ES2210263T3 - Adn que codifica subunidades de 1,3,-beta-d glucano sintasa. - Google Patents
Adn que codifica subunidades de 1,3,-beta-d glucano sintasa.Info
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Abstract
SE IDENTIFICAN, DUPLICAN, EXPRESAN Y UTILIZAN EN ENSAYOS IN VITRO MOLECULAS DE ADN QUE CODIFICAN PROTEINAS IMPLICADAS EN LA BIOSINTESIS DE GLUCANO 1,3-BETA-D PARA SELECCIONAR COMPUESTOS ANTIFUNGALES, INCLUYENDO COMPUESTOS QUE AFECTAN A LA BIOSINTESIS DE LA PARED CELULAR. LA INVENCION INCLUYE PERO NO SE LIMITA A LAS MOLECULAS DE ADN PURIFICADAS, ENSAYOS QUE EMPLEAN LAS MOLECULAS DE ADN, PROTEINAS CODIFICADAS POR LAS MOLECULAS DE ADN, CELULAS QUE EXPRESAN LAS MOLECULAS DEL ADN Y FORMAS ALTERADAS DE LAS MOLECULAS.
Description
ADN que codifica subunidades de
1,3-\beta-D glucano sintasa.
Las moléculas de ADN que codifican proteínas
implicadas en la biosíntesis de la
1,3-beta-D glucano se identifican,
clonan, expresan y usan en ensayos in vitro para seleccionar
compuestos antifúngicos, incluyendo compuestos que afectan a la
biosíntesis de la pared celular. La invención incluye las moléculas
de ADN purificadas, ensayos que emplean las moléculas de ADN,
proteínas codificadas por las moléculas de ADN, las células que
expresan las moléculas de ADN y formas alteradas de la molécula.
La figura 1 es un mapa de restricción del
plásmido pFF119.
La figura 2 es un mapa de restricción de plásmido
pFF334.
La figura 3 es un mapa de restricción de la
inserción EcoRI de 11,0 kb de pGS3.
La figura 4 es un mapa de restricción de la
inserción XbaI de 11,0 kb de pGS6. La línea negrita señala la parte
del gen fksA que se secuenció. Se muestra la inserción de pGS15 y
sus derivados que contienen las deleciones anidadas
(pGS17-pGS21).
La figura 5 es la secuencia de ADN y la supuesta
traducción de amino-ácidos de parte del gen fksA.
La figura 6 es la secuencia del ADN FKS1.
La figura 7 es la secuencia de aminoácidos de la
proteína FKS1.
La figura 8 es la secuencia de ADN FKS2
La figura 9 es la secuencia de aminoácidos de la
proteína FKS2.
La figura 10 muestra las secuencias de ADN y de
aminoácidos de fksA.
La figura 11 muestra la secuencia de ADN de un
homólogo de FKS1 aislado a partir de Candida albicans.
La figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos
de un homólogo de FKS1 de C. albicans.
La figura 13 es una lista parcial de cepas de
levadura.
Las moléculas de ADN que codifican las proteínas
implicadas en la biosíntesis de 1,3,-beta-D glucano
se identifican, clonan, expresan y usan en ensayos in vitro
para seleccionar compuestos antifúngicos, incluyendo compuestos que
afectan a la biosíntesis de la pared celular. La invención incluye,
pero no de forma limitante, las moléculas de ADN purificadas,
ensayos que emplean las moléculas de AND, proteínas codificadas por
las moléculas de ADN, células que expresan las moléculas de ADN y
formas alteradas de la molécula.
La presente solicitud está dirigida a fragmentos
de ADN purificados que contienen un gen que revierte los fenotipos
mutantes de varias cepas diferentes de Saccharomyces
cerevisiae. El gen se denomina FKS1, gen 1 de sensibilidad a
FK506, y también se conoce como ETG1 (gen 1 diana de equinocandina).
Las equinocandinas son heptapéptidos cíclicos
acil-sustituidos que inhiben la síntesis de
1,3-beta-D glucano en muchos
hongos. FKS2 es un homólogo de FKS1. FKS1 se clonó a partir de una
genoteca genómica de Saccharomyces cerevisiae. Las
propiedades de FKS1 sugiere que codifica una subnidad la
1,3-\beta-D glucano sintasa. Las
proteínas codificadas por FKS1 u homólogos de éste representan
posibles dianas para terapia con fármacos en enfermedad fúngica. La
invención incluye homólogos tales como FKS2, que también codifica
una diana de las equinocandinas, y genes estrechamente relacionados
a partir de hongos patogénicos tales como Aspergillus
fumigatus, Candida albicans y Cryptococcus
neoformans.
La invención comprende un gen que revierte los
fenotipos relacionados con fármacos de distintos mutantes de S.
cerevisiae. Se identificaron varias cepas de mutantes por su
sensibilidad alterada a clases específicas de inhibidores de la
pared celular, mientras que otra cepa mutante es hipersensible a los
compuestos inmunosupresores FK506 y ciclosporina A.
El entendimiento del modo de acción de nuevos
compuestos terapéuticos requiere de varias aproximaciones
experimentales involucrando tanto bioquímicas como genéticas. Una
aproximación es probar a aislar organismos resistentes o sensibles a
los compuestos probados. Entonces, a veces tales mutantes pueden
usarse para aislar genes que codifican las dianas farmacológicas.
Sigue una descripción general de algunas de las áreas relevantes de
la biología de levaduras y de los organismos mutantes.
FK506 y ciclosporina A (CsA) son potentes
inmunosupresores que inhiben una etapa intermedia dependiente de
Ca^{2+} en la activación de la célula T y bloquean la producción
de interleucina-2 (IL-2) (para
revisión, véase Sigal et al., 1992, Ann. Rev.
Immunol., 10:519-560). FK506 se une a una
familia de proteínas conocidas como proteínas que unen FK506 (FKBP)
mientras que CsA se une a miembros de otra familia de proteínas
denominadas ciclofilinas. El complejo
fármaco-receptor resultante
(FKBP-FK506 o ciclofilina-CsA) se
unen e inhiben a la calcineurina, una proteína fosfatasa
dependiente de Ca^{2+} y calmodulina, sugiriendo que la
inhibición de calcineurina puede ser un mecanismo de
inmunosupresión (Liu et al., 1991. Cell, 66:
807-815).
FK506 y CsA también son antibióticos que inhiben
el crecimiento de ciertas cepas de levaduras y hongos. Las
propiedades antifúngicas de estos fármacos y la existencia de FKBP,
ciclofilinas y calcineurinas en levaduras y hongos han impulsado los
exámenes genéticos del modo de acción de los fármacos en estos
organismos.
Usando FK506 como un agente de selección, se
aislaron mutantes hipersensibles. La mutación fks1-1
descubierta en esta selección se usó para clonar el gen FKS1.
También se descubrió y clonó un homólogo de FKS1 (FKS2). A
continuación se proporcionan ejemplos que describen el
descubrimiento de esta mutación, su uso y la clonación de FKS1, FKS2
y homólogos de estos genes.
Se han publicado mutantes muy sensibles a CsA,
pero su relación con FKS1 o FKS2, si hay alguna, no se ha descrito
(Koser, P.K. et al., 1991. Gene,
108:73-80).
La pared de la célula fúngica es una estructura
compleja implicada en diversos procesos celulares vitales. El
crecimiento vegetativo, morfogénesis, consumo y secreción de
macromoléculas y protección contra cambios osmóticos se afectan por
cambios en la composición e integridad de la pared celular. Se
podría esperar que compuestos antifúngicos que actúan a través de la
inhibición de la síntesis de la pared celular, un proceso esencial
para los hongos y ausente en las células de mamíferos, produciría
una combinación ideal de actividad fungicida y baja toxicidad en
mamíferos.
Los esfuerzos de un gran número de laboratorios
se han dirigido hacia la identificación de tales agentes, a pesar de
que todavía no se han introducido compuestos de este tipo en la
práctica clínica. Las paredes de los hongos están compuestas de
varios polímeros: quitina, alfa y beta-glucanos, y
manoproteínas, y todos son dianas potenciales para terapia
antifúngica.
Una clase principal de inhibidores de
beta-glucanos está compuesta de varios antibióticos
lipopeptídicos incluyendo aculeacina A, equinocandina B y las
neumocandinas. Todos estos componentes son hexapéptidos cíclicos que
contienen una cadena lateral de ácido graso no polar. La actividad
fungicida de los productos naturales está limitada en gran medida a
levaduras. Las equinocandinas son fungicidas en virtud de su
capacidad para inhibir la síntesis celular completa de
1,3-beta-D glucano, que interrumpe
la integridad de la pared celular y causa la lisis de la célula de
levadura completa. Las equinocandinas inhiben in vitro la
polimerización de la glucosa en
1,3-beta-D glucano, una reacción
que puede ser catalizada por fracciones de mezcla de membranas a
partir de varios tipos de hongos, tales como C. albicans,
Aspergillus fumigatus y Neurospora crassa.
Una segunda clase estructural de inhibidores de
la síntesis de beta-glucano, las papulacandinