ES2202351T3

ES2202351T3 - Sistema de expresion de anticuerpos por recombinacion homologa para celulas murinas.

Info

Publication number: ES2202351T3
Application number: ES95903890T
Authority: ES
Inventors: Gregory Franklin Hollis; George E. Mark
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2014-12-22
Also published as: ATE244311T1; FI962268A; GB2299336A; DK0731845T3; EP0731845A1; FI119698B; FI962268A0; US20030124648A1; AU691857B2; WO1995017516A1; HU9601467D0; CZ185996A3; US6743622B2; CZ289308B6; CA2177959A1; JP3654446B2; HUT74844A; AU1278695A; CA2177959C; EP0731845B1

Abstract

SE IDENTIFICA UN LOCUS ESPECIFICO EN EL GENOMA DE UNA CELULA HUESPED DE MURINA QUE CAUSA ALTOS NIVELES DE EXPRESION DE GEN RECOMBINANTE QUE SIGUEN A LA INTEGRACION ESTABLE, POR RECOMBINACION HOMOLOGA, DEL GEN RECOMBINANTE DENTRO DEL LOCUS CROMOSOMAL ESPECIFICO. SE PRESENTA LA SELECCION DE UN LOCUS DE GENOMA FAVORABLE PARA LA INSERCION Y EXPRESION DE UN GEN RECOMBINANTE, COMO SON LOS VECTORES DE ADN Y LAS CELULAS HUESPEDES.

Description

Sistema de expresión de anticuerpos por recombinación homóloga para células murinas.

Antecedentes

Las construcciones de expresiones recombinantes se usan rutinariamente para generar líneas celulares de mamíferos estables que expresan una proteína recombinante deseada. Estas construcciones de expresiones recombinantes pueden ser de un tipo que se mantenga como plásmido extracromosómico en una célula huésped transfectada, o bien de un tipo que se integre en el genoma del huésped. Las células huésped de mamíferos que contienen copias establemente integradas de genes recombinantes son normalmente más seguras en lo que respecta al mantenimiento e integridad del gen recombinante. Una vez que se ha identificado una célula huésped de mamífero que produce la proteína recombinante, las copias integradas del gen recombinante pueden ser más deseables para las copias extracromosómicas del mismo.

Sin embargo, la frecuencia de líneas celulares que contienen copias integradas de forma estable de un gen recombinante que expresa una proteína recombinante deseada a elevados niveles es bastante baja. Normalmente, debe examinarse un elevado número de células de mamíferos transfectadas de forma estable para identificar clones que expresen altos niveles de la proteína recombinante. Está ampliamente aceptada la creencia de que esto se debe a los efectos del lugar de inserción del gen recombinante en el genoma del mamífero. Debido al tamaño del genoma del mamífero, resulta altamente improbable que un suceso de integración aleatoria produzca una inserción del gen recombinante en un lugar favorable a elevados niveles de expresión del gen.

Un aumento en la frecuencia de líneas celulares que expresen altos niveles de genes recombinantes proporcionaría una agrupación mucho mayor de altos expresores donde elegir en la posterior selección como el productor de proteína recombinante. Además, el aumento en la frecuencia reduciría el número de líneas celulares estables que sería necesario generar para identificar expresores de altos niveles de proteína recombinante.

Sumario de la descripción

Esta invención describe un método para definir una posición específica en el genoma del mamífero que favorezca altos niveles de expresión de genes recombinantes, y un método eficaz para aumentar la frecuencia de altos expresores dirigiendo la construcción de la expresión hacia una posición favorable en el genoma.

También se describe el funcionamiento del método de esta invención para establecer una línea celular estable que exprese altos niveles de una proteína recombinante. Además, la invención muestra que la línea celular generada usando esta invención expresa proteínas recombinantes a niveles extremadamente altos, que superan con frecuencia a las mejores líneas celulares expresoras producidas mediante integración aleatoria de la construcción de la expresión en el genoma de mamífero.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 - Se muestra un diagrama esquemático del plásmido p9014.

Figura 2 - Se muestra el sitio de inserción de p9014 en el cromosoma de ratón.

Figura 3 - Paneles A, B y C - El panel A muestra un diagrama del plásmido pIgG2A de expresión del anticuerpo de recombinación homóloga; el panel B muestra un diagrama del evento de recombinación homóloga para la inserción del plásmido de expresión del anticuerpo en el cromosoma; y el panel C muestra la porción del cromosoma que contiene el plásmido de expresión del anticuerpo homólogamente recombinado.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para lograr altos niveles de expresión de genes recombinantes en células de mamíferos. Los altos niveles de expresión de genes recombinantes en el método de la presente invención resultan de la integración posicionalmente dirigida de genes recombinantes en el genoma de la célula huésped. El punto de integración se preselecciona, y el evento de integración se logra a través de la recombinación homóloga de un vector de ADN que contiene secuencias específicas de ADN que se sabe que son homólogas con un sitio específico dentro del genoma del huésped. El sitio específico dentro del genoma del huésped se selecciona para la inserción del gen recombinante basándose en la determinación de que este sitio es altamente activo respecto a la transcripción del gen e integra fácilmente segmentos de ADN homólogos.

Las células de mamífero susceptibles de ser utilizadas en el método de la presente invención incluyen, pero no se restringen a las células NS/O, que son las células más preferidas.

Las células NS/O [Galfre,G. y Milstein, C. Methods in Enzymology (1981) 73B:3-46.] se cultivan en suspensión a 37ºC aproximadamente en, por ejemplo, medio esencial mínimo modificado por Dulbecco (Hazelton Research Products) con aproximadamente un 10% de suero de ternero fetal. (HyClone; sueros definidos sin endotoxinas
detectables) o medio de Dulbecco modificado por Iscove (JRH Biosciences) con aproximadamente un 9% de suero equino. Las células se cultivan en botellas rotativas, matraces de suspensión de 46 litros Wheaton turbolift (Wheaton), o fermentadores de 75, 200 ó 300 litros con recogidas semanales de aproximadamente 1-2 x 10^{6} células/ml (3-4 duplicaciones/semana). los medios utilizados en los fermentadores o matraces de suspensión pueden contener alrededor de 0,1-0,3% de pluronic F68 para reducir el esfuerzo de cizalladura sobre las células. Normalmente, las células no se cultivan durante más de 3-4 meses después del cultivo inicial.

Los extractos exentos de células se preparan a partir de células NSO y mediante ruptura de las células por cavitación de nitrógeno, lisis hipotónica o similares. Las células se recogen mediante centrifugación y pueden lavarse en una solución tamponante isotónica tal como solución salina tamponada con fosfato, pH aproximadamente 7,4. La lisis hipotónica se realiza lavando las células en aproximadamente 10 volúmenes de tampón hipotónico (KCl aproximadamente 10 mM, HEPES aproximadamente 20 mM, pH aproximadamente 7,4, MgCl_{2} aproximadamente 1,5 mM, EGTA aproximadamente 0,1 mM) o (HEPES aproximadamente 25 mM, pH aproximadamente 7,5, MgCl_{2} aproximadamente 5 mM, y EGTA 1mM) y recogiéndolas mediante centrifugación. El tampón de lisis puede contener, así mismo, un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT). El tampón hipotónico contendrá generalmente inhibidores de proteasa tales como PMSF, leupeptina y pepstatina. Las células se suspenden de nuevo en aproximadamente 3 volúmenes de tampón hipotónico, se ponen sobre hielo durante alrededor 20 min. y se someten a lisis mediante unos 20 golpes en un homogeneizador Dounce. La ruptura de aproximadamente el 90 a aproximadamente el 95% de las células se obtiene en un homogeneizador aforado Dounce de 100 o 300 ml usando aproximadamente 25 o aproximadamente 15 golpes, respectivamente. La ruptura por presión de nitrógeno también tiene lugar en un tampón hipotónico. Las células suspendidas de nuevo se colocan en una celda de presión de nitrógeno a 28 kg/cm^{2} de nitrógeno durante aproximadamente 30 min. a aproximadamente 4ºC y con agitación. La ruptura se realiza bajando la presión y evacuando las células de la celda de presión. El lisado celular se clarifica mediante etapas sucesivas de centrifugación; a aproximadamente 400 hasta aproximadamente 1000 x g (sobrenadante S1), a aproximadamente 30.000 x g (sobrenadante S2) y a aproximadamente 300.000 x g (sobrenadante S3). El lisado celular puede también clarificarse mediante el siguiente procedimiento. Las células no rotas y los núcleos se separan mediante centrifugación a aproximadamente 3.000 rpm, durante aproximadamente 10 minutos, a aproximadamente 5ºC en una centrífuga Beckman GPR. El fluido sobrenadante post nuclear se centrifuga durante aproximadamente 20 minutos y aproximadamente 16.000 rpm en una centrifuga Sorval con un rotor SS34. El fluido sobrenadante se clarifica posteriormente mediante centrifugación durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 50.000 rpm en una centrífuga Beckman (rotor 50.2 Ti) o 45.000 rpm (rotor 45 Ti). El fluido sobrenadante resultante se almacena a aproximadamente -80ºC tras añadirle DTT aproximadamente 2 mM y un 0,1% de CHAPS.

Se pueden usar varios procedimientos para la clonación molecular de ADNc. Estos métodos incluyen, pero no se limitan, a la expresión funcional directa del gen recombinante tras la construcción de un banco de ADNc en un sistema de vector de expresión apropiado. Otro método es seleccionar un banco de ADNc construido en un bacteriófago o vector lanzadera de plásmido con una sonda de oligonucleótido marcada y diseñada a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína deseada.

La preparación de bancos de ADNc se puede llevar a cabo mediante técnicas estándar bien conocidas. Las técnicas conocidas para la construcción de bancos de ADNc se pueden encontrar, por ejemplo, en Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1982). Resulta fácilmente evidente para los expertos en la técnica que el ADN que codifica la proteína deseada puede también aislarse a partir de un banco de ADN genómico adecuado.

La construcción de bancos de ADN genómico puede llevarse a cabo mediante técnicas normalizadas bien conocidas. Estas técnicas bien conocidas para la construcción de bancos de ADN genómico pueden encontrarse en Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. en Molecular Cloning: A Laboratory Manuel (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1982).

Para clonar un gen recombinante mediante el método preferido, puede ser necesaria la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada si la secuencia de ADN no está disponible. Para lograr esto, la proteína deseada puede purificarse y determinar secuencias parciales de aminoácidos mediante secuenciadores automáticos. No es necesario determinar la secuencia completa de aminoácidos, sino tan solo la secuencia lineal de una o más regiones de aproximadamente 6 a 8 aminoácidos determinada por la amplificación por PCR de un fragmento parcial de ADN.

Una vez que se han identificado las secuencias de aminoácidos adecuadas, se sintetizan las secuencias de ADN susceptibles de codificarlas. Debido a que el código genético está degenerado, debe utilizarse más de un codón para codificar un aminoácido particular y, por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede codificarse por uno cualquiera de un conjunto de oligonucleótidos de ADN similares. Sólo un miembro del conjunto será idéntico a la secuencia de ADN, pero será capaz de hibridarse con el ADN incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con desemparejamientos. Los oligonucleótidos de ADN desemparejados pueden todavía hibridarse suficientemente con el ADN para permitir la identificación y el aislamiento del ADN que codifica la proteína deseada.

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Tal como se han utilizado aquí, todas las designaciones de aminoácidos de una y tres letras corresponden a las designaciones normalizadas en la técnica, y que se relacionan en la siguiente lista:

Alanina	Ala	A	Leucina	Leu	L
Arginina	Arg	R	Lisina	Lys	K
Asparagina	Asn	N	Metiotina	Met	M
Ácido aspártico	Asp	D	Fenilalanina	Phe	F
Cisteína	Cys	C	Prolina	Pro	P
Ácido glutámico	Glu	E	Serina	Ser	S
Glutamina	Gln	Q	Treonina	Thr	T
Glicina	Gly	G	Triptófano	Trp	W
Histidina	His	H	Tirosina	Tyr	Y
Isoleucina	Ile	I	Valina	Val	V

El ADN clonado que se ha obtenido a través de los métodos descritos anteriormente puede expresarse de modo recombinante por clonación molecular en un vector de expresión que contenga un promotor adecuado, así como otros elementos apropiados para la regulación de la transcripción, y puede transferirse a células huésped procariotas o eucariotas para producir una proteína recombinante. Las técnicas para estas manipulaciones están descritas por completo en Maniatis, T, et al., supra, y son bien conocidas en la técnica.

Los vectores de expresión se definen aquí como secuencias de ADN que son necesarias para la transcripción de copias clonadas de genes y para la traducción de su ARNms a un huésped apropiado. Estos vectores pueden utilizarse para expresar genes eucarióticos en diversos huéspedes tales como bacterias, algas cianofíceas, células vegetales, células de insectos y células animales.

Los vectores específicamente diseñados permiten el transporte de ADN entre huéspedes tales como bacterias-levadura o bacterias-células animales. Un vector de expresión construido adecuadamente debería contener: un origen de replicación para la replicación autónoma en células huésped, marcadores seleccionables, un número limitado de sitios de restricción enzimática útiles, un alto número potencial de copias y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige a la ARN polimerasa a unirse al ADN e iniciar la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es aquel que produce una alta frecuencia de iniciación de ARNms. Los vectores de expresión pueden incluir, sin que esto signifique una restricción, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos específicamente diseñados o virus.

Pueden utilizarse diversos vectores de expresión de mamíferos para expresar proteínas recombinantes en células de mamíferos. Los vectores de expresión de mamíferos disponibles comercialmente, que pueden ser adecuados para la expresión de proteínas recombinantes, incluyen, sin que esto signifique una restricción, pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBOpSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) e IZD35 (ATCC 37565).

El ADN que codifica la proteína deseada puede clonarse en un vector de expresión para expresarse en una célula huésped recombinante. Células huésped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, incluyendo, sin que esto signifique una restricción, bacterias, levaduras, células de mamífero incluidas, sin que esto signifique una restricción, líneas de células de origen humano, bovino, porcino, de mono y de roedor, y células de insectos incluidas, sin que esto signifique una restricción, las líneas celulares derivadas de la Drosophila. Las líneas celulares derivadas de especies de mamíferos, que son adecuadas y se encuentran disponibles comercialmente, incluyen, aunque no se restringen a CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ACC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CCL 171).

El vector de expresión puede introducirse en la célula huésped mediante diversas técnicas incluidas, sin que esto signifique una restricción, las de transformación, transfección, fusión de protoplastos y electroporación. Las células que contienen el vector de expresión se propagan por clonación y se analizan individualmente para determinar si producen la proteína recombinante. La identificación de los clones de la célula huésped que expresan la proteína recombinante puede hacerse por diversos medios incluidos, sin que esto signifique una restricción, la reactividad inmunológica con anticuerpos, y la presencia de actividad recombinante de proteínas asociada a las células huésped.

Tras la expresión de la proteína recombinante en una célula huésped recombinante, la proteína puede recuperarse para obtenerla en forma purificada. Hay diversos procedimientos de purificación disponibles que son adecuados. La proteína recombinante puede purificarse a partir de lisados y extractos celulares, o a partir de medios de cultivo acondicionados, mediante la aplicación combinada o individual de fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de adsorción de hidroxilapatito y cromatografía de interacción hidrofóba.

Además, las proteínas recombinantes pueden separarse de otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad hecha con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para la proteína recombinante. Los anticuerpos se preparan siguiendo métodos bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos monoespecíficos se purifican a partir de antisueros de mamífero que contienen anticuerpos reactivos contra la proteína recombinante o se preparan como anticuerpos monoclonales reactivos con la proteína recombinante haciendo uso de la técnica de Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975). El anticuerpo monoespecífico utilizado aquí se define como una especie de anticuerpo simple o múltiple con características de unión homogénea a la proteína recombinante. La unión homogénea usada aquí se refiere a la capacidad de la especie de anticuerpo de unirse a un antígeno o epítopo específico, tales como los que están asociados a la proteína recombinante, tal como se describió anteriormente. Los anticuerpos específicos se consiguen mediante la inmunización de animales tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras, caballos y similares, siendo los conejos los más preferidos, con una concentración apropiada de la proteína recombinante que puede contener o no un coadyuvante inmune.

Los siguiente procedimientos se prefieren para preparar secuencias de ADN recombinante que incorporen las regiones variables del anticuerpo, cadenas ligeras y cadenas pesadas obtenidas de líneas celulares humanas tipo B, combinadas con regiones humanas constantes. Estos ADNs recombinantes pueden utilizarse para transfectar células de mamífero para la expresión de un anticuerpo humano recombinante que mantiene la especificidad antigénica del anticuerpo derivado de la célula tipo B del donante humano. Preferiblemente las inmunoglobulinas recombinantes serán reconocidas como proteínas propias cuando se administren con fines terapéuticos. Se extrae todo el ARN de los heterohibridomas humanos, por ejemplo las células de heterohibridoma humano descritas, utilizando métodos normalizados, por ejemplo que implican la solubilización celular con isotiocianato de guanidinio (Chirgwin et al., Biochem. 18: 5294-5299 [1979[).

