TW201841942A - 抗ｃｄ１３７抗體及其使用方法 - Google Patents

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班傑明 莫林
馬克 菲德斯
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馬克 德克
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美商艾吉納斯公司
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Abstract

本揭示案提供特異性結合於CD137(例如人類CD137)且增加CD137功能之抗體。亦提供包含此等抗體之醫藥組合物、編碼此等抗體之核酸、用於製造此等抗體之表現載體及宿主細胞以及使用此等抗體治療受試者之方法。

Description

抗ＣＤ１３７抗體及其使用方法
本揭示案係關於特異性結合於CD137(例如人類CD137)之抗體及使用該等抗體之方法。
CD137亦稱為TNFRSF9或4-1BB，其為腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族中之跨膜蛋白。其具有含有富含半胱胺酸之基元的N端細胞外域、跨膜域及含有潛在磷酸化位點之C端短細胞質域。CD137在活化CD4+ T淋巴球、活化CD8+ T淋巴球、活化自然殺手(NK)細胞、單核球、樹突狀細胞、B細胞、嗜中性白血球及肥大細胞上進行表現(Vinay等人(2011)Cellular & Molecular Immunology 8：281-84)。CD137L亦稱為TNFSF9或4-1BBL，其為CD137之配位體。在CD137L結合後，CD137轉導提昇細胞存活、增殖、細胞介素產生及效應功能活化之共刺激性信號。亦已展示CD137L與CD137之結合對CD8+T細胞進行共刺激的程度比對CD4+T細胞更大。
動物模型中之研究已展示，使用CD137L或促效性抗體對CD137之接合藉由提昇T細胞活性來抑制腫瘤生長(Vinay等人(2012)Mol. Cancer. Ther. 11：1062-70)。亦已展示CD137在疫苗接種後增強針對人類免疫缺陷病毒(HIV)及C型肝炎病毒(HCV)之T細胞免疫性(Munks等人(2004)Immunology 112：559-66；Arribillaga等人(2005) Vaccine 23：3493-99)。另外，已展示CD137促效劑在狼瘡、膠原蛋白誘導之關節炎及實驗性自體免疫腦脊髓炎的動物模型中改善自體免疫性。
鑒於人類CD137在調節免疫反應中之明顯作用，經設計以提昇CD137信號傳導之治療劑具有用於治療涉及免疫抑制之疾病的巨大前景。
本揭示案提供特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且增加或提昇CD137功能，例如CD137介導之免疫活化的抗體。亦提供包含此等抗體之醫藥組合物、編碼此等抗體之核酸、用於製造此等抗體之表現載體及宿主細胞以及使用此等抗體治療受試者之方法。本文所揭示之抗體尤其適用於增加針對抗原(例如腫瘤抗原或感染性疾病抗原)之T細胞活化及/或減少Treg介導之免疫抑制，且因此適用於在受試者中治療癌症或在受試者中治療或預防感染性疾病。
因此，在一個態樣中，本揭示案提供一種抗體或經分離之抗體，其包含有包含互補決定區(CDR) CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區(VH)及包含互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區(VL)，其中： 　　(a)CDRH1包含X1 X2 X3 X4 H(SEQ ID NO：82)之胺基酸序列，其中 　　X1 為G、A、D、E、L、N、Q、R、S或W； 　　X2 為Y、F、H、N、R或S； 　　X3 為Y或H；且 　　X4 為M、I、T或V； 　　(b)CDRH2包含WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列； 　　(c)CDRH3包含X1 PX2 YX3 GX4 GLX5 X6 (SEQ ID NO：83)之胺基酸序列，其中 　　X1 為E或G； 　　X2 為G、A、R或S； 　　X3 為Y、F、H或S； 　　X4 為S、A或T； 　　X5 為D或G；且 　　X6 為Y或H； 　　(d)CDRL1包含GGDDIGDKRVH(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列； 　　(e)CDRL2包含EDRYRPS(SEQ ID NO：5)之胺基酸序列；及/或 　　(f)CDRL3包含QX1 WX2 X3 X4 X5 X6 X7 PGV(SEQ ID NO：84)之胺基酸序列，其中 　　X1 為V或I； 　　X2 為D、A、E、G、H、N或Y； 　　X3 為S、A、E、F、L、P、R、T、W或Y； 　　X4 為S、A、L、M或R； 　　X5 為S、A、F、G、L、P、Q、R或T； 　　X6 為D、E、H、V或Y；且 　　X7 為H或Y。
在某些實施例中， 　　(a)CDRH1包含X1 X2 YX3 H(SEQ ID NO：85)之胺基酸序列，其中 　　X1 為G、A、D、L、R、S或W； 　　X2 為Y、F、H或N；且 　　X3 為M或V； 　　(b)CDRH3包含EPGYX1 GX2 GLDX3 (SEQ ID NO：86)之胺基酸序列，其中 　　X1 為Y或F； 　　X2 為S或T；且 　　X3 為Y或H；及/或 　　(c)CDRL3包含QVWX1 X2 X3 X4 X5 X6 PGV(SEQ ID NO：87)之胺基酸序列，其中 　　X1 為D、A、E、H、N或Y； 　　X2 為S、A、E、L、R或T； 　　X3 為S、A、L或R； 　　X4 為S、A、F、G、L、P、Q或R； 　　X5 為D、E或V；且 　　X6 為H或Y。
在某些實施例中， 　　(a)CDRH1包含GYYMH(SEQ ID NO：1)之胺基酸序列； 　　(b)CDRH3包含EPGYYGSGLDY(SEQ ID NO：3)或EPGYYGTGLDY(SEQ ID NO：59)之胺基酸序列；及/或 　　(c)CDRL3包含QVWDSSSDHPGV(SEQ ID NO：6)、QVWNSSSDHPGV(SEQ ID NO：60)、QVWDSSSDYPGV (SEQ ID NO：61)或QVWYSSPDHPGV(SEQ ID NO：62)之胺基酸序列。
在某些實施例中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5及6；1、2、59、4、5及6；1、2、3、4、5及60；1、2、3、4、5及61；或1、2、3、4、5及62中分別闡述之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗體包含有包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH。在某些實施例中，VH包含SEQ ID NO：7、63、64或65之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。在某些實施例中，VH之胺基酸序列由SEQ ID NO：7、63、64或65之胺基酸序列組成。在某些實施例中，VH之胺基酸序列由SEQ ID NO：7之胺基酸序列組成。在某些實施例中，X為麩醯胺酸(Q)。在某些實施例中，X為焦麩胺酸鹽(pE)。在某些實施例中，抗體包含有包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VL包含SEQ ID NO：8、66、67或68之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。在某些實施例中，VL之胺基酸序列由SEQ ID NO：8、66、67或68之胺基酸序列組成。在某些實施例中，VL之胺基酸序列由SEQ ID NO：8之胺基酸序列組成。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：7、63、64或65之胺基酸序列的VH。在某些實施例中，VH包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。在某些實施例中，VH之胺基酸序列由SEQ ID NO：7、63、64或65之胺基酸序列組成。在某些實施例中，VH之胺基酸序列由SEQ ID NO：7之胺基酸序列組成。在某些實施例中，X為麩醯胺酸(Q)。在某些實施例中，X為焦麩胺酸鹽(pE)。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：8、66、67或68之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VL包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。在某些實施例中，VL之胺基酸序列由SEQ ID NO：8、66、67或68之胺基酸序列組成。在某些實施例中，VL之胺基酸序列由SEQ ID NO：8之胺基酸序列組成。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有分別包含SEQ ID NO：7及8；63及8；64及66；7及67；或65及68之胺基酸序列的VH及VL。在某些實施例中，VH及VL之胺基酸序列分別由SEQ ID NO：7及8；63及8；64及66；7及67；或65及68之胺基酸序列組成。在某些實施例中，SEQ ID NO：7、63、64或65中之X為麩醯胺酸(Q)。在某些實施例中，SEQ ID NO：7、63、64或65中之X為焦麩胺酸鹽(pE)。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含胺基酸序列來源於人類IGHV1-2*02生殖系序列之VH。在某些實施例中，VH包含SEQ ID NO：3或59中所闡述之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含胺基酸序列來源於人類IGLV3-21*02生殖系序列之VL。在某些實施例中，VL包含SEQ ID NO：6、60、61或62中所闡述之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含胺基酸序列來源於人類IGHV1-2*02生殖系序列之VH及胺基酸序列來源於人類IGLV3-21*02生殖系序列之VL。在某些實施例中，VH包含SEQ ID NO：3中所闡述之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO：6、60、61或62中所闡述之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗體包含選自由以下組成之群的重鏈恆定區：人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
在某些實施例中，抗體包含IgG1重鏈恆定區。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈恆定區。在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，IgG1重鏈恆定區之胺基酸序列包含N297A突變。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈恆定區。在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，IgG1重鏈恆定區之胺基酸序列包含S267E及L328F突變。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的重鏈恆定區。
在某些實施例中，抗體包含IgG2重鏈恆定區。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈恆定區。在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，IgG2重鏈恆定區之胺基酸序列包含N297A突變。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈恆定區。
在某些實施例中，抗體包含IgG4重鏈恆定區。在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，IgG4重鏈恆定區之胺基酸序列包含S228P突變。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的重鏈恆定區。
在某些實施例中，抗體包含本身為野生型重鏈恆定區之變異體的重鏈恆定區，其中該變異型重鏈恆定區與FcγR結合之親和力比該野生型重鏈恆定區與該FcγR結合之親和力更高。在某些實施例中，FcγR為FcγRIIB。
在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含：(a)包含選自由SEQ ID NO：9-14、49-54及73-78組成之群之胺基酸序列的重鏈；及/或(b)包含SEQ ID NO：21及79-81之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，重鏈及輕鏈分別包含SEQ ID NO：9及21；10及21；11及21；12及21；13及21；14及21；49及21；50及21；51及21；52及21；53及21；54及21；73及21；74及21；75及79；76及79；9及80；49及80；77及81；或78及81之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈及輕鏈分別包含SEQ ID NO：9及21；或49及21之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9及21；10及21；11及21；12及21；13及21；14及21；49及21；50及21；51及21；52及21；53及21；54及21；73及21；74及21；75及79；76及79；9及80；49及80；77及81；或78及81之胺基酸序列組成。在某些實施例中，重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9及21；或49及21之胺基酸序列組成。在某些實施例中，X為麩醯胺酸(Q)。在某些實施例中，X為焦麩胺酸鹽(pE)。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其中該抗體與該CD137之結合使在該CD137與第二人類CD137分子之間二聚化的水準相對於在無該抗體存在下二聚化之水準增加。在某些實施例中，抗體與CD137之結合使在兩個CD137分子之PLAD結構域之間成對結合的水準相對於在無該抗體存在下兩個CD137分子之PLAD結構域之間成對結合的水準增加。在某些實施例中，抗體與CD137之結合使在CD137分子之第一區與第二人類CD137分子之第二區之間成對結合的水準相對於在無該抗體存在下在該第一區與該第二區之間成對結合的水準增加，其中該第一區及/或該第二區包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其中該抗體與該CD137之結合使CD137多聚化(例如二聚化)之水準相對於在無該抗體存在下CD137多聚化(例如二聚化)之水準增加。在某些實施例中，CD137多聚化(例如二聚化)之水準增加包含在兩個CD137分子之PLAD結構域之間成對結合的水準增加。在某些實施例中，CD137多聚化(例如二聚化)之水準增加包含在第一CD137分子之第一區與第二分子之第二區之間成對結合的水準增加，其中該第一區及/或第二區包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗體為多價抗體且能夠同時結合於兩個或超過兩個CD137分子。
在某些實施例中，本文所揭示之抗體基本上不抑制人類CD137與人類CD137L結合。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於人類CD137且基本上不抑制人類CD137與人類CD137L結合的經分離之抗體。
在某些實施例中，抗體基本上不抑制人類CD137之可溶性片段與人類CD137L之可溶性片段結合。在某些實施例中，抗體基本上不抑制表現CD137之細胞與人類CD137L之可溶性片段結合。在某些實施例中，抗體基本上不抑制表現CD137之細胞與表現CD137L之細胞結合。
在某些實施例中，抗體不抑制人類CD137之可溶性片段與人類CD137L之可溶性片段結合。在某些實施例中，抗體不抑制表現CD137之細胞與人類CD137L之可溶性片段結合。在某些實施例中，抗體不抑制表現CD137之細胞與表現CD137L之細胞結合。
在某些實施例中，本文所揭示之抗體對人類CD137具有促效性。在某些實施例中，抗體增加或提昇人類CD137之活性。在某些實施例中，抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力依賴於該抗體之交聯。在某些實施例中，在無交聯存在下，抗體基本上不增加或提昇人類CD137之活性。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137)且增加或提昇人類CD137之活性的經分離之抗體，其中該抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力依賴於該抗體之交聯。在某些實施例中，在無交聯存在下，抗體基本上不增加或提昇人類CD137之活性。
在某些實施例中，抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力依賴於CD137L之存在。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137)且增加或提昇人類CD137之活性的經分離之抗體，其中該抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力依賴於CD137L之存在。
在某些實施例中，抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力與CD137L之濃度正相關。在某些實施例中，抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力為CD137L之濃度的基本上遞增函數。在某些實施例中，在無CD137L存在下，抗體基本上不增加或提昇人類CD137之活性。在某些實施例中，在無CD137L存在下，抗體不增加或提昇人類CD137之活性。
在某些實施例中，人類CD137之活性包含使表現人類CD137之T細胞活化。在某些實施例中，人類CD137之活性包含誘導由用葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之外周血液單核細胞(PBMC)進行的IL-2產生。在某些實施例中，人類CD137之活性包含使表現人類CD137之自然殺手(NK)細胞活化。在某些實施例中，人類CD137之活性包含使表現CD137L之抗原呈遞細胞(APC)活化。
在某些實施例中，抗體與包含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之VL的抗體結合於人類CD137之相同抗原決定基。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，其中該抗體與包含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之VL的抗體結合於人類CD137之相同抗原決定基。在某些實施例中，抗體結合於位於人類CD137之CRD4結構域內的抗原決定基。在某些實施例中，人類CD137之CRD4結構域包含SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列。
在某些實施例中，本文所揭示之抗體結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：26-31及43中之任一者之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在某些實施例中，抗體結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：43之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，其中該抗體結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：26-31及43中之任一者之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在某些實施例中，抗體結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：43之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。
在某些實施例中，抗體基本上不結合於包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的蛋白質。在某些實施例中，抗體特異性結合於包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的蛋白質。在某些實施例中，抗體特異性結合於包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的蛋白質，且基本上不結合於包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的蛋白質。在某些實施例中，抗體基本上不結合於由SEQ ID NO：45之胺基酸序列組成或主要由該胺基酸序列組成的蛋白質。在某些實施例中，抗體特異性結合於由SEQ ID NO：46之胺基酸序列組成或主要由該胺基酸序列組成的蛋白質。在某些實施例中，抗體特異性結合於由SEQ ID NO：46之胺基酸序列組成或主要由該胺基酸序列組成的蛋白質，且基本上不結合於由SEQ ID NO：45之胺基酸序列組成或主要由該胺基酸序列組成的蛋白質。
在某些實施例中，抗體包含VH及VL，其中：(a)包含該VH及該VL中之每一者各兩個的F(ab')2結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：27之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基；及/或(b)包含該VH及該VL之Fab結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：26之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基，且視情況結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：28或29之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。
在某些實施例中，抗體包含VH及VL，其中：(a)若該抗體形成為包含該VH及該VL中之每一者各兩個的F(ab')2 ，則該F(ab')2 結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：27之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基；及/或(b)若該抗體形成為包含該VH及該VL之Fab，則該Fab結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：26之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基，且視情況結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：28或29之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。
在某些實施例中，抗體包含VH及VL，其中：(a)如藉由氫/氘交換分析所量測，包含該VH及該VL中之每一者各兩個的F(ab')2 使在CD137中由SEQ ID NO：34之胺基酸序列組成之區中的氫變為氘之交換相對於在無該F(ab')2 存在下在同一區中的氫變為氘之交換顯著減少；及(b)如藉由氫/氘交換分析所量測，包含該VH及該VL之Fab基本上不使在CD137中由SEQ ID NO：34之胺基酸序列組成之區中的氫變為氘之交換相對於在無該Fab存在下在同一區中的氫變為氘之交換減少。
在某些實施例中，抗體包含VH及VL，其中：(a)若該抗體形成化為包含該VH及該VL中之每一者各兩個的F(ab')2 ，則如藉由氫/氘交換分析所量測，該F(ab')2 使在CD137中由SEQ ID NO：34之胺基酸序列組成之區中的氫變為氘之交換相對於在無該F(ab')2 存在下在同一區中的氫變為氘之交換顯著減少；及(b)若該抗體形成化為包含該VH及該VL之Fab，則如藉由氫/氘交換分析所量測，該Fab基本上不使在CD137中由SEQ ID NO：34之胺基酸序列組成之區中的氫變為氘之交換相對於在無該Fab存在下在同一區中的氫變為氘之交換減少。
在某些實施例中，抗體特異性結合於包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的蛋白質，抗體不特異性結合於包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，其中該抗體特異性結合於包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的蛋白質；且該抗體不特異性結合於包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質。
在某些實施例中，本文所揭示之抗體為人類抗體。在某些實施例中，本文所揭示之抗體為多特異性抗體。
在某些實施例中，本文所揭示之抗體與細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、毒素、放射性核種或可偵測標記綴合。在某些實施例中，抗體與第二抗體綴合。
在另一態樣中，本揭示案提供一種編碼如本文所揭示之抗體之VH及/或VL或重鏈及/或輕鏈的經分離之多核苷酸。在另一態樣中，本揭示案提供一種包含如本文所揭示之多核苷酸的載體。在另一態樣中，本揭示案提供一種包含如本文所揭示之多核苷酸或載體的重組宿主細胞。
在另一態樣中，本揭示案提供一種醫藥組合物，其包含如本文所揭示之抗體、多核苷酸、載體或宿主細胞；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
在另一態樣中，本揭示案提供一種產生特異性結合於人類CD137之抗體的方法，該方法包含在適合之條件下培養如本文所揭示之宿主細胞以表現多核苷酸且產生抗體。
在另一態樣中，本揭示案提供一種在受試者中增加免疫反應之方法，該方法包含向該受試者投與有效量的如本文所揭示之抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或醫藥組合物。
在另一態樣中，本揭示案提供一種在受試者中響應於抗原而增加T細胞活化及/或NK細胞活化之方法，該方法包含向該受試者投與有效量的如本文所揭示之抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或醫藥組合物。
在另一態樣中，本揭示案提供一種在受試者中治療癌症之方法，該方法包含向該受試者投與有效量的如本文所揭示之抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或醫藥組合物。
在某些實施例中，全身性地投與該抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或醫藥組合物。在某些實施例中，靜脈內投與該抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或醫藥組合物。在某些實施例中，皮下、瘤內投與該抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或醫藥組合物，或將其遞送至腫瘤引流淋巴結。
在某些實施例中，本文所揭示的在受試者中增加免疫反應之方法、在受試者中響應於抗原而增加T細胞活化及/或NK細胞活化之方法或在受試者中治療癌症之方法進一步包含向該受試者投與一種額外治療劑。在某些實施例中，額外治療劑為化學治療劑。在某些實施例中，額外治療劑為檢查點靶向劑。在某些實施例中，檢查點靶向劑係選自由以下組成之群：拮抗性抗PD-1抗體、拮抗性抗PD-L1抗體、拮抗性抗PD-L2抗體、拮抗性抗CTLA-4抗體、拮抗性抗TIM-3抗體、拮抗性抗LAG-3抗體、拮抗性抗VISTA抗體、拮抗性抗CD96抗體、拮抗性抗CEACAM1抗體、拮抗性抗TIGIT抗體、促效性抗GITR抗體及促效性抗OX40抗體。在某些實施例中，額外治療劑為抗PD-1抗體，視情況其中該抗PD-1抗體為派立珠單抗(pembrolizumab)或納武單抗(nivolumab)。在某些實施例中，額外治療劑為吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)之抑制劑。在某些實施例中，抑制劑係選自由以下組成之群：艾帕斯塔(epacadostat)、F001287、因多莫得(indoximod)及NLG919。在某些實施例中，額外治療劑為疫苗。在某些實施例中，疫苗包含有包含熱休克蛋白與抗原肽複合的熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)。在某些實施例中，熱休克蛋白為hsc70且與腫瘤相關抗原肽複合。在某些實施例中，熱休克蛋白為gp96蛋白質且與腫瘤相關抗原肽複合，其中HSPPC來源於自受試者獲得之腫瘤。
在另一態樣中，本揭示案提供一種在受試者中治療感染性疾病之方法，該方法包含向該受試者投與有效量的如本文所揭示之抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或醫藥組合物。
本揭示案提供特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且增加或提昇CD137功能，例如CD137介導之免疫活化的抗體。亦提供包含此等抗體之醫藥組合物、編碼此等抗體之核酸、用於製造此等抗體之表現載體及宿主細胞以及使用此等抗體治療受試者之方法。本文所揭示之抗體尤其適用於響應於抗原(例如腫瘤抗原或感染性疾病抗原)而增加T細胞活化，且因此適用於在受試者中治療癌症或在受試者中治療或預防感染性疾病。本文所描述的「經分離之抗體」的所有例子另外作為可但不必經分離之抗體涵蓋。本文所描述的「經分離之多核苷酸」的所有例子另外作為可但不必經分離之多核苷酸涵蓋。本文所描述之「抗體」的所有例子另外作為可但不必經分離之抗體涵蓋。本文所描述之「多核苷酸」的所有例子另外作為可但不必經分離之多核苷酸涵蓋。1.1 定義
如本文所用，當用於修飾數值或數值範圍時，術語「約」及「大致」指示比該值或範圍高5%至10%(例如高至多5%至10%)及低5%至10%(例如低至多5%至10%)之偏差保持在所敍述之值或範圍的預期含義內。
如本文所用，術語「CD137」係指在人類中由TNFRSF9基因編碼之TNF受體超家族成員9(亦稱為4-1BB)。如本文所用，術語「人類CD137」係指由野生型人類CD137基因(例如GenBank™寄存編號NM_001561.5)編碼之CD137蛋白質或此類蛋白質之細胞外域。不成熟人類CD137蛋白質之例示性胺基酸序列以SEQ ID NO：25形式提供。成熟人類CD137蛋白質之例示性胺基酸序列以SEQ ID NO：33形式提供。成熟人類CD137蛋白質之細胞外域的例示性胺基酸序列以SEQ ID NO：24形式提供。
如本文所用，術語「抗體」包括全長抗體、全長抗體之抗原結合片段以及包含抗體CDR、VH區及/或VL區之分子。抗體之實例包括(但不限於)單株抗體、以重組方式產生之抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、胞內抗體、異綴合抗體、抗體-藥物綴合物、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)、駱駝化抗體、親和抗體、Fab片段、F(ab')2 片段、二硫鍵連接之Fv(sdFv)、抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如抗抗Id抗體)以及以上中之任一者的抗原結合片段。在某些實施例中，本文所描述之抗體係指多株抗體群體。抗體可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何類別(例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 或IgA2 )或任何子類別(例如IgG2a 或IgG2b )之免疫球蛋白分子。在某些實施例中，本文所描述之抗體為IgG抗體或其類別(例如人類IgG1 或IgG4 )或子類別。在一個具體實施例中，抗體為人類化單株抗體。在另一個具體實施例中，抗體為人類單株抗體。
如本文所用，術語「VH區」及「VL區」分別係指單個抗體重鏈及輕鏈可變區，包含FR(構架區)1、2、3及4以及CDR(互補決定區)1、2及3(參見Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest (NIH出版物第91-3242號, Bethesda)，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。
如本文所用，術語「CDR」或「互補決定區」意謂在重鏈及輕鏈多肽兩者之可變區內發現的非相鄰抗原組合位點。此等特定區已由Kabat等人, J. Biol. Chem. 252, 6609-6616(1977)及Kabat等人, Sequences of protein of immunological interest.(1991)，由Chothia等人, J. Mol. Biol. 196：901-917(1987)及由MacCallum等人, J. Mol. Biol. 262：732-745(1996)描述，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中，其中定義包括對照彼此比較時的胺基酸殘基之重疊或子組。在某些實施例中，術語「CDR」為如由MacCallum等人, J. Mol. Biol. 262：732-745(1996)及Martin A. 「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains」,Antibody Engineering , Kontermann及Dübel編, 第31章, 第422-439頁, Springer-Verlag, Berlin(2001)所定義之CDR。在某些實施例中，術語「CDR」為如由Kabat等人, J. Biol. Chem. 252, 6609-6616(1977)及Kabat等人, Sequences of protein of immunological interest.(1991)所定義之CDR。在某些實施例中，抗體之重鏈CDR及輕鏈CDR使用不同規約來加以定義。舉例而言，在某些實施例中重鏈CDR根據MacCallum (同前文獻)來加以定義，而輕鏈CDR根據Kabat(同前文獻)來加以定義。CDRH1、CDRH2及CDRH3指示重鏈CDR，而CDRL1、CDRL2及CDRL3指示輕鏈CDR。
如本文所用，術語「構架(FR)胺基酸殘基」係指免疫球蛋白鏈構架區中之彼等胺基酸。如本文所用之術語「構架區」或「FR」包括本身為可變區之一部分但不為CDR(例如使用Kabat或MacCallum之CDR定義)之一部分的胺基酸殘基。
如本文所用，術語「可變區」及「可變域」可互換地使用且在此項技術中具有共性。可變區通常係指抗體之一部分，一般係指輕鏈或重鏈之一部分，通常係指成熟重鏈中胺基端約110至120個胺基酸或110至125個胺基酸以及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸，其序列在抗體間廣泛不同且用於特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。序列中之可變性集中於稱為互補決定區(CDR)之彼等區中，而可變域中更高度保守之區稱為構架區(FR)。在不希望受任何特定機制或理論束縛的情況下，咸信輕鏈及重鏈之CDR為引起抗體與抗原之相互作用及特異性的主要原因。在某些實施例中，可變區為人類可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒類或鼠類CDR及人類構架區(FR)。在特定實施例中，可變區為靈長類(例如非人類靈長類)可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒類或鼠類CDR及靈長類(例如非人類靈長類)構架區(FR)。
術語「VL」及「VL域」可互換地用於指抗體之輕鏈可變區。
術語「VH」及「VH域」可互換地用於指抗體之重鏈可變區。
如本文所用，術語「恆定區」及「恆定域」為可互換的且在此項技術中具有共性。恆定區為抗體部分，例如輕鏈及/或重鏈之羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原之結合但可展現各種效應功能，諸如與Fc受體(例如Fcγ受體)相互作用。免疫球蛋白分子之恆定區之胺基酸序列一般比免疫球蛋白可變域更保守。
如本文所用，當參照抗體使用時，術語「重鏈」可指任何獨特類型，例如基於恆定域之胺基酸序列的α、δ、ε、γ及μ，其分別得到IgA、IgD、IgE、IgG及IgM類別之抗體，包括IgG之子類別，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 及IgG4 。
如本文所用，當參照抗體使用時，術語「輕鏈」可指任何獨特類型，例如基於恆定域之胺基酸序列的κ或λ。輕鏈胺基酸序列為此項技術中熟知的。在具體實施例中，輕鏈為人類輕鏈。
如本文所用，術語「EU編號系統」係指用於抗體之恆定區的EU編號規約，如Edelman, G.M.等人, Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85(1969)及Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services, 第5版, 1991中所描述，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。
「結合親和力」一般係指在分子(例如抗體)之單個結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用的總和強度。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗體與抗原)之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(KD )表示。親和力可以此項技術中已知之多種方式加以量測及/或表達，包括(但不限於)平衡解離常數(KD )及平衡締合常數(KA )。KD 由k離 /k合 之商計算，而KA 由k合 /k離 之商計算。k合 係指例如抗體與抗原之結合速率常數，而k離 係指例如抗體與抗原之解離速率常數。k合 及k離 可藉由一般熟習此項技術者已知之技術，諸如BIAcore® 或KinExA來加以測定。如本文所用，「較低親和力」係指較大KD 。
