CN110546166A - 抗cd137抗体和其使用方法 - Google Patents

抗cd137抗体和其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了特异性结合于CD137(例如人CD137)并增加CD137功能的抗体。还提供了包含这些抗体的药物组合物、编码这些抗体的核酸、用于产生这些抗体的表达载体和宿主细胞以及使用这些抗体治疗受试者的方法。

Description

抗CD137抗体和其使用方法
相关申请
本申请要求2017年4月13日提交的美国临时申请第62/485,365号的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开涉及特异性结合于CD137(例如人CD137)的抗体和其使用方法。
背景技术
CD137又称为TNFRSF9或4-1BB，是肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)受体超家族中的一种跨膜蛋白。其具有含有富含半胱氨酸的基元的N端胞外结构域、跨膜结构域和含有潜在磷酸化位点的短C端细胞质域。CD137在活化的CD4+T淋巴细胞、活化的CD8+T淋巴细胞、活化的自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞上表达(Vinay等人(2011)《细胞与分子免疫学(Cellular&Molecular Immunology)》8:281-84)。CD137L又称为TNFSF9或4-1BBL，是CD137的配体。在结合CD137L时，CD137转导共刺激信号，所述共刺激信号促进细胞存活、增殖、细胞因子产生和效应功能活化。CD137L与CD137的结合亦显示比CD4+T细胞更大程度地共刺激CD8+T细胞。
动物模型中的研究已显示使用CD137L或激动抗体接合CD137通过促进T细胞活性而抑制肿瘤生长(Vinay等人(2012)《分子癌症治疗(Mol.Cancer.Ther.)》11:1062-70)。CD137也已经显示在疫苗接种之后增强针对人类免疫缺陷病毒(HIV，humanimmunodeficiency virus)和C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的T细胞免疫性(Munks等人(2004)《免疫学(Immunology)》112:559-66；Arribillaga等人(2005)《疫苗(Vaccine)》23:3493-99)。另外，CD137激动剂已经显示在狼疮、胶原蛋白诱发的关节炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎的动物模型中改善自身免疫性。
考虑到人CD137在调节免疫反应上的明显作用，被设计用于促进CD137信号传导的治疗剂非常有望用于治疗涉及免疫抑制的疾病。
发明内容
本公开提供了特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)并增加或促进CD137功能，例如CD137介导的免疫活化的抗体。还提供了包含这些抗体的药物组合物、编码这些抗体的核酸、用于产生这些抗体的表达载体和宿主细胞以及使用这些抗体治疗受试者的方法。本文公开的抗体特别适用于增加针对抗原(例如肿瘤抗原或感染性疾病抗原)的T细胞活化和/或减少Treg介导的免疫抑制，因此用于治疗受试者的癌症或治疗或预防受试者的感染性疾病。
因此，在一方面，本公开提供了一种抗体或分离的抗体，其包括包含互补决定区(CDR)CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区(VH)和包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区(VL)，其中：
(a)CDRH1包含X1X2X3X4H(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列，其中
X1是G、A、D、E、L、N、Q、R、S或W；
X2是Y、F、H、N、R或S；
X3是Y或H；并且
X4是M、I、T或V；
(b)CDRH2包含WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；
(c)CDRH3包含X1PX2YX3GX4GLX5X6(SEQ ID NO:83)的氨基酸序列，其中
X1是E或G；
X2是G、A、R或S；
X3是Y、F、H或S；
X4是S、A或T；
X5是D或G；并且
X6是Y或H；
(d)CDRL1包含GGDDIGDKRVH(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；
(e)CDRL2包含EDRYRPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和/或
(f)CDRL3包含QX1WX2X3X4X5X6X7PGV(SEQ ID NO:84)的氨基酸序列，其中
X1是V或I；
X2是D、A、E、G、H、N或Y；
X3是S、A、E、F、L、P、R、T、W或Y；
X4是S、A、L、M或R；
X5是S、A、F、G、L、P、Q、R或T；
X6是D、E、H、V或Y；并且
X7是H或Y。
在某些实施例中，
(a)CDRH1包含X1X2YX3H(SEQ ID NO:85)的氨基酸序列，其中
X1是G、A、D、L、R、S或W；
X2是Y、F、H或N；并且
X3是M或V；
(b)CDRH3包含EPGYX1GX2GLDX3(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中
X1是Y或F；
X2是S或T；并且
X3是Y或H；和/或
(c)CDRL3包含QVWX1X2X3X4X5X6PGV(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列，其中
X1是D、A、E、H、N或Y；
X2是S、A、E、L、R或T；
X3是S、A、L或R；
X4是S、A、F、G、L、P、Q或R；
X5是D、E或V；并且
X6是H或Y。
在某些实施例中，
(a)CDRH1包含GYYMH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；
(b)CDRH3包含EPGYYGSGLDY(SEQ ID NO:3)或EPGYYGTGLDY(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列；和/或
(c)CDRL3包含QVWDSSSDHPGV(SEQ ID NO:6)、QVWNSSSDHPGV(SEQ ID NO:60)、QVWDSSSDYPGV(SEQ ID NO:61)或QVWYSSPDHPGV(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列。
在某些实施例中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含以下中所述的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6；SEQ ID NO:1、2、59、4、5和6；SEQ ID NO:1、2、3、4、5和60；SEQ ID NO:1、2、3、4、5和61；或SEQ ID NO:1、2、3、4、5和62。
在某些实施例中，抗体包含氨基酸序列与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一的VH。在某些实施例中，VH包含SEQ ID NO:7、63、64或65的氨基酸序列。在某些实施例中，VH包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:7、63、64或65的氨基酸序列组成。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。在某些实施例中，X是谷氨酰胺(Q)。在某些实施例中，X是焦谷氨酸(pE)。在某些实施例中，抗体包含氨基酸序列与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一的VL。在某些实施例中，VL包含SEQ ID NO:8、66、67或68的氨基酸序列。在某些实施例中，VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在某些实施例中，VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:8、66、67或68的氨基酸序列组成。在某些实施例中，VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:7、63、64或65的氨基酸序列的VH。在某些实施例中，VH包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由SEQID NO:7、63、64或65的氨基酸序列组成。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。在某些实施例中，X是谷氨酰胺(Q)。在某些实施例中，X是焦谷氨酸(pE)。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:8、66、67或68的氨基酸序列的VL。在某些实施例中，VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在某些实施例中，VL的氨基酸序列由SEQID NO:8、66、67或68的氨基酸序列组成。在某些实施例中，VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括分别包含SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:63和8、SEQ IDNO:64和66、SEQ ID NO:7和67或SEQ ID NO:65和68的氨基酸序列的VH和VL。在某些实施例中，VH和VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:63和8、SEQ ID NO:64和66、SEQ ID NO:7和67或SEQ ID NO:65和68的氨基酸序列组成。在某些实施例中，SEQ ID NO:7、63、64或65中的X是谷氨酰胺(Q)。在某些实施例中，SEQ ID NO:7、63、64或65中的X是焦谷氨酸(pE)。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包含具有来源于人IGHV1-2*02胚系序列的氨基酸序列的VH。在某些实施例中，所述VH包含SEQ ID NO:3或59中所述的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包含具有来源于人IGLV3-21*02胚系序列的氨基酸序列的VL。在某些实施例中，VL包含SEQ ID NO:6、60、61或62中所述的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包含具有来源于人IGHV1-2*02胚系序列的氨基酸序列的VH和具有来源于人IGLV3-21*02胚系序列的氨基酸序列的VL。在某些实施例中，VH包含SEQ IDNO:3中所述的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:6、60、61或62中所述的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗体包含选自由人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2组成的群组的重链恒定区。
在某些实施例中，抗体包含IgG1重链恒定区。在某些实施例中，抗体包括包含SEQID NO:15的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施例中，IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号系统编号的N297A突变。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施例中，IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号系统编号的S267E和L328F突变。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链恒定区。
在某些实施例中，抗体包含IgG2重链恒定区。在某些实施例中，抗体包括包含SEQID NO:18的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施例中，IgG2重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号系统编号的N297A突变。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链恒定区。
在某些实施例中，抗体包含IgG4重链恒定区。在某些实施例中，IgG4重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号系统编号的S228P突变。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的重链恒定区。
在某些实施例中，抗体包含作为野生型重链恒定区的变体的重链恒定区，其中变异重链恒定区以比野生型重链恒定区结合于FcγR的亲和力高的亲和力结合于FcγR。在某些实施例中，FcγR是FcγRIIB。
在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链恒定区。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包含：(a)包含选自由SEQ ID NO:9-14、49-54和73-78组成的群组的氨基酸序列的重链；和/或(b)包含SEQ ID NO:21和79-81的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，重链和轻链分别包含SEQ ID NO:9和21、SEQ ID NO:10和21、SEQ ID NO:11和21、SEQ ID NO:12和21、SEQ ID NO:13和21、SEQ ID NO:14和21、SEQ ID NO:49和21、SEQID NO:50和21、SEQ ID NO:51和21、SEQ ID NO:52和21、SEQ ID NO:53和21、SEQ ID NO:54和21、SEQ ID NO:73和21、SEQ ID NO:74和21、SEQ ID NO:75和79、SEQ ID NO:76和79、SEQID NO:9和80、SEQ ID NO:49和80、SEQ ID NO:77和81或SEQ ID NO:78和81的氨基酸序列。在某些实施例中，重链和轻链分别包含SEQ ID NO:9和21或SEQ ID NO:49和21的氨基酸序列。在某些实施例中，重链和轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:9和21、SEQ ID NO:10和21、SEQ ID NO:11和21、SEQ ID NO:12和21、SEQ ID NO:13和21、SEQ ID NO:14和21、SEQ IDNO:49和21、SEQ ID NO:50和21、SEQ ID NO:51和21、SEQ ID NO:52和21、SEQ ID NO:53和21、SEQ ID NO:54和21、SEQ ID NO:73和21、SEQ ID NO:74和21、SEQ ID NO:75和79、SEQ IDNO:76和79、SEQ ID NO:9和80、SEQ ID NO:49和80、SEQ ID NO:77和81或SEQ ID NO:78和81的氨基酸序列组成。在某些实施例中，重链和轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:9和21或49和21的氨基酸序列组成。在某些实施例中，X是谷氨酰胺(Q)。在某些实施例中，X是焦谷氨酸(pE)。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其中所述抗体与所述CD137的结合使所述CD137与第二人CD137分子之间二聚的水平相对于在缺乏抗体下二聚的水平增加。在某些实施例中，所述抗体与所述CD137的结合使所述两个CD137分子的PLAD结构域之间的成对结合水平相对于在缺乏抗体下所述两个CD137分子的PLAD结构域之间的成对结合水平增加。在某些实施例中，所述抗体与所述CD137的结合使所述CD137分子的第一区域与第二人CD137分子的第二区域之间的成对结合水平相对于在缺乏抗体下所述第一区域与所述第二区域之间的成对结合水平增加，其中所述第一区域和/或所述第二区域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其中抗体与CD137的结合使CD137多聚(例如二聚)的水平相对于在缺乏抗体下CD137多聚(例如二聚)的水平增加。在某些实施例中，CD137多聚(例如二聚)的水平增加包含两个CD137分子的PLAD结构域之间的成对结合水平增加。在某些实施例中，CD137多聚(例如二聚)的水平增加包含第一CD137分子的第一区域与第二分子的第二区域之间的成对结合水平增加，其中第一区域和/或第二区域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗体是多价抗体并能够同时结合于CD137的两个或更多个分子。
在某些实施例中，本文公开的抗体基本上不抑制人CD137与人CD137L的结合。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于人CD137并且基本上不抑制人CD137与人CD137L的结合的分离的抗体。
在某些实施例中，抗体基本上不抑制人CD137的可溶性片段与人CD137L的可溶性片段的结合。在某些实施例中，抗体基本上不抑制表达CD137的细胞与人CD137L的可溶性片段的结合。在某些实施例中，抗体基本上不抑制表达CD137的细胞与表达CD137L的细胞的结合。
在某些实施例中，抗体不抑制人CD137的可溶性片段与人CD137L的可溶性片段的结合。在某些实施例中，抗体不抑制表达CD137的细胞与人CD137L的可溶性片段的结合。在某些实施例中，抗体不抑制表达CD137的细胞与表达CD137L的细胞的结合。
在某些实施例中，本文公开的抗体对人CD137具有激动作用。在某些实施例中，抗体增加或促进人CD137的活性。在某些实施例中，抗体增加或促进人CD137的活性的能力取决于抗体的交联。在某些实施例中，抗体在缺乏交联下基本上不增加或促进人CD137的活性。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137)并且增加或促进人CD137的活性的分离的抗体，其中抗体增加或促进人CD137的活性的能力取决于抗体的交联。在某些实施例中，抗体在缺乏交联下基本上不增加或促进人CD137的活性。
在某些实施例中，抗体增加或促进人CD137的活性的能力取决于CD137L的存在。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137)并且增加或促进人CD137的活性的分离的抗体，其中抗体增加或促进人CD137的活性的能力取决于CD137L的存在。
在某些实施例中，抗体增加或促进人CD137的活性的能力与CD137L的浓度正相关。在某些实施例中，抗体增加或促进人CD137的活性的能力是CD137L的浓度的基本上递增函数。在某些实施例中，抗体在缺乏CD137L下基本上不增加或促进人CD137的活性。在某些实施例中，抗体在缺乏CD137L下不增加或促进人CD137的活性。
在某些实施例中，人CD137的活性包含活化表达人CD137的T细胞。在某些实施例中，人CD137的活性包含诱导经葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)刺激的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)产生IL-2。在某些实施例中，人CD137的活性包含活化表达人CD137的自然杀伤(NK)细胞。在某些实施例中，人CD137的活性包含活化表达CD137L的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)。
在某些实施例中，抗体结合于与包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL的抗体相同的人CD137的表位。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，其中抗体结合于与包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL的抗体相同的人CD137的表位。在某些实施例中，抗体结合于位于人CD137的CRD4结构域内的表位。在某些实施例中，人CD137的CRD4结构域包含SEQ ID NO:42中所述的氨基酸序列。
在某些实施例中，本文公开的抗体结合于位于由SEQ ID NO:26-31和43中的任一个的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。在某些实施例中，抗体结合于位于由SEQID NO:43的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，其中抗体结合于位于由SEQ ID NO:26-31和43中的任一个的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。在某些实施例中，抗体结合于位于由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。
在某些实施例中，抗体基本上不结合于包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的蛋白质。在某些实施例中，抗体特异性结合于包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的蛋白质。在某些实施例中，抗体特异性结合于包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的蛋白质，并且基本上不结合于包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的蛋白质。在某些实施例中，抗体基本上不结合于由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成或基本上由其组成的蛋白质。在某些实施例中，抗体特异性结合于由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成或基本上由其组成的蛋白质。在某些实施例中，抗体特异性结合于由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成或基本上由其组成的蛋白质，并且基本上不结合于由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成或基本上由其组成的蛋白质。
在某些实施例中，所述抗体包含VH和VL，其中：(a)包含所述VH和所述VL各两个的F(ab')2结合于位于由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位；和/或(b)包含所述VH和所述VL的Fab结合于位于由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位，和任选地位于由SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。
在某些实施例中，所述抗体包含VH和VL，其中：(a)如果抗体被格式化为包含所述VH和所述VL各两个的F(ab')2，那么所述F(ab')2结合于位于由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位；和/或(b)如果抗体被格式化为包含所述VH和所述VL的Fab，那么所述Fab结合于位于由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位，和任选地位于由SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。
在某些实施例中，所述抗体包含VH和VL，其中：(a)如通过氢/氘交换分析法所测量，包含所述VH和所述VL各两个的F(ab')2使由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的CD137的区域中氢与氘的交换相对于在缺乏所述F(ab')2下相同区域中氢与氘的交换显著减少；以及(b)如通过氢/氘交换分析法所测量，包含所述VH和所述VL的Fab不使由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的CD137的区域中氢与氘的交换相对于在缺乏所述Fab下相同区域中氢与氘的交换显著减少。
在某些实施例中，所述抗体包含VH和VL，其中：(a)如果抗体被格式化为包含所述VH和所述VL各两个的F(ab')2，那么如通过氢/氘交换分析法所测量，所述F(ab')2使由SEQID NO:34的氨基酸序列组成的CD137的区域中氢与氘的交换相对于在缺乏所述F(ab')2下相同区域中氢与氘的交换显著减少；以及(b)如果抗体被格式化为包含所述VH和所述VL的Fab，那么如通过氢/氘交换分析法所测量，所述Fab不使由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的CD137的区域中氢与氘的交换相对于在缺乏所述Fab下相同区域中氢与氘的交换显著减少。
在某些实施例中，抗体特异性结合于包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的蛋白质，抗体不特异性结合于包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，其中抗体特异性结合于包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的蛋白质；并且抗体不特异性结合于包含SEQID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。
在某些实施例中，本文公开的抗体是人类抗体。在某些实施例中，本文公开的抗体是多特异性抗体。
在某些实施例中，本文公开的抗体缀合于细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、毒素、放射性核素或可检测标记。在某些实施例中，抗体缀合于第二抗体。
在另一方面，本公开提供了一种分离的多核苷酸，其编码如本文中所公开的抗体的VH和/或VL或重链和/或轻链。在另一方面，本公开提供了一种载体，其包含如本文中所公开的多核苷酸。在另一方面，本公开提供了一种重组宿主细胞，其包含如本文中所公开的多核苷酸或载体。
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含如本文中所公开的抗体、多核苷酸、载体或宿主细胞；和药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一方面，本公开提供了一种产生特异性结合于人CD137的抗体的方法，所述方法包含在使多核苷酸表达并产生抗体的合适条件下培养如本文中所公开的宿主细胞。
在另一方面，本公开提供了一种增加受试者中的免疫反应的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的如本文中所公开的抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物。
在另一方面，本公开提供了一种回应于抗原而增加受试者中T细胞活化和/或NK细胞活化的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的如本文中所公开的抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的如本文中所公开的抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物。
在某些实施例中，所述抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物全身性施用。在某些实施例中，所述抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物静脉内施用。在某些实施例中，所述抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物皮下、瘤内施用或递送至肿瘤引流淋巴结。
在某些实施例中，本文公开的增加受试者中的免疫反应的方法、回应于抗原而增加受试者中T细胞活化和/或NK细胞活化的方法或治疗受试者的癌症的方法进一步包含向所述受试者施用额外治疗剂。在某些实施例中，额外治疗剂是化疗剂。在某些实施例中，额外治疗剂为检查点靶向剂。在某些实施例中，检查点靶向剂选自由以下组成的群组：拮抗剂抗PD-1抗体、拮抗剂抗PD-L1抗体、拮抗剂抗PD-L2抗体、拮抗剂抗CTLA-4抗体、拮抗剂抗TIM-3抗体、拮抗剂抗LAG-3抗体、拮抗剂抗VISTA抗体、拮抗剂抗CD96抗体、拮抗剂抗CEACAM1抗体、拮抗剂抗TIGIT抗体、激动剂抗GITR抗体和激动剂抗OX40抗体。在某些实施例中，额外治疗剂是抗PD-1抗体，任选地其中所述抗PD-1抗体是派姆单抗(pembrolizumab)或纳武单抗(nivolumab)。在某些实施例中，额外治疗剂是吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂。在某些实施例中，抑制剂选自由艾卡哚司他(epacadostat)、F001287、吲哚莫德(indoximod)和NLG919组成的群组。在某些实施例中，额外治疗剂是疫苗。在某些实施例中，疫苗包括包含热休克蛋白与抗原肽复合的热休克蛋白肽复合物(HSPPC)。在某些实施例中，热休克蛋白是hsc70并与肿瘤相关抗原肽复合。在某些实施例中，热休克蛋白是gp96蛋白并与肿瘤相关抗原肽复合，其中HSPPC来源于从受试者获得的肿瘤。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的如本文中所公开的抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物。
附图说明
图1A和1B是一系列流式细胞术图，其展示抗CD137抗体BA001或IgG1同型对照抗体与在细胞表面上表达人CD137(图1A)或食蟹猕猴CD137(图1B)的细胞的结合。在图1A中，评估被工程化成在表面上表达人CD137的Jurkat细胞(左图)、表达内源性CD137的活化的人CEM/C1T细胞(中间图)或活化的人原代CD8+T细胞(右图)与人CD137的结合。在图1B中，评估被工程化成在表面上表达食蟹猕猴CD137的Jurkat细胞(左图)或活化的食蟹猕猴原代CD8+T细胞(右图)与食蟹猕猴CD137的结合。
图2A和2B是表面等离子体共振图，其展示在CD137/BA001-F(ab')2复合物的情况下人CD137L与人CD137的结合。在图2A中，BA001-F(ab')2结合于流槽，并且接着CD137流过流槽，由此形成CD137/BA001-F(ab')2复合物。接着CD137L流过流槽，并显示与复合物结合。在图2B中，预先形成的CD137/BA001-F(ab')2复合物首先与流槽结合。接着CD137L流过流槽，并显示与复合物结合。
图3A-3C是展示抗人CD137抗体BA001不阻断CD137L与CD137结合的图。图3A是一系列流式细胞术曲线图，其展示BA001不阻断在表面上表达CD137L的细胞与在表面上表达CD137的细胞的结合。曲线图的顶行展示每种抗体的侧向散射(SSC)和前向散射(FSC)信号，而曲线图的底行展示每种抗体的Jurkat-CD137(PE)和Jurkat-CD137L(FITC)信号。图3B和3C是展示在表达抗CD137L的细胞和表达CD137的细胞的共培养物中缀合细胞占总细胞数的百分比的图，其中抗CD137抗体或同型对照抗体在两种类型细胞组合在混合培养物中之前(图3B)或之后(图3C)加入。
图4A至4B是展示抗CD137抗体BA001的交联依赖性的图。图4A示出在不存在1μg/mLCD137L下与2μg/mL交联BA001、同型对照或参考抗CD137抗体#2一起培育的表达人CD137的Jurkat细胞中的NFκB-荧光素酶报告体活性。报告体活性由发光水平表示，并针对交联剂(AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG)与抗体的摩尔比对数绘图。图4B展示与表达CD16的CHO细胞共同培养的表达人CD137的Jurkat细胞中的NFκB-荧光素酶报告体活性。
图5是展示人外周血单核细胞(PBMC)中在葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激后由抗CD137抗体(即BA001和两种参考抗CD137抗体)或对应同型对照抗体(即分别IgG1、IgG2和IgG4同型对照抗体)诱导的IL-2产生的图。
图6A-6C是展示经抗CD3抗体刺激的纯化的人T细胞中由抗CD137抗体诱导的IL-2产生的图(图6A和6B)。通过流式细胞术评估这些实验中所用的纯化的人T细胞中CD137L的表达。在这些细胞上未观测到可检测的CD137L表达(图6C)。
图7A是展示Jurkat报告细胞中在1μg/mL CD137L存在或缺乏下抗CD137抗体BA001的交联和配体依赖性的图。图7B是展示CD137和CD137L在Jurkat报告细胞的表面上的表达(或缺乏其)的直方图。从刚解冻的细胞(“0h”)、解冻后培养4小时的细胞(“4h”)和解冻后培养24小时的细胞(“24h”)分析表达。
图8A-8D是展示表达人CD137(图8A和8B)或食蟹猕猴CD137(图8C和8D)并与抗CD137抗体BA001或同型对照抗体的连续稀释液一起培育的Jurkat细胞中的NFκB-荧光素酶报告体活性的图。在一组样品中，细胞还在人CD137L存在(图8B和8D)或缺乏(图8A和8C)下培育。
图9A-9C是展示表达人CD137并与(i)2μg/ml抗CD137抗体(BA001或两种参考抗CD137抗体之一)或适当同型对照抗体以及(ii)人CD137L(配体)的连续稀释液一起培育的Jurkat细胞中的NFκB-荧光素酶报告体活性的一系列图。在第一组样品中，在CD137L之前加入抗CD137抗体或同型对照抗体(图9A)。在第二组样品中，抗CD137抗体或同型对照抗体与CD137L同时加入(图9B)。在第三组样品中，CD137L在抗CD137抗体或同型对照抗体之前加入(图9C)。
图10A是展示人外周血单核细胞(PBMC)中在葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激后由BA001的Fc变体或对应同型对照抗体诱导的IL-2产生的图。
图10B是展示人外周血单核细胞(PBMC)中在葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激后由BA001的Fc变体或对应同型对照抗体的连续稀释液诱导的IL-2产生的图。
图11是表达人或食蟹猕猴CD137并与BA001的Fc变体或适当同型对照抗体的连续稀释液一起培育的Jurkat细胞中的一系列NFκB-荧光素酶报告体活性。在一组样品中，细胞还在人CD137L存在(右列)或不存在(左列)下培育。
图12A和12B是展示人外周血单核细胞(PBMC)中在葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激后由抗体诱导的IL-2产生的图。图12A中测试的抗体包括抗CD137抗体BA001、同型对照抗体、抗PD-1抗体和BA001与抗PD-1抗体的组合。在图12B中测试的抗体包括抗CD137抗体BA001、同型对照抗体、抗OX40抗体和BA001与抗OX40抗体的组合。
图13是人CD137和食蟹猕猴CD137的序列比对。“*”(星号)指示具有单一完全保守残基的位置。“:”(冒号)指示具有强烈相似性质的组之间的保守性。“.”(句点)指示具有微弱相似性质的组之间的保守性。当人CD137结合于BA001-F(ab')2时，以点线加框的区域(DPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCD，SEQ ID NO:34)显示氘吸收轻度减少，这可能是因为在此区域发生CD137均二聚。当人CD137结合于BA001-Fab时，以实线加框的区域(FNDQKRGICRPWTNCSL，SEQ ID NO:26)显示氘吸收强烈减少。
图14A和14B是展示通过FACS进行BA001的表位定位的一系列图。在图14A中，针对所示的每个区域产生CD137的一系列人至鼠序列转换突变体(即5014、5015、5016、5017和5018，参见下表5)。接着这些突变构建体转染至Jurkat细胞中，通过FACS分析抗CD137抗体的结合。图14B展示BA001、参考抗CD137抗体#1和#2(分别“参考#1”和“参考#2”)和同型对照抗体与表达上述每一转换突变体的工程化Jurkat细胞的细胞结合数据。
图15A-15C展示通过表面等离子体共振(SPR)分析对CD137表位的精细定位。图15A是人CD137和鼠CD137的序列比对。「*」(星号)指示具有单一完全保守残基的位置。“:”(冒号)指示具有强烈相似性质的组之间的保守性。“.”(句点)指示具有微弱相似性质的组之间的保守性。以实线加框的区域(FNDQKRGICRPWTNCSL，SEQ ID NO:26)是如图13中所示，通过氢/氘交换分析法鉴别的表位区域。以点线加框的区域(LTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNC，SEQ ID NO:30)是使用如图14A和14B所示的人-小鼠融合构建体，由结合分析法鉴别的5017区域。通过实线突出的区域(KRGI，SEQ ID NO:43)指示已经在人与鼠CD137之间转换以产生嵌合蛋白的氨基酸序列。图15B是展示通过SPR分析法，BA001与人CD137和嵌合蛋白“人至小鼠”和“小鼠至人”的结合的传感图。图15C是在类似SPR分析法中展示参考抗CD137抗体#1(“参考#1”)与相同CD137蛋白的结合的传感图。
图16A-16D是如通过酶联免疫吸附分析法(ELISA)使用荧光标记作为读数所测量，展示四个BA001变体BA049、BA050、BA051和BA052与人CD137(图16A)、食蟹猕猴CD137(图16B)、小鼠-人融合构建体5017(“mCD137-人112-139”)(图16C)和小鼠-人融合构建体5015(“mCD137-人53-80”)(图16D)的胞外结构域的结合的一系列图。中值荧光强度水平针对抗CD137抗体的浓度绘图。
具体实施方式
本公开提供了特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)并增加或促进CD137功能，例如CD137介导的免疫活化的抗体。还提供了包含这些抗体的药物组合物、编码这些抗体的核酸、用于产生这些抗体的表达载体和宿主细胞以及使用这些抗体治疗受试者的方法。本文公开的抗体尤其可用于增加回应于抗原(例如肿瘤抗原或感染性疾病抗原)的T细胞活化，并且因此可用于治疗受试者的癌症或治疗或预防受试者的感染性疾病。本文所述的“分离的抗体”的所有情况都另外预期为可以但不必分离的抗体。本文所述的“分离的多核苷酸”的所有情况都另外预期为可以但不必分离的多核苷酸。本文所述的“抗体”的所有情况都另外预期为可以但不必分离的抗体。本文所述的“多核苷酸”的所有情况都另外预期为可以但不必分离的多核苷酸。
5.1定义
如本文所用，术语“约”和“大致”当用于修饰数值或数字范围时，指示比所述值或范围高5％至10％(例如高多达5％至10％)和低5％至10％(例如低多达5％至10％)的偏差保持在所叙述值或范围的预期含义内。
如本文所用，术语“CD137”是指在人体内由TNFRSF9基因编码的TNF受体超家族成员9(又称为4-1BB)。如本文所用，术语“人CD137”是指由野生型人CD137基因编码的CD137蛋白质(例如GenBankTM寄存编号NM_001561.5)或这类蛋白质的胞外结构域。不成熟人CD137蛋白质的一种示例性氨基酸序列提供为SEQ ID NO:25。成熟人CD137蛋白质的一种示例性氨基酸序列提供为SEQ ID NO:33。成熟人CD137蛋白质的胞外结构域的一种示例性氨基酸序列提供为SEQ ID NO:24。
如本文所用，术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”包括全长抗体、全长抗体的抗原结合片段以及包含抗体CDR、VH区和/或VL区的分子。抗体的实例包括(但不限于)单克隆抗体、以重组方式产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、内抗体、异源缀合抗体、抗体-药物缀合物、单域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼化抗体、亲和体、Fab片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗抗Id抗体)以及以上任一个的抗原结合片段。在某些实施例中，本文所述的抗体是指多克隆抗体群体。抗体可以属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如IgG2a或IgG2b)。在某些实施例中，本文所述的抗体是IgG抗体，或其类别(例如人IgG1或IgG4)或亚类。在一个特定实施例中，抗体是人源化单克隆抗体。在另一特定实施例中，抗体是人类单克隆抗体。
如本文所用，术语“VH区”和“VL区”分别是指包含FR(框架区)1、2、3和4以及CDR(互补决定区)1、2和3的单一抗体重链和轻链可变区(参见Kabat等人,(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》(NIH公开第91-3242号,贝塞斯达(Bethesda))，其以全文引用的方式并入本文中)。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区域已经由以下描述：Kabat等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》252,6609-6616(1977)；和Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》.(1991)；Chothia等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987)；以及MacCallum等人,《分子生物学杂志》262:732-745(1996)，这些文献全部以全文引用的方式并入本文中，其中在彼此比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或亚群。在某些实施例中，术语“CDR”是如由MacCallum等人,《分子生物学杂志》262:732-745(1996)和Martin A.《抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析(Protein Sequence and Structure Analysis ofAntibody Variable Domains)》,《抗体工程(Antibody Engineering)》,Kontermann和Dubel编,第31章,第422-439页,柏林施普林格出版社(Springer-Verlag,Berlin)(2001)定义的CDR。在某些实施例中，术语“CDR”是如由Kabat等人,《生物化学杂志》252,6609-6616(1977)和Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(1991)定义的CDR。在某些实施例中，抗体的重链CDR和轻链CDR使用不同惯例来界定。举例来说，在某些实施例中，重链CDR根据MacCallum(上述)界定，并且轻链CDR根据Kabat(上述)界定。CDRH1、CDRH2和CDRH3表示重链CDR，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3表示轻链CDR。
如本文所用，术语“框架(FR)氨基酸残基”是指在免疫球蛋白链的框架区中的那些氨基酸。如本文所用，术语“框架区”或“FR区”包括作为可变区的一部分，但不是CDR的一部分(例如使用CDR的Kabat或MacCallum定义)的氨基酸残基。
如本文所用，术语“可变区”和“可变结构域”可互换地使用并且是本领域中常见的。可变区通常是指抗体的一部分，一般是轻链或重链的一部分，通常是成熟重链中的约氨基端110至120个氨基酸或110至125个氨基酸和成熟轻链中的约90至115个氨基酸，其在抗体之间在序列上有很大差异并用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中。序列可变性集中在被称作互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中的更高度保守区被称作框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，相信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施例中，可变区是人可变区。在某些实施例中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和人框架区(FR)。在特定实施例中，可变区是灵长类动物(例如非人灵长类动物)可变区。在某些实施例中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和灵长类动物(例如非人灵长类动物)框架区(FR)。
