペプチドの存在下又は不在下でポリ-オルニチン／コラーゲン被覆カバースリップにプレーティングし、保湿されたチャンバー中で37℃、５％のCO2でインキュベートした。神経突起の長さ及び数を測定し、その他の細胞と接触しておらず、24時間培養後の細胞体の直径と同じ長さである少なくとも一工程離れた、単離された神経細胞についてカウントした。
背根神経節神経細胞の調節及び培養
運動神経細胞を用いた実験と同じようにカバースリップを調製した。背根神経節神経細胞を胚の11日のニワトリ卵から単離した。神経節を消化溶液（HBSS培地中0.05％のトリプシン、0.01％のDNAse 1）1mlに移し、2-5分毎に再度懸濁しながら37℃で15分間インキュベートした。次いで神経節を氷冷解離溶液（L15培地中0.05％のDNAse 1、0.1％のBSA）1ml中で解離し、15mlのファルコンチューブ中の４％のBSAクッション3mlの上に装荷し、４℃で600xgで20分間遠心分離した。細胞を先の節中に記載された完全培地0.5ml中で再度懸濁させた。20,000の細胞を一つのカバースリップを含むウェルに添加し、保湿されたチャンバー中で37℃にて５％のCO2で18時間増殖させた。神経突起外殖の固定及び分析を先の節に記載されたようにして行なった。
免疫組織学及び免疫細胞学
免疫組織学
生後４ヶ月のマウスからの大腿神経の凍結切片を使用してペプチド-BSA複合体の結合を調べた。内因性ペルオキシダーゼ活性を低下させるために、切片を１時間にわたってPBS中の１％のH2O2、0.5％のウシ血清アルブミン(BSA)、及び10％のヤギ血清で処理した。次いで切片を一晩４℃にてペプチド-BSA複合体又はBSA（PBS中1mg/ml、150μl/カバースリップ）とともにインキュベーションし、次いでPBS-0.01％トゥイーン20で４回洗浄した。検出のために、抗BSA抗体（シグマ、1:16希釈、150μl/カバースリップ）を添加し、４℃にて一晩インキュベーションした。HRP結合ヤギ抗ウサギ血清を１時間にわたって150μl/カバースリップの容積で添加した（1:2000）。0.1％のH2O2を含む、0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.8中のN,N'-ジメチルホルムアミド中の9-アミノ-3-エチルカルバゾール（AEC、フルカ）の4mg/ml原液の５％の希釈液を使用して着色反応を発生させた。L2-412抗体及びHRP結合ヤギ抗ラット抗体を陽性対照に使用した。ビオチン化BSA-ペプチドコンジュゲートを使用して同様の実験を行なった。50μg/mlの濃度を一晩のインキュベーションに使用し、HRP結合ストレプトアビジン（1:2000）を１時間添加した。着色反応を上記のようにして発生させた。
免疫細胞学
カバースリップをポリオルニチン（1.5μg/ml）、次いでコラーゲン（20μg/ml）で被覆し、40,000の細胞を上記のようにして５％のCO2の下で37℃で40時間増殖させた。次いで固定カバースリップを２時間にわたってPBS中５％の無脂肪乾燥ミルク中でブロックした。PBS-0.05％トゥイーン20で徹底的に洗浄した後、ビオチン化BSA-ペプチドコンジュゲートを４時間にわたって50μg/mlの濃度で添加した。別の６回の洗浄工程後に、１時間にわたってHRP結合ストレプトアビジン、1:500を使用して検出を行なった。色検出は免疫組織学について上記されたとおりにした。固定神経細胞を40倍の倍率で写真撮影した。アドビ フォトショップを使用して、現れた画像をエンハストカラーレンダリング処理した。
以下はこの実施例で言及された文献のアルファベット順のリストである。
Figure 0005670608
実施例３
オリゴデンドロサイトに反応性のヒトモノクローナル抗体は多発性硬化症モデルにおいて髄鞘再形成を促進する
髄鞘脱落疾患に有効な治療の主要な目標である、髄鞘再形成を促進することは、脆弱な軸索を保護し、伝導速度を増大し、かつ神経欠陥を改善する可能性を有する。髄鞘再形成を促進する戦略は、オリゴデンドロサイト(OL)を移植すること、又は内因性髄鞘形成細胞を栄養因子で救済することに集中していた。種々の神経疾患及び自己免疫疾患を治療するのに常套的に使用される、免疫グロブリン(Ig)をベースとする治療は、髄鞘再形成を増進する本発明者らのアプローチの根底にある。本発明者らは多発性硬化症(MS)のウイルス媒介モデルにおいて有意な髄鞘再形成を促進する、OL表面抗原に対し誘導される２種のヒトモノクローナル抗体(mAb)を単離した。４種の更なるOL結合ヒトmAbは髄鞘再形成を促進しなかった。どちらのヒトmAbも、MSに効力を有することが示された治療であるヒト静脈内免疫グロブリン（IVIg）と同じくらい有効であり、ヒトOLの表面に結合し、髄鞘形成を担う細胞に対するmAbの直接効果を示唆した。また、ヒトmAbを中枢神経系(CNS)病変の領域にターゲッティングすることはミエリンデブリのオプソニン作用を促進して修復を進行し得る。ヒトmAbを単クローン性免疫グロブリン異常症の様相を有する個体の血清から単離した。これらの個体は障害を生じることなく血液中に高レベルのモノクローナルタンパク質を有し、治療としてのこれらのmAb投与が安全であるという考えに支持を与える。本発明者らの結果は1)ヒトの正常なIgレパートリーの一部であるCNS反応性mAbが病原性免疫障害からCNSを修復し、保護することを助けるかもしれないという仮説に一致し、2)更にOLに結合するAbは必然的に病原性であるという前提に異議を唱えるものである。
序論
髄鞘再形成の増進及び軸索の障害からの保護はMSの如き炎症性髄鞘脱落CNS障害の治療に重要な治療目標である。MSプラーク中の髄鞘再形成は起こり得るが、たとえOL前駆体が成人に存在するとしても（3,4）限定的なものである(1,2)。髄鞘再形成を促進するための幾つかの戦略が実験動物で試験されていた。髄鞘脱落した組織へのOL(5)又はそれらの前駆体(6)の移植は新しいミエリンを生じる。移植されたOL前駆体はまた成人CNS中で髄鞘脱落した病変を髄鞘再形成することができ(7)、病変に接近して置かれた場合に損傷の領域に向かって移動する(8)。無傷の成人CNS中の移植されたOL前駆体の生存及びミエリン病変の領域を標的とするそれらの能力に関して未解決の問題が残っている(9)。しかしながら、CNS病変が手術アプローチ可能であり、軸索が依然として無傷である場合、グリア細胞の移植は機能的性能を改善するのに実行できる治療であり得る(10)。
成長因子又は栄養因子のin vitro投与はOL前駆体の拡張を誘導し(11,12)、又は成熟OLが脱分化し、続いて髄鞘形成のプログラムを再開することを促進する(13,14)。損傷されたCNSへの遺伝子操作された繊維芽細胞による栄養因子のin vivo投与は軸索の新芽形成及びOL増殖を促進する(15)。in vivo栄養因子治療の障害として、具体的には生理学上妥当な局所因子濃度及び高濃度で投与される殆どの栄養因子の潜在的な多面作用の役割を測定することが残されている。
別法として、本発明者らの研究所はCNS結合Ig(16)を使用して、既に髄鞘脱落後にアップレギュレートされているかもしれない自然の回復応答をあてにすることによりCNS病変を修復し、内因性髄鞘再形成を促進することを提案する。Ig治療はヒト髄鞘脱落疾患の治療として迅速に採用され、試験し得る(17,18)。本発明者らのアプローチの前提は髄鞘再形成することができる細胞及びそれらの成長及び分化に必要な因子が髄鞘脱落されたCNS中に存在することであるが、ミエリンを生じるそれらの能力は限定的なものである。MS集団(19)内に現れる病変の不均一性及びOL節約(sparing)は、実際に、ヒト髄鞘脱落疾患の治療が個体の要求に基づいた幾つかの治療アプローチの組み合わせを必要とするかもしれないことを示唆する。
本発明者らはIgをベースとする治療を開発するために髄鞘脱落のウイルス媒介モデルを使用した。マウス脳脊髄炎サイラーウイルス(TMEV)がマウスの感受性系統に脳内接種された場合、TMEVはMSと臨床上かつ病理学上同様の免疫媒介進行性CNS髄鞘脱落を誘導する(20)。ヒトMSの治療の効力はTMEVモデル(21)で観察されたものと密接に対応するので、このモデルは臨床試験の設計に重要なプラットフォームになる。SCH94.03と称される、脊髄ホモジネートに対し産生されたマウスmAbは、TMEVモデルにおいて髄鞘再形成を増進する(22)。SCH94.03はOLの表面に結合する多反応性の、マウスIgMk mAbである(23)。また、SCH94.03はリゾレシチン誘導髄鞘脱落後に自発CNS髄鞘再形成の速度を増進し(24)、実験自己免疫脳脊髄炎(EAE)で再発を減少させる(25)。更なるOL結合マウスIgMk mAb（これらの幾つかはOL系列の通常のマーカーである）もまたCNS髄鞘再形成を促進する(26)。
マウスIgM mAbが髄鞘再形成を促進するので、本発明者らはポリクローナルヒトIgMが、免疫媒介障害の証明された治療であるIVIg(27)よりも髄鞘脱落疾患の有効な治療であると仮定した。ポリクローナルヒトIgMによるTMEV慢性感染マウスの治療はIVIgと比較した場合に、増進された髄鞘再形成をもたらした。抗原非依存性戦略を使用して、２種のヒトIgM mAbも明らかにされ、これらはポリクローナルヒトIgMよりも同等又は大きく髄鞘再形成を促進する。本発明者らはヒト髄鞘再形成促進mAbが、ヒト髄鞘脱落疾患に容易に実施できる、有効な治療であり得ることを示唆する。ヒトmAbは臨床試験に直ぐに適用可能であり、感染性物質を含まないで生成でき、IVIgの国内の不足を解し、高コストを軽減し得る。髄鞘再形成を促進する有効なヒトmAbはまた免疫調節治療の作用メカニズムの研究を簡素化し得る。
物質及び方法
ヒト抗体及びそれらの単離
2500を越える健康なドナーのプールされた血漿から精製された正常なヒトIgMをS.V. Kaveri (28)から得た。IgMの純度はSDS-PAGEによる確認では90％より大きかった。臨床上IVIgと称される健康なドナーからプールされたヒトIgGはマイルズ社（エルクハート、IN）からのものである。
ヒト血清サンプルをMayo ClinicのRobert A. Kyle博士の指示のもとにディスプロテイン血症診療所から得、単に20mg/mlより大きいIgクローナルピークが存在することにより選抜した。血清はワルデンストロームマクログロブリン血症、多発性ミエローマ、リンパ腫、及び測定されていない有意のモノクローナルガンモパシーを含む、血清中のモノクローナルIgG又はIgMスパイクを特徴とする多種の疾病状態を有する102の患者からのものであった。血清を水に対して透析し、沈殿を遠心分離（14,000rpm/30分）により集め、PBSに溶解した。溶液を遠心分離し、スペロース-6カラム（ファーマシア、アップサラ、スウェーデン）でクロマトグラフィーにかけた。IgMフラクションをプールし、SDS-PAGEにより分析した。濃度をシプロ・オレンジ（モレキュラー・プローブス、オイゲン、OR）デンシトメトリーによるゲル染色により測定した。IgM溶液を無菌濾過し、低温保存した。
OL細胞培養及び免疫細胞科学
PO-P2ホルツマンSDラットからの脳半球を記載されたようにして(29)混合一次グリア細胞培養のために調製し、９日にわたってin vitroで増殖させた。ラットOL前駆体を記載されたようにして単離した(30)。難治性癲癇のための治療切除を受ける患者から得られた一時的葉バイオプシーから成人ヒトOLを調製した。組織は外科病理学当局により調べられた時には癲癇病巣を含まず、正常な細胞構造のものであった。成人グリア細胞を記載されたようにして単離し(31)、ビオチン（0.01mg/ml）、トリ-ヨードチロニン（15nM）、0.5％のBSA（全てシグマから）、N2、１％のpen/strep（両方ともライフ・テクノロジィズから）及び組換えヒトPDGF AA（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、MN）で補充されたDMEM/F12の特定培地中でポリ-オルニチン（シグマ）及びラミニン（ライフ・テクノロジィズ）被覆プラスチック・マルチウェル（ベクトン・ディケンソン）又はガラスカバースリップ（フィッシャー・サイエンティフィック）に播いた。細胞表面染色を５％のBSAを含むHEPES-緩衝EBSS（E/H）でブロックした後に未固定細胞について４℃で12分間行なった。全てのヒトAbは10mg/mlで使用した。ポリクローナルマウス抗血清（ベーリンガー・マンハイム）を使用して、ミエリン塩基性タンパク質についての細胞内染色を４％のパラホルムアルデヒドによる固定及び0.05％のサポニンによる５分間の透過後に室温で行なった。蛍光結合二次抗体Ab（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリィズ、ウェスト・グループ、PA）を使用して一次Abを検出した。細胞単層を退色を防止するための2.5％の1,4-ジアザビシクロ〔2.2.2〕オクタン(37)及び0.1μg/mlのビスベンゾイミド（両方ともシグマから）を含む90％グリセリン/PBSに載せ、SPOTデジタルカメラ（ダイアグノスチック・インストルメンツ社、スターリング・ハイツ、MI）を備えたオリンパス・プロビスエピ蛍光顕微鏡で見た。
ウイルス及び動物
TMEVのダニエル株をこれらの実験に使用し、記載されたようにして調製した(32)。ジャクソン・ラボラトリィズからの雌のSJL/Jマウスを１週間の順化後に使用した。4-6週齢のマウスに、容積10ml中のTMEVの2x105プラーク形成単位を脳内注射し、98％を越える慢性ウイルス感染発生率をもたらした。この研究に使用した動物は感染後５〜８ヶ月のものであり、Ig又はPBSの単一腹腔内注射をした動物である。用量は1.0mgのIVIg又はヒトポリクローナルIgM或いは0.5mgのヒトmAbとした。動物を形態評価のためにAb治療の５週後に殺した；これを選択したのは、髄鞘脱落の毒性モデルの研究により、CNS髄鞘再形成がこの時点までに殆ど完全であることが示されているからである(33)。プラスチックに埋め込んだ脊髄切片は集中顕微鏡施設により切断され、数字コードでマークして研究所に戻された。この方法では、スライドは盲検様式で髄鞘再形成について等級が付けられる。
ウェスタン・ブロッティング