如本文所用，術語「特異性結合」、「特異性識別」、「免疫特異性結合」及「免疫特異性識別」在抗體之情形下為類似術語，且係指分子以由熟習此項技術者所理解之結合的方式結合於抗原(例如抗原決定基或免疫複合體)。舉例而言，如藉由例如免疫分析、BIAcore® 、KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments，Boise，ID)或此項技術中已知之其他分析所測定，特異性結合於抗原之分子可一般以較低親和力結合於其他肽或多肽。在一個具體實施例中，特異性結合於抗原之分子結合於該抗原之KA 的對數(例如以10為係數之對數)為該分子非特異性結合於另一種抗原時之KA 的對數的至少2、2.5、3、4或大於4倍。
在另一個具體實施例中，特異性結合於抗原之分子在類似結合條件下不與其他蛋白質交叉反應。在另一個具體實施例中，特異性結合於CD137之分子不與其他非CD137蛋白質交叉反應。在一個具體實施例中，本發明提供一種抗體，其與CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)結合之親和力比與另一種無關抗原結合之親和力更高。在某些實施例中，本發明提供一種抗體，如藉由例如放射免疫分析、表面電漿子共振或動力學排除分析所量測，該抗體與CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)結合之親和力比與另一種無關抗原結合之親和力高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或高於95%。在一個具體實施例中，如藉由例如放射免疫分析所量測，本文所描述之抗CD137抗體與無關非CD137蛋白質結合之程度為該抗體與CD137蛋白質結合之程度的小於10%、15%或20%。
如本文所用，A「基本上不抑制」B意謂，B在A存在下相對於B在無A存在下減少不超過1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%或30%。
如本文所用，若在指定A值範圍內，例如在給定實驗中或在使用來自多個實驗之平均值的情況下，B隨A增加而顯著增加，則B在該指定範圍內為A之「顯著遞增函數」。此定義允許對應於指定A值之B值比對應於任何A下限值之B值低至多1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%或20%。
如本文所用，「抗原決定基」為此項技術中之術語且係指抗原中抗體可特異性結合之局部區。抗原決定基可為例如多肽之相鄰胺基酸(線性或相鄰抗原決定基)，或抗原決定基可例如由一或多個多肽之兩個或超過兩個非相鄰區聚集在一起得到(構形、非線性、不連續或非相鄰抗原決定基)。在某些實施例中，抗體結合之抗原決定基可藉由例如以下來加以確定：NMR光譜法、X射線繞射晶體學研究、ELISA分析、氫/氘交換與質譜(例如液相層析電噴霧質譜)聯合、基於陣列之寡肽掃描分析(例如使用CLIPS(肽與骨架之化學鍵)約束肽以定位不連續或構形抗原決定基)及/或突變誘發定位(例如定點突變誘發定位)。對於X射線晶體學，結晶可使用此項技術中已知之任何方法來實現(例如Giegé R等人,(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(第4部分)：339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189：1-23；Chayen NE(1997) Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中)。抗體：抗原晶體可使用熟知X射線繞射技術來加以研究，且可使用電腦軟體來加以優化，諸如X-PLOR(耶魯大學(Yale University), 1992, 由Molecular Simulations, Inc.分銷；參見例如Meth Enzymol(1985)第114 & 115卷, Wyckoff HW等人編；U.S. 2004/0014194)及BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(第1部分)：37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A：361-423, Carter CW編；Roversi P等人,(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(第10部分)：1316-1323)，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。突變誘發定位研究可使用熟習此項技術者已知之任何方法來實現。關於突變誘發技術之描述，包括丙胺酸掃描突變誘發技術，參見例如Champe M等人,(1995)J Biol Chem 270：1388-1394及Cunningham BC & Wells JA(1989)Science 244：1081-1085，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。CLIPS(肽與骨架之化學鍵)為以結構上受約束之組態呈遞一或多個肽以表現為複雜蛋白域之功能模擬物的技術。參見例如美國公開案第US 2008/0139407 A1號及第US 2007/099240 A1號以及美國專利第7,972,993號，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。在一個具體實施例中，抗體之抗原決定基使用丙胺酸掃描突變誘發研究來加以確定。在一個具體實施例中，抗體之抗原決定基使用氫/氘交換與質譜聯合來加以確定。在一個具體實施例中，抗體之抗原決定基使用來自Pepscan Therapeutics之CLIPS抗原決定基定位技術來加以確定。在一個具體實施例中，抗體之抗原決定基藉由蛋白質突變誘發來加以確定，例如藉由產生抗原中直系同源物之部分來自另一種物種的抗原交換突變體，且隨後測試該交換突變體中抗體結合之損失(例如，如本文所描述，藉由基於FACS之細胞結合分析)來加以確定。
如本文所用，術語「位於」人類CD137之區「內的抗原決定基」係指包含指定區中之一或多個胺基酸殘基的抗原決定基。在某些實施例中，抗原決定基包含位於指定區內之每一個胺基酸殘基。在某些實施例中，抗原決定基由位於指定區內之每一個胺基酸殘基組成。在某些實施例中，人類CD137中處於指定區外之一或多個額外胺基酸殘基與位於該指定區內之抗原決定基一起結合於抗體。
如本文所用，術語「T細胞受體」及「TCR」可互換地使用且係指全長異二聚αβ或γδ TCR、全長TCR之抗原結合片段及包含TCR CDR或可變區之分子。TCR之實例包括(但不限於)全長TCR、全長TCR之抗原結合片段、不具有跨膜及細胞質區之可溶性TCR、含有由柔性連接子附接之TCR可變區的單鏈TCR、藉由經工程改造之二硫鍵連接的TCR鏈、單特異性TCR、多特異性TCR(包含雙特異性TCR)、TCR融合體、人類TCR、人類化TCR、嵌合TCR、以重組方式產生之TCR及合成TCR。術語涵蓋野生型TCR及經基因工程改造之TCR(例如，包含嵌合TCR鏈之嵌合TCR，該嵌合TCR鏈包括來自第一物種之TCR的第一部分及來自第二物種之TCR的第二部分)。
如本文所用，術語「CD137多聚化之水準」係指在CD137分子群體(例如在一或多個細胞之表面上表現的CD137分子群體)中，多聚(例如二聚)CD137與單體CD137相比之相對量。
如本文所用，術語「主要組織相容性複合體」及「MHC」可互換地使用且係指MHC I類分子及/或MHC II類分子。
如本文所用，術語「肽-MHC複合物」係指在MHC之此項技術中公認之肽結合袋中結合有肽的MHC分子(MHC I類或MHC II類)。
如本文所用，術語「治療(treat/treating /treatment)」係指本文所描述之治療或預防性措施。「治療」方法採用向患有疾病或病症或傾向於患有此類疾病或病症之受試者投與抗體以便預防、治癒、延遲疾病或病症或復發性疾病或病症、減輕其嚴重程度或改善其一或多種症狀，或以便使受試者之存活期延長超出在無此類治療存在下預期之存活期。
如本文所用，在向受試者投與療法之情形下，術語「有效量」係指達成所要預防或治療作用的療法之量。
如本文所用，術語「受試者」包括任何人類或非人類動物。在一個實施例中，受試者為人類或非人類哺乳動物。在一個實施例中，受試者為人類。
確定兩個序列(例如胺基酸序列或核酸序列)之間的「一致性百分比」可使用數學演算法來實現。用於比較兩個序列之數學演算法的一個具體非限制性實例為Karlin S & Altschul SF(1990)PNAS 87：2264-2268之演算法，如在Karlin S & Altschul SF(1993)PNAS 90：5873-5877中所修改，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。將此類演算法併入至Altschul SF等人,(1990)J Mol Biol 215：403之NBLAST及XBLAST程式中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。可用NBLAST核苷酸程式參數設定(例如對於評分=100，字長=12)進行BLAST核苷酸檢索，以獲得與本文所描述之核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程式參數設定(例如對評分50，字長=3)進行BLAST蛋白質檢索，以獲得與本文所描述之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了出於比較目的獲得間隙比對，可如Altschul SF等人,(1997)Nuc Acids Res 25：3389-3402中所描述利用間隙式BLAST(Gapped BLAST)，該文獻以全文引用之方式併入本文中。或者，PSI BLAST可用於進行迭代檢索，其偵測分子間之遠距離關係(Id. )。當利用BLAST、間隙式BLAST及PSI Blast程式時，可使用相應程式(例如XBLAST及NBLAST)之默認參數(參見例如，全球資訊網上之國家生物技術資訊中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用於比較序列之數學演算法的另一個具體非限制性實例為Myers及Miller, 1988, CABIOS 4：11-17之演算法，該文獻以全文引用之方式併入本文中。將此類演算法併入於ALIGN程式(2.0版)中，該ALIGN程式為GCG序列比對軟體套件之一部分。當利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120權重殘基表、空隙長度罰分12及空隙罰分4。
兩個序列之間的一致性百分比可在允許有空隙或不允許有空隙的情況下，使用與上文所描述類似的技術來確定。在計算一致性百分比時，通常僅對精確匹配進行計數。1.2 抗 CD137 抗體
在一個態樣中，本揭示案提供特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且增加或提昇CD137功能之抗體。例示性抗體之胺基酸序列闡述於本文表1中。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含本文表1中所闡述之VH域之CDR中之一者、兩者或全部三者的VH域。在某些實施例中，抗體包含表1中所闡述之VH域中之一者的CDRH1。在某些實施例中，抗體包含表1中所闡述之VH域中之一者的CDRH2。在某些實施例中，抗體包含表1中所闡述之VH域中之一者的CDRH3。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含本文表1中所揭示之VL域之CDR中之一者、兩者或全部三者的VL域。在某些實施例中，抗體包含表1中所闡述之VL域中之一者的CDRL1。在某些實施例中，抗體包含表1中所闡述之VL域中之一者的CDRL2。在某些實施例中，抗體包含表1中所闡述之VL域中之一者的CDRL3。
在某些實施例中，抗體之CDR可根據Kabat等人, J. Biol. Chem. 252, 6609-6616(1977)及Kabat等人, Sequences of protein of immunological interest(1991)來加以確定，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，抗體之輕鏈CDR根據Kabat來加以確定，而抗體之重鏈CDR根據MacCallum(同前文獻)來加以確定。
在某些實施例中，抗體之CDR可根據Chothia編號方案來加以確定，其係指對免疫球蛋白結構環進行定位(參見例如Chothia C & Lesk AM,(1987), J Mol Biol 196：901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)J Mol Biol 273：927-948；Chothia C等人,(1992)J Mol Biol 227：799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol 215(1)：175-82；及美國專利第7,709,226號，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中)。通常，當使用Kabat編號規約時，Chothia CDRH1環存在於重鏈胺基酸26至32、33或34處，Chothia CDRH2環存在於重鏈胺基酸52至56處，且Chothia CDRH3環存在於重鏈胺基酸95至102處，而Chothia CDRL1環存在於輕鏈胺基酸24至34處，Chothia CDRL2環存在於輕鏈胺基酸50至56處，且Chothia CDRL3環存在於輕鏈胺基酸89至97處。當使用Kabat編號規約加以編號時，視環的長度而定，Chothia CDRH1環末端在H32與H34之間變化(此係因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B；若既不存在35A，亦不存在35B，則環末端位於32；若僅存在35A，則環末端位於33；若35A及35B兩者均存在，則環末端位於34)。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含本文表1中所揭示之VH的Chothia VH CDR。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含本文表1中所揭示之VL的Chothia VL CDR。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含本文表1中所揭示之抗體的Chothia VH CDR及Chothia VL CDR。在某些實施例中，特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體包含一或多個CDR，其中Chothia及Kabat CDR具有相同胺基酸序列。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且包含Kabat CDR與Chothia CDR之組合的經分離之抗體。
在某些實施例中，抗體之CDR可根據MacCallum RM等人,(1996)J Mol Biol 262：732-745來加以確定，該文獻以全文引用之方式併入本文中。另外，參見例如Martin A. 「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains」,Antibody Engineering , Kontermann及Dübel編, 第31章, 第422-439頁, Springer-Verlag, Berlin(2001)，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中抗體之CDR可根據如Lefranc M-P,(1999)The Immunologist 7：132-136及Lefranc M-P等人,(1999)Nucleic Acids Res 27：209-212中所描述之IMGT編號系統來加以確定，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。根據IMGT編號方案，CDRH1處於位置26至35處，CDRH2處於位置51至57處，CDRH3處於位置93至102處，CDRL1處於位置27至32處，CDRL2處於位置50至52處，且CDRL3處於位置89至97處。
在某些實施例中，本揭示案提供特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且包含本文表1中所揭示之抗體之CDR的抗體，如藉由例如如Lefranc M-P(1999)同前文獻及Lefranc M-P等人,(1999)同前文獻中所描述所確定。
在某些實施例中，抗體之CDR可根據AbM編號方案來加以確定，其係指AbM高變區，該等AbM高變區表示在Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且由Oxford Molecular's AbM抗體模型化軟體(Oxford Molecular Group, Inc.)使用，其以全文引用之方式併入本文中。在一個特定實施例中，本揭示案提供特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且包含本文表1中所揭示之抗體之CDR的抗體，如藉由AbM編號方案所確定。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其中該抗體包含有包含VH之CDRH1、CDRH2及CDRH3區胺基酸序列的重鏈可變區及包含VL之CDRL1、CDRL2及CDRL3區胺基酸序列的輕鏈可變區，其中該VH及該VL之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：7及8；63及8；64及66；7及67；或65及68中，且其中各CDR根據CDR之MacCallum定義、Kabat定義、Chothia定義、Kabat定義與Chothia定義之組合、IMGT編號系統或AbM定義來加以定義。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：7中所闡述之VH域之CDRH1、CDRH2及CDRH3區胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：8中所闡述之VL域之CDRL1、CDRL2及CDRL3區胺基酸序列的輕鏈可變區，其中各CDR根據CDR之MacCallum定義、Kabat定義、Chothia定義、Kabat定義與Chothia定義之組合、IMGT編號系統或AbM定義來加以定義。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含互補決定區(CDR)CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區(VH)及包含CDR CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區(VL)，其中： 　　(a)CDRH1包含X1 X2 X3 X4 H(SEQ ID NO：82)之胺基酸序列，其中 　　X1 為G、A、D、E、L、N、Q、R、S或W； 　　X2 為Y、F、H、N、R或S； 　　X3 為Y或H；且 　　X4 為M、I、T或V； 　　(b)CDRH2包含WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列； 　　(c)CDRH3包含X1 PX2 YX3 GX4 GLX5 X6 (SEQ ID NO：83)之胺基酸序列，其中 　　X1 為E或G； 　　X2 為G、A、R或S； 　　X3 為Y、F、H或S； 　　X4 為S、A或T； 　　X5 為D或G；且 　　X6 為Y或H； 　　(d)CDRL1包含GGDDIGDKRVH(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列； 　　(e)CDRL2包含EDRYRPS(SEQ ID NO：5)之胺基酸序列；及/或 　　(f)CDRL3包含QX1 WX2 X3 X4 X5 X6 X7 PGV(SEQ ID NO：84)之胺基酸序列，其中 　　X1 為V或I； 　　X2 為D、A、E、G、H、N或Y； 　　X3 為S、A、E、F、L、P、R、T、W或Y； 　　X4 為S、A、L、M或R； 　　X5 為S、A、F、G、L、P、Q、R或T； 　　X6 為D、E、H、V或Y；且 　　X7 為H或Y。
在某些實施例中，CDRH1包含X1 X2 X3 X4 H (SEQ ID NO：82)之胺基酸序列，其中X1 為G、A、D、E、L、N、Q、R、S或W；X2 為Y、F、H、N、R或S；X3 為Y或H；且X4 為M、I、T或V。在某些實施例中，CDRH3包含X1 PX2 YX3 GX4 GLX5 X6 (SEQ ID NO：83)之胺基酸序列，其中X1 為E或G；X2 為G、A、R或S；X3 為Y、F、H或S；X4 為S、A或T；X5 為D或G；且X6 為Y或H。在某些實施例中，CDRL3包含QX1 WX2 X3 X4 X5 X6 X7 PGV(SEQ ID NO：84)之胺基酸序列，其中X1 為V或I；X2 為D、A、E、G、H、N或Y；X3 為S、A、E、F、L、P、R、T、W或Y；X4 為S、A、L、M或R；X5 為S、A、F、G、L、P、Q、R或T；X6 為D、E、H、V或Y；且X7 為H或Y。在某些實施例中， 　　(a)CDRH1包含X1 X2 X3 X4 H(SEQ ID NO：82)之胺基酸序列，其中 　　X1 為G、A、D、E、L、N、Q、R、S或W； 　　X2 為Y、F、H、N、R或S； 　　X3 為Y或H；且 　　X4 為M、I、T或V； 　　(b)CDRH2包含WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列； 　　(c)CDRH3包含X1 PX2 YX3 GX4 GLX5 X6 (SEQ ID NO：83)之胺基酸序列，其中 　　X1 為E或G； 　　X2 為G、A、R或S； 　　X3 為Y、F、H或S； 　　X4 為S、A或T； 　　X5 為D或G；且 　　X6 為Y或H； 　　(d)CDRL1包含GGDDIGDKRVH(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列； 　　(e)CDRL2包含EDRYRPS(SEQ ID NO：5)之胺基酸序列；及 　　(f)CDRL3包含QX1 WX2 X3 X4 X5 X6 X7 PGV(SEQ ID NO：84)之胺基酸序列，其中 　　X1 為V或I； 　　X2 為D、A、E、G、H、N或Y； 　　X3 為S、A、E、F、L、P、R、T、W或Y； 　　X4 為S、A、L、M或R； 　　X5 為S、A、F、G、L、P、Q、R或T； 　　X6 為D、E、H、V或Y；且 　　X7 為H或Y。
在某些實施例中， 　　(a)CDRH1包含X1 X2 YX3 H(SEQ ID NO：85)之胺基酸序列，其中 　　X1 為G、A、D、L、R、S或W； 　　X2 為Y、F、H或N；且 　　X3 為M或V； 　　(b)CDRH3包含EPGYX1 GX2 GLDX3 (SEQ ID NO：86)之胺基酸序列，其中 　　X1 為Y或F； 　　X2 為S或T；且 　　X3 為Y或H；及/或 　　(c)CDRL3包含QVWX1 X2 X3 X4 X5 X6 PGV(SEQ ID NO：87)之胺基酸序列，其中 　　X1 為D、A、E、H、N或Y； 　　X2 為S、A、E、L、R或T； 　　X3 為S、A、L或R； 　　X4 為S、A、F、G、L、P、Q或R； 　　X5 為D、E或V；且 　　X6 為H或Y。
在某些實施例中，CDRH1包含X1 X2 YX3 H (SEQ ID NO：85)之胺基酸序列，其中X1 為G、A、D、L、R、S或W；X2 為Y、F、H或N；且X3 為M或V。在某些實施例中，CDRH3包含EPGYX1 GX2 GLDX3 (SEQ ID NO：86)之胺基酸序列，其中X1 為Y或F；X2 為S或T；且X3 為Y或H。在某些實施例中，CDRL3包含QVWX1 X2 X3 X4 X5 X6 PGV(SEQ ID NO：87)之胺基酸序列，其中X1 為D、A、E、H、N或Y；X2 為S、A、E、L、R或T；X3 為S、A、L或R；X4 為S、A、F、G、L、P、Q或R；X5 為D、E或V；且X6 為H或Y。在某些實施例中， 　　(a)CDRH1包含X1 X2 YX3 H(SEQ ID NO：85)之胺基酸序列，其中 　　X1 為G、A、D、L、R、S或W； 　　X2 為Y、F、H或N；且 　　X3 為M或V； 　　(b)CDRH3包含EPGYX1 GX2 GLDX3 (SEQ ID NO：86)之胺基酸序列，其中 　　X1 為Y或F； 　　X2 為S或T；且 　　X3 為Y或H；及 　　(c)CDRL3包含QVWX1 X2 X3 X4 X5 X6 PGV(SEQ ID NO：87)之胺基酸序列，其中 　　X1 為D、A、E、H、N或Y； 　　X2 為S、A、E、L、R或T； 　　X3 為S、A、L或R； 　　X4 為S、A、F、G、L、P、Q或R； 　　X5 為D、E或V；且 　　X6 為H或Y。
在某些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。在某些實施例中，CDRH3包含SEQ ID NO：3或59之胺基酸序列。在某些實施例中，CDRL3包含SEQ ID NO：6、61、62或63之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：1、2及3；或1、2及59中分別闡述之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列的VH域。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：4、5及6；4、5及60；4、5及61；或4、5及62中分別闡述之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列的VL域。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其中該抗體包含有包含CDRH1、CDRH2及CDRH3區之重鏈可變區及包含CDRL1、CDRL2及CDRL3區之輕鏈可變區，其中該CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3區包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5及6；1、2、59、4、5及6；1、2、3、4、5及60；1、2、3、4、5及61；或1、2、3、4、5及62中分別闡述之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含： 　　(a) CDRH1包含GYYMH(SEQ ID NO：1)之胺基酸序列； 　　(b) CDRH2包含WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列； 　　(c) CDRH3包含EPGYYGSGLDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列； 　　(d) CDRL1包含GGDDIGDKRVH(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列； 　　(e) CDRL2包含EDRYRPS(SEQ ID NO：5)之胺基酸序列；及/或 　　(f) CDRL3包含QVWDSSSDHPGV(SEQ ID NO：6)之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：1、2及3中分別闡述之CDRH1、CDRH2及CDRH3胺基酸序列的VH域。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：4、5及6中分別闡述之CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列的VL域。某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其中該抗體包含有包含CDRH1、CDRH2及CDRH3區之重鏈可變區及包含CDRL1、CDRL2及CDRL3區之輕鏈可變區，其中該CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3區包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5及6中分別闡述之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其包含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其包含有包含與SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100%(例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：63、64或65之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其包含有包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其包含有包含與SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100%(例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO：66、67或68之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其包含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其包含有包含與SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100%(例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之胺基酸序列的重鏈可變區及包含與SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或100%(例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：63及8；64及66；7及67；或65及68之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其包含胺基酸序列來源於人類IGHV1-2生殖系序列(例如，來源於IGHV1-2*02，例如具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列)的重鏈可變區。選自構架1、構架2、構架3、CDRH1及CDRH2之一或多個區(例如此等區中之兩者、三者、四者或五者)可來源於人類IGHV1-2生殖系序列(例如，來源於IGHV1-2*02，例如具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列)。在一個實施例中，構架1、構架2、構架3、CDRH1及CDRH2全部來源於人類IGHV1-2生殖系序列(例如，來源於IGHV1-2*02，例如具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列)。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：3中所闡述之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其包含胺基酸序列來源於人類IGLV3-21生殖系序列(例如，來源於IGLV3-21*02，例如具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列，或來源於IGLV3-21*03)的輕鏈可變區。選自構架1、構架2、構架3、CDRL1及CDRL2之一或多個區(例如此等區中之兩者、三者、四者或五者)可來源於人類IGLV3-21生殖系序列(例如，來源於IGLV3-21*02，例如具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列，或來源於IGLV3-21*03)。在一個實施例中，構架1、構架2、構架3、CDRL1及CDRL2全部來源於人類IGLV3-21生殖系序列(例如，來源於IGLV3-21*02，例如具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列，或來源於IGLV3-21*03)。在某些實施例中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，其包含胺基酸序列來源於人類IGHV1-2生殖系序列(例如，來源於IGHV1-2*02，例如具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列)的重鏈可變區及胺基酸序列來源於人類IGLV3-21生殖系序列(例如，來源於IGLV3-21*02，例如具有SEQ ID NO：41之胺基酸序列，或來源於IGLV3-21*03)的輕鏈可變區。在某些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO：3中所闡述之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6中所闡述之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供一種經分離之抗體，其與包含SEQ ID NO：7及8中分別闡述之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體交叉競爭結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)。
在某些實施例中，本揭示案提供一種經分離之抗體，其與本文所描述之抗體，例如包含SEQ ID NO：7及8中分別闡述之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列的抗體結合於CD137之相同或重疊抗原決定基(例如人類CD137之抗原決定基或食蟹獼猴CD137之抗原決定基)。在某些實施例中，抗體之抗原決定基可藉由例如以下來加以確定：NMR光譜法、表面電漿子共振(BIAcore® )、X射線繞射晶體學研究、ELISA分析、氫/氘交換與質譜(例如液相層析電噴霧質譜)聯合、基於陣列之寡肽掃描分析及/或突變誘發定位(例如定點突變誘發定位)。對於X射線晶體學，結晶可使用此項技術中已知之任何方法來實現(例如Giegé R等人,(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(第4部分)：339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189：1-23；Chayen NE(1997)Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中)。抗體：抗原晶體可使用熟知X射線繞射技術來加以研究，且可使用電腦軟體來加以優化，諸如X-PLOR(耶魯大學(Yale University), 1992, 由Molecular Simulations, Inc.分銷；參見例如Meth Enzymol (1985)第114 & 115卷, Wyckoff HW等人編；美國專利申請案第2004/0014194號)及BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(第1部分)：37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A：361-423, Carter CW編；Roversi P等人,(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(第10部分)：1316-1323，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中)。突變誘發定位研究可使用熟習此項技術者已知之任何方法來實現。關於突變誘發技術之描述，包括丙胺酸掃描突變誘發技術，參見例如Champe M等人,(1995)同前文獻及Cunningham BC & Wells JA(1989)同前文獻。在一個具體實施例中，抗體之抗原決定基使用丙胺酸掃描突變誘發研究來加以確定。另外，識別且結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之相同或重疊抗原決定基的抗體可使用例行技術來加以鑑別，諸如免疫分析，例如藉由展示一種抗體阻斷另一種抗體與靶抗原之結合的能力，亦即競爭性結合分析。競爭結合分析亦可用於確定兩種抗體是否具有對一種抗原決定基之類似結合特異性。競爭性結合可在其中受測試免疫球蛋白抑制參考抗體與共同抗原(諸如CD137，例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之特異性結合的分析中加以確定。已知許多類型之競爭性結合分析，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見Stahli C等人,(1983)Methods Enzymol 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland TN等人,(1986)J Immunol 137：3614-9)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見Harlow E & Lane D,(1988)Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見Morel GA等人,(1988)Mol Immunol 25(1)：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Cheung RC等人,(1990)Virology 176：546-52)；及直接標記RIA(參見Moldenhauer G等人,(1990)Scand J Immunol 32：77-82)，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。通常，此類分析涉及使用結合於固體表面的經純化之抗原(例如CD137，諸如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或攜有此等抗原中之任一者的細胞、未經標記之測試免疫球蛋白及經標記之參考免疫球蛋白。可藉由測定在測試免疫球蛋白存在下結合於固體表面或細胞之標記的量來量測競爭性抑制。測試免疫球蛋白通常過量存在。通常，當競爭抗體過量存在時，其將使參考抗體與共同抗原之特異性結合抑制至少50%-55%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%或超過75%。競爭結合分析可使用經標記之抗原或經標記之抗體以大量不同形式組態。在此分析之常見型式中，將抗原固定化在96孔培養盤上。隨後使用放射性標記或酶標記來量測未經標記之抗體阻斷經標記之抗體與抗原之結合的能力。其他細節參見例如Wagener C等人,(1983)J Immunol 130：2308-2315；Wagener C等人,(1984)J Immunol Methods 68：269-274；Kuroki M等人,(1990)Cancer Res 50：4872-4879；Kuroki M等人,(1992)Immunol Invest 21：523-538；Kuroki M等人,(1992)Hybridoma 11：391-407及Antibodies：A Laboratory Manual, Ed Harlow E & Lane D編 同前文獻, 第386-389頁，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