术语“VL”和“VL结构域”可互换用于指抗体的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换用于指抗体的重链可变区。
如本文所用，术语“恒定区”和“恒定域”是可互换的并且是本领域中常见的。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合但可以展现各种效应功能，如与Fc受体(例如Fcγ受体)的相互作用的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基端部分。免疫球蛋白分子的恒定区通常具有相对于免疫球蛋白可变结构域来说更为保守的氨基酸序列。
如本文所用，术语“重链”当关于抗体使用时可以指基于恒定域的氨基酸序列的任何不同类型，例如α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)和μ(μ)，其分别产生抗体的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别，包括IgG的亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
如本文所用，术语“轻链”当关于抗体使用时可以指基于恒定域的氨基酸序列的任何独特类型，例如κ(κ)或λ(λ)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。在特定实施例中，轻链是人轻链。
如本文所用，术语“EU编号系统”是指如以下所描述的抗体的恒定区的EU编号惯例：Edelman,G.M.等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)》,63,78-85(1969)和Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》,美国卫生与公众服务部(U.S.Dept.Healthand Human Services),第5版,1991，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
“结合亲和力”一般是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用的总强度。除非另外指示，否则如本文所用「结合亲和力」是指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的内源性结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力一般可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以按本领域中已知的多种方式测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD是由koff/kon的商计算的，而KA是由kon/koff的商计算的。kon是指例如抗体与抗原的缔合速率常数，并且koff是指例如抗体与抗原的解离速率常数。kon和koff可以通过本领域普通技术人员已知的技术，如或KinExA来确定。如本文所用，“较低亲和力”是指较大KD。
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”、“免疫特异性结合”以及“免疫特异性识别”是抗体背景下的类似术语，并且是指与抗原(例如表位或免疫复合物)结合的分子，严格来说这种结合是本领域普通技术人员所理解的。举例来说，特异性结合于抗原的分子可以结合于其它肽或多肽，通常以较低亲和力结合，如通过例如免疫分析法、KinExA 3000仪器(爱达荷州博伊西(Boise,ID)的Sapidyne Instruments)或本领域中已知的其它分析法所测定。在一特定实施例中，特异性结合于抗原的分子以当分子非特异性结合于另一抗原时的KA的至少2个log(即，10的系数)、2.5个log、3个log、4个log或更大的KA结合于抗原。
在另一特定实施例中，特异性结合于抗原的分子不与其它蛋白质在类似结合条件下交叉反应。在另一特定实施例中，特异性结合于CD137的分子不与其它非CD137蛋白交叉反应。在一特定实施例中，本文提供了一种抗体，其以比针对另一不相关抗原高的亲和力结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)。在某些实施例中，本文提供了一种抗体，如根据例如放射免疫分析法、表面等离子体共振或动力排阻分析法所测量，以比结合于另一不相关抗原高20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的亲和力结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)。在一特定实施例中，本文所述的抗CD137抗体与不相关非CD137蛋白的结合程度小于抗体与CD137蛋白的结合的10％、15％或20％，如根据例如放射免疫分析法所测量。
如本文所用，「基本上不抑制」B意指相对于不存在A下的B，在A存在下不使B减少超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。
如本文所用，如果例如在给定实验中或使用来自多个实验的平均值，B基本上随着指定域内A增加而增加，那么在A值的指定域内B是A的“基本上递增函数”。此定义允许与A的指定值对应的B值相对于与A的任何更低值对应的B值低多达1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％或20％。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语并且是指可以与抗体特异性结合的局部抗原区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或表位可以例如由一个或多个多肽的两个或更多个非连续区集合在一起(构象、非线性、不连续或非连续表位)。在某些实施例中，抗体所结合的表位可以通过例如NMR光谱法、X射线衍射晶体学研究、ELISA分析法、氢/氘交换联合质谱法(例如液相色谱法电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描分析法(例如使用CLIPS(肽化学连接至骨架上)定位不连续或构象表位的限制肽)和/或诱变定位(例如定点诱变定位)确定。在X射线晶体学中，结晶可以使用本领域中的已知方法中的任一种实现(例如GiegéR等人,(1994)《结晶学报D辑：生物结晶学(Acta Crystallogr D BiolCrystallogr)》50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)《欧洲生物化学杂志(Eur JBiochem)》189:1-23；Chayen NE(1997)《结构(Structure)》5:1269-1274；McPherson A(1976)《生物化学杂志》251:6300-6303，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中)。抗体:抗原晶体可以使用众所周知的X射线衍射技术研究并且可以使用计算机软件细化，所述计算机软件如X-PLOR(耶鲁大学(Yale University),1992,由MolecularSimulations,Inc.分发；参见例如《酶学方法(Meth Enzymol)》(1985)第114与115卷,Wyckoff HW等人编；U.S.2004/0014194)和BUSTER(Bricogne G(1993)《结晶学报D辑：生物结晶学》49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)《酶学方法》276A:361-423,Carter CW编；Roversi P等人,(2000)《结晶学报D辑：生物结晶学》56(Pt 10):1316-1323)，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。诱变定位研究可以使用本领域技术人员已知的任何方法实现。关于诱变技术(包括丙氨酸扫描诱变技术)的描述，参见例如Champe M等人,(1995)《生物化学杂志》270:1388-1394和Cunningham BC与Wells JA(1989)《科学(Science)》244:1081-1085，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。CLIPS(肽化学连接至骨架上)是以结构受限构型呈现一种或多种肽以表现为复杂蛋白质结构域的功能模拟物的技术。参见例如美国公开第US 2008/0139407 A1号和第US 2007/099240 A1号和美国专利第7,972,993号，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在一个特定实施例中，使用丙氨酸扫描诱变研究确定抗体的表位。在一特定实施例中，抗体的表位使用氢/氘交换联合质谱法来确定。在一特定实施例中，抗体的表位使用来自PepscanTherapeutics的CLIPS表位定位技术来确定。在一特定实施例中，抗体的表位通过蛋白质诱变，例如通过用来自另一物种的抗原的直系同源物的部分产生所述抗原的转换突变体并且接着测试所述转换突变体与抗体的结合的丧失来确定(例如通过如本文所述的基于FACS的细胞结合分析法)。
如本文所用，术语“位于”人CD137的区域“内的表位”是指包含指定区域的氨基酸残基中的一个或多个残基的表位。在某些实施例中，表位包含位于指定区域内的氨基酸残基中的每一个残基。在某些实施例中，表位由位于指定区域内的氨基酸残基中的每一个残基组成。在某些实施例中，指定区域外的人CD137的一个或多个额外氨基酸残基连同位于指定区域内的表位一起结合于抗体。
如本文所用，术语“T细胞受体”和“TCR”可互换使用并且是指全长杂二聚αβ或γδTCR、全长TCR的抗原结合片段以及包含TCR CDR或可变区的分子。TCR的实例包括(但不限于)全长TCR、全长TCR的抗原结合片段、不具有跨膜和细胞质区的可溶TCR、含有由柔性连接子连接的TCR的可变区的单链TCR、由工程化的二硫键连接的TCR链、单特异性TCR、多特异性TCR(包括双特异性TCR)、TCR融合物、人TCR、人源化TCR、嵌合TCR、以重组方式产生的TCR和合成TCR。所述术语涵盖野生型TCR和遗传工程化的TCR(例如包含嵌合TCR链的嵌合TCR，其包括来自第一物种的TCR的第一部分和来自第二物种的TCR的第二部分)。
如本文所用，术语“CD137多聚水平”是指CD137分子的群体(例如在一种或多种细胞的表面上表达的CD137分子的群体)中多聚(例如二聚)CD137相比于单体CD137的相对量。
如本文所用，术语“主要组织相容性复合物”和“MHC”可互换使用并且是指MHC I类分子和/或MHC II类分子。
如本文所用，术语“肽-MHC复合物”是指有肽结合于MHC的本领域中公认的肽结合袋中的MHC分子(MHC I类或MHC II类)。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指本文所述的治疗性或预防性措施。“治疗”方法采用向患有疾病或病症或容易患这类疾病或病症的受试者施用抗体，以便对所述疾病或病症或复发性疾病或病症进行预防、治愈、延迟、降低其严重程度或改善其一种或多种症状，或是为了延长受试者的存活期，超过在没有这种治疗的情况下的预期存活期。
如本文所用，术语“有效量”在向受试者施用疗法的情形下是指实现所期望的预防或治疗作用的疗法的量。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。在一个实施例中，受试者是人或非人哺乳动物。在一个实施例中，受试者是人。
两个序列(例如氨基酸序列或核酸序列)之间的“同一性百分比”的确定可以使用数学算法实现。用于比较两个序列的数学算法的一特定非限制性实例是Karlin S与Altschul SF(1990)PNAS 87:2264-2268的算法，如Karlin S与Altschul SF(1993)PNAS90:5873-5877中所修改，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。这类算法并入Altschul SF等人,(1990)《分子生物学杂志》215:403的NBLAST和XBLAST程序中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序参数集进行，例如评分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序参数集进行BLAST蛋白质搜索，例如评分50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得带空位的比对以达成比较目的，可以如Altschul SF等人,(1997)《核酸研究(Nuc Acids Res)》25:3389-3402中所描述利用带空位的BLAST，所述文献以全文引用的方式并入本文中。或者，PSI BLAST可以用于进行迭代搜索，其检测分子之间的远距离关系(同上)。在使用BLAST、带空位的BLAST以及PSI Blast程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的万维网ncbi.nlm.nih.gov)。用于比较序列的数学算法的另一特定非限制性实例是Myers和Miller,1988,CABIOS 4:11-17的算法，所述文献以全文引用的方式并入本文中。这类算法并入ALIGN程序(2.0版)中，所述程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。
两个序列之间的同一性百分比可以在允许或不允许空位的情况下使用与上述类似的技术确定。在计算同一性百分比时，通常只对精确匹配计数。
5.2抗CD137分子
在一方面，本公开提供了特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)并增加或促进CD137功能的抗体。示例性抗体的氨基酸序列阐述于本文表1中。
表1.示例性抗CD137抗体的氨基酸序列
表2.示例性抗CD137抗体的VH、VL、scFv和全长重链和轻链序列
表3.最接近BA001的胚系基因
表4.人CD137的示例性序列
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含本文表1中所述的VH结构域的CDR中的一个、两个或全部三个CDR的VH结构域。在某些实施例中，抗体包含表1中所述的VH结构域之一的CDRH1。在某些实施例中，抗体包含表1中所述的VH结构域之一的CDRH2。在某些实施例中，抗体包含表1中所述的VH结构域之一的CDRH3。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含本文表1中所述的VL结构域的CDR中的一个、两个或全部三个CDR的VL结构域。在某些实施例中，抗体包含表1中所述的VL结构域之一的CDRL1。在某些实施例中，抗体包含表1中所述的VL结构域之一的CDRL2。在某些实施例中，抗体包含表1中所述的VL结构域之一的CDRL3。
在某些实施例中，抗体的CDR可以根据Kabat等人,《生物化学杂志》252,6609-6616(1977)和Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(1991)确定，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，抗体的轻链CDR根据Kabat确定，并且抗体的重链CDR根据MacCallum(上述)确定。
在某些实施例中，抗体的CDR可以根据Chothia编号方案确定，所述编号方案提及免疫球蛋白结构环的位置(参见例如Chothia C与Lesk AM,(1987),《分子生物学杂志》196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)《分子生物学杂志》273:927-948；Chothia C等人,(1992)《分子生物学杂志》227:799-817；Tramontano A等人,(1990)《分子生物学杂志》215(1):175-82；和美国专利第7,709,226号，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中)。典型地，当使用Kabat编号惯例时，Chothia CDRH1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，Chothia CDRH2环存在于重链氨基酸52至56处，并且Chothia CDRH3环存在于重链氨基酸95至102处，而Chothia CDRL1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDRL2环存在于轻链氨基酸50至56处，并且Chothia CDRL3环存在于轻链氨基酸89至97处。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDRH1环的末端在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入放在H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，那么环末端在32；如果仅存在35A，那么环末端在33；如果35A和35B都存在，那么环末端在34)。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包含本文表1中所公开的VH的Chothia VH CDR。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包含本文表1中所公开的VL的Chothia VL CDR。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包含本文表1中所公开的抗体Chothia VH CDR和Chothia VL CDR。在某些实施例中，特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体包含一个或多个CDR，其中Chothia和Kabat CDR具有相同氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)并且包含Kabat CDR与Chothia CDR的组合的分离的抗体
在某些实施例中，抗体的CDR可以根据MacCallum RM等人,(1996)《分子生物学杂志》262:732-745确定，其以全文引用的方式并入本文中。还参见例如Martin A.《抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析(Protein Sequence and Structure Analysis ofAntibody Variable Domains)》,《抗体工程(Antibody Engineering)》,Kontermann和Dubel编,第31章,第422-439页,柏林施普林格出版社(2001)，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，抗体的CDR可以根据IMGT编号系统确定，如Lefranc M-P,(1999)《免疫学家(The Immunologist)》7:132-136和Lefranc M-P等人,(1999)《核酸研究》27:209-212中所述，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。根据IMGT编号方案，CDRH1处于位置26至35处，CDRH2处于位置51至57处，CDRH3处于位置93至102处，CDRL1处于位置27至32处，CDRL2处于位置50至52处，并且CDRL3处于位置89至97处。
在某些实施例中，本公开提供了特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)并且包含本文表1中所公开的抗体的CDR的抗体，如通过例如如Lefranc M-P(1999)上述和Lefranc M-P等人,(1999)上述中所述的IMGT编号系统所确定。
在某些实施例中，抗体的CDR可以根据AbM编号方案确定，所述编号方案提及AbM高变区，其代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(Oxford Molecular Group,Inc.)使用，其以全文引用的方式并入本文中。在一具体实施例中，本公开提供了特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)并且包含本文表1中所公开的抗体的CDR的抗体，如通过AbM编号方案所确定。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列的重链可变区和包含VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3区氨基酸序列的轻链可变区，其中VH和VL的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:7和8、63和8、64和66、7和67或65和68中，并且其中每个CDR根据MacCallum定义、Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义与Chothia定义的组合、IMGT编号系统或CDR的AbM定义界定。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO:7中所述的VH结构域的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:8中所述的VL结构域的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列的轻链可变区，其中每个CDR根据CDR的MacCallum定义、Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义与Chothia定义的组合、IMGT编号系统或AbM定义界定。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含互补决定区(CDR)CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区(VH)和包含CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区(VL)，其中：
(a)CDRH1包含X1X2X3X4H(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列，其中
X1是G、A、D、E、L、N、Q、R、S或W；
X2是Y、F、H、N、R或S；
X3是Y或H；并且
X4是M、I、T或V；
(b)CDRH2包含WINPNSGGTNYAQRFQG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；
(c)CDRH3包含X1PX2YX3GX4GLX5X6(SEQ ID NO:83)的氨基酸序列，其中
X1是E或G；
X2是G、A、R或S；
X3是Y、F、H或S；
X4是S、A或T；
X5是D或G；并且
X6是Y或H；
(d)CDRL1包含GGDDIGDRRVH(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；
(e)CDRL2包含EDRYRPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和/或
(f)CDRL3包含QX1WX2X3X4X5X6X7PGV(SEQ ID NO:84)的氨基酸序列，其中
X1是V或I；
X2是D、A、E、G、H、N或Y；
X3是S、A、E、F、L、P、R、T、W或Y；
X4是S、A、L、M或R；
X5是S、A、F、G、L、P、Q、R或T；
X6是D、E、H、V或Y；并且
X7是H或Y。
在某些实施例中，CDRH1包含X1X2X3X4H(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列，其中X1是G、A、D、E、L、N、Q、R、S或W；X2是Y、F、H、N、R或S；X3是Y或H；并且X4是M、I、T或V。在某些实施例中，CDRH3包含X1PX2YX3GX4GLX5X6(SEQ ID NO:83)的氨基酸序列，其中X1是E或G；X2是G、A、R或S；X3是Y、F、H或S；X4是S、A或T；X5是D或G；并且X6是Y或H。在某些实施例中，CDRL3包含QX1WX2X3X4X5X6X7PGV(SEQ ID NO:84)的氨基酸序列，其中X1是V或I；X2是D、A、E、G、H、N或Y；X3是S、A、E、F、L、P、R、T、W或Y；X4是S、A、L、M或R；X5是S、A、F、G、L、P、Q、R或T；X6是D、E、H、V或Y；并且X7是H或Y。在某些实施例中，
(a)CDRH1包含X1X2X3X4H(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列，其中
X1是G、A、D、E、L、N、Q、R、S或W；
X2是Y、F、H、N、R或S；
X3是Y或H；并且
X4是M、I、T或V；
(b)CDRH2包含WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；
(c)CDRH3包含X1PX2YX3GX4GLX5X6(SEQ ID NO:83)的氨基酸序列，其中
X1是E或G；
X2是G、A、R或S；
X3是Y、F、H或S；
X4是S、A或T；
X5是D或G；并且
X6是Y或H；
(d)CDRL1包含GGDDIGDKRVH(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；
(e)CDRL2包含EDRYRPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；并且
(f)CDRL3包含QX1WX2X3X4X5X6X7PGV(SEQ ID NO:84)的氨基酸序列，其中
X1是V或I；
X2是D、A、E、G、H、N或Y；
X3是S、A、E、F、L、P、R、T、W或Y；
X4是S、A、L、M或R；
X5是S、A、F、G、L、P、Q、R或T；
X6是D、E、H、V或Y；并且
X7是H或Y。
在某些实施例中，
(a)CDRH1包含X1X2YX3H(SEQ ID NO:85)的氨基酸序列，其中
X1是G、A、D、L、R、S或W；
X2是Y、F、H或N；并且
X3是M或V；
(b)CDRH3包含EPGYX1GX2GLDX3(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中
X1是Y或F；
X2是S或T；并且
X3是Y或H；和/或
(c)CDRL3包含QVWX1X2X3X4X5X6PGV(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列，其中
X1是D、A、E、H、N或Y；
X2是S、A、E、L、R或T；
X3是S、A、L或R；
X4是S、A、F、G、L、P、Q或R；
X5是D、E或V；并且
X6是H或Y。
在某些实施例中，CDRH1包含X1X2YX3H(SEQ ID NO:85)的氨基酸序列，其中X3是G、A、D、L、R、S或W；X2是Y、F、H或N；并且X3是M或V。在某些实施例中，CDRH3包含EPGYX1GX2GLDX3(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中X3是Y或F；X2是S或T；并且X3是Y或H。在某些实施例中，CDRL3包含QVWX1X2X3X4X5X6PGV(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列，其中X3是D、A、E、H、N或Y；X2是S、A、E、L、R或T；X3是S、A、L或R；X4是S、A、F、G、L、P、Q或R；X5是D、E或V；并且X6是H或Y。在某些实施例中，
(a)CDRH1包含X1X2YX3H(SEQ ID NO:85)的氨基酸序列，其中
X1是G、A、D、L、R、S或W；
X2是Y、F、H或N；并且
X3是M或V；
(b)CDRH3包含EPGYX1GX2GLDX3(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中
X1是Y或F；
X2是S或T；并且
X3是Y或H；并且
(c)CDRL3包含QVWX1X2X3X4X5X6PGV(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列，其中
X1是D、A、E、H、N或Y；
X2是S、A、E、L、R或T；
X3是S、A、L或R；
X4是S、A、F、G、L、P、Q或R；
X5是D、E或V；并且
X6是H或Y。
在某些实施例中，CDRH1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施例中，CDRH3包含SEQ ID NO:3或59的氨基酸序列。在某些实施例中，CDRL3包含SEQ ID NO:6、61、62或63的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含分别SEQ ID NO:1、2和3或SEQ ID NO:1、2和59中所述的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列的VH结构域。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含分别SEQ ID NO:4、5和6、SEQ ID NO:4、5和60、SEQ ID NO:4、5和61或SEQ ID NO:4、5和62中所述的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列的VL结构域。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区的重链可变区和包含CDRL1、CDRL2和CDRL3区的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含分别SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6、SEQ ID NO:1、2、59、4、5和6、SEQ ID NO:1、2、3、4、5和60、SEQ ID NO:1、2、3、4、5和61或SEQ ID NO:1、2、3、4、5和62中所述的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包含：
(a)CDRH1包含GYYMH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；
(b)CDRH2包含WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；
(c)CDRH3包含EPGYYGSGLDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；
(d)CDRL1包含GGDDIGDKRVH(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；
(e)CDRL2包含EDRYRPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和/或
(f)CDRL3包含QVWDSSSDHPGV(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含分别SEQ ID NO:1、2和3中所述的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列的VH结构域。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含分别SEQ IDNO:4、5和6中所述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列的VL结构域。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其中所述抗体包括包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区的重链可变区和包含CDRL1、CDRL2和CDRL3区的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含分别SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6中所述的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其包括包含与SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施例中，所述重链可变区包含SEQID NO:63、64或65的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其包括包含与SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施例中，所述轻链可变区包含SEQID NO:66、67或68的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其包含包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其包括包含与SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施例中，重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO:63和8、64和66、7和67或65和68的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其包含具有来源于人IGHV1-2胚系序列(例如具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的IGHV1-2*02)的氨基酸序列的重链可变区。选自框架1、框架2、框架3、CDRH1和CDRH2的一个或多个区(例如，这些区中的两个、三个、四个或五个)可以来源于人IGHV1-2胚系序列(例如具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的IGHV1-2*02)。在一个实施例中，框架1、框架2、框架3、CDRH1和CDRH2都来源于人IGHV1-2胚系序列(例如具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的IGHV1-2*02)。在某些实施例中，重链可变区包含SEQ ID NO:3中所述的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其包含具有来源于人IGLV3-21胚系序列(例如具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的IGLV3-21*02，或IGLV3-21*03)的氨基酸序列的轻链可变区。选自框架1、框架2、框架3、CDRL1和CDRL2的一个或多个区(例如这些区中的两个、三个、四个或五个)可以来源于人IGLV3-21胚系序列(例如具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的IGLV3-21*02，或IGLV3-21*03)。在一个实施例中，框架1、框架2、框架3、CDRL1和CDRL2都来源于人IGLV3-21胚系序列(例如具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的IGLV3-21*02，或IGLV3-21*03)。在某些实施例中，轻链可变区包含SEQ ID NO:6中所述的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，其包含具有来源于人IGHV1-2胚系序列(例如具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的IGHV1-2*02)的氨基酸序列的重链可变区和具有来源于人IGLV3-21胚系序列(例如具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的IGLV3-21*02，或IGLV3-21*03)的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施例中，重链可变区包含SEQ ID NO:3中所述的氨基酸序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:6中所述的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种分离的抗体，其与包含分别SEQ ID NO:7和8中所述的重链和轻链可变区氨基酸序列的抗体交叉竞争结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)
在某些实施例中，本公开提供了一种分离的抗体，其与本文所述的抗体，例如包含分别SEQ ID NO:7和8中所述的重链和轻链可变区氨基酸序列的抗体结合于相同或重叠的CD137的表位(例如人CD137的表位或食蟹猕猴CD137的表位)。在某些实施例中，抗体的表位可以通过例如NMR光谱法、表面等离子体共振X射线衍射晶体学研究、ELISA分析法、氢/氘交换联合质谱法(例如液相色谱法电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描分析法和/或诱变定位(例如定点诱变定位)确定。在X射线晶体学中，结晶可以使用本领域中的已知方法中的任一种实现(例如GiegéR等人,(1994)《结晶学报D辑：生物结晶学》50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)《欧洲生物化学杂志》189:1-23；Chayen NE(1997)《结构》5:1269-1274；McPherson A(1976)《生物化学杂志》251:6300-6303，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中)。抗体:抗原晶体可以使用众所周知的X射线衍射技术研究并且可以使用计算机软件细化，所述计算机软件如X-PLOR(耶鲁大学(YaleUniversity),1992,由Molecular Simulations,Inc.分发；参见例如《酶学方法》(1985)第114与115卷,Wyckoff HW等人编；美国专利申请第2004/0014194号)和BUSTER(Bricogne G(1993)《结晶学报D辑：生物结晶学》49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)《酶学方法》276A:361-423,Carter CW编；Roversi P等人,(2000)《结晶学报D辑：生物结晶学》56(Pt10):1316-1323)，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。诱变定位研究可以使用本领域技术人员已知的任何方法实现。关于诱变技术(包括丙氨酸扫描诱变技术)的描述，参见例如Champe M等人,(1995)上述和Cunningham BC与Wells JA(1989)上述。在一个特定实施例中，使用丙氨酸扫描诱变研究确定抗体的表位。另外，识别和结合于相同或重叠的CD137表位(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体可以使用常规技术，例如免疫分析法，例如通过展示抗体阻断另一抗体与靶抗原结合的能力，即竞争性结合分析法来鉴别。竞争性结合分析法还可以用于确定两种抗体是否对表位具有类似结合特异性。竞争性结合可以在其中测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原，例如CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的特异性结合的分析法中确定。许多类型的竞争性结合分析法是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析法(EIA)、夹心竞争分析法(参见Stahli C等人,(1983)《酶学方法》9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland TN等人,(1986)《免疫学杂志(J Immunol)》137:3614-9)；固相直接标记分析法、固相直接标记夹心分析法(参见Harlow E与Lane D,(1988)《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel GA等人,(1988)《分子免疫学(Mol Immunol)》25(1):7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Cheung RC等人,(1990)《病毒学(Virology)》176:546-52)；和直接标记RIA(参见Moldenhauer G等人,(1990)《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand J Immunol)》32:77-82)，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。通常，这类分析法包括使用纯化抗原(例如CD137，例如人CD137或食蟹猕猴CD137)，其结合于载有未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白中的任一个的固体表面或细胞。竞争性抑制可以通过测定在测试免疫球蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。测试免疫球蛋白通常过量存在。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。竞争结合分析法可以按许多不同格式使用标记的抗原或标记的抗体配置。在这一分析法的常见版本中，抗原固定在96孔板上。未标记的抗体阻断标记的抗体结合于抗原的能力然后使用放射性或酶标记进行测量。关于其它细节，参见例如Wagener C等人,(1983)《免疫学杂志》130:2308-2315；Wagener C等人,(1984)《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》68:269-274；Kuroki M等人,(1990)《癌症研究(Cancer Res)》50:4872-4879；Kuroki M等人,(1992)《免疫学研究(Immunol Invest)》21:523-538；Kuroki M等人,(1992)《杂交瘤(Hybridoma)》11:391-407；和《抗体：实验室手册》,Harlow E与Lane D编辑编上文,第386-389页，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于人CD137的抗体或分离的抗体，其中(a)所述抗体特异性结合于包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的蛋白质；并且(b)所述抗体不特异性结合于包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于人CD137的抗体或分离的抗体，其中所述抗体以比对具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的蛋白质低的亲和力特异性结合于具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于人CD137的抗体或分离的抗体，其中所述抗体不特异性结合于具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于人CD137的抗体或分离的抗体，其中所述抗体与具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质之间的结合相对于所述抗体与具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的蛋白质之间的结合显著减弱。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于人CD137的抗体或分离的抗体，其中相比于与具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的蛋白质，所述抗体展现减少的与具有SEQ IDNO:38的氨基酸序列的蛋白质的结合或不结合。