Resulta claro para los expertos en la técnica que las células productoras de anticuerpos son adecuadas para la preparación de moléculas de ADN recombinante que codifican una parte o toda la molécula del anticuerpo. Tales células productoras de anticuerpo incluyen, sin que esto signifique una restricción, las descritas en el Catálogo ATCC de Líneas Celulares e Hibridomas, 7ª edición, 1992. Cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina que codifican ADN están descritas y los datos de la secuencia disponibles para dominios variables de anticuerpos humanos están compilados por Kabat et al., "Sequences of Proteins o Immunological Interest", 4ª Ed., Bethesda, Maryland: National Institutes of Healh, 1987, actualizaciones de esta base de datos, y otras bases de datos de los Estados Unidos o extranjeras accesibles (tanto para secuencias de ácidos nucleicos como de proteínas).

Se construyó un plásmido de expresión p9014 [Palladino et al., 1993, Biotechniques, 14, págs. 754-755] mediante métodos normalizados de clonación de ADN, que contiene las unidades de transcripción de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglubulina derivadas de los promotores tempranos inmediatos del citomegalovirus humano y que utiliza la unidad de transcripción de la glutamina-sintetasa como un marcador selectivo (figura 1). Se generó una línea celular mediante electroporación de un p9014 linearizado con SalI en la línea celular NS/0 de plasmacitoma de ratón, y selección de integrantes estables mediante cultivo en medios exentos de glutamina [DeMartino et. al. Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 1991 4:829-835 y Singer et. al. Journal of Immunology 1993 150:2844-2857]. De entre los clones generados, se seleccionó el D12 para su estudio posterior y mostró expresar niveles excepcionalmente elevados de anticuerpos recombinantes (>15 pg/célula/día). La elevada productividad específica de este clon sugiere que el vector p9014 se había insertado en el genoma del ratón en un sitio privilegiado para su expresión. Como fase inicial para la caracterización del sitio de integración de p9014 en estas células, se aisló el ADN genómico del D12, se digirió con Xba I y se sondeó con un fragmento de la región constante kappa de la inmunoglubulina humana. Bajo estrictas condiciones, este fragmento sólo se hibridará con el gen transfectado y, dado que se encuentra cerca del sitio Sal I utilizado para linearizar el plásmido, identificará el fragmento de restricción que contiene la unión de ADN genómico plásmido/ratón. Este ensayo indentificó una banda de 3,3 kb en el ADN genómico de D12 que representaba una copia de p9014 integrado. Estos resultados sugieren que el elevado nivel de expresión observado en el clon D12 se derivan de una copia simple de p9014 que se insertó para producir un fragmento de unión Xba I de 3,3 kb.

Para caracterizar este sitio de inserción, se hicieron todos los bancos del ADN genómico de D12 y se examinaron placas de bacteriófago recombinante con la sonda de la región constante kappa de la inmunoglobulina humana y una sonda de plásmido de la otra cara del sitio Sal I utilizado para linearizar el plásmido original antes de la transfección. Se aislaron y subclonaron en un plásmido los clones de bacteriófago recombinante que contenían fragmentos de la unión del ADN genómico de ratón/p9014, de ambas caras del sitio de inserción. El análisis de la secuencia del ADN genómico de ratón en la posición de integración demostró que el vector p9014 se había insertado en el lugar de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón. La inserción generó una duplicación de 1,8 kilobases (kb) del gen de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón, iniciando 48 pares de bases (p.b.) más arriba del exón 2 de la membrana y extendiéndose hacia abajo de la señal de adición de poli A. En la unión 3' de ADN genómico de plásmido/ratón, se presentaron 36 p.b. de ADN que no se derivaban ni del vector transfectado ni del lugar de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón. En esta unión, se habían suprimido 32 p.b. de la secuencia de plásmido. El examen de la unión 5' reveló que 791 p.b. de la secuencia del vector se habían suprimido en el proceso de inserción y que estaban presentes 16 p.b. de ADN no identificado (figura 2).

La línea celular original utilizada para la transfección, NS/O, es una célula B plenamente diferenciada, un tipo de célula que normalmente expresa niveles extremadamente altos de ARN inmunoglubulina desde el lugar de la cadena pesada de Ig. La observación del p9014 insertado en este lugar demuestra que el promotor CMV-IEp puede expresarse a altos niveles en esta posición cromosómica. Esos resultados muestran que el uso de la recombinación homóloga para insertar vectores de expresión de ADN recombinante en este lugar de inmunoglubulina puede fomentar altos niveles de expresión de otras proteínas recombinantes en esta línea celular.

Para evaluar este enfoque se generó una construcción de expresión que contenía la línea germinal del gen de la 2A gamma inmunoglubulina de ratón como una secuencia de recombinación homóloga dirigida. Se hizo un banco de ADN genómico de bacteriófago NS/O, rastreado con una sonda de la región 3' no traducida de M2 del gen de IgG2A de ratón y varios clones purificados mostraron contener la línea germinal completa del gen IgG2A de ratón. De uno de estos bacteriófagos se subclonó un fragmento genómico BamHI de 5,1 kb que incluía toda la región codificadora de la 2A gamma Ig de ratón, excepto la mayor parte 5' del exón CHl. Se insertó un sitio Sal I de restricción en el punto natural de ocurrencia Stu I, presente a 39 p.b. más arriba de la membrana del exón 2, para proporcionar un punto único de linearización dentro de la secuencia de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón. Este fragmento clonado se utilizó para generar un vector de expresión complejo que contenía: 1) genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada, transcritos de un promotor temprano inmediato de CMV humano; 2) un gen de glutamina-sintetasa para utilizarlo como marcador selectivo; 3) secuencias de vector de plásmido; y 4) el fragmento BamHI de 5,1 kb del lugar de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón (Figura 3A) [Yamawaki-Kataoka, Y. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1982 79:2623-2627; Hall, B. et. al. Molecular Immunology 1989 26:819-826, Yamawaki-Kataoka, Y. et. al. Nucleic Acid Research 1981 9:1365-1381; Bebbington, C.R. et. al. Biotechnology 1992 10:169-175]. Este tipo de vector de inserción de recombinación homóloga se ha diseñado para optimizar los eventos de integración en los que el lugar de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón, que está contenida en el vector, pueda recombinarse con el lugar de la 2A inmunoglobulina de ratón endógeno, originando una inserción directa y definida del vector de expresión (Figura 3B). Se espera que la inserción de este vector vía recombinación homóloga en cualquier lugar dentro de la posición de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón traerá como resultado la expresión de altos niveles del ADN codificador del anticuerpo recombinante.