在另一態樣中，本揭示案一種特異性結合於人類CD137的抗體或經分離之抗體，其中(a)該抗體特異性結合於包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的蛋白質且(b)該抗體不特異性結合於包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於人類CD137的抗體或經分離之抗體，其中該抗體與具有SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質特異性結合的親和力比與具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的蛋白質結合的親和力更低。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於人類CD137的抗體或經分離之抗體，其中該抗體不特異性結合於具有SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於人類CD137的抗體或經分離之抗體，其中該抗體與具有SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質之間的結合相對於該抗體與具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的蛋白質之間的結合顯著減弱。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於人類CD137的抗體或經分離之抗體，其中該抗體展現，相較於與具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的蛋白質的結合，與具有SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質的結合減低或不存在。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或經分離之抗體，其與本發明之任何抗體特異性結合於人類CD137之相同抗原決定基。在某些實施例中，抗體與具有SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質特異性結合的親和力比與具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的蛋白質結合的親和力更低。在某些實施例中，抗體不特異性結合於具有SEQ ID NO：38胺基酸序列胺基酸序列的蛋白質。在某些實施例中，抗體與具有SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質之間的結合相對於該抗體與具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的蛋白質之間的結合顯著減弱。在一個實施例中，抗體展現，相較於與具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的蛋白質的結合，與具有SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質的結合減低或不存在。
在某些實施例中，經分離之抗體結合於位於人類CD137中包含SEQ ID NO：26-31及43中之任一者之胺基酸序列之區內的抗原決定基。在某些實施例中，經分離之抗體結合於位於人類CD137中主要由SEQ ID NO：26-31及43中之任一者之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在某些實施例中，經分離之抗體結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：26-31及43中之任一者之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在某些實施例中，經分離之抗體結合於位於人類CD137中包含多種胺基酸序列之區內的不連續抗原決定基，該多種胺基酸序列中之每一者均由SEQ ID NO：26-31及43中之任一者的胺基酸序列組成，主要由該胺基酸序列組成或包含該胺基酸序列。
在某些實施例中，經分離之抗體結合於位於人類CD137中包含SEQ ID NO：26中所闡述之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，如藉由氫/氘交換分析所確定，當結合於人類CD137蛋白質或其片段時，該抗體使在由SEQ ID NO：26中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換相對於在無該抗體存在下在由SEQ ID NO：26中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換減少。在某些實施例中，氫/氘交換之減少使用氫-氘交換(HDX)，例如如本文實例中所描述來加以量測。
在某些實施例中，經分離之抗體結合於位於人類CD137中包含SEQ ID NO：27中所闡述之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，如藉由氫/氘交換分析所確定，當結合於人類CD137蛋白質或其片段時，該抗體使在由SEQ ID NO：27中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換相對於在無該抗體存在下在由SEQ ID NO：27中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換減少。在某些實施例中，氫/氘交換之減少使用氫-氘交換(HDX)，例如如本文實例中所描述來加以量測。
在某些實施例中，經分離之抗體結合於位於人類CD137中包含SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，如藉由氫/氘交換分析所確定，當結合於人類CD137蛋白質或其片段時，該抗體使在由SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換相對於在無該抗體存在下在由SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換減少。在某些實施例中，氫/氘交換之減少使用氫-氘交換(HDX)，例如如本文實例中所描述來加以量測。
在某些實施例中，經分離之抗體結合於位於人類CD137中包含SEQ ID NO：29中所闡述之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，如藉由氫/氘交換分析所確定，當結合於人類CD137蛋白質或其片段時，該抗體使在由SEQ ID NO：29中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換相對於在無該抗體存在下在由SEQ ID NO：29中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換減少。在某些實施例中，氫/氘交換之減少使用氫-氘交換(HDX)，例如如本文實例中所描述來加以量測。
在某些實施例中，經分離之抗體結合於位於人類CD137中包含SEQ ID NO：30中所闡述之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，如藉由氫/氘交換分析所確定，當結合於人類CD137蛋白質或其片段時，該抗體使在由SEQ ID NO：30中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換相對於在無該抗體存在下在由SEQ ID NO：30中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換減少。在某些實施例中，氫/氘交換之減少使用氫-氘交換(HDX)，例如如本文實例中所描述來加以量測。
在某些實施例中，經分離之抗體結合於位於人類CD137中包含SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，如藉由氫/氘交換分析所確定，當結合於人類CD137蛋白質或其片段時，該抗體使在由SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換相對於在無該抗體存在下在由SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換減少。在某些實施例中，氫/氘交換之減少使用氫-氘交換(HDX)，例如如本文實例中所描述來加以量測。
在某些實施例中，經分離之抗體結合於位於人類CD137中包含KRGI(SEQ ID NO：43)之胺基酸序列、主要由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在某些實施例中，抗體KRGI之至少一個、至少兩個或至少三個胺基酸殘基。在某些實施例中，抗體結合於KRGI之全部四個胺基酸殘基。在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體，如藉由氫/氘交換分析所確定，當結合於人類CD137蛋白質或其片段時，該抗體使在由SEQ ID NO：43中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換相對於在無該抗體存在下在由SEQ ID NO：43中所闡述之胺基酸序列組成之區中的氫/氘交換減少。在某些實施例中，氫/氘交換之減少使用氫-氘交換(HDX)，例如如本文實例中所描述來加以量測。在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合於人類CD137且基本上不結合於鼠類CD137的抗體。在某些實施例中，抗體特異性結合於包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的蛋白質，且/或基本上不結合於包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的蛋白質。在某些實施例中，抗體特異性結合於由SEQ ID NO：46之胺基酸序列組成或主要由該胺基酸序列組成的蛋白質，且/或基本上不結合於由SEQ ID NO：45之胺基酸序列組成或主要由該胺基酸序列組成的蛋白質。在某些實施例中，抗體特異性結合於由SEQ ID NO：46之胺基酸序列組成或主要由該胺基酸序列組成的蛋白質，且基本上不結合於由SEQ ID NO：45之胺基酸序列組成或主要由該胺基酸序列組成的蛋白質。
在另一態樣中，本揭示案提供一種抗體或經分離之抗體，其與本發明之抗體結合，例如特異性結合於人類CD137之相同抗原決定基。在某些實施例中，抗原決定基藉由氫-氘交換(HDX)，例如如實例中所描述，或藉由蛋白質突變誘發，例如如實例中所描述來加以確定。
在某些實施例中，抗體包含VH及VL，其中若該抗體形成為包含該VH及該VL中之每一者各兩個的F(ab')2 ，則該F(ab')2 結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：27之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在某些實施例中，抗體包含VH及VL，其中若該抗體形成為包含該VH及該VL中之每一者各兩個的F(ab')2 ，則如藉由氫/氘交換分析所量測，該F(ab')2 使在CD137中由SEQ ID NO：27之胺基酸序列組成之區中的氫變為氘之交換相對於在無該F(ab')2 存在下在同一區中的氫變為氘之交換顯著減少(例如減少至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)。
在某些實施例中，抗體包含VH及VL，其中若該抗體形成為包含該VH及該VL之Fab，則該Fab結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：26之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基，且視情況結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：28及/或29之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。在某些實施例中，抗體包含VH及VL，其中若該抗體形成化為包含該VH及該VL之Fab，則如藉由氫/氘交換分析所量測，該Fab使在CD137中由SEQ ID NO：26之胺基酸序列組成之區中的氫變為氘之交換相對於在無該Fab存在下在同一區中的氫變為氘之交換顯著減少(例如減少至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)，且視情況使在CD137中由SEQ ID NO：28及/或SEQ ID NO：29之胺基酸序列組成之區中的氫變為氘之交換相對於在無該Fab存在下在同一區中的氫變為氘之交換顯著減少(例如減少至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)。
在某些實施例中，抗體包含VH及VL，其中若該抗體形成為包含兩個鏈，各鏈包含該VH及該VL的F(ab')2 ，則如藉由氫/氘交換分析所量測，該F(ab')2 使在CD137中由SEQ ID NO：34之胺基酸序列組成之區中的氫變為氘之交換相對於在無該F(ab')2 存在下在同一區中的氫變為氘之交換顯著減少(例如減少至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)。在某些實施例中，抗體包含VH及VL，其中若該抗體形成化為包含該VH及該VL之Fab，則如藉由氫/氘交換分析所量測，該Fab基本上不使在CD137中由SEQ ID NO：34之胺基酸序列組成之區中的氫變為氘之交換相對於在無該Fab存在下在同一區中的氫變為氘之交換減少(例如減少不超過1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%或30%)。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且不抑制人類CD137與人類CD137L結合的經分離之抗體。在某些實施例中，人類CD137與人類CD137L在抗體存在下之結合相對於人類CD137與人類CD137L在無抗體存在下之結合減低不超過1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%或30%。在某些實施例中，抗體不抑制人類CD137之可溶性片段與人類CD137L之可溶性片段結合。在某些實施例中，人類CD137之可溶性片段與人類CD137L之可溶性片段在抗體存在下的結合相對於人類CD137之可溶性片段與人類CD137L之可溶性片段在無抗體存在下的結合減低不超過1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%或30%。在某些實施例中，抗體不抑制表現CD137之細胞與人類CD137L之可溶性片段結合。在某些實施例中，表現CD137之細胞與人類CD137L之可溶性片段在抗體存在下的結合相對於表現CD137之細胞與人類CD137L之可溶性片段在無抗體存在下的結合減低不超過1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%或30%。在某些實施例中，抗體不抑制表現CD137之細胞與表現CD137L之細胞結合。在某些實施例中，表現CD137之細胞與表現CD137L之細胞在抗體存在下的結合相對於表現CD137之細胞與表現CD137L之細胞在無抗體存在下的結合減低不超過1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%或30%。
在某些實施例中，本文所揭示之抗體使CD137多聚化(例如二聚化或三聚化)之水準相對於在無該抗體存在下CD137多聚化之水準增加至少約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或超過100倍。在某些實施例中，多聚CD137存在於包含CD137及CD137L分子之複合物(例如，包含三個CD137L分子及兩個CD137分子之複合物，一個包含三個CD137L分子及三個CD137分子之複合物)中。在某些實施例中，CD137多聚化(例如二聚化或三聚化)之水準在處於平衡的包含CD137及CD137L分子之活體外系統中加以量測，視情況其中該CD137分子處於脂質雙層膜中。在某些實施例中，CD137多聚化(例如二聚化或三聚化)之水準在細胞中或在細胞之質膜上加以量測。在某些實施例中，CD137多聚化(例如二聚化或三聚化)之水準使用CD137之可溶性片段來加以量測。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、73、74、75、76、77或78中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：13中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：14中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：51中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：52中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：53中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：54中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：73中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：74中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：75中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：76中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：77中所闡述之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：78中所闡述之胺基酸序列的重鏈。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：21、79、80或81中所闡述之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：79中所闡述之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：80中所闡述之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：81中所闡述之胺基酸序列的輕鏈。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、73、74、75、76、77或78之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21、79、80或81之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的輕鏈。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的輕鏈。
在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、73、74、75、76、77或78之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21、79、80或81之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：9之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：10之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：11之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：12之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：13之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：14之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：49之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：50之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：51之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：52之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：53之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：54之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：73之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：74之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：21之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：75之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：79之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：76之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：79之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：9之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：80之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：49之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：80之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：77之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：81之胺基酸序列組成的輕鏈。在某些實施例中，抗體包含由SEQ ID NO：78之胺基酸序列組成的重鏈；及由SEQ ID NO：81之胺基酸序列組成的輕鏈。
任何抗體形式均可用於本文所揭示之抗體。在某些實施例中，抗體為單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)。在某些實施例中，抗體為與Fc區融合之scFv(scFv-Fc)。在某些實施例中，抗體為Fab片段。在某些實施例中，抗體為F(ab')2 片段。
在某些實施例中，本文所揭示之抗體為特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)及第二抗原之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。
在某些實施例中，本文所揭示之抗體與特異性結合於第二抗原之第二抗體綴合。在某些實施例中，本文所揭示之抗體與第二抗體共價綴合。在某些實施例中本文所揭示之抗體與第二抗體非共價綴合。在某些實施例中，本文所揭示之抗體與第二抗體交聯。在某些實施例中，第二抗原為腫瘤相關抗原(例如，在腫瘤中過度表現之多肽、來源於腫瘤病毒之多肽、包含對腫瘤具有特異性之轉譯後修飾的多肽、在腫瘤中特異性突變之多肽)。在某些實施例中，腫瘤相關抗原為EGFR(例如人類EGFR)、Her2(例如人類Her2)或CD20(例如人類CD20)。
在某些實施例中，本文所揭示之抗體與細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、毒素、放射性核種或可偵測標記綴合。在某些實施例中，細胞毒性劑能夠誘導與其接觸之細胞的死亡或破壞。在某些實施例中，細胞生長抑制劑能夠阻止或基本上減少與其接觸之細胞的增殖及/或抑制該細胞之活性或功能。在某些實施例中，細胞毒性劑或細胞生長抑制劑為化學治療劑。在某些實施例中，放射性核種係選自由以下同位素組成之群：3 H、14 C、32 P、35 S、36 Cl、51 Cr、57 Co、58 Co、59 Fe、67 Cu、90 Y、99 Tc、111 In、117 Lu、121 I、124 I、125 I、131 I、198 Au、211 At、213 Bi、225 Ac及186 Re。在某些實施例中，可偵測標記包含螢光部分或點擊化學控點(click chemistry handle)。
任何免疫球蛋白(Ig)恆定區均可用於本文所揭示之抗體。在某些實施例中，Ig區為人類IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子，任何類別(例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 )或任何子類別(例如IgG2a 及IgG2b )之免疫球蛋白分子。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：15、16、17、18、19或20之胺基酸序列的重鏈恆定區。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，將一個、兩個或超過兩個突變(例如胺基酸取代)引入至本文所描述之抗體的Fc區(例如CH2域(人類IgG1 之殘基231-340)及/或CH3域(人類IgG1 之殘基341-447)及/或鉸鏈區中，以改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合(complement fixation)、Fc受體結合(binding)及/或抗原依賴性細胞毒性。
在某些實施例中，將一個、兩個或超過兩個突變(例如胺基酸取代)引入至Fc區(CH1域)之鉸鏈區中以使得該鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目得到改變(例如增加或減少)，如例如美國專利第5,677,425號中所描述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。可改變CH1域之鉸鏈區中的半胱胺酸殘基之數目以例如促進輕鏈與重鏈之組裝或改變(例如增加或降低)抗體之穩定性。
在一個具體實施例中，將一個、兩個或超過兩個胺基酸突變(例如取代、插入或缺失)引入至IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳為Fc或鉸鏈-Fc結構域片段)中以改變(例如減短或增加)抗體在活體內之半衰期。將改變(例如減短或增加)抗體在活體內之半衰期的突變之實例參見例如國際公開案第WO 02/060919號；第WO 98/23289號；及第WO 97/34631；以及美國專利第5,869,046號、第6,121,022號、第6,277,375號及第6,165,745號，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，將一個、兩個或超過兩個胺基酸突變(例如取代、插入或缺失)引入至IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳為Fc或鉸鏈-Fc結構域片段)中以減短抗體在活體內之半衰期。在其他實施例中，將一個、兩個或超過兩個胺基酸突變(例如取代、插入或缺失)引入至IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳為Fc或鉸鏈-Fc結構域片段)中以增加抗體在活體內之半衰期。在一個具體實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，抗體可在第二恆定(CH2)域(人類IgG1 之殘基231-340)及/或第三恆定(CH3)域(人類IgG1 之殘基341-447)中具有一或多個胺基酸突變(例如取代)。在一個具體實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，本文所描述之抗體的IgG1 之恆定區在位置252處包含甲硫胺酸(M)變為酪胺酸(Y)之取代，在位置254處包含絲胺酸(S)變為蘇胺酸(T)之取代，且在位置256處包含蘇胺酸(T)變為麩胺酸(E)之取代。參見美國專利第7,658,921號，該文獻以全文引用之方式併入本文中。已展示此類型之突變型IgG(稱為「YTE突變體」)顯示半衰期相較於野生型型式之相同抗體四倍增加(參見Dall'Acqua WF等人,(2006)J Biol Chem 281：23514-24，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，抗體包含IgG恆定域，該IgG恆定域包含一個、兩個、三個或超過三個對位置251-257、285-290、308-314、385-389及428-436處之胺基酸殘基的胺基酸取代。
在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，將一個、兩個或超過兩個突變(例如胺基酸取代)引入至本文所描述之抗體的Fc區(例如CH2域(人類IgG1 之殘基231-340)及/或CH3域(人類IgG1 之殘基341-447)及/或鉸鏈區中，以該抗體對效應細胞表面上之Fc受體(例如活化Fc受體)的親和力增加或減小。在抗體之Fc區中減小或增加抗體對Fc受體之親和力的突變及將此類突變引入至該Fc受體或其片段中的技術為熟習此項技術者已知的。可在抗體之Fc受體中進行以改變該抗體對Fc受體之親和力的突變之實例描述於例如Smith P等人,(2012)PNAS 109：6181-6186，美國專利第6,737,056號及國際公開案第WO 02/060919號；第WO 98/23289號；及第WO 97/34631號中，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，抗體包含本身為野生型重鏈恆定區之變異體的重鏈恆定區，其中該變異型重鏈恆定區與FcγRIIB結合之親和力比該野生型重鏈恆定區與FcγRIIB結合之親和力更高。在某些實施例中，變異型重鏈恆定區為變異型人類重鏈恆定區，例如變異型人類IgG1、變異型人類IgG2或變異型人類IgG4重鏈恆定區。在某些實施例中，根據EU編號系統，變異型人類IgG重鏈恆定區包含以下胺基酸突變中之一或多者：G236D、P238D、S239D、S267E、L328F及L328E。在某些實施例中，根據EU編號系統，變異型人類IgG重鏈恆定區包含選自由以下組成之群的一組胺基酸突變：S267E及L328F；P238D及L328E；P238D及選自由E233D、G237D、H268D、P271G及A330R組成之群的一或多個取代；P238D、E233D、G237D、H268D、P271G及A330R；G236D及S267E；S239D及S267E；V262E、S267E及L328F；以及V264E、S267E及L328F。在某些實施例中，FcyRIIB在選自由以下組成之群的細胞上進行表現：巨噬細胞、單核球、B細胞、樹突狀細胞、內皮細胞及活化T細胞。
在另一個實施例中，將一個、兩個或超過兩個胺基酸取代引入至IgG恆定域Fc區中以改變抗體之效應功能。舉例而言，在根據EU編號系統編號的情況下，選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之一或多個胺基酸可由不同胺基酸殘基置換，以使得抗體對效應配位體之親和力改變但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應配位體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，恆定區結構域之缺失或失活(經由點突變或其他手段)可減少Fc受體與循環抗體之結合，藉此增加腫瘤定位。對使恆定域缺失或失活且藉此增加腫瘤定位之突變的描述參見例如美國專利第5,585,097號及第8,591,886號，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，可將一或多個胺基酸取代引入至本文所描述之抗體的Fc區中以移除該Fc區上之潛在糖基化位點，其可以減少Fc受體結合(參見例如Shields RL等人,(2001)J Biol Chem 276：6591-604，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。在各種實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，可在本文所描述之抗體的恆定區中進行以下突變中之一或多者：N297A取代；N297Q取代；L235A取代及L237A取代；L234A取代及L235A取代；E233P取代；L234V取代；L235A取代；C236 缺失；P238A取代；D265A取代；S267E取代及L328F取代；A327Q取代；或P329A取代。在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，可在本文所描述之抗體的恆定區中進行選自由D265A、P329A及其組合組成之群的突變。
在一個具體實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，本文所描述之抗體包含具有N297Q或N297A胺基酸取代的IgG1 之恆定域。在一個實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，本文所描述之抗體包含具有選自由D265A、P329A及其組合組成之群之突變的IgG1 之恆定域。在另一實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，本文所描述之抗體包含具有選自由L234A、L235A及其組合組成之群之突變的IgG1 之恆定域。在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，在本文所描述之抗體的恆定區中處於對應於人類IgG1 重鏈中位置L234、L235及D265之位置處的胺基酸殘基分別不為L、L及D。此方法詳細描述於國際公開案第WO 14/108483號中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一個特定實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，對應於人類IgG1 重鏈中位置L234、L235及D265之胺基酸分別為F、E及A；或A、A及A。
在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，選自本文所描述之抗體之恆定區中胺基酸殘基329、331及322的一或多個胺基酸可由不同胺基酸殘基置換以使得該抗體之C1q結合改變及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)減小或消除。此方法進一步詳細描述於美國專利第6,194,551號(Idusogie等人)中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，改變處於本文所描述之抗體之CH2域N端區中胺基酸位置231至238內的一或多個胺基酸殘基以藉此改變該抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於國際公開案第WO 94/29351號中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，在根據EU編號系統編號的情況下，藉由在以下位置處使一或多個胺基酸突變(例如引入胺基酸取代)來修飾本文所描述之抗體的Fc區以增加該抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或增加該抗體對Fcγ受體之親和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、328、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方法進一步描述於國際公開案第WO 00/42072號中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，本文所描述之抗體包含IgG4 抗體之恆定區，且在根據EU編號系統編號的情況下，處於重鏈之胺基酸殘基228處的絲胺酸取代為脯胺酸。在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的重鏈恆定區。
在某些實施例中，可將本文所描述之恆定區突變或修飾中的任一者引入至本文所描述之具有兩個重鏈恆定區之抗體的一個或兩個重鏈恆定區中。
在列舉SEQ ID NO：7、9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、63、64、65、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78的本文所揭示之任一態樣的某些實施例中，SEQ ID NO：7、9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、63、64、65、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78中之X為麩醯胺酸(Q)。在列舉SEQ ID NO：7、9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、63、64、65、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78的本文所揭示之任一態樣的某些實施例中，SEQ ID NO：7、9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、63、64、65、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78中之X為焦麩胺酸鹽(pE)。
在某些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且充當促效劑的經分離之抗體。