在另一方面，本公开提供了一种抗体或分离的抗体，其特异性结合于与本发明的任何抗体相同的人CD137的表位。在某些实施例中，抗体以比具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的蛋白质低的亲和力特异性结合于具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在某些实施例中，抗体不特异性结合于具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在某些实施例中，抗体与具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质之间的结合相对于抗体与具有SEQ IDNO:37的氨基酸序列的蛋白质之间的结合显著减弱。在一个实施例中，相比于与具有SEQ IDNO:37的氨基酸序列的蛋白质，所述抗体展现减少的与具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质的结合或不结合。
在某些实施例中，分离的抗体结合于位于包含SEQ ID NO:26-31和43中的任一个的氨基酸序列的人CD137的区域内的表位。在某些实施例中，分离的抗体结合于位于基本上由SEQ ID NO:26-31和43中的任一个的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。在某些实施例中，分离的抗体结合于位于由SEQ ID NO:26-31和43中的任一个的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。在某些实施例中，分离的抗体结合于位于包含多个氨基酸序列的人CD137的区域内的不连续表位，所述多个氨基酸序列中的每一个由SEQ ID NO:26-31和43中的任一个的氨基酸序列组成、基本上由其组成或包含其。
在某些实施例中，分离的抗体结合于位于包含SEQ ID NO:26中所述的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的人CD137的区域内的表位。在另一方面，本公开提供了一种抗体，如通过氢/氘交换分析法所确定，其在结合于人CD137蛋白质或其片段时，相对于在不存在所述抗体下由SEQ ID NO:26中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换，减少由SEQ ID NO:26中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换。在某些实施例中，例如如实例中本文所述，使用氢-氘交换(HDX)，测量氢/氘交换的减少。
在某些实施例中，分离的抗体结合于位于包含SEQ ID NO:27中所述的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的人CD137的区域内的表位。在另一方面，本公开提供了一种抗体，如通过氢/氘交换分析法所确定，其在结合于人CD137蛋白质或其片段时，相对于在不存在所述抗体下由SEQ ID NO:27中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换，减少由SEQ ID NO:27中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换。在某些实施例中，例如如实例中本文所述，使用氢-氘交换(HDX)，测量氢/氘交换的减少。
在某些实施例中，分离的抗体结合于位于包含SEQ ID NO:28中所述的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的人CD137的区域内的表位。在另一方面，本公开提供了一种抗体，如通过氢/氘交换分析法所确定，其在结合于人CD137蛋白质或其片段时，相对于在不存在所述抗体下由SEQ ID NO:28中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换，减少由SEQ ID NO:28中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换。在某些实施例中，例如如实例中本文所述，使用氢-氘交换(HDX)，测量氢/氘交换的减少。
在某些实施例中，分离的抗体结合于位于包含SEQ ID NO:29中所述的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的人CD137的区域内的表位。在另一方面，本公开提供了一种抗体，如通过氢/氘交换分析法所确定，其在结合于人CD137蛋白质或其片段时，相对于在缺乏所述抗体下由SEQ ID NO:29中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换，减少由SEQ ID NO:29中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换。在某些实施例中，例如如实例中本文所述，使用氢-氘交换(HDX)，测量氢/氘交换的减少。
在某些实施例中，分离的抗体结合于位于包含SEQ ID NO:30中所述的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的人CD137的区域内的表位。在另一方面，本公开提供了一种抗体，如通过氢/氘交换分析法所确定，其在结合于人CD137蛋白质或其片段时，相对于在缺乏所述抗体下由SEQ ID NO:30中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换，减少由SEQ ID NO:30中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换。在某些实施例中，例如如实例中本文所述，使用氢-氘交换(HDX)，测量氢/氘交换的减少。
在某些实施例中，分离的抗体结合于位于包含SEQ ID NO:31中所述的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的人CD137的区域内的表位。在另一方面，本公开提供了一种抗体，如通过氢/氘交换分析法所确定，其在结合于人CD137蛋白质或其片段时，相对于在缺乏所述抗体下由SEQ ID NO:31中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换，减少由SEQ ID NO:31中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换。在某些实施例中，例如如实例中本文所述，使用氢-氘交换(HDX)，测量氢/氘交换的减少。
在某些实施例中，分离的抗体结合于位于包含KRGI(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的人CD137的区域内的表位。在某些实施例中，抗体结合于KRGI的至少一个、至少两个或至少三个氨基酸残基。在某些实施例中，抗体结合于KRGI的所有四个氨基酸残基。在另一方面，本公开提供了一种抗体，如通过氢/氘交换分析法所确定，其在结合于人CD137蛋白质或其片段时，相对于在缺乏所述抗体下由SEQ ID NO:43中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换，减少由SEQ ID NO:43中所述的氨基酸序列组成的区域中的氢/氘交换。在某些实施例中，例如如实例中本文所述，使用氢-氘交换(HDX)，测量氢/氘交换的减少。在另一方面，本公开提供了一种特异性结合于人CD137并且基本上不结合于鼠CD137的抗体。在某些实施例中，抗体特异性结合于包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的蛋白质，和/或基本上不结合于包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的蛋白质。在某些实施例中，抗体特异性结合于由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成或基本上由其组成的蛋白质，和/或基本上不结合于由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成或基本上由其组成的蛋白质。在某些实施例中，抗体特异性结合于由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成或基本上由其组成的蛋白质，并且基本上不结合于由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成或基本上由其组成的蛋白质。
在另一方面，本公开提供了一种抗体或分离的抗体，其结合，例如特异性结合于与本发明的抗体相同的人CD137的表位。在某些实施例中，例如如实例中所述，通过氢-氘交换(HDX)，或例如如实例中所述，通过蛋白质诱变，来确定表位。
在某些实施例中，抗体包含VH和VL，其中如果抗体被格式化为包含VH和VL各两个的F(ab')2，那么F(ab')2结合于位于由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。在某些实施例中，抗体包含VH和VL，其中如果抗体被格式化为包含VH和VL各两个的F(ab')2，那么如通过氢/氘交换分析法所测量，F(ab')2使由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的CD137的区域中氢与氘的交换相对于在缺乏F(ab')2下相同区域中氢与氘的交换显著减少(例如达至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。
在某些实施例中，抗体包含VH和VL，其中如果抗体被格式化为包含VH和VL的Fab，那么Fab结合于位于由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位，并且任选地位于由SEQ ID NO:28和/或29的氨基酸序列组成的人CD137的区域内。在某些实施例中，所述抗体包含VH和VL，其中：如果抗体被格式化为包含VH和VL的Fab，那么如通过氢/氘交换分析法所测量，Fab使由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成的CD137的区域中氢与氘的交换相对于在缺乏Fab下相同区域中氢与氘的交换显著减少(例如达至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)，并且任选地，使由SEQ ID NO:28和/或SEQID NO:29的氨基酸序列组成的CD137的区域中氢与氘的交换相对于在缺乏Fab下相同区域中氢与氘的交换下显著减少(例如达至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。
在某些实施例中，抗体包含VH和VL，其中如果抗体被格式化为包含各链包含VH和VL的两条链的F(ab')2，那么如通过氢/氘交换分析法所测量，F(ab')2使由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的CD137的区域中氢与氘的交换相对于在缺乏F(ab')2下相同区域中氢与氘的交换显著减少(例如达至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。在某些实施例中，抗体包含VH和VL，其中如果抗体被格式化为包含VH和VL的Fab，那么如通过氢/氘交换分析法所测量，Fab不使由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的CD137的区域中氢与氘的交换相对于在缺乏Fab下相同区域中氢与氘的交换显著减少(例如减少不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或30％)。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)并且不抑制人CD137与人CD137L的结合的分离的抗体。在某些实施例中，在抗体存在下人CD137与人CD137L的结合相对于在缺乏抗体下人CD137与人CD137L的结合减少不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。在某些实施例中，抗体不抑制人CD137的可溶性片段与人CD137L的可溶性片段的结合。在某些实施例中，在抗体存在下人CD137的可溶性片段与人CD137L的可溶性片段的结合相对于在缺乏抗体下人CD137的可溶性片段与人CD137L的可溶性片段的结合减少不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。在某些实施例中，抗体不抑制表达CD137的细胞与人CD137L的可溶性片段的结合。在某些实施例中，在抗体存在下表达CD137的细胞与人CD137L的可溶性片段的结合相对于在缺乏抗体下表达CD137的细胞与人CD137L的可溶性片段的结合减少不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。在某些实施例中，抗体不抑制表达CD137的细胞与表达CD137L的细胞的结合。在某些实施例中，在抗体存在下表达CD137的细胞与表达CD137L的细胞的结合相对于在缺乏抗体下表达CD137的细胞与表达CD137L的细胞的结合减少不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。
在某些实施例中，本文公开的抗体使CD137多聚(例如二聚或三聚)水平相对于在缺乏抗体下的CD137多聚水平增加至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。在某些实施例中，多聚CD137呈包含CD137和CD137L分子的复合物(例如包含三个CD137L分子和两个CD137分子的复合物，或包含三个CD137L分子和三个CD137分子的复合物)存在。在某些实施例中，在包含处于平衡的CD137和CD137L分子的体外系统中测量CD137多聚(例如二聚或三聚)水平，任选地，其中CD137分子在脂质双层膜中。在某些实施例中，在细胞中或在细胞的质膜上测量CD137多聚(例如二聚或三聚)水平。在某些实施例中，使用CD137的可溶性片段测量CD137多聚(例如二聚或三聚)水平。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、73、74、75、76、77或78中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:9中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:10中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:11中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:12中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:13中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:14中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:49中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:50中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:51中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:52中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:53中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:54中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:73中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:74中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:75中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:76中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:77中所述的氨基酸序列的重链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:78中所述的氨基酸序列的重链。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:21、79、80或81中所述的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:21中所述的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:79中所述的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:80中所述的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，抗体包括包含SEQID NO:81中所述的氨基酸序列的轻链。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、73、74、75、76、77或78的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21、79、80或81的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链；和包含SEQID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链；和包含SEQID NO:81的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的轻链。
在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、73、74、75、76、77或78的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21、79、80或81的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ IDNO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:50的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ IDNO:51的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:52的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:53的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:54的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:73的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:75的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:79的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQID NO:76的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:79的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:80的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:80的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:77的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:81的氨基酸序列组成的轻链。在某些实施例中，抗体包含由SEQ ID NO:78的氨基酸序列组成的重链；和由SEQ ID NO:81的氨基酸序列组成的轻链。
任何抗体格式可以用于本文公开的抗体。在某些实施例中，抗体是单链抗体或单链Fv(scFv)。在某些实施例中，抗体是与Fc区融合的scFv(scFv-Fc)。在某些实施例中，抗体是Fab片段。在某些实施例中，抗体是F(ab')2片段。
在某些实施例中，本文公开的抗体是特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)和第二抗原的多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
在某些实施例中，本文公开的抗体与特异性结合于第二抗原的第二抗体缀合。在某些实施例中，本文公开的抗体与第二抗体共价缀合。在某些实施例中，本文公开的抗体与第二抗体非共价缀合。在某些实施例中，本文公开的抗体与第二抗体交联。在某些实施例中，第二抗原是肿瘤相关抗原(例如在肿瘤中过表达的多肽、来源于致癌病毒的多肽、包含特异性针对肿瘤的翻译后修饰的多肽、在肿瘤中特异性突变的多肽)。在某些实施例中，肿瘤相关抗原是EGFR(例如人EGFR)、Her2(例如人Her2)或CD20(例如人CD20)。
在某些实施例中，本文公开的抗体缀合于细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、毒素、放射性核素或可检测标记。在某些实施例中，细胞毒性剂能够诱发与其接触的细胞死亡或毁灭。在某些实施例中，细胞生长抑制剂能够预防或基本上减少与其接触的细胞增殖和/或抑制细胞的活性或功能。在某些实施例中，细胞毒性剂或细胞生长抑制剂是一种化疗剂。在某些实施例中，放射性核素是由以下同位素组成的群组中选出：3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、90Y、99Tc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、211At、213Bi、225Ac和186Re。在某些实施例中，可检测标记包含荧光部分或点击化学手柄。
任何免疫球蛋白(Ig)恒定区都可以用于本文公开的抗体。在某些实施例中，Ig区是人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:15、16、17、18、19或20的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链恒定区。
在某些实施例中，一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入本文所述的抗体的Fc区(例如CH2结构域(人IgG1的残基231-340)和/或CH3结构域(人IgG1的残基341-447)和/或铰链区，根据EU编号系统编号)中，以改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。
在某些实施例中，一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入Fc区(CH1结构域)的铰链区中，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数目改变(例如增加或减少)，如例如美国专利第5,677,425号中所描述，所述专利以全文引用的方式并入本文中。CH1结构域的铰链区中的半胱氨酸残基的数目可以改变，以例如促进轻链和重链的装配，或改变(例如提高或降低)抗体的稳定性。
在一特定实施例中，一个、两个或更多个氨基酸突变(例如取代、插入或缺失)引入IgG恒定域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链-Fc结构域片段)中以改变(例如缩短或延长)抗体在体内的半衰期。关于改变(例如缩短或延长)抗体在体内的半衰期的突变的实例，参见例如国际公开第WO 02/060919号、第WO 98/23289号和第WO 97/34631号以及美国专利第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号和第6,165,745号，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，一个、两个或更多个氨基酸突变(例如取代、插入或缺失)引入IgG恒定域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链-Fc结构域片段)中以缩短抗体在体内的半衰期。在其它实施例中，一个、两个或更多个氨基酸突变(例如取代、插入或缺失)引入IgG恒定域或其FcRn结合片段(优选Fc铰链-Fc结构域片段)中以延长抗体在体内的半衰期。在一特定实施例中，抗体可以在第二恒定(CH2)域(人IgG1的残基231-340)和/或第三恒定(CH3)域(人IgG1的残基341-447)中具有一个或多个氨基酸突变(例如取代)，根据EU编号系统编号。在一特定实施例中，本文所述的抗体的IgG1的恒定区在位置252包含甲硫氨酸(M)至酪氨酸(Y)取代，在位置254包含丝氨酸(S)至苏氨酸(T)取代，并且在位置256包含苏氨酸(T)至谷氨酸(E)取代，根据EU编号系统编号。参见美国专利第7,658,921号，其以全文引用的方式并入本文中。已经展示这一类型的突变IgG(被称作“YTE突变体”)与相同抗体的野生型形式相比展现出半衰期的四倍延长(参见Dall'Acqua WF等人,(2006)《生物化学杂志》281:23514-24，其以全文引用的方式并入本文中)。在某些实施例中，抗体包含在位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436(根据EU编号系统编号)包含氨基酸残基的一个、两个、三个或更多个氨基酸取代的IgG恒定域。
在某些实施例中，一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入本文所述的抗体的Fc区(例如CH2结构域(人IgG1的残基231-340)和/或CH3结构域(人IgG1的残基341-447)和/或铰链区，根据EU编号系统编号)中，以提高或降低抗体对效应细胞表面上的Fc受体(例如活化的Fc受体)的亲和力。抗体的Fc区中提高或降低抗体对Fc受体的亲和力的突变以及将这类突变引入Fc受体或其片段中的技术是本领域的技术人员已知的。为改变抗体对Fc受体的亲和力而对抗体的Fc受体作出的突变的实例描述于例如Smith P等人,(2012)PNAS109:6181-6186，美国专利第6,737,056号，以及国际公开第WO 02/060919号、第WO 98/23289号和第WO 97/34631号，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，抗体包含作为野生型重链恒定区的变体的重链恒定区，其中变异重链恒定区与FcγRIIB的结合亲和力高于野生型重链恒定区与FcγRIIB的结合。在某些实施例中，变异重链恒定区是变异人重链恒定区，例如变异人IgG1、变异人IgG2或变异人IgG4重链恒定区。在某些实施例中，变异人IgG重链恒定区包含根据EU编号系统编号的以下氨基酸突变中的一个或多个：G236D、P238D、S239D、S267E、L328F和L328E。在某些实施例中，变异人IgG重链恒定区包含选自以下组成的群组的氨基酸突变集合：根据EU编号系统，S267E和L328F；P238D和L328E；P238D和选自以下组成的群组的一个或多个取代：E233D、G237D、H268D、P271G和A330R；P238D、E233D、G237D、H268D、P271G和A330R；G236D和S267E；S239D和S267E；V262E、S267E和L328F；以及V264E、S267E和L328F。在某些实施例中，FcγRIIB在选自以下组成的群组的细胞上表达：巨噬细胞、单核细胞、B细胞、树突状细胞、内皮细胞和活化T细胞。
在另一实施例中，一个、两个或更多个氨基酸取代引入IgG恒定域Fc区中以改变抗体的(一种或多种)效应功能。举例来说，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322(根据EU编号系统编号)的一个或多个氨基酸可以替换为不同氨基酸残基，使得抗体对效应配体的亲和力改变但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变了的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法更详细地描述于美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可能降低循环抗体的Fc受体结合，从而增强肿瘤定位。关于使恒定域缺失或失活从而增强肿瘤定位的突变的描述，参见例如美国专利第5,585,097号和第8,591,886号，所述专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，一个或多个氨基酸取代可以引入本文所述的抗体的Fc区中以去除Fc区上的可能会减少Fc受体结合的潜在糖基化位点(参见例如Shields RL等人,(2001)《生物化学杂志》276:6591-604，其以全文引用的方式并入本文中)。在各种实施例中，可以对本文所述的抗体的恒定区作出以下突变中的一个或多个：根据EU编号系统编号，N297A取代；N297Q取代；L235A取代和L237A取代；L234A取代和L235A取代；E233P取代；L234V取代；L235A取代；C236缺失；P238A取代；D265A取代；S267E取代和L328F取代；A327Q取代；或P329A取代。在某些实施例中，选自由以下组成的群组的突变可以在本文所述的抗体的恒定区中作出：D265A、P329A和其组合，根据EU编号系统编号。
在一特定实施例中，本文所述的抗体包含根据EU编号系统编号，具有N297Q或N297A氨基酸取代的IgG1的恒定域。在一个实施例中，本文所述的抗体包含具有选自由以下组成的群组的突变的IgG1的恒定域：根据EU编号系统编号，D265A、P329A和其组合。在另一实施例中，本文所述的抗体包含具有选自由以下组成的群组的突变的IgG1的恒定域：根据EU编号系统编号，L234A、L235A和其组合。在某些实施例中，本文所述的抗体的恒定区中在对应于人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的位置处的氨基酸残基分别不是L、L和D。这种方法详细地描述于国际公开第WO 14/108483号中，其以全文引用的方式并入本文中。在一具体实施例中，根据EU编号系统编号，对应于人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的氨基酸分别是F、E和A；或A、A和A。
在某些实施例中，本文所述的抗体的恒定区中的选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸(根据EU编号系统编号)可以替换为不同氨基酸残基，使得抗体的C1q结合改变和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)降低或消除。这种方法更详细地描述于美国专利第6,194,551号(Idusogie等人)中，其以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，根据EU编号系统编号，本文所述的抗体的CH2结构域的N末端区中的氨基酸位置231至238内的一个或更多个氨基酸残基改变，从而改变抗体固定补体的能力。这种方法进一步描述于国际公开第WO 94/29351号中，其以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，本文所述的抗体的Fc区通过使以下位置的一个或多个氨基酸突变(例如引入氨基酸取代)而进行修饰以增强抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增强抗体对Fcγ受体的亲和力：根据EU编号系统编号，238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、328、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这种方法进一步描述于国际公开第WO00/42072号中，其以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，本文所述的抗体包含IgG4抗体的恒定区，并且在重链的氨基酸残基228处丝氨酸(根据EU编号系统编号)取代脯氨酸。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQID NO:20的氨基酸序列的重链恒定区。
在某些实施例中，本文所述的恒定区突变或修饰中的任一个可以引入具有两个重链恒定区的本文所述的抗体的一个或两个重链恒定区中。
在叙述SEQ ID NO:7、9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、63、64、65、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78的本文公开的任一方面的某些实施例中，SEQ ID NO:7、9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、63、64、65、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78中的X是谷氨酰胺(Q)。在叙述SEQ ID NO:7、9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、63、64、65、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78的本文公开的任一方面的某些实施例中，SEQ ID NO:7、9、10、11、12、13、14、49、50、51、52、53、54、63、64、65、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78中的X是焦谷氨酸(pE)。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)并且充当激动剂的分离的抗体。
在某些实施例中，本公开提供了一种分离的抗体，其特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)，并且如通过本文所述和/或本领域的技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体下或在不相关抗体(例如不特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体)下的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)活性，增加或促进CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)活性达至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些实施例中，本公开提供了一种分离的抗体，其特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)，并且如通过本文所述和/或本领域的技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体下或在不相关抗体(例如不特异性结合于CD137(例如人CD137)的抗体)下的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)活性，增加或促进CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)活性达至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)活性的非限制性实例可以包括CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)信号传导、CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)配体(例如CD137L(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或其片段和/或融合蛋白)、活化T细胞(例如表达人CD137的T细胞)、增加细胞因子产生(例如IL-2、IFN-γ和/或TNF-α)、活化自然杀伤(NK)细胞、增加CD137L活性和活化表达CD137L的抗原呈递细胞(APC)。在特定实施例中，如以下实例中所述评估CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)活性的增加。在某些实施例中，在CD137配体(例如CD137L(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或其片段和/或融合蛋白)存在下抗体增加或促进CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的活性。
在某些实施例中，抗体活化、增加或促进CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的活性的能力取决于抗体交联的存在。在某些实施例中，在不存在抗体交联下抗体最低程度地增加或促进CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的活性。在某些实施例中，在不存在抗体交联下抗体基本上不增加或促进CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的活性。在一个实施例中，例如如本文所述的实例中所测量，在不存在抗体交联下抗体最低程度地诱导NF-κB报告细胞系中的NF-κB信号传导。在一个实施例中，例如如本文所述的实例中所测量，在不存在抗体交联下抗体最低程度地在抗CD3抗体刺激下诱导IL-2和/或IFNγ从纯化的T细胞产生。本文所涵盖的抗体交联包括抗体群集。本文所用的交联方法是本领域中已知的。在某些实施例中，在本文所述的实例中抗体通过使例如抗人IgG(Fab')2的抗体的Fc区二聚的试剂来交联。在某些实施例中，抗体通过接触表达与抗体的Fc区(例如FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIIa、FcγRIIb或FcγRI)结合的Fc受体的细胞来交联。在某些实施例中，Fc受体在细胞表面上成簇表达。在某些实施例中，抗体结合的抗原的配体也在细胞上表达。在某些实施例中，细胞是抗原呈递细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或B淋巴细胞)。
在某些实施例中，抗体活化、增加或促进CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的活性的能力取决于CD137配体(例如CD137L(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或其片段和/或融合蛋白)的存在。在某些实施例中，在不存在CD137配体(例如CD137L(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或其片段和/或融合蛋白)下抗体最低程度地增加或促进CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的活性。在某些实施例中，在不存在CD137配体(例如CD137L(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或其片段和/或融合蛋白)下抗体基本上不增加或促进CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的活性。在一个实施例中，例如如本文所述的实例中所测量，抗体最低程度地在抗CD3抗体刺激下诱导IL-2和/或IFNγ从纯化的T细胞产生。在一个实施例中，例如如本文所述的实例中所测量，抗体最低程度地诱导NF-κB报告细胞系中的NF-κB信号传导。在某些实施例中，抗体活化、增加或促进人CD137的活性的能力与CD137L的浓度正相关。在某些实施例中，当抗体与例如抗人IgG(Fab')2以约1:1至1:10(例如约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或更低)的交联剂比抗体比率交联时观测到CD137L依赖性。
在特定实施例中，本公开提供了一种分离的抗体，其特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)并活化T细胞(例如表达人CD137的T细胞)。在某些实施例中，活化T细胞表达一种或多种标记物(例如穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B、Bcl-XL)的水平增加(例如增加至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍)，任选地其中标记物的水平可以通过流式细胞术来测量。在某些实施例中，在CD137配体(例如CD137L(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或其片段和/或融合蛋白)存在下抗体活化T细胞(例如表达人CD137的T细胞)。在某些实施例中，在不存在CD137配体(例如CD137L(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或其片段和/或融合蛋白)下抗体不活化T细胞(例如表达人CD137的T细胞)。
在特定实施例中，本公开提供了一种分离的抗体，其特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)，并且如通过本文所述(参见以下实例)或本领域的技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体下或在不相关抗体(例如不特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体)下的细胞因子产生，使细胞因子产生(例如IL-2、IFN-γ和/或TNF-α)增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在特定实施例中，本公开提供了一种分离的抗体，其特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)，并且如通过本文所述(参见以下实例)或本领域的技术人员已知的方法所评估，相对于在无任何抗体下或在不相关抗体(例如不特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体)下的细胞因子产生，使细胞因子产生(例如IL-2、IFN-γ和/或TNF-α)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在某些实施例中，在CD137配体(例如CD137L(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或其片段和/或融合蛋白)存在下抗体增加细胞因子产生(例如IL-2、IFN-γ和/或TNF-α)。在某些实施例中，在不存在CD137配体(例如CD137L(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或其片段和/或融合蛋白)下，相对于在无任何抗体下或在不相关抗体(例如不特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体)下的细胞因子产生，抗体使细胞因子产生(例如IL-2、IFN-γ和/或TNF-α)增加不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。
在特定实施例中，本公开提供了一种分离的抗体，其特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)，并且如通过本文所述(参见下文实例)或本领域的技术人员已知的方法所评估，单独地或与抗PD-1抗体(例如派姆单抗或纳武单抗)组合，使人外周血单核细胞(PBMC)中回应于葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的IL-2和/或IFNγ产生相对于在无任何抗体下或在不相关抗体(例如不特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体)下的IL-2和/或IFNγ产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在某些实施例中，如通过本文所述(参见下文实例)或本领域的技术人员已知的方法所评估，在特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的本文所述的抗体存在下经葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)的IL-2和/或IFNγ产生相对于在无任何抗体下或在不相关抗体(例如不特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体)下IL-2和/或IFNγ从仅仅经SEA刺激的PBMC的产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在某些实施例中，在CD137配体(例如CD137L(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或其片段和/或融合蛋白)存在下抗体增加人PBMC中回应于SEA刺激的IL-2和/或IFNγ产生。在某些实施例中，在不存在CD137配体(例如CD137L(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或其片段和/或融合蛋白)下，相对于在无任何抗体下或在不相关抗体(例如不特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体)下的细胞因子产生，抗体使人PBMC中回应于SEA刺激的IL-2和/或IFNγ产生增加不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。