精製TMEV(34)をSDS-PAGEにより分離し、タンパク質をニトロセルロースに移した。５％の無脂肪乾燥ミルク及び0.05％トゥイーン20を含むトリス緩衝生理食塩水で室温で２時間にわたってブロックした後、膜を４時間にわたってヒトIg（10μg/ml）又はウサギポリクローナル抗TMEV Ab (1:2000)とともにインキュベートした。5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウム（BCIP/NBT、KPL、ガイザーズブルグ、MD）を使用して、結合したIgをビオチン化ヤギ抗ヒトmAb又はビオチン化ヤギ抗ウサギmAb（両方ともジャクソン・イムノリサーチから）及びアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンで検出した。
脊髄髄鞘脱落／髄鞘再形成の定量
本発明者らは、ミエリンを視覚化するために、４％のパラフェニレンジアミン(PPD)で染色されたプラスチックに埋め込まれた断片を使用して、感受性マウス中の脊髄髄鞘脱落、髄鞘再形成及び萎縮の量を定量する方法を開発した（35、図24A）。全脊髄の代表的なサンプリングを得るために、厚さ1mmの断片を２つおきの連続の1mmブロックから切り出し、全脊髄に相当する10〜12の断片を作製した。ツァイス光学顕微鏡（カール・ツァイス社、ソーンウッド、NY）に取り付けられたツァイス相互作用デジタル分析系(ZIDAS)及びカメラルシダを使用して、夫々の断片から、白質、白質病変、OL髄鞘再形成、及びシュワン細胞(SC)髄鞘再形成の面積を計算した。40倍の倍率で白質の輪郭を描いた。白質病変の領域は髄鞘脱落又は髄鞘再形成を有する白質の領域として定義され、次にこの領域を100倍の倍率でトレースした。白質病変領域はしばしばマクロファージ浸潤、炎症を含み、PPD染色を殆ど又は全く含まなかった（図25C、Ｄ、Ｈ）。髄鞘再形成を伴う、又は伴わない一次髄鞘脱落を含む病変の面積の合計を全髄鞘脱落の目安として測定した。
髄鞘再形成、OL又はSCの領域を250倍の倍率でトレースした。OLは多重軸索繊維を髄鞘再形成することができ、従って、OL髄鞘再形成は残った正常に髄鞘形成された軸索と較べて稠密に充填された、しかし薄い髄鞘をもたらす。SCは単一軸索繊維のみを髄鞘再形成することができ、OL髄鞘再形成と較べて一層厚い髄鞘を生じさせ、かつ軸索繊維間の増大されたスペースをもたらす。SC体及び核はそれらが髄鞘再形成した軸索に隣接して観察し得る。マウス当り10〜12の脊髄切片の夫々からトレースされた全ての面積を合計することにより、全面積を夫々のマウスについて計算した。
白質病変の全面積をサンプリングされた白質の全面積で割ることによりマウス当りの脊髄白質病変の面積％を得た。OL又はSC髄鞘再形成の面積を白質病変の全面積で割ることによりマウス当りの髄鞘再形成の面積％を得た。白質病変及び広範なミエリン修復を繰り返して測定し、1.5％しか相違しない、同等な値が明らかにされた。脊髄中の髄鞘再形成の代表として10の断片を使用することの正当性を決定するために、単一の慢性感染マウスの10の断片対32全部の断片を使用して比較を行なった。10の断片のアッセイは47.7％という髄鞘再形成面積％値を生じ、一方、全32の断片からのデータは40.0％という値を生じた。いずれの値も本発明者らのアッセイで有意な髄鞘再形成を示したであろう。
結果
ヒトIVIg及びポリクローナルヒトIgMはTMEV感染マウスでCNS髄鞘再形成を促進する
MSの臨床研究はIVIgが疾患進行を安定化するのに部分的に有効であり得ることを示す(18,36,37)。ヒトIVIgがMSのTMEVモデルにおいて髄鞘再形成を促進し得るかどうかを測定するために、慢性感染マウスを1mgのIVIgの単一同腹腔内注射で処置した。外来Igに対する免疫応答を誘発することを避けるため単一用量を投与した。ヒトIgの合計用量はヒトIVIg治療(18)に使用された合計用量の1/4である体重1kg当り約0.05gであった。追加のマウスをポリクローナルヒトIgMの単一の1mgのボーラスで処置した。脊髄を試験したところ、IVIg又はポリクローナルヒトIgMを与えたマウスのOL髄鞘再形成の面積％（表４、夫々14.15％及び23.19％）はPBS治療グループで観察された自発OL髄鞘再形成よりも有意に高かった（6.74％、IgGについてp<0.05、IgMについてp<0.01）。処置グループ又はPBS対照グループ間の白質の面積或いは白質病変の面積に統計上の有意差はなかった。データは、IVIgで処置したマウス７匹及び９匹のグループ、及び、ポリクローナルヒトIgMで処置したマウスの７匹及び10匹のグループの二つの独立の実験を記載したものである。表４中の最終値は、少なくとも５％の白質病変を有するこれらの動物のみを含む。
［表８］ 表４ ヒトAbによる処置後のマウスのCNS髄鞘再形成
Figure 0005670608
値は平均±SEMを表す。一方向ANOVA及びt-検定を使用してPBSで処置したマウスに対するヒト抗体で処置されたマウスのCNS型髄鞘再形成の面積％を比較した。このような分析により、*P<0.05；†P<0.01、‡P<0.001であることが明らかされた。その他の処置方法で処置されたマウスの比較はポリクローナルヒトIgM p=0.05、sHIgm 46 P<0.05を明らかにした。全てのその他の比較は統計上有意ではなかった。ポリクローナルヒトIgM、sHIgM 22及びsHIgM 46の間にCNS型髄鞘再形成に関する相違はなかった。末梢神経型SC髄鞘再形成の面積は０〜0.08mm2の範囲であった。これはミエリン病変の関数として末梢神経系型SC髄鞘再形成の0.0〜6.92面積％に相当する。種々の処置グループ、もしくはPBSと比較して、又はその他の末梢神経系型SC髄鞘再形成において、グループ間におけるミエリン病変の面積に統計上の差がなかった。
ポリクローナルヒトIgMによる処置はIVIgで処置されたマウスで観察されたものよりも多いOL髄鞘再形成をもたらした（p=0.05、図25A、Ｂ）。ミエリン病変の全面積の約1/4がポリクローナルヒトIgMで処置されたマウスで髄鞘再形成され、これは数千の髄鞘形成された軸索に相当した。平均で、病変の集密に髄鞘再形成された面積内の1mm2は46,000〜125,000の髄鞘再形成された軸索に相当した。それ故、ヒトIg処置後のCNS髄鞘再形成は広範なものであった。炎症性細胞又はマクロファージはほとんど存在しなかった。対照的に、PBSで処置したマウスでは、ミエリン病変の領域は髄鞘再形成された軸索をほとんど含んでいなかった（図25H）。活性ミエリン破壊の兆候、例えば、ミエリン旋回(whirl)、炎症性細胞及びマクロファージが存在した。
髄鞘再形成を促進するための治療の有効性を判断するための更なる一層速い方法として、動物の代表的な10の脊髄切片について、ほぼ完全な修復を示す白質病変の領域が存在するかを試験した。本発明者らは、自発髄鞘再形成における非常に稀な事象である、ほぼ集密の髄鞘再形成された軸索を含み、炎症性細胞又はマクロファージが存在しない白質病変の領域として完全修復を定義した（図25B、Ｆ、Ｇのように）。完全修復の少なくとも一つの領域がIVIgで処置した10匹の動物のうちの４匹及びポリクローナルヒトIgMで処置した14匹の動物のうちの10匹で観察された。本発明者らは、IVIg及びポリクローナルヒトIgMのどちらもPBS処置と較べて髄鞘再形成を促進し、またポリクローナルヒトIgMはCNS髄鞘再形成を促進する能力においてIVIgより優れていると結論した。
OLに結合するヒトmAbはTMEV感染マウスでCNS髄鞘再形成を促進する。CNS髄鞘再形成を促進するこれまでに同定されたマウスmAbの全てがOLに結合する(23,26)。TMEVモデルにおいて試験するためのヒトmAbをスクリーニングするために、ヒトmAbを未固定混合一次グリア培養物中でラットOLの表面に結合する能力について試験した。新生仔ラット脳から樹立された一次培養物はin vitroにおいて９日間で分化の種々の段階のOLを含む(38)。ヒトmAbの本発明者らの供給源は血清由来ヒトモノクローナルIgM（sHIgM）及び血清由来ヒトモノクローナルIgG（sHIgG）であった。50のsHIgGのいずれもが末固定ラットOLに結合しなかったが、52のsHIgMのうちの６種が抗スルファチドmAb, 04(39)で同時標識されるラットOLの表面に結合した。
この６種のOL結合sHIgMを使用してTMEV感染マウスを処置した。５匹の動物からなるグループに0.5mgのヒトmAbの単一注射をした。sHIgM22及びsHIgM46による処置後のOL髄鞘再形成の平均面積％（図25F、G）は両方とも自発髄鞘再形成に起因するバックグラウンドレベルより有意に上であった。その他の４種のOL結合sHIgMはPBSによる治療後に観察されたレベルと同等又はそれより下のレベルで髄鞘再形成を促進した。動物の第二組をsHIgM22、sHIgM46又はPBSで処置して初期の観察を確認した。sHIgM14はまたOLに結合するヒトmAbの例として繰り返されるが、髄鞘再形成を促進しなかった。組み合わされたデータが表１に示される。少なくとも５％の合計の白質病変を含む動物のみが統計分析に入れられた。
OL髄鞘再形成の最高の面積％はsHIgM46で治療された動物で観察され（27.1％）、sHIgM22で治療された動物がそれに続く（17.1％）。sHIgM14による治療後の髄鞘再形成の面積％（8.41％）はPBSによる処置後に観察された面積％（6.74％）と同様であった。抗原特異性にかかわらず、どのsHIgMも髄鞘再形成を促進し得るかを試験するために、本発明者らは混合一次培養物中でOLに免疫反応性を示さない２種のmAb、sHIgM1及びsHIgM2をin vivoで研究した（図25C、D）。sHIgM1 (8.3％)、sHIgM2 (11.4％)による治療後の髄鞘再形成の面積％はsHIgM14治療グループ又はPBS処置グループと有意に異ならなかった。全てのグループで、白質の面積及び白質病変の面積は統計上異ならなかった。PBS処置グループで観察された髄鞘再形成と較べて、sHIgM46又はsHIgM22による治療後の髄鞘再形成の面積％は夫々<0.001及び<0.05のｐ値を生じた。末梢神経系型SC髄鞘再形成の面積は治療グループ内で０から0.08mm2までの範囲であった。これは白質病変の関数としてSC髄鞘再形成の0.0から6.92面積％までの値に相当した。治療グループ間でSC髄鞘再形成の面積％に統計上の差がなかった。
ヒトポリクローナル又はモノクローナル製剤による治療後に観察されたOL髄鞘再形成の面積％の比較はsHIgM46がIVIgよりも統計上優れているが（p<0.05）、ポリクローナルヒトIgMより優れていないことを明らかにした。sHIgM22による治療後に観察されたOL髄鞘再形成の面積％はIVIg、ポリクローナルヒトIgM又はsHIgM46による治療後のそれとは異ならなかった。
完全修復した白質病変の面積について調べたところ、少なくとも一つの領域がsHIgM22で治療された８匹の動物のうちの４匹及びsHIgM46で治療された５匹の動物のうちの５匹で観察された。対照的に、sHIgM1、sHIgM2、sHIgM14又はPBSで処置した動物のいずれもが完全修復の領域を一つも含んでいなかった。
ポリクローナルヒトIgはラットヒトOLに結合するがヒトmAbは結合しない
ヒトmAbがヒトの髄鞘再形成を促進するのに潜在的な治療であるとすれば、ヒトOLの表面抗原に対する反応性はヒトCNS病変の領域にターゲッティングするのに重要であることが重要であることが分かるであろう。それ故、本発明者らはヒト髄鞘再形成促進mAbが成人の脳から得られたOLに結合し得るか否かを測定した。ヒトグリア細胞培養物を成人の一時的葉バイオプシーから樹立し、培養中の幾つかの時点でヒトmAbで免疫標識した。
本発明者らの初期スクリーンでOLの表面に結合した６種のsHIgMのうちの３種がヒトOLにも結合した。培養１週間で、形態的に未成熟のスルファチド陽性ヒトOLはsHIgM14及びsHIgM46で標識されたが、sHIgM22で標識されなかった。培養３週までに、形態的に複雑なスルファチド陽性ヒトOLはsHIgM14、sHIgM22及びsHIgM46で同時標識された（図26A、Ｂ、Ｃ）。培養４週までに、実質的に全てのMBP陽性ヒトOLがまたsHIgM22及びsHIgM46を結合したが、sHIgM14の結合は大いに減少された（データは示されていない）。
IVIg又はポリクローナルヒトIgMのいずれも試験したいずれの時点でも培養中のヒトOLの表面に結合しなかった。しかしながら、ポリクローナルヒトIgMはげっ歯類CNSの新しい未固定切片とともにインキュベートされた場合に白質道及び種々の神経細胞集団に強く結合した。IVIgはこの結合アッセイで完全に陰性であった（データは示されていない）。sHIgM22及びsHIgM46（これらの両方とも髄鞘再形成を促進する）、並びにsHIgM14（これは髄鞘再形成を促進しない）も精製されたミエリン塩基性タンパク質陽性ラットOLの表面に結合した（データは示されていない）。
本発明者らは、OL抗原に対するアフィニティーが必要であるかもしれないが、ヒトmAbは髄鞘再形成を促進するのに充分ではないと結論した。有意な髄鞘再形成を促進する両方のヒトmAbが成熟分化したヒトOLに結合するという事実はin vivo機能のために生存する成人OLに対し誘導されるmAbの可能な要件を強調する。
ヒトIg又はmAbがウイルスを中和することにより髄鞘再形成を促進した可能性を排除するために、夫々の調製物をウェスタンブロッティング(34)により精製TMEV抗原に対する反応性について試験した。ヒトAb調製物のいずれもTMEVタンパク質と反応しなかった。しかしながら、TMEVに対し産生されたウサギポリクローナルIgは４種のウイルスキャプシドタンパク質に強く反応した（データは示されていない）。
末梢Ｂ細胞を個体から得、これからsHIgM22を同定した。sHIgM22の軽鎖及び重鎖可変ドメイン配列を決定した。sHIgM22軽鎖可変領域（GenBank受理番号AF212992）はヒト軽鎖可変領域のλサブグループＩに属する。sHIgM22Ｈ鎖可変領域（GenBank受理番号AF212993）はヒトＨ鎖可変領域のサブグループIIIに属する。sHIgM22可変ドメインと最も密接な既知のヒト生殖系列可変ドメイン配列(40)の間に有意な相違があった。
考察