Las células NS/O se transfectaron por electroporación con la construcción del vector de inmunoglobulina linearizado con SAlI y se extendieron en placas de microtitulación de 96 pocillos. 147 pocillos fueron positivos al cultivo celular bajo condiciones de medio GS selectivas. Las líneas celulares estables, que habían integrado la construcción de inmunoglobulina en el lugar de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón endógeno por recombinación homóloga, expresaban altos niveles del anticuerpo recombinante. Para rastrear rápidamente los clones que eran potenciales recombinantes homólogos, se empleó un ELISA como primer paso rápido en el rastreo de pocillos que expresaran elevados niveles del anticuerpo recombinante. El ELISA hecho con los sobrenadantes de todos los 147 pocillos, identificó 20 pocillos que expresaban altos niveles del anticuerpo. Las células de estos 20 pocillos se expandieron y volvieron a ensayar en lo relativo a la expresión del anticuerpo. Las células derivadas de 12 de los 20 pocillos continuaron expresando altos niveles de anticuerpo. Estas 12 líneas celulares formaban la agrupación de clones que se habían insertado el plásmido de inmunoglobulina pIgG2A en un cromosoma.

Se desarrolló un ensayo de manchas de Southern genómico para identificar clones estables en los que el vector transfectado se hubiera integrado en el lugar de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón. Se escaneó un gran número de enzimas de restricción para identificar una enzima adecuada para detectar recombinantes homólogos. La HpaI da una banda de línea germinal a 15 kb cuando se digiere, marca y analiza ADN genómico de NS/O con una sonda de 2A gamma inmunoglobulina de ratón del lado 3' del lugar. Por el contrario, si el vector de inmunoglobulina se ha insertado en la posición IgG2A por recombinación homóloga, un fragmento Hpa I de 10 kb se hará presente en la mancha. (Figura 3C).

El análisis Southern de las 12 líneas celulares de alta expresión demostró que 9 de estas líneas celulares tenían una banda 10 kb compatible con la inserción por recombinación homóloga de la construcción en la posición IgG2A de ratón. (Tabla 1). Se confirmó que estos 9 clones eran recombinantes homólogos mediante un ensayo de manchas de Southern adicional utilizando una sonda de hibridación exclusiva para el vector de expresión de la inmunoglobulina. Este resultado indica que la recombinación homóloga en la posición de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón tiene lugar con una frecuencia extremadamente alta. El 75% de los clones de alta expresión y el 6% del número total de líneas celulares estables fueron recombinantes homólogos.

TABLA 1

Clon Nº	Recombinante homólogo	Producción específica
		pg/célula/día
13	Sí	24,40
16	Sí	16,50
10	Sí	21.80
28	No	18,3
42		21,50
6	Sí	28,10
22	No	43,10
41		33,60
58	Sí	14,00
60	Sí	36,40
69	Sí	40,70
88	No	32,50

Se examinó el nivel de la productividad de proteína recombinante de los 12 clones de alta expresión. Se separó, a intervalos de 24, 48 y 72 horas, el medio de cultivo celular de las células, extendido en placa en una densidad conocida, y se llevaron a cabo ensayos de Poros para determinar la cantidad de anticuerpo recombinante producido por célula y día. Estas células producen niveles extremadamente altos de anticuerpo recombinante que oscilan entre los 14 y los 43 pg/célula/día. Este nivel de productividad era igual o superior a la cantidad de anticuerpo recombinante producido por la línea celular D12 original.

Para determinar si la variación al triple en la productividad específica de anticuerpo recombinante en estas células es debida a diferencias en los niveles de ARN o a variaciones clonales, se extendieron en placa las líneas celulares seleccionadas y se midió la productividad específica y se aisló el ARN de la misma agrupación celular original. Se llevó a cabo un análisis Northern del ARN aislado usando genes de cadena ligera y pesada de la región constante de la inmunoglobulina como sondas de hibridación. Se normalizó en expresión de beta actina de ratón la cantidad de ARN cargado por línea y se cuantificó la fuerza de la señal de hibridación. Los resultados de este experimento indican que la cantidad de ARN es relativamente constante entre líneas celulares. Esto sugiere que la variación en la expresión del anticuerpo en estas células es debida a factores celulares y no principalmente causada por diferentes niveles de ARN.

Los Ejemplos que siguen se exponen como ilustrativos de la presente invención, sin que ello suponga una limitación al alcance de la misma.

Ejemplo 1 Construcción de bancos

Se generó una línea celular por electroporación de un p9014 linearizado en Sal I [Palladino et al., 1993, Biotechniques, 14, págs. 754-755] en la línea celular NS/O de plasmacitoma de ratón y seleccionando integrantes estables mediante cultivo en medio exento de glutamina [DeMartino et al. Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 1991 4:829-835 y Singer et. al. Journal of Immunology 1993 150:2744-2857]. De entre los clones generados, la línea celular D12 mostró expresar niveles excepcionalmente altos de anticuerpo recombinante (>15 pg/célula/día). La alta productividad específica de este clon sugiere que el vector de p9014 se había insertado en el genoma de ratón en un lugar privilegiado para la expresión. Para clonar la unión plásmido/ADN genómico 5', se construyó un banco genómico usando el sistema de clonación Lambda-Gem 11 Xho I Half Site Arms (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico de D12 se digirió parcialmente con Mbo I (Boehringer-Mannheim). Las placas positivas se identificaron utilizando dos sondas diferentes: 1) fragmento Xmn I/Pst del gen de resistencia a la ampicilina (354 pb) y 2) un fragmento a 300 pb del exón 7 del gen de la glutamina-sintetasa de hamster.