5.3药物组合物
本文提供了组合物，其在生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂中包含具有所需纯度的本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体(参见例如《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(1990)马克出版公司(Mack PublishingCo.),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,PA))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者来说无毒性，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一特定实施例中，药物组合物在药学上可接受的载体中包含本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体和任选地一种或多种额外的预防剂或治疗剂。在一特定实施例中，药物组合物在药学上可接受的载体中包含有效量的本文所述的抗体和任选地一种或多种额外的预防剂或治疗剂。在某些实施例中，抗体是药物组合物中所包括的唯一活性成分。本文所述的药物组合物可用于增加或促进CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)活性并治疗例如癌症或感染性疾病等病状。在一个实施例中，本发明涉及包含本发明的抗CD137抗体的本发明的药物组合物，其用作药剂。在另一实施例中，本发明涉及本发明的药物组合物，其用于治疗癌症或感染性疾病的方法中。
用于肠胃外制剂中的药学上可接受的载体包括水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂和其它药学上可接受的物质。水性媒剂的实例包括氯化钠注射剂、林格氏注射剂(RingersInjection)、等渗右旋糖注射剂、无菌注射用水、右旋糖和乳酸化林格氏注射剂。非水性肠胃外媒剂包括植物来源的不挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以向封装于多剂量容器中的肠胃外制剂中加入抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂，所述多剂量容器包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride)。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素以及聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(80)。金属离子的掩蔽剂或螯合剂包括EDTA。药物载体还包括用于水可混溶的媒剂的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；和用于调整pH值的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
可以针对向受试者施用的任何途径来配制药物组合物。施用途径的具体实例包括鼻内、口服、经肺、经皮、皮内以及肠胃外。本文还涵盖肠胃外施用，其特征在于皮下、肌肉内或静脉内注射。可注射剂可以呈常规形式，呈液体溶液或悬浮液形式、呈适合于在注射之前在液体中形成溶液或悬浮液的固体形式或呈乳液形式制备。可注射剂、溶液和乳液也可以含有一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，必要时，待施用的药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解性增强剂和其它这类试剂，如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
用于肠胃外施用抗体的制剂包括可以立即用于注射的无菌溶液；准备在临用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品，如冻干粉末，包括皮下注射片剂；可以立即用于注射的无菌悬浮液；准备在临用前与媒剂组合的无菌干燥不溶性产品；以及无菌乳液。溶液可以是水性或非水性的。
如果静脉内施用，那么合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffered saline，PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，所述增稠剂和增溶剂例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇以及其混合物。
如针对局部和全身施用所述制备包含抗体的局部混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等并且可以被配制成乳膏、凝胶、软膏、乳液、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴片或任何其它适合局部施用的制剂。
本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体可以被配制成用于局部施加，例如通过吸气来施加的气溶胶(参见例如美国专利第4,044,126号、第4,414,209号和第4,364,923号，其描述用于递送可用于治疗炎性疾病、尤其哮喘的类固醇的气溶胶，并以全文引用的方式并入本文中)。用于向呼吸道施用的这些配制物可以呈用于喷雾器的气雾剂或溶液形式，或呈用于吹入的微细粉末形式，单独或与如乳糖的惰性载体组合。在这种情况下，制剂的颗粒在一个实施例中将具有小于50微米，在一个实施例中小于10微米的直径。
本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体可以被配制用于局部或表面施加，如表面施加于皮肤和粘膜，如在眼睛中，呈凝胶、乳膏和洗剂的形式，并且被配制成用于施加于眼睛或用于脑池内或脊柱内施加。预期局部施用用于经皮递送以及用于施用于眼睛或粘膜，或用于吸入疗法。还可以施用单独的或与其它药学上可接受的赋形剂组合的抗体的鼻用溶液。
经皮贴片，包括离子导入和电泳装置，是本领域技术人员众所周知的，并且可以用于施用抗体。举例来说，这类贴片公开于美国专利第6,267,983号、第6,261,595号、第6,256,533号、第6,167,301号、第6,024,975号、第6,010715号、第5,985,317号、第5,983,134号、第5,948,433号和第5,860,957号中，所述专利全部以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，包含本文所述的抗体的药物组合物是冻干粉末，其可以被复原用于呈溶液、乳液和其它混合物形式施用。它也可以进行复原并被配制成固体或凝胶。冻干粉末是通过将本文所述的抗体或其药学上可接受的衍生物溶解于合适溶剂中制备的。在某些实施例中，冻干粉末是无菌的。溶剂可以含有能够改善粉末或由粉末制备的复原溶液的稳定性或其它药理学组分的赋形剂。可以使用的赋形剂包括(但不限于)右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适试剂。溶剂还可以含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾、或本领域的技术人员已知的其它这类缓冲剂，在一个实施例中，缓冲剂约呈中性pH。随后无菌过滤溶液，随后在本领域的技术人员已知的标准条件下冻干，得到所需配制物。在一个实施例中，将所得溶液分配至小瓶中进行冻干。每个小瓶将含有单剂量或多剂量的化合物。可以将冻干粉末储存在适当的条件下，如在约4℃至室温下。用注射用水复原这种冻干粉末，得到用于肠胃外施用的配制物。为了复原，将冻干粉剂加入无菌水或其它适合的载体中。精确的量取决于选定的化合物。这个量可以凭经验确定。
本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体和本文所提供的其它组合物还可以被配制成靶向具体组织、受体或待治疗受试者身体的其它区域。许多这类靶向方法是本领域的技术人员众所周知的。本文考虑所有这类靶向方法用于本发明组合物。关于靶向方法的非限制性实例，参见例如美国专利第6,316,652号、第6,274,552号、第6,271,359号、第6,253,872号、第6,139,865号、第6,131,570号、第6,120,751号、第6,071,495号、第6,060,082号、第6,048,736号、第6,039,975号、第6,004,534号、第5,985,307号、第5,972,366号、第5,900,252号、第5,840,674号、第5,759,542号和第5,709,874号，所述专利全部以全文引用的方式并入本文中。在一特定实施例中，本文所述的抗体靶向肿瘤。
待用于体内施用的组合物可以是无菌的。这易于通过例如无菌过滤膜过滤来实现。
5.4使用方法和用途
在另一方面，本公开提供了一种使用本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体治疗受试者的方法。将得益于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)功能增加的受试者的任何疾病或病症可以使用本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体治疗。本文公开的抗CD137(例如人CD137)抗体尤其可用于抑制免疫系统对肿瘤的耐受性，并且因此可以用作用于患有癌症的受试者的免疫疗法。举例来说，在某些实施例中，本公开提供了一种增加受试者中回应于抗原的T细胞活化的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的如本文中所公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其药物组合物。在某些实施例中，本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的如本文中所公开的抗体或其药物组合物。
可以用本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或药物组合物治疗的癌症包括(但不限于)实体肿瘤、血液癌(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤)和转移病灶。在一个实施例中，癌症是实体肿瘤。实体肿瘤的实例包括恶性病，例如肉瘤和癌瘤，例如多个器官系统的腺癌，例如影响肺、乳房、卵巢、淋巴、胃肠道(例如结肠)、肛门、生殖器和泌尿生殖道(例如肾、尿道上皮、膀胱细胞、前列腺)、咽、CNS(例如脑、神经或神经胶质细胞)、头颈部、皮肤(例如黑素瘤)和胰腺的腺癌，以及包括例如结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、小肠癌和食道癌等恶性病的腺癌。癌症可以处于早期、中间、晚期或转移癌。
在一个实施例中，癌症选自肺癌(例如肺腺癌或非小细胞肺癌(NSCLC)(例如具有鳞状和/或非鳞状组织结构的NSCLC或NSCLC腺癌))、黑素瘤(例如晚期黑素瘤)、肾癌(例如肾细胞癌)、肝癌(例如肝细胞癌)、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、前列腺癌、乳腺癌(例如不表达雌激素受体、孕酮受体或Her2/neu中的一个、两个或全部的乳腺癌，例如三阴性乳腺癌)、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌(例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、肛门癌、胃食道癌(例如食道鳞状细胞癌)、间皮瘤、鼻咽癌、甲状腺癌、宫颈癌、上皮癌、腹膜癌或淋巴增生性疾病(例如移植后淋巴增生性疾病)。在一特定实施例中，癌症是宫颈癌。
在一个实施例中，癌症是血液癌，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一个实施例中，癌症是白血病，例如急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、急性成骨髓细胞性白血病(acutemyeloblastic leukemia，AML)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、慢性骨髓白血病(chronic myeloid leukemia，CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(chronicmyelomonocytic leukemia，CMML)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia，CLL)或毛状细胞白血病。在一个实施例中，癌症是淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)、活化B细胞样(activatedB-cell like，ABC)弥漫性大B细胞淋巴瘤、生发中心B细胞(germinal center B cell，GCB)弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、复发性非霍奇金淋巴瘤、难治性非霍奇金淋巴瘤、复发性滤泡性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、小淋巴细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤或结外边缘区淋巴瘤。在一个实施例中，癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。
在另一实施例中，癌症选自癌瘤(例如晚期或转移性癌瘤)、黑素瘤或肺癌，例如非小细胞肺癌。
在一个实施例中，癌症是肺癌，例如肺腺癌、非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
在一个实施例中，癌症是黑素瘤，例如晚期黑素瘤。在一个实施例中，癌症是对其它疗法不起反应的晚期或不可切除性黑素瘤。在其它实施例中，癌症是具有BRAF突变(例如BRAF V600突变)的黑素瘤。在其它实施例中，本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或药物组合物在有或无BRAF抑制剂(例如维罗非尼(vemurafenib)或达拉菲尼(dabrafenib))下用抗CTLA-4抗体(例如伊派利单抗(ipilimumab))治疗之后施用。
在另一实施例中，癌症是肝癌，例如晚期肝癌，有或无病毒感染，例如慢性病毒性肝炎。
在另一实施例中，癌症是前列腺癌，例如晚期前列腺癌。
在另一实施例中，癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。
在另一实施例中，癌症是肾癌，例如肾细胞癌(RCC)(例如转移性RCC、透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，CCRCC)或肾乳头状细胞癌)。
在另一实施例中，癌症选自肺癌、黑素瘤、肾癌、乳癌、结肠直肠癌、白血病或癌症的转移病灶。
在某些实施例中，本公开提供了一种预防或治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的如本文中所公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其药物组合物。在一个实施例中，本文提供了用于预防和/或治疗感染(例如病毒感染、细菌感染、真菌感染、原生动物感染或寄生虫感染)的方法。根据所述方法预防和/或治疗的感染可以由本文中所鉴定的感染物引起。在一特定实施例中，本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其组合物是向受试者施用的唯一活性剂。在某些实施例中，本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其组合物与抗感染干预(例如抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂或抗蠕虫剂)组合用于治疗感染性疾病。因此，在一实施例中，本发明涉及本发明的抗体和/或药物组合物，其用于预防和/或治疗感染性疾病的方法中，任选地其中抗体或药物组合物是给受试者施用的唯一活性剂，或其中抗体或药物组合物与抗感染干预组合使用。
可以通过本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或药物组合物治疗和/或预防的感染性疾病由包括(但不限于)细菌、寄生虫、真菌、原生动物和病毒的感染物引起。在一特定实施例中，可以通过本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或药物组合物治疗和/或预防的感染性疾病由病毒引起。可以根据本文所述的方法预防和/或治疗的病毒性疾病或病毒感染包括但不限于由以下引起的病毒性疾病或病毒感染：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感(例如甲型流感或乙型流感)、水痘、腺病毒、单纯疱疹I型(HSV-I)、单纯疱疹II型(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、埃可病毒(echovirus)、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、棘状病毒、虫媒病毒、汉坦病毒(huntavirus)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、天花、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus)、人类免疫缺陷病毒I型(HIV-I)、人类免疫缺陷病毒II型(HIV-II)以及例如病毒性脑膜炎、脑炎、登革热(dengue)或天花等病毒性疾病的媒介。
可以预防和/或治疗的细菌感染包括由以下引起的感染：大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、草绿色葡萄球菌(Staphylococcus viridans)以及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。可以根据本文所述的方法预防和/或治疗的由细菌(例如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、普通变形杆菌、草绿色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌)引起的细菌性疾病包括(但不限于)分枝杆菌立克次氏体(Mycobacteria rickettsia)、支原体(Mycoplasma)、奈瑟菌(Neisseria)、肺炎链球菌(S.pneumonia)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病(Lyme disease))、炭疽杆菌(Bacillus antracis)(炭疽)、破伤风、链球菌、葡萄球菌、分枝杆菌、百日咳、霍乱、瘟疫、白喉、衣原体、金黄色葡萄球菌以及军团杆菌(legionella)。
可以根据本文所述的方法预防和/或治疗的由原生动物引起的原生动物疾病或原生动物感染包括(但不限于)利什曼原虫(leishmania)、球虫病、锥虫血吸虫或疟疾。可以根据本文所述的方法预防和/或治疗的由寄生虫引起的寄生虫病或寄生虫感染包括但不限于衣原体和立克次氏体。
可以根据本文所述的方法预防和/或治疗的真菌疾病或真菌感染包括(但不限于)由以下引起的真菌疾病或真菌感染：念珠菌(Candida)感染、接合菌病(zygomycosis)、念珠菌乳腺炎、具有潜伏性毛孢子虫血症的进行性播散性毛孢子菌病、播散性念珠菌病、肺副球孢子菌病、肺曲霉病、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)肺炎、隐球菌性脑膜炎、球孢子菌性(coccidioidal)脑膜脑炎和脑脊髓血管炎、黑曲霉(Aspergillus niger)感染、镰刀菌角膜炎(Fusariumkeratitis)、副鼻窦霉菌病、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)心内膜炎、胫骨软骨发育不良、光滑念珠菌(Candida glabrata)阴道炎、口咽念珠菌病、X连锁慢性肉芽肿病、足癣、皮肤念珠菌病、霉菌性胎盘炎、播散性毛孢子菌病、过敏性支气管肺曲霉病、霉菌性角膜炎、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)感染、真菌性腹膜炎、曲弯孢霉(Curvularia geniculata)感染、葡萄球菌性眼内炎、孢子丝菌病以及皮肤癣菌病。
在某些实施例中，这些方法进一步包含向受试者施用一额外治疗剂。在某些实施例中，额外治疗剂是化疗剂、放疗剂或检查点靶向剂。在某些实施例中，化疗剂是低甲基化剂(例如阿扎胞苷(azacitidine))。在某些实施例中，检查点靶向剂选自由以下组成的群组：拮抗剂抗CTLA-4抗体、拮抗剂抗PD-L1抗体、拮抗剂抗PD-L2抗体、拮抗剂抗PD-1抗体、拮抗剂抗TIM-3抗体、拮抗剂抗LAG-3抗体、拮抗剂抗VISTA抗体、拮抗剂抗CD96抗体、拮抗剂抗CEACAM1抗体、抗体抗TIGIT抗体、激动剂抗GITR抗体和激动剂抗OX40抗体。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的抗体和/或药物组合物，其用于本发明的方法中，其中所说方法还包含向所述受试者施用一额外治疗剂。在一个实施例中，本发明涉及(a)本发明的抗体和/或药物组合物和(b)用作药剂的额外治疗剂。在一个实施例中，本发明涉及(a)本发明的抗体和/或药物组合物和(b)用于治疗癌症的方法中的额外治疗剂。在另一实施例中，本发明涉及一种药物组合物、试剂盒或成套部件，其包含(a)本发明的抗体和/或药物组合物和(b)额外治疗剂。在一个实施例中，额外治疗剂是化疗剂、放疗剂或检查点靶向剂。
在某些实施例中，抗PD-1抗体用于本文公开的方法中。在某些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗，又称为BMS-936558或MDX1106，由Bristol-Myers Squibb开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是派姆单抗，又称为兰利珠单抗(lambrolizumab)或MK-3475，由Merck&Co.开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是匹立珠单抗(pidilizumab)，又称为CT-011，由CureTech开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是MEDI0680，又称为AMP-514，由Medimmune开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是PDR001，由Novartis Pharmaceuticals开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是REGN2810，由Regeneron Pharmaceuticals开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是PF-06801591，由Pfizer开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是BGB-A317，由BeiGene开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是TSR-042，由AnaptysBio和Tesaro开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是SHR-1210，由Hengrui开发。
可以用于本文公开的治疗方法中的抗PD-1抗体的其它非限制性实例在以下专利和专利申请中公开，所述专利和专利申请都以全文引用的方式并入本文中以达成所有目的∶美国专利第6,808,710号；美国专利第7,332,582号；美国专利第7,488,802号；美国专利第8,008,449号；美国专利第8,114,845号；美国专利第8,168,757号；美国专利第8,354,509号；美国专利第8,686,119号；美国专利第8,735,553号；美国专利第8,747,847号；美国专利第8,779,105号；美国专利第8,927,697号；美国专利第8,993,731号；美国专利第9,102,727号；美国专利第9,205,148号；美国公开第US 2013/0202623 A1号；美国公开第US 2013/0291136 A1号；美国公开第US 2014/0044738 A1号；美国公开第US 2014/0356363 A1号；美国公开第US 2016/0075783 A1号；以及PCT公开第WO 2013/033091 A1号；PCT公开第WO2015/036394 A1号；PCT公开第WO 2014/179664 A2号；PCT公开第WO 2014/209804 A1号；PCT公开第WO 2014/206107 A1号；PCT公开第WO 2015/058573 A1号；PCT公开第WO 2015/085847 A1号；PCT公开第WO 2015/200119 A1号；PCT公开第WO 2016/015685 A1号；以及PCT公开第WO 2016/020856 A1号。
在某些实施例中，抗PD-L1抗体用于本文公开的方法中。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗(atezolizumab)，由Genentech开发。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是度伐单抗(durvalumab)，由AstraZeneca、Celgene和Medimmune开发。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗(avelumab)，又称为MSB0010718C，由Merck Serono和Pfizer开发。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是MDX-1105，由Bristol-Myers Squibb开发。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是AMP-224，由Amplimmune和GSK开发。
可以用于本文公开的治疗方法中的抗PD-L1抗体的非限制性实例在以下专利和专利申请中公开，所述专利和专利申请都出于所有目的以全文引用的方式并入本文中∶美国专利第7,943,743号；美国专利第8,168,179号；美国专利第8,217,149号；美国专利第8,552,154号；美国专利第8,779,108号；美国专利第8,981,063号；美国专利第9,175,082号；美国公开第US 2010/0203056 A1号；美国公开第US 2003/0232323 A1号；美国公开第US2013/0323249 A1号；美国公开第US 2014/0341917 A1号；美国公开第US 2014/0044738 A1号；美国公开第US 2015/0203580 A1号；美国公开第US 2015/0225483 A1号；美国公开第US2015/0346208 A1号；美国公开第US 2015/0355184 A1号；以及PCT公开第WO 2014/100079A1号；PCT公开第WO 2014/022758 A1号；PCT公开第WO 2014/055897 A2号；PCT公开第WO2015/061668 A1号；PCT公开第WO 2015/109124 A1号；PCT公开第WO 2015/195163 A1号；PCT公开第WO 2016/000619 A1号；以及PCT公开第WO 2016/030350 A1号。
在某些实施例中，本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体与靶向免疫调节酶，如IDO(吲哚胺-(2,3)-双加氧酶)和/或TDO(色氨酸2,3-双加氧酶)的化合物组合向受试者施用。因此，在一个实施例中，额外治疗剂是靶向免疫调节酶的化合物，如吲哚胺-(2,3)-双加氧酶(IDO)的抑制剂。在某些实施例中，这类化合物选自由艾卡哚司他(Incyte Corp；参见例如WO 2010/005958，其以全文引用的方式并入本文中)、F001287(Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、吲哚莫德(NewLink Genetics)和NLG919(NewLink Genetics)组成的群组。在一个实施例中，所述化合物是艾卡哚司他。在另一实施例中，所述化合物是F001287。在另一实施例中，所述化合物是吲哚莫德。在另一实施例中，所述化合物是NLG919。在一特定实施例中，本文公开的抗CD137(例如人CD137)抗体与IDO抑制剂组合向受试者施用以治疗癌症。如本文所述的用于治疗癌症的IDO抑制剂存在于药物组合物的固体剂型中，例如片剂、丸剂或胶囊，其中药物组合物包括IDO抑制剂和药学上可接受的赋形剂。因此，如本文所述的抗体和如本文所述的IDO抑制剂可以作为单独的剂型分开、依序或同时施用。在一个实施例中，抗体肠胃外施用，并且IDO抑制剂口服。在特定实施例中，抑制剂选自由艾卡哚司他(Incyte Corporation)、F001287(Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、吲哚莫德(NewLink Genetics)以及NLG919(NewLink Genetics)组成的群组。艾卡哚司他已描述于PCT公开第WO 2010/005958号中，所述公开出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。在一个实施例中，所述抑制剂是艾卡哚司他。在另一实施例中，所述抑制剂是F001287。在一个实施例中，所述抑制剂是吲哚莫德。在另一实施例中，所述抑制剂是NLG919。
在某些实施例中，本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体与疫苗组合向受试者施用。疫苗可以是例如肽疫苗、DNA疫苗或RNA疫苗。在某些实施例中，疫苗是基于热休克蛋白的肿瘤疫苗或基于热休克蛋白的病原体疫苗。在一特定实施例中，本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体与基于热休克蛋白的肿瘤疫苗组合向受试者施用。热休克蛋白(HSP)是在所有物种中普遍存在的高度保守蛋白质家族。由于热休克或其它形式的应激，包括暴露于毒素、氧化应激或葡萄糖剥夺，其表达可以被强有力地诱导至高得多的水平。已经根据分子量分类成了五个家族：HSP-110、HSP-90、HSP-70、HSP-60和HSP-28。HSP通过如巨噬细胞和树突状细胞(DC)等抗原呈递细胞(APC)中的交叉呈递途径递送免疫原性肽，引起T细胞活化。HSP充当肿瘤相关抗原肽的分子伴侣(chaperone)载体，形成能够诱导肿瘤特异性免疫的复合物。从垂死的肿瘤细胞释放后，HSP-抗原复合物被抗原呈递细胞(APC)吸收，其中抗原被加工成结合MHC I类和II类分子的肽，引起抗肿瘤CD8+和CD4+T细胞的活化。由源自肿瘤制剂的HSP复合物引发的免疫特异性针对由每个受试者的癌症表达的独特抗原肽谱。因此，在一个实施例中，本发明涉及(a)本发明的抗体和/或药物组合物和(b)疫苗，其用作药剂，例如用于治疗癌症的方法中。在一个实施例中，本发明涉及一种药物组合物、试剂盒或成套部件，其包含(a)本发明的抗体和/或药物组合物和(b)疫苗。在一个实施例中，疫苗是基于热休克蛋白的肿瘤疫苗。在一个实施例中，疫苗是基于热休克蛋白的病原体疫苗。在某些实施例中，疫苗如以全文引用的方式并入本文中WO 2016/183486中所述。
热休克蛋白肽复合物(HSPPC)是由与抗原肽非共价复合的热休克蛋白组成的蛋白质肽复合物。HSPPC引发先天性和适应性免疫反应。在一个特定实施例中，抗原肽呈现对所治疗癌症的抗原性。HSPPC通过APC经由膜受体(主要是CD91)或通过结合于Toll样受体而高效地捕获。HSPPC内化导致APC的功能成熟，伴随着趋化因子和细胞因子产生，导致自然杀伤细胞(NK)、单核细胞以及Th1和Th-2介导的免疫反应的活化。在某些实施例中，本文公开的方法中所用的HSPPC包含一种或多种来自与抗原肽复合的hsp60、hsp70或hsp90应激蛋白家族的热休克蛋白。在某些实施例中，HSPPC包含hsc70、hsp70、hsp90、hsp110、grp170、gp96、钙网蛋白(calreticulin)或其中两种或更多种的组合。
在一特定实施例中，热休克蛋白肽复合物(HSPPC)包含与重组抗原肽复合的重组热休克蛋白(例如hsp70或hsc70)或其肽结合域。重组热休克蛋白可以通过重组DNA技术，例如使用如Dwomiczak和Mirault,核酸研究15:5181-5197(1987)和GenBank寄存编号P11142和/或Y00371(所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中)中所述的人hsc70序列产生。在某些实施例中，hsp70序列如Hunt和Morimoto美国国家科学院院刊82(19),6455-6459(1985)和GenBank寄存编号P0DMV8和/或Ml 1717中所述，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。抗原肽还可以通过本领域中已知的重组DNA法制备。
在某些实施例中，抗原肽包含修饰氨基酸。在某些实施例中，修饰氨基酸包含翻译后修饰。在某些实施例中，修饰氨基酸包含翻译后修饰的模拟物。在某些实施例中，修饰氨基酸是在侧链羟基或胺上已经磷酸化的Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His。在某些实施例中，修饰氨基酸是在侧链羟基或胺上已经磷酸化的Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His氨基酸的模拟物。
在一特定实施例中，本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体与热休克蛋白肽复合物(HSPPC)，例如，热休克蛋白肽复合物-96(HSPPC-96)组合向受试者施用，以治疗癌症。HSPPC-96包含与抗原肽复合的96kDa热休克蛋白(Hsp)，gp96。HSPPC-96是由受试者的肿瘤制造的癌症免疫疗法并且含有癌症的抗原“指纹”。在某些实施例中，这种指纹含有仅存在于所述特定受试者的特定癌细胞中的独特抗原，并且注射疫苗旨在刺激受试者的免疫系统识别并攻击任何具有特定癌症指纹的细胞。因此，在一个实施例中，本发明涉及本发明的抗体和/或药物组合物与热休克蛋白肽复合物(HSPPC)组合，用作药剂和/或用于治疗癌症的方法中。
在某些实施例中，HSPPC，例如HSPPC-96，由受试者的肿瘤组织产生。在一特定实施例中，HSPPC(例如HSPPC-96)由所治疗的癌症类型的肿瘤或其转移产生。在另一特定实施例中，HSPPC(例如HSPPC-96)是所治疗的受试者自身的。在某些实施例中，肿瘤组织是非坏死肿瘤组织。在某些实施例中，至少1克(例如至少1克、至少2克、至少3克、至少4克、至少5克、至少6克、至少7克、至少8克、至少9克或至少10克)非坏死肿瘤组织用于产生疫苗方案。在某些实施例中，在手术切除之后，在用于疫苗制备之前，冷冻非坏死肿瘤组织。在某些实施例中，HSPPC(例如HSPPC-96)通过纯化技术从肿瘤组织分离、过滤并制备成可注射疫苗。在某些实施例中，向受试者施用6-12剂HSPPC，例如HSPCC-96。在这类实施例中，HSPPC、例如HSPPC-96的剂量中的前4个剂可以每周施用，并且然后额外2-8剂每两周施用。
可以根据本文所述的方法使用的HSPPC的其它实例在以下专利和专利申请中公开，所述专利和专利申请都以全文引用的方式并入本文中：美国专利第6,391,306号、第6,383,492号、第6,403,095号、第6,410,026号、第6,436,404号、第6,447,780号、第6,447,781号和第6,610,659号。
在某些实施例中，本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体与佐剂组合向受试者施用。多种佐剂可以取决于治疗背景而使用。适当佐剂的非限制性实例包括(但不限于)完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、montanide ISA(不完全赛比克佐剂(incomplete Seppic adjuvant)、瑞比佐剂系统(Ribiadjuvant system，RAS)、Titer Max、胞壁酰基肽、Syntex佐剂配制物(SAF)、明矾(氢氧化铝和/或磷酸铝)、铝盐佐剂、佐剂、硝化纤维吸收抗原、囊封或包埋抗原、3De-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)、免疫刺激寡核苷酸、toll样受体(TLR)配体、甘露聚糖结合凝集素(MBL)配体、STING激动剂、免疫刺激复合物，例如皂苷、Quil A、QS-21、QS-7、ISCOMATRIX等。其它佐剂包括CpG寡核苷酸和双链RNA分子，例如多聚(A)和多聚(U)。还可以使用以上佐剂的组合。参见例如美国专利第6,645,495号、第7,029,678号和第7,858,589号，所述专利都以全文引入的方式并入本文中。在一个实施例中，本文所用的佐剂是QS-21STIMULON。
在某些实施例中，本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体与包含TCR的额外疗剂向受试者施用。在某些实施例中，额外治疗剂是可溶性TCR。在某些实施例中，额外治疗剂是表达TCR的细胞。因此，在一个实施例中，本发明涉及本发明的抗体和/或药物组合物与包含TCR的额外治疗剂组合，用作药剂和/或用于治疗癌症的方法中。
在某些实施例中，本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体与包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞向受试者施用。在某些实施例中，细胞为T细胞。
在某些实施例中，本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体与TCR模拟抗体组合向受试者施用。在某些实施例中，TCR模拟抗体是特异性结合于肽-MHC复合物的抗体。关于TCR模拟抗体的非限制性实例，参见例如美国专利第9,074,000号和美国公开第US 2009/0304679 A1号和第US 2014/0134191 A1号，所述文献全部以全文引入的方式并入本文中。
在某些实施例中，本文公开的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体与双特异性T细胞接合分子(BiTE)(例如如W02005061547A2中所述，其以全文引用的方式并入本文中)和/或双亲和力再靶向抗体(DART)(例如如WO2012162067A2中所述，其以全文引用的方式并入本文中)组合向受试者施用。在某些实施例中，BiTE和/或DART特异性结合于肿瘤相关抗原(例如在肿瘤中过表达的多肽、来源于致癌病毒的多肽、包含特异性针对肿瘤的翻译后修饰的多肽、在肿瘤中特异性突变的多肽)和效应细胞上的分子(例如CD3或CD16)。在某些实施例中，肿瘤相关抗原是EGFR(例如人EGFR)、Her2(例如人Her2)或CD20(例如人CD20)。
抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体和额外治疗剂(例如化疗剂、放疗剂、检查点靶向剂、IDO抑制剂、疫苗、佐剂、可溶性TCR、表达TCR的细胞、表达嵌合抗原受体的细胞和/或TCR模拟抗体)可以作为单独的剂型分开、依序或同时施用。在一个实施例中，抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体肠胃外施用，并且IDO抑制剂口服。
本文所述的抗体或药物组合物可以通过多种途径递送至受试者。这些途径包括但不限于肠胃外、鼻内、气管内、口服、皮内、局部、肌肉内、腹膜内、经皮、静脉内、瘤内、结膜、动脉内和皮下途径。还可以采用经肺施用，例如通过使用吸入器或雾化器，和含有适用作喷雾剂的雾化剂的配制物。在某些实施例中，本文所述的抗体或药物组合物皮下或静脉内递送。在某些实施例中，本文所述的抗体或药物组合物动脉内递送。在某些实施例中，本文所述的抗体或药物组合物瘤内递送。在某些实施例中，本文所述的抗体或药物组合物递送至肿瘤引流淋巴结。
抗体或组合物有效治疗和/或预防病状的量将取决于疾病的性质，并且可以通过标准临床技术确定。
组合物中所用的精确剂量还将取决于施用途径和感染或由其引起的疾病的严重性，并且应根据执业医生的判断和每个受试者的情况来决定。举例来说，有效剂量还可以取决于施用方式、目标部位、患者的生理状态(包括年龄、体重和健康状况)、患者是人还是动物、所施用的其它药剂或治疗是预防性还是治疗性而变化。通常，患者是人，但也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。最优地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体还可以使用本领域技术人员已知的经典的免疫组织学方法，包括免疫分析法，例如酶联免疫吸附分析法(ELISA)、免疫沉淀法或蛋白质印迹法用于分析生物样品中的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)蛋白质水平。合适的抗体分析标记是本领域中已知的，并且包括酶标记，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标记，如鲁米诺(luminol)；和荧光标记，如荧光素和若丹明，和生物素。这类标记可以用于标记本文所述的抗体。可替代地，识别本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体的第二抗体可以标记并与抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体组合使用以检测CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)蛋白质水平。因此，在一个实施例中，本发明涉及本发明的抗体用于在体外检测生物样品中的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)蛋白质的用途。在另一实施例中本发明涉及本发明的抗CD137抗体的用途，其用于在体外分析和/或检测生物样品中的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)蛋白质水平，任选地其中抗CD137抗体缀合到放射性核素或可检测标记，和/或携有本文所述的标记，和/或其中使用免疫组织学方法。
CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)蛋白质的表达水平的分析意图包括直接(例如通过测定或评估绝对蛋白质水平)或相对(例如通过与第二生物样品中的疾病相关蛋白质水平比较)定性或定量测量或估计第一生物样品中的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)蛋白质的水平。可以测量或估计第一生物样品中的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)多肽表达水平，并与标准CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)蛋白质水平相比，标准取自例如从未患疾病的个体获得的第二生物样品，或通过将来自未患疾病的个体的群体的水平求平均值来确定。如本领域中了解，一旦已知“标准”CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)多肽水平，就可以重复使用其作为比较的标准。因此，在另一实施例中，本发明涉及一种在体外分析和/或检测生物样品中的CD137蛋白质水平、例如人CD137蛋白质水平的方法，所述方法包含通过免疫组织学方法定性或定量测量或估计生物样品中CD137蛋白质、例如人CD137蛋白质的水平。
如本文所用，术语“生物样品”是指从受试者、细胞系、组织或其它可能表达CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的细胞来源获得的任何生物样品。从动物(例如人类或食蟹猕猴)获得组织活检体和体液的方法是本领域中众所周知的。生物样品包括外周单核血球。