この一連の実験において、本発明者らはヒトAbがCNS髄鞘再形成を促進し得ることを実証した。更に広範な髄鞘再形成は、ヒトIVIgによる治療よりもポリクローナルヒトIgMによる治療後にTMEV感染マウスの脊髄で観察された。加えて、本発明者らは髄鞘再形成を一致して増進する２種のヒトモノクローナルIgMを同定した。どちらのmAbも、モノクローナルIgMを含む血清を多量流出する成熟の最後の段階における単一Ｂ細胞の悪性のクローン性増殖を特徴とするリンパ腫のクラスであるワルデンストロームマクログロブリン血症(WM)(41)を有する患者の血清から単離されたものである。高レベルのこれらのmAbは有害ではないようである。WMを有する患者において支配的IgMは健康な個体中に存在するIgMレパートリーにより認識される抗原を正常に認識する(42)。本発明者らがOL抗原結合性の髄鞘再形成促進mAbをヒト集団から容易に同定し、単離することができたことは、これらのAbがＢ細胞レパートリーの中で一般的であり、CNS損傷に応答する修飾因子として機能し得るという考えを支持するものである。
髄鞘再形成促進mAbはCNS損傷に直面した場合に個体の血清中に産生し得る
IVIg及びポリクローナルヒトIgMのどちらも髄鞘再形成を促進したが、どちらも培養中のラットOL又はヒトOLに結合しなかった。対照的に、髄鞘再形成を促進するどちらのヒトmAbもラット及びヒトの両方のOL表面抗原に結合した。髄鞘再形成を促進するヒトmAbの増大された効力は損傷の領域の成人OLへの有効なターゲッティングのためであるかもしれない。StangelはIVIgが培養中のOL前駆体の分化、移動又は増殖に効果を有しないことを報告した。しかしながら、OL前駆体へのIVIgの結合は評価されなかった(43)。OLに対するIVIgのアフィニティーの欠如は、OL前駆体に対して認識できる作用を欠くことを説明するであろう。しかしながら、IVIgがOLに結合しないという事実は、髄鞘再形成を促進する作用機序がヒトmAbのそれと異なるかもしれないことを示す。
この研究に使用したポリクローナルヒトIgMのまさに同じ調製物が自己抗体を中和し(28)、EAE中のサイトカイン発現を変化させ(44)、重症筋無力症のマウスモデルに有益であることが実証されていた(45)。ポリクローナルヒトIgMはげっ歯類の脳の未固定切片中で髄鞘形成された道に結合するが、IVIgは結合しない。いずれのポリクローナル調製物も新しいヒト白質に結合しなかった。ポリクローナルヒトIgMは全般の免疫調節、病原性抗体への結合及びミエリンデブリのオプソニン作用の組み合わせによりマウスの有意な髄鞘再形成を促進し得る。
Igによって髄鞘再形成が促進されるメカニズムは解明されるべく残っている。髄鞘再形成促進mAbの多くがOL及び／又はミエリンに結合するので、認識された細胞に対する直接効果を仮定することは妥当である。培養中のOLに結合し、その生物学を変化するmAbの例がある(46-48)。しかしながら、髄鞘再形成を促進するmAbは種々の特異性を有するので(23,26)、夫々のmAbが共通の抗原又は受容体により直接機能することはありそうにない。IgMのような多価分子は、通常は離れているシグナリング分子を原形質膜内部で接近させ、続いて活性化することができるであろう(49)。髄鞘再形成促進mAbの殆どが脂質に結合するようなので(26)、細胞表面へのこれらのIgMの結合は原形質膜を再編し、シグナリング経路を促進することができるであろう。SCH94.03が混合初代グリア培養物に添加される場合、トリチウム標識されたチミジンとり込みの2-3倍の増加が観察される（Rodriguez, 未公表の観察）。
髄鞘再形成促進mAbが機能し得る別の潜在的なメカニズムはミエリンデブリ又は損傷されたOLへのターゲッティングによる。OL又はミエリンへの結合は損傷の領域からの細胞残渣の排除を増進し、自発CNS修復の正常なプロセスが進行することを可能にし得る。おそらくポリクローナルヒトIgの作用のメカニズムは、主として、Ｂ細胞分化又はサイトカイン発現の変化及び抗イディオタイプのネットワークによる免疫調節によるものであり(27,50)、一方、ヒトmAbの作用はOL抗原及び／又はミエリンへの直接ターゲッティングによるものであろう。髄鞘再形成を促進するAbの能力を完全には予測する特徴はなかった。実際に、慢性TMEV感染マウスで試験した一種のヒトmAbは髄鞘再形成を自発髄鞘再形成のレベルより下に抑制するようであり、或る種のOL結合ヒトmAbがin vivoで髄鞘再形成を抑制でき、又は髄鞘脱落を悪化し得ることを示唆する。これはOL抗原（即ち、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、51）に反応性の特異的mAbがEAEで髄鞘脱落を増進するという観察(52)と一致する。結局のところ、Abの髄鞘再形成潜能力及び病原性の欠如の証明はin vivo試験を必要とする。
ヒトIVIgを用いる幾つかの二重盲検の偽薬対照試験がMSにおける若干の効力を示していた(18,36,37)。ポリクローナルヒトIgM、sHIgM22及びsHIgM46の全てだけでなくIVIgがTMEVにおけるCNS髄鞘再形成を増進し、これらのAbがMSに有効であり得ることを示唆した。OLに結合するヒトmAbは直接のOL刺激という付加的な利益を有し得る。ヒトmAbは病原体感染の可能性なしに産生でき、それらの有効性及び免疫原性を強化するように構造変化し得る。マウスmAb又は“ヒト化”マウスmAbとは対照的に、ヒトmAbは最小の免疫応答を生じるはずであり、ヒト臨床試験に容易に適用し得る。ヒトmAbが慢性麻痺した動物で髄鞘再形成を促進したことを考慮すると、長年疾病に苦しんでいる患者について好結果を与える治療を開発し得るという希望が与えられる。
参考文献
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実施例４
先の実施例に記載されたように、本発明者らは髄鞘脱落疾患のサイラーウイルスモデルにおける髄鞘再形成と類似するパターンを誘導するヒトモノクローナル抗体を同定するために二つのアプローチを使用した。最初のアプローチはヒトＢ細胞をエプスタインバールウイルス(EBV)で形質転換して免疫グロブリン分泌Ｂ細胞クローンを作製することであった。得られた細胞株をスクリーニングして高レベルで抗体を発現する培養物を同定し、および、産生された抗体のCNS抗原に結合する能力をスクリーニングした（特にオリゴデンドロサイトを結合したものが強調される）。第二のアプローチはモノクローナルガンモパシー、例えば、MUGUS、リンパ腫、又はワルデンストローム症候群と診断された患者からの血清の同様のスクリーンCNS結合を行なうことであった。EBV形質転換細胞の場合、細胞それら自体が臨床試験に充分な量のGMPグレードの抗体を生じるための抗体の源を与え得る。加えて、どちらの供給源から同定された抗体も、注目の抗体をコードする合成抗体遺伝子を使用した人工抗体産生系において一層最適に産生し得る。本発明者らは、注目の抗体をコードする抗体発現カセットでトランスフェクトされたハイブリドーマ細胞株がin vivo分析及び臨床試験に充分な抗体を与えると予見する。
スクリーニング研究の過程で、髄鞘脱落疾患の本発明者らのin vivoサイラーウイルスモデルにおいて統計上有意な髄鞘再形成を誘導するヒトモノクローナルIgM抗体の組が同定された（表５）。これらの抗体の夫々がプロトタイプのマウスモノクローナル抗体SCH94.03について初期に記載された髄鞘再形成応答を模倣した。これらのヒト抗体の中に、MSI 19D10及びCB2bG8と称される、EBV形質転換Ｂ細胞系に由来する２種、並びに高レベルのモノクローナルIgMを血清中で発現する50人以上の患者からの抗体のパネルの中で同定された、sHIgM 22及びsHIgM46と称される、２種の抗体がある。
［表９］
表５ サイラーウイルスで慢性感染されたSJL/Jマウスでヒトモノクローナル抗体により誘導された髄鞘再形成
Figure 0005670608
動物は９ヶ月以上にわたってサイラーウイルスのDA株で慢性感染させ、その後、患者血清（sHIgM22及びsHIgM 46）又はEBV形質転換細胞系（MSI 19D10又はCB2b-G8）から単離されたIgM抗体0.5mgの単一回ip注射による処置をした。５週間後に、マウスを固定液で潅流し、脊髄を組織分析のために単離した。髄鞘脱落及び髄鞘再形成の面積を顕微鏡により直接評価した。髄鞘再形成面積％を、式 [髄鞘再形成された面積／髄鞘脱落した面積]x100 により測定した。抗体の代わりにPBS注射を与えた動物グループに対する統計上の比較により治療効果を評価した。
EBV形質転換体に由来する両方の抗体に関するIgM重鎖及び軽鎖の構造を、細胞から単離した免疫グロブリンmRNAから作製したcDNAの分析により決定した。MSI 19D10及びsHIgM 22の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を夫々図19及び20（配列番号９及び11）並びに図17及び18（配列番号１、49、５及び50）に示す。CB2bG8のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の配列を図27及び28（配列番号13及び15）に示す。配列自体は、それらが既知の生殖系列免疫グロブリン配列とは若干異なる以外は注目に値しない。従って、それらは未同定抗原に対する免疫応答過程中の体細胞多様化の産物であるかもしれない。これらの配列の価値は、それらが制御された条件下の免疫グロブリン生成のための発現ベクター構築のための青写真を与えることである。
同様に、IgMを生じる患者の一人の血清からの重鎖及び軽鎖の構造をタンパク質配列分析、続いて患者から単離された末梢血単核細胞からのcDNAのクローニング及び配列分析により決定した。２種の密接に関連する重鎖及び軽鎖が患者の血清中に同定され、これをsHIgM22と命名した（図17及び18）。この２種の重鎖及びＬ鎖は両方とも60:40の比で単離されたcDNA集団中に存在した。両方の抗体は共通のμ-VDJ再配列及びλ-VJ再配列を有し、それらが共通のＢ細胞前駆体に由来することを示す。それらは続いてそれらの可変領域の構造を変化させる突然変異の累積の結果として分岐した。本発明者らは両方の抗体とも患者の血清中で発現されていると結論する。なぜなら、どちらの抗体からのペプチドも血清から単離されたタンパク質から特性決定されたからである。しかしながら、可変鎖及び軽鎖の二つの明確な組み合わせが直接観察されず、同定された重鎖及び軽鎖のその他の組み合わせが実際に存在し得るという可能性が残っている。観察されたアミノ酸置換の位置に基づいて、本発明者らはこれらの抗体が非常に類似した反応性パターンを有することを推測する。
実施例５
細胞培養における抗体遺伝子の発現のためのトランスフェクション系の開発
ヒト抗体からの高力価抗体の継続的な供給を行うために、本発明者らはトランスフェクションをベースとする発現系を開発した。内因性免疫グロブリンmRNA生成の欠如について選択されたハイブリドーマ細胞を組換え抗体遺伝子でトランスフェクションして注目する抗体を発現する細胞を作製することができる。
本発明者らは細胞培養物中でクローン化抗体遺伝子を発現するためにゲノム及びcDNAをベースとする一連のベクター系の使用を検討した。本発明者らはゲノム遺伝子又はcDNAをベースとする遺伝子を使用して軽鎖タンパク質を成功裡に発現させた。本発明者らはゲノムをベースとする重鎖ベクターPAG4026（UCLAのSherie Morison博士により親切に提供された）を使用してＨ鎖発現を得た。しかしながら、このベクター系による抗体の収量は実用的なin vivo使用にはあまりにも低い。本発明者らの焦点は、高力価抗体を産生するトランスフェクトされたハイブリドーマクローンを日常的に生じさせる新規ベクターを開発することであった。本発明者らの現在の戦略は、良く機能することが本発明者らの手によって個々に示された構成部分からベクターを構築することである。
本発明者らは、dHfR及びCMVプロモーター制御下で免疫グロブリン軽鎖cDNAを発現するベクターが軽鎖を発現すること、及びこの発現がメトトレキセート濃度を増加させつつトランスフェクションした免疫グロブリン生産細胞を増殖させることにより増幅し得ることを示した（図29）。次いで本発明者らは、免疫グロブリン軽鎖及びdHfRを発現する、この機能性単位を相補μ鎖をコードするゲノム重鎖遺伝子を発現するベクターにクローン化する。本発明者らがこの方針に沿ってつくった最初のベクターはマウス／ヒトキメラ94.03をコードし、図30の上部パネルに示される。このベクターを抗体陰性ハイブリドーマ細胞に導入し、少量の機能性抗体を発現するクローンが単離された。抗体は天然マウス抗体94.03と同じ様式でCNS組織を染色する（図31）。これらの抗体産生細胞は、産生される量の抗体を拡張させるために、メトトレキセートを増加させることによる選択を受ける。ヒト血清sHIgM 22中で２種の重鎖及び２種の軽鎖が同定されたので、重鎖及び軽鎖の全ての４つの順列を評価する必要がある。本発明者らの配列研究により同定されたsHIgM 22の４つの可能な組み合わせのうちの三つを発現するベクターを調製し、今、免疫グロブリン陰性ハイブリドーマ細胞に導入されている。プロトタイプベクターを図30の下部パネルに示す。
方法
マウス／ヒトキメラ94.03(M1)及びsHIgM-22抗体を発現するための発現ベクターの構築
マウス／ヒトキメラ94.03のための発現系の構築
構築されたベクターは二つの単位からなる。最初の単位はゲノムDNA由来免疫グロブリン遺伝子によりコードされる免疫グロブリンの重鎖をコードする。ベクターは一部UCLAからSherrie Morrison博士の研究室から得られた骨格ベクター（PAG4026）の誘導体である。PAG4026ベクターは無関係の可変領域を発現するIgM重鎖をコードする。注目する可変領域の置換に利用できる便利なクローニング部位がなかった。それ故、本発明者らは無関係の重鎖配列を欠失させ、固有の制限部位（5'末端にRsr II及び3'末端にPac I）でその可変領域を挟む領域を再構築することにより部位を操作した。PAGベクターの配列は知られていなかったので、本発明者らは、哺乳類DNA中には滅多に存在しない配列を認識する酵素を使用してどの制限酵素部位が唯一であるのかを試行錯誤により決定した。
マウスIgMモノクローナル抗体94.03のＨ鎖可変領域を、RsrIIプライマー
ACTCCCAAGTCGGCTCGCTTTCTCTTCAGTGACAAACACAGACATAGAACATTCACCATGGGATGGAGCTGTATCACT（配列番号39）