在某些實施例中，本揭示案提供一種經分離之抗體，其特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且如藉由本文所描述及/或熟習此項技術者已知之方法所評定，使CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)活性相對於在無任何抗體或在具有無關抗體(例如不特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體)的情況下之CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)活性增加或提昇至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。在某些實施例中，本揭示案提供一種經分離之抗體，其特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且如藉由本文所描述及/或熟習此項技術者已知之方法所評定，使CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)活性相對於在無任何抗體或在具有無關抗體(例如不特異性結合於CD137(例如人類CD137)之抗體)的情況下之CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)活性增加或提昇至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或超過100倍。CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)活性之非限制性實例可包括CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)信號傳導、CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)與CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)配位體(例如CD137L(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或其片段及/或融合蛋白)之結合、T細胞(例如，表現人類CD137之T細胞)的活化、細胞介素產生(例如IL-2、IFN-γ及/或TNF-α)之增加、自然殺手(NK)細胞之活化、CD137L活性之增加及表現CD137L之抗原呈遞細胞(APC)的活化。在具體實施例中，如下文實例中所描述來評定CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)活性之增加。在某些實施例中，抗體在CD137之配位體(例如CD137L(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或其片段及/或融合蛋白)存在下增加或提昇CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之活性。
在某些實施例中，抗體使CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之活性活化、增加或提昇的能力視該抗體之交聯的存在而定。在某些實施例中，抗體在無抗體交聯存在下最低限度地增加或提昇CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之活性。在某些實施例中，抗體在無抗體交聯存在下基本上不增加或提昇CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之活性在一個實施例中，抗體在無抗體交聯存在下最低限度地在NF-κB報導體細胞株中誘導NF-κB信號傳導，例如如在本文所描述之實例中所量測。在一個實施例中，抗體在無抗體交聯存在下最低限度地誘導在抗CD3抗體刺激下由經純化之T細胞進行的IL-2及/或IFNγ產生，例如如在本文所描述之實例中所量測。本文所涵蓋之抗體交聯包括抗體之簇聚(clustering)。本文所用之交聯方法為此項技術中已知的。在某些實施例中，抗體藉由使該抗體之Fc區二聚化的試劑來進行交聯，例如如在本文所描述之實例中所用的抗人類IgG(Fab')2 。在某些實施例中，抗體藉由與表現與該抗體之Fc區結合的Fc受體(例如FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIIa、FcγRIIb或FcγRI)的細胞接觸來進行交聯。在某些實施例中，Fc受體在細胞表面上之團簇中進行表現。在某些實施例中，抗體所結合之抗原的配位體亦在細胞上進行表現。在某些實施例中，細胞為抗原呈遞細胞(例如巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞或B淋巴球)。
在某些實施例中，抗體使CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之活性活化、增加或提昇的能力視CD137之配位體(例如CD137L(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或其片段及/或融合蛋白)的存在而定。在某些實施例中，抗體在無CD137之配位體(例如CD137L(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或其片段及/或融合蛋白)存在下最低限度地增加或提昇CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之活性。在某些實施例中，抗體在無CD137之配位體(例如CD137L(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或其片段及/或融合蛋白)存在下基本上不增加或提昇使CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之活性。在一個實施例中，抗體最低限度地誘導在抗CD3抗體刺激下由經純化之T細胞進行的IL-2及/或IFNγ產生，例如如在本文所描述之實例中所量測。在一個實施例中，抗體最低限度地在NF-κB報導體細胞株中誘導NF-κB信號傳導，例如如在本文所描述之實例中所量測。在某些實施例中，抗體使人類CD137之活性活化、增加或提昇的能力與CD137L之濃度正相關。在某些實施例中，當抗體例如與抗人類IgG(Fab')2 以約1：1至1：10(例如約1：1、1：2、1：3、1：4、1：5或低於1：5)之交聯劑比抗體比率交聯時，觀測到CD137L依賴性。
在具體實施例中，本揭示案提供一種特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且使T細胞(例如，表現人類CD137之T細胞)活化的經分離之抗體。在某些實施例中，活化T細胞表現一或多種標記物(例如穿孔蛋白、顆粒酶A、顆粒酶B、Bcl-XL )之含量增加(例如增加至少約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍)，視情況其中該等標記物之含量可藉由流式細胞量測術來加以量測。在某些實施例中，抗體在CD137之配位體(例如CD137L(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或其片段及/或融合蛋白)存在下使T細胞(例如，表現人類CD137之T細胞)活化。在某些實施例中，抗體在無CD137之配位體(例如CD137L(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或其片段及/或融合蛋白)存在下不使T細胞(例如，表現人類CD137之T細胞)活化。
在具體實施例中，本揭示案提供一種經分離之抗體，其特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且如藉由本文所描述(參見下文實例)及/或熟習此項技術者已知之方法所評定，使細胞介素產生(例如IL-2、IFN-γ及/或TNF-α)相對於在無任何抗體或在具有無關抗體(例如不特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體)的情況下之細胞介素產生增加至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。在具體實施例中，本揭示案提供一種經分離之抗體，其特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且如藉由本文所描述(參見下文實例)及/或熟習此項技術者已知之方法所評定，使細胞介素產生(例如IL-2、IFN-γ及/或TNF-α)相對於在無任何抗體或在具有無關抗體(例如不特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體)的情況下之細胞介素產生增加至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在某些實施例中，抗體在CD137之配位體(例如CD137L(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或其片段及/或融合蛋白)存在下增加細胞介素產生(例如IL-2、IFN-γ及/或TNF-α)。在某些實施例中，在無CD137之配位體(例如CD137L(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或其片段及/或融合蛋白)存在下，抗體不使細胞介素產生(例如IL-2、IFN-γ及/或TNF-α)相對於在無任何抗體或在具有無關抗體(例如不特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體)的情況下之細胞介素產生增加超過1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%或30%。
在具體實施例中，本揭示案提供一種經分離之抗體，其特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且在單獨或與抗PD-1抗體(例如派立珠單抗或納武單抗)組合的情況下，如藉由本文所描述(參見下文實例)及/或熟習此項技術者已知之方法所評定，使在人類外周血液單核細胞(PBMC)中響應於葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之IL-2及/或IFNγ產生相對於在無任何抗體或在具有無關抗體(例如不特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體)的情況下之IL-2及/或IFNγ產生增加至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在某些實施例中，如藉由本文所描述(參見下文實例)及/或熟習此項技術者已知之方法所評定，在特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的本文所描述之抗體存在下用葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之人類外周血液單核細胞(PBMC)的IL-2及/或IFNγ產生相對於在無任何抗體或在具有無關抗體(例如不特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體)的情況下由僅用SEA刺激之PBMC進行的IL-2及/或IFNγ產生增加至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在某些實施例中，在CD137之配位體(例如CD137L(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或其片段及/或融合蛋白)存在下，抗體增加在人類PBMC中響應於SEA刺激之IL-2及/或IFNγ產生。在某些實施例中，在無CD137之配位體(例如CD137L(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或其片段及/或融合蛋白)存在下，抗體不使在PBMC中響應於SEA刺激之IL-2及/或IFNγ產生相對於在無任何抗體或在具有無關抗體(例如不特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體)的情況下之細胞介素產生增加超過1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%或30%。1.3 醫藥組合物
本文提供在生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑中包含具有所要純度的本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體的組合物(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co., Easton, PA)。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨，苄索氯銨；苯酚，丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
在一個具體實施例中，醫藥組合物在醫藥學上可接受之載劑中包含本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體，且視情況包含一或多種額外預防劑或治療劑。在一個具體實施例中，醫藥組合物在醫藥學上可接受之載劑中包含有效量的本文所描述之抗體，且視情況包含一或多種額外預防劑或治療劑。在某些實施例中，抗體為醫藥組合物中所包括之僅有的活性成分。本文所描述之醫藥組合物可適用於增加或提昇CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)活性及治療諸如癌症或感染性疾病之病況。在一個實施例中，本發明係關於包含本發明之抗CD137抗體的本發明之醫藥組合物，其用作藥劑。在另一實施例中，本發明係關於本發明之醫藥組合物，其用於一種用於治療癌症或感染性疾病之方法中。
用於非經腸製劑中的醫藥學上可接受之載劑包括水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等張劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮劑及分散劑、乳化劑、鉗合劑或螯合劑及其他醫藥學上可接受之物質。水性媒劑之實例包括氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringers Injection)、等張右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖及乳酸林格氏注射液。非水性非經腸媒劑包括植物來源之不揮發性油，棉籽油、玉米油、芝麻油及花生油。可將呈抑細菌或抑制真菌濃度之抗微生物劑添加至封裝於多劑量容器中之非經腸製劑中，該等抗微生物劑包括苯酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氯丁醇、甲基對羥基苯甲酸酯及丙基對羥基苯甲酸酯、硫柳汞、苯紮氯銨及苄索氯銨。等張劑包括氯化鈉及右旋糖。緩衝劑包含磷酸鹽及檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉劑包括鹽酸普魯卡因(procaine hydrochloride)。懸浮劑及分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮。乳化劑包括聚山梨醇酯80(TWEEN® 80)。金屬離子之鉗合劑或螯合劑包括EDTA。醫藥載劑亦包括作為與水可混溶之媒劑的乙醇、聚乙二醇及丙二醇，及用於pH調整之氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。
醫藥組合物可經調配以用於任何向受試者投藥之途徑。投藥途徑之具體實例包括鼻內、經口、肺部、透皮、皮內及非經腸。本文亦涵蓋非經腸投藥，其特徵在於皮下、肌肉內或靜脈內注射。可注射劑可呈習知形式，以液體溶液或懸浮液形式，以適用於在注射之前在液體中溶解或懸浮之固體形式或以乳液形式製備。可注射劑、溶液及乳液亦含有一或多種賦形劑。適合之賦形劑為例如水、鹽水、右旋糖、甘油(glycerol)或乙醇。此外，必要時，待投與之醫藥組合物亦可含有少量無毒輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解增強劑及其他此類試劑，諸如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯及環糊精。
用於非經腸投與抗體之製劑包括可立即用於注射之無菌溶液、在臨用之前可立即與溶劑組合的無菌無水可溶產品(諸如凍乾粉末)(包括皮下錠劑)、可立即用於注射之無菌懸浮液、在臨用之前可立即與媒劑組合的無菌無水不可溶產品、以及無菌乳液。溶液可為水溶液或非水溶液。
若靜脈內投與，則適合之載劑包括生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，及含有增稠劑及增溶劑(諸如葡萄糖、聚乙二醇及聚丙二醇及其混合物)之溶液。
如對局部及全身性投藥所描述來製備包含抗體之表面混合物。所得混合物可為溶液、懸浮液、乳液或其類似物，且可調配為乳膏、凝膠、軟膏、乳液、溶液、酏劑、洗劑、懸浮液、酊劑、糊劑、泡沫、氣霧劑、沖洗劑、噴霧劑、栓劑、繃帶、經皮貼片或適合於表面投藥之任何其他調配物。
本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體可調配為用於表面施用之氣霧劑，諸如藉由吸入來局部施用(參見例如美國專利第4,044,126號、第4,414,209號及第4,364,923號，該等文獻描述用於遞送適用於治療發炎性疾病，尤其哮喘之類固醇的氣霧劑，且以全文引用之方式併入本文中)。用於向呼吸道投與之此等調配物可單獨或與諸如乳糖之惰性載劑組合而呈用於霧化器之氣霧劑或溶液形式，或呈用於吹入之微細粉末形式。在此類情況下，調配物之粒子的直徑在一個實施例中將小於50微米，在一個實施例中小於10微米。
本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體可經調配以用於以凝膠、乳膏及洗劑形式局部或表面施用，諸如用於表面施用至皮膚及黏膜，諸如眼睛中；及經調配以用於施用至眼睛或用於腦池內或脊柱內施用。涵蓋表面投藥以用於經皮遞送以及向眼睛或黏膜投與，或用於吸入療法。亦可投與單獨或與其他醫藥學上可接受之賦形劑組合的抗體之鼻用溶液。
包括離子導入及電泳裝置之經皮貼片為熟習此項技術者熟知的，且可用以投與抗體。舉例而言，此類貼片揭示於美國專利第6,267,983號、第6,261,595號、第6,256,533號、第6,167,301號、第6,024,975號、第6,010715號、第5,985,317號、第5,983,134號、第5,948,433號及第5,860,957號中，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，包含本文所描述之抗體的醫藥組合物為凍乾粉末，其可經復原以用於以溶液、乳液及其他混合物形式投與。其亦可經復原且調配為固體或凝膠。凍乾粉末藉由將本文所描述之抗體或其醫藥學上可接受之衍生物溶解於適合之溶劑中來加以製備。在某些實施例中，凍乾粉末為無菌的。溶劑可含有改良粉末或由該粉末製備之復原溶液的穩定性或其他藥理學組分的賦形劑。可使用之賦形劑包括(但不限於)右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油(glycerin)、葡萄糖、蔗糖或其他適合之試劑。溶劑亦可含有緩衝劑，諸如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀，或熟習此項技術者已知之其他此類緩衝劑，在一個實施例中，其處於約中性pH。隨後無菌過濾溶液，繼而在熟習此項技術者已知之標準條件下凍乾，以提供所要調配物。在一個實施例中，所得溶液將分配至小瓶中用於凍乾。各小瓶將含有單劑量或多劑量之化合物。凍乾粉末可儲存在適當條件下，諸如在約4℃至室溫下。用注射用水復原此凍乾粉末得到用於非經腸投藥之調配物。對於復原，將凍乾粉末添加至無菌水或其他適合之載劑中。精確量視所選化合物而定。此類量可以憑經驗確定。
本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體及本文所提供之其他組合物亦可經調配以將其靶向至待治療之受試者的特定組織、受體或身體其他區域。許多此類靶向方法為熟習此項技術者熟知的。本文涵蓋所有此類靶向方法以用於本發明之組合物中。靶向方法之非限制性實例參見例如美國專利第6,316,652號、第6,274,552號、第6,271,359號、第6,253,872號、第6,139,865號、第6,131,570號、第6,120,751號、第6,071,495號、第6,060,082號、第6,048,736號、第6,039,975號、第6,004,534號、第5,985,307號、第5,972,366號、第5,900,252號、第5,840,674號、第5,759,542號及第5,709,874號，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。在一個具體實施例中，將本文所描述之抗體靶向至腫瘤。
待用於活體內投藥之組合物可為無菌的。此容易藉由經由例如無菌過濾膜過濾來實現。1.4 使用方法及用途
在另一態樣中，本揭示案提供一種使用本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體來治療受試者的方法。在受試者中將受益於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)功能增加之任何疾病或病症均可使用本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體來加以治療。本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137)抗體尤其適用於抑制免疫系統對腫瘤之耐受性，且因此可用作用於患有癌症之受試者的免疫療法。舉例而言，在某些實施例中，本揭示案提供一種在受試者中響應於抗原而增加T細胞活化之方法，該方法包含向該受試者投與有效量的如本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其醫藥組合物。在某些實施例中，本揭示案提供一種在受試者中治療癌症之方法，該方法包含向該受試者投與有效量的如本文所揭示之抗體或醫藥組合物。
可用本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或醫藥組合物治療的癌症包括(但不限於)實體腫瘤、血液癌症(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如多發性骨髓瘤)及轉移性病灶。在一個實施例中，癌症為實體腫瘤。實體腫瘤之實例包括惡性疾病，例如各種器官系統之肉瘤及癌瘤(例如腺癌)，諸如影響肺、乳房、卵巢、淋巴、胃腸(例如結腸)、肛門、生殖器及泌尿生殖道(例如腎、尿道上皮、膀胱細胞、前列腺)、咽、CNS(例如大腦、神經或神經膠質細胞)、頭頸部、皮膚(例如黑素瘤)及胰臟之彼等實體腫瘤，以及包括惡性疾病之腺癌，諸如結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺癌(例如非小細胞肺癌或小細胞肺癌)、小腸癌及食道癌。癌症可處於早期、中期、晚期或為轉移性癌症。
在一個實施例中，癌症係選自肺癌(例如肺腺癌或非小細胞肺癌(NSCLC)(例如，具有鱗狀及/或非鱗狀組織學之NSCLC，或NSCLC腺癌))、黑素瘤(例如晚期黑素瘤)、腎癌(例如腎細胞癌)、肝癌(例如肝細胞癌)、骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)、前列腺癌、乳癌(例如並不表現雌激素受體、孕酮受體或Her2/neu中之一者、兩者或全部的乳癌，例如三陰性乳癌)、卵巢癌、結腸直腸癌、胰臟癌、頭頸癌(例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、肛門癌、胃食道癌(例如食道鱗狀細胞癌)、間皮瘤、鼻咽癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、上皮癌、腹膜癌或淋巴組織增生性疾病(例如移植後淋巴組織增生性疾病)。在一個具體實施例中，癌症為子宮頸癌。
在一個實施例中，癌症為血液癌症，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一個實施例中，癌症為白血病，例如急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性骨髓母細胞性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓單核球性白血病(CMML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)或毛細胞白血病。在一個實施例中，癌症為淋巴瘤，例如B細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B細胞樣(ABC)彌漫性大B細胞淋巴瘤、生發中心B細胞(GCB)彌漫性大B細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、復發性非霍奇金淋巴瘤、難治性非霍奇金淋巴瘤、復發性濾泡性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、小淋巴球性淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤或結外邊緣區淋巴瘤。在一個實施例中，癌症為骨髓瘤，例如多發性骨髓瘤。
在另一實施例中，癌症係選自癌瘤(例如晚期或轉移性癌瘤)、黑素瘤或肺癌，例如非小細胞肺癌。
在一個實施例中，癌症為肺癌，例如肺腺癌、非小細胞肺癌或小細胞肺癌。
在一個實施例中，癌症為黑素瘤，例如晚期黑素瘤。在一個實施例中，癌症為對其他療法無反應之晚期或不可切除性黑素瘤。在其他實施例中，癌症為具有BRAF突變(例如BRAF V600突變)之黑素瘤。在又其他實施例中，本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或醫藥組合物在用抗CTLA-4抗體(例如伊匹單抗(ipilimumab))在使用或不使用BRAF抑制劑(例如維羅非尼(vemurafenib)或達拉非尼(dabrafenib))的情況下治療之後進行投與。
在另一實施例中，癌症為肝癌，例如晚期肝癌，伴有或不伴有病毒感染，例如慢性病毒性肝炎。
在另一實施例中，癌症為前列腺癌，例如晚期前列腺癌。
在又另一實施例中，癌症為骨髓瘤，例如多發性骨髓瘤。
在又另一實施例中，癌症為腎癌，例如腎細胞癌(RCC)(例如轉移性RCC、透明細胞腎細胞癌(CCRCC)或腎乳突狀細胞癌)。
在又另一實施例中，癌症係選自肺癌、黑素瘤、腎癌、乳癌、結腸直腸癌、白血病或轉移性癌症病灶。
在某些實施例中，本揭示案提供一種在受試者中預防或治療感染性疾病之方法，該方法包含向該受試者投與有效量的如本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其醫藥組合物。在一個實施例中，本文提供用於預防及/或治療感染(例如病毒感染、細菌感染、真菌感染、原蟲感染或寄生蟲感染)之方法。根據該等方法預防及/或治療之感染可由本文所鑑別之感染物引起。在一個具體實施例中，本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其組合物為向受試者投與之僅有的活性劑。在某些實施例中，將本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其組合物與用於治療感染性疾病之抗感染干預(例如抗病毒劑、抗細菌劑、抗真菌劑或抗蠕蟲劑(anti-helminthics)組合使用。因此，在一個實施例中，本發明係關於用於預防及/或治療感染性疾病之方法中的本發明之抗體及/或醫藥組合物，視情況其中該抗體或醫藥組合物為向受試者投與之僅有的活性劑，或其中該抗體或醫藥組合物與抗感染干預組合使用。
可藉由本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或醫藥組合物治療及/或預防的感染性疾病由包括(但不限於)細菌、寄生蟲、真菌、原蟲及病毒之感染物引起。在一個具體實施例中，藉由本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或醫藥組合物治療及/或預防的感染性疾病由病毒引起。可根據本文所描述之方法預防及/或治療的病毒性疾病或病毒感染包括(但不限於)由A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、流感(例如A型流感或B型流感)、水痘、腺病毒、I型單純性疱疹(HSV-I)II型單純性疱疹(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、埃可病毒(echovirus)、輪狀病毒、呼吸道融合性病毒、乳頭瘤，、乳多泡病毒、巨細胞病毒、埃克諾病毒(echinovirus)、蟲媒病毒、漢坦病毒(huntavirus)、科沙奇病毒(coxsackie virus)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、脊髓灰質炎病毒、天花、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus)、I類型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)、II型人類免疫缺陷病毒(HIV-II)以及諸如病毒性腦膜炎、腦炎、登革熱或天花之病毒性疾病試劑引起的彼等病毒性疾病或病毒感染。
可預防及/或治療之細菌感染包括由大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、草綠色葡萄球菌(Staphylococcus viridans)及綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起之感染。可根據本文所描述之方法預防及/或治療的由細菌(例如大腸桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、普通變形桿菌、草綠色葡萄球菌及綠膿假單胞菌)引起之細菌性疾病包括(但不限於)立克次體分枝桿菌(Mycobacteria rickettsia)、支原體(Mycoplasma)、奈瑟氏菌(Neisseria)、肺炎鏈球菌(S. pneumonia)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)(萊姆病(Lyme disease))、炭疽芽孢桿菌(Bacillus antracis)(炭疽病)、破傷風、鏈球菌、葡萄球菌、分枝桿菌、百日咳(pertissus)、霍亂(cholera)、瘟疫(plague)、白喉(diptheria)、披衣菌(chlamydia)、金黃色葡萄球菌及軍團桿菌(legionella)。
可根據本文所描述之方法預防及/或治療的由原蟲引起之原蟲性疾病或原蟲感染包括(但不限於)利什曼原蟲(leishmania)、球蟲病(coccidiosis)、錐蟲(trypanosoma)住血吸蟲(schistosoma)或瘧疾。可根據本文所描述之方法預防及/或治療的由寄生蟲引起之寄生蟲性疾病或寄生蟲感染包括(但不限於)披衣菌及立克次體。
可根據本文所描述之方法預防及/或治療的真菌性疾病或真菌感染包括(但不限於)由以下引起之彼等真菌性疾病或真菌感染：念珠菌(Candida )感染、接合菌病(zygomycosis)、念珠菌乳腺炎、伴有潛在毛孢子菌性血液病(trichosporonemia)之進行性散播性毛孢子菌病(trichosporonosis)、散播性念珠菌病、肺部巴西副球黴菌病(paracoccidioidomycosis)、肺部麯黴病(aspergillosis)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii )肺炎、隱球菌腦膜炎、球黴菌腦膜腦炎(coccidioidal meningoencephalitis)及腦脊髓脈管炎、黑麯黴(Aspergillus niger )感染、鐮刀菌角膜炎(Fusarium keratitis )、副鼻竇黴菌病、熏煙色麴菌(Aspergillus fumigatus )心內膜炎、脛骨軟骨發育不良、平滑念珠菌(Candida glabrata )陰道炎、口咽念珠菌病、X連鎖慢性肉芽腫性疾病、足癬(tinea pedis)、皮膚念珠菌病、黴菌性胎盤炎(mycotic placentitis)、散播性毛孢子菌病、過敏性支氣管肺部麯黴病、真菌性角膜炎、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans )感染、真菌性腹膜炎、膝曲彎孢菌(Curvularia geniculata )感染、葡萄球菌內眼炎、孢子絲菌病及皮癬菌病(dermatophytosis)。
在某些實施例中，此等方法進一步包含向受試者投與一種額外治療劑。在某些實施例中，額外治療劑為化學治療劑、放射性治療劑或檢查點靶向劑。在某些實施例中，化學治療劑為低甲基化劑(例如阿紮胞苷(azacitidine))。在某些實施例中，檢查點靶向劑係選自由以下組成之群：拮抗性抗CTLA-4抗體、拮抗性抗PD-L1抗體、拮抗性抗PD-L2抗體、拮抗性抗PD-1抗體、拮抗性抗TIM-3抗體、拮抗性抗LAG-3抗體、拮抗性抗VISTA抗體、拮抗性抗CD96抗體、拮抗性抗CEACAM1抗體、抗體抗TIGIT抗體、促效性抗GITR抗體及促效性抗OX40抗體。
在一個實施例中，本發明係關於用於本發明之方法中的本發明之抗體及/或醫藥組合物，其中該方法進一步包含向受試者投與一種額外治療劑。在一個實施例中，本發明係關於(a)本發明之抗體及/或醫藥組合物及(b)一種額外治療劑，其用作藥劑。在一個實施例中，本發明係關於(a)本發明之抗體及/或醫藥組合物及(b)一種額外治療劑，其用於一種用於治療癌症之方法中。在另一個實施例中，本發明係關於一種醫藥組合物、套組或分裝部分之套組，其包含(a)本發明之抗體及/或醫藥組合物及(b)一種額外治療劑。在一個實施例中，額外治療劑為化學治療劑、放射性治療劑或檢查點靶向劑。
在某些實施例中，抗PD-1抗體用於本文所揭示之方法中。在某些實施例中，抗PD-1抗體為由Bristol-Myers Squibb研發之納武單抗，亦稱為BMS-936558或MDX1106。在某些實施例中，抗PD-1抗體為由Merck & Co研發之派立珠單抗，亦稱為拉立珠單抗(lambrolizumab)或MK-3475。在某些實施例中，抗PD-1抗體為由CureTech研發之皮立珠單抗(pidilizumab)，亦稱為CT-011。在某些實施例中，抗PD-1抗體為由醫學免疫研發之MEDI0680，亦稱為AMP-514。在某些實施例中，抗PD-1抗體為由Novartis Pharmaceuticals研發之PDR001。在某些實施例中，抗PD-1抗體為由Regeneron Pharmaceuticals研發之REGN2810。在某些實施例中，抗PD-1抗體為由Pfizer研發之PF-06801591。在某些實施例中，抗PD-1抗體為由BeiGene研發之BGB-A317。在某些實施例中，抗PD-1抗體為由AnaptysBio及Tesaro研發之TSR-042。在某些實施例中，抗PD-1抗體為由Hengrui Hengrui研發之SHR-1210。
可用於本文所揭示之治療方法中之抗PD-1抗體的其他非限制性實例揭示於以下專利及專利申請案中，該等文獻均出於所有目的以全文引用之方式併入本文中：美國專利第6,808,710號；美國專利第7,332,582號；美國專利第7,488,802號；美國專利第8,008,449號；美國專利第8,114,845號；美國專利第8,168,757號；美國專利第8,354,509號；美國專利第8,686,119號；美國專利第8,735,553號；美國專利第8,747,847號；美國專利第8,779,105號；美國專利第8,927,697號；美國專利第8,993,731號；美國專利第9,102,727號；美國專利第9,205,148號；美國公開案第US 2013/0202623 A1號；美國公開案第US 2013/0291136 A1號；美國公開案第US 2014/0044738 A1號；美國公開案第US 2014/0356363 A1號；美國公開案第US 2016/0075783 A1號；以及PCT公開案第WO 2013/033091 A1號；PCT公開案第WO 2015/036394 A1號；PCT公開案第WO 2014/179664 A2號；PCT公開案第WO 2014/209804 A1號；PCT公開案第WO 2014/206107 A1號；PCT公開案第WO 2015/058573 A1號；PCT公開案第WO 2015/085847 A1號；PCT公開案第WO 2015/200119 A1號；PCT公開案第WO 2016/015685 A1號；及PCT公開案第WO 2016/020856 A1號。
在某些實施例中，抗PD-L1抗體用於本文所揭示之方法中。在某些實施例中，抗PD-L1抗體為由Genentech研發之阿特珠單抗(atezolizumab)。在某些實施例中，抗PD-L1抗體為由AstraZeneca、Celgene及Medimmune研發之德瓦魯單抗(durvalumab)。在某些實施例中，抗PD-L1抗體為由Merck Serono及Pfizer研發之艾維路單抗(avelumab)，亦稱為MSB0010718C。在某些實施例中，抗PD-L1抗體為由Bristol-Myers Squibb研發之MDX-1105。在某些實施例中，抗PD-L1抗體為由Amplimmune及GSK研發之AMP-224。
可用於本文所揭示之治療方法中之抗PD-L1抗體的非限制性實例揭示於以下專利及專利申請案中，該等文獻均出於所有目的以全文引用之方式併入本文中：美國專利第7,943,743號；美國專利第8,168,179號；美國專利第8,217,149號；美國專利第8,552,154號；美國專利第8,779,108號；美國專利第8,981,063號；美國專利第9,175,082號；美國公開案第US 2010/0203056 A1號；美國公開案第US 2003/0232323 A1號；美國公開案第US 2013/0323249 A1號；美國公開案第US 2014/0341917 A1號；美國公開案第US 2014/0044738 A1號；美國公開案第US 2015/0203580 A1號；美國公開案第US 2015/0225483 A1號；美國公開案第US 2015/0346208 A1號；美國公開案第US 2015/0355184 A1號；以及PCT公開案第WO 2014/100079 A1號；PCT公開案第WO 2014/022758 A1號；PCT公開案第WO 2014/055897 A2號；PCT公開案第WO 2015/061668 A1號；PCT公開案第WO 2015/109124 A1號；PCT公開案第WO 2015/195163 A1號；PCT公開案第WO 2016/000619 A1號；及PCT公開案第WO 2016/030350 A1號。