Para clonar la unión plásmido/ADN genómico 3', se construyó una biblioteca genómica utilizando el kit de clonación Lambda/Zap II/Gigapack II Gold (Stratagene). Tanto el vector como el ADN genómico de D12 se digirieron completamente con Xba I (Boehringer-Mannheim), los productos se ligaron (kit de ligación, Stratagene), y empaquetaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las placas positivas se identificaron usando como sonda el gen humano de la región constante kappa. El ADN del fago se aisló utilizando LambdaSorb (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los insertos de fagos se subclonaron en el vector pSP72 (Promega). El ADN del plásmido de bacterias se aisló utilizando el método de lisis alcalina normalizado. Los insertos se secuenciaron utilizando el método de terminación de cadena didesoxi de Sanger.

Ejemplo 2 Aislamiento del gen de la IgG2A de la línea germinal de ratón a partir de células NS/O

Se insertó un digerido parcial MboI de ADN aislado de la línea celular NS/O de plasmacitoma de ratón en el vector Lambda Gem-11 de Promega y se rastrearon 1,8 x 10^{6} placas independientes con una sonda (Bg1II-BstX1) derivada de la región 3' no traducida de la IgG2A M2. Se purificaron en placa catorce bacteriófagos positivos y se prepararon lisados a gran escala. El bacteriófago recombinante se caracterizó mediante cartografía de restricción e hibridación Southern y se identificó un clon que englobaba toda la región codificante del gen de la 2A gamma Ig de ratón. Un fragmento BamHI de 5,1 kb que contenía toda la región codificante de la IgG2A (excepto la mayor parte 5' del exón CH1), exones de membrana y la región 3 no traducida se escindió y se clonó en la posición BamHI de una forma modificada de Bluescript (Stratagene) en la que se había destruido la posición SalI del sitio multiclonal.

Ejemplo 3 Construcción del plásmido dirigido a IgG2A

El plásmido que contenía 5,1 kb del gen IgG2A de ratón se digirió parcialmente con StuI y el plásmido linearizado se purificó sobre gel. Se introdujo un sitio SalI único en el fragmento de la IgG2A mediante ligación des enlazador y se seleccionó un subclón que contenía el sitio SalI añadido a 39 pb más arriba del exón M2 de la IgG2A. El inserto modificado de la IgG2A a 5,1 kb se escindió mediante digestión con BamHI, se enromó con T4 ADN polimerasa, y se clonó en un sitio SalI del vector de expresión Ig enromado de manera similar. El plásmido dirigido de la pIgG2A final se linearizó para su electroporación mediante digestión con SalI. Un mapa del plásmido dirigido final se muestra en la figura 3.

Ejemplo 4 Electroporaciones

Se cultivaron células NS/O en medio de Dulbecco modificado por Iscove (Sigma), suplementado con un 10% de suero de ternero fetal y glutamina 4 mM. Se mezclaron 10 millones de células con 25 \mug de pIgG2A linearizado en un volumen de 800 \mul de solución salina tamponada con fosfato y se electroporaron utilizando un pulsador de genes Bio-Rad (1,5 kV; 3 \muF; distancia de electrodos, 0,4 cm). Las células transfectadas se cultivaron en medio de Iscove con un 10% de FCS y glutamina 1 mM para los clones GS seleccionados. 24 horas más tarde se añadió a los pocillos un medio selectivo (medio de Iscove con selección GS, exento de glutamina, 10% de FCS dializado, nucleósidos 1X, asparagina 1X). 147 pocillos fueron positivos respecto al cultivo celular y se ensayaron mediante ELISA.

Ejemplo 5 ELISA

Mediante ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) se consiguió el rastreo de clones para la producción de anticuerpos recombinantes. Los sobrenadantes de cultivos clonales se diluyeron 1:10 y 1:100 en BSA y PBS al 1%. Las muestras se añadieron a placas de microtitulación de 96 pocillos. (Immulon 2, Dynatech Laboratories, Inc.) cubiertas con anticuerpo monoclonal de ratón para la cadena lambda ligera humana (Zymed) y se incubaron a 37ºC durante una hora. Se añadió entonces el anticuerpo monoclonal de ratón anti IgG1 humano conjugado con peroxidasa de rábano picante (Zymed) y se incubó durante una hora a 37ºC. Se lavó la placa tres veces con PBS tras cada incubación. Se visualizó la detección del anticuerpo ligado añadiendo el substrato ABTS (ácido 2,2-azino-di(3-etilbentotiazolina)sulfónico) (Zymed). Se permitió el desarrollo de color durante veinte minutos a temperatura ambiente. La absorbancia se midió a 415 nm (Lector de Microplas BioRad 3550) y la concentración de anticuerpo se calculó utilizando el programa de análisis de datos Microplate Manager (BioRad). Se generó una curva patrón utilizando una serie de diluciones al doble del anticuerpo recombinante.

Ejemplo 6 Identificación de recombinantes homólogos mediante manchas Southern

El ADN genómico de los clones se aisló bien por el método de la proteinasa K/SDS o bien por un método rápido del hidrocloruro de guanidina (Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. en Molecular Cloning: A Laboratory Manuel (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1982)).

Para identificar recombinantes homólogos, 10 \mug de ADN genómico de clones de elevada expresión, así como clones de control no productores, se digirieron completamente con Hpa I, se hicieron pasar por un gel de agarosa al 0,8% y se transfirieron a nitrocelulosa mediante el método Southern (Southern, E. J. Mol. Biol. 1975 98:503). Las manchas se hibridaron con dos sondas diferentes, 1) un fragmento de Xba I a aproximadamente 3,5 kb más abajo del lugar de la IgG2a de ratón, y 2) un fragmento SalI/BamHI (276 pb) de la cadena principal de plásmido. Las sondas de ADN para hibridación se marcaron mediante translación por cortes (Rigby, P.J J. Molec. Biol. 1977 113:237-251). Se identificaron veinte pocillos que expresaban altos niveles de anticuerpo. Rastreando de nuevo tras la expansión clonal, 12 de los 20 pocillos continuaron produciendo altos niveles del anticuerpo, recombinando todos ellos homólogamente el vector de expresión en el ADN genómico.

Ejemplo 7 Productividad específica

La productividad específica de los clones se determinó extendiendo en placa las células a una densidad de 3 x 105 células/pocillo por triplicado, en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Se recogió el medio de un pocillo a las 24 horas, del segundo pocillo a las 48 y del tercero a las 72 horas. En cada recogida se realizó el recuento de células. La concentración en anticuerpos del medio se analizó utilizando una columna POROS de afinidad A a proteínas. La productividad específica, expresada en picogramos/célula/día, se calculó utilizando el programa Kalaidagraph. Los niveles de producción de anticuerpo alcanzaron valores de entre aproximadamente 14 y aproximadamente 43 pg/célula/día.

Ejemplo 8 Análisis de ARN

En cada línea celular, 10^{8} células se lavaron tres veces con 1X PBS, se lisaron en isotiocianato de guanidina 4M y se rompieron utilizando un homogeneizador de tejidos. El lisado se extendió sobre un colchón de CsCl 5,7 M y se centrifugó toda la noche en un rotor SW28 a 20.000 rpm y 20ºC. Se recuperó el ARN disolviendo el sedimento en dH_{2}O seguido de una precipitación en etanol. La concentración de ARN se determinó leyendo la densidad óptica a una longitud de onda de 260 nm.

10 \mug del total de ARN de cada línea celular se hicieron pasar por un gel de formaldehído/agarosa en un tampón de 1X MOPS durante tres horas a 180 V y luego se transfirieron a papel de nitrocelulosa, esencialmente como está descrito (Chirgwin et. al. Biochem. 18:5294-5299 [1979])

Las manchas de ARN se hibridaron con las siguientes sondas de ADN de ratón marcadas a 32p: a.) fragmento EcoR1-Xho1 a 2 kb que contiene la región constante de la IgG1 humana; b.) fragmento EcoR1-Xba1 a 600 pb que contiene la región constante de la Iglambda C2 humana; c.) fragmento EcoR1-BamHI a 1200 pb del gen beta-actina de ratón que se generó a través de la amplificación por RT-PCR utilizando los oligonucleótidos 5'-CUA CUA CUA CUA ATG GAT GAC GAT ATC GCT GC-3'(SEQ.ID.NO.:1) y 5' CAU CAU CAU CAU ACG CAG CTC AGT AAC AGT CC-3' (SEQ.ID.NO.:2). Una mancha de ARN se hibridó con cada una de las dos sondas de inmunoglobulina durante toda la noche a 42ºC y en sulfato de dextrano al 10%, 4X SSC, formamida al 40%, solución tamponada Tris de Denhardt al 0,8%. Tras la hibridación se lavaron tres veces los filtros con 2X SSC, con SDS al 0,1%, a temperatura ambiente, y con 0,1X SSC, con SDS al 0,1%, dos veces, durante veinte minutos y a 50ºC, antes de la autorradiografía. La intensidad de la señal se determinó con un Phosphorimager. Tras la cuantificación con las dos sondas de inmunoglobulina, se eliminó la señal de los filtros lavándolos a 70ºC durante 15 minutos en dH_{2}O y rehibridándolo con sonda de beta-actina para permitir la normalización de la cantidad de ARN cargada en cada pista. Cada línea celular produjo aproximadamente cantidades equivalentes de ARN específico del anticuerpo.

Ejemplo 9 Transfección de células NS/O

Las células NS/O se mantuvieron en crecimiento exponencial en el siguiente medio: medio mínimo esencial de Iscove suplementado con un 10% de suero de bovino fetal inactivado con calor y glutamina 4 mM; se mantuvieron a 37ºC en un incubador humidificado con entre un 5% y un 6,5% de CO_{2}.

El plásmido para la transfección se linearizó por digestión con una enzima de restricción en un lugar único; el lugar único preferido era uno situado fuera de las secuencias de expresión del gen extraño, en las secuencias bacterianas del vector. Tras la restricción, se desproteinizó el ADN mediante extracción con fenol, extracción con fenol/cloroformo (1:1) y una extracción final con cloroformo; entonces se precipitó bajo condiciones de esterilidad en una cabina de seguridad biológica, utilizando una concentración final de 0,2-0,4 M de cloruro de sodio y un 70% de etanol. El ADN se suspendió de nuevo en agua destilada estéril en una concentración calculada de 1 mg/ml. El ADN se utilizó inmediatamente o bien fue congelado (-20ºC) hasta su uso.

En el día de la transfección, el recuento de células viables se tomó para cultivo de NS/O original. Se utilizaron un total de 1 x 10^{7} células viables por cubeta de transfección. Las células se recogieron primero por centrifugación a 3.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente; las células sedimentadas se lavaron luego dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril y se suspendieron de nuevo en PBS en una concentración de 10^{7} células por 800 ml. La suspensión celular se mantuvo en hielo a partir de este momento. Se transfirieron con cuidado 10^{7} células a una cubeta BioRad de 0,4 cm (distancia entre electrodos), bajo condiciones estériles en una cabina de seguridad biológica. 40 mg de ADN de plásmido linearizado en disolución se mezclaron cuidadosamente con las células y se mantuvo la cubeta en hielo durante 5 minutos.

Antes de la electroporación, se secó el exterior de la cubeta, y luego se colocó en el soporte para cubetas de un "BioRad Gene Pulser". Se programó el pulsador de genes para que aplicara 3 mF a 1500 voltios por pulso. Se utilizaron dos pulsos consecutivos. Entonces se colocó la cubeta en hielo durante ente 2-5 minutos y luego se transfirieron las células a 30 ml de medio de cultivo modificado que contenía glutamina 1mM, mejor que glutamina 4 mM, en un tubo estéril desechable de 50 ml. Se distribuyeron 10 de los 30 ml de suspensión celular en una bandeja de microtitulación de 96 pocillos, aproximadamente 100 ml por pocillo; 10 ml de suspensión celular (de los restantes 20 ml) se diluyeron con 10 ml de medio de cultivo modificado y se distribuyó en dos bandejas de microtitulación de 96 pocillos, aproximadamente 100 ml por pocillo; los 10 ml finales de suspensión celular se diluyeron con 30 ml de medio de cultivo modificado y se distribuyeron en cuatro bandejas de microtitulación de 96 pocillos a aproximadamente 100 ml por pocillo. Estas placas se incubaron durante la noche en un incubador humidificado a 37ºC con entre 5% - 6,5% de CO_{2}.

Medio selectivo

El medio selectivo para la selección GS fue como sigue:

: Medio esencial mínimo de Iscove (exento de glutamina; Sigma)

: 10% de suero fetal de bovino dializado (de Hyclone).

: 1X nucleósidos *

: 1X asparagina **

: *50X de solución original de ribonucleósidos.

: 35 mg de adenosina

: 35 mg de guanosina

: 35 mg de citidina

: 12 mg de timidina

(todas de calidad de cultivo celular, Sigma) completa hasta 100 ml con agua destilada estéril. Filtrar a través de una unidad filtrante de 0,1 m y almacenar bajo congelación (-20ºC) en partes alícuotas de 10 ml.

**100X Asparagina: 600 mg por 100 ml de agua destilada estéril, filtrar a través de una unidad filtrante de 0,1 m y almacenar a 4ºC.

Selección

24 horas tras la transfección, cada bandeja de microtitulación de 96 pocillos fue alimentada con 100 \mul de medio selectivo e incubada en un incubador humidificado a 37ºC y con entre un 5% y un 6,5% de CO_{2} hasta que las colonias aparecieron, lo que tardó aproximadamente entre 3 y 3,5 semanas. No fue necesaria alimentación, salvo en los casos en que los pocillos comenzaron a secarse; las placas se monitorizaron a intervalos de 3-4 días. Los pocillos con colonias en crecimiento viraban finalmente al amarillo, y en este punto estos pocillos se ensayaron extrayendo entre 50 \mul y 100 \mul del fluido de cultivo y realimentando los pocillos con medio selectivo (para mantener clones viables).

Claims

1. Un vector de expresión de recombinación homóloga para la expresión de genes recombinantes en células de mamífero, en donde dicho vector comprende un promotor para la expresión de un gen recombinante, una unidad de transcripción que codifica un marcador selectivo, y secuencias de ADN específicas para el lugar de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón para el direccionamiento de la recombinación homóloga.

2. Un vector de expresión de recombinación homóloga de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el mencionado marcador selectivo se seleccione entre el grupo consistente en gpt, dhfr, resistencia a antibióticos o unidad de transcripción de la glutamina-sintetasa.

3. Un vector de expresión de recombinación homóloga de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, en el que el mencionado gen recombinante es un gen de inmunoglobulina.

4. Un vector de expresión de recombinación homóloga de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la expresión de genes recombinantes en células de ratón.

5. Un vector de expresión de recombinación homóloga de acuerdo con la reivindicación 4 para la expresión de genes recombinantes en células NS/O.

6. Un vector de expresión de recombinación homóloga para la expresión de genes de inmunoglobulina recombinantes en células de mamífero, en donde dicho vector comprende un primer promotor para la expresión de un primer gen de inmunoglobulina recombinante, un segundo promotor para la expresión de un segundo gen de inmunoglobulina, una unidad de transcripción que codifica un marcador selectivo, secuencias de ADN específicas para el lugar de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón para el direccionamiento de la recombinación homóloga.

7. Un vector de expresión de recombinación homóloga de acuerdo con cualquiera de las reivindicciones 1 a 6, en el que el mencionado promotor o los mencionados primer y segundo promotores son cada uno un promotor CMV-IE.

8. Un vector de expresión de recombinación homóloga de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el marcador selectivo es una unidad de transcripción de glutamina-sintetasa.

9. Las células huésped transfectadas con el vector de expresión de la reivindicación 1, en donde la célula húesped es una célula B plenamente diferenciada.

10. Un método in vitro para la expresión de genes recombinantes en una célula huésped de mamífero, que comprenda los pasos de:

(a): Transferir un vector de recombinación homóloga específico para el lugar de la 2A gamma inmunoglobulina de ratón en la mencionada célula huésped, que es una célula B plenamente diferenciada, en donde el mencionado vector comprende ADN que codifica un gen recombinante y el mencionado vector recombina homólogamente con la posición gamma 2A cromosómica de la célula huésped; y

(b): Cultivar la mencionada célula huésped bajo condiciones adecuadas para la selección y expresión de genes recombinantes.

11. El método de la reivindicación 10, en el que dicha selección de la célula huésped se selecciona entre el grupo consistente en gpt, dhfr, resistencia a antibióticos o glutamina-sintetasa.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el mencionado vector se recombina homólogamente con el lugar gamma 2A cromosómico de la célula huésped en cualquier sitio del mencionado lugar gamma 2A de la célula huésped.