を使用してRsrII部位をリーダー配列の上流に導入し、PacIプライマー
ACTGACTCTCTTAATTAAGACTCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT（配列番号40）
を使用してPacI部位を導入するとともに正確なスプライス結合を可変領域コーディングブロックの3'末端で維持して、PCRによりcDNAから単離した。
発現ベクターの第二部分は複数のプラスミドに由来する。最終構築物は両末端にEagI、SV40プロモーターの調節制御下のDHFR（ジヒドロホレート還元酵素）コーディング配列及びCMVプロモーターの調節制御下のキメラマウス／ヒトκＬ鎖cDNAコーディングブロックを含む。ベクターのこの部分は、適当なクローニング部位、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、及びDHFRコーディングブロックを提供する３種のプラスミド（pCIneo（プロメガ・コーポレーション）、pUC18（ニュー・イングランド・バイオラブズ）、及びpFR400（Simonsen及びLevinson, Proc Natl Acad Sci USA 80:2495: 1983）から開始して段階的に構築した。合成リンカー領域の導入及び望ましくない制限エンドヌクレアーゼ認識部位の欠失を含む一連の修飾後に、メトトレキセート選択可能な軽鎖カセットをアセンブルした。このカセットは軽鎖遺伝子のcDNAコーディングブロックに隣接する固有の制限エンドヌクレアーゼ部位（Nhe I及びXho I）を含む。
キメラ軽鎖遺伝子を２種のcDNA配列からオーバーラップ伸長技術（Hortonら, Gene 77:61: 1989）によりPCRスプライシングを使用して構築した。キメラcDNAの融合領域に隣接するプライマーはエンドヌクレアーゼXho I及びNhe Iのための酵素認識配列を含んでいた。融合遺伝子産物を増幅するのに使用した5'プライマーは
TTGGCGCGCCAAAGACTCAGCCTGGACATGATGTCCTCTGCTCAGTTC（配列番号41）であり、3'プライマーは
ATAGTTTAGCGGCCGCATTCTTATCTAACACTCTCCCCTGTTG（配列番号42）であった。これらの部位を使用してcDNAコーディングブロックを軽鎖カセットベクターに挿入した。
アッセンブルされたならば、エンドヌクレアーゼEag Iを使用してカセットを切り出し、重鎖遺伝子を含むベクター中の唯一のEag I部位に挿入した。得られる構築物は“ヒト化”94.03のためのマウス／ヒトキメラ抗体の重鎖構成部分及び軽鎖構成部分の両方のためのコーディング配列を含む。重鎖はヒトIgHプロモーターにより発現され、軽鎖はCMVプロモーターにより発現される。dHFR遺伝子は増幅マーカーを与え、SV40プロモーターにより発現される。これらの遺伝子の夫々は3'末端にポリアデニル化シグナルを含む。ベクターのその他の重要な特徴には、細菌の複製起点及びアンピシリンに対する耐性をコードする細菌中で発現された遺伝子が含まれる。重鎖可変鎖及び軽鎖cDNAをコードするブロックは、抗体産生細胞のmRNAから単離される新規な免疫グロブリン配列又は合成免疫グロブリン遺伝子の配列を置換するのに使用し得る固有の制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される。
発現ベクター系へのsHIgM 22配列の挿入
重鎖及び軽鎖それぞれのアミノ酸情報並びに定常領域の配列から推定される5'プライマーを使用して、末梢血RNAのPCR増幅によりsHIgM 22の重鎖及び軽鎖をコードするmRNAのcDNAを調製した。重鎖可変領域コーディングブロック、リーダー配列並びに隣接RsrII部位及びPacI部位と一緒のドナースプライシング結合部を、PCRを使用して5'領域
GACTCGGTCCGCCCAGCCACTGGAAGTCGCCGGTGTTTCCATTCGGTGATCATCACTGAACACAGAGGACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG（配列番号43）及び3'配列
CCTTAATTAAGACCTGGAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC（配列番号44）を加えることにより構築した。得られたDNA分子をRsr II及びPac Iで消化し、続いて発現ベクターにクローン化し、ベクター中の無関係の配列に代えて所望の可変領域配列を置換した。
軽鎖配列を２工程でアッセンブルした。λ定常領域を、5'プライマー
CTAGCTAGCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCC（配列番号45）及び3'プライマーATAGTTTAGCGGCCGCACCTATGAACATTCTGTAGG（配列番号46）を使用してRT-PCRによりmRNAから単離した。唯一のAvrII部位及び3'Not I部位を使用してこのフラグメントをpCIneoベクターにクローン化した。
必要とされるNhe I部位及びリーダー配列をcDNAに導入するために5'プライマー
CTAGCTAGCCCGAATTTCGGGACAATCTTCATCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCCTCACCCTTCTCATTCACTGCACAGGGTCCTGGGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCCG（配列番号47）を使用してsHIgM 22の可変領域を生成した。3'プライマー
GGGCAGCCTTGGGCTGAGCTAGGACGGTCAGC（配列番号48）を使用してAvrII部位を導入し、このフラグメントを定常領域片と結合できるようにした。得られたコーディングブロックは機能性リーダーシグナルを含み、dHFR/軽鎖カセットにクローニングするのに必要なNheI部位及びXho I部位により隣接され、そのカセットを続いて重鎖プラスミドとアッセンブルして重鎖コーディング配列及び軽鎖コーディング配列の両方並びに哺乳類細胞中の発現に必要とされるプロモーターを含む最終生成物を作製した。
実施例６
94.03IgGイソタイプ抗体
髄鞘再形成を誘導するマウス抗体94.03の能力におけるイソタイプの重要性を決定するための一つの戦略はIgGイソタイプを有する94.03の可変領域を発現する組換え抗体を生成することである。別の戦略として、本発明者らは培養中に94.03産生細胞の集団内の天然イソタイプスイッチ変異体を同定しようと探求した。自発スイッチ変異体はこの型の培養物中に時折現れることが知られていた。細胞表面IgGについて染色された細胞の連続FACS選別後に、本発明者らはIgG1イソタイプを有する94.03を分泌するクローナル細胞系を単離することができた（図32）。これらの細胞により産生された抗体の構造をELISA、SDSゲルによる生成されたタンパク質の特性決定、及びcDNAクローニングにより確認した。図33に概説された直接配列分析により本発明者らが94.03抗体のIgG1変異体を単離したことを示す明確なデータが得られた。
実施例７
IgG 3 イソタイプ抗オリゴデンドロサイトマウス抗体09
マウス09抗体は抗オリゴデンドロサイト抗体として単離され、IgG3サブタイプのものである（Kuhlmann-Krieg, S., Sammer, I.及びShachner M. (1988) Devel Brain Res 39:269-280）。09抗体はCNS中の白質に強くかつ特異的に結合する。本発明者らはTMEVモデルで髄鞘再形成を刺激する09抗体の能力を試験し、実証した（データは示されていない）。09抗体重鎖可変領域配列が図34（配列番号７）に示される。09のκ軽鎖１可変領域の配列が図35（配列番号19）に示される。09のκ軽鎖１可変領域の配列が図36（配列番号21）に示される。
実施例８
IgMモノマーは髄鞘再形成を誘導する
髄鞘再形成の誘導に関するIgM抗体の構造上の特徴の重要性を把握するための別のアプローチは、抗体を生化学的に分別し、髄鞘再形成を誘導する抗体フラグメントの能力をin vivoで評価することである。一つの可能性は、同定された抗体がCNS構造に対する低いアフィニティーを有することであり、それ故、IgMのデカバレンシー(decavalency)が髄鞘再形成活性に重要であり得ることである。なぜなら、複数の結合部位は抗体がCNS中の標的構造と相互作用するのに充分な結合活性を与えるからである。この問題に取り組むために、本発明者らは５量体の免疫グロブリン分子を一緒に維持しているジスルフィド結合の還元によりIgMモノマーを作製した。得られるモノマーは２価である。このモノマーはin vitroでオリゴデンドロサイトを結合することができず、無傷の未変性抗体で観察されたパターンで脳切片を染色しない。しかしながら、このモノマーの抗体はin vivoの髄鞘再形成を誘導する能力を保持する（表６）。これは本発明者らのin vitroアッセイでは観察される染色が存在しないことに鑑みて驚くべき結果であった。一つの可能性は結合を監視するin vitroアッセイが髄鞘再形成に関するバイオアッセイと同じ位に良い感度ではないことである。結合と髄鞘再形成の誘導の間にこのような強い相関関係があるので、本発明者らは、モノマーとの結合を観察することはできなかったが、CNS構造に対するこれらの抗体の特異性は重要であると考える。
［表１０］
表６ マウスIgM mAb 94.03のモノマーフラグメントにより誘導された髄鞘再形成
Figure 0005670608
IgM抗体を温和な条件下で還元し、アルキル化した。この処理により抗体の５量体構造が破壊され、２価のモノマーをカラムクロマトグラフィーにより単離することが可能になった。慢性感染SJL/Jマウスに５週の治療期間にわたって週に２回ip投与される合計0.5mgの抗体を与えた。５週後に、動物を固定液で潅流し、それらの脊髄を組織分析のために除去した。表５に示されたように髄鞘再形成された病変の面積を合計の髄鞘脱落した面積と比較することにより髄鞘再形成％を顕微鏡で測定した。個々の治療グループを抗体に代えてPBS注射をした動物と比較した。
本発明者らは抗体の(Fab')2フラグメント、Fabフラグメント、及びFvフラグメントを作製することにより抗体を更に分別した。サイラーウイルスで慢性感染されたSJLマウスをこれらの抗体フラグメントで処置し、抗体のFc部分を欠いている２価のフラグメントと単一抗原結合部位を主として含む１価の抗体フラグメントのどちらが髄鞘再形成を誘導し得るか否かを測定した。
ヒトモノクローナル抗体sHIgM 22を並行して分析し、ヒトIgMの抗体フラグメントが同様の様式で挙動するか否かを測定する。単一の小さい結合ドメインが髄鞘再形成を誘導し得ることが測定される場合、この情報は修復のメカニズムを測定するのに重要と判明し得るだけでなく、薬理学的類似体の開発の手がかりを与えるであろう。
実施例９
sHIgM 46抗体はミエリン修復を誘導する
本発明者らの初期の研究は、sHIgM 46によるミエリン修復の誘導がsHIgM 22で観察された修復よりも定性的に優れているかもしれないことを示唆する。TMEVで慢性感染されたSJLマウスの切片の組織試験をすると、髄鞘脱落の一層小さい領域がその他のモノクローナル抗体によるよりもsHIgM 46による治療後に観察された（表７）。この観察は高度に統計上有意であった。この結果は注目に値する。なぜなら、抗体による治療は髄鞘脱落した病変が良く樹立され、慢性感染した動物中で最大のサイズに達するまで始まらないからである。この結果の本発明者らの解釈は、ミエリン修復が脊髄の或る領域で完全であり、その結果、それらが本発明者らの通常の組織試験の際には脊髄の正常な領域と区別されないことである。sHIgM 46治療マウスの病変を電子顕微鏡により調べ、修復された病変がその他の治療グループよりも多数のミエリンラップを含むか否かを確かめる。
［表１１］ 表７ ヒト抗体sHIgM 46によるミエリン修復の定性的相違
Figure 0005670608
９ヶ月以上にわたってサイラーウイルスで慢性感染させたSJL/Jマウスをグループに分け、個々のグループにこの一群のモノクローナル抗体の一つを単一回0.5mg ip注射をした。５週後に、動物を固定液で潅流し、それらの脊髄を組織分析のために単離した。25倍の光学レンズを使用して光学顕微鏡により視覚化された、白質により占有された脊髄の合計面積及び髄鞘脱落の面積を測定することにより、髄鞘脱落の面積を測定した。データは３回の独立実験からのマウスについてのものを含む。プールされた治療グループ動物を治療するのに使用された抗体（“全てのその他の抗体”）はヒトモノクローナルIgM sHIgM 12、14、22、47、50、AKJR8、MSI 10E10、2B2GE7、NA8FE4、及びマウス抗体06、09、RIP、及びMOGであった。データ組は正規性試験に合格し、ANOVAにより分析した。
実施例10
ヒト抗体AKJR4、CB2iE12及びCB2iE7の重鎖及び軽鎖可変領域、並びにMSI19E5の軽鎖可変領域の配列を決定した。AKJR4の重鎖及び軽鎖可変領域の配列を夫々図37及び38（配列番号23及び25）に示した。CB2iE12の重鎖及び軽鎖可変領域の配列を夫々図39及び40（配列番号27及び29）に示した。CB2iE7の重鎖及び軽鎖可変領域の配列を夫々図41及び42（配列番号31及び33）に示した。MSI19E5の軽鎖可変領域の配列を図43（配列番号35）に示した。
実施例のこの節に示されたリストされた文献の開示だけでなく、本明細書に引用されたその他の刊行物、特許開示又は文書は、引用として本明細書にそのまま含まれる。
本発明はその他の形態で具体化することもでき、本発明の精神もしくは必須の特徴から逸脱せずにその他の方法で行うこともできる。それ故、本開示はあらゆる意味で例示的であり、限定的ではないと考えるべきであり、本発明の範囲は特許請求の範囲により示され、均等物の意味及び範囲内に入る全ての変化はその中に含まれることが意図されている。当業者は本明細書に記載された本発明の具体的な実施態様の多くの均等物を認め、又は、日常的な実験以上のものを使用せずに確かめることができるであろう。そのような均等物は特許請求の範囲により含まれることが意図されている。
以下に本発明に関した配列表を示す。