在某些實施例中，本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體與靶向諸如IDO(吲哚胺-(2,3)-雙加氧酶)及/或TDO(色胺酸2,3-雙加氧酶)之免疫調節酶的化合物組合向受試者進行投與。因此，在一個實施例中，額外治療劑為靶向免疫調節酶之化合物，諸如吲哚胺-(2,3)-雙加氧酶(IDO)之抑制劑。在某些實施例中，此類化合物係選自由以下組成之群：艾帕斯塔(epacadostat)(Incyte Corp；參見例如WO 2010/005958，該文獻以全文引用之方式併入本文中)、F001287(Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、因多莫得(NewLink Genetics)及NLG919(NewLink Genetics)。在一個實施例中，化合物為艾帕斯塔。在另一實施例中，化合物為F001287。在另一實施例中，化合物為因多莫得。在另一實施例中，化合物為NLG919。在一個具體實施例中，本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137)抗體與用於治療癌症之IDO抑制劑組合向受試者進行投與。如本文所描述的用於治療癌症之IDO抑制劑以醫藥組合物之固體劑型(諸如錠劑、丸劑或膠囊)存在，其中該醫藥組合物包括IDO抑制劑及醫藥學上可接受之賦形劑。由此，如本文所描述之抗體及如本文所描述之IDO抑制劑可以單獨劑型分開、依序或同時進行投與。在一個實施例中，抗體非經腸進行投與，而IDO抑制劑經口進行投與。在特定實施例中，抑制劑係選自由以下組成之群：艾帕斯塔(Incyte Corporation)、F001287(Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、因多莫得(NewLink Genetics)及NLG919(NewLink Genetics)。艾帕斯塔已描述於PCT公開案第WO 2010/005958號中，該文獻出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。在一個實施例中，抑制劑為艾帕斯塔。在另一實施例中，抑制劑為F001287。在另一實施例中，抑制劑為因多莫得。在另一實施例中，抑制劑為NLG919。
在某些實施例中，本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體與疫苗組合向受試者進行投與。疫苗可為例如肽疫苗、DNA疫苗或RNA疫苗。在某些實施例中，疫苗為基於熱休克蛋白之腫瘤疫苗或基於熱休克蛋白之病原體疫苗。在一個具體實施例中，本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體與基於熱休克蛋白之腫瘤疫苗組合向受試者進行投與。熱休克蛋白(HSP)為跨所有物種廣泛發現的高度保守蛋白質之家族。其表現可由於熱休克或其他形式之應激(包括暴露於毒素、氧化應激或葡萄糖去除)而被強有力地誘導達到高得多的水準。已根據分子量分類為五個家族：HSP-110、HSP-90、HSP-70、HSP-60及HSP-28。HSP經由抗原呈遞細胞(APC)(諸如巨噬細胞及樹突狀細胞(DC))中之交叉呈遞路徑遞送免疫原性肽，從而引起T細胞活化。HSP充當腫瘤相關抗原肽之伴隨蛋白載體，從而形成能夠誘導腫瘤特異性免疫性之複合物。在自將死亡之腫瘤細胞釋放時，HSP-抗原複合物由抗原呈遞細胞(APC)吸收，其中該等抗原經加工成結合MHC I類及II類分子之肽，從而引起抗腫瘤CD8+及CD4+T細胞之活化。由來源於腫瘤製劑之HSP複合物引發的免疫性特異性針對由各受試者之癌症表現的獨特抗原肽譜系。因此，在一個實施例中，本發明係關於(a)本發明之抗體及/或醫藥組合物及(b)疫苗，其用作藥劑，例如用於一種用於治療癌症之方法。在一個實施例中，本發明係關於一種醫藥組合物、套組或分裝部分之套組，其包含(a)本發明之抗體及/或醫藥組合物及(b)疫苗。在一個實施例中，疫苗為基於熱休克蛋白之腫瘤疫苗。在一個實施例中，疫苗為基於熱休克蛋白之病原體疫苗。在某些實施例中，疫苗如WO 2016/183486中所描述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)為由熱休克蛋白與抗原肽非共價複合而組成之蛋白質肽複合物。HSPPC引發先天性及適應性免疫反應。在一個具體實施例中，抗原肽顯示對所治療之癌症的抗原性。HSPPC由APC經由膜受體(主要CD91)或藉由與類鐸受體結合來高效地捕獲。HSPPC內化引起APC功能成熟以及趨化介素及細胞介素產生，從而引起自然殺手細胞(NK)、單核球及Th1及Th-2介導之免疫反應活化。在某些實施例中，在本文所揭示之方法中所用的HSPPC包含一或多種來自應激蛋白與抗原肽複合之hsp60、hsp70或hsp90家族的熱休克蛋白。在某些實施例中，HSPPC包含hsc70、hsp70、hsp90、hsp110、grp170、gp96、鈣網蛋白或其兩者或超過兩者之組合。
在一個具體實施例中，熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)包含重組熱休克蛋白(例如hsp70或hsc70)或其肽結合域與重組抗原肽複合。重組熱休克蛋白可藉由重組DNA技術，例如使用如Dworniczak及Mirault, Nucleic Acids Res. 15：5181-5197(1987)及GenBank寄存編號P11142及/或Y00371中所描述之人類hsc70序列來產生，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，Hsp70序列如Hunt及Morimoto Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82(19), 6455-6459(1985)及GenBank寄存編號P0DMV8及/或M11717中所描述，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。抗原肽亦可藉由此項技術中已知之重組DNA方法來加以製備。
在某些實施例中，抗原肽包含經修飾之胺基酸。在某些實施例中，經修飾之胺基酸包含轉譯後修飾。在某些實施例中，經修飾之胺基酸包含轉譯後修飾之模擬物。在某些實施例中，經修飾之胺基酸為已在側鏈羥基或胺上磷酸化之Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His。在某些實施例中，經修飾之胺基酸為已在側鏈羥基或胺上磷酸化之Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His胺基酸的模擬物。
在一個具體實施例中，本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體與熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)，例如熱休克蛋白肽複合物-96(HSPPC-96)組合向受試者進行投與以治療癌症。HSPPC-96包含96 kDa熱休克蛋白(Hsp)gp96與抗原肽複合。HSPPC-96為由受試者之腫瘤製造的癌症免疫療法且含有該癌症之抗原「指紋」。在某些實施例中，此指紋含有僅存在於特定(particular)受試者之特定(specific)癌細胞中的獨特抗原，且注射疫苗意欲刺激該受試者之免疫系統以識別及攻擊具有該特定癌症指紋之任何細胞。因此，在一個實施例中，本發明係關於本發明之抗體及/或醫藥組合物與熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)組合，其用作藥劑及/或用於一種用於治療癌症之方法中。
在某些實施例中，HSPPC(例如HSPPC-96)由受試者之腫瘤組織產生。在一個具體實施例中，HSPPC(例如HSPPC-96)由所治療之癌症類型或其癌轉移的腫瘤產生。在另一個具體實施例中，HSPPC(例如HSPPC-96)為所治療之受試者自體的。在某些實施例中，腫瘤組織為非壞死腫瘤組織。在某些實施例中，至少1公克(例如至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10公克)非壞死腫瘤組織用於產生疫苗方案。在某些實施例中，在手術切除之後，在用於疫苗製備之前冷凍非壞死腫瘤組織。在某些實施例中，藉由純化技術將HSPPC(例如HSPPC-96)自腫瘤組織分離，過濾且製備為可注射疫苗。在某些實施例中，向受試者投與6-12個劑量之HSPPC(例如HSPCC-96)。在此類實施例中，HSPPC(例如HSPPC-96)劑量可每週進行投與持續前4個劑量，且隨後每兩週進行投與持續2-8個額外劑量。
可根據本文所描述之方法使用的HSPPC之其他實例揭示於以下專利及專利申請案中，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中：美國專利第6,391,306號、第6,383,492號、第6,403,095號、第6,410,026號、第6,436,404號、第6,447,780號、第6,447,781號及第6,610,659號。
在某些實施例中，本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體與佐劑組合向受試者進行投與。各種佐劑可視治療情形而加以使用。適當佐劑之非限制性實例包括(但不限於)弗氏完全佐劑(Complete Freund's Adjuvant，CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)、montanide ISA(不完全Seppic佐劑)、Ribi佐劑系統(RAS)、Titer Max、胞壁醯基肽、Syntex佐劑調配物(SAF)、明礬(氫氧化鋁及/或磷酸鋁)、鋁鹽佐劑、Gerbu® 佐劑、硝化纖維素吸收之抗原、囊封或截留之抗原、3脫氧-醯基化單磷醯基脂質A(3 D-MPL)、免疫刺激寡核苷酸、類鐸受體(TLR)配位體、甘露聚糖結合性凝集素(MBL)配位體、STING促效劑、免疫刺激性複合物(諸如皂素)、Quil A、QS-21、QS-7、ISCOMATRIX及其他。其他佐劑包括CpG寡核苷酸及雙鏈RNA分子，諸如poly(A)及poly(U)。亦可使用上文佐劑之組合。參見例如美國專利第6,645,495號；第7,029,678號；及第7,858,589號，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。在一個實施例中，本文所用之佐劑為QS-21刺激子。
在某些實施例中，本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體與包含TCR之額外治療劑組合向受試者進行投與。在某些實施例中，額外治療劑為可溶性TCR。在某些實施例中，額外治療劑為表現TCR之細胞。因此，在一個實施例中，本發明係關於本發明之抗體及/或醫藥組合物與包含TCR之額外治療劑組合，其用作藥劑及/或用於一種用於治療癌症之方法中。
在某些實施例中，本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體與表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞組合向受試者進行投與。在某些實施例中，細胞為T細胞。
在某些實施例中，本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體與TCR模擬抗體組合向受試者進行投與。在某些實施例中，TCR模擬抗體為特異性結合於肽-MHC複合物之抗體。TCR模擬抗體之非限制性實例參見例如美國專利第9,074,000號及美國公開案第US 2009/0304679 A1號及第US 2014/0134191 A1號，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，本文所揭示之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體與雙特異性T細胞接合分子(BiTE)(例如如WO2005061547A2中所描述，該文獻以全文引用之方式併入本文中)及/或雙親和力再靶向抗體(DART)(例如如WO2012162067A2中所描述，該文獻以全文引用之方式併入本文中)組合向受試者進行投與。在某些實施例中，BiTE及/或DART特異性結合於腫瘤相關抗原(例如，在腫瘤中過度表現之多肽、來源於腫瘤病毒之多肽、包含對腫瘤具有特異性之轉譯後修飾的多肽、在腫瘤中特異性突變之多肽)及效應細胞上之分子(例如CD3或CD16)在某些實施例中，腫瘤相關抗原為EGFR(例如人類EGFR)、Her2(例如人類Her2)或CD20(例如人類CD20)。
抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體及額外治療劑(例如化學治療劑、放射性治療劑、檢查點靶向劑、IDO抑制劑、疫苗、佐劑、可溶性TCR、表現TCR之細胞、表現嵌合抗原受體之細胞及/或TCR模擬抗體)可以單獨劑型分開、依序或同時進行投與。在一個實施例中，抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體非經腸進行投與，而IDO抑制劑經口進行投與。
本文所描述之抗體或醫藥組合物可藉由多種途徑向受試者進行遞送。此等途徑包括(但不限於)非經腸、鼻內、氣管內、經口、皮內、表面、肌肉內、腹膜內、透皮、靜脈內、瘤內、結膜、動脈內及皮下途徑。亦可採用肺部投與，例如藉由使用吸入器或霧化器及具有用作噴霧之氣霧劑的調配物。在某些實施例中，本文所描述之抗體或醫藥組合物皮下或靜脈內進行遞送。在某些實施例中，本文所描述之抗體或醫藥組合物動脈內進行遞送。在某些實施例中，本文所描述之抗體或醫藥組合物瘤內進行遞送。在某些實施例中，將本文所描述之抗體或醫藥組合物遞送至腫瘤引流淋巴結中。
將在治療及/或預防病況中有效的抗體或組合物之量將視疾病性質而定，且可藉由標準臨床技術來加以確定。
待用於組合物中之精確劑量亦將視投藥途徑及感染或由其引起之疾病的嚴重性而定，且應根據醫師之判斷及各受試者之情況來決定。舉例而言，有效劑量亦可視投藥手段、靶位點、患者之生理學狀態(包括年齡、體重及健康狀況)、患者是人類還是動物、所投與之其他藥劑或治療是預防性還是治療性而變化。通常，患者為人類，但亦可治療非人類哺乳動物，包括轉殖基因哺乳動物。最佳地對治療劑量進行滴定以使安全性及功效最佳化。
本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體亦可用於在生物樣品中使用熟習此項技術者已知之傳統免疫組織化學方法來分析CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)蛋白質含量，該等方法包括免疫分析，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、免疫沈澱或西方墨點法(Western blotting)。適合之抗體分析標記為此項技術中已知的，且包括酶標記，諸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，諸如碘(125 I、121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(121 In)及鎝(99 Tc)；發光標記，諸如魯米諾；及螢光標記，諸如螢光素及若丹明，及生物素。此類標記可用於標記本文所描述之抗體。或者，識別本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體的第二抗體可經標記且與抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體組合使用以偵測CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)蛋白質含量。因此，在一個實施例中，本發明係關於本發明之抗體的用途，其用於在生物樣品中活體外偵測CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)蛋白質。在另一個實施例中，本發明係關於本發明之抗CD137抗體的用途，其用於在生物樣品中活體外分析及/或偵測CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)蛋白質含量，視情況其中該抗CD137抗體與放射性核種或可偵測標記綴合及/或攜載本文所描述之標記，且/或其中使用免疫組織化學方法。
對CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)蛋白質之表現量的分析意欲包括定性或定量地直接(例如藉由測定或估計絕對蛋白質含量)或相對(例如藉由與第二生物樣品中之疾病相關蛋白質含量相比)量測或估計CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)蛋白質在第一生物樣品中之含量。可量測或估計第一生物樣品中之CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)多肽表現量且將其與標準CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)蛋白質含量相比，該標準品例如自獲自未患有病症之個體的第二生物樣品取得或藉由對來自未患有病症之個體群體的含量進行平均來加以確定。如在此項技術中應瞭解，一旦已知「標準」CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)多肽含量，其可作為標準品重複用於比較。因此，在另一個實施例中，本發明係關於一種用於在生物樣品中分析及/或偵測CD137蛋白質含量(例如人類CD137蛋白質含量)之活體外方法，其包含定性或定量地藉由免疫組織化學方法來量測或估計CD137蛋白質(例如人類CD137蛋白質)在生物樣品中之含量。
如本文所用，術語「生物樣品」係指自潛在地表現CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之受試者、細胞株、組織或其他細胞源獲得的任何生物樣品。用於自動物(例如人類或食蟹獼猴)獲得組織活體切片及體液之方法為此項技術中熟知的。生物樣品包括外周單核血細胞。
本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體可用於預後、診斷、監測及篩查應用，包括熟練技術人員熟知且視為標準且基於本發明描述的活體外及活體內應用。用於活體外評定及評估免疫系統狀態及/或免疫反應之預後、診斷、監測及篩選分析及套組可用於預測、診斷及監測以評估患者樣品，包括評估已知具有或疑似具有免疫系統功能異常之彼等患者樣品或關於預期或所要免疫系統反應、抗原反應或疫苗反應對該等患者樣品進行評估。對免疫系統狀態及/或免疫反應之評定及評估亦適用於確定患者對於藥物臨床試驗或對於與不同藥劑或抗體對比投與特定化學治療劑、放射性治療劑或抗體(包括其組合)的適合性。此類型之預後及診斷監測及評定已在實踐中利用針對乳癌HER2蛋白質之抗體(HercepTestTM ，Dako)進行，其中該分析亦用於對於使用Herceptin® 之抗體療法評估患者。活體內應用包括定向細胞療法及免疫系統調節及免疫反應放射性成像。因此，在一個實施例中，本發明係關於本發明之抗CD137抗體及/或醫藥組合物，其用作診斷劑。在一個實施例中，本發明係關於本發明之抗CD137抗體及/或醫藥組合物。其用於一種用於預測、診斷及/或監測具有或疑似具有免疫系統功能異常之受試者或關於預期或所要免疫系統反應、抗原反應或疫苗反應對該受試者進行預測、診斷及/或監測的方法。在另一實施例中，本發明係關於本發明之抗CD137抗體的用途，其用於預測、診斷及/或監測具有或疑似具有免疫系統功能異常之受試者或關於預期或所要免疫系統反應、抗原反應或疫苗反應對該受試者進行預測、診斷及/或監測，該預測、診斷及/或監測藉由在該受試者之生物樣品中活體外分析及/或偵測人類CD137蛋白質含量來進行。
在一個實施例中，抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體可用於活體檢查樣品之免疫組織化學中。在一個實施例中，該方法為活體外方法。在另一實施例中，抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體可用於偵測CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之含量或在其膜表面上含有CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之細胞的含量，該等含量可隨後與某些疾病症狀相聯。本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體可攜載可偵測或功能性標記及/或可與放射性核種或可偵測標記綴合。當使用螢光標記時，目前可獲得的此項技術中已知之顯微法及螢光活化細胞分類器分析或兩中方法程序之組合可用以鑑別特異性結合成員及對其進行定量。本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體可攜載螢光標記或可與其綴合。例示性螢光標記包括例如反應性及綴合探針，例如胺基香豆素(Aminocoumarin)、螢光素及Texas red、Alexa Fluor染料、Cy染料及DyLight染料。抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體可攜載放射性標記或放射性核種或可與其綴合，該放射性標記或放射性核種諸如同位素3 H、14 C、32 P、35 S、36 Cl、51 Cr、57 Co、58 Co、59 Fe、67 Cu、90 Y、99 Tc、111 In、117 Lu、121 I、124 I、125 I、131 I、198 Au、211 At、213 Bi、225 Ac及186 Re。當使用放射性標記時，目前可獲得的此項技術中已知之計數程序可用以鑑別抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體與CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之特異性結合及對其進行定量。在其中標記為酶之例子中，偵測可藉由本發明所利用的如此項技術中已知之比色、分光光度、氟分光光度、電流測定或氣體定量技術中的任一者來實現。此可藉由使樣品或對照樣品與抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體在允許在該抗體與CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之間形成複合物的條件下接觸來達成。偵測在抗體與CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)與之間形成的任何複合物，且在樣品與對照物中進行比較。鑒於本文所描述之抗體對CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的特異性結合，該抗體可用於特異性偵測細胞表面上之CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)表現。本文所描述之抗體亦可用於經由免疫親和力純化來純化CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)。本文亦包括一種分析系統，其可以測試套組、套組或分裝部分之套組的形式製備以用於對例如CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)或CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)/CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)配位體複合物之存在的程度進行定量分析。系統、測試套組、套組或分裝部分之套組可包含經標記之組分(例如經標記之抗體)及一或多種額外免疫化學試劑。1.5 產生抗 CD137 抗體之多核苷酸、載體及方法
在另一態樣中，本文提供以下多核苷酸，其包含編碼特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗原的本文所描述之抗體或其片段(例如輕鏈可變區及/或重鏈可變區)的核苷酸序列；以及載體，例如包含此類多核苷酸以用於在宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli )及哺乳動物細胞)中重組表現之載體。本文提供以下多核苷酸，其包含編碼本文所提供抗體中之任一者之重鏈及/或輕鏈的核苷酸序列；以及包含此類多核苷酸序列之載體，例如用於在宿主細胞(例如哺乳動物細胞)中使該等多核苷酸有效表現的表現載體。
如本文所用，「經分離」之多核苷酸或核酸分子為與存在於核酸分子天然來源中(例如在小鼠或人類中)之其他核酸分子分離的多核苷酸或核酸分子。此外，「經分離」之核酸分子(諸如cDNA分子)可在藉由重組技術產生時基本上不含其他細胞材料或培養基，或在化學合成時基本上不含化學前驅物或其他化學物質。舉例而言，語言「基本上不含」包括多核苷酸或核酸分子製劑具有少於約15%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%(尤其少於約10%)之其他材料，例如細胞材料、培養基、其他核酸分子、化學前驅物及/或其他化學物質。在一個具體實施例中，分離或純化編碼本文所描述之抗體的核酸分子。
在特定態樣中，本文提供以下多核苷酸，其包含編碼特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)多肽且包含如本文所描述之胺基酸序列的抗體以及與此類抗體競爭結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)多肽(例如以劑量依賴性方式)或與此類抗體結合於相同抗原決定基之抗體的核苷酸序列。
在某些態樣中，本文提供以下多核苷酸，其包含編碼本文所描述之抗體之輕鏈或重鏈的核苷酸序列。多核苷酸可包含編碼包含本文所描述之抗體之VL FR及CDR(參見例如表1)之輕鏈的核苷酸序列或編碼本文所描述之抗體之VH FR及CDR(參見例如表1)之重鏈的核苷酸序列。
本文亦提供以下多核苷酸，其編碼例如藉由密碼子/RNA最佳化、用異源信號序列置換及消除mRNA不穩定性元件而最佳化的抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體。藉由引入密碼子變化及/或消除mRNA中抑制區而產生經最佳化以用於重組表現的編碼抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其片段(例如輕鏈、重鏈、VH域或VL域)之核酸的方法可藉由採用例如美國專利第5,965,726號；第6,174,666號；第6,291,664號；第6,414,132號；及第6,794,498號中所描述之最佳化方法來實行，相應地，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，RNA內之潛在剪接位點及不穩定性元件(例如富含A/T或A/U之元件)可經突變而不改變由該核酸序列編碼之胺基酸以增加該RNA用於重組表現之穩定性。改變利用遺傳密碼之簡併，例如對相同胺基酸使用替代性密碼子。在某些實施例中，可能期望改變一或多個密碼子以編碼保守性突變，例如具有與原始胺基酸類似之化學結構及特性及/或功能的類似胺基酸。此類方法可將抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其片段之表現相對於由尚未經最佳化之多核苷酸編碼的抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體之表現增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或超過100倍。
在某些實施例中，經最佳化的編碼本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其片段(例如VL域及/或VH域)之多核苷酸序列可與未最佳化的編碼本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其片段(例如VL域及/或VH域)之多核苷酸序列的反義(例如互補)多核苷酸雜交。在具體實施例中，經最佳化的編碼本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或片段之核苷酸序列在高嚴格度條件下與未最佳化的編碼本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其片段之多核苷酸序列的反義多核苷酸雜交。在一個具體實施例中，經最佳化的編碼本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其片段之核苷酸序列在高嚴格度、中等或較低嚴格度雜交條件下與未最佳化的編碼本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其片段之核苷酸序列的反義多核苷酸雜交。已描述關於雜交條件之資訊，參見例如美國專利申請公開案第2005/0048549號(例如第72-73段)，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
可藉由此項技術中已知之任何方法獲得多核苷酸及確定該等多核苷酸之核苷酸序列。編碼本文所描述之抗體(例如表1中所描述之抗體)及此等抗體之經修飾型式的核苷酸序列可使用此項技術中熟知之方法來加以確定，亦即，將已知編碼特定胺基酸之核苷酸密碼子以產生編碼該抗體之核酸的方式進行組裝。此類編碼抗體之多核苷酸可自化學合成之寡核苷酸組裝(例如如Kutmeier G等人,(1994), BioTechniques 17：242-6中所描述，該文獻以全文引用之方式併入本文中)，簡言之，其涉及合成含有編碼抗體之序列部分的重疊寡核苷酸，對彼等寡核苷酸進行黏接及接合，且隨後藉由PCR使經接合之寡核苷酸擴增。
或者，編碼本文所描述之抗體的多核苷酸可使用此項技術中熟知之方法(例如PCR及其他分子選殖方法)由來自適合之來源(例如融合瘤)的核酸來產生。舉例而言，使用可與已知序列之3'及5'端雜交之合成引子的PCR擴增可使用自產生所關注抗體之融合瘤細胞獲得的基因組DNA來進行。此類PCR擴增方法可用於獲得包含編碼抗體輕鏈及/或重鏈之序列的核酸。此類PCR擴增方法可用於獲得包含編碼抗體可變輕鏈區及/或可變重鏈區之序列的核酸。可將經擴增之核酸選殖至載體中以用於在宿主細胞中表現及用於進一步選殖以例如產生嵌合及人類化抗體。
若含有編碼特定抗體之核酸的純系不可獲得，但已知該抗體分子之序列，則編碼免疫球蛋白之核酸可經化學合成，或藉由使用可與序列之3'及5'端雜交之合成引子的PCR擴增或藉由使用對特定基因序列具有特異性之寡核苷酸探針選殖來鑑別例如來自編碼該抗體之cDNA庫的cDNA純系而自適合之來源(例如抗體cDNA庫、或由表現該抗體之任何組織或細胞(諸如經選擇以表現本文所描述之抗體的融合瘤細胞)產生之cDNA庫、或自該等組織或細胞分離之核酸(較佳為polyA+RNA))獲得。可隨後使用此項技術中熟知之任何方法將藉由PCR產生之經擴增核酸選殖至可複製之選殖載體中。
編碼本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體的DNA可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合於編碼抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)來容易地進行分離及定序。融合瘤細胞可充當此類DNA之來源。一旦分離，可將DNA置放於表現載體中，隨後將該等表現載體轉染至宿主細胞，諸如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如來自CHO GS System™(龍沙公司(Lonza))之CHO細胞)或在其他情況下不產生免疫球蛋白蛋白質之骨髓瘤細胞中，以在重組宿主細胞中獲得抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體之合成。
為了產生完整抗體，包括VH或VL核苷酸序列、限制位點及保護該限制位點之側接序列的PCR引子可用於使scFv純系中之VH或VL序列擴增。利用熟習此項技術者已知之選殖技術，可將經PCR擴增之VH域選殖至表現重鏈恆定區(例如人類γ4恆定區)之載體中，且可將經PCR擴增之VL域選殖至表現輕鏈恆定區(例如人類κ或λ恆定區)之載體中。在某些實施例中，用於表現VH或VL域之載體包含EF-1α啟動子、分泌信號、用於可變區之選殖位點、恆定域及諸如新黴素之選擇標記物。亦可將VH及VL域選殖至一個表現必要恆定區之載體中。隨後使用熟習此項技術者已知之技術將重鏈轉化載體及輕鏈轉化載體共轉染至細胞株中以產生表現全長抗體(例如IgG)之穩定或瞬時細胞株。
DNA亦可例如藉由將鼠類序列取代為用於人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列，或藉由將用於非免疫球蛋白多肽之編碼序列的全部或部分共價接合於免疫球蛋白編碼序列來加以修飾。
亦提供以下多核苷酸，其在高嚴格度、中等或較低嚴格度雜交條件下與編碼本文所描述之抗體的多核苷酸雜交。在具體實施例中，本文所描述之多核苷酸在高嚴格度、中等或較低嚴格度雜交條件下與編碼本文所提供之VH域及/或VL域的多核苷酸雜交。
雜交條件已描述於此項技術中且為熟習此項技術者已知的。舉例而言，在嚴格條件下雜交可涉及在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45℃下與濾紙結合之DNA雜交，後接在0.2×SSC/0.1% SDS中在約50℃-65℃下洗滌一或多次；在高度嚴格條件下雜交可涉及在6×SSC中在約45℃下與濾紙結合之核酸雜交，後接在0.1×SSC/0.2% SDS中在約68℃下洗滌一或多次。在其他嚴格雜交條件下雜交為熟習此項技術者已知的且已加以描述，參見例如Ausubel FM等人編,(1989)Current Protocols in Molecular Biology, 第I卷, Green Publishing Associates, Inc.及John Wiley & Sons, Inc., New York，第6.3.1-6.3.6及2.10.3頁，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
在某些態樣中，本文提供以下細胞(例如宿主細胞)，其表現(例如以重組方式表現)特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的本文所描述之抗體以及相關多核苷酸及表現載體。本文提供以下載體(例如表現載體)，其包含有包含編碼抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或片段之核苷酸序列的多核苷酸以用於在宿主細胞中，較佳地在哺乳動物細胞(例如CHO細胞)中重組表現。本文亦提供以下宿主細胞，其包含此類載體以用於以重組方式表現本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體(例如人類或人類化抗體)。在一個特定態樣中，本文提供用於產生本文所描述之抗體的方法，其包含由宿主細胞表現此類抗體。
對特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)的本文所描述之抗體(例如全長抗體、抗體之重鏈及/或輕鏈或本文所描述之單鏈抗體)的重組表現一般涉及構築含有編碼該抗體之多核苷酸的表現載體。一旦已獲得編碼本文所描述之抗體分子、抗體之重鏈及/或輕鏈或其片段(例如重鏈及/或輕鏈可變區)的多核苷酸，用於產生抗體分子之載體可藉由重組DNA技術使用此項技術中熟知之技術來產生。因此，本文描述用於製備蛋白質的方法，其藉由表現含有編碼抗體或抗體片段(例如輕鏈或重鏈)之核苷酸序列的多核苷酸來進行。熟習此項技術者熟知之方法可用於構築含有抗體或抗體片段(例如輕鏈或重鏈)編碼序列及適當轉錄及轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括例如活體外重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組。亦提供以下可複製載體，其包含編碼本文所描述之抗體分子、抗體之重鏈或輕鏈、抗體之重鏈或輕鏈可變區或其片段、或重鏈或輕鏈CDR的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接於啟動子。此類載體可例如包括編碼抗體分子之恆定區的核苷酸序列(參見例如國際公開案第WO 86/05807號及第WO 89/01036號；以及美國專利第5,122,464號，該等文獻以全文引用之方式併入本文中)，且可將抗體之可變區選殖至此類載體中以用於表現整個重鏈、整個輕鏈或整個重鏈及輕鏈兩者。
可藉由習知技術將表現載體轉移至細胞(例如宿主細胞)中，且可隨後藉由習知技術培養所得細胞以產生本文所描述之抗體或其片段。因此，本文提供以下宿主細胞，其含有編碼本文所描述之抗體或其片段、或其重鏈或輕鏈、或其片段、或本文所描述之單鏈抗體的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接於啟動子以用於在宿主細胞中表現此類序列。在某些實施例中，如下文所詳述，為表現雙鏈抗體，個別地編碼重鏈及輕鏈兩者之載體可在宿主細胞中共表現以用於表現整個免疫球蛋白分子。在某些實施例中，宿主細胞含有載體，該載體包含編碼本文所描述之抗體之重鏈及輕鏈兩者或其片段的多核苷酸。在具體實施例中，宿主細胞含有兩種不同載體，第一載體包含編碼本文所描述之抗體之重鏈或重鏈可變區或其片段的多核苷酸，而第二載體包含編碼本文所描述之抗體之輕鏈或輕鏈可變區或其片段的多核苷酸。在其他實施例中，第一宿主細胞包含第一載體，該第一載體包含編碼本文所描述之抗體之重鏈或重鏈可變區或其片段的多核苷酸，而第二宿主細胞包含第二載體，該第二載體包含編碼本文所描述之抗體之輕鏈或輕鏈可變區的多核苷酸。在具體實施例中，由第一細胞表現之重鏈/重鏈可變區與第二細胞之輕鏈/輕鏈可變區締合以形成本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體。在某些實施例中，本文提供以下宿主細胞群體，其包含此類第一宿主細胞及此類第二宿主細胞。
在一個特定實施例中，本文提供以下載體群體，其包含第一載體及第二載體，該第一載體包含編碼本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體之輕鏈/輕鏈可變區的多核苷酸，該第二載體包含編碼本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體之重鏈/重鏈可變區的多核苷酸。
多種宿主-表現載體系統可用於表現本文所描述之抗體分子(參見例如美國專利第5,807,715號，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。此類宿主-表現系統表示可產生且隨後純化所關注之編碼序列的媒劑，且亦表示可在經適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時原位表現本文所描述之抗體分子的細胞。此等系統包括(但不限於)微生物，諸如經含有抗體編碼序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型的細菌(例如大腸桿菌及枯草桿菌(B. subtilis ))；經含有抗體編碼序列之重組酵母表現載體轉型的酵母(例如畢赤酵母(Saccharomyces Pichia ))；經含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒(baculovirus))感染的昆蟲細胞系統；經含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)，CaMV；菸草嵌紋病毒(tobacco mosaic virus)，TMV)感染或經含有抗體編碼序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型的植物細胞系統(例如綠藻，諸如萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii ))；或具有含有來源於哺乳動物細胞基因組之啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或來源於哺乳動物病毒之啟動子(例如腺病毒晚期啟動子；痘瘡病毒7.5K啟動子)之重組表現構築體的哺乳動物細胞系統(例如COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa及NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20及BMT10細胞)。在一個具體實施例中，用於表現本文所描述之抗體的細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，例如來自CHO GS System™(龍沙公司)之CHO細胞。在某些實施例中，由CHO細胞產生的抗體之重鏈及/或輕鏈的N端麩醯胺酸或麩胺酸鹽殘基可經焦麩胺酸鹽置換。在一個特定實施例中，用於表現本文所描述之抗體的細胞為人類細胞，例如人類細胞株。在一個具體實施例中，哺乳動物表現載體為pOptiVEC™或pcDNA3.3。在一個特定實施例中，尤其用於表現完整重組抗體分子的細菌細胞(諸如大腸桿菌)或真核細胞(例如哺乳動物細胞)用於表現重組抗體分子。舉例而言，，諸如CHO細胞之哺乳動物細胞與諸如來自人類巨細胞病毒之主要中早期基因啟動子元件的載體結合為用於抗體之有效表現系統(Foecking MK & Hofstetter H(1986)Gene 45：101-5；及Cockett MI等人, (1990)Biotechnology 8(7)：662-7，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中)。在某些實施例中，本文所描述之抗體由CHO細胞或NS0細胞產生。在一個具體實施例中，編碼本文所描述之特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體的核苷酸序列的表現由組成性啟動子、誘導性啟動子或組織特異性啟動子加以調控。
在細菌系統中，多個表現載體可有利地視所表現之抗體分子的預期用途而加以選擇。舉例而言，當待產生大量此類抗體時，為產生抗體分子之醫藥組合物，可能期望的是容易純化的導引高含量之融合蛋白產物之表現的載體。此類載體包括(但不限於)大腸桿菌表現載體pUR278(Ruether U & Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2：1791-1794)，其中抗體編碼序列可個別地接合至與lac Z編碼區同框之載體中以產生融合蛋白；pIN載體(Inouye S & Inouye M(1985)Nuc Acids Res 13：3101-3109；Van Heeke G & Schuster SM(1989)J Biol Chem 24：5503-5509)；及其類似物，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，pGEX載體亦可用於將外源多肽表現為具有麩胱甘肽5-轉移酶(GST)之融合蛋白。一般而言，此類融合蛋白為可溶的，且可藉由吸附及結合於麩胱甘肽瓊脂糖珠粒基質，繼而在游離麩胱甘肽存在下溶離而容易地自溶解細胞純化。pGEX載體經設計以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點，以使得可自GST部分釋放所選殖之靶基因產物。
在昆蟲系統中，舉例而言，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica )核型多角體病毒(AcNPV)可用作載體來表現外源基因。病毒生長於草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )細胞中。可將抗體編碼序列個別地選殖至病毒之非必需區(例如多角體蛋白基因)中，且置放於AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)之控制下。
在哺乳動物宿主細胞中，可利用多種基於病毒之表現系統。在其中使用腺病毒作為表現載體的情況下，所關注之抗體編碼序列可接合至腺病毒轉錄/轉譯控制複合物，例如晚期啟動子及三聯前導序列。此嵌合基因可隨後藉由活體外或活體內重組而插入在腺病毒基因組中。插入在病毒基因組之非必需區(例如區E1或E3)中將產生在所感染之宿主中可存活且能夠表現抗體分子之重組病毒(例如參見Logan J & Shenk T(1984)PNAS 81(12)：3655-9，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。為高效轉譯所插入之抗體編碼序列亦可需要特定起始信號。此等信號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。此外，起始密碼子必須與所要編碼序列之閱讀框架同相，以確保整個插入物之轉譯。此等外源性轉譯控制信號及起始密碼子可為多種來源，天然及合成兩者。可藉由包括適當轉錄強化子元件、轉錄終止子等來提高表現效率(參見例如Bitter G等人,(1987)Methods Enzymol. 153：516-544，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。
另外，可選擇以所要特定方式調節插入序列之表現或修飾及處理基因產物的宿主細胞品系。蛋白質產物之此類修飾(例如糖基化)及處理(例如裂解)對該蛋白質之功能可為至關重要的。不同宿主細胞具有蛋白質及基因產物之轉譯後處理及修飾的特徵及特定機制。可選擇適當細胞株或宿主系統以確保所表現之外源蛋白質的正確修飾及處理。為此目的，可使用具有用於恰當處理初級轉錄物、使基因產物糖基化及磷酸化之細胞機制的真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括(但不限於)CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NS0(不內源性產生任何免疫球蛋白鏈之、CRL7O3O、COS(例如COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10及HsS78Bst細胞。在某些實施例中，本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體在哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)中產生。
在一個具體實施例中，本文所描述之抗體的海藻糖含量減少或無海藻糖含量。此類抗體可使用熟習此項技術者已知之技術來產生。舉例而言，抗體可在缺乏或不具有海藻糖化之能力的細胞中進行表現。在一個具體實例中，α1,6-海藻糖基轉移酶之兩個等位基因均基因剔除的細胞株可用於產生海藻糖含量減少之抗體。Potelligent® 系統(龍沙公司)為可用於產生海藻糖含量減少之抗體的此類系統之一個實例。
為長期高產率產生重組蛋白質，可產生穩定表現細胞。舉例而言，穩定表現本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體的細胞株可經工程改造。在具體實施例中，本文所提供之細胞穩定表現締合以形成本文所描述之抗體的輕鏈/輕鏈可變區及重鏈/重鏈可變區。
在某些態樣中，宿主細胞可用由適當表現控制元件(例如啟動子、強化子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選標記物轉型，而非使用含有病毒複製起點之表現載體。在引入外源DNA/多核苷酸後，可使經工程改造之細胞在豐富培養基(enriched media)中生長1-2天，且隨後交換至選擇性培養基中。重組質體中之可選標記物賦予選擇抗性，且允許細胞將質體穩定地整合至其染色體中且生長形成變異區(foci)，該等變異區繼而可選殖及擴增至細胞株中。此方法可有利地用於對表現本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體或其片段的細胞株進行工程改造。此類經工程改造之細胞株可尤其適用於篩選及評估與抗體分子直接或間接相互作用之組合物。
可使用多種選擇系統，包括(但不限於)分別處於tk、hgprt或aprt細胞中之單純疱疹病毒(herpes simplex virus)胸苷激酶(Wigler M等人,(1977)Cell 11(1)：223-32)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Szybalska EH & Szybalski W(1962)PNAS 48(12)：2026-2034)及腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy I等人,(1980)Cell 22(3)：817-23)基因，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。另外，抗代謝物抗性可用作選擇以下基因之基礎：賦予甲胺喋呤抗性之dhfr (Wigler M等人,(1980)PNAS 77(6)：3567-70；O'Hare K等人,(1981)PNAS 78：1527-31)；賦予黴酚酸抗性之gpt (Mulligan RC & Berg P(1981)PNAS 78(4)：2072-6)；賦予胺基醣苷G-418抗性之neo(Wu GY & Wu CH(1991)Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev P(1993)Ann Rev Pharmacol Toxicol 32：573-596；Mulligan RC (1993)Science 260：926-932；及Morgan RA & Anderson WF(1993)Ann Rev Biochem 62：191-217；Nabel GJ & Felgner PL(1993)Trends Biotechnol 11(5)：211-5)；及賦予濕黴素抗性之hygro (Santerre RF等人,(1984)Gene 30(1-3)：147-56)，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。重組DNA技術領域中通常已知之方法可常規地應用於選擇所要之重組純系，且此類方法描述於例如以下中：Ausubel FM等人(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993)；Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990)；及在Dracopoli NC等人(編), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY(1994)第12及13章中；Colbère-Garapin F等人,(1981)J Mol Biol 150：1-14，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
抗體分子之表現量可藉由載體擴增來增加(綜述參見Bebbington CR & Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, 第3卷(Academic Press, New York, 1987)，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。當表現抗體之載體系統中的標記物可擴增時，存在於宿主細胞培養物中之抑制劑的含量增加將增加標記基因複本之數目。因為擴增區與抗體基因締合，所以抗體之產生亦將增加(Crouse GF等人,(1983)Mol Cell Biol 3：257-66，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。
宿主細胞可經兩種或超過兩種本文所描述之表現載體共轉染，第一載體編碼重鏈源性多肽且第二載體編碼輕鏈源性多肽。兩種載體可含有相同之可選標記物，其使得能夠等量表現重鏈及輕鏈多肽。宿主細胞可經不同量的兩種或超過兩種表現載體共轉染。舉例而言，宿主細胞可以以下第一表現載體與第二表現載體比率中之任一者進行轉染：1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：12、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45或1：50。
或者，可使用編碼且能夠表現重鏈及輕鏈多肽兩者之單個載體。在此類情形下，應將輕鏈置放在重鏈之前以避免有毒自由重鏈過量(Proudfoot NJ(1986)Nature 322：562-565；及Köhler G(1980)PNAS 77：2197-2199，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中)。重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。表現載體可為單順反子或多順反子。多順反子核酸構築體可編碼2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個基因/核苷酸序列，或介於2-5、5-10或10-20個範圍內之基因/核苷酸序列。舉例而言，雙順反子核酸構築體可按以下次序包含啟動子、第一基因(例如本文所描述之抗體的重鏈)及第二基因及(例如本文所描述之抗體的輕鏈)。在此類表現載體中，兩種基因之轉錄均可由啟動子驅動，而來自第一基因之mRNA的轉譯可藉由帽依賴性掃描機制進行，且來自第二基因之mRNA的轉譯可藉由非帽依賴性機制(例如藉由IRES)來進行。
一旦已藉由重組表現產生本文所描述之抗體分子，則其可藉由此項技術中已知用於免疫球蛋白分子純化之任何方法來加以純化，例如藉由層析(例如離子交換、親和力，尤其藉由對蛋白質A之後特定抗原的親和力，及篩分管柱層析)、離心、溶解度差異或藉由任何其他用於蛋白質純化之標準技術。此外，本文所描述之抗體可融合於本文所描述或此項技術中另外已知之異源多肽序列以便於純化。
在具體實施例中，本文所描述之抗體經分離或經純化。一般而言，經分離之抗體為基本上不含抗原特異性與經分離之抗體不同之其他抗體的抗體。舉例而言，在一個特定實施例中，本文所描述之抗體的製劑基本上不含細胞材料及/或化學前驅物。語言「基本上不含細胞材料」包括其中抗體與自其中分離或重組地產生該抗體之細胞的細胞組分分離的抗體製劑。因此，基本上不含細胞材料之抗體包括具有少於約30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%(以乾重計)之異源蛋白質(在本文中亦稱為「污染性蛋白質」)及/或抗體變異體(例如抗體之不同轉譯後修飾形式或抗體之其他不同型式，例如抗體片段)的抗體製劑。當以重組方式產生抗體時，其一般亦基本上不含培養基，亦即培養基佔蛋白質製劑體積之小於約20%、10%、2%、1%、0.5%或0.1%。當藉由化學合成產生抗體時，其一般基本上不含化學前驅物或其他化學品，亦即，其與參與該蛋白質之合成的化學前驅物或其他化學品分離。因此，此類抗體製劑具有少於約30%、20%、10%或5%(以乾重計)的除所關注抗體以外之化學前驅物或化合物。在一個具體實施例中，本文所描述之抗體經分離或經純化。
特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體或其片段可藉由此項技術中已知用於抗體合成之任何方法來產生，例如藉由化學合成或藉由重組表現技術。除非另有指示，否則本文所描述之方法採用分子生物學、微生物學、遺傳分析、重組DNA、有機化學、生物化學、PCR、寡核苷酸合成及修飾、核酸雜交及此項技術內相關領域中的習知技術。此等技術描述於例如本文所引用之參考文獻中，且充分解釋於文獻中。參見例如Maniatis T等人,(1982)Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人,(1989), Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人, (2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Ausubel FM等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987及每年更新)；Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(1987及每年更新)Gait(編)(1984)Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach, IRL Press；Eckstein (編)(1991)Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach, IRL Press；Birren B等人(編)(1999)Genome Analysis：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
在一個具體實施例中，本文所描述之抗體為藉由涉及產生之任何手段，例如經由合成、DNA序列基因工程改造來製備、表現、產生或分離的抗體(例如重組抗體)。在某些實施例中，此類抗體包含不天然存在於動物或哺乳動物(例如人類)活體內之抗體生殖系譜系內的序列(例如DNA序列或胺基酸序列)。
在一個態樣中，本文提供一種製造特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體的方法，其包含培養本文所描述之細胞或宿主細胞。在一個實施例中，該方法活體外進行。在某一態樣中，本文提供一種製造特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之抗體的方法，其包含使用本文所描述之細胞或宿主細胞(例如，包含編碼本文所描述之抗體之多核苷酸的細胞或宿主細胞)來表現(例如以重組方式表現)該抗體。在一個特定實施例中，細胞為經分離之細胞。在一個特定實施例中，已將外源性多核苷酸引入至細胞中。在一個特定實施例中，該方法進一步包含使自細胞或宿主細胞獲得之抗體純化的步驟。
用於產生多株抗體之方法為此項技術中已知的(參見例如Short Protocols in Molecular Biology,(2002)第5版, Ausubel FM等人編, John Wiley and Sons, New York中第11章，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。
單株抗體可使用此項技術中已知之多種技術來加以製備，該等技術包括使用融合瘤、重組及噬菌體呈現技術或其組合。舉例而言，單株抗體可使用融合瘤技術來產生，該等融合瘤技術包括此項技術中已知且如在Harlow E & Lane D, Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988)中；Hammerling GJ等人, 在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681(Elsevier, N.Y., 1981)中教示之彼等技術，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。如本文所用之術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。舉例而言，單株抗體可自外源地表現本文所描述之抗體或其片段(例如此類抗體之輕鏈及/或重鏈)的宿主細胞以重組方式產生。
在具體實施例中，如本文所用之「單株抗體」為由單一細胞(例如，產生重組抗體之融合瘤或宿主細胞)產生之抗體，其中如例如由ELISA或在此項技術中或本文所提供之實例中已知的其他抗原結合或競爭性結合分析所確定，該抗體特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)。在特定實施例中，單株抗體可為嵌合抗體或人類化抗體。在某些實施例中，單株抗體為單價抗體或多價(例如二價)抗體。在特定實施例中，單株抗體為單特異性或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。本文所描述之單株抗體可例如藉由如Kohler G & Milstein C (1975)Nature 256：495(其以全文引用之方式併入本文中)中所描述之融合瘤方法來加以製造，或舉例而言，可例如使用如本文所描述之技術而自噬菌體庫中分離。用於製備純系細胞株及由其表現之單株抗體的其他方法為此項技術中熟知的(參見例如Short Protocols in Molecular Biology,(2002)第5版, Ausubel FM等人, 同前文獻中第11章)。
如本文所用，當抗體包含至少兩個(例如兩個或超過兩個)單價結合域，各單價結合域均能夠結合於抗原上之抗原決定基時，該抗體多價(例如二價)結合於該抗原。各單價結合域可結合於抗原上之相同或不同抗原決定基。
用於使用融合瘤技術產生及篩選特異性抗體之方法為此項技術中常規且熟知的。舉例而言，在融合瘤方法中，對小鼠或其他適當宿主動物(諸如綿羊、山羊、兔、大鼠、倉鼠或獼猴)進行免疫以引發產生或能夠產生將特異性結合於免疫所用蛋白質(例如CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137))之抗體的淋巴球。或者，淋巴球可在活體外經免疫。隨後使用適合之融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴球與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞(Goding JW(編), Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, 第59-103頁(Academic Press, 1986)，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。另外，RIMMS(重複免疫多個位點)技術可用於對動物進行免疫(Kilpatrick KE等人,(1997)Hybridoma 16：381-9，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。
在某些實施例中，可用抗原(例如CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137))對小鼠(或其他動物，諸如大鼠、猴、驢、豬、綿羊、倉鼠或犬)進行免疫，且一旦偵測到免疫反應，例如在小鼠血清中偵測到對該抗原具有特異性之抗體，則採集小鼠脾臟且分離脾細胞。隨後藉由熟知之技術將脾細胞融合於任何適合之骨髓瘤細胞，例如來自可購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC® )(Manassas, VA)之細胞株SP20的細胞，以形成融合瘤。選擇融合瘤且藉由極限稀釋法來對其進行選殖。在某些實施例中，採集經免疫之小鼠的淋巴結且將其與NS0骨髓瘤細胞融合。
由此製備之融合瘤接種且生長於適合培養基中，該培養基較佳含有一或多種抑制未融合之親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞不具有酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質會阻止缺乏HGPRT之細胞生長。
具體實施例採用高效融合、支持所選產抗體細胞穩定高量產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感的骨髓瘤細胞。在此等骨髓瘤細胞株當中為鼠類骨髓瘤細胞株，諸如可購自沙克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center), San Diego, CA, USA的NS0細胞株或來源於MOPC-21及MPC-11之彼等細胞株，及可購自美國典型培養物保藏中心, Rockville, MD, USA的SP-2或X63-Ag8.653細胞。對於人類單株抗體之產生，亦已描述人類骨髓瘤及小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株(Kozbor D(1984)J Immunol 133：3001-5；Brodeur等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中)。
對於針對CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之單株抗體的產生，分析其中生長融合瘤細胞之培養基。由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性藉由此項技術中已知之方法(例如免疫沈澱)或藉由活體外結合分析(諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))來加以確定。
在鑑別出產生具有所要特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞之後，可藉由限制稀釋法程序對純系進行次選殖且藉由標準方法使其生長(Goding JW(編), Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, 同前文獻)。用於此目的之適合的培養基包括例如D-MEM或RPMI 1640培養基。另外，融合瘤細胞可在動物中活體內生長為腹水腫瘤。
由次純系所分泌之單株抗體可藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如蛋白質A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析而自培養基、腹水液或血清中分離。
本文所描述之抗體包括例如識別特定CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)且可藉由熟習此項技術者已知之任何技術來產生的抗體片段。舉例而言，本文所描述之Fab及F(ab')2 片段可藉由使用酶，諸如番木瓜蛋白酶(用於產生Fab片段)或胃蛋白酶(用於產生F(ab')2 片段)對免疫球蛋白分子進行蛋白水解裂解來產生。Fab片段對應於抗體分子之兩個相同臂中之一者，且含有與重鏈之VH及CH1域配對的完整輕鏈。F(ab')2 片段含有抗體分子中的在鉸鏈區中由二硫鍵連接之兩個抗原結合臂。
此外，本文所描述之抗體亦可使用此項技術中已知之各種噬菌體呈現方法來產生。在噬菌體呈現方法中，功能抗體域呈現於攜載編碼其之多核苷酸序列之噬菌體粒子的表面上。特定而言，編碼VH及VL域之DNA序列自動物cDNA庫(例如，受感染組織之人類或鼠類cDNA庫)擴增。藉由PCR用scFv連接子將編碼VH及VL域之DNA重組在一起，且將其選殖至噬菌粒載體中。載體在大腸桿菌中電穿孔，且該大腸桿菌經輔助噬菌體感染。此等方法中所用之噬菌體通常為絲狀噬菌體，包括fd及M13，且VH及VL域通常以重組方式融合於噬菌體基因III或基因VIII。表現結合於特定抗原之抗原結合域的噬菌體可用抗原，例如使用經標記之抗原或結合或捕獲於固體表面或珠粒之抗原來加以選擇或鑑別。可用於製造本文所描述之抗體的噬菌體呈現方法之實例包括以下中所揭示之彼等方法：Brinkman U等人,(1995)J Immunol Methods 182：41-50；Ames RS等人,(1995)J Immunol Methods 184：177-186；Kettleborough CA等人,(1994)Eur J Immunol 24：952-958；Persic L等人,(1997)Gene 187：9-18；Burton DR & Barbas CF(1994)Advan Immunol 57：191-280；PCT申請案第PCT/GB91/001134號；國際公開案第WO 90/02809號、第WO 91/10737號、第WO 92/01047號、第WO 92/18619號、第WO 93/1 1236號、第WO 95/15982號、第WO 95/20401號及第WO 97/13844號；以及美國專利第5,698,426號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,750,753號、第5,821,047號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,516,637號、第5,780,225號、第5,658,727號、第5,733,743號及第5,969,108號，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
如上文參考文獻中所描述，在噬菌體選擇之後，可分離來自該噬菌體之抗體編碼區且將其用於產生完整抗體(包括人類抗體)或任何其他所要抗原結合片段，且在任何所要宿主(包括例如如下文所描述之哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌)中進行表現。以重組方式產生諸如Fab、Fab'及F(ab')2 片段之抗體片段的技術亦可使用此項技術中已知之方法來加以採用，諸如使用PCT公開案第WO 92/22324號；Mullinax RL等人,(1992)BioTechniques 12(6)：864-9：Sawai H等人,(1995)Am J Reprod Immunol 34：26-34；及Better M等人,(1988)Science 240：1041-1043中所揭示之彼等方法，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，為了產生完整抗體，包括VH或VL核苷酸序列、限制位點及保護該限制位點之側接序列的PCR引子可用於使來自模板(例如scFv純系)之VH或VL序列擴增。利用熟習此項技術者已知之選殖技術，可將經PCR擴增之VH域選殖至表現VH恆定區之載體中，且可將經PCR擴增之VL域選殖至表現VL恆定區(例如人類κ或λ恆定區)之載體中。亦可將VH及VL域選殖至一個表現必要恆定區之載體中。隨後使用熟習此項技術者已知之技術將重鏈轉化載體及輕鏈轉化載體共轉染至細胞株中以產生表現全長抗體(例如IgG)之穩定或瞬時細胞株。
嵌合抗體為其中抗體之不同部分來源於不同免疫球蛋白分子的分子。舉例而言，嵌合抗體可含有小鼠或大鼠單株抗體之可變區融合於人類抗體之恆定區。用於產生嵌合抗體之方法為此項技術中已知的。參見例如Morrison SL(1985)Science 229：1202-7；Oi VT & Morrison SL(1986)BioTechniques 4：214-221；Gillies SD et al.,(1989)J Immunol Methods 125：191-202；及美國專利第5,807,715號、第4,816,567號、第4,816,397號及第6,331,415號，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
人類化抗體能夠結合於預定抗原，且其包含基本上具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的構架區及基本上具有非人類免疫球蛋白(例如鼠類免疫球蛋白)之胺基酸序列的CDR。在特定實施例中，人類化抗體亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3、及CH4區。人類化抗體可選自任何類別之免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，以及任何同型，包括IgG1 、IgG2 、IgG3 及IgG4 。人類化抗體可使用此項技術中已知之多種技術來產生，包括(但不限於)CDR接枝(歐洲專利第EP 239400號國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號)、鑲飾或表面重修(歐洲專利第EP 592106號及第519596號；Padlan EA(1991)Mol Immunol 28(4/5)：489-498；Studnicka GM等人,(1994)Prot Engineering 7(6)：805-814；及Roguska MA等人,(1994)PNAS 91：969-973)、鏈改組(美國專利第5,565,332號)及例如以下中所揭示之技術：美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、國際公開案第WO 93/17105號；Tan P等人,(2002)J Immunol 169：1119-25；Caldas C等人,(2000)Protein Eng. 13(5)：353-60；Morea V等人,(2000)Methods 20(3)：267-79；Baca M等人,(1997)J Biol Chem 272(16)：10678-84；Roguska MA等人,(1996)Protein Eng 9(10)：895 904；Couto JR等人,(1995)Cancer Res. 55(23增刊)：5973s-5977s；Couto JR等人,(1995)Cancer Res 55(8)：1717-22；Sandhu JS(1994)Gene 150(2)：409-10及Pedersen JT等人,(1994)J Mol Biol 235(3)：959-73，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。亦參見美國申請案公開案第US 2005/0042664 A1號(2005年2月24日)，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
已描述用於製造多特異性(例如雙特異性抗體)之方法，參見例如美國專利第7,951,917號；第7,183,076號；第8,227,577號；第5,837,242號；第5,989,830號；第5,869,620號；第6,132,992號及第8,586,713號，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
單域抗體(例如不具有輕鏈之抗體)可藉由此項技術中熟知之方法產生。參見Riechmann L & Muyldermans S(1999)J Immunol 231：25-38；Nuttall SD等人,(2000)Curr Pharm Biotechnol 1(3)：253-263；Muyldermans S,(2001)J Biotechnol 74(4)：277-302；美國專利第6,005,079號；及國際公開案第WO 94/04678號、第WO 94/25591號及第WO 01/44301號，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
此外，特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗原之抗體繼而可用於使用熟習此項技術者熟知之技術來產生「模擬」抗原之抗個體基因型抗體。參見例如Greenspan NS & Bona CA(1989)FASEB J 7(5)：437-444；及Nissinoff A(1991)J Immunol 147(8)：2429-2438，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。
在特定實施例中，與本文所描述之抗CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗體結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之相同抗原決定基的本文所描述之抗體為人類抗體。在特定實施例中，競爭性地阻斷(例如以劑量依賴性方式)本文所描述之任一抗體與CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)結合的本文所描述之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之任何方法來產生。舉例而言，可使用不能表現功能性內源性免疫球蛋白但可表現人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠。特定而言，可將人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因複合物隨機或藉由同源重組而引入至小鼠胚胎幹細胞中。或者，除人類重鏈及輕鏈基因以外，亦可將人類可變區、恆定區及多樣性區引入至小鼠胚胎幹細胞中。可在藉由同源重組引入人類免疫球蛋白基因座的情況下使小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因分開或同時變為非功能。特定而言，JH 區之同型接合子缺失阻止內源性抗體產生。使經修飾之胚胎幹細胞擴增且將其顯微注射入囊胚中以產生嵌合小鼠。隨後飼養嵌合小鼠一產生表現人類抗體之同型接合子後代。以普通方式用所選抗原，例如抗原(例如CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137))之全部或一部分對轉殖基因小鼠進行免疫。針對該抗原之單株抗體可使用習知融合瘤技術而自經免疫之轉殖基因小鼠獲得。轉殖基因小鼠具有之人類免疫球蛋白轉殖基因在B細胞分化期間重排，且隨後進行類別轉換及體細胞突變。因此，使用此類技術，有可能產生治療學上適用之IgG、IgA、IgM及IgE抗體。用於產生人類抗體之此技術的概述參見Lonberg N & Huszar D(1995)Int Rev Immunol 13：65-93，該文獻以全文引用之方式併入本文中。用於產生人類抗體及人類單株抗體之此技術及用於產生此類抗體之方案的詳細討論參見例如國際公開案第WO 98/24893號、第WO 96/34096號及第WO 96/33735號；及美國專利第5,413,923號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,569,825號、第5,661,016號、第5,545,806號、第5,814,318號及第5,939,598號，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。能夠產生人類抗體之小鼠的實例包括XenomouseTM (Abgenix, Inc.；美國專利第6,075,181號及第6,150,184號)、HuAb-MouseTM (Mederex, Inc./Gen Pharm；美國專利第5,545,806號及第5,569, 825號)、Trans Chromo MouseTM (Kirin)及KM MouseTM (Medarex/Kirin)，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
特異性結合於CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)之人類抗體可藉由此項技術中已知之多種方法(包括上文所描述之噬菌體呈現方法)使用來源於人類免疫球蛋白序列之抗體庫來製造。亦參見美國專利第4,444,887號、第4,716,111號及第5,885,793號；以及國際公開案第WO 98/46645號、第WO 98/50433號、第WO 98/24893號、第WO 98/16654號、第WO 96/34096號、第WO 96/33735號及第WO 91/10741號，該等文獻均以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，人類抗體可使用小鼠-人類融合瘤來產生。舉例而言，可將用艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus；EBV)轉型之人類外周血液淋巴球與小鼠骨髓瘤細胞融合以產生分泌人類單株抗體之小鼠-人類融合瘤，且可篩選此等小鼠-人類融合瘤以確定分泌特異性結合於靶抗原(例如CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137))之人類單株抗體的融合瘤。此類方法為已知的且描述於此項技術中，參見例如Shinmoto H等人,(2004)Cytotechnology 46：19-23；Naganawa Y等人,(2005)Human Antibodies 14：27-31，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。1.6 套組
亦提供包含本文所描述之一或多種抗體或其醫藥組合物或綴合物的套組。在一個具體實施例中，本文提供一種醫藥封裝或套組，其包含一或多個填充有本文所描述之醫藥組合物成分中之一或多者，諸如一或多種本文所提供之抗體的容器。在某些實施例中，套組含有本文所描述之醫藥組合物及任何預防劑或治療劑，諸如本文所描述之彼等預防劑或治療劑。在某些實施例中，套組可含有T細胞有絲分裂原，諸如例如植物凝血素(PHA)及/或佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate；PMA)，或TCR複合物刺激性抗體，諸如抗CD3抗體及抗CD28抗體。視情況與此類容器相關聯的可為呈由管理醫藥或生物產品之製造、使用或銷售的政府機構所規定之形式的注意事項，該注意事項反映由人類投藥之製造、使用或銷售機構之批准。
亦提供可用於上文方法中之套組。在一個實施例中，套組在一或多個容器中包含本文所描述之抗體，較佳地包含經純化之抗體。在一個具體實施例中，本文所描述之套組含有基本上經分離之CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗原作為對照物。在另一個具體實施例中，本文所描述之套組進一步包含不與CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗原反應之對照抗體。在另一個具體實施例中，本文所描述之套組含有一或多個用於偵測抗體與CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗原之結合的元件(例如該抗體可與可偵測受質綴合，該可偵測受質諸如螢光化合物、酶受質、放射性化合物或發光化合物；或識別第一抗體之第二抗體可與可偵測受質綴合)。在具體實施例中，本文所提供之套組可包括以重組方式產生或化學合成之CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗原。套組中所提供之CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗原亦可附接於固體支撐物。在一個更具體實施例中，上文所描述之套組的偵測手段包括其上附接CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗原之固體支撐物。此類套組亦可包括未附接的經報導體標記之抗人類抗體或抗小鼠/大鼠抗體。在此實施例中，抗體與CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)抗原之結合可藉由該經報導體標記之抗體的結合來加以偵測。在一個實施例中，本發明係關於本發明之套組的用途，其用於在生物樣品中活體外分析及/或偵測CD137(例如人類CD137或食蟹獼猴CD137)。2. 實例
此部分(亦即部分6)中之實例作為說明而非作為限制提供。2.1 實例 1 ：抗 CD137 抗體之表徵
此實例描述對結合於人類CD137之抗體的表徵。特定而言，表徵特異性結合於人類CD137且刺激其功能之BA001抗體。BA001之可變區的序列資訊提供於表1中。2.1.1 抗人類 CD137 抗體結合於表現 CD137 之 細胞
如圖1A及1B中所示，在多種細胞類型中測試人類抗CD137 IgG1抗體BA001結合於表現人類CD137或食蟹獼猴CD137之細胞的能力。經工程改造之 Jurkat 細胞
在一個實例中，Jurkat細胞經工程改造以構成性表現人類CD137或食蟹獼猴CD137，且用於分析抗體BA001之結合。簡言之，將經轉染之Jurkat細胞以5×104 個細胞/孔接種在96孔圓底培養盤中，且與抗體(亦即BA001或同型對照，處於指定濃度下)之連續稀釋液一起在4℃下培育25分鐘(圖1A及1B之左側圖)。洗滌細胞兩次，且與抗人類λ-PE二級抗體(Life Technologies，Cat #MH10614)一起培育。洗滌細胞且將其懸浮於80 μl在PBS中製備之2%多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)中。用BD FACS Canto採集資料，且使用BD FACSDiva軟體來對其進行分析。
如圖1A及1B(左側圖)中所示，BA001抗體結合於表現人類CD137或食蟹獼猴CD137之Jurkat細胞。活化 CEM/C1 T 細胞
在第二實例中，測試BA001結合於表現內源性人類CD137之活化人類CEM/C1 T細胞的能力。簡言之，藉由與10 ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)及1 µg/ml離子黴素一起在37℃下培育18小時來刺激CEM/C1細胞。將經刺激之細胞以1×105 個細胞/孔接種在96孔圓底培養盤中，且與抗體(亦即BA001或同型對照，處於圖1A中間圖中所示之濃度下)之連續稀釋液一起在4℃下培育25分鐘。洗滌細胞兩次，且與抗人類λ-PE二級抗體(Life Technologies，Cat #MH10614)一起培育。洗滌細胞且將其懸浮於80 μl在PBS中製備之2%多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)中。用BD FACS Canto採集資料，且使用BD FACSDiva軟體來對其進行分析。
如圖1A之中間圖中所示，BA001抗體結合於表現內源性CD137之活化CEM/C1細胞。活化原代 CD8+T 細胞
在第三實例中，測試BA001結合於活化人類或食蟹獼猴CD8+T細胞之能力。簡言之，藉由與10 ng/ml PMA及1 µg/ml離子黴素一起在37℃下培育18小時來刺激人類或食蟹獼猴PBMC。將經刺激之細胞以1×105 個細胞/孔接種在96孔圓底培養盤中，且與抗體(亦即BA001或同型對照，處於圖1A及1B右側圖中所示之濃度下)及抗人類CD8-APC(Biolegend，Cat# 311049)之連續稀釋液一起在4℃下培育25分鐘。洗滌細胞兩次，且與F(ab')2 山羊抗人類IgG-PE二級抗體(Jackson ImmunoResearch，Cat# 109-116-098)一起培育。洗滌細胞且將其懸浮於80 μl在PBS中製備之2%多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)中。用BD FACS Canto採集資料，且隨後使用Flowjo V10對其進行分析(在CD8+T細胞上閘控)。
如圖1A-1B之右側圖中所示，BA001抗體結合於表現內源性CD137之活化人類或食蟹獼猴CD8+T細胞。2.1.2 抗 CD137 抗體不阻斷 CD137L 與 CD137 結合 CD137L 與 CD137/BA001-F(ab ')2 複合物之結合
表面電漿子共振用於評估CD137L結合於與BA001之F(ab')2 片段(BA001-F(ab')2 )複合之CD137的能力。BA001-F(ab')2 使用FragIT™套組，Genovis(Cat #A2-FR2-100)來產生。在25℃下使用BIAcore® T200(GE Healthcare)及1×HBS-P+(GE Healthcare，BR-1006-71)作為操作緩衝液來分析所有相互作用。
在一個實例中，將BA001-F(ab')2 固定在晶片上，且隨後結合於CD137，其後准許CD137L結合於CD137/BA001-F(ab')2 複合物。首先，將抗人類Fab捕獲抗體(GE Healthcare，Fab捕獲套組，28-9583-25)固定在CM5系列S感測器晶片(GE Healthcare，29-1496-03)之流動槽2上。隨後將BA001-F(ab')2 在操作緩衝液中稀釋為6.75 µg/ml，且以10 µl/min固定於流動槽1持續120秒。作為用於量測CD137或CD137L之非特異性相互作用的對照物，晶片之流動槽1僅僅與抗人類Fab捕獲抗體結合。在捕獲BA001-F(ab')2 之後，使100 nM CD137(Acro Biosystem，41B-H5227)以30 µl/min流經晶片之兩個流動槽持續90秒，後接400秒解離。隨後使200 nM CD137L(R&D Systems，# 2295-4L-025)以30 µl/min流經兩個流動槽持續90秒，後接400秒解離時間。
流動槽2所獲得之反應減流動槽1所獲得之反應展示於圖2A中。當使CD137流經流動槽2時，偵測到反應信號增加，展示CD137與BA001-F(ab')2 之結合。發現CD137自BA001-F(ab')2 極緩慢解離。隨後使CD137L流經流動槽2，且觀測到信號反應增加，展示CD137L與CD137/BA001-F(ab')2 複合物之結合。此等結果展示BA001-F(ab')2 與CD137之結合不阻斷CD137L與CD137之結合。
在另一個實例中將過量CD137(110 nM)與BA001-F(ab')2 (6 µg/ml，54 nM)預混以形成CD137/BA001-F(ab')2 複合物。隨後將複合物以10 µl/min固定在CM5系列S感測器晶片(GE Healthcare，29-1496-03)之流動槽3上持續180秒，後接60秒解離。隨後使60 nM CD137L以50 µl/min流經所有流動槽持續90秒，後接400秒解離時間。作為用於量測CD137或CD137L之非特異性相互作用的對照物，晶片之流動槽1僅僅與抗人類Fab捕獲抗體結合。
流動槽3所獲得之反應減流動槽1所獲得之反應展示於圖2B中。此等資料展現儘管BA001-F(ab')2 以高親和力結合於CD137，但此相互作用不削弱CD137L與CD137之結合。
對BA001及來源於BA001之Fab片段(BA001-Fab；資料未展示)亦觀測到與此實例中所描述之結果類似的結果。因此，BA001為非配位體阻斷性抗CD137抗體。BA001 不阻斷細胞表面 CD137L 與細胞表面 CD137 結合
為了確定BA001是否可阻斷CD137L與細胞表面上(亦即在更符合生理學之設定中)中所表現CD137之間的結合，使用Xiao等人(JEM 211(5)：943-959, 2014；該文獻以全文引用之方式併入本文中)中所描述之方法進行細胞綴合分析。簡言之，用人類CD137轉染一組Jurkat細胞(Jurkat-CD137)，且用人類CD137L轉染另一組Jurkat細胞(Jurkat-CD137L)。用紅色染料PKH26(Sigma Cat #PKH26GL-1KT)對表現CD137之Jurkat細胞進行染色，且用綠色染料PKH67(Sigma Cat #PKH67GL-1KT)對表現CD137L之Jurkat細胞進行染色。將經紅色染料標記之Jurkat-CD137細胞(1×105 個/孔)與50 µg/ml之BA001、參考抗CD137抗體#1、參考抗CD137抗體#2或同型對照一起在圓底96孔培養盤中在室溫下培育30分鐘。隨後添加經綠色染料標記之Jurkat-CD137L細胞(1×105 個/孔)，且在37℃下培育45分鐘。細胞與細胞結合/綴合物形成藉由流式細胞量測術使用FACS Canto及BD FACSDiva軟體來進行分析。PE信道用於紅色染料，且FITC信道用於綠色染料。由此，在表現CD137之細胞與表現CD137L之細胞之間的結合將引起雙正信號(亦即紅+綠)，其展現所偵測之細胞大小增加。此效應將由配位體阻斷性抗CD137抗體減小或消除。
圖3A展示BA001及參考抗CD137抗體#2不阻斷細胞上之CD137L與細胞上之CD137結合。相比之下，參考抗CD137抗體#1阻斷配位體結合。
在類似設定中，分別用PKH26紅色螢光細胞連接物或PKH67綠色螢光細胞連接物對表現CD137L及表現CD137之細胞進行染色，且將其以4×106 個細胞/毫升之濃度懸浮於漢克氏平衡鹽溶液(Hanks'balanced salt solution；HBSS)中。在HBSS中以3×工作濃度製備BA001、參考抗CD137抗體#1、參考抗CD137抗體#2或相應同型對照抗體之3倍連續稀釋液。在U底96孔培養盤中，將25 μL Jurkat-CD137細胞與25 μL抗CD137抗體一起在室溫下培育30分鐘，且添加表現CD137L之細胞。或者，將25 μL Jurkat-CD137細胞與25 μL表現CD137L之細胞一起在室溫下培育30分鐘，且添加抗CD137抗體。將培養盤在37℃及5% CO2下培育45分鐘，且藉由流式細胞量測術使用BD Fortessa細胞計數器將表現CD137L之細胞及表現CD137之細胞的綴合物鑑別為PE及FITC雙正性。
如圖3B及3C中所示，當在細胞共培養之前(圖3B)或之後(圖3C)添加抗CD137抗體時，BA001及參考抗CD137抗體#2不影響表現CD137之細胞與表現CD137L之細胞的綴合。相比之下，參考抗CD137抗體#1抑制細胞綴合，指示此抗體阻斷細胞表面CD137L與細胞表面CD137結合。2.2 實例 2 ： 抗 CD137 抗體之促效活性具有交聯依賴性及配位體依賴性 2.2.1 抗 CD137 抗體僅在抗體交聯存在下誘導 NF-κB 驅動之基因表現
為了表徵BA001使CD137信號傳導活化之能力，產生併入有(i)NFκB-螢光素酶報導體構築體及(ii)用於人類或食蟹獼猴CD137之表現構築體的Jurkat報導體細胞。由此，報導體細胞表面上之CD137的活化誘導下游信號傳導，該信號傳導在NFκB啟動子之控制下驅動螢光素酶之表現。
發現BA001使CD137活化之能力依賴於BA001交聯。實際上，未交聯之BA001不能刺激經工程改造以表現CD137及NF-κB螢光素酶報導體構築體之Jurkat細胞中的報導體活性(資料未展示)。為了表徵交聯依賴性，將BA001、同型對照抗體及參考抗CD137抗體#2與劑量遞增(dose titration)之交聯劑(Fcγ片段特異性AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗人類IgG(Jackson ImmunoResearch，109-006-098))一起培育。以50,000個細胞/孔之密度接種Jurkat報導體細胞，且將其與2 μg/mL BA001、同型對照抗體或參考抗CD137抗體#2一起培育4小時。NF-kB活性藉由Nano-Glo®螢光素酶分析系統(Promega N1120)來加以量測。
如圖4A中所示，當BA001以高於1：1之交聯劑比抗體比率交聯時，其在此分析中獲得活性。相比之下，參考抗CD137抗體#2在無交聯劑的情況下即具活性，且隨著交聯劑之量增加而逐漸喪失活性。
進一步評定BA001在於無人工抗體交聯劑存在下抗體簇聚時是否能夠對CD137進行促效。抗體簇聚藉由經工程改造以表現FcγRIIIa(CD16)之CHO細胞來加以誘導。簡言之，將密度為50,000個細胞/孔之Jurkat報導體細胞與劑量遞增的經工程改造以表現CD16之CHO細胞或對照CHO細胞一起，在2 μg/mL之BA001、同型對照抗體或在Fc區中具有N297A突變之BA001變異體存在下共培養。在4小時培育之後，NF-kB活性藉由Nano-Glo®螢光素酶分析系統(Promega N1120)來加以量測。
如圖4B中所示，單獨的BA001不使CD137信號傳導活化，且單獨的表現CD16之CHO細胞作用有限。然而，BA001與表現CD16之CHO細胞的組合協同使報導體細胞活化。N297A突變消除BA001刺激CD137信號傳導之能力，很可能係因為N297A Fc變異體不能接合CHO細胞上表現之CD16，且因此不能進行抗體簇聚。此結果表明BA001可在其中存在表現CD16之細胞(例如抗原呈遞細胞或NK細胞)的微環境中選擇性地具有活性。2.2.2 抗 CD137 抗體在完整 PBMC 的情況下 增強 T 細胞 功能但不在經純化之 T 細胞的情況下 增強 T 細胞 功能 BA001 在 CD137L 存在下提昇人類 T 細胞 之 IL-2 分泌
在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激後評定BA001對原代人類PBMC之促效活性。簡言之，在37℃下在抗體(亦即BA001、參考抗CD137抗體#1或#2、或同型對照抗體，處於圖5中所示之濃度下)之連續稀釋液存在下用200 ng/ml SEA超抗原(Toxin Technologies，Cat #AT101red)刺激低溫保存之PBMC持續5天。藉由AlphaLISA(Perkin Elmer，Cat #AL221F)分析培養物上清液中之IL-2濃度。各條件重複測試五次。
如圖5中所示，抗CD137抗體BA001(IgG1)以劑量依賴性方式增加人類PBMC中之IL-2產生，其增加水準與參考抗CD137抗體之彼等增加水準相當或更大。BA001 在無 CD137L 存在下不提昇經純化之人類 T 細胞的 IL-2 分泌
評定BA001在無表現CD137L之抗原呈遞細胞存在下對經純化經刺激人類T細胞的促效活性。簡言之，遵循製造商說明書使用MACS Pan T細胞分離套組(人類)用autoMACS管柱自低溫保存之PBMC純化T細胞。以1×106 個細胞/孔將經純化之T細胞接種至以2 µg/ml預塗有低內毒素且無疊氮化物(low endotoxin, azide-free；LEAF)之抗CD3抗體(Biolegend Cat #300432)的96孔培養盤中。用F(ab')2 片段山羊抗人類IgG(傑克遜，Cat# 109-006-098)使5 µg/ml之抗CD137抗體(BA001，參考抗CD137抗體#1或參考抗CD137抗體#2)或同型對照交聯，且隨後將其添加至培養盤中。將細胞在37℃下培育三天。隨後藉由AlphaLISA(Perkin Elmer，Cat #AL221F)分析培養物上清液中之IL-2濃度。各條件重複測試六次。
如圖6A-6B中所示，相對於同型對照，BA001不提昇經純化之T細胞的IL-2分泌增加。相比之下，兩種參考抗CD137抗體均誘導經純化之T細胞的IL-2分泌升高。圖6C展示經純化之T細胞不表現可偵測之量的CD137L。
綜合而言，部分6.2.2中之資料展示，如在完整PBMC中，BA001之促效活性在CD137L(例如，藉由表現CD137L之細胞產生)存在下升高。預期BA001之促效活性可能需要在所用條件下存在CD137L。因此，此等資料展現BA001使表現CD137之細胞活化的能力可具有配位體依賴性。2.2.3 抗 CD137 抗體僅在 CD137L 存在下誘導 NFκB 驅動之基因表現 BA001 在 NFκB- 螢光素酶報導體細胞中之配位體依賴性
在部分6.2.1中展示，BA001活性在無CD137L存在下依賴於交聯。進一步評定交聯劑在CD137L存在下之效應。簡言之，視情況向上文所描述之培養系統中添加1 μg/mL CD137L(重組人類4-1BB配位體/TNFSF9(His標籤)，R&D system，2295-4L-025/CF)，且類似地量測NF-κB活性。
如圖7A中所示，在CD137L存在下，BA001仍需要交聯劑以在報導體分析中得到活性，且CD137L及交聯之效應為累加的。當交聯劑比抗體比率為約1：10至1：1時，BA001僅在CD137L存在下展示活性。
為了確認外源性CD137L為此實驗系統中CD137L之唯一來源，藉由流式細胞量測術分析Jurkat報導體細胞。簡言之，使表現CD137及表現CD137L之Jurkat細胞解凍，且將其在補充有10%胎牛血清及1 µg/mL嘌呤黴素之RPMI培養基中培養4或24小時。對於藉由流式細胞量測術分析，將3×104 個細胞接種在96孔U底培養盤中，用補充有2%胎牛血清之冷磷酸鹽緩衝鹽水洗滌兩次，且用與藻紅素(PE)綴合之抗CD137抗體、與別藻藍蛋白(APC)綴合之抗CD137L抗體及近IR live/dead染料加以標記。在染色對照組中，細胞用與PE綴合之無關同型對照抗體、與APC綴合之無關同型對照抗體及live/dead染料加以標記。
如圖7B中所示，表現CD137之Jurkat報導體細胞表現高量之CD137而非CD137L。相比之下，表現CD137L之Jurkat細胞表現高量之CD137L而非CD137。
在下文使用Jurkat報導體細胞之所有NF-κB活化分析中，抗CD137抗體及其同型對照抗體以1：2之比率交聯。
在一個實例中，將表現人類CD137之Jurkat NFκB-螢光素酶報導體細胞(50,000個細胞/孔)與BA001或同型對照之連續稀釋液一起在存在或不存在可溶性人類CD137L(125 ng/ml)的情況下在37℃下培育四小時。螢光素酶表現使用Nano-Glo®螢光素酶分析系統(Promega Cat #N1120)及EnVision培養盤讀取器來加以偵測。如圖8A中所示，BA001在無CD137L存在下不誘導NFκB-螢光素酶表現。在CD137L存在下，BA001能夠以劑量依賴性方式誘導NFκB-螢光素酶表現(圖8B)。
在一個實例中，將表現食蟹獼猴CD137之Jurkat NFκB-螢光素酶報導體細胞(50,000個細胞/孔)與BA001或同型對照之連續稀釋液一起在存在或不存在可溶性人類CD137L(150 ng/ml)的情況下在37℃下培育四小時。螢光素酶表現使用Nano-Glo®螢光素酶分析系統(Promega Cat #N1120)及EnVision培養盤讀取器來加以偵測。如圖8C中所示，BA001在無CD137L存在下不誘導NFκB-螢光素酶表現。在CD137L存在下，BA001能夠以劑量依賴性方式誘導NFκB-螢光素酶表現(圖8D)。
因此，此等資料展示，BA001僅在對應CD137L存在下誘導人類或食蟹獼猴的經由NFκB之CD137信號傳導。BA001 與 CD137L 合作以提昇 CD137 信號傳導
在另一個實例中，將表現人類CD137之Jurkat NFκB-螢光素酶報導體細胞(50,000個細胞/孔)與2 µg/ml 抗CD137抗體(BA001、參考抗CD137抗體#1或參考抗CD137抗體#2)或同型對照一起在可溶性人類CD137L之連續稀釋液(0-1000 ng/ml，如圖9A-9C中所示)存在下在37℃下培育四小時。在一組樣品中，在CD137L之前添加抗CD137抗體(圖9A)。在第二組樣品中，同時添加抗CD137抗體及CD137L(圖9B)。在第三組樣品中，在抗CD137抗體之前添加CD137L(圖9C)。螢光素酶表現使用Nano-Glo®螢光素酶分析系統(Promega Cat #N1120)及EnVision培養盤讀取器來加以偵測。
如圖9A-9C中所示，CD137L以劑量依賴性方式誘導NFκB-螢光素酶表現。BA001以配位體依賴性方式誘導NFκB-螢光素酶表現，且顯著增加報導體表現超出在較高配位體濃度下對同型對照所偵測到之報導體表現。無論抗體及配位體之添加次序如何，均觀測到此效應(圖9A-9C，左側圖)。相比之下，無論所存在之CD137L的濃度如何(例如在無CD137L存在下)且無論抗體及配位體之添加次序如何，配位體阻斷性參考抗CD137抗體#1驅動大致相同之報導體表現量(圖9A-9C，中間圖)。當在配位體之前添加抗體時(圖9A，右側圖)，無論所存在之CD137L的濃度如何(例如在無CD137L存在下)，部分/非配位體阻斷性參考抗CD137抗體#2亦驅動類似之報導體表現量，但當一起添加抗體及配位體(圖9B，右側圖)時或當在抗體之前添加配位體時(圖9C，右側圖)，展示在較高CD137L濃度下，報導體表現顯著減少。2.3 具有不同 Fc 區 之抗 CD137 抗體的表徵
此實例分析Fc/Fc受體相互作用對抗CD137抗體BA001之功能活性的影響。特定而言，表現具有各種Fc主鏈的BA001之VH區，該等主鏈包括IgG2及IgG4以及其中Fc區包含N297A或S267E/L328F(SELF)突變(在根據EU編號系統編號的情況下)之IgG1主鏈及其中Fc區包含N297A突變之IgG2主鏈。如此項技術中已知，IgG1 N297A及IgG2 N297A變異體攜載Fc緘默突變，其消除FcγR接合且因此阻斷抗體經由FcγR之ADCC/ADCP潛能或交聯。IgG1 SELF Fc變異體展現FcγRIIIa結合減弱且FcγRIIb結合增強，由此降低ADCC/ADCP但增強抗體經由FcγRIIb之交聯。潛能在一些情況下，本文所描述之抗CD137抗體之重鏈序列的N端殘基為麩醯胺酸。在一些情況下，本文所描述之抗CD137抗體之重鏈序列的N端殘基為焦麩胺酸鹽(例如，歸因於轉譯後處理)。
抗體BA001(IgG1)包含有包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。抗體BA001 IgG1 N297A(亦即BA001之IgG1 N297A變異體)包含有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。抗體BA001 IgG1 SELF(亦即BA001之IgG1 S267E/L328F變異體)包含有包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。抗體BA001 IgG2(亦即BA001之IgG2變異體)包含有包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。抗體BA001 IgG2 N297A(亦即BA001之IgG2 N297A變異體)包含有包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。抗體BA001 IgG4(亦即BA001之IgG4變異體)包含有包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在一些情況下，包括IgG4 Fc區之抗體(例如抗體BA001 IgG4)包括可增加重鏈穩定性之S228P突變。隨後如下文所描述在功能分析中測試BA001之此等Fc變異體。2.3.1 原代人類 PBMC 中之 Fc 變異體功能性
在SEA刺激後評定上文所描述之BA001 Fc變異體對原代人類PBMC的功能活性。簡言之，在37℃下在BA001 Fc變異體或對應同型對照抗體之連續稀釋液存在下用200 ng/ml SEA超抗原(Toxin Technologies，Cat #AT101red)刺激低溫保存之PBMC持續5天。藉由AlphaLISA(Perkin Elmer，Cat #AL221F)分析培養物上清液中之IL-2濃度。各條件重複測試五次。
如圖10A中所示，BA001 IgG1及BA001 IgG1 SELF在經SEA刺激之原代人類PBMC中各自誘導強IL-2表現，其可歸因於此等變異體之抗體交聯增強。相比之下，不形成抗體交聯之BA001 IgG1 N297A及BA001 IgG2 N297A變異體展現極少或不展現可偵測之功能。此等資料指示抗體交聯增強BA001在對原代人類T細胞上之CD137進行促效中的功能。BA001 IgG2及BA001 IgG4亦誘導中等之IL-2表現量。
圖10B展示BA001 Fc變異體(排除N297A突變體)在增強經SEA刺激之原代人類T細胞之IL-2表現中的劑量依賴性活性。BA001 IgG1 SELF及BA001 IgG1誘導最穩固效應，後接BA001 IgG4及BA001 IgG2。2.3.2 Fc 變異體維持配位體依賴性
使用部分2.2中所描述之NFκB-螢光素酶報導系統來檢查BA001 Fc變異體之配位體依賴性。簡言之，將表現人類CD137之Jurkat NFκB-螢光素酶報導體細胞(50,000個細胞/孔)與藉由部分6.2.3中所描述之方法交聯的BA001 Fc變異體或對應同型對照一起在存在或不存在可溶性人類CD137L(125 ng/ml)的情況下在37℃下培育四小時。螢光素酶表現使用Nano-Glo®螢光素酶分析系統(Promega Cat #N1120)及EnVision培養盤讀取器來加以偵測。
如圖11中所示所有BA001 Fc變異體均展現配位體依賴性CD137促效作用。在無CD137L存在下，對所測試之任一Fc變異體均未偵測到報導體活性(圖11，左欄)，而在CD137L存在下，BA001 Fc變異體均以劑量依賴性方式誘導報導體表現(圖11，右欄)。缺乏交聯之變異體能夠在此情形下對CD137進行促效很可能歸因於與原代T細胞中之CD137表現量相比，報導體細胞表現極高量之CD137。2.4 組合療法 2.4.1 與抗 PD-1 抗體組合
進一步評定抗CD137抗體BA001單獨或與抗PD-1抗體或抗OX40抗體組合刺激活化T細胞之細胞介素產生的能力。在一個實例中，在BA001(5 µg/ml)及同型對照(10 µg/ml)、抗PD-1抗體(10 µg/ml)及同型對照(5 µg/ml)、BA001(5 µg/ml)及抗PD-1抗體(10 µg/ml)之組合或單獨同型對照(15 µg/ml)存在下，如上文所描述用SEA刺激低溫保存之原代人類PBMC。在另一個實例中，在BA001(5 µg/ml)及同型對照(10 µg/ml)、抗OX40抗體(10 µg/ml)及同型對照(5 µg/ml)、BA001(5 µg/ml)及抗OX40抗體(10 µg/ml)之組合或單獨同型對照(15 µg/ml)存在下，如上文所描述用SEA刺激低溫保存之原代人類PBMC。藉由AlphaLISA(Perkin Elmer，Cat #AL221F)分析培養物上清液中之IL-2濃度。各條件重複測試六次。
如圖12A中所示，BA001及抗PD-1抗體之組合引起的IL-2分泌比單獨任一抗體更大。類似地，如圖12B中所示，BA001及抗OX40抗體之組合誘導的IL-2分泌比單獨任一抗體更大。2.5 抗原決定基定位
藉由HDX質譜研究人類CD137與BA001之Fab片段(BA001-Fab)或BA001之F(ab')2 片段(BA001-F(ab')2 )的相互作用。此等資料用於鑑別與人類CD137細胞外域上之BA001-Fab及BA001- F(ab')2 結合的抗原決定基區。2.5.1 藉由氫 - 氘交換 (HDX) 對抗 CD137 抗體進行之抗原決定基定位
使用下文方法來評估CD137與抗人類CD137 F(ab')2 及抗人類CD137 Fab之相互作用。(A)CD137 與 抗人類 CD137 F(ab ')2 之 相互作用
將20 µL人類CD137(5.48 µg)或20 µL人類CD137及BA001-F(ab')2 混合物(5.48 µg：22.36 µg)與105 µL氧化氘標記緩衝液(50 mM磷酸鈉、100 mM氯化鈉，在pD 7.4下)一起在20℃下培育0秒、60秒、300秒、1800秒、7200秒及14400秒。藉由添加125 µL之4 M鹽酸胍、0.85 M TCEP緩衝液(最終pH為2.5)使氫/氘交換淬滅，且將混合物在20℃下培育5分鐘。隨後，如下文所描述，使經淬滅之樣品經受管柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化及LC-MS分析。以僅MS模式記錄質譜。(B) CD137 與 抗人類 CD137 Fab 之 相互作用
將15 µL人類CD137(5.0 µg)或15 µL人類CD137及BA001-Fab混合物(5.0 µg CD137 +15.0 µg Fab)與110 µL氧化氘標記緩衝液(50 mM磷酸鈉、100 mM氯化鈉，在pD 7.4下)一起在25℃下培育0秒、60秒、300秒及1800秒。藉由添加125 µL之4 M鹽酸胍、0.85 M TCEP緩衝液(最終pH為2.5)使氫/氘交換淬滅，且將混合物在25℃下培育3分鐘。隨後，如下文所描述，使經淬滅之樣品經受管柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化及LC-MS分析。以僅MS模式記錄質譜。HDX 資料分析
使用HDX WorkBench軟體處理原始MS資料以用於對H/D交換MS資料之分析。使用氘化肽與其原生形式(t0 )之間的平均質量差來計算氘含量。對於氘併入之計算，跨所抽取之離子層析圖峰組合給定肽之質譜，且計算加權平均m/z。原生肽(0分鐘)之質量變至加權平均質量的質量增加對應於氘併入之量。胃蛋白酶 / 蛋白酶 XIII 消化及 LC-MS
使經His標籤標記之人類CD137 (AcroBiosystems Inc.)片段化為肽以用於藉由胃蛋白酶/蛋白酶XII消化之HDX中。藉由添加125 µL之4 M鹽酸胍、0.85 M TCEP緩衝液(最終pH為2.5)使125 µL對照緩衝液(50 mM磷酸鹽、100 mM氯化鈉，在pH 7.4下)中之5.48 µg人類CD137變性，且將混合物在20℃下培育5分鐘。使用內部(in-house)封裝之胃蛋白酶/蛋白酶XIII(w/w，1：1)管柱使混合物經受管柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化，且使用包含Waters Acquity UPLC與Q ExactiveTM 混合四極-軌道阱質譜儀(Thermo)耦接之UPLC-MS系統分析所得肽。肽鑑別藉由用Mascot針對人類CD137序列檢索MS/MS資料來進行。前驅物及產物離子之質量公差分別為10 ppm及0.05 Da。抗人類 CD137 F(ab ')2 之抗原決定基結合
在存在及不存在BA001-F(ab')2 的情況下，大多數CD137肽顯示相同或類似之氘含量。然而，發現若干肽區段在F(ab')2 結合後氘併入顯著減少。此段中之所有殘基均根據SEQ ID NO：25編號。由殘基125-155(，SEQ ID NO：27)組成之一個區在人類CD137結合於BA001-F(ab')2 時經歷強氘保護。因此，此區對應於CD137上之BA001的抗原決定基或其部分。對BA001均強結合(圖1A及1B)之人類及食蟹獼猴CD137序列的檢驗揭露在上文所描述之區中的完全序列一致性(圖11)。相比之下，BA001不以任何顯著程度結合於鼠類CD137(資料未展示)，其在此區中包括多個相對於人類CD137之胺基酸取代及插入(圖14A)。最後，CD137之片段殘基26-63(DPCSNCPAGTFCDNNRNQ ICSPCPPNSFSSAGGQRTCD，SEQ ID NO：34)亦展示氘保護。在不希望受理論束縛的情況下，預期此信號反映CD137經由PLAD-PLAD相互作用二聚化，其可藉由BA001-F(ab')2 之各臂與例如兩個不同CD137分子中之一者結合，藉此使該等CD137分子之PLAD域足夠接近以准許PLAD-PLAD相互作用來加以增強。抗人類 CD137 Fab 之抗原決定基結合
在存在及不存在BA001-Fab的情況下，大多數CD137肽顯示相同或類似之氘含量。然而，發現若干肽區段在BA001-Fab結合後氘併入顯著減少。此段中之所有殘基均根據SEQ ID NO：25編號。由殘基125-141(，SEQ ID NO：26)界定之區在人類CD137結合於BA001-Fab時經歷強氘保護。因此，此區對應於CD137上之BA001的抗原決定基或其部分。由殘基89-98(TPGFHCLGAG，SEQ ID NO：28)及殘基107-112(KQGQEL，SEQ ID NO：29)組成之兩個額外區亦展現顯著氘保護，且因此視情況對應於CD137上之BA001的額外抗原決定基或其部分。對BA001均強結合(圖1A及1B)之人類及食蟹獼猴CD137序列的檢驗揭露在上文所描述對應於SEQ ID NO：26及29之區中的完全序列一致性(圖13)。BA001不以任何顯著程度結合於鼠類CD137(資料未展示)，其在此等區中與人類CD137顯著不同(圖14A)。在食蟹獼猴序列中對應於SEQ ID NO：28之區中發現四個胺基酸取代(亦即T82I、P83S、F85Y及G91E)。CD137中由殘基26-63(SEQ ID NO：34)組成之區在此實驗中不展現任何氘保護。在不希望受理論束縛的情況下，預期個別BA001-Fab片段與單個CD137分子之結合不提昇PLAD-PLAD二聚化。2.5.2 使用人類 / 小鼠嵌合蛋白質對抗 CD137 抗體進行之抗原決定基定位
使用一系列轉染至Jurkat細胞中之鼠類交換突變型構築體來進一步研究人類CD137上由抗CD137抗體BA001識別之抗原決定基，該等Jurkat細胞可隨後藉由FACS來進行分析。產生各自構成性表現在細胞外域內含有單個突變區之人類CD137的Jurkat交換突變體，其中使人類CD137序列之部分與來自鼠類CD137之對應序列交換(亦即，圖14A中所示之突變體5014-5018；序列提供於下表5中)。
此等經工程改造之突變型細胞株用於測試抗CD137抗體是否可結合於特定交換突變體。不存在結合將因此指示可能之抗原決定基位置。細胞結合分析大體上如部分1.1中所描述進行。簡言之，使用抗CD137抗體(亦即BA001、參考抗CD137抗體#1或參考抗CD137抗體#2)之連續稀釋液在96孔培養盤中在4℃下對5×104 個細胞/孔之經轉染之Jurkat細胞進行染色持續25分鐘。洗滌細胞兩次，且與F(ab')2 山羊抗人類IgG-PE二級抗體(Jackson ImmunoResearch，Cat# 109-116-098)一起培育。隨後洗滌細胞且將其懸浮於80 μl在PBS中製備之2%多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)中。用BD FACS Canto採集資料，且使用BD FACSDiva軟體來對其進行分析。
如圖14B中所示，抗體BA001能夠結合於表現除突變體5017之外的所有鼠類交換突變體，在該突變體5017中，人類CD137中之序列LTKKGCKDCCFGTFNDQKR GICRPWTNC(SEQ ID NO：30)由鼠類CD137中之對應區置換。由BA001展現之結合模式與由參考抗CD137抗體#1及#2展現之彼等結合模式不同(圖14B)。參考抗CD137抗體#1在較低抗體濃度下展現與突變體5017之最小結合，但在處於或大於10 μg/ml之濃度下明確偵測到結合。另外，與BA001不同，參考抗CD137抗體#1展示不與突變體5016結合。
人類CD137中由鼠類交換突變體鑑別之BA001抗原決定基與在中部分6.5.1中所描述之HDX抗原決定基定位實驗中所鑑別的BA001抗原決定基基本上重疊。在重疊區中，人類CD137中具有KRGI(SEQ ID NO：43)之序列的四個連續胺基酸殘基與在鼠類CD137之對應區中發現的NGTGV(SEQ ID NO：44)之序列不同(圖15A)。此差異可為不具有BA001與鼠類CD137之顯著親和力的原因。為了確定KRGI(SEQ ID NO：43)之序列是否為由BA001識別之抗原決定基，產生兩種包含嵌合CD137細胞外域之蛋白質：「4-aa人類變為小鼠」CD137蛋白質為KRGI序列由NGTGV置換之人類CD137細胞外域；「4-aa小鼠變為人類」CD137蛋白質為NGTGV序列由KRGI置換之鼠類CD137細胞外域。此等嵌合蛋白質在C端進一步包含Gly-Ser連接子及6×His標籤。細胞外域之序列提供於表6中。
在表面電漿子共振(SPR)分析中測試上文所描述之嵌合CD137蛋白質。簡言之，首先使用胺偶合套組用抗人類Fab抗體塗佈CM5感測器晶片。以10 µl/min之流動速率分別在流動槽2及3上捕獲6 µg/ml之BA001及參考抗CD137抗體#1，同時保留流動槽1作為參考。隨後以30 µl/min使完全人類CD137蛋白質、「人類變為小鼠」CD137嵌合蛋白質及「小鼠變為人類」CD137嵌合蛋白質以60 nM之濃度獨立地流經流動槽持續90秒，後接400秒解離。在締合及解離階段兩者期間記錄感測器圖譜。
如圖15B中所示，當人類CD137之KRGI(SEQ ID NO：43)序列經鼠類CD137之NGTGV(SEQ ID NO：44)置換時，嵌合蛋白質喪失其結合BA001之能力。相反，當鼠類CD137之NGTGV(SEQ ID NO：44)序列經人類CD137之KRGI(SEQ ID NO：43)置換時，嵌合蛋白質獲得結合BA001之能力。此等資料表明，KRGI(SEQ ID NO：43)序列表示人類CD137中參與與BA001之結合的關鍵性抗原決定基區。
相比之下，如圖15C中所示，當人類CD137之KRGI(SEQ ID NO：43)序列經鼠類CD137之NGTGV(SEQ ID NO：44)序列置換時，嵌合蛋白質喪失其結合參考抗CD137抗體#1之能力。然而，當鼠類CD137之NGTGV(SEQ ID NO：44)序列經人類CD137之KRGI(SEQ ID NO：43)序列置換時，嵌合蛋白質不獲得結合參考抗CD137抗體#1之能力。此等資料表明，儘管KRGI(SEQ ID NO：43)序列為結合參考抗CD137抗體#1所必要的，但其在鼠類CD137情形下不足。2.6 抗 CD137 抗體變異體之表徵
此實例描述對本身為BA001抗體變異體之抗CD137抗體的表徵。四種此等抗體中之可變區的序列資訊提供於表1及2中。2.6.1 BA001 變異體結合於人類及食蟹獼猴 CD137
BA001之變異體藉由篩選在BA001之CDRH1、CDRH3及CDRL3中含有胺基酸取代之scFv噬菌體呈現庫來產生。簡言之，產生包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的BA001之scFv，進行scFv之突變誘發，且藉由基於親和力之選擇使陽性純系增濃。鑑別總計347個結合於人類CD137之純系。由對347個純系之胺基酸序列之分析構築的共同CDRH1、CDRH3及CDRL3序列分別闡述於SEQ ID NO：82、83及84中。在347個純系當中，233個純系之解離速率小於1×10-3 s-1 。由此233個純系構築之共同CDRH1、CDRH3及CDRL3分別闡述於SEQ ID NO：85、86及87中。
進一步表徵四種BA001變異體與CD137之結合親和力。此四種變異體稱為BA049、BA050、BA051及BA052，如表1中所提供，其分別包含SEQ ID NO：69、70、71及72中所闡述之scFv胺基酸序列。該四種變異體轉化為IgG1形式，且其重鏈及輕鏈序列提供於表1及2中。為了量測結合親和力，使用各自包含Gly-Ser連接子後接6×His標籤之人類CD137、食蟹獼猴CD137、小鼠-人類融合構築體5015(胺基酸殘基53-81用人類CD137之對應序列置換的鼠類CD137)及小鼠-人類融合構築體5017(胺基酸殘基112-140由人類CD137之對應序列置換的鼠類CD137)的細胞外域作為抗原。兩種嵌合蛋白質之細胞外域序列(排除連接子及6×His標籤)提供於表7中。
BA001變異體(呈IgG1形式)與抗原之親和力藉由ELISA來加以量測。具體言之，向Thermo Scientific™黑色96孔免疫培養盤(Thermofisher Scientific，目錄號437111)中之各槽中添加50 µl各抗原於1×PBS pH 7.4 (Gibco™，目錄號10010056)中稀釋之5 µg/ml溶液，且在4℃下培育隔夜。使用具有Biostack3微量培養盤堆疊器之Biotek 405TS微量培養盤洗滌器，用PBS洗滌培養盤三次。藉由與300微升/孔含3%奶粉之PBS(Marvel無水脫脂奶粉)一起在室溫下培育1小時來阻斷培養盤，且用1×PBS洗滌三次。向培養盤中添加在3% M-PBS(含奶粉之1×PBS)中滴定的抗體，且在室溫下培育1小時。使用培養盤洗滌器，用具有0.1% Tween20(Sigma Aldrich，目錄號P1379)之1×PBS洗滌培養盤三次，且用1×PBS洗滌三次。向各槽中添加50 µl以1：2000稀釋於3% M-PBS中之生物素-SP(長間隔子)Fcγ片段特異性AffiniPure山羊抗人類IgG(Jackson Immuno Research，編碼：109-065-098，批次號123909)，且在室溫下培育1小時。使用培養盤洗滌器，用具有0.1% Tween20之1×PBS洗滌培養盤三次，且用1×PBS洗滌三次。對於偵測，向各槽中添加50 µl以1：500稀釋於DELFIA®分析緩衝液(PerkinElmer，產品號4002-0010，批次號646702)中的DELFIA®經銪標記之抗生蛋白鏈菌素(PerkinElmer，產品號1244-360，批次號2195997)，且在室溫下培育1小時。使用培養盤洗滌器，用具有0.1% Tween20之1×PBS洗滌培養盤三次，且用PBS洗滌三次。向各槽中添加50 µl DELFIA®增強溶液(PerkinElmer，產品號4001-0010，批次號650872)，且在室溫下在溫和震盪下培育5分鐘。使用Tecan Infinite M1000 Pro培養盤讀取器在激發340 nm及發射615 nm下讀取螢光。用Tecan iControl軟體1.11.1.0版獲得資料，且用Graphpad Prism 7.02版對其進行分析。
如圖16A及16B中所示，四種BA001變異體展示與人類及食蟹獼猴CD137之結合。另外，其結合於小鼠-人類融合構築體5017(「mCD137-人類112-139」」)(圖16C)但不結合於小鼠-人類融合構築體5015(「mCD137-人類53-80」)(圖16D)，指示其結合於人類CD137在胺基酸殘基112-139之區中的抗原決定基。此等資料表明此四種變異體與BA001結合於相同或類似抗原決定基。 　　* * *
本發明之範疇不受本文所描述之具體實施例限制。實際上，根據前文描述及附圖，除所描述之修改之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。此類修改意欲處於隨附申請專利範圍之範疇內。
本文所引用之所有參考文獻(例如公開案或專利或專利申請案)均以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其併入程度如同各個別參考文獻(例如公開案或專利或專利申請案)具體且個別地指示為出於所有目的以全文引用之方式併入一般。
其他實施例在以下申請專利範圍內。
圖 1A 及 1B 之一系列流式細胞量測圖展示抗CD137抗體BA001或IgG1同型對照抗體與在其細胞表面上表現人類CD137(圖1A)或食蟹獼猴CD137(圖1B)之細胞的結合。在圖1A中，評定經工程改造以在其表面上表現人類CD137之Jurkat細胞(左側圖)、表現內源性CD137之活化人類CEM/C1 T細胞(中間圖)或活化人類原代CD8+T細胞(右側圖)與人類CD137的結合。在圖1B中，評定經工程改造以在其表面上表現食蟹獼猴CD137之Jurkat細胞(左側圖)或活化食蟹獼猴原代CD8+T細胞(右側圖)與食蟹獼猴CD137的結合。圖 2A 及 2B 之表面電漿子共振圖展示在CD137/BA001-F(ab')2 複合物之情形下，人類CD137L與人類CD137之結合。在圖2A中，使BA001-F(ab')2 結合於流動槽，且隨後使CD137流經該流動槽，藉此形成CD137/BA001-F(ab')2 複合物。隨後使CD137L流經流動槽，且展示其結合於複合物。在圖2B中，使預先形成之CD137/BA001-F(ab')2 複合物首先結合於流動槽。隨後使CD137L流經流動槽，且展示其結合於複合物。圖 3A-3C 之圖展示抗人CD137抗體BA001不阻斷CD137L與CD137結合。圖3A之一系列流式細胞量測曲線圖展示BA001不阻斷在其表面上表現CD137L之細胞與在其表面上表現CD137之細胞的結合。頂部曲線圖列展示各抗體之側向散射(SSC)及前向散射(FSC)信號，而底部曲線圖列展示各抗體之Jurkat-CD137(PE)及Jurkat-CD137L(FITC)信號。圖3B及3C之圖展示在表現抗CD137L之細胞及表現CD137之細胞的共培養中，綴合細胞在細胞總數目中之百分比，其中在將兩種類型之細胞組合為混合培養物之前(圖3B)或之後(圖3C)，添加抗CD137抗體或同型對照抗體。圖 4A-4B 之圖展示抗CD137抗體BA001之交聯依賴性。圖4A說明在與2 μg/mL交聯BA001、同型對照或參考抗CD137抗體#2在無1 μg/mL CD137L存在下一起培育的表現人類CD137之Jurkat細胞中的NFκB-螢光素酶報導體活性。報導體活性由發光水準表示，且針對交聯劑(AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗人IgG)比抗體之莫耳比的對數加以繪製。圖4B展示在與表現CD16之CHO細胞一起共培養的表現人類CD137之Jurkat細胞中的NFκB-螢光素酶報導體活性。圖 5 之圖展示在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激後在人類外周血液單核細胞(PBMC)中由抗CD137抗體(亦即，BA001及種參考抗CD137抗體)或對應同型對照抗體(亦即，分別為IgG1、IgG2及IgG4同型對照抗體)誘導的IL-2產生。圖 6A-6C 之圖展示在用抗CD3抗體刺激的經純化之人類T細胞中由抗CD137抗體誘導的IL-2產生(圖6A及6B)。藉由流式細胞量測術評定在此等實驗中所用經純化之人類T細胞中的CD137L表現。在此等細胞上未觀測到可偵測之CD137L表現(圖6C)。圖 7A 之圖展示在存在或不存在1 μg/mL CD137L的情況下所量測的抗CD137抗體BA001在Jurkat報導體細胞中之交聯依賴性及配位體依賴性。圖 7B 之直方圖展示CD137及CD137L在Jurkat報導體細胞上之表現(或不具有該表現)由新鮮解凍之細胞(「0 h」)、解凍後培養4小時之細胞(「4 h」)及解凍後培養24小時之細胞(「24 h」)分析表現。圖 8A-8D 之圖展示在表現人類CD137(圖8A及8B)或食蟹獼猴CD137(圖8C及8D)且與抗CD137抗體BA001或同型對照抗體之連續稀釋液一起培育之Jurkat細胞中的NFκB-螢光素酶報導體活性。在一組樣品中，亦在存在(圖8B及8D)或不存在(圖8A及8C)人類CD137L的情況下培育細胞。圖 9A-9C 之一系列圖形展示在表現人類CD137且與(i)2 µg/ml抗CD137抗體(BA001或兩種參考抗CD137抗體中之一者)或適當同型對照抗體及(ii)人類CD137L(配位體)之連續稀釋液一起培育之Jurkat細胞中的NFκB-螢光素酶報導體活性。在第一組樣品中，在CD137L之前添加抗CD137抗體或同型對照抗體(圖9A)。在第二組樣品中，與CD137L同時添加抗CD137抗體或同型對照抗體(圖9B)。在第三組樣品中，在抗CD137抗體或同型對照抗體之前添加CD137L(圖9C)。圖 10A 之圖展示在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激後在人類外周血液單核細胞(PBMC)中由BA001之Fc變異體或對應同型對照抗體誘導的IL-2產生。圖 10B 之圖展示在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激後在人類外周血液單核細胞(PBMC)中由BA001之Fc變異體或對應同型對照抗體的連續稀釋液誘導的IL-2產生。圖 11 為在表現人類或食蟹獼猴CD137且與BA001之Fc變異體或適當同型對照抗體的連續稀釋液一起培育之Jurkat細胞中的一系列NFκB-螢光素酶報導體活性。在一組樣品中，亦在存在(右欄)或不存在(左欄)人類CD137L的情況下培育細胞。圖 12A 及 12B 之圖展示在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激後在人類外周血液單核細胞(PBMC)中由抗體誘導的IL-2產生。在圖12A中所測試之抗體包括抗CD137抗體BA001、同型對照抗體、抗PD-1抗體及BA001與抗PD-1抗體之組合。在圖12B中所測試之抗體包括抗CD137抗體BA001、同型對照抗體、抗OX40抗體及BA001與抗OX40抗體之組合。圖 13 為人類CD137與食蟹獼猴CD137之序列比對。「*」(星號)指示具有單個完全保守殘基之位置。「：」(冒號)指示特性強相似的基團之間的保守。「.」(句點)指示在特性弱相似的基團之間的保守。以點線加框之區(DPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCD，SEQ ID NO：34)展現當人類CD137結合於BA001-F(ab')2 時氘吸收輕度減少，可能由於CD137在此區處均二聚。以實線加框之區(FNDQKRGICRPWTNCSL，SEQ ID NO：26)展現當人類CD137結合於BA001-Fab時氘吸收極大減少。圖 14A 及 14B 之一系列圖展示藉由FACS對BA001進行之抗原決定基定位。在圖14A中，對於所展示之區中之每一者，產生CD137的一系列人類變為鼠類之序列交換突變體(亦即，5014、5015、5016、5017及5018，參見下表5)。隨後將此等突變型構築體轉染至Jurkat細胞中以用於藉由FACS對抗CD137抗體結合進行分析。圖14B展示BA001、參考抗CD137抗體#1及#2(分別為「Reference #1」及「參考#2」)及同型對照抗體與表現上文所描述之交換突變體中之每一者的經工程改造之Jurkat細胞的細胞結合數據。圖 15A -15C 展示藉由表面電漿子共振(SPR)分析對CD137抗原決定基進行之精細定位。圖15A為人類CD137與鼠類CD137之序列比對。「*」(星號)指示具有單個完全保守殘基之位置。「：」(冒號)指示特性強相似的基團之間的保守。「.」(句點)指示在特性弱相似的基團之間的保守。以實線加框之區(FNDQKRGICRPWTNCSL，SEQ ID NO：26)為如圖13中所說明的藉由氫/氘交換分析而鑑別之抗原決定基區。以點線加框之區(，SEQ ID NO：30)為如圖14A及14B中所說明的由使用人類-小鼠融合構築體之結合分析而鑑別之5017區。以實線突出顯示之區(KRGI，SEQ ID NO：43)指示已在人類與鼠類CD137之間交換以產生嵌合蛋白質之胺基酸序列。圖15B之感測器圖譜展示藉由SPR分析得到的BA001與人類CD137及嵌合蛋白質「人類變為小鼠」及「小鼠變為人類」之結合。圖15C之感測器圖譜展示在相似之SPR分析中得到的參考抗CD137抗體#1(「參考#1」)與相同CD137蛋白質之結合。圖 16A-16D 之一系列圖形展示如藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)使用螢光標記作為讀數所量測，四種BA001變異體BA049、BA050、BA051及BA052與人類CD137(圖16A)、食蟹獼猴CD137(圖16B)、小鼠-人類融合構築體5017(「mCD137-human112-139」)(圖16C)及小鼠-人類融合構築體5015(「mCD137-human53-80」)(圖16D)之細胞外域的結合。中值螢光強度水準針對抗CD137抗體之濃度加以繪製。

Claims (110)

  1. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，該抗體包含有包含互補決定區(CDR)CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區(VH)及包含CDR CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區(VL)，其中： 　　(a)CDRH1包含X1 X2 X3 X4 H(SEQ ID NO：82)之胺基酸序列，其中 　　X1 為G、A、D、E、L、N、Q、R、S或W； 　　X2 為Y、F、H、N、R或S； 　　X3 為Y或H；且 　　X4 為M、I、T或V； 　　(b)CDRH2包含WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列； 　　(c)CDRH3包含X1 PX2 YX3 GX4 GLX5 X6 (SEQ ID NO：83)之胺基酸序列，其中 　　X1 為E或G； 　　X2 為G、A、R或S； 　　X3 為Y、F、H或S； 　　X4 為S、A或T； 　　X5 為D或G；且 　　X6 為Y或H； 　　(d)CDRL1包含GGDDIGDKRVH(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列； 　　(e)CDRL2包含EDRYRPS(SEQ ID NO：5)之胺基酸序列；及/或 　　(f)CDRL3包含QX1 WX2 X3 X4 X5 X6 X7 PGV(SEQ ID NO：84)之胺基酸序列，其中 　　X1 為V或I； 　　X2 為D、A、E、G、H、N或Y； 　　X3 為S、A、E、F、L、P、R、T、W或Y； 　　X4 為S、A、L、M或R； 　　X5 為S、A、F、G、L、P、Q、R或T； 　　X6 為D、E、H、V或Y；且 　　X7 為H或Y。
  2. 如請求項1之經分離之抗體，其中： 　　(a)CDRH1包含X1 X2 YX3 H(SEQ ID NO：85)之胺基酸序列，其中 　　X1 為G、A、D、L、R、S或W； 　　X2 為Y、F、H或N；且 　　X3 為M或V； 　　(b)CDRH3包含EPGYX1 GX2 GLDX3 (SEQ ID NO：86)之胺基酸序列，其中 　　X1 為Y或F； 　　X2 為S或T；且 　　X3 為Y或H；及/或 　　(c)CDRL3包含QVWX1 X2 X3 X4 X5 X6 PGV(SEQ ID NO：87)之胺基酸序列，其中 　　X1 為D、A、E、H、N或Y； 　　X2 為S、A、E、L、R或T； 　　X3 為S、A、L或R； 　　X4 為S、A、F、G、L、P、Q或R； 　　X5 為D、E或V；且 　　X6 為H或Y。
  3. 如請求項1或2之經分離之抗體，其中： 　　(a)CDRH1包含GYYMH(SEQ ID NO：1)之胺基酸序列； 　　(b)CDRH3包含EPGYYGSGLDY(SEQ ID NO：3)或EPGYYGTGLDY(SEQ ID NO：59)之胺基酸序列；及/或 　　(c)CDRL3包含QVWDSSSDHPGV(SEQ ID NO：6)、QVWNSSSDHPGV(SEQ ID NO：60)、QVWDSSSDYPGV (SEQ ID NO：61)或QVWYSSPDHPGV(SEQ ID NO：62)之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之經分離之抗體，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5及6；1、2、59、4、5及6；1、2、3、4、5及60；1、2、3、4、5及61；或1、2、3、4、5及62中分別闡述之胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含有包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少75%、80 %、85%、90%、95%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH。
  6. 如請求項5之經分離之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO：7、63、64或65之胺基酸序列。
  7. 如請求項5或6之經分離之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
  8. 如請求項6或7之經分離之抗體，其中X為麩醯胺酸(Q)。
  9. 如請求項6或7之經分離之抗體，其中X為焦麩胺酸鹽(pE)。
  10. 如請求項1至9中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含有包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
  11. 如請求項10之經分離之抗體，其中該VL包含SEQ ID NO：8、66、67或68之胺基酸序列。
  12. 如請求項10或11之經分離之抗體，其中該VL包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
  13. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：7、63、64或65之胺基酸序列的VH。
  14. 如請求項13之經分離之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
  15. 如請求項13或14之經分離之抗體，其中X為麩醯胺酸(Q)。
  16. 如請求項13或14之經分離之抗體，其中X為焦麩胺酸鹽(pE)。
  17. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，該抗體包含有包含SEQ ID NO：8、66、67或68之胺基酸序列的VL。
  18. 如請求項17之經分離之抗體，其中該VL包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
  19. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，該抗體包含有分別包含SEQ ID NO：7及8；63及8；64及66；7及67；或65及68之胺基酸序列的VH及VL。
  20. 如請求項19之經分離之抗體，其中該VH及VL分別包含SEQ ID NO：7及8之胺基酸序列。
  21. 如請求項19或20之經分離之抗體，其中SEQ ID NO：7、63、64或65中之X為麩醯胺酸(Q)。
  22. 如請求項19或20之經分離之抗體，其中SEQ ID NO：7、63、64或65中之X為焦麩胺酸鹽(pE)。
  23. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，該抗體包含胺基酸序列來源於人類IGHV1-2*02生殖系序列之VH。
  24. 如請求項23之經分離之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO：3或59中所闡述之胺基酸序列。
  25. 如請求項23或24之經分離之抗體，其中該抗體包含胺基酸序列來源於人類IGLV3-21*02生殖系序列之VL。
  26. 如請求項25之經分離之抗體，其中該VL包含SEQ ID NO：6、60、61或62中所闡述之胺基酸序列。
  27. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，該抗體包含胺基酸序列來源於人類IGLV3-21*02生殖系序列之VL。
  28. 如請求項27之經分離之抗體，其中該VL包含SEQ ID NO：6、60、61或62中所闡述之胺基酸序列。
  29. 如請求項1至28中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含選自由以下組成之群的重鏈恆定區：人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
  30. 如請求項29之經分離之抗體，其中該抗體包含IgG1重鏈恆定區。
  31. 如請求項30之經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈恆定區。
  32. 如請求項30之經分離之抗體，其中在根據EU編號系統編號的情況下，該IgG1重鏈恆定區之胺基酸序列包含N297A突變。
  33. 如請求項32之經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈恆定區。
  34. 如請求項30之經分離之抗體，其中在根據EU編號系統編號的情況下，該IgG1重鏈恆定區之胺基酸序列包含S267E及L328F突變。
  35. 如請求項34之經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的重鏈恆定區。
  36. 如請求項29之經分離之抗體，其中該抗體包含IgG2重鏈恆定區。
  37. 如請求項36之經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈恆定區。
  38. 如請求項36之經分離之抗體，其中在根據EU編號系統編號的情況下，該IgG2重鏈恆定區之胺基酸序列包含N297A突變。
  39. 如請求項37之經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈恆定區。
  40. 如請求項29之經分離之抗體，其中該抗體包含IgG4重鏈恆定區。
  41. 如請求項40之經分離之抗體，其中在根據EU編號系統編號的情況下，該IgG4重鏈恆定區之胺基酸序列包含S228P突變。
  42. 如請求項41之經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的重鏈恆定區。
  43. 如請求項1至29中任一項之經分離之抗體，其中該包含本身為野生型重鏈恆定區之變異體的重鏈恆定區，其中該變異型重鏈恆定區與FcγR結合之親和力比該野生型重鏈恆定區與該FcγR結合之親和力更高。
  44. 如請求項43之經分離之抗體，其中該FcγR為FcγRIIB。
  45. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
  46. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，該抗體包含： 　　(a)包含選自由SEQ ID NO：9-14、49-54及73-78組成之群之胺基酸序列的重鏈；及/或 　　(b)包含選自由SEQ ID NO：21及79-81組成之群之胺基酸序列的輕鏈。
  47. 如請求項46之經分離之抗體，其中該重鏈及輕鏈分別包含SEQ ID NO：9及21；10及21；11及21；12及21；13及21；14及21；49及21；50及21；51及21；52及21；53及21；54及21；73及21；74及21；75及79；76及79；9及80；49及80；77及81；或78及81之胺基酸序列。
  48. 如請求項47之經分離之抗體，其中該重鏈及輕鏈分別由SEQ ID NO：9及21；10及21；11及21；12及21；13及21；14及21；49及21；50及21；51及21；52及21；53及21；54及21；73及21；74及21；75及79；76及79；9及80；49及80；77及81；或78及81之胺基酸序列組成。
  49. 如請求項47之經分離之抗體，其中該重鏈及輕鏈分別包含SEQ ID NO：9及21；或49及21之胺基酸序列。
  50. 如請求項49之經分離之抗體，其中該重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9及21；或49及21之胺基酸序列組成。
  51. 如請求項46至50中任一項之經分離之抗體，其中X為麩醯胺酸(Q)。
  52. 如請求項46至50中任一項之經分離之抗體，其中X為焦麩胺酸鹽(pE)。
  53. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，其中該抗體與該CD137之結合使在該CD137與第二人類CD137分子之間二聚化的水準相對於在無該抗體存在下二聚化之水準增加。
  54. 如請求項53之經分離之抗體，其中該抗體與該CD137之結合使在該兩個CD137分子之PLAD結構域之間成對結合的水準相對於在無該抗體存在下該兩個CD137分子之PLAD結構域之間成對結合的水準增加。
  55. 如請求項53之經分離之抗體，其中該抗體與該CD137之結合使在該CD137分子之第一區與該第二人類CD137分子之第二區之間成對結合的水準相對於在無該抗體存在下在該第一區與該第二區之間成對結合的水準增加，其中該第一區及/或該第二區包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列。
  56. 如請求項53至55中任一項之經分離之抗體，其中該抗體為多價抗體且能夠同時結合於兩個或超過兩個CD137分子。
  57. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中： 　　(a)該抗體基本上不抑制人類CD137與人類CD137L結合； 　　(b)該抗體基本上不抑制人類CD137之可溶性片段與人類CD137L之可溶性片段結合； 　　(c)該抗體基本上不抑制表現CD137之細胞與人類CD137L之可溶性片段結合；及/或 　　(d)該抗體基本上不抑制表現CD137之細胞與表現CD137L之細胞結合。
  58. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體對人類CD137具有促效性。
  59. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體增加或提昇人類CD137之活性。
  60. 如請求項59之經分離之抗體，其中該抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力依賴於該抗體之交聯。
  61. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，其中該抗體增加或提昇人類CD137之活性，且該抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力依賴於該抗體之交聯。
  62. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中在無交聯存在下，該抗體基本上不增加或提昇人類CD137之活性。
  63. 如請求項60至62中任一項之經分離之抗體，其中該抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力依賴於CD137L之存在。
  64. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，其中該抗體增加或提昇人類CD137之活性，且該抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力依賴於CD137L之存在。
  65. 如請求項63或64之經分離之抗體，其中該抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力與CD137L之濃度正相關。
  66. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中在無CD137L存在下，該抗體基本上不增加或提昇人類CD137之活性。
  67. 如請求項59至66中任一項之經分離之抗體，其中該人類CD137之活性包含使表現該人類CD137之T細胞活化。
  68. 如請求項59至67中任一項之經分離之抗體，其中該人類CD137之活性包含誘導由用葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激之外周血液單核細胞(PBMC)進行的IL-2產生。
  69. 如請求項59至68中任一項之經分離之抗體，其中該人類CD137之活性包含使表現該人類CD137之自然殺手(NK)細胞活化。
  70. 如請求項59至69中任一項之經分離之抗體，其中該人類CD137之活性包含使表現CD137L之抗原呈遞細胞(APC)活化。
  71. 如請求項59-70中任一項之經分離之抗體，其中該抗體增加或提昇人類CD137之活性的能力為該CD137L之濃度的基本上遞增函數。
  72. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體與包含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之VL的抗體結合於人類CD137之相同抗原決定基。
  73. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，其中該抗體與包含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之VL的抗體結合於人類CD137之相同抗原決定基。
  74. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體結合於位於人類CD137之CRD4結構域內的抗原決定基。
  75. 如請求項74之經分離之抗體，其中人類CD137之該CRD4結構域包含SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列。
  76. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：26-31及43中之任一者之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。
  77. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，其中該抗體結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：26-31及43中之任一者之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。
  78. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：43之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。
  79. 如請求項78之經分離之抗體，其中該抗體基本上不結合於包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的蛋白質。
  80. 如請求項79之經分離之抗體，其中該抗體特異性結合於包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的蛋白質。
  81. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含VH及VL，其中： 　　(a)包含該VH及該VL中之每一者各兩個的F(ab')2結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：27之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基；及/或 　　(b)包含該VH及該VL之Fab結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：26之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基，且視情況結合於位於人類CD137中由SEQ ID NO：28或29之胺基酸序列組成之區內的抗原決定基。
  82. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含VH及VL，其中： 　　(a)如藉由氫/氘交換分析所量測，包含該VH及該VL中之每一者各兩個的F(ab')2 使在CD137中由SEQ ID NO：34之胺基酸序列組成之區中的氫變為氘之交換相對於在無該F(ab')2 存在下在同一區中的氫變為氘之交換顯著減少；及 　　(b)如藉由氫/氘交換分析所量測，包含該VH及該VL之Fab基本上不使在CD137中由SEQ ID NO：34之胺基酸序列組成之區中的氫變為氘之交換相對於在無該Fab存在下在同一區中的氫變為氘之交換減少。
  83. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中： 　　(a)該抗體特異性結合於包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的蛋白質；且 　　(b)該抗體不特異性結合於包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質。
  84. 一種特異性結合於人類CD137的經分離之抗體，其中： 　　(a)該抗體特異性結合於包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的蛋白質；且 　　(b)該抗體不特異性結合於包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的蛋白質。
  85. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體為人類抗體。
  86. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體為多特異性抗體。
  87. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體與細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、毒素、放射性核種或可偵測標記綴合。
  88. 如前述請求項中任一項之經分離之抗體，其中該抗體與第二抗體綴合。
  89. 一種經分離之多核苷酸，其編碼如請求項1至88中任一項之抗體的VH及/或VL或重鏈及/或輕鏈。
  90. 一種載體，其包含如請求項89之多核苷酸。
  91. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項89之多核苷酸或如請求項89之載體。
  92. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至88中任一項之抗體、如請求項89之多核苷酸、如請求項90之載體或如請求項91之宿主細胞；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  93. 一種產生特異性結合於人類CD137之抗體的方法，該方法包含在適合之條件下培養如請求項91之宿主細胞以表現多核苷酸且產生該抗體。
  94. 一種在受試者中增加免疫反應之方法，該方法包含向該受試者投與有效量的如請求項1至88中任一項之抗體、如請求項89之多核苷酸、如請求項90之載體、如請求項91之宿主細胞或如請求項92之醫藥組合物。
  95. 一種在受試者中治療癌症之方法，該方法包含向該受試者投與有效量的如請求項1至88中任一項之抗體、如請求項89之多核苷酸、如請求項90之載體、如請求項91之宿主細胞或如請求項92之醫藥組合物。
  96. 如請求項94或95之方法，其中該抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或醫藥組合物全身性地進行投與。
  97. 如請求項96之方法，其中該抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或醫藥組合物靜脈內進行投與。
  98. 如請求項94或95之方法，其中該抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或醫藥組合物皮下、瘤內進行投與或遞送至腫瘤引流淋巴結。
  99. 如請求項94至98中任一項之方法，其進一步包含向該受試者投與一種額外治療劑。
  100. 如請求項99之方法，其中該額外治療劑為化學治療劑。
  101. 如請求項99之方法，其中該額外治療劑為檢查點靶向劑。
  102. 如請求項101之方法，其中該檢查點靶向劑係選自由以下組成之群：拮抗性抗PD-1抗體、拮抗性抗PD-L1抗體、拮抗性抗PD-L2抗體、拮抗性抗CTLA-4抗體、拮抗性抗TIM-3抗體、拮抗性抗LAG-3抗體、拮抗性抗VISTA抗體、拮抗性抗CD96抗體、拮抗性抗CEACAM1抗體、拮抗性抗TIGIT抗體、促效性抗GITR抗體及促效性抗OX40抗體。
  103. 如請求項102之方法，其中該額外治療劑為抗PD-1抗體，視情況其中該抗PD-1抗體為派立珠單抗(pembrolizumab)或納武單抗(nivolumab)。
  104. 如請求項99之方法，其中該額外治療劑為吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)之抑制劑。
  105. 如請求項104之方法，其中該抑制劑係選自由以下組成之群：艾帕斯塔(epacadostat)、F001287、因多莫得(indoximod)及NLG919。
  106. 如請求項99之方法，其中該額外治療劑為疫苗。
  107. 如請求項106之方法，其中該疫苗包含有包含熱休克蛋白與抗原肽複合的熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)。
  108. 如請求項107之方法，其中該熱休克蛋白為hsc70且與腫瘤相關抗原肽複合。
  109. 如請求項107之方法，其中該熱休克蛋白為gp96蛋白質且與腫瘤相關抗原肽複合，其中HSPPC來源於自受試者獲得之腫瘤。
  110. 一種在受試者中治療感染性疾病之方法，該方法包含向該受試者投與有效量的如請求項1至88中任一項之抗體、如請求項89之多核苷酸、如請求項90之載體、如請求項91之宿主細胞或如請求項92之醫藥組合物。
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