本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体可以用于预后、诊断、监测和筛选应用，包括本领域技术人员众所周知和标准并基于本发明的描述的体外和体内应用。用于体外评估和评定免疫系统状态和/或免疫反应的预后、诊断、监测和筛查分析法和试剂盒可以用于预测、诊断和监测以评定患者样品，包括已知具有或疑似具有免疫系统功能障碍的患者样品，或预期或所需免疫系统反应、抗原反应或疫苗反应。评估和评定免疫系统状态和/或免疫反应还可用于确定患者对于药物临床试验或对于施用特定化疗剂、放疗剂或抗体(包括其组合)对比不同药剂或抗体的适合性。这种类型的预后和诊断监测和评估实际上已经利用针对乳腺癌中的HER2蛋白的抗体(HercepTestTM，Dako)，其中分析法也用于使用针对抗体疗法评估患者。体内应用包括导向细胞疗法和免疫系统调节和免疫反应的放射成像。因此，在一个实施例中，本发明涉及本发明的抗CD137抗体和/或药物组合物，其用作诊断。在一个实施例中，本发明涉及本发明的抗CD137抗体和/或药物组合物，其用于预测、诊断和/或监测具有或怀疑具有免疫系统功能障碍的受试者和/或预期或所需免疫系统反应、抗原反应或疫苗反应的方法。在另一实施例中，本发明涉及本发明的抗CD137抗体的用途，其通过在体外分析和/或检测受试者的生物样品中的人CD137蛋白质水平，用于预测、诊断和/或监测具有或怀疑具有免疫系统功能障碍的受试者和/或预期或所需免疫系统反应、抗原反应或疫苗反应。
在一个实施例中，抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体可以用于活检样品的免疫组织化学中。在一个实施例中，方法是体外方法。在另一实施例中，抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体可以用于检测CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的水平，或在膜表面上含有CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的细胞的水平，然后所述水平可能与某些疾病症状相关。本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体可以携有可检测或功能性标记和/或可缀合于放射性核素或可检测标记。当使用荧光标记时，本领域中已知的目前可用的显微术和荧光激活细胞分选仪分析(FACS)或两种方法程序的组合可以用于鉴别和定量特异性结合成员。本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体可以携有或可以缀合于荧光标记。示范性荧光标记包括例如反应性和缀合探针，例如氨基香豆素(Aminocoumarin)、荧光素(Fluorescein)和德克萨斯红(Texas red)、Alexa Fluor染料、Cy染料和DyLight染料。抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体可以携有或可以缀合于放射性标记或放射性核素，例如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、90Y、99Tc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、211At、213Bi、225Ac和186Re。当使用放射性标记时，本领域中已知的目前可用的计数程序可以用以鉴别和定量抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体与CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的特异性结合。在标记是酶的情况下，检测可以通过如本领域中已知的当前利用的比色、分光光度、荧光分光光度、安培或气体定量技术中的任一种实现。这可以通过使样品或对照样品与抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体在允许抗体与CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)之间形成复合物的条件下接触来实现。检测样品和对照中在抗体与CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)之间形成的任何复合物并进行比较。依据本文所述的抗体对CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的特异性结合，抗体可以用于特异性检测细胞表面上的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)表达。本文所述的抗体还可以用于经由免疫亲和力纯化来纯化CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)。本文中还包括一种分析系统，其可以制备成检验试剂盒、试剂盒或成套部件的形式，用于定量分析例如CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)或CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)/CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)配体复合物的存在程度。系统、检验试剂盒、试剂盒或成套部件可以包含标记的组分，例如标记的抗体，和一种或多种额外免疫化学试剂。
5.5产生抗CD137抗体的多核苷酸、载体和方法
在另一方面，本文提供了包含编码特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗原的本文所述的抗体或其片段(例如轻链可变区和/或重链可变区)的核苷酸序列的多核苷酸，以及载体，例如用于在宿主细胞(例如大肠杆菌和哺乳动物细胞)中重组表达的包含这类多核苷酸的载体。本文提供了包含编码本文提供的任一抗体的重链和/或轻链的核苷酸序列的多核苷酸，以及包含这类多核苷酸序列的载体，例如在宿主细胞，例如哺乳动物细胞中有效表达的表达载体。
如本文所用，“分离的”多核苷酸或核酸分子是与核酸分子的天然来源中(例如，小鼠或人类中)存在的其它核酸分子分离的多核苷酸或核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，当通过重组技术产生时基本上不含其它细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。举例来说，措辞“基本上不含”包括具有少于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(具体地说，少于约10％)的其它物质(例如细胞物质、培养基、其它核酸分子、化学前体和/或其它化学物质)的多核苷酸或核酸分子制剂。在一特定实施例中，编码本文所述的抗体的核酸分子是分离或纯化的。
在具体方面，本文提供了包含编码特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)多肽并包含如本文所述的氨基酸序列的抗体以及与这类抗体竞争结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)多肽(例如以剂量依赖性方式)或结合于与这类抗体所结合相同的表位的抗体的核苷酸序列的多核苷酸。
在某些方面，本文提供了多核苷酸，其包含编码本文所述的抗体的轻链或重链的核苷酸序列。多核苷酸可以包含编码包含本文所述的抗体的VL FR和CDR(参见例如表1)的轻链的核苷酸序列或编码包含本文所述的抗体的VH FR和CDR(参见例如表1)的重链的核苷酸序列。
本文还提供了编码抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体的多核苷酸，其例如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列置换和消除mRNA不稳定元件来优化。通过引入密码子变化和/或消除mRNA中的抑制区域来产生编码抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其片段(例如轻链、重链、VH结构域或VL结构域)的优化核酸以进行重组表达的方法可以通过采用例如美国专利第5,965,726号、第6,174,666号、第6,291,664号、第6,414,132号和第6,794,498号(相应地，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中)中所述的优化方法进行。举例来说，RNA内的潜在剪接位点和不稳定元件(例如富含A/T或A/U的元件)可以在不改变由核酸序列编码的氨基酸的情况下突变以提高RNA对于重组表达的稳定性。所述改变利用遗传密码的简并，例如将替代密码子用于一致氨基酸。在某些实施例中，可能需要改变一个或多个密码子以编码保守突变，例如与原始氨基酸具有类似化学结构和特性和/或功能的类似氨基酸。这类方法可以使抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其片段的表达相对于由未进行优化的多核苷酸编码的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体的表达增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍。
在某些实施例中，编码本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其片段(例如VL结构域和/或VH结构域)的优化的多核苷酸序列可以与编码本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其片段(例如VL结构域和/或VH结构域)的未优化的多核苷酸序列的反义(例如互补)多核苷酸杂交。在特定实施例中，编码本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其片段的优化的核苷酸序列在高严格性条件下与编码本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其片段的未优化的核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。在一特定实施例中，编码本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其片段的优化的核苷酸序列在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与编码本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其片段的未优化的核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。已经描述关于杂交条件的信息，参见例如美国专利申请公开第US 2005/0048549号(例如段落72-73)，其以全文引用的方式并入本文中。
通过本领域中已知的任何方法，可以获得多核苷酸，并且测定多核苷酸的核苷酸序列。编码本文所述的抗体(例如表1中所述的抗体)和这些抗体的修饰形式的核苷酸序列可以使用本领域中众所周知的方法测定，即已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以产生编码抗体的核酸的方式装配。编码抗体的这类多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸装配(例如如以全文引用的方式并入本文中的Kutmeier G等人,(1994),《生物技术(BioTechniques)》17:242-6中所描述)，简单来说，其涉及合成含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸，退火和连接那些寡核苷酸，并且然后通过PCR来扩增连接的寡核苷酸。
可替代地，编码本文所述的抗体的多核苷酸可以使用本领域中众所周知的方法(例如PCR和其它分子克隆方法)从来自合适来源(例如杂交瘤)的核酸产生。举例来说，使用可与已知序列的3'和5'末端杂交的合成引物的PCR扩增可以使用从产生所关注抗体的杂交瘤细胞获得的基因组DNA进行。这类PCR扩增方法可以用于获得包含编码抗体的轻链和/或重链的序列的核酸。这类PCR扩增方法可以用于获得包含编码抗体的可变轻链区和/或可变重链区的序列的核酸。扩增的核酸可以克隆至用于在宿主细胞中表达和用于进一步克隆的载体中，例如以产生嵌合和人源化抗体。
如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可用，但已知抗体分子的序列，那么编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成，或者通过使用可与序列的3'和5'末端杂交的合成引物进行PCR扩增或通过使用对于特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针进行克隆以鉴别例如来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆而从合适来源(例如抗体cDNA文库或由表达抗体的任何组织或细胞，如被选择用以表达本文所述的抗体的杂交瘤细胞产生的cDNA文库，或由其分离的核酸，优选聚A+RNA)获得。通过PCR产生的扩增的核酸然后可以使用本领域中众所周知的任何方法克隆至可复制克隆载体中。
编码本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体的DNA容易使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合于编码抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。杂交瘤细胞可以充当这类DNA的来源。一旦分离，DNA就可以放至表达载体中，然后被转染至例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞)或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞等宿主细胞中，实现重组宿主细胞中抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体的合成。
为了产生全抗体，包括VH或VL核苷酸序列、限制位点和保护限制位点的侧接序列的PCR引物可以用于扩增scFv克隆中的VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，通过PCR扩增的VH结构域可以克隆至表达重链恒定区(例如人γ4恒定区)的载体中，并且通过PCR扩增的VL结构域可以克隆至表达轻链恒定区(例如人κ或λ恒定区)的载体中。在某些实施例中，用于表达VH或VL结构域的载体包含EF-1α启动子、分泌信号、用于可变区的克隆位点、恒定域和选择标志物(如新霉素(neomycin))。VH和VL结构域也可以克隆至表达必需恒定区的一个载体中。接着使用本领域技术人员已知的技术将重链转换载体和轻链转换载体共转染至细胞系中，产生表达全长抗体，例如IgG的稳定或短暂细胞株。
DNA也可以例如通过用人类重链和轻链恒定域的编码序列替代鼠序列或者通过共价接合非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列至免疫球蛋白编码序列进行修饰。
还提供了在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与编码本文所述的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。在特定实施例中，本文所述的多核苷酸在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与编码本文所提供的VH结构域和/或VL结构域的多核苷酸杂交。
杂交条件已经在本领域中描述并且是本领域技术人员已知的。举例来说，在严格条件下的杂交可以包括在约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与过滤器结合的DNA杂交，随后在约50-65℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中一次或多次洗涤；在高度严格条件下的杂交可以包括在约45℃下在6×SSC中与过滤器结合的核酸杂交，随后在约68℃下在0.1×SSC/0.2％SDS中一次或多次洗涤。在其它严格杂交条件下的杂交是本领域技术人员已知的并且已经予以描述，参见例如以全文引用的方式并入本文中的Ausubel FM等人编,(1989)《现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》,第I卷,格林出版联合公司(Green Publishing Associates,Inc.)和约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.),纽约(New York)第6.3.1-6.3.6页和第2.10.3页。
在某些方面，本文提供了表达(例如以重组方式)特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的本文所述的抗体的细胞(例如宿主细胞)和相关多核苷酸和表达载体。本文提供了包括包含编码抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或片段的核苷酸序列的多核苷酸的载体(例如表达载体)，用于在宿主细胞中，优选在哺乳动物细胞(例如CHO细胞)重组表达。本文还提供了包含这类载体以重组表达本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体(例如人源或人源化抗体)的宿主细胞。在一特定方面，本文提供了用于产生本文所述的抗体的方法，其包含从宿主细胞表达这类抗体。
本文所述的特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体(例如全长抗体、抗体的重链和/或轻链或本文所述的单链抗体)的重组表达一般涉及含有编码所述抗体的多核苷酸的表达载体的构建。在获得编码本文所述的抗体分子、抗体的重链和/或轻链或其片段(例如重链和/或轻链可变区)的多核苷酸后，用于产生抗体分子的载体可以通过重组DNA技术使用本领域中众所周知的技术产生。因此，本文中描述了通过表达含有编码抗体或抗体片段(例如轻链或重链)的核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。本领域技术人员众所周知的方法可以用于构建含有抗体或抗体片段(例如轻链或重链)编码序列和适宜的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。还提供了包含可操作地连接于启动子的编码本文所述的抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体或其片段的重链或轻链可变区或者重链或轻链CDR的核苷酸序列的可复制载体。这类载体可以例如包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如国际公开第WO 86/05807号和第WO 89/01036号；以及美国专利第5,122,464号，其以全文引用的方式并入本文中)，并且抗体的可变区可以克隆至这类载体中用于表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链两条链。
表达载体可以通过常规技术转移至细胞(例如宿主细胞)并且所得细胞然后可以通过常规技术培养以产生本文所述的抗体或其片段。因此，本文提供了含有编码本文所述的抗体或其片段、或其重链或轻链或其片段、或本文所述的单链抗体的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸可操作地连接于用于在宿主细胞中表达这类序列的启动子。在某些实施例中，为了表达双链抗体，单独地编码重链和轻链两条链的载体可以在宿主细胞中共表达以表达整个免疫球蛋白分子，如以下所详述。在某些实施例中，宿主细胞含有包含编码本文所述的抗体或其片段的重链和轻链两条链的多核苷酸的载体。在特定实施例中，宿主细胞含有两个不同载体，第一载体包含编码本文所述的抗体或其片段的重链或重链可变区的多核苷酸，并且第二载体包含编码本文所述的抗体或其片段的轻链或轻链可变区的多核苷酸。在其它实施例中，第一宿主细胞包括包含编码本文所述的抗体或其片段的重链或重链可变区的多核苷酸的第一载体，并且第二宿主细胞包括包含编码本文所述的抗体的轻链或轻链可变区的多核苷酸的第二载体。在特定实施例中，由第一细胞表达的重链/重链可变区与第二细胞的轻链/轻链可变区缔合，形成本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体。在某些实施例中，本文提供了包含这类第一宿主细胞和这类第二宿主细胞的宿主细胞群体。
在一具体实施例中，本文提供了包含第一载体和第二载体的载体群体，所述第一载体包含编码本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体的轻链/轻链可变区的多核苷酸，所述第二载体包含编码本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体的重链/重链可变区的多核苷酸。
多种宿主表达载体系统可以用于表达本文所述的抗体分子(参见例如美国专利第5,807,715号，其以全文引用的方式并入本文中)。这类宿主表达系统代表可以产生所关注的编码序列并且随后纯化的媒剂，而且代表在用适宜的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文所述的抗体分子的细胞。这些包括(但不限于)用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，如细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如绿藻，如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或携带含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10细胞)。在一特定实施例中，用于表达本文所述的抗体的细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞。在某些实施例中，由CHO细胞产生的抗体的重链和/或轻链可以使N端谷氨酰胺或谷氨酸残基被焦谷氨酸置换。在一具体实施例中，用于表达本文所述的抗体的细胞是人细胞，例如人细胞系。在一特定实施例中，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。在一具体实施例中，尤其用于表达完整重组抗体分子的细菌细胞如大肠杆菌或真核细胞(例如哺乳动物细胞)用于表达重组抗体分子。举例来说，与载体(如来自人巨细胞病毒的主要中早期基因启动子元件)结合的哺乳动物细胞(如CHO细胞)是抗体的有效表达系统(Foecking MK与Hofstetter H(1986)《基因(Gene)》45:101-5；和Cockett MI等人,(1990)《生物技术》8(7):662-7，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中)。在某些实施例中，本文所述的抗体由CHO细胞或NSO细胞产生。在一特定实施例中，编码本文所述的特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体的核苷酸序列的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调控。
在细菌系统中，多种表达载体可以有利地取决于所表达抗体分子预期的用途来选择。举例来说，当待产生大量的这类抗体用于生成抗体分子的药物组合物时，指导高水平的容易纯化的融合蛋白产物的表达的载体可能是所希望的。这类载体包括(但不限于)大肠杆菌表达载体pUR278(Ruether U与Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2:1791-1794)，其中抗体编码序列可以单独地与lac Z编码区同框连接至载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye S与Inouye M(1985)《核酸研究》13:3101-3109；Van Heeke G与Schuster SM(1989)《生物化学杂志》24:5503-5509等等，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中)。举例来说，pGEX载体也可以用于将外源多肽作为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白表达。一般来说，这类融合蛋白是可溶性的并且可以通过吸附和结合基质谷胱甘肽琼脂糖珠从裂解的细胞纯化，随后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱。pGEX载体被设计为包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
在昆虫系统中，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)可以用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可以单独地克隆至病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并且放在AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用多种基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，所关注的抗体编码序列可以连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联体前导序列。这一嵌合基因然后可以通过体外或体内重组插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区(例如E1或E3区)中的插入将产生活的并且能够在感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(例如参见Logan J与Shenk T(1984)PNAS 81(12):3655-9，其以全文引用的方式并入本文中)。特定的起始信号也可能是插入的抗体编码序列的高效翻译所需的。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的，天然的和合成的。表达的效率可以通过包括适宜的转录增强子元件、转录终止子等增强(参见例如Bitter G等人,(1987)《酶学方法》153:516-544，其以全文引用的方式并入本文中)。
另外，可以选择调节所插入序列的表达或以所需特定方式修饰并加工基因产物的宿主细胞品系。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白质的功能来说可能是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性并且特定的机制。可以选择适宜的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括(但不限于)CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、NSO(不内源地产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、COS(例如COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在某些实施例中，本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体在哺乳动物细胞，例如CHO细胞中产生。
在一特定实施例中，本文所述的抗体具有降低的岩藻糖含量或没有岩藻糖含量。这类抗体可以使用本领域技术人员已知的技术产生。举例来说，抗体可以在岩藻糖基化能力缺陷或缺乏的细胞中表达。在一特定实例中，敲除α1,6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因的细胞系可以用于产生具有减少的岩藻糖含量的抗体。系统(Lonza)是可以用于产生具有减少的岩藻糖含量的抗体的这类系统的一实例。
对于重组蛋白的长期、高产率的产生，可以生成稳定表达细胞。举例来说，稳定表达本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体的细胞系可以工程化。在特定实施例中，本文所提供的细胞稳定表达轻链/轻链可变区和重链/重链可变区，其缔合形成本文所述的抗体。
在某些方面，替代使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用通过适宜的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选标志物转化。在引入外源DNA/多核苷酸之后，可以允许工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，并且然后换成选择培养基。重组质粒中的可选标志物赋予对选择的抗性并且允许细胞稳定地整合质粒至其染色体中和生长形成基因座，其随后可以克隆和扩增至细胞系中。此方法可以有利地用于将表达本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体或其片段的细胞系工程化。这类工程化的细胞系尤其可用于筛选和评估直接或间接地与抗体分子相互作用的组合物。
可以使用多种选择系统，包括(但不限于)分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人,(1977)《细胞(Cell)》11(1):223-32)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska EH与Szybalski W(1962)PNAS 48(12):2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy I等人,(1980)《细胞》22(3):817-23)基因，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。此外，抗代谢物抗性可以用作以下基因的选择基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler M等人,(1980)PNAS 77(6):3567-70；O'Hare K等人,(1981)PNAS 78:1527-31)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan RC与Berg P(1981)PNAS78(4):2072-6)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu GY与Wu CH(1991)《生物疗法(Biotherapy)》3:87-95；Tolstoshev P(1993)《药理学与毒理学年度评论(Ann RevPharmacol Toxicol)》32:573-596；Mulligan RC(1993)《科学》260:926-932；和Morgan RA与Anderson WF(1993)《生物化学年度评论(Ann Rev Biochem)》62:191-217；Nabel GJ与Felgner PL(1993)《生物技术趋势(Trends Biotechnol)》11(5):211-5)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre RF等人,(1984)《基因》30(1-3):147-56)，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。重组DNA技术领域中通常已知的方法可以常规地应用于选择所需的重组克隆并且这类方法描述于例如Ausubel FM等人,(编),《现代分子生物学实验技术》,约翰·威利父子公司,纽约州(NY)(1993)；Kriegler M,《基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual)》,斯托克顿出版社(StocktonPress),纽约州(1990)；和第12和13章,Dracopoli NC等人,(编),《人类遗传学实验室指南(Current Protocols in Human Genetics)》,约翰·威利父子公司,纽约州(1994)；Colbère-Garapin F等人,(1981)《分子生物学杂志》150:1-14中，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。
抗体分子的表达水平可以通过载体扩增提高(关于综述，参见Bebbington CR与Hentschel CCG,《在DNA克隆中使用基于基因扩增的载体在哺乳动物细胞中表达克隆基因(The use of vectors based on gene amplification for the expression of clonedgenes in mammalian cells in DNA cloning)》,第3卷(学术出版社(Academic Press),纽约,1987)，其以全文引用的方式并入本文中)。当表达抗体的载体系统中的标志物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的提高将增加标志物基因的拷贝数。因为扩增的区域与抗体基因相关，所以抗体的产生也增加(Crouse GF等人,(1983)《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》3:257-66，其以全文引用的方式并入本文中)。
宿主细胞可以与本文所述的两种或更多种表达载体共转染，第一载体编码重链获得的多肽并且第二载体编码轻链获得的多肽。两种载体可以含有一致的可选标志物，这使得能够等同地表达重链和轻链多肽。宿主细胞可以用不同量的两种或更多种表达载体共转染。举例来说，宿主细胞可以用以下比率中的任一比率的第一表达载体与第二表达载体转染∶约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。
可替代地，可以使用编码并且能够表达重链和轻链多肽两者的单一载体。在这类情况下，轻链应当放在重链之前以避免过量的毒性游离重链(Proudfoot NJ(1986)《自然(Nature)》322:562-565；和G(1980)PNAS 77:2197-2199，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中)。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。表达载体可以是单顺反子的或多顺反子的。多顺反子的核酸构建体可以编码2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基因/核苷酸序列或者2-5、5-10或10-20个范围内的基因/核苷酸序列。举例来说，双顺反子的核酸构建体可以按以下顺序包含启动子、第一基因(例如本文所述的抗体的重链)和第二基因(例如本文所述的抗体的轻链)。在这类表达载体中，两个基因的转录可以由启动子驱动，而来自第一基因的mRNA的翻译可以是通过帽依赖性(cap-dependent)的扫描机制并且来自第二基因的mRNA的翻译可以是通过非帽依赖性的机制，例如通过IRES。
在本文所述的抗体分子已经通过重组表达产生时，其可以通过本领域已知用于免疫球蛋白分子纯化的任何方法进行纯化，例如通过色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是通过蛋白A后对特定抗原的亲和力，和尺寸排阻柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过任何其它用于蛋白质纯化的标准技术。此外，本文所述的抗体可以与本文所述的或本领域中另外已知的异源多肽序列融合以促进纯化。
在特定实施例中，分离或纯化本文所述的抗体。一般来说，分离的抗体是基本上不含具有与分离的抗体不同的抗原特异性的其它抗体的抗体。举例来说，在一具体实施例中，本文所述的抗体的制剂基本上不含细胞物质和/或化学前体。措辞“基本上不含细胞物质”包括其中抗体与分离的或以重组方式产生的细胞的细胞组分分离的抗体的制剂。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括具有少于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以干重计)的异源蛋白质(本文中也称为“污染蛋白质”)和/或抗体的变体，例如抗体的不同翻译后修饰形式或抗体的其它不同形式(例如抗体片段)的抗体制剂。当抗体重组产生时，它通常也基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积的少于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当抗体通过化学合成产生时，它通常基本上不含化学前体或其它化学物质，即它与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学物质分离。因此，这类抗体制剂具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的除所关注抗体以外的化学前体或化合物。在一特定实施例中，分离或纯化本文所述的抗体。
特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体或其片段可以通过本领域中已知的用于合成抗体的任何方法，例如通过化学合成或通过重组表达技术来产生。除非另有指示，否则本文所述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本领域技术范围内的相关领域的常规技术。这些技术描述于例如本文所引用的参考文献中并在文献中有充分说明。参见例如Maniatis T等人,(1982)《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook J等人,(1989),《分子克隆：实验指南》,第二版,冷泉港实验室出版社；Sambrook J等人,(2001)《分子克隆：实验指南》,冷泉港实验室出版社,纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor,NY)；Ausubel FM等人,《现代分子生物学实验技术》,约翰·威利父子公司(1987和年度更新)；《免疫学实验室指南(Current Protocols in Immunology)》,约翰·威利父子公司(1987和年度更新)；Gait(编)(1984)《寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach)》,IRL出版社(IRL Press；Eckstein(编)(1991)《寡核苷酸和类似物：实用方法(Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach)》,IRL出版社；Birren B等人,(编)(1999)《基因组分析：实验室手册(Genome Analysis:A LaboratoryManual)》,冷泉港实验室出版社，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。
在一特定实施例中，本文所述的抗体是通过涉及DNA序列产生(例如经由合成)、基因工程的任何方式制备、表达、产生或分离的抗体(例如重组抗体)。在某些实施例中，这类抗体包含不天然存在于动物或哺乳动物(例如人)体内的抗体胚系谱中的序列(例如DNA序列或氨基酸序列)。
在一方面，本文提供了一种制造特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体的方法，其包含培养本文所述的细胞或宿主细胞。在一个实施例中，所述方法体外进行。在某一方面，本文提供了一种制造特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的抗体的方法，其包含使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如包含编码本文所述的抗体的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如以重组方式表达)抗体。在一具体实施例中，细胞是分离的细胞。在一具体实施例中，外源多核苷酸已经被引入细胞中。在一具体实施例中，所述方法进一步包含纯化从细胞或宿主细胞获得的抗体的步骤。
用于产生多克隆抗体的方法是本领域中已知的(参见例如《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》,(2002)第5版,Ausubel FM等人编,约翰·威利父子出版公司,纽约中的第11章，其以全文引用的方式并入本文中)。
单克隆抗体可以使用本领域中已知的各种技术制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。举例来说，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术产生，包括本领域中已知的和例如在Harlow E与Lane D,《抗体：实验室手册》,(冷泉港实验室出版社,第2版1988)；Hammerling GJ等人,《单克隆抗体和T细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)》563 681(爱思唯尔(Elsevier),纽约州,1981)中传授的那些，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。举例来说，单克隆抗体可以从外源表达本文所述的抗体或其片段(例如这类抗体的轻链和/或重链)的宿主细胞重组产生。
在特定实施例中，如本文所用，“单克隆抗体”是由单细胞(例如产生重组抗体的杂交瘤或宿主细胞)产生的抗体，其中如例如通过ELISA或本领域中或本文提供的实例中已知的其它抗原结合或竞争性结合分析所测定，所述抗体特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)。在具体实施例中，单克隆抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施例中，单克隆抗体是单价抗体或多价(例如二价)抗体。在具体实施例中，单克隆抗体是单特异性或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。举例来说，本文所述的单克隆抗体可以例如通过如Kohler G与Milstein C(1975)《自然》256:495中所述的杂交瘤方法产生，或可以例如使用如本文所述的技术从噬菌体文库分离。克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其它制备方法是本领域中众所周知的(参见例如《精编分子生物学实验指南》第11章,(2002)第5版,Ausubel FM等人,上述)。
如本文所用，当抗体包含至少两个(例如两个或更多个)单价结合域时，抗体多价(例如双价)结合于抗原，各单价结合域能够结合于抗原上的表位。各单价结合域可以结合于抗原上的相同或不同表位。
使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的和本领域中众所周知的。举例来说，在杂交瘤方法中，小鼠或其它适宜的宿主动物，例如绵羊、山羊、兔、大鼠、仓鼠或猕猴，进行免疫接种，以引发淋巴细胞产生或能够产生用于免疫接种的特异性结合于蛋白质(例如CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137))的抗体。可替代地，淋巴细胞可以体外免疫接种。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding JW(编),《单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies:Principles andPractice)》,第59-103页(学术出版社,1986)，其以全文引用的方式并入本文中)。另外，RIMMS(多位点重复免疫)技术可以用于对动物进行免疫接种(Kilpatrick KE等人,(1997)《杂交瘤》16:381-9，其以全文引用的方式并入本文中)。
在某些实施例中，小鼠(或其它动物，如大鼠、猴、驴、猪、绵羊、仓鼠或狗)可以用抗原(例如CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137))免疫接种并且在检测到免疫反应时，例如在小鼠血清中检测到对抗原具有特异性的抗体时，收获小鼠脾脏并且分离脾细胞。然后脾细胞通过众所周知的技术与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如与来自可从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，)(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))获得的细胞系SP20的细胞融合，形成杂交瘤。选择杂交瘤并且通过有限稀释法克隆。在某些实施例中，收集已免疫接种的小鼠的淋巴结并将其与NS0骨髓瘤细胞融合。
如此制备的杂交瘤细胞在优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质的合适培养基中接种和生长。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基喋呤(aminopterin)和胸苷(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。
特定的实施例采用有效融合，通过所选择的产抗体细胞支持稳定的高水平抗体产生，并且对例如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些骨髓瘤细胞系中有鼠骨髓瘤系，如NSO细胞系，或来源于可从美国加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA,USA)的索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系，以及可从美国马里兰州罗克维尔(Rockville,MD,USA)的美国菌种保藏中心获得的SP-2或X63-Ag8.653细胞。也已经描述人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系用于产生人类单克隆抗体(Kozbor D(1984)《免疫学杂志》133:3001-5；Brodeur等人,《单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications)》,第51-63页(马塞尔德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,1987)，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中)。
分析使杂交瘤细胞生长的培养基的针对CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的单克隆抗体的产生。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过本领域中已知的方法，例如免疫沉淀来测定，或通过体外结合分析法，如放射免疫分析法(RIA)或酶联免疫吸附分析法(ELISA)来测定。
在鉴定了产生具有所期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，克隆可以通过有限稀释程序进行亚克隆并通过标准方法生长(Goding JW(编),《单克隆抗体：原理和实践》,上述)。用于达成这一目的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI 1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤在体内生长。
可以通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水液或血清适当地分离。
本文所述的抗体包括例如识别特异性CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)并且可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生的抗体片段。举例来说，本文所述的Fab和F(ab')2片段可以使用酶，如木瓜蛋白酶(用以产生Fab片段)或胃蛋白酶(用以产生F(ab')2片段)，通过免疫球蛋白分子的蛋白水解裂解产生。Fab片段对应于抗体分子的两个一致臂之一并且含有与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链。F(ab')2片段含有通过铰链区中的二硫键连接的抗体分子的两个抗原结合臂。
此外，本文所述的抗体还可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码其的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。具体来说，编码VH和VL结构域的DNA序列从动物cDNA文库(例如受影响组织的人或鼠cDNA文库)扩增。编码VH和VL结构域的DNA通过PCR与scFv连接子重组在一起并且克隆至噬粒载体中。将载体在大肠杆菌中电穿孔并用辅助噬菌体感染大肠杆菌。用于这些方法中的噬菌体典型地是丝状噬菌体，包括fd和M13，并且VH和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。表达结合于特定抗原的抗原结合域的噬菌体可以用抗原，例如使用标记的抗原或者结合或捕获至固体表面或珠粒的抗原进行选择或鉴别。可以用于制备本文所述的抗体的噬菌体展示方法的实例包括Brinkman U等人,(1995)《免疫学方法杂志》182:41-50；Ames RS等人,(1995)《免疫学方法杂志》184:177-186；Kettleborough CA等人,(1994)《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》24:952-958；Persic L等人,(1997)《基因》187:9-18；Burton DR与Barbas CF(1994)《免疫学进展(Advan Immunol)》57:191-280；PCT申请第PCT/GB91/001134号；国际公开第WO 90/02809号、第WO 91/10737号、第WO 92/01047号、第WO 92/18619号、第WO 93/1 1236号、第WO 95/15982号、第WO 95/20401号和第WO 97/13844号；和美国专利第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号和第5,969,108号中公开的那些，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。
如以上参考文献中所描述，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以分离并用于产生全抗体(包括人类抗体)，或任何其它所需抗原结合片段，并且在任何所需宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达，例如如下文所描述。重组产生抗体片段如Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术也可以使用本领域中已知的方法来利用，如以下中公开的那些方法：PCT公开第WO 92/22324号；Mullinax RL等人,(1992)《生物技术》12(6):864-9；Sawai H等人,(1995)《美国生殖免疫学杂志(Am J Reprod Immunol)》34:26-34；和Better M等人,(1988)《科学》240:1041-1043，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，为了产生全抗体，包括VH或VL核苷酸序列、限制位点和保护限制位点的侧接序列的PCR引物可以用于从模板(例如scFv克隆)扩增VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，通过PCR扩增的VH结构域可以克隆至表达VH恒定区的载体中，并且通过PCR扩增的VL结构域可以克隆至表达VL恒定区(例如人κ或λ恒定区)的载体中。VH和VL结构域也可以克隆至表达必需恒定区的一个载体中。接着使用本领域技术人员已知的技术将重链转换载体和轻链转换载体共转染至细胞系中，产生表达全长抗体，例如IgG的稳定或短暂细胞株。
嵌合抗体是抗体的不同部分来源于不同免疫球蛋白分子的分子。例如，嵌合抗体可以含有与人类抗体的恒定区融合的小鼠或大鼠单克隆抗体的可变区。产生嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如Morrison SL(1985)《科学》229:1202-7；Oi VT与MorrisonSL(1986)《生物技术》4:214-221；Gillies SD等人,(1989)《免疫学方法杂志》125:191-202；和美国专利第5,807,715号、第4,816,567号、第4,816,397号和第6,331,415号，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。
人源化抗体能够结合于预定抗原并且包含基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架区和基本上具有非人免疫球蛋白(例如鼠免疫球蛋白)的氨基酸序列的CDR。在具体实施例中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区((Fc)的至少一部分，典型地人免疫球蛋白的恒定区的一部分。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以使用本领域中已知的多种技术产生，包括(但不限于)CDR-移植(欧洲专利第EP 239400号；国际公开第WO 91/09967号；和美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号)、镶嵌(veneering)或表面重塑(resurfacing)(欧洲专利第EP592106号和第EP 519596号；Padlan EA(1991)《分子免疫学》28(4/5):489-498；StudnickaGM等人,(1994)《蛋白质工程(Prot Engineering)》7(6):805-814；和Roguska MA等人,(1994)PNAS 91:969-973)、链改组(美国专利第5,565,332号)和例如美国专利第6,407,213号、美国专利第5,766,886号、国际公开第WO 93/17105号；Tan P等人,(2002)《免疫学杂志》169:1119-25；Caldas C等人,(2000)《蛋白质工程》13(5):353-60；Morea V等人,(2000)《方法》20(3):267-79；Baca M等人,(1997)《生物化学杂志》272(16):10678-84；Roguska MA等人,(1996)《蛋白质工程》9(10):895 904；Couto JR等人,(1995)《癌症研究》.55(23增刊):5973s-5977s；Couto JR等人,(1995)《癌症研究》55(8):1717-22；Sandhu JS(1994)《基因》150(2):409-10；和Pedersen JT等人,(1994)《分子生物学杂志》235(3):959-73中公开的技术，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。还参见美国申请公开第US 2005/0042664A1号(2005年2月24日)，其以全文引用的方式并入本文中。
已经描述了制造多特异性抗体(例如双特异性抗体)的方法，参见例如美国专利第7,951,917号、第7,183,076号、第8,227,577号、第5,837,242号、第5,989,830号、第5,869,620号、第6,132,992号和第8,586,713号，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。
单域抗体，例如缺乏轻链的抗体，可以通过本领域中众所周知的方法产生。参见Riechmann L与Muyldermans S(1999)《免疫学杂志》231:25-38；Nuttall SD等人,(2000)《当今药物生物技术(Curr Pharm Biotechnol)》1(3):253-263；Muyldermans S,(2001)《生物技术杂志(J Biotechnol)》74(4):277-302；美国专利第6,005,079号；和国际公开第WO94/04678号、第WO 94/25591号和第WO 01/44301号，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。
此外，特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗原的抗体又可以使用本领域的技术人员众所周知的技术用以产生“模拟”抗原的抗个体基因型抗体。参见例如Greenspan NS与Bona CA(1989)FASEB J 7(5):437-444；和Nissinoff A(1991)《免疫学杂志》147(8):2429-2438，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
在具体实施例中，结合于与本文所述的抗CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗体相同的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)表位的本文所述的抗体是人类抗体。在具体实施例中，竞争性阻断(例如以剂量依赖性方式)本文所述的任一抗体结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的本文所述的抗体是人类抗体。人类抗体可以使用本领域中已知的任何方法产生。举例来说，可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但是可以表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠。具体来说，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机地或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。可替代地，除了人重链和轻链基因之外，还可以将人可变区、恒定区和多样性区域引入小鼠胚胎干细胞中。可以与通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座分开或同时，使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因不具功能性。具体来说，JH区的纯合缺失阻止内源抗体产生。使经修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射至囊胚中以产生嵌合小鼠。接着饲养嵌合小鼠以产生表达人类抗体的纯合子代。以正常方式，用所选抗原，例如抗原(例如CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137))的全部或一部分对转基因小鼠进行免疫接种。可以使用常规杂交瘤技术，从进行免疫接种的转基因小鼠获得针对所述抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并且随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这类技术，有可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于用于产生人类抗体的这种技术的综述，参见Lonberg N与Huszar D(1995)《国际免疫学评论(Int Rev Immunol)》13:65-93，所述文献以全文引用的方式并入本文中。关于用于产生人类抗体和人类单克隆抗体的这种技术和用于产生这类抗体的方案的详细论述，参见例如国际公开第WO 98/24893号、第WO 96/34096号和第WO 96/33735号；以及美国专利第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号和第5,939,598号，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。能够产生人类抗体的小鼠的实例包括XenomouseTM(Abgenix,Inc.；美国专利第6,075,181号和第6,150,184号)、HuAb-MouseTM(Mederex,Inc./Gen Pharm；美国专利第5,545,806号和第5,569,825号)、Trans Chromo MouseTM(Kirin)和KM MouseTM(Medarex/Kirin)，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。
特异性结合于CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)的人类抗体可以通过包括上述噬菌体展示方法在内的本领域中已知的多种方法，使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库来制备。还参见美国专利第4,444,887号、第4,716,111号和第5,885,793号；以及国际公开第WO 98/46645号、第WO 98/50433号、第WO 98/24893号、第WO 98/16654号、第WO 96/34096号、第WO 96/33735号和第WO 91/10741号，所述专利全部以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，人类抗体可以使用小鼠-人杂交瘤产生。举例来说，用埃-巴二氏病毒(EBV)转化的人外周血淋巴细胞可以与小鼠骨髓瘤细胞融合以产生分泌人类单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤，并且可以对这些小鼠-人杂交瘤进行筛选以确定分泌特异性结合于靶抗原(例如CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137))的人类单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤。这类方法是已知的并且本领域中予以描述，参见例如Shinmoto H等人,(2004)《细胞工程技术(Cytotechnology)》46:19-23；Naganawa Y等人,(2005)《人类抗体(Human Antibodies)》14:27-31，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
5.6试剂盒
还提供了试剂盒，其包含本文所述的一种或多种抗体或其药物组合物或缀合物。在一特定实施例中，本文提供了一种药包或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述一个或多个容器填充有本文所述的药物组合物的成分中的一种或多种，如本文所提供的一种或多种抗体。在某些实施例中，试剂盒含有本文所述的药物组合物和任何预防剂或治疗剂，如本文所述的那些。在某些实施例中，试剂盒可以含有T细胞有丝分裂原，例如植物血球凝集素(PHA)和/或佛波醇肉豆蔻乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)，或TCR复合物刺激抗体，如抗CD3抗体和抗CD28抗体。任选地与所述容器相关联的可以是呈由管理医药或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的注意事项，所述注意事项反映了所述机构批准制造、使用或销售供人施用。
还提供了可以用于以上方法的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒在一个或多个容器中包含本文所述的抗体，优选纯化的抗体。在一特定实施例中，本文所述的试剂盒含有基本上分离的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗原作为对照。在另一特定实施例中，本文所述的试剂盒进一步包含不与CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗原反应的对照抗体。在另一特定实施例中本文所述的试剂盒含有用于检测抗体与CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗原的结合的一个或多个元件(例如抗体可以缀合于可检测底物，例如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物，或识别第一抗体的第二抗体可以缀合于可检测底物)。在特定实施例中，本文提供的试剂盒可以包括重组产生或化学合成的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗原。试剂盒中提供的CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗原还可以附接至固体载体。在一更特定实施例中，上述试剂盒的检测装置包括附接CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗原的固体载体。这类试剂盒还可以包括非附接的报告子标记的抗人抗体或抗小鼠/大鼠抗体。在此实施例中，抗体与CD137(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)抗原的结合可以通过所述报告子标记的抗体的结合来检测。在一个实施例中，本发明涉及本发明的试剂盒的用途，其用于体外分析和/或检测生物样品中的CD137抗原(例如人CD137或食蟹猕猴CD137)。
6.实例
这一章节(即，章节6)中的实例是以说明的方式提供的，而不是作为限制。
6.1实例1∶抗CD137抗体的表征
本实例描述了对结合于人CD137的抗体的表征。具体地说，对特异性结合于人CD137并刺激其功能的BA001抗体进行表征。BA001的可变区的序列信息提供于表1中。
6.1.1抗人CD137抗体结合于表达CD137的细胞
在多种细胞类型中测试人类抗CD137 IgG1抗体BA001结合于表达人CD137或食蟹猕猴CD137的细胞的能力，如图1A和1B中所示。
工程化的Jurkat细胞
在一个实例中，Jurkat细胞被工程化成组成性地表达人CD137或食蟹猕猴CD137并用于分析抗体BA001的结合。简单来说，将转染的Jurkat细胞以5×104个细胞/孔涂铺在96孔圆底板中，并与抗体的连续稀释液(即，BA001或同型对照，在所指示浓度下)一起在4℃下培育25分钟(图1A和1B的左图)。将细胞洗涤两次并与抗人λ-PE二级抗体(LifeTechnologies，目录号MH10614)一起培育。将细胞洗涤并且悬浮于80μl的在PBS中制备的2％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)中。用BD FACS Canto采集数据并使用BDFACSDiva软件分析。
如图1A和1B(左图)中所示，BA001抗体结合于表达人CD137或食蟹猕猴CD137的Jurkat细胞。
活化的CEM/C1 T细胞
在第二实例中，测试BA001结合于表达内源性人CD137的活化的人CEM/C1T细胞的能力。简单来说，通过与10ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)和1μg/ml离子霉素一起在37℃下培育18小时来刺激CEM/C1细胞。将经过刺激的细胞以1×105个细胞/孔涂铺在96孔圆底板中并与抗体的连续稀释液(即BA001或同型对照，在图1A的中间图中所示的浓度下)一起在4℃下培育25分钟。将细胞洗涤两次并与抗人λ-PE二级抗体(LifeTechnologies，目录号MH10614)一起培育。将细胞洗涤并且悬浮于80μl的在PBS中制备的2％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)中。用BD FACS Canto采集数据并使用BDFACSDiva软件分析。
如图1A的中间图中所示，BA001抗体结合于表达内源性CD137的活化的CEM/C1细胞。
活化的原代CD8+T细胞
在第三实例中，测试BA001结合于活化的人或食蟹猕猴CD8+T细胞的能力。简单来说，通过与10ng/ml PMA和1μg/ml离子霉素一起在37℃下培育18小时来刺激人或食蟹猕猴PBMC。将经过刺激的细胞以1×105个细胞/孔涂铺在96孔圆底板中并与抗体的连续稀释液(即BA001或同型对照，在图1A和1B的右图中所示的浓度下)和抗人CD8-APC(Biolegend，目录号311049)一起在4℃下培育25分钟。将细胞洗涤两次并与F(ab')2山羊抗人IgG-PE二级抗体(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)一起培育。将细胞洗涤并且悬浮于80μl的在PBS中制备的2％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)中。用BD FACS Canto采集数据并且然后使用Flowjo V10分析(对CD8+T细胞门控)。
如图1A-1B的右图中所示，BA001抗体结合于表达内源性CD137的活化的人或食蟹猕猴CD8+T细胞。
6.1.2抗CD137抗体不阻断CD137L与CD137的结合
CD137L与CD137/BA001-F(ab')2复合物的结合
表面等离子体共振用于评估CD137L结合于与BA001的F(ab')2片段(BA001-F(ab')2)复合的CD137的能力。使用Genovis FragITTM试剂盒(目录号A2-FR2-100)产生BA001-F(ab')2。使用T200(GE Healthcare)和IX HBS-P+(GE Healthcare，BR-1006-71)作为操作缓冲液，在25℃下分析所有相互作用。
在一个实例中，将BA001-F(ab')2固定于芯片并且接着结合于CD137，然后使CD137L结合于CD137/BA001-F(ab')2复合物。首先，抗人Fab捕捉抗体(GE Healthcare，FabCapture Kit，28-9583-25)固定于CM5系列S传感器芯片(GE Healthcare，29-1496-03)的流槽2。接着BA001-F(ab')2在操作缓冲液中稀释至6.75μg/ml，并以10μl/min固定至流槽1，历时120秒。作为测量CD137或CD137L的非特异性相互作用的对照，芯片的流槽1仅仅与抗人Fab捕捉抗体结合。在捕捉BA001-F(ab')2之后，100nM CD137(Aero Biosystem，41B-H5227)以30μl/min流过芯片的两个流动槽，历时90秒，接着解离400秒。接着200nM CD137L(R&DSystems，#2295-4L-025)以30μl/min流过两个流动槽，历时90秒，接着是400秒的解离时间。
图2A中示出针对流槽2获得的反应减去针对流槽1获得的反应。当CD137流过流槽2时，检测到反应信号增加，表明CD137结合于BA001-F(ab')2。看到CD137从BA001-F(ab')2极慢地解离。接着CD137L流过流槽2并观测到反应信号增加，表明CD137L结合于CD137/BA001-F(ab')2复合物。这些结果显示BA001-F(ab')2与CD137的结合不阻断CD137L与CD137的结合。
在另一实例中，过量CD137(110nM)与BA001-F(ab')2(6μg/ml，54nM)预先混合，形成CD137/BA001-F(ab')2复合物。接着复合物以10μl/min固定于CM5系列S传感器芯片(GEHealthcare，29-1496-03)的流槽3，历时180秒，接着解离60秒。接着60nM CD137L以50μl/min流过所有流动槽，历时90秒，接着是400秒的解离时间。作为测量CD137或CD137L的非特异性相互作用的对照，芯片的流槽1仅仅与抗人Fab捕捉抗体结合。
图2B中示出针对流槽3获得的反应减去针对流槽1获得的反应。这些数据证明虽然BA001-F(ab')2以高亲和力结合于CD137，但此相互作用不削弱CD137L与CD137的结合。
亦对BA001和来源于BA001的Fab片段(BA001-Fab；数据未示)观测到与此实例中所述类似的结果。因此，BA001是不阻断配体的抗CD137抗体。
BA001不阻断细胞表面CD137L与细胞表面CD137的结合
为了确定BA001是否会阻断CD137L与在细胞表面上表达(即，在更多生理背景下)的CD137之间的结合，使用Xiao等人(JEM211(5):943-959,2014；以全文引用的方式并入本文中)中描述的方法进行细胞缀合分析。简单来说，将一组Jurkat细胞用人CD137转染(Jurkat-CD137)，并且另一组Jurkat细胞用人CD137L转染(Jurkat-CD137L)。将表达CD137的Jurkat细胞用红色染料PKH26(Sigma目录号PKH26GL-1KT)染色并且表达CD137L的Jurkat细胞用绿色染料PKH67(Sigma目录号PKH67GL-1KT)染色。将红色染料标记的Jurkat-CD137细胞(1×105个/孔)与50μg/ml BA001、参考抗CD137抗体#1、参考抗CD137抗体#2或同型对照一起在圆底96孔板中在室温下培育30分钟。接着加入绿色染料标记的Jurkat-CD137L细胞(1×105个/孔)并在37℃下培育45分钟。通过流式细胞术，使用BD FACS Canto和BDFACSDiva软件分析细胞与细胞结合/缀合物形成。PE通道用于红色染料，并且FITC通道用于绿色染料。因而，表达CD137的细胞与表达CD137L的细胞之间的结合将产生展现检测到的细胞尺寸增加的双重阳性信号(即，红+绿)。阻断配体的抗CD137抗体将减弱或消除此作用。
图3A展示BA001和参考抗CD137抗体#2不阻断细胞上的CD137L与细胞上的CD137结合。相比之下，参考抗CD137抗体#1阻断配体结合。
在类似背景下，将表达CD137L的细胞和表达CD137的细胞分别用PKH26红色荧光细胞连接子或PKH67绿色荧光细胞连接子染色，并以4×106个细胞/毫升的浓度悬浮于汉克平衡盐溶液(Hanks'balanced salt solution，HBSS)。3倍连续稀释的BA001、参考抗CD137抗体#1、参考抗CD137抗体#2或相应同型对照抗体在HBSS中以3X工作浓度制备。在U形底96孔板中，将25μL Jurkat-CD137细胞与25μL抗CD137抗体一起在室温下培育30分钟，并加入表达CD137L的细胞。可替代地，将25μL Jurkat-CD137细胞与25μL表达CD137L的细胞一起在室温下培育30分钟，并加入抗CD137抗体。将平板在37℃和5％CO2下培育45分钟，并通过流式细胞术，使用BD Fortessa细胞仪鉴定表达CD137L的细胞和表达CD137的细胞的缀合物为PE和FITC双重阳性。
如图3B和3C中所示，当抗CD137抗体在细胞共培养之前(图3B)或之后(图3C)加入时BA001和参考抗CD137抗体#2不影响表达CD137的细胞与表达CD137L的细胞的缀合。相比之下，参考抗CD137抗体#1抑制细胞缀合，表明此抗体阻断细胞表面的CD137L与细胞表面的CD137的结合。
6.2实例2∶抗CD137抗体的激动活性是交联和配体依赖性的
6.2.1抗CD137抗体仅仅在抗体交联存在下诱导NF-κB驱动的基因表达
为了表征BA001活化CD137信号传导的能力，产生并入了(i)NFκB-荧光素酶报告构建体和(ii)人或食蟹猕猴CD137的表达构建体的Jurkat报告细胞。因而，在报告细胞表面上的CD137的活化诱发下游信号传导，在NFκB启动子控制下驱动荧光素酶的表达。
发现BA001活化CD137的能力取决于BA001交联。实际上，非交联的BA001不能够刺激被工程化成表达CD137和NF-κB荧光素酶报告构建体的Jurkat细胞中的报告活性(数据未示)。为了表征交联依赖性，将BA001、同型对照抗体和参考抗CD137抗体#2与剂量滴定的交联剂(AffmiPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch，J09-006-098))一起培育。Jurkat报告细胞以50,000个细胞/孔的密度接种，并与2μg/mLBA001、同型对照抗体或参考抗CD137抗体#2一起培育4小时。通过荧光素酶分析系统(Promega N1120)测量NF-κB活性。
如图4A中所示，在此分析法中当以超过1:1的交联剂与抗体比率交联时BA001获得活性。相比之下，在无交联剂下参考抗CD137抗体#2具有活性，并且在递增量的交联剂下活性逐渐消失。
进一步评估在不存在人工抗体交联剂下在抗体群集时BA001是否能够使CD137激动。通过被工程化成表达FcγRIIIa(CD16)的CHO细胞诱发抗体群集。简单来说，将Jurkat报告细胞以50,000个细胞/孔的密度与剂量滴定的并工程化成表达CD16的CHO细胞或对照CHO细胞在2μg/mL BA001、同型对照抗体或在Fc区中具有N297A突变的BA001变体存在下共培养。在培育4小时之后通过荧光素酶分析系统(Promega N1120)测量NF-κB活性。
如图4B中所示，单独BA001不活化CD137信号传导，并且单独的表达CD16的CHO细胞具有有限的作用。然而，BA001与表达CD16的CHO细胞的组合协同活化报告细胞。N297A突变消除了BA001刺激CD137信号传导的能力，这可能是因为N297A Fc变体不能够啮合在CHO细胞上表达的CD16，因此不能够进行抗体群集。这个结果表明BA001在其中存在表达CD16的细胞(例如抗原呈递细胞或NK细胞)的微环境中具有选择性活性。
6.2.2抗CD137抗体在全PBMC下增强T细胞功能，但在纯化的T细胞下不增强。
在CD137L存在下BA001促进人T细胞分泌IL-2
在葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激之后评估BA001对原代人PBMC的激动活性。简单来说，在抗体(即，BA001、参考抗CD137抗体#1或#2或同型对照抗体，在图5中所示的浓度下)的连续稀释液存在下将冷冻保存的PBMC用200ng/ml SEA超抗原(Toxin Technologies，目录号AT101red)在37℃下刺激5天。通过AlphaLISA(Perkin Elmer，目录号AL221F)分析培养物上清液中的IL-2浓度。测试每个条件，重复五次。
如图5所示，抗CD137抗体BA001(IgG1)以剂量依赖性方式增加人PBMC中的IL-2产生，水平与参考抗CD137抗体相当或超过其。
在不存在CD137L下BA001不促进纯化的人T细胞分泌IL-2
评估在表达CD137L的抗原呈递细胞不存在下BA001对经过刺激的纯化的人T细胞的激动活性。简单来说，使用MACS全T细胞分离试剂盒(人)，利用autoMACS柱，根据制造商说明书，从冷冻保存的PBMC纯化T细胞。将纯化的T细胞以1×106个细胞/孔涂铺至预先涂有2μg/ml的低内毒素、无叠氮化物(LEAF)的抗CD3抗体(Biolegend目录号300432)的96孔培养板中。5μg/ml抗CD137抗体(BA001、参考抗CD137抗体#1或参考抗CD137抗体#2)或同型对照与F(ab')2片段山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，目录号109-006-098)交联，并接着加入平板中。在37℃下培育细胞三天。然后通过AlphaLISA(Perkin Elmer，目录号AL221F)分析培养物上清液中的IL-2浓度。测试每个条件，重复六次。
如图6A-6B中所示，相对于同型对照，BA001不促进纯化的T细胞的IL-2分泌增加。相比之下，两种参考抗CD137抗体诱导纯化的T细胞的IL-2分泌提高。图6C展示纯化的T细胞不表达可检测水平的CD137L。
综合而言，章节6.2.2中的数据表明BA001的激动活性在CD137L(例如由表达CD137L的细胞产生)存在下得到提高，如全PBMC中。预期在所用条件下BA001的激动活性可能需要CD137L的存在。因此，这些数据证明BA001活化表达CD137的细胞的能力可能是配体依赖性的。
6.2.3抗CD137抗体仅仅在CD137L存在下诱导NFκB驱动的基因表达
NFκB-荧光素酶报告细胞中BA001的配体依赖性
章节6.2.1中展示BA001活性取决于在CD137L不存在下的交联。进一步评估在CD137L存在下交联剂的作用。简单来说，任选地将1μg/mL CD137L(重组人4-1BB配体/TNFSF9(His标签)，R&D system，2295-4L-025/CF)加入上述培养系统，并类似地测量NF-κB活性。
如图7A中所示，在CD137L存在下，对于在报告体分析中的活性来说BA001仍需要交联剂，并且CD137L和交联的作用是累加的。当交联剂与抗体比率约1:10至1:1时，BA001仅仅在CD137L存在下显示活性。
为了证实外源性CD137L是此实验系统中CD137L的唯一来源，通过流式细胞术分析Jurkat报告细胞。简单来说，使表达CD137和表达CD137L的Jurkat细胞解冻并在补充有10％胎牛血清和1μg/mL嘌呤霉素的RPMI培养基中培养4或24小时。为利用流式细胞术分析，将3×104个细胞涂铺在96孔U形底板中，用补充有2％胎牛血清的冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并用与藻红蛋白(PE)缀合的抗CD137抗体、与别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗CD137L抗体和近红外活/死染料标记。在染色对照组中，将细胞用与PE缀合的不相关的同型对照抗体、与APC缀合的不相关的同型对照抗体和活/死染料标记。
如图7B中所示，表达CD137的Jurkat报告细胞表达高水平的CD137，但不表达CD137L。相比之下，表达CD137L的Jurkat细胞表达高水平的CD137L，但不表达CD137。
在以下使用Jurkat报告细胞的所有NF-κB活化分析中，抗CD137抗体和其同型对照抗体以1:2的比率交联。
在一个实例中，将表达人CD137的Jurkat NFκB-荧光素酶报告细胞(50,000个细胞/孔)与BA001或同型对照的连续稀释液一起在可溶性人CD137L(125ng/ml)存在或不存在下在37℃下培育四小时。使用荧光素酶分析系统(Promega目录号N1120)和EnVision板式读取器检测荧光素酶的表达。如图8A中所示，在不存在CD137L下BA001不诱导NFκB-荧光素酶的表达。在CD137L存在下，BA001能够以剂量依赖性方式诱导NFκB-荧光素酶的表达(图8B)。
在另一实例中，将表达食蟹猕猴CD137的Jurkat NFκB-荧光素酶报告细胞(50,000个细胞/孔)与BA001或同型对照的连续稀释液一起在可溶性人CD137L(150ng/ml)存在或不存在下在37℃下培育四小时。使用荧光素酶分析系统(Promega目录号N1120)和EnVision板式读取器检测荧光素酶的表达。如图8C中所示，在不存在CD137L下BA001不诱导NFκB-荧光素酶的表达。在CD137L存在下，BA001能够以剂量依赖性方式诱导NFκB-荧光素酶的表达(图8D)。
因此，这些数据表明在所用条件下BA001仅仅在对应CD137L存在下经由NFkB诱导人或食蟹猕猴CD137信号传导。
BA001与CD137L合作促进CD137信号传导
在另外实例中，将表达人CD137的Jurkat NFκB-荧光素酶报告细胞(50,000个细胞/孔)与2μg/ml抗CD137抗体(BA001、参考抗CD137抗体#1或参考抗CD137抗体#2)或同型对照一起在可溶性人CD137L的连续稀释液(0-1000ng/ml，如图9A-9C中所示)存在下在37℃下培育四小时。在一组样品中，在CD137L之前加入抗CD137抗体(图9A)。在第二组样品中，抗CD137抗体和CD137L同时加入(图9B)。在第三组样品中，CD137L在抗CD137抗体之前加入(图9C)。使用荧光素酶分析系统(Promega目录号N1120)和EnVision板式读取器检测荧光素酶的表达。
如图9A-9C中所示，CD137L以剂量依赖性方式诱导NFκB-荧光素酶的表达。BA001以配体依赖性方式诱导NFκB-荧光素酶的表达，并且在较高配体浓度下使报告体表达显著增加超出针对同型对照所检测到的表达。无论抗体和配体的加入顺序如何，都观测到此作用(图9A-9C，左图)。相比之下，阻断配体的参考抗CD137抗体#1驱动大致相同水平的报告体表达，无论存在的CD137L的浓度(例如在不存在CD137L下)和抗体和配体的加入顺序如何(图9A-9C，中间图)。当抗体在配体之前加入时部分/不阻断配体的参考抗CD137抗体#2也驱动类似水平的报告体表达，无论存在的CD137L的浓度(例如在不存在CD137L下)如何(图9A，右图)，但当抗体和配体一同加入(图9B，右图)时或当配体在抗体之前加入时(图9C，右图)显示在较高CD137L浓度下报告体表达显著减少。
6.3具有不同Fc区的抗CD137抗体的表征
本实例分析Fc/Fc受体相互作用对抗CD137抗体BA001的功能活性的影响。具体地说，BA001的VH区与多种Fc骨架，包括IgG2和IgG4，以及其中Fc区包含N297A或S267E/L328F(SELF)突变(根据EU编号系统编号)的IgG1骨架和其中Fc区包含N297A突变的IgG2骨架一起表达。如本领域中已知，IgG1 N297A和IgG2 N297A变体携带了消除FcγR啮合的Fc沉默突变，因此阻断ADCC/ADCP潜能或抗体经由FcγR的交联。IgG1 SELF Fc变体展现减少的FcγRIIIa结合和增强的FcγRIIb结合，因此降低ADCC/ADCP潜能，但增强抗体经由FcγRIIb的交联。在一些情况下，本文所述的抗CD137抗体的重链序列的N端残基是谷氨酰胺。在一些情况下，本文所述的抗CD137抗体的重链序列的N端残基是焦谷氨酸(例如归因于翻译后加工)。
抗体BA001(IgG1)包括包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。抗体BA001 IgG1 N297A(即，BA001的IgG4 N297A变体)包括包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。抗体BA001IgG1 SELF(即，BA001的IgG1 S267E/L328F变体)包括包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。抗体BA001 IgG2(即，BA001的IgG2变体)包括包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。抗体BA001 IgG2 N297A(即，BA001的IgG2N297A变体)包括包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。抗体BA001 IgG4(即，BA001的IgG4变体)包括包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在一些情况下，包括IgG4 Fc区的抗体(例如抗体BA001 IgG4)包括S228P突变，所述突变可能增加重链稳定性。接着如下所述，在功能分析中测试BA001的这些Fc变体。
6.3.1原代人PBMC中的Fc变体功能性
在SEA刺激之后评估上述BA001 Fc变体在原代人类PBMC上的功能活性。简单来说，在37℃下在BA001 Fc变体或对应同型对照抗体的连续稀释液存在下将冷冻保存的PBMC用200ng/ml SEA超抗原(Toxin Technologies，目录号AT101red)刺激5天。通过AlphaLISA(Perkin Elmer，目录号AL221F)分析培养物上清液中的IL-2浓度。测试每个条件，重复五次。
如图10A中所示，BA001 IgG1和BA001 IgG1 SELF各在SEA刺激的原代人PBMC中诱导强烈的IL-2表达，这可以归因于这些变体的抗体交联增强。相比之下，未形成抗体交联的BA001 IgG1 N297A和BA001 IgG2 N297A变体几乎未展现可检测的功能。这些数据表明抗体交联增强BA001对原代人T细胞上的CD137的激动功能。BA001 IgG2和BA001 IgG4也诱导中等水平的IL-2表达。
图10B展示除N297A突变体外的BA001 Fc变体增强SEA刺激的原代人T细胞的IL-2表达具有剂量依赖性活性。BA001 IgG1 SELF和BA001 IgG1诱导最强的作用，接着是BA001IgG4和BA001 IgG2。
6.3.2 Fc变体维持配体依赖性
使用章节2.2中描述的NFκB-荧光素酶报告系统检查BA001 Fc变体的配体依赖性。简单来说，将表达人CD137的Jurkat NFκB-荧光素酶报告细胞(50,000个细胞/孔)与通过章节6.2.3中描述的方法交联的BA001 Fc变体或对应同型对照的连续稀释液一起在可溶性人CD137L(125ng/ml)存在或不存在下在37℃下培育四小时。使用荧光素酶分析系统(Promega目录号N1120)和EnVision板式读取器检测荧光素酶的表达。
如图11中所示，所有BA001 Fc变体均展示配体依赖性CD137激动作用。在CD137L不存在下，测试的任一Fc变体均未检测到报告体活性(图11，左列)，而在CD137L存在下BA001Fc变体都以剂量依赖性方式诱导报告体表达(图11，右列)。在此背景下缺乏交联的Fc变体能够对CD137产生激动作用可能是因为与原代T细胞中的CD137表达水平相比报告细胞表达的CD137的水平高。
6.4组合疗法
6.4.1与抗PD-1抗体组合
进一步评估抗CD137抗体BA001单独或与抗PD-1抗体或抗OX40抗体组合刺激活化T细胞产生细胞因子的能力。在一个实例中，如上所述，在BA001(5μg/ml)和同型对照(10μg/ml)、抗PD-1抗体(10μg/ml)和同型对照(5μg/ml)、BA001(5μg/ml)与抗PD-1抗体(10μg/ml)的组合或单独同型对照(15μg/ml)存在下将冷冻保存的原代人PBMC用SEA刺激。在另一实例中，如上所述，在BA001(5μg/ml)和同型对照(10μg/ml)、抗OX40抗体(10μg/ml)和同型对照(5μg/ml)、BA001(5μg/ml)与抗OX40抗体(10μg/ml)的组合或单独同型对照(15μg/ml)存在下将冷冻保存的原代人PBMC用SEA刺激。通过AlphaLISA(Perkin Elmer，目录号AL221F)分析培养物上清液中的IL-2浓度。测试每个条件，重复六次。
如图12A中所示，BA001与抗PD-1抗体的组合引起IL-2分泌比任一单独抗体大。类似地，如图12B中所示，BA001与抗OX40抗体的组合诱导比任一单独抗体更大的IL-2分泌。
6.5表位定位
通过HDX质谱分析研究人CD137与BA001的Fab片段(BA001-Fab)或BA001的F(ab')2片段(BA001-F(ab')2)的相互作用。这些数据用于鉴别人CD137的胞外结构域上BA001-Fab和BA001-F(ab')2结合的表位区域。
6.5.1通过氢-氘交换(HDX)对抗CD137抗体进行表位定位
使用以下方法评估CD137与抗人CD137 F(ab')2和抗人CD137 Fab的相互作用。
(A)CD137与抗人CD137 F(ab')2的相互作用
将20μL人CD137(5.48μg)或20μL人CD137和BA001-F(ab')2混合物(5.48μg∶22.36μg)与105μL氧化氘标记缓冲液(50mM磷酸钠、100mM氯化钠，pD 7.4)一起在20℃下培育0秒、60秒、300秒、1800秒、7200秒和14400秒。通过加入125μl的4M盐酸胍、0.85M TCEP缓冲液(最终pH值是2.5)并在20℃下培育混合物5分钟来淬灭氢/氘交换。随后，如下所述对淬灭后的样品进行柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化和LC-MS分析。以仅MS模式记录质谱。
(B)CD137与抗人CD137 Fab相互作用
将15μL人CD137(5.0μg)或15μL人CD137和BA001-Fab混合物(5.0μg人CD137+15.0μg Fab)与110μL氧化氘标记缓冲液(50mM磷酸钠、100mM氯化钠，pD 7.4)一起在25℃下培育0秒、60秒、300秒和1800秒。通过加入125μl的4M盐酸胍、0.85M TCEP缓冲液(最终pH值是2.5)并在25℃下培育混合物3分钟来淬灭氢/氘交换。随后，如下所述对淬灭后的样品进行柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化和LC-MS分析。以仅MS模式记录质谱。
HDX数据分析
使用HDX WorkBench软件处理原始MS数据以分析H/D交换MS数据。使用氘化肽与其天然形式(t0)之间的平均质量差计算氘水平。为了计算氘掺入，将给定肽的质谱在提取的离子色谱峰上组合，并计算加权平均m/z。从天然肽的质量(0分钟)至加权平均质量的质量增加对应于氘掺入水平。
胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化和LC-MS
His标记的人CD137(AcroBiosystems Inc.)通过胃蛋白酶/蛋白酶XII消化而碎裂成肽，用于HDX。通过加入125μl的4M盐酸胍、0.85M TCEP缓冲液(最终pH值是2.5)并在20℃下培育混合物5分钟，使125μL对照缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pH 7.4)中的5.48μg人CD137变性。使用内部装填的胃蛋白酶/蛋白酶XIII(w/w，1:1)柱，混合物经受柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化，并使用UPLC-MS系统分析所得肽，所述UPLC-MS系统由Waters AcquityUPLC联合Q ExactiveTM Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪(Thermo)构成。通过用Mascot针对人CD137序列搜索MS/MS数据来鉴别肽。前体和产物离子的质量容差分别是10ppm和0.05Da。
抗人CD137 F(ab')2的表位结合
大部分CD137肽展示在存在和不存在BA001-F(ab')2下一致或类似的氘水平。然而，发现几个肽区段在F(ab')2结合后具有显著降低的氘掺入。本段中的所有残基都根据SEQ ID NO:25编号。由残基125-155(FNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERD，SEQ ID NO:27)组成的一个区域在人CD137结合于BA001-F(ab')2时经历强烈的氘保护。因此，此区域对应于CD137上BA001的表位或其部分。对BA001都强烈结合的人和食蟹猕猴CD137的序列的检查(图1A和1B)揭露上述区中的完整序列一致性(图11)。相比之下，BA001不在任何显著程度上结合于鼠CD137(数据未示)，鼠CD137相对于人CD137在此区域中包括大量氨基酸取代和插入(图14A)。最后，CD137的片段残基26-63(DPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCD，SEQ ID NO:34)亦显示氘保护。不希望受理论所束缚，预期此信号反映了CD137经由PLAD-PLAD相互作用的二聚，这可以通过BA001-F(ab')2的各臂结合于例如两种不同CD137分子之一，从而使CD137分子的PLAD结构域足够靠近以致于允许PLAD-PLAD相互作用来增强。
抗人CD137 Fab的表位结合
大部分CD137肽展示在存在和不存在BA001-Fab下一致或类似的氘水平。然而，发现几个肽区段在BA001-Fab结合后具有显著降低的氘掺入。本段中的所有残基都根据SEQID NO:25编号。由残基125-141(FNDQKRGICRPWTNCSL，SEQ ID NO:26)界定的区域在人CD137结合于BA001-Fab时经历强烈的氘保护。因此，此区域对应于CD137上BA001的表位或其部分。由残基89-98(TPGFHCLGAG，SEQ ID NO:28)和残基107-112(KQGQEL，SEQ ID NO:29)组成的两个其它区域亦展示显著氘保护，因此任选地对应于CD137上BA001的其它表位或其部分。如上所述，对BA001都强烈结合的人和食蟹猕猴CD137的序列的检查(图1A和1B)揭露与SEQ ID NO:26和29对应的区域中的完整序列一致性(图13)。BA001不在任何显著程度上结合于鼠CD137(数据未示)，鼠CD137在这些区域基本上与人CD137不同(图14A)。在与SEQ IDNO:28对应的食蟹猕猴序列的区域中发现四个氨基酸取代(即，T82I、P83S、F85Y和G91E)。在此实验中由残基26-63(SEQ ID NO:34)组成的CD137区域未展现任何氘保护。不希望受理论所束缚，预期个别BA001-Fab片段结合于CD137的单一分子不促进PLAD-PLAD二聚。
6.5.2使用人/小鼠嵌合蛋白的抗CD137抗体的表位定位
使用一系列转染至Jurkat细胞中的鼠转换突变构建体，进一步研究由抗CD137抗体BA001识别的人CD137上的表位，接着可以通过FACS分析。产生Jurkat转换突变体，所述突变体每一个组成性表达在胞外结构域内含有单一突变区域的人CD137，其中人CD137序列的部分转换为来自鼠CD137的对应序列(即，图14A中所示的突变体5014-5018；下表5中提供的序列)。
表5.CD137的人-小鼠融合物构建体序列的胞外结构域
*人CD137序列以纯文字指示。鼠CD137序列加粗。
这些工程化的突变细胞系用于测试抗CD137抗体是否可以结合于特定转换突变体。由此，缺乏结合表明可能的表位位置。细胞结合分析法一般如章节1.1中所述进行。简单来说，在96孔盘中在4℃下使用抗CD137抗体(即，BA001、参考抗CD137抗体#1或参考抗CD137抗体#2)的连续稀释液以5×104个细胞/孔将转染的Jurkat细胞染色25分钟。将细胞洗涤两次并与F(ab')2山羊抗人IgG-PE二级抗体(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)一起培育。接着将细胞洗涤并且悬浮于80μl的在PBS中制备的2％多聚甲醛(ElectronMicroscopy Sciences)中。用BD FACS Canto采集数据并使用BD FACSDiva软件分析。
如图14B中所示，抗体BA001能够结合于表达除突变体5017外的所有鼠转换突变体的Jurkat细胞，其中人CD137中的序列LTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNC(SEQ ID NO:30)被替换为鼠CD137中的对应区。BA001展示的结合模式与参考抗CD137抗体#1和#2展示的结合模式不同(图14B)。参考抗CD137抗体#1展示在较低抗体浓度下最低程度地结合于突变体5017，但在等于或超过10μg/ml的浓度下清楚地检测到结合。另外，与BA001不同，参考抗CD137抗体#1未显示结合于突变体5016。
从鼠转换突变体鉴别的人CD137中的BA001表位基本上与在章节6.5.1中所述的HDX表位定位实验中鉴别的BA001表位重叠。在重叠区域中，具有KRGI的序列(SEQ ID NO:43)的人CD137的四个连续氨基酸残基与在鼠CD137的对应区中发现的NGTGV的序列(SEQ IDNO:44)不同(图15A)。此差异可能造成BA001对鼠CD137缺乏显著亲和力。为了确定KRGI的序列(SEQ ID NO:43)是否是BA001所识别的表位，产生两种包含嵌合CD137胞外结构域的蛋白质∶“4aa人至小鼠”CD137蛋白质是人KRGI序列被替换为NGTGV的CD137胞外结构域；“4aa小鼠至人”CD137蛋白质是NGTGV序列被替换为KRGI的鼠CD137胞外结构域。这些嵌合蛋白进一步包含Gly-Ser连接子和C端6×His标签。胞外结构域的序列提供于表6中。
表6.嵌合CD137蛋白质和其片段的胞外结构域
在表面等离子体共振(SPR)分析中测试上述嵌合CD137蛋白质。简单来说，首先，使用胺偶合试剂盒，将CM5传感器芯片涂上抗人Fab抗体。6μg/ml BA001和参考抗CD137抗体#1以10μl/min的流动速率分别捕捉在流槽2和3上，保持流槽1作为参考。接着完全人CD137蛋白质、“人至小鼠”CD137嵌合蛋白和“小鼠至人”CD137嵌合蛋白在60nM的浓度下以30μl/min独立地流过流槽，历时90秒，接着解离400秒。在缔合期与解离期期间记录传感图。
如图15B中所示，当人CD137的KRGI(SEQ ID NO:43)序列被鼠CD137的NGTGV(SEQID NO:44)序列替换时，嵌合蛋白丧失其结合BA001的能力。相反，当鼠CD137的NGTGV(SEQID NO:44)序列被人CD137的KRGI(SEQ ID NO:43)序列替换时，嵌合蛋白获得结合BA001的能力。这些数据表明KRGI(SEQ ID NO:43)序列代表与结合于BA001有关的人CD137的关键表位区。
相比之下，如图15C中所示，当人CD137的KRGI(SEQ ID NO:43)序列被鼠CD137的NGTGV(SEQ ID NO:44)序列替换时，嵌合蛋白丧失其结合参考抗CD137抗体#1的能力。然而，当鼠CD137的NGTGV(SEQ ID NO:44)序列被人CD137的KRGI(SEQ ID NO:43)序列时，嵌合蛋白未获得结合参考抗CD137抗体#1的能力。这些数据表明KRGI(SEQ ID NO:43)序列尽管是结合参考抗CD137抗体#1所需的，但在鼠CD137环境中并不足够。
6.6抗CD137抗体变体的表征
本实例描述作为BA001抗体变体的抗CD137抗体的表征。这些抗体中的四个抗体的可变区的序列信息提供于表1和表2中。
6.6.1 BA001变体结合于人和食蟹猕猴CD137
通过筛选在BA001的CDRH1、CDRH3和CDRL3中含有氨基酸取代的scFv噬菌体展示文库，产生BA001变体。简单来说，产生包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的BA001的ScFv，进行scFv的诱变，并且通过基于亲和力的选择来富集阳性纯系。鉴别总共347个结合于人CD137的纯系。由347个纯系的氨基酸序列的分析构建的共有CDRH1、CDRH3和CDRL3序列分别阐述于SEQ ID NO:82、83和84中。在347个纯系中，233个具有小于1×10-3s-1的解离速率。由这233个纯系构建的共有CDRH1、CDRH3和CDRL3序列分别阐述于SEQ ID NO:85、86和87中。
进一步表征BA001变体中的四个对CD137的结合亲和力。这四个名为BA049、BA050、BA051和BA052的变体分别包含如表1中提供的SEQ ID NO:69、70、71和72中所述的scFv氨基酸序列。四个变体转化成IgG1格式，并且其重链和轻链序列提供于表1和2中。为测量结合亲和力，使用人CD137、食蟹猕猴CD137、小鼠-人融合物构建体5015(氨基酸残基53-81被替换为人CD137的对应序列的鼠CD137)和小鼠-人融合物构建体5017(氨基酸残基112-140被替换为人CD137的对应序列的鼠CD137)作为抗原，各包含Gly-Ser连接子，接着6×His标签。两种嵌合蛋白的胞外结构域序列(除连接子和6×His标签外)提供于表7中。
表7.嵌合CD137蛋白质的胞外结构域
通过ELISA测量BA001变体(呈IgG1格式)对抗原的亲和力。具体地说，将50μl在1xPBS pH 7.4(GibcoTM，目录号10010056)中稀释的5μg/ml各抗原加入ThermoScientificTM黑色96孔Immuno板(Thermofisher Scientific，目录号437111)中的每个孔中并在4℃下培育隔夜。使用Biotek 405TS微定量板式洗涤器，利用Biostack3微定量板式堆叠器，用PBS洗涤平板三次。通过与300微升/孔的含3％奶粉的PBS(Marvel脱脂奶粉)一起在室温下培育1小时来阻断平板，并且用1x PBS洗涤三次。将在3％M-PBS(1x PBS中奶粉)中滴定的抗体加入平板并在室温下培育1小时。使用平板洗涤器，将平板用含0.1％Tween20的1x PBS(SigmaAldrich，目录号P1379)洗涤三次并用1x PBS洗涤三次。将50μl在3％M-PBS中1:2000稀释的Fcγ片段特异性的Biotin-SP(长间隔子)AffiniPure山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，代码：109-065-098，批号123909)加入每个孔并在室温下培育1小时。使用平板洗涤器，将平板用含0.1％Tween20的1x PBS洗涤三次并用1x PBS洗涤三次。为进行检测，将50μl在分析缓冲液(PerkinElmer，部件号4002-0010，批号646702)中1:500稀释的铕标记抗生蛋白链菌素(PerkinElmer，部件号1244-360，批号2195997)加入每个孔并在室温下培育1小时。使用平板洗涤器，将平板用含0.1％Tween20的1x PBS洗涤三次并用PBS洗涤三次。将50μl强化溶液(PerkinElmer，部件号4001-0010，批号650872)加入每个孔并在室温下在缓缓震荡下培育5分钟。使用Tecan Infinite M1000 Pro板式读取器，在激发340nm和发射615nm下读取荧光。用Tecan iControl软件1.11.1.0版采集数据，并用Graphpad Prism 7.02版分析。
如图16A和16B中所示，四个BA001变体显示结合于人和食蟹猕猴CD137。另外，其结合于小鼠-人融合物构建体5017(“mCD137-人112-139”)(图16C)，但不结合于小鼠-人融合物构建体5015(“mCD137-人53-80”)(图16D)，这表明其结合于在氨基酸残基112-139的区域中的人CD137的表位。这些数据表明这四个变体结合于与BA001相同或类似的表位。
本发明的范围不限于本文所述的特定实施例。实际上，除了所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述和附图中变得显而易见。希望这些修改属于所附权利要求书的范围内。
本文引用的所有参考文献(例如公开或专利或专利申请)以全文引用的方式并出于所有目的并入本文中，并入程度如同每个单独的参考文献(例如公开或专利或专利申请)明确地并且单独地指示出于所有目的以全文引用的方式并入本文中一般。
其它实施例在所附权利要求书内。

Claims (110)

1.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，所述抗体包括包含互补决定区(CDR)CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区(VH)和包含CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区(VL)，其中：
(a)CDRH1包含X1X2X3X4H(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列，其中
X1是G、A、D、E、L、N、Q、R、S或W；
X2是Y、F、H、N、R或S；
X3是Y或H；并且
X4是M、I、T或V；
(b)CDRH2包含WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；
(c)CDRH3包含X1PX2YX3GX4GLX5X6(SEQ ID NO:83)的氨基酸序列，其中
X1是E或G；
X2是G、A、R或S；
X3是Y、F、H或S；
X4是S、A或T；
X5是D或G；并且
X6是Y或H；
(d)CDRL1包含GGDDIGDKRVH(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；
(e)CDRL2包含EDRYRPS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和/或
(f)CDRL3包含QX1WX2X3X4X5X6X7PGV(SEQ ID NO:84)的氨基酸序列，其中
X1是V或I；
X2是D、A、E、G、H、N或Y；
X3是S、A、E、F、L、P、R、T、W或Y；
X4是S、A、L、M或R；
X5是S、A、F、G、L、P、Q、R或T；
X6是D、E、H、V或Y；并且
X7是H或Y。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中：
(a)CDRH1包含X1X2YX3H(SEQ ID NO:85)的氨基酸序列，其中
X1是G、A、D、L、R、S或W；
X2是Y、F、H或N；并且
X3是M或V；
(b)CDRH3包含EPGYX1GX2GLDX3(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中
X1是Y或F；
X2是S或T；并且
X3是Y或H；和/或
(c)CDRL3包含QVWX1X2X3X4X5X6PGV(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列，其中
X1是D、A、E、H、N或Y；
X2是S、A、E、L、R或T；
X3是S、A、L或R；
X4是S、A、F、G、L、P、Q或R；
X5是D、E或V；并且
X6是H或Y。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其中：
(a)CDRH1包含GYYMH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；
(b)CDRH3包含EPGYYGSGLDY(SEQ ID NO:3)或EPGYYGTGLDY(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列；和/或
(c)CDRL3包含QVWDSSSDHPGV(SEQ ID NO:6)、QVWNSSSDHPGV(SEQ ID NO:60)、QVWDSSSDYPGV(SEQ ID NO:61)或QVWYSSPDHPGV(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含以下中所述的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6；1、2、59、4、5和6；1、2、3、4、5和60；1、2、3、4、5和61；或1、2、3、4、5和62。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体包含氨基酸序列与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一的VH。
6.根据权利要求5所述的分离的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:7、63、64或65的氨基酸序列。
7.根据权利要求5或6所述的分离的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
8.根据权利要求6或7所述的分离的抗体，其中X是谷氨酰胺(Q)。
9.根据权利要求6或7所述的分离的抗体，其中X是焦谷氨酸(pE)。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体包含氨基酸序列与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一的VL。
11.根据权利要求10所述的分离的抗体，其中所述VL包含SEQ ID NO:8、66、67或68的氨基酸序列。
12.根据权利要求10或11所述的分离的抗体，其中所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
13.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:7、63、64或65的氨基酸序列的VH。
14.根据权利要求13所述的分离的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
15.根据权利要求13或14所述的分离的抗体，其中X是谷氨酰胺(Q)。
16.根据权利要求13或14所述的分离的抗体，其中X是焦谷氨酸(pE)。
17.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，所述抗体包括包含SEQ ID NO:8、66、67或68的氨基酸序列的VL。
18.根据权利要求17所述的分离的抗体，其中所述VL包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
19.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，所述抗体包括分别包含SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:63和8、SEQ ID NO:64和66、SEQ ID NO:7和67或SEQ ID NO:65和68的氨基酸序列的VH和VL。
20.根据权利要求19所述的分离的抗体，其中所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:7和8的氨基酸序列。
21.根据权利要求19或20所述的分离的抗体，其中SEQ ID NO:7、63、64或65中的X是谷氨酰胺(Q)。
22.根据权利要求19或20所述的分离的抗体，其中SEQ ID NO:7、63、64或65中的X是焦谷氨酸(pE)。
23.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，所述抗体包含具有来源于人IGHV1-2*02胚系序列的氨基酸序列的VH。
24.根据权利要求23所述的分离的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:3或59中所述的氨基酸序列。
25.根据权利要求23或24所述的分离的抗体，其中所述抗体包含具有来源于人IGKV3-21*02胚系序列的氨基酸序列的VL。
26.根据权利要求25所述的分离的抗体，其中所述VL包含SEQ ID NO:6、60、61或62中所述的氨基酸序列。
27.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，所述抗体包含具有来源于人IGLV3-21*02胚系序列的氨基酸序列的VL。
28.根据权利要求27所述的分离的抗体，其中所述VL包含SEQ ID NO:6、60、61或62中所述的氨基酸序列。
29.根据权利要求1至28中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体包含选自由人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2组成的群组的重链恒定区。
30.根据权利要求29所述的分离的抗体，其中所述抗体包含IgG1重链恒定区。
31.根据权利要求30所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链恒定区。
32.根据权利要求30所述的分离的抗体，其中所述IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号系统编号的N297A突变。
33.根据权利要求32所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链恒定区。
34.根据权利要求30所述的分离的抗体，其中所述IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号系统编号的S267E和L328F突变。
35.根据权利要求34所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链恒定区。
36.根据权利要求29所述的分离的抗体，其中所述抗体包含IgG2重链恒定区。
37.根据权利要求36所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链恒定区。
38.根据权利要求36所述的分离的抗体，其中所述IgG2重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号系统编号的N297A突变。
39.根据权利要求37所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链恒定区。
40.根据权利要求29所述的分离的抗体，其中所述抗体包含IgG4重链恒定区。
41.根据权利要求40所述的分离的抗体，其中所述IgG4重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号系统编号的S228P突变。
42.根据权利要求41所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链恒定区。
43.根据权利要求1至29中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体包含作为野生型重链恒定区的变体的重链恒定区，其中所述变异重链恒定区以比所述野生型重链恒定区结合于FcγR的亲和力高的亲和力结合于所述FcγR。
44.根据权利要求43所述的分离的抗体，其中所述FcγR是FcγRIIB。
45.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体包括包含SEQID NO:22的氨基酸序列的轻链恒定区。
46.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，所述抗体包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:9-14、49-54和73-78组成的群组的氨基酸序列的重链；和/或
(b)包含选自由SEQ ID NO:21和79-81组成的群组的氨基酸序列的轻链。
47.根据权利要求46所述的分离的抗体，其中所述重链和所述轻链分别包含SEQ IDNO:9和21、SEQ ID NO:10和21、SEQ ID NO:11和21、SEQ ID NO:12和21、SEQ ID NO:13和21、SEQ ID NO:14和21、SEQ ID NO:49和21、SEQ ID NO:50和21、SEQ ID NO:51和21、SEQ IDNO:52和21、SEQ ID NO:53和21、SEQ ID NO:54和21、SEQ ID NO:73和21、SEQ ID NO:74和21、SEQ ID NO:75和79、SEQ ID NO:76和79、SEQ ID NO:9和80、SEQ ID NO:49和80、SEQ IDNO:77和81或SEQ ID NO:78和81的氨基酸序列。
48.根据权利要求47所述的分离的抗体，其中所述重链和所述轻链分别由SEQ ID NO:9和21、SEQ ID NO:10和21、SEQ ID NO:11和21、SEQ ID NO:12和21、SEQ ID NO:13和21、SEQID NO:14和21、SEQ ID NO:49和21、SEQ ID NO:50和21、SEQ ID NO:51和21、SEQ ID NO:52和21、SEQ ID NO:53和21、SEQ ID NO:54和21、SEQ ID NO:73和21、SEQ ID NO:74和21、SEQID NO:75和79、SEQ ID NO:76和79、SEQ ID NO:9和80、SEQ ID NO:49和80、SEQ ID NO:77和81或SEQ ID NO:78和81的氨基酸序列组成。
49.根据权利要求47所述的分离的抗体，其中所述重链和所述轻链分别包含SEQ IDNO:9和21或SEQ ID NO:49和21的氨基酸序列。
50.根据权利要求49所述的分离的抗体，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:9和21或SEQ ID NO:49和21的氨基酸序列组成。
51.根据权利要求46至50中任一权利要求所述的分离的抗体，其中X是谷氨酰胺(Q)。
52.根据权利要求46至50中任一权利要求所述的分离的抗体，其中X是焦谷氨酸(pE)。
53.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，其中所述抗体与所述CD137的结合使所述CD137与第二人CD137分子之间二聚的水平相对于在缺乏所述抗体下所述二聚的水平增加。
54.根据权利要求53所述的分离的抗体，其中所述抗体与所述CD137的结合使所述两个CD137分子的PLAD结构域之间的成对结合水平相对于在缺乏所述抗体下所述两个CD137分子的PLAD结构域之间的成对结合水平增加。
55.根据权利要求53所述的分离的抗体，其中所述抗体与所述CD137的结合使所述CD137分子的第一区域与所述第二人CD137分子的第二区域之间的成对结合水平相对于在缺乏所述抗体下所述第一区域与所述第二区域之间的成对结合水平增加，其中所述第一区域和/或所述第二区域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
56.根据权利要求53至55中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体是多价抗体并能够同时结合于CD137的两个或更多个分子。
57.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中：
(a)所述抗体基本上不抑制人CD137与人CD137L的结合；
(b)所述抗体基本上不抑制人CD137的可溶性片段与人CD137L的可溶性片段的结合；
(c)所述抗体基本上不抑制表达CD137的细胞与人CD137L的可溶性片段的结合；和/或
(d)所述抗体基本上不抑制表达CD137的细胞与表达CD137L的细胞的结合。
58.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体对人CD137具有激动作用。
59.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体增加或促进人CD137的活性。
60.根据权利要求59所述的分离的抗体，其中所述抗体增加或促进人CD137的活性的能力取决于所述抗体的交联。
61.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，其中所述抗体增加或促进人CD137的活性，并且所述抗体增加或促进人CD137的活性的能力取决于所述抗体的交联。
62.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体在缺乏交联下基本上不增加或促进人CD137的活性。
63.根据权利要求60至62中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体增加或促进人CD137的活性的能力取决于CD137L的存在。
64.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，其中所述抗体增加或促进人CD137的活性，并且所述抗体增加或促进人CD137的活性的能力取决于CD137L的存在。
65.根据权利要求63或64所述的分离的抗体，其中所述抗体增加或促进人CD137的活性的能力与CD137L的浓度正相关。
66.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体在缺乏CD137L下基本上不增加或促进人CD137的活性。
67.根据权利要求59至66中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述人CD137的活性包含活化表达所述人CD137的T细胞。
68.根据权利要求59至67中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述人CD137的活性包含诱导经葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的外周血单核细胞(PBMC)产生IL-2。
69.根据权利要求59至68中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述人CD137的活性包含活化表达所述人CD137的自然杀伤(NK)细胞。
70.根据权利要求59至69中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述人CD137的活性包含活化表达CD137L的抗原呈递细胞(APC)。
71.根据权利要求59至70中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体增加或促进人CD137的活性的能力是所述CD137L的浓度的基本上递增函数。
72.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体结合于与包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL的抗体相同的人CD137的表位。
73.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，其中所述抗体结合于与包括包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL的抗体相同的人CD137的表位。
74.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体结合于位于人CD137的CRD4结构域内的表位。
75.根据权利要求74所述的分离的抗体，其中人CD137的所述CRD4结构域包含SEQ IDNO:42中所述的氨基酸序列。
76.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体结合于位于由SEQ ID NO:26-31和43中的任一个的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。
77.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，其中所述抗体结合于位于由SEQ ID NO:26-31和43中的任一个的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。
78.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体结合于位于由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。
79.根据权利要求78所述的分离的抗体，其中所述抗体基本上不结合于包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列的蛋白质。
80.根据权利要求79所述的分离的抗体，其中所述抗体特异性结合于包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的蛋白质。
81.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体包含VH和VL，其中：
(a)包含所述VH和所述VL各两个的F(ab')2结合于位于由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位；和/或
(b)包含所述VH和所述VL的Fab结合于位于由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位，并且任选地，位于由SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列组成的人CD137的区域内的表位。
82.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体包含VH和VL，其中：
(a)如通过氢/氘交换分析法所测量，包含所述VH和所述VL各两个的F(ab')2使由SEQ IDNO:34的氨基酸序列组成的CD137的区域中氢与氘的交换相对于在缺乏所述F(ab')2下相同区域中氢与氘的交换显著减少；以及
(b)如通过氢/氘交换分析法所测量，包含所述VH和所述VL的Fab不使由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的CD137的区域中氢与氘的交换相对于在缺乏所述Fab下相同区域中氢与氘的交换显著减少。
83.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中：
(a)所述抗体特异性结合于包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的蛋白质；并且
(b)所述抗体不特异性结合于包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。
84.一种特异性结合于人CD137的分离的抗体，其中：
(a)所述抗体特异性结合于包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的蛋白质；并且
(b)所述抗体不特异性结合于包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。
85.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体是人类抗体。
86.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。
87.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体缀合于细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、毒素、放射性核素或可检测标记。
88.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离的抗体，其中所述抗体缀合于第二抗体。
89.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至88中任一权利要求所述的抗体的VH和/或VL或重链和/或轻链。
90.一种载体，其包含根据权利要求89所述的多核苷酸。
91.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求89所述的多核苷酸或根据权利要求89所述的载体。
92.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至88中任一权利要求所述的抗体、根据权利要求89所述的多核苷酸、根据权利要求90所述的载体或根据权利要求91所述的宿主细胞；和药学上可接受的载体或赋形剂。
93.一种产生特异性结合于人CD137的抗体的方法，所述方法包含在使所述多核苷酸表达并产生所述抗体的合适条件下培养根据权利要求91所述的宿主细胞。
94.一种增加受试者中的免疫反应的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至88中任一权利要求所述的抗体、根据权利要求89所述的多核苷酸、根据权利要求90所述的载体、根据权利要求91所述的宿主细胞或根据权利要求92所述的药物组合物。
95.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至88中任一权利要求所述的抗体、根据权利要求89所述的多核苷酸、根据权利要求90所述的载体、根据权利要求91所述的宿主细胞或根据权利要求92所述的药物组合物。
96.根据权利要求94或95所述的方法，其中所述抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物全身性施用。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物静脉内施用。
98.根据权利要求94或95所述的方法，其中所述抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物皮下、瘤内施用或递送至肿瘤引流淋巴结。
99.根据权利要求94至98中任一权利要求所述的方法，其进一步包含向所述受试者施用额外治疗剂。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述额外治疗剂是化疗剂。
101.根据权利要求99所述的方法，其中所述额外治疗剂是检查点靶向剂。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述检查点靶向剂选自由以下组成的群组：拮抗剂抗PD-1抗体、拮抗剂抗PD-L1抗体、拮抗剂抗PD-L2抗体、拮抗剂抗CTLA-4抗体、拮抗剂抗TIM-3抗体、拮抗剂抗LAG-3抗体、拮抗剂抗VISTA抗体、拮抗剂抗CD96抗体、拮抗剂抗CEACAM1抗体、拮抗剂抗TIGIT抗体、激动剂抗GITR抗体和激动剂抗OX40抗体。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述额外治疗剂是抗PD-1抗体，任选地其中所述抗PD-1抗体是派姆单抗或纳武单抗。
104.根据权利要求99所述的方法，其中所述额外治疗剂是吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述抑制剂选自由艾卡哚司他、F001287、吲哚莫德和NLG919组成的群组。
106.根据权利要求99所述的方法，其中所述额外治疗剂是疫苗。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述疫苗包括包含热休克蛋白与抗原肽复合的热休克蛋白肽复合物(HSPPC)。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述热休克蛋白是hsc70并与肿瘤相关抗原肽复合。
109.根据权利要求107所述的方法，其中所述热休克蛋白是gp96蛋白并与肿瘤相关抗原肽复合，其中所述HSPPC来源于从受试者获得的肿瘤。
110.一种治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至88中任一权利要求所述的抗体、根据权利要求89所述的多核苷酸、根据权利要求90所述的载体、根据权利要求91所述的宿主细胞或根据权利要求92所述的药物组合物。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021170067A1 (zh) * 2020-02-28 2021-09-02 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗cd137构建体及其用途
WO2021226883A1 (en) * 2020-05-13 2021-11-18 Adagene Ag Compositions and methods for treating cancer submission of sequence listing on ascii text file
US11242395B2 (en) 2017-08-21 2022-02-08 Adagene Inc. Anti-CD137 molecules and use thereof
US11359016B2 (en) 2018-02-02 2022-06-14 Adagene Inc. Anti-CTLA4 antibodies and methods of making and using the same
WO2023098785A1 (zh) * 2021-12-01 2023-06-08 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗4-1bb抗体及其用途

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2019012223A (es) 2017-04-13 2019-12-09 Agenus Inc Anticuerpos anti-cd137 y metodos de uso de los mismos.
CA3069438A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Compass Therapeutics Llc Agonist antibodies that bind human cd137 and uses thereof
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
WO2019100052A2 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
US20200109195A1 (en) 2018-05-21 2020-04-09 Compass Therapeutics Llc Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by nk cells
US20220064314A1 (en) * 2019-01-02 2022-03-03 Qlsf Biotherapeutics Inc. Cd137 agonist antibodies and uses thereof
US20200407440A1 (en) 2019-04-24 2020-12-31 Magenta Therapeutics, Inc. Amatoxin antibody-drug conjugates and uses thereof
SG11202113221RA (en) * 2019-06-05 2021-12-30 Adagene Pte Ltd Anti-cd137l antibodies and methods of using same
JP2023106636A (ja) * 2020-05-22 2023-08-02 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 ヒト抗破傷風毒素抗体
CN113621065B (zh) * 2021-08-30 2023-08-01 武汉海沙百得生物技术有限公司 靶向4-1bb的全人源抗体及其制备方法和应用
WO2024040195A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104126009A (zh) * 2011-10-07 2014-10-29 国立大学法人三重大学 嵌合抗原受体
WO2016134358A1 (en) * 2015-02-22 2016-08-25 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind cd137
US20170081409A1 (en) * 2015-09-01 2017-03-23 Agenus Inc. Anti-pd-1 antibodies and methods of use thereof

Family Cites Families (225)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
EP1997891A1 (en) 1988-09-02 2008-12-03 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5585112A (en) 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
IT1246382B (it) 1990-04-17 1994-11-18 Eurand Int Metodo per la cessione mirata e controllata di farmaci nell'intestino e particolarmente nel colon
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
US5543390A (en) 1990-11-01 1996-08-06 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
WO1992018619A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
JPH07503124A (ja) 1991-06-14 1995-04-06 ゾーマ・コーポレーション 微生物によって生産される抗体断片とそれらの複合体
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
ATE249840T1 (de) 1991-12-13 2003-10-15 Xoma Corp Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9206422D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
US6010715A (en) 1992-04-01 2000-01-04 Bertek, Inc. Transdermal patch incorporating a polymer film incorporated with an active agent
US6024975A (en) 1992-04-08 2000-02-15 Americare International Diagnostics, Inc. Method of transdermally administering high molecular weight drugs with a polymer skin enhancer
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
DE69334258D1 (de) 1992-08-21 2009-02-26 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne Leichtkette
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
ES2156149T3 (es) 1992-12-04 2001-06-16 Medical Res Council Proteinas de union multivalente y multiespecificas, su fabricacion y su uso.
US6274552B1 (en) 1993-03-18 2001-08-14 Cytimmune Sciences, Inc. Composition and method for delivery of biologically-active factors
US5523092A (en) 1993-04-14 1996-06-04 Emory University Device for local drug delivery and methods for using the same
US5985307A (en) 1993-04-14 1999-11-16 Emory University Device and method for non-occlusive localized drug delivery
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US6004534A (en) 1993-07-23 1999-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Targeted polymerized liposomes for improved drug delivery
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5997873A (en) 1994-01-13 1999-12-07 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Method of preparation of heat shock protein 70-peptide complexes
DK0744958T3 (da) 1994-01-31 2003-10-20 Univ Boston Polyklonale antistofbiblioteker
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5759542A (en) 1994-08-05 1998-06-02 New England Deaconess Hospital Corporation Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular and other diseases
US5660854A (en) 1994-11-28 1997-08-26 Haynes; Duncan H Drug releasing surgical implant or dressing material
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5983134A (en) 1995-04-23 1999-11-09 Electromagnetic Bracing Systems Inc. Electrophoretic cuff apparatus drug delivery system
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US6316652B1 (en) 1995-06-06 2001-11-13 Kosta Steliou Drug mitochondrial targeting agents
US6167301A (en) 1995-08-29 2000-12-26 Flower; Ronald J. Iontophoretic drug delivery device having high-efficiency DC-to-DC energy conversion circuit
US5935576A (en) 1995-09-13 1999-08-10 Fordham University Compositions and methods for the treatment and prevention of neoplastic diseases using heat shock proteins complexed with exogenous antigens
GB9601081D0 (en) 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
AU6873396A (en) 1995-10-16 1997-05-07 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6039975A (en) 1995-10-17 2000-03-21 Hoffman-La Roche Inc. Colon targeted delivery system
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
TW345603B (en) 1996-05-29 1998-11-21 Gmundner Fertigteile Gmbh A noise control device for tracks
US6027947A (en) 1996-08-20 2000-02-22 Ramtron International Corporation Partially or completely encapsulated top electrode of a ferroelectric capacitor
US5985317A (en) 1996-09-06 1999-11-16 Theratech, Inc. Pressure sensitive adhesive matrix patches for transdermal delivery of salts of pharmaceutical agents
NZ334914A (en) 1996-10-01 2000-09-29 Stanford Res Inst Int Taste-masked microcapsule compositions and methods of manufacture using a phase seperation-coacervation technique
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
CA2268340A1 (en) 1996-10-11 1998-04-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods and compositions for immunomodulation
US6131570A (en) 1998-06-30 2000-10-17 Aradigm Corporation Temperature controlling device for aerosol drug delivery
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
DK0942968T3 (da) 1996-12-03 2008-06-23 Amgen Fremont Inc Fuldt humane antistoffer, der binder EGFR
US6017540A (en) 1997-02-07 2000-01-25 Fordham University Prevention and treatment of primary and metastatic neoplastic diseases and infectious diseases with heat shock/stress protein-peptide complexes
US5860957A (en) 1997-02-07 1999-01-19 Sarcos, Inc. Multipathway electronically-controlled drug delivery system
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6120751A (en) 1997-03-21 2000-09-19 Imarx Pharmaceutical Corp. Charged lipids and uses for the same
AU742045B2 (en) 1997-04-14 2001-12-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Novel method for the production of anti-human antigen receptors and uses thereof
US6060082A (en) 1997-04-18 2000-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5948433A (en) 1997-08-21 1999-09-07 Bertek, Inc. Transdermal patch
CA2302522C (en) 1997-08-29 2010-08-17 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising the adjuvant qs-21 and polysorbate or cyclodextrin as excipient
CN1152673C (zh) 1997-10-28 2004-06-09 坂东化学株式会社 皮肤贴附药片及其基片的制造方法
US5948646A (en) 1997-12-11 1999-09-07 Fordham University Methods for preparation of vaccines against cancer comprising heat shock protein-peptide complexes
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6048736A (en) 1998-04-29 2000-04-11 Kosak; Kenneth M. Cyclodextrin polymers for carrying and releasing drugs
DK1104306T3 (da) 1998-08-10 2006-05-22 Antigenics Inc Præparater af CpG- og saponinadjuvanser og fremgangsmåder til anvendelse deraf
FR2784997A1 (fr) 1998-10-22 2000-04-28 Transgene Sa Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6271359B1 (en) 1999-04-14 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
US6256533B1 (en) 1999-06-09 2001-07-03 The Procter & Gamble Company Apparatus and method for using an intracutaneous microneedle array
EP2360254A1 (en) 1999-08-23 2011-08-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Assays for screening anti-pd-1 antibodies and uses thereof
PT1233987E (pt) 1999-11-29 2009-12-28 Bac Ip B V Imobilização de moléculas de ligação ao antigénio de um domínio
EP1234031B2 (en) 1999-11-30 2021-11-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h1, a novel immunoregulatory molecule
EP1125905A1 (en) 2000-02-16 2001-08-22 Pepscan Systems B.V. Segment synthesis
US6261595B1 (en) 2000-02-29 2001-07-17 Zars, Inc. Transdermal drug patch with attached pocket for controlled heating device
EP1197755A1 (en) 2000-10-11 2002-04-17 Pepscan Systems B.V. Identification of protein binding sites
US7658921B2 (en) 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
CA2431600C (en) 2000-12-12 2012-04-17 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
JP2004537032A (ja) 2001-02-16 2004-12-09 ペプスキャン　システムズ　ベー．フェー． ピクセルアレイ
EP1539233B1 (en) 2001-07-12 2011-04-27 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
EP1434596B1 (en) 2001-10-09 2009-07-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Enhancement of immune responses by agonist 4-1bb-antibodies
CA2466279A1 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Agents that modulate immune cell activation and methods of use thereof
US20040014194A1 (en) 2002-03-27 2004-01-22 Schering Corporation Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
ATE481985T1 (de) 2002-07-03 2010-10-15 Ono Pharmaceutical Co Immunpotenzierende zusammensetzungen
JP2006500921A (ja) 2002-07-30 2006-01-12 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー ヒト４−１ｂｂに対するヒト化抗体
AU2003288675B2 (en) 2002-12-23 2010-07-22 Medimmune Limited Antibodies against PD-1 and uses therefor
EP1578419A4 (en) 2002-12-30 2008-11-12 3M Innovative Properties Co IMMUNOSTIMULATING COMBINATIONS
US9068234B2 (en) 2003-01-21 2015-06-30 Ptc Therapeutics, Inc. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating gene expression
US20050042664A1 (en) 2003-08-22 2005-02-24 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
US20090304679A1 (en) 2004-05-27 2009-12-10 Weidanz Jon A Antibodies as T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
PT2161336E (pt) 2005-05-09 2013-10-03 Ono Pharmaceutical Co Anticorpos monoclonais humanos para morte programada 1 (pd-1) e métodos de tratamento do cancro utilizando anticorpos anti- pd-1 sozinhos ou em combinação com outros agentes imunoterapêuticos¿
KR100694508B1 (ko) 2005-05-24 2007-03-13 울산대학교 산학협력단 Ｈｂｂｋ４항체를 포함하는 암 질환 치료용 약학조성물및 이를 이용한 암의 면역치료 방법
KR101607288B1 (ko) 2005-07-01 2016-04-05 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
US8268635B2 (en) 2006-05-19 2012-09-18 Antonio Ferrante Methods of identifying agents that selectively activate p38 and/or NKkB signaling
ES2616355T3 (es) 2007-06-18 2017-06-12 Merck Sharp & Dohme B.V. Anticuerpos para el receptor humano de muerte programada PD-1
AU2008275589B2 (en) 2007-07-12 2013-11-21 Gitr, Inc. Combination therapies employing GITR binding molecules
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
EP2242773B1 (en) 2008-02-11 2017-06-14 Cure Tech Ltd. Monoclonal antibodies for tumor treatment
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
PT2824100T (pt) 2008-07-08 2018-05-10 Incyte Holdings Corp 1,2,5-oxadiazoles como inibidores da indoleamina 2,3-dioxigenase
EP2350129B1 (en) 2008-08-25 2015-06-10 Amplimmune, Inc. Compositions of pd-1 antagonists and methods of use
US8927697B2 (en) 2008-09-12 2015-01-06 Isis Innovation Limited PD-1 specific antibodies and uses thereof
SI2342226T1 (sl) 2008-09-26 2016-11-30 Dana-Farber Cancer Institute Inc. Humana protitelesa proti PD-1, PD-L1 in PD-L2 in njihove uporabe
WO2010042433A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of cd137 antibody and ctla-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
EP3929216A1 (en) 2008-12-09 2021-12-29 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
TWI507525B (zh) 2009-06-26 2015-11-11 Regeneron Pharma 具天然免疫球蛋白形式之易分離的雙專一性抗體
NO2504364T3 (zh) 2009-11-24 2018-01-06
US9005619B2 (en) 2009-12-07 2015-04-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for enhancing anti-tumor antibody therapy
US20130202623A1 (en) 2010-02-16 2013-08-08 Nicolas Chomont Pd-1 modulation and uses thereof for modulating hiv replication
US8993731B2 (en) 2010-03-11 2015-03-31 Ucb Biopharma Sprl PD-1 antibody
MY177065A (en) 2010-09-09 2020-09-03 Pfizer 4-1bb binding molecules
WO2012129520A1 (en) 2011-03-24 2012-09-27 Texas Tech University System Tcr mimic antibodies as vascular targeting tools
JP6082997B2 (ja) 2011-04-01 2017-02-22 メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センター Ｈｌａ−ａ２により提示されるｗｔ１ペプチドへのｔ細胞受容体様抗体
US20140178368A1 (en) 2011-04-19 2014-06-26 Leslie Lynne SHARP Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
JP6072771B2 (ja) 2011-04-20 2017-02-01 メディミューン，エルエルシー Ｂ７−ｈ１およびｐｄ−１に結合する抗体およびその他の分子
JP6141831B2 (ja) 2011-05-21 2017-06-07 マクロジェニクス，インコーポレーテッド ヒト及び非ヒトｃｄ３に結合可能なｃｄ３結合分子
WO2012177788A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Modulators of 4-1bb and immune responses
EP2723381A4 (en) 2011-06-21 2015-03-18 Univ Johns Hopkins FOCUSED RADIATION FOR THE REINFORCEMENT OF IMMUNE TREATMENTS AGAINST NEOPLASMS
LT2734551T (lt) 2011-07-24 2018-04-10 Cure Tech Ltd. Humanizuotų imunomoduliuojančių monokloninių antikūnų variantai
US8920075B2 (en) 2011-09-01 2014-12-30 Halo Maritime Defense Systems, Inc. Marine barrier and gate
PT2785375T (pt) 2011-11-28 2020-10-29 Merck Patent Gmbh Anticorpos anti-pd-l1 e usos destes
EP2817619B1 (en) 2012-02-23 2018-07-25 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Prediction of responsiveness to treatment with immunomodulatory therapeutics and method of monitoring abscopal effects during such treatment
CN104736168B (zh) 2012-05-31 2018-09-21 索伦托治疗有限公司 与pd-l1结合的抗原结合蛋白
SG11201408646VA (en) 2012-07-06 2015-01-29 Genmab Bv Dimeric protein with triple mutations
CN104936982B (zh) 2012-08-03 2020-04-24 丹娜法伯癌症研究院 抗-pd-l1和pd-l2双结合抗体单一试剂及其使用方法
JP6461800B2 (ja) 2012-10-04 2019-01-30 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド ヒトモノクローナル抗ｐｄ−ｌ１抗体および使用方法
AR093984A1 (es) 2012-12-21 2015-07-01 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos que se unen a ligando 1 de muerte programada (pd-l1) humano
WO2014128245A1 (en) 2013-02-21 2014-08-28 CORAL, Sandra Dna hypomethylating agents for cancer therapy
US20160002342A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-07 Xinghang Ma Anti-prolactin receptor antibody formulations
CN105339389B (zh) 2013-05-02 2021-04-27 安奈普泰斯生物有限公司 针对程序性死亡-1(pd-1)的抗体
JP6563906B2 (ja) 2013-05-31 2019-08-21 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｐｄ−１に結合する抗原結合蛋白質
US20160145355A1 (en) 2013-06-24 2016-05-26 Biomed Valley Discoveries, Inc. Bispecific antibodies
CN104250302B (zh) 2013-06-26 2017-11-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd‑1抗体及其应用
WO2015036394A1 (en) 2013-09-10 2015-03-19 Medimmune Limited Antibodies against pd-1 and uses thereof
CN112457403B (zh) 2013-09-13 2022-11-29 广州百济神州生物制药有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
CN104558177B (zh) 2013-10-25 2020-02-18 苏州思坦维生物技术股份有限公司 拮抗抑制程序性死亡受体pd-1与其配体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
CA2926856A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Anti-pd-l1 monoclonal antibodies and fragments thereof
SI3081576T1 (sl) 2013-12-12 2019-12-31 Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd., Protitelo PD-1, njegov antigen-vezavni fragment in njegova medicinska uporaba
HUE057917T2 (hu) 2014-01-15 2022-06-28 Kadmon Corp Llc Immunmodulátor szerek
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
US10899840B2 (en) 2014-02-04 2021-01-26 Pfizer Inc. Combination of a PD-1 antagonist and a 4-1BB agonist for treating cancer
RS62038B1 (sr) 2014-02-10 2021-07-30 Merck Patent Gmbh Ciljana tgf beta inhibicija
MX2016011832A (es) 2014-03-12 2017-05-12 Yeda Res & Dev Reduccion de los niveles o la actividad de las células t reguladoras sistémicas para el tratamiento de enfermedad y lesión del sistema nervioso central (snc).
US20150307620A1 (en) 2014-04-16 2015-10-29 University Of Connecticut Linked immunotherapeutic agonists that costimulate multiple pathways
DK3149042T3 (da) 2014-05-29 2019-11-04 Spring Bioscience Corp PD-L1-antistoffer og anvendelser deraf
WO2015195163A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 R-Pharm Overseas, Inc. Pd-l1 antagonist fully human antibody
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
TWI726608B (zh) 2014-07-03 2021-05-01 英屬開曼群島商百濟神州有限公司 抗pd-l1抗體及其作為治療及診斷之用途
CN105330740B (zh) 2014-07-30 2018-08-17 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗pd-1抗体及其应用
EP3177644B1 (en) 2014-08-05 2020-10-07 Mabquest SA Immunological reagents binding to pd-1
EP3183269A2 (en) 2014-08-22 2017-06-28 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of cancer using a combination of an anti-pd-1 antibody and an anti-cd137 antibody
CN106794245B (zh) 2014-08-29 2021-06-01 豪夫迈·罗氏有限公司 肿瘤靶向性il-2变体免疫细胞因子和针对人pd-l1的抗体的组合疗法
MX2017012131A (es) 2015-03-25 2018-06-15 Univ Michigan Regents Composiciones y métodos para la administración de agentes de biomacromoléculas.
IL293135A (en) 2015-05-13 2022-07-01 Agenus Inc A preparation containing at least two different complexes of purified stress protein linked to an antigenic peptide
WO2016185016A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides
US10875926B2 (en) 2015-09-22 2020-12-29 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Fully human antibody against human CD 137
PE20240096A1 (es) 2015-10-02 2024-01-18 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos especificos para un receptor de tnf coestimulador
GB201519481D0 (en) 2015-11-04 2015-12-16 Cancer Rec Tech Ltd Immunomodulatory antibodies
RU2022106508A (ru) 2016-01-11 2022-04-05 Инхибркс, Инк. Поливалентные и полиспецифические ох40-связывающие слитые белки
KR20180096789A (ko) 2016-01-11 2018-08-29 인히브릭스, 인크. 다가 및 다중특이적 41bb-결합 융합 단백질
EP3192805A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 Humanitas Mirasole S.p.A. Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof
US20190031765A1 (en) 2016-01-25 2019-01-31 Pfizer Inc. Combination of an ox40 agonist and a 4-1bb agonist monoclonal antibody for treating cancer
US11104739B2 (en) 2016-04-14 2021-08-31 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy using an anti-fucosyl-GM1 antibody and an anti-CD137 antibody
DK3445788T3 (en) 2016-04-22 2022-04-11 Alligator Bioscience Ab Novel bispecific polypeptides against cd137
EP3452107A4 (en) 2016-05-05 2020-04-15 The Trustees of The University of Pennsylvania DNA MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST CHECKPOINT MOLECULES
US10875921B2 (en) 2016-05-27 2020-12-29 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-4-1BB antibodies and their uses
CN109475600A (zh) 2016-06-17 2019-03-15 瓦里安医疗系统公司 免疫调节剂与辐射治疗组合
AU2017299608A1 (en) 2016-07-20 2019-02-07 Igm Biosciences, Inc. Multimeric CD137/4-1BB binding molecules and uses thereof
GB201613167D0 (en) 2016-07-29 2016-09-14 Univ Southampton Cancer and b-cell related disease therapy
WO2018045110A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2018056821A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Merus N.V. Binding molecules that modulate a biological activity expressed by a cell
GB201619648D0 (en) 2016-11-21 2017-01-04 Alligator Bioscience Ab Novel antibodies and uses thereof
EP3544628A4 (en) 2016-11-23 2020-11-18 Immunoah Therapeutics, Inc. 4-1BB BINDING PROTEINS AND THEIR USES
CA3047059A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Novel tnfr agonists and uses thereof
MX2019007795A (es) 2017-01-03 2019-08-16 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno biespecificas que comprenden el clon 20h4.9 anti-4-1bb.
US10174122B2 (en) 2017-01-06 2019-01-08 Eutilex Co., Ltd. Anti-human 4-1BB antibodies and uses thereof
CN110740748A (zh) 2017-01-17 2020-01-31 芝加哥大学 肿瘤微环境中功能障碍的抗原特异性cd8+t细胞
MA47612A (fr) 2017-02-24 2020-01-01 Macrogenics Inc Molécules de liaison bispécifiques capables de se lier à cd137 et à des antigènes tumoraux, et leurs utilisations
MX2019012223A (es) 2017-04-13 2019-12-09 Agenus Inc Anticuerpos anti-cd137 y metodos de uso de los mismos.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104126009A (zh) * 2011-10-07 2014-10-29 国立大学法人三重大学 嵌合抗原受体
WO2016134358A1 (en) * 2015-02-22 2016-08-25 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind cd137
US20160244528A1 (en) * 2015-02-22 2016-08-25 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind cd137
US20170081409A1 (en) * 2015-09-01 2017-03-23 Agenus Inc. Anti-pd-1 antibodies and methods of use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEI LIN等: "Fc-dependent expression of CD137 on human NK cells: insights into "agonistic" effects of anti-CD137 monoclonal antibodies", 《BLOOD》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11242395B2 (en) 2017-08-21 2022-02-08 Adagene Inc. Anti-CD137 molecules and use thereof
US11859003B2 (en) 2017-08-21 2024-01-02 Adagene Inc. Method for treating cancer using anti-CD137 antibody
US11359016B2 (en) 2018-02-02 2022-06-14 Adagene Inc. Anti-CTLA4 antibodies and methods of making and using the same
WO2021170067A1 (zh) * 2020-02-28 2021-09-02 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗cd137构建体及其用途
WO2021226883A1 (en) * 2020-05-13 2021-11-18 Adagene Ag Compositions and methods for treating cancer submission of sequence listing on ascii text file
WO2023098785A1 (zh) * 2021-12-01 2023-06-08 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗4-1bb抗体及其用途

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Publication number Publication date
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