SEQUENCE LISTING

<110> Rodriguez, Moses
Miller, David J.
Pease, Larry R.

<120> HUMAN IGM ANTIBODIES AND DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC
USES THEREOF PARTICULARLY IN THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM

<130> X1J1890

<140> JP 2001-582396
<141> 2000-05-30

<160> 50

<170> PatentIn Ver. 2.0

<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95

Ala Lys Gly Val Thr Gly Ser Pro Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115


<210> 2
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 2
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagaggtg 300
actgctattc cctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 3
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 3
caggtgcagc tggtggagtc tggggggggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctctggca tgcactgggt ccgccaagct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttcatatg atggaagtag gaaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa cactctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgac ggctgacgac acggctgtgt attattgtgc gaaaggagtg 300
actggtagtc cgacgcttga ctactggggc cagggagccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 4
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 4
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctctggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaatc atttcatatg atggaagtac gaaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa cactctctat 240
ctgcaaatga acagcctgac agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggagtg 300
actggtagtc cgacgcttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcg 357

<210> 5
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<400> 5
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30

Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45

Ile Tyr Asp Ile Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95

Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110

Pro Lys



<210> 6
<211> 337
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 6
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgtg tggtattcgg 300
cggagggacc aagctgaccg tcctaggtca gcccaag 337

<210> 7
<211> 342
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 7
cagtctgtgt tgacggagcc gccttcagtg tctgctgccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggc aataattttg tatcctggta ccagcaactc 120
ccaggaacag cccccagact cctcatttat gacattacta agcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgctgtggta 300
ttcggcgggg ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca ag 342

<210> 8
<211> 342
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 8
cagtctgtgt tgacggagcc gccttcagtg tctgctgccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggc aataattttg tatcctggta ccagcaactc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacattacta agcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ttactgcgaa acatgggata gcagcctgag tgctgtggta 300
ttcggcgggg ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca ag 342

<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95

Arg Ser Ala Gln Gln Gln Leu Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120


<210> 10
<211> 370
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 10
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacab ccagttctcc 240
ctgaagctga gctctgtgac cgctgcggac acggccabcg tgtattactg tgcgaggtcg 300
gcacagcagc agctggtata ctacdtttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt 360
ctcctcaggg 370

<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
115


<210> 12
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 12
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300
cctctcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaac gaactgtggc tgcacca 357

<210> 13
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 13
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser
20 25 30

Tyr Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys
35 40 45

Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Xaa
50 55 60

Xaa Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Xaa Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
65 70 75 80

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
85 90 95

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Ser Gly Trp
100 105 110

Tyr Trp Ser Cys Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser
115 120 125

Ser



<210> 14
<211> 387
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 14
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnagnnn gccgtggtcc agcctgggag gtccctgaga 60
ctctcctgtg cagcgtctgg attcattttc agtagctatg gcnnnnnnnn nnnnatgcac 120
tgggtccgcc aggttccagg caaggggctg gagtgggtgg cagttatatg gtatgatgga 180
agtgataaan nnnnntacta tgtagactcc gtgaagnnng gccgattcac catctccaga 240
gacaattcta aaaacacgct ctatctgcaa atgaacagcc tgagagccga ggacacggct 300
gtgtattact gtgcgagaga tcgcagcagt ggctggtact ggtcctgcga ctcctggggc 360
cagggaaccc tggtcattgt ctcctca 387

<210> 15
<211> 140
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Ser Gly Ser Pro Gly
1 5 10 15

Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly
20 25 30

Tyr Asn Tyr Xaa Xaa Xaa Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys
35 40 45

Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60

Xaa Asp Arg Pro Ser Gly Val Ser Xaa Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys
65 70 75 80

Xaa Xaa Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala
85 90 95

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Ser
100 105 110

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Pro Xaa
130 135 140


<210> 16
<211> 421
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 16
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt tngcctcnnn ctgtctgggt ctcctggaca gtcgatcacc 60
atctccctga ctggaaccag cagtgacgtt ggtggttata actatnnnnn nnnngtctcc 120
tggtaccaac agcacccagg caaagccccc aaactcatga tttatgatgt cagtnnnnnn 180
nnnnnnnnnn nnnnngatcg gccctcaggg gtttctnnna atcgcttctc tggctccaag 240
nnnnnntctg gcaacacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga ggacgaggct 300
gattattact gcagctcata tacaagcagc agctctgtgg tattcggcgg agggaccaag 360
ctgaccgtcc taggtcagcc caaggctgcc ccctcggtca ctctgttccc gcctccaang 420
g 421

<210> 17
<211> 128
<212> PRT
<213> Mus musculus

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 17
Gln Asp His Leu Gln Gln Ser Gly Pro Xaa Glu Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15

Ala Phe Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn
20 25 30

Tyr Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asn Thr Xaa
50 55 60

Xaa Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Xaa Gly Leu Ala Ser Leu Thr Ala
65 70 75 80

Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser
85 90 95

Glu Ser Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Leu Pro Arg Gly Trp
100 105 110

Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125





<210> 18
<211> 384
<212> DNA
<213> Mus musculus

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 18
caggatcacc tgcagcagtc tggacctnnn gagctggtga agcctggggc ttttgtgaag 60
atatcctgca aggcttctgg ttacaccttc acaaactacg atnnnnnnnn nnnnctaaac 120
tgggtgaggc agaggcctgg acagggcctt gagtggattg gatggattta tcctggaaat 180
gataatactn nnnnnaagta caatgagaag ttcaagnnng gcctggcctc actgactgca 240
gacaagtcct ccaccacagc ctacttgcat ctcagcagcc tgacttctga gagctctgca 300
gtctatttct gtgcaagagg gttacctagg ggctggtact tcgatgtctg gggcgcaggg 360
accacggtca ccgtctcctc agct 384

<210> 19
<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 19
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr
20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln
35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60

Xaa Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Xaa Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly
65 70 75 80

Xaa Xaa Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
85 90 95

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr
100 105 110

Thr Phe Gly Gly Gly
115


<210> 20
<211> 351
<212> DNA
<213> Mus musculus

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 20
aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 60
ttgacctgca aggccagtga gaatgtggtt acttatnnnn nnnnnnnnnn nnnngtttcc 120
tggtatcaac agaaaccaga gcagtctcct aaactgctga tatacggggc atccnnnnnn 180
nnnnnnnnnn nnnnnaaccg gtacactggg gtccccnnng atcgcttcac aggcagtgga 240
nnnnnntctg caacagattt cactctgacc atcagcagtg tgcaggctga agaccttgca 300
gattatcact gtggacaggg ttacagctat ccgtacacgt tcggaggggg g 351

<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 21
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Phe Pro Gly
1 5 10 15

Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Arg Pro Gly Lys
35 40 45

Thr Asn Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60

Xaa Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Xaa Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
65 70 75 80

Xaa Xaa Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
85 90 95

Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr
100 105 110

Thr Phe Gly Gly Gly
115


<210> 22
<211> 351
<212> DNA
<213> Mus musculus

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 22
gatgtccaga taacccagtc tccatcttat cttgctgcat ttcctggaga aaccattact 60
attaattgta gggcaagtaa gagcattagt aaatatnnnn nnnnnnnnnn nnnnttagcc 120
tggtatcaag agagacctgg aaaaactaat aagcttctta tctactctgg atccnnnnnn 180
nnnnnnnnnn nnnnnacttt gcaatctgga attccannnt caaggttcag tggcagtgga 240
nnnnnntctg gtacagattt cactctcacc atcagtagcc tggagcctga agattttgca 300
atgtattact gtcaacagca taatgaatac ccgtatacgt tcggaggggg g 351

<210> 23
<211> 132
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Xaa Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ile Asp
20 25 30

Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Leu Ser Gly Asp Ser Gly Ser Ser Xaa
50 55 60

Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Xaa Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
65 70 75 80

Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ala
85 90 95

Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Gln Glu Thr Gly Pro Gln Arg
100 105 110

Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser
115 120 125

Ala Pro Thr Leu
130


<210> 24
<211> 396
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 24
gaggtgcaac tattggaatc tgggggannn ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 60
ctctcctgtg cagcctctgg attcagcttt atcgactatg ccnnnnnnnn nnnnatgagc 120
tgggtccgcc aggctccagg gaagggactg gagtgggtct caagtcttag tggtgatagt 180
ggtagttcan nnnnntatta tgcagactcc gtgaagnnng gccgattcac catctccaga 240
gacaattcca agagcacggt gtttctgcaa ctgagcagcc tgagagccga ggacacggcc 300
atatattact gtgcgcagga gaccggtccc cagcgtcgct ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct cagggagtgc atccgcccca accctt 396

<210> 25
<211> 132
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60

Xaa Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Xaa Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly
65 70 75 80

Xaa Xaa Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
85 90 95

Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
100 105 110

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
115 120 125

Pro Ser Val Phe
130


<210> 26
<211> 396
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 26
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggnnnn nnnnnnnnnn nnnnttggcc 120
tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct aaactcctga tctataaggc gtttnnnnnn 180
nnnnnnnnnn nnnnnaattt agaaagtggg gtcccannnt caaggttcag aggcagtggc 240
nnnnnntctg ggacagaatt cactctcacc atcagcagcc tgcagcctga tgattctgca 300
acttattact gccagcagta tagtagttac cccctcactt tcggcggagg gaccaaggtg 360
gacattaaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttc 396

<210> 27
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 27
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Glu
1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly
20 25 30

Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
35 40 45

Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Xaa
50 55 60

Xaa Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Xaa Gly Arg Val Thr Met Thr Arg
65 70 75 80

Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser
85 90 95

Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Pro Gly
100 105 110

Arg Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125


<210> 28
<211> 378
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 28
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnccaggnnn nagnananga aancggaggc ctcagtgaag 60
gtctcctgca aggcttctgg atacaccttc accggctact atnnnnnnnn nnnnatgcac 120
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gatggatcaa ccctaacagt 180
ggtggcacan nnnnnaacta tgcacagaag tttcagnnng gcagggtcac catgaccagg 240
gacacgtcca tcagcacagc ctacatggag ctgagcaggc tgagatctga cgacacggcc 300
gtgtattact gtgcgagaga tcgatcgtat ccgggaagga actactttga ctactggggc 360
cagggaaccc tggtcacc 378

<210> 29
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30

Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60

Xaa Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Xaa Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
65 70 75 80

Xaa Xaa Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
85 90 95

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser His Thr
100 105 110

Phe Gly Gln Gly
115


<210> 30
<211> 348
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 30
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctacn nnnnnnnnnn nnnnttagcc 120
tggtaccagc agaaacctgg ccaggctccc aggctcctca tctatggtgc atccnnnnnn 180
nnnnnnnnnn nnnnnagcag ggccactggc atcccannng acaggttcag tggcagtggg 240
nnnnnntctg ggacagactt cactctcacc atcagcagac tggagcctga agattttgca 300
gtgtattact gtcagcagta tggtagctct cacacttttg gccagggg 348

<210> 31
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 31
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp
20 25 30

Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45

Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Xaa
50 55 60

Xaa Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Xaa Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
65 70 75 80

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
85 90 95

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Ser Ser Ser
100 105 110

Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
115 120 125


<210> 32
<211> 378
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 32
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngannn ggcttggtca agcctggagg gtccctgaga 60
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttc agtgactact acnnnnnnnn nnnnatgagc 120
tggatccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttt catacattag tagtagtagt 180
agttacacan nnnnnaacta cgcagactct gtgaagnnng gccgattcac catctccaga 240
gacaacgcca agaactcact gtatctgcaa atgaacagcc tgagagccga ggacacggct 300
gtgtattact gtgcgagaga tcggtcgagc agcagctggt actactacta ctacggtatg 360
gacgtctggg gccaaggg 378

<210> 33
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45

Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60

Xaa Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Xaa Ser Arg Phe Asn Gly Ser Gly
65 70 75 80

Xaa Xaa Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
85 90 95

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Lys Cys Pro Ser
100 105 110

His Phe Arg Gly Arg Asp
115


<210> 34
<211> 354
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 34
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcgagtca gggcattagc aattatnnnn nnnnnnnnnn nnnnttagcc 120
tggtatcagc agaaaccagg gaaagttcct aagctcctga tctatgctgc atccnnnnnn 180
nnnnnnnnnn nnnnnacttt gcaatcaggg gtcccannnt ctcggttcaa tggcagtgga 240
nnnnnntctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tgcaacctga agatgttgca 300
acttattact gtcaaaagta taacaagtgc ccctctcact ttcgggggag ggac 354

<210> 35
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 35
Asp Ile Ala Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Arg Ser Val Leu Phe Ser
20 25 30

Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60

Xaa Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Xaa Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
65 70 75 80

Xaa Xaa Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
85 90 95

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile
100 105 110

Thr Phe Gly
115


<210> 36
<211> 345
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 36
gacatcgcga tgacccagtc tccagactcc ctggcagtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagccg gagtgtttta ttcagctcca acaataacaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctactca tttactgggc atctnnnnnn 180
nnnnnnnnnn nnnnnacccg ggaatccggg gtccctnnng accgattcag tggcagcggg 240
nnnnnntctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca 300
gtttattact gtcagcaata ttatagtact ccaatcacct tcggc 345

<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus

<220>
<223> All "Xaa"s in the sequence represent unknown amino
acids.

<400> 37
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60

Xaa Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Xaa Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly
65 70 75 80

Xaa Xaa Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
85 90 95

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu
100 105 110

Thr Phe Gly Ala Gly
115


<210> 38
<211> 351
<212> DNA
<213> Mus musculus

<220>
<223> All "n"s in the sequence represent unknown nucleic
acids.

<400> 38
gacatcgtaa tgacgcagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctnnnn nnnnnnnnnn nnnngtagcc 120
tggtatcaac agaaaccagg acaatctcct aaactactga tttactcggc atccnnnnnn 180
nnnnnnnnnn nnnnntaccg gtacactgga gtccctnnng atcgcttcac tggcagtgga 240
nnnnnntctg ggacggattt cactttcacc atcagcagtg tgcaggctga agacctggca 300
gtttattact gtcagcaaca ttatactact ccgctcacgt tcggtgctgg g 351

<210> 39
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer.

<400> 39
actcccaagt cggctcgctt tctcttcagt gacaaacaca gacatagaac attcaccatg 60
ggatggagct gtatcact 78

<210> 40
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer.

<400> 40
actgactctc ttaattaaga ctcacctgag gagactgtga gagtggt 47

<210> 41
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer.

<400> 41
ttggcgcgcc aaagactcag cctggacatg atgtcctctg ctcagttc 48

<210> 42
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer.

<400> 42
atagtttagc ggccgcattc ttatctaaca ctctcccctg ttg 43

<210> 43
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer.

<400> 43
gactcggtcc gcccagccac tggaagtcgc cggtgtttcc attcggtgat catcactgaa 60
cacagaggac tcaccatgga gtttgggctg agctgggttt tcctcgttgc tcttttaaga 120
ggtgtccagt gtcaggtgca gctggtggag tctgg 155

<210> 44
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer.

<400> 44
ccttaattaa gacctggaga ggccattctt acctgaggag acggtgacca gggttc 56

<210> 45
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer.

<400> 45
ctagctagcg tcctaggtca gcccaaggct gccccc 36

<210> 46
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer.

<400> 46
atagtttagc ggccgcacct atgaacattc tgtagg 36

<210> 47
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer.

<400> 47
ctagctagcc cgaatttcgg gacaatcttc atcatgacct gctcccctct cctcctcacc 60
cttctcattc actgcacagg gtcctgggcc cagtctgtgt tgacgcagcc g 111

<210> 48
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer.

<400> 48
gggcagcctt gggctgagct aggacggtca gc 32

<210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45

Ala Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95

Ala Lys Gly Val Thr Gly Ser Pro Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115


<210> 50
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<400> 50
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30

Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45

Ile Tyr Asp Ile Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95

Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110

Pro Lys
ポリクローナルヒト抗体及び血清由来ヒトモノクローナルIgM抗体（sHIgM）が小脳の切片中の細胞の表面抗原に高い特異性で結合することを示す写真を含む。新生仔ラット小脳の未固定切片の間接の免疫蛍光標識。sHIgMは未固定脳切片内の細胞集団及び構造に種々の特異性を示す。この性質が髄鞘再形成を促進する能力についてin vivo試験するための候補抗体を選択する基準の一つとして使用された（表１及び図12を参照のこと）。ポリクローナルヒトIgGは白質及びプルキニエ細胞を含む、小脳内の多くの構造に非常に弱く結合し(A)、一方、ポリクローナルヒトIgMは葉の中枢の白質内のミエリン及び推定のオリゴデンドロサイト、プルキニエ細胞体並びに顆粒層及び分子層内の多くの小さい細胞に強く結合する(B)。sHIgM 22 (C)は葉の中枢の白質の上にある損傷された星状細胞、プルキニエ細胞及びそれらの樹状分枝細胞骨格、並びに分子層中の小さい丸形細胞に良く結合する。sHIgM 22は顆粒細胞の表面を、弱く、しかし一様に標識する。sHIgM 14 (D)は顆粒層の細胞及び切片の表面に位置するプルキニエ細胞に良く結合し、一方、葉の中枢の白質は標識を殆ど含まない。sHIgM 1 (E)は葉の中枢の白質の上にある星状細胞の細胞骨格を標識する。全てのその他の構造がバックグラウンドレベルのすぐ上で同定される。sHIgM 2 (F)は顆粒層の細胞及び葉の中枢の白質を横切る繊維に結合する。倍率x。 付加的なsHIgMが小脳の切片中の細胞に高い特異性で結合することを示す写真を含む。新生仔ラット小脳の未固定切片の間接の免疫蛍光標識。sHIgMは未固定脳切片内の細胞集団及び構造に種々の特異性を示す。sHIgM 12 (A)は葉の中枢の白質に結合してスポンジ状外観を与え、細胞外基質分子を連想させる、分子層の上に一様の標識を与える。上にある星状細胞がまた良く特定される。sHIgM 29 (B)は、顆粒層及び分子層中の神経細胞の小集団を除いて、バックグラウンドのすぐ上の強さで小脳中の多くの構造に弱く結合する。100(mを越える長さの軸索延長が明瞭に形どられている。sHIgM 31 (C)及びsHIgM 50 (F)は夫々顆粒層に主として結合し、白質、プルキニエ細胞又は星状細胞に殆ど結合しない。sHIgM 50の結合パターンはまた細胞外基質分子を連想させる。sHIgM 42 (D)は全葉、分子層及び顆粒層並びに白質に繊維状パターンで結合する。sHIgM 46 (E)は顆粒層及び白質に繊維状パターンで結合する。プルキニエ細胞体が良く特定される。 sHIgMが成人皮質白質の未固定切片に高い特異性で結合することを示す写真を含む。成人皮質白質の未固定切片の間接の免疫蛍光標識。皮質ヒト白質はCNS感染又はトラウマを有しない個体から解剖で得られた。死亡の原因はCNS関連以外であった。組織を氷上で得て、抗体標識操作中は低温に維持した。sHIgM 2 (A)は視野内の二三の細胞のみに結合する。対照的に、その他のsHIgMはヒト白質を非常に良く、しかも高度の特異性で結合する。sHIgM 32は型２星状細胞の外観の細胞に結合し(C)、一方、sHIgM 31は多くの未同定丸形細胞体に結合する(B)。sHIgM 26はオリゴデンドロサイトの外観の細胞及び繊維状白質に結合する(E)。sHIgM 22は細胞外基質結合分子を示唆する様式でヒト皮質白質に結合する(D)。倍率x。 EBV不死化ヒトＢ細胞クローン由来モノクローナルIgM抗体（ebvHIgM）が小脳中の細胞の表面抗原に高い特性で結合することを示す写真を含む。新生仔ラット小脳の未固定切片の間接の免疫蛍光標識。ebvHIgMは未固定ラット脳切片内の細胞集団及び構造に種々の特異性を示す。ebvHIgM MSI19E15 (A)は白質内の繊維状構造並びに顆粒層及び分子層に集密に近いパターンで結合する。ebvHIgM AKJR4 (B)は顆粒層に殆ど専ら結合する。分子層内の小さい細胞がまた同定される。ebvHIgM MSI17A2 (C)及びMSI20H10 (E)は種々の強さの程度で中枢白質、顆粒層及び分子層並びにプルキニエ細胞に結合する。ebvHIgM MSI16E6 (D)はプルキニエ細胞及びそれらの樹脂状樹に対し非常に強いアフィニティーを示し、一方、顆粒層ははるかに明確ではなく標識される。ebvHIgM MSI7E11 (F)は脳切片の表面で二三のグリア外観の細胞のみに点状様式で結合する。倍率x。 小脳の切片中の細胞の表面抗原に高い特異性で結合する付加的なebvHIgMを示す。新生仔ラット小脳の未固定切片の間接の免疫蛍光標識。ebvHIgMは未固定脳切片内の細胞集団及び構造に対し種々の特異性を示す。夫々のパネルは中枢の白質、並びに顆粒層、プルキニエ層及び分子層を含む、単一小脳葉の端部を示す。脳の切片を、ebvHIgMを含む上清：緩衝培地1:1でインキュベートした。多くのebvHIgMが白質、プルキニエ細胞体、及び分子層内の小さい細胞に結合するが、アフィニティーは様々である。ebvHIgM MSI19D10 (A)は顆粒層の細胞並びにプルキニエ細胞及びそれらの樹状分枝に強く結合し、加えて白質及び星状細胞を弱く同定する。ebvHIgM MSI19D10をin vivoで髄鞘再形成を促進する能力について試験した（表１及び図13を参照のこと）。その他の脳結合性ebvHIgM、CB2bG8(B)、CB2eC2(C)、CB2iE12(D)、及びMSI10E10(F)が単離され、更なる研究を保証するが、in vivoで試験されなかった。CB2eC2(E)は非反応性上清の典型的な強さである。倍率x。 ポリクローナルヒトIgMが培養中のオリゴデンドロサイトに結合することを示す。免疫細胞化学により、ポリクローナルヒトIgMはオリゴデンドロサイトの亜集団の表面を染色する。オリゴデンドロサイト表面抗原に対する反応性がポリクローナルヒトIgG、又はsHIgM 1もしくはsHIgM 2からの血清で観察されなかった。固定され、透過された細胞中のプールされたヒトIgM又はIgGによる免疫細胞化学は細胞内構造のわずかな染色を示した。 sHIgMが培養中のグリア細胞の表面抗原に高い特異性で結合することを示す。接種後９日目の生ラット一次混合グリア細胞培養物の間接の免疫蛍光標識。sHIgMは結合する細胞型だけでなく、混合グリア培養物中で同定される細胞分化段階について種々の特異性を示す。sHIgM 12は一層成熟した04+オリゴデンドロサイト（Ａ、赤色標識）の中央で推定のオリゴデンドロサイト前駆細胞（Ａ、緑色標識）のクラスターに結合する。sHIgM 22はグリア培養物の表面に付着する成熟段階のオリゴデンドロサイト(B)に結合する。sHIgM 46は成熟段階のオリゴデンドロサイト（Ｃ、図の中央）及び一層かすかな点状標識を有する未成熟段階のオリゴデンドロサイト（Ｃ、図の左側）の両方に強く結合する。sHIgM 42 (D)及びsHIgM 51 (F)の両方が成熟段階のオリゴデンドロサイトそしてかすかに、下にある星状細胞に結合する。sHIgM 30は培養中の殆どの細胞の細胞体に結合するが、突起延長は描かれない(E)。倍率x。 sHIgMが小脳の切片及び混合一次グリア細胞の培養物中のオリゴデンドロサイト系列の細胞に結合することを示す。オリゴデンドロサイト系列のマーカーとのｓＨＩｇＭ同時標識により同定された細胞。新生仔ラット小脳の未固定切片中でsHIgM 22を結合する細胞は成熟段階のオリゴデンドロサイトの細胞質マーカーであるRip抗体を同時標識する。二重標識共焦像はRip陽性でもある（C）sHIgM22陽性細胞（Ａ）を示している。sHIgM 22陽性細胞(A)を示す。像(A)及び(C)は(E)中に合併されている。混合一次ラットグリア細胞培養物(B)中でsHIgM 51を結合する細胞はまた04陽性である(D)。抗スルファチドである04は増殖の停止の前に現れ、成人髄鞘中に維持されるオリゴデンドロサイト系列の良く確立されたマーカーである。像(B)及び(D)は(F)中で合併される。倍率x。 ebvHIgMが小脳の切片中でオリゴデンドロサイト系列の細胞に結合することを示す。新生仔ラット小脳の未固定切片中でebvHIgM MSI19E5により同定される細胞は抗スルファチドかつオリゴデンドロサイトの細胞表面マーカーである04抗体と同時標識される。葉の白質内の細胞の二重標識共焦像はまた04陽性(B)でもあるebvHIgM MSI19E5陽性細胞(A)を示す。像(A)及び(B)は(C)中で合併されている。 脊髄ホモジネート中に見られるCNS抗原への結合についてのsHIgMのスクリーニングの結果を示す。ポリスチレンプレートに結合された脊髄ホモジネートへの結合についてsHIgMをスクリーニングした。プレートに結合する抗原の殆どが脊髄の白質からの脂質及びタンパク質である。従って、SCHホモジネートへの強い抗体結合は白質成分への結合と解される。１種のsHIgMのみが１より大きいODでSCHに結合する、sHIgM 22。この抗体はまた培養中の脳切片、オリゴデンドロサイトに良く結合し、in vivoの髄鞘再形成を促進する能力について試験されたものである（表１を参照のこと）。この簡単なアッセイはin vivoの髄鞘再形成を促進する抗体の能力を予測する際に強力な手段であることが判明した。SCHに良く結合するその他のsHIgM（例えば、38及び49）は研究中である。 脊髄ホモジネート中に見られるCNS抗原への結合についてのebvHIgMのスクリーニングの結果を示す。ポリスチレンに結合された脊髄ホモジネートへの結合についてebvHIgMをスクリーニングした。４種のebvHIgMが１より大きいODでSCHホモジネートに結合した。これらの一種、MSI19D10はin vivoの髄鞘再形成を促進する能力について試験されたものである（表１を参照のこと）。低結合性抗体、AKJR4もin vivoで試験したものである（表１を参照のこと）。一種のその他の強い結合性の抗体、AKJR8は研究中である。クローンCB2iH1及びCB1bD2は培養中に非常にわずかな抗体しか産生しない。ここでもまた、この簡単なアッセイは抗体をスクリーニングし、どの抗体がin vivoの髄鞘再形成を促進することができるのかを予測する際に非常に強力な手段であることが判明した。 ポリクローナルヒト抗体及びsHIgMがTMEV感染マウスで髄鞘再形成を促進することを示す。TMEVで慢性感染されたSJL/Jマウスの脊髄中のミエリン病変の領域の光学顕微鏡写真。軸索直径に関する薄い髄鞘を特徴とする、広範なCNS髄鞘再形成が、ポリクローナルヒトIgG(A)、ポリクローナルヒトIgM(B)、及びsHIgM 22(C)による治療後にマウス中で観察される。有意な髄鞘再形成のない髄鞘脱落がsHIgM 14(D)、SHIgM 1(E)及びsHIgM 2で治療されたマウス中で観察された。アラルダイトに埋め込まれた切片を１％のp-フェニレンジアミンで染色した。倍率x 。ポリクローナルヒトIgMはポリクローナルヒトIgGよりもin vivoの髄鞘再形成を促進する能力が優れていることが判明した（表１）。強いCNS特異性は抗体がin vivoの髄鞘再形成を促進するための要件の一つであるようだが、単独では髄鞘再形成を促進する抗体の能力を予測するのに充分ではない。 ebvHIgMがTMEV感染マウスで髄鞘再形成を促進し得ることを示す。TMEVで慢性感染されたSJL/Jマウスの脊髄中のミエリン病変の領域の光学顕微鏡写真。軸索直径に関する薄い髄鞘を特徴とする、広範なCNS髄鞘再形成が、ebvHIgM MSI19D10(A)による治療後にマウス中で観察される。有意な髄鞘再形成のない髄鞘脱落がebvHIgM AKJR4(B)で治療されたマウス中で観察された。アラルダイトに埋め込まれた切片を１％のp-フェニレンジアミンで染色した。再度、強いCNS特異性は抗体がin vivoの髄鞘再形成を促進するための要件の一つのようだが、単独では髄鞘再形成を促進する抗体の能力を予測するのに充分ではない。 ヒトポリクローナルIgMで治療されたリゾレシチン病変中の髄鞘形成された軸索の定量を示す。治療されたリゾレシチン病変vs未治療のリゾレシチン病変中の髄鞘再形成された軸索/mm2。ポリクローナルヒトIgGで治療された動物よりもポリクローナルヒトIgMで治療されたリゾレシチン病変中に有意に多い髄鞘再形成された軸索があった（p<0.05）。PBS対照グループ中の１匹の動物が自発的に髄鞘再形成し、したがって、ヒト抗体治療グループと対照グループの間の差は統計上有意ではない（p>0.05）。 ヒト抗体が化学ハプテンに多反応性であることをELISAにより示す。直接ELISAにより評価された免疫グロブリンの抗原結合特異性。ポリクローナルヒトIgM、ポリクローナルヒトIgGの化学ハプテン反応性。これらの図中に使用される略号：NP、(4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニル)アセチル；PhoX、フェニルオキサゾロン；TMA、アゾフェニルトリメチルアンモニウム；FITC、フルオレセイン；PC、アゾフェニルホスホリル-コリン；ARS、アゾフェニルアルソネート；TNP、トリニトロフェニルアセチル。 ヒト抗体が自己タンパク質に多反応性であることをELISAにより示す。直接ELISAにより評価された免疫グロブリンのタンパク質抗原結合特異性。これらの図中に使用される略号：MBP、ミエリン塩基性タンパク質；KLH、キーホールリンペットヘモシアニン；ＨＥＬ、ニワトリ卵リゾチーム；BSA、ウシ血清アルブミン；Rbt、ウサギ；Bo、ウシ；Mo Hb、マウスヘモグロビン。 sHIgM 22重鎖可変領域配列を示す。配列は刊行物：Sequences of Proteins ofImmunological Interest, I巻, 第５編(1991), Kabat E.A., Wu, T.T., Perry, H.M. Gottesman, K.S.及びFoeller, C., NIH Publication中のヒトVH配列のナンバリングシステムに従って整列される。sHIgM 22 VHはVHサブグループIIIの員である。下線を施されたアミノ酸はタンパク質配列決定により確認された。アミノ酸配列はsHIgM 22ヌクレオチド配列に相当する。sHIgM 22 VH型Ａ配列及びＢ配列はIGHV3-30/3-30-05*01、IGHJ4*02及びIGHD2-21*02生殖系列配列とは異なるヌクレオチドのみで表される。sHIgM 22 VH型Ｂのタンパク質配列中の二つのアミノ酸置換がボールド体で印刷される。sHIgM 22 VH型Ａ及びＢの両方の配列はIGHV3-30/3-30-5*01生殖系列配列に最も密接にマッチした（96％の相同性）。生殖系列配列に関する文献：IMGT、国内ImMunoGeneTicsデータベース〔http://imgt.cnusc.fr:8104〕（イニシエーター及びコーディネーター：Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France） sHIgM 22軽鎖可変領域配列を示す。配列は刊行物：Sequences of Proteins of Immunological Interest, I巻, 第５編(1991), Kabat E.A., Wu, T.T., Perry, H.M. Gottesman, K.S.及びFoeller, C., NIH Publication中のヒトVH配列のナンバリングシステムに従って整列される。VλsHIgM 22はλサブグループIの員である。下線を施されたアミノ酸はタンパク質配列決定により確認された。アミノ酸配列はsHIgM 22ヌクレオチド配列に相当する。sHIgM 22 Vλ型Ｉ配列及びII配列はIGLV1-51*01及びIGLJ3*01生殖系列配列とは異なるヌクレオチドのみで表される。sHIgM 22 Vλ型IIのタンパク質配列中の二つのアミノ酸置換がボールド体で印刷される。sHIgM 22からのVλ配列はIGLV-51*01生殖系列配列に最も密接にマッチした（97％の相同性）。二つの遺伝子は単一ヌクレオチド変化によりそれらの共通の祖先とは異なる。生殖系列配列に関する文献：IMGT、国内ImMunoGeneTicsデータベース〔http://imgt.cnusc.fr:8104〕（イニシエーター及びコーディネーター：Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France） ebvHIgM MSI19D10重鎖可変領域配列を示す。 ebvHIgM MSI19D10軽鎖可変領域配列を示す。 髄鞘再形成を促進するモノクローナル抗体が培養中のグリア細胞中でCa2+フラックスを生じることを示す。三つのパネルは４種の異なる抗体に対するグリアのCa2+応答を示す：in vivoの髄鞘再形成を促進する２種、sHIgM 22(A)及びSCH94.03(B)、並びに髄鞘再形成を促進しない２種、sHIgM 14（パネルＣ）及びCH12（Ｃ）。応答した細胞はカルシウムスパイクの２種の異なる型、抗体の添加直後の速いスパイク（Ａ＆Ｂ、赤色トレース）、又は抗体の添加後に短い遅延で現れる一層広いスパイク（Ａ＆Ｂ、黒色トレース）の一つを示した。時間軸の小さい着色された三角形は抗体（又はイオノホア）が添加された瞬間を表す。抗体sHIgM 22及びSCH94.03は両方の型の応答を誘発したが、グリア細胞の異なるサブセットから誘発した（パネルＡ＆Ｂ）。in vivoの髄鞘再形成を促進しない、抗体sHIgM 14及びCH12は培養グリア中でカルシウムフラックスを生じないことが観察された（パネルＣ）。夫々の実験の終了時に、カルシウムイオノホアBr-A23187を細胞保全性についての対照として夫々の培養物に添加した。生存細胞へのイオノホアの添加は大きいCa2+内向きフラックスを生じる。このことは示した実験の夫々で明らかである。 sHIgM及びebvHIgMが培養中の一次神経細胞に結合することを示す。培養６日の生存一次ラット顆粒細胞の間接の免疫蛍光標識。sHIgM 12は培養中の小脳顆粒細胞の実際に全ての軸索及び樹脂状延長に結合する(A)。結合パターンは抗ガングリオシド抗体、例えば、マウス抗体A2B5で観察されたパターンと同様である。A2B5はin vivoの髄鞘再形成を促進することが示されていた（Asakaraら, 1998）。ebvHIgM CB2iE12は顆粒細胞体及びそれらの近位の軸索延長のみに結合する(B)。CB2iE12により認識される抗原は発生的に調節される。なぜなら、プレーティング後、4-5日まで培養中の顆粒細胞についてCB2iE12染色に対し陰性だからである。倍率x。 マウスモノクローナル抗体SCH94.03が培養中の顆粒細胞の表面に結合することを示す。間接の免疫蛍光標識及び共焦連続イメージングはマウスモノクローナル抗体SCH94.03が培養中の顆粒細胞神経細胞の表面にのみ結合することを示す。一連の像を１μm離して撮影し、突起延長を有する外部標識された球形細胞体について予想される同心の円形環が明瞭に示されている。 TMEV感染マウスの脊髄中の白質、白質病変及び髄鞘再形成を定量するのに使用された方法を示す。TMEVで慢性感染され、ポリクローナルヒトIgMで治療されたSJL/Jマウスからの胸レベル脊髄切片の光学顕微鏡写真(A)。周辺の白質が一層明るい中枢の灰質よりも暗く染色される。全白質の領域が40倍の倍率でトレースされている（赤色アウトラインにより示される）。次いで100倍の倍率で、白質病変の領域がトレースされている（緑色アウトラインにより示される）。この例では、白質病変の領域が切片の周辺と同じ位明るい領域として見える。最後に、250倍の倍率で、OL髄鞘再形成の領域（青色アウトラインにより示される）及びSC髄鞘再形成の領域（黄色アウトラインにより示される）がトレースされている。OL髄鞘再形成は軸索直径に関して薄い髄鞘を特徴とする。白質病変の面積％は緑色の面積を赤色の面積で割り、100を掛けることにより計算される。OL髄鞘再形成の面積％は青色の面積を緑色の面積で割り、100を掛けることにより計算される。10の脊髄断片を考慮した夫々の動物についてトレースし、面積を合計して動物に関するスコアーを計算する。一般に、各実験グループにおいて7-8匹の動物を処置し、死亡及び少なくとも５％の全白質病変を含まない動物を許す。通常4-5匹の動物が最終データ組に含まれるための基準を満たす。背側柱白質（Ａ中のアステリスクにより示された領域からのＢ）の高倍率視野により有意なOL髄鞘再形成が示される（矢印）。スケールバーはAで250μmであり、Bで20μmである。 ヒトAbによる治療後に、TMEV慢性感染マウスは有意なOL髄鞘再形成を示す。異なる治療グループの脊髄白質病変の代表的な領域の光学顕微鏡写真。IVIgによる治療は有意なOL髄鞘再形成をもたらした(A)。軸索直径に関する稠密に充填された薄い髄鞘を特徴とする、殆ど完全なOL髄鞘再形成（Ｂ、矢印）が、ポリクローナルヒトIgM(B)並びにヒトmAb sHIgM 22(F)及びsHIgM46(G)による治療後にマウスの脊髄からの切片中に観察された。対照的に、ヒトmAb sHIgM1(C)、sHIgM2(D)、sHIgM14(E)又はPBS(H)による治療後に、マウスは有意なOL髄鞘再形成のない白質病変を示した。活性ミエリン破壊の兆候である、浸潤性炎症性細胞及びマクロファージ摂取ミエリンデブリ（Ａ、矢印）がまた明らかであった。sHIgM22で治療された８匹の動物のうちの４匹及びsHIgM46で治療された５匹の動物のうちの５匹の脊髄断片が有意な組織修復を示す稀なイベントである、少なくとも一つのほぼ集密のOL髄鞘再形成領域を含んでいた。対照的に、sHIgM1、sHIgM2、sHIgM14、又はPBSで治療された夫々のマウスからの10の脊髄断片は何も含んでいなかった。スケールバーは20mmである。 ラットOLに結合する能力ゆえに単離されたヒトmAbはまた培養中のヒトOLの表面にも結合する。sHIgM14(A)（これは髄鞘再形成を促進しなかった）、並びにsHIgM22(B)及びsHIgM46(C)（これらは髄鞘再形成を促進した）は３週間にわたって培養物中に維持されたスルファチド陽性ヒトOLの神経細胞形質及び複雑な突起並びに膜延長に結合した。sHIgM2（Ｄ、緑色のチャンネル）はスルファチド陽性（Ｄ、赤色チャンネル）ヒトOLに結合しなかったヒトmAbの例である。核が青色に標識されている。IVIg、ポリクローナルヒトIgM、並びにヒトmAb sHIgM1及びsHIgM2は試験したあらゆる時点でヒトOLの表面に結合しなかった。スケールバーは25mmである。 EBV形質転換体抗体CB2b-G8の重鎖可変領域配列を示す。 EBV形質転換体抗体CB2b-G8の軽鎖可変領域配列を示す。 dHfRを含む発現プラスミドのメトトレキセート増幅による軽鎖RNAの増幅及びトランスフェクトされたハイブリドーマ細胞中のタンパク質発現。SV40プロモーターの制御下に連結されたdHfR遺伝子と一緒のCMVプロモーターの制御下のヒト化94.03κ軽鎖のコーディング配列を含む発現プラスミドをエレクトロポレーションにより免疫グロブリン陰性F3B6ヒト／マウスハイブリドーマ細胞系に導入した。最小メトトレキセート選択下の細胞（0.5μg/ml）及び更にストリンジェントな選択を受けた細胞（51.2μg/ml）を培養して上清を回収して軽鎖分泌を評価し、RNAを回収して軽鎖遺伝子発現を評価した。ノーザンブロット分析は一つのクローン（＃５）中のRNA発現の実質的な増幅を示す。タンパク質発現がクローン４中のメトトレキセート選択後に増大されたが、クローン５では増大されなかった。これらの知見はメトトレキセート増幅が密接に連関した遺伝子によるmRNAの増幅及びタンパク質発現を時にはもたらすが、その他の場合には転写の増幅及びタンパク質合成を生じさせないことを示す。 ヒト化94.03及びsHIgM 22をコードする増幅可能なベクター。上部パネルはヒト化94.03軽鎖（κ）のコーディング配列及びヒト化94.03重鎖（μ）をコードするハイブリッドゲノム構築物を含むプロトタイプベクターである。下部パネルはsHIgM 22配列に由来するコーディング配列を含む同様の構築物である。 マウス及びヒト化94.03で染色された新生仔ラット小脳。小脳切片をマウス及びヒト化94.03で染色した。結合した抗体を夫々マウス又はヒトIgMに特異性の蛍光二次抗体を使用して位置を明らかにした。どちらの抗体も小脳中の白質道及び星状細胞に対し同様の染色パターンを示した。 94.03のIgG変異体の単離。表面でIgGを発現する細胞についてのソーティングにより94.03の天然スイッチ変異体が培養物から単離された。細胞培養物のソーティング前プロフィール及びソーティング後プロフィールを示してある。IgG細胞が制限希釈クローニングにより後選別集団から単離された。IgGイソタイプ特異性抗体を使用して産生された抗体がIgG1であると同定された。 IgG1産生細胞が実際に94.03の変異体であったことの実証。RNAをIgG1発現クローナル細胞から単離した。cDNAを94.03の可変領域及びγ１イソタイプの定常領域に特異性のプライマーを用いるRTPCRを使用して作製した。得られたDNAを配列決定して自発スイッチ変異体について予想される正確なスプライシング結合を明らかにした。 マウス09抗体の重鎖可変領域配列を示す。 マウス09抗体のマウス09可変領域配列のκ軽鎖１可変領域配列を示す。 マウス09抗体のκ軽鎖２可変領域配列を示す。 AKJR4重鎖可変領域配列を示す。 AKJR4κ軽鎖可変領域配列を示す。 CB2iE12重鎖可変領域配列を示す。 CB2iE12κ軽鎖可変領域配列を示す。 CB2iE7重鎖可変領域配列を示す。 CB2iE7κ軽鎖可変領域配列を示す。 MSI 19E5軽鎖可変領域配列を示す。 マウス04抗体のκ軽鎖２を示す。

Claims (29)

  1. 哺乳類の中枢神経系軸索の髄鞘再形成の刺激または中枢神経系の髄鞘脱落疾患の治療に使用するための、中枢神経内の構造及び細胞に結合する能力を特徴とするヒトモノクローナルIgM抗体、又はそのモノマー、又はその活性フラグメント、又は、中枢神経内の構造及び細胞に結合する能力を有する天然または合成の抗体であって、
    ｉ）それぞれ配列番号１または配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する、Ａ型またはＢ型sHIGM22の重鎖可変ドメイン、またはそれらのCDR1、CDR2およびCDR3領域配列を含む重鎖可変ドメイン；および、配列番号５または配列番号５０にそれぞれ記載のアミノ酸配列を有する、I型またはII型sHIGM22の軽鎖可変ドメイン、またはそれらのCDR1、CDR2およびCDR3領域配列を含む軽鎖可変ドメイン；または、
    ii）配列番号９記載のアミノ酸配列を有する、ebvHIgM MS119D10の重鎖可変ドメインまたはそのCDR1、CDR2およびCDR3領域配列を含む重鎖可変ドメイン；および配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する、ebvHIgM MS119D10の軽鎖可変ドメイン、またはそのCDR1、CDR2およびCDR3領域配列を含む軽鎖可変ドメイン、
    を含む、前記抗体又はそのモノマー、又はその活性フラグメント。
  2. 以下の性質を有する、請求項１記載の抗体：
    a) 髄鞘再形成を誘導すること、
    b) グリア細胞の細胞増殖を促進すること、または、
    c) オリゴデンドロサイトにおいてCa++シグナリングを促進すること。
  3. 請求項１または２記載の抗体を含む静脈内又は腹腔内投与用医薬組成物。
  4. 投与すべき量が0.5mg/kgから400mg/kgである、請求項１または２記載の抗体。
  5. キメラ抗体である、請求項１記載の抗体。
  6. 検出可能な標識で標識された請求項１記載の抗体。
  7. 標識が酵素、発光する薬品または放射性元素である、請求項６記載の抗体。
  8. 哺乳類の中枢神経系軸索の髄鞘再形成の刺激または中枢神経系の髄鞘脱落疾患の治療に使用するための、請求項１または２記載のモノクローナル抗体。
  9. 多発性硬化症のヒト、または、マウス脳脊髄炎サイラーウイルスのDA株に感染したマウスのような、髄鞘脱落疾患のヒトまたは家畜の治療用に使用するための、請求項１または２記載の抗体。
  10. a) グリア細胞を含む混合細胞培養物を細胞増殖に充分な条件下で培養すること、
    b) 前記混合培養物に、有効量の、中枢神経内の構造及び細胞に結合するそれらの能力を特徴とする請求項１または２記載のヒトモノクローナル抗体、その活性フラグメント、そのモノマー、または、これらの特性を有する天然又は合成の抗体を導入し、それによりモノクローナル抗体処理混合培養物を作製すること、
    c) 工程b)の培養物をモノクローナル抗体処理細胞の増殖に充分な条件下に維持し、それにより前記混合培養物中のグリア細胞の増殖を生じさせること、および
    d) 前記グリア細胞を前記混合培養物から回収すること、
    を含む、混合細胞培養物からグリア細胞の増殖を刺激するin vitro方法。
  11. A) グリア細胞を細胞増殖に充分な条件下で培養し、それによりグリア細胞培養物を生産すること、
    B) 前記グリア細胞培養物にグリア細胞を刺激してカルシウム（Ca++）ピークを示すことができる有効量の薬剤を導入し、それにより処理されたグリア細胞培養物を生産することであって、前記薬剤は請求項１または２記載のヒト抗体、これらの活性フラグメント、これらのモノマー、またはこれらの特性を有する天然又は合成の抗体であり、前記抗体は中枢神経系の構造及び細胞に結合することができることを特徴とし、
    C) 工程B)の処理されたグリア細胞培養物を処理された細胞の増殖に充分な条件下に維持すること、および、
    D) 前記処理された細胞を培養物から回収し、それによりグリア細胞を得ること、
    によって得られる、中枢神経系軸索の髄鞘再形成を要する哺乳類の中枢神経軸索の髄鞘再形成を刺激するための収集されたグリア細胞。
  12. 活性薬剤として、請求項１または２記載の抗体若しくはその活性フラグメント、その混合物、またはそのモノマー、および医薬上許容できる担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
  13. さらに1以上の抗炎症剤、ステロイド、ベータセロン、コパキソンを含む、請求項１２記載の医薬組成物。
  14. 請求項１または２記載の抗体又はこれらの活性フラグメントをコードする、DNA分子またはRNA分子である核酸分子又はその縮重変異体。
  15. 請求項１４記載のDNA分子またはその縮重変異体を含む組換えDNA分子。
  16. 発現調節配列に機能し得る形で連結されている、請求項１５記載の組換えDNA分子。
  17. 発現調節配列がSV40又はアデノウイルスの初期若しくは後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、ファージλの主要オペレーター領域及びプロモーター領域、fdコートタンパク質の調節領域、3-ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーターまたは酵母α交配因子のプロモーターである、請求項１６記載の組換えDNA分子。
  18. 請求項１５または１６記載の組換えDNA分子で形質転換された単細胞宿主。
  19. 大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、酵母、CHO細胞、R1.1細胞、B-W細胞、L-M細胞、COS1細胞、COS7細胞、BSC1細胞、BSC40細胞、及びBTM10細胞、植物細胞、昆虫細胞、または組織培養ヒト細胞である、請求項１８記載の単細胞宿主。
  20. 請求項１５〜１７のいずれか1項記載のDNA分子で形質転換された組換えウイルス。
  21. RNA転写のプロモーターに機能し得る形で連結された、請求項１４記載のDNA分子。
  22. 請求項２１記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
  23. プロモーターが細菌プロモーター、酵母プロモーター、昆虫プロモーター、ウイルスプロモーター又は哺乳類プロモーターを含む請求項２２記載のベクター。
  24. 好適な宿主細胞中に請求項２２記載のベクターを含むことを特徴とするポリペプチドの生産用の宿主ベクター系。
  25. 好適な宿主細胞が原核生物細胞又は真核生物細胞を含む請求項２４記載の宿主ベクター系。
  26. (a) 請求項２２記載のベクターを好適な宿主細胞に導入すること、
    (b) ポリペプチドを生産するように得られる宿主細胞を培養すること、および、
    (c) 工程(b)で生産されたポリペプチドを回収すること、
    を特徴とする精製形態のポリペプチドを得る方法。
  27. 請求項２６記載のポリペプチド及び医薬上許される担体又は希釈剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
  28. 請求項１または２記載のモノクローナル抗体の存在又は活性を検出する方法であって、前記モノクローナル抗体が、
    A) 前記モノクローナル抗体の存在又は活性が疑われている哺乳類からの生物学的サンプルを、脊髄ホモジネート、グリア細胞およびオリゴデンドロサイトからなる群より選ばれる結合パートナーへの前記モノクローナル抗体の結合を生じさせる条件下で、前記モノクローナル抗体の結合パートナーと接触させること、および、
    B) 前記サンプル中の前記モノクローナル抗体と前記結合パートナーの間に結合が生じたか否かを検出すること、
    によって測定され、前記結合の検出が前記サンプル中の前記モノクローナル抗体の存在又は活性の指標となる、前記モノクローナル抗体の存在又は活性を検出する方法。
  29. A. 所定量の請求項１または２記載のモノクローナル抗体、
    B. 所定量の、脊髄ホモジネート、グリア細胞およびオリゴデンドロサイトからなる群より選ばれる前記モノクローナル抗体の特異的結合パートナー、
    C. その他の試薬、及び
    D. キットの使用のための指示書、
    を含み、
    前記モノクローナル抗体又は前記特異的結合パートナーが検出可能に標識されていることを特徴とする、真核生物細胞サンプル中の請求項１または２記載のモノクローナル抗体の存在を証明するための試験キット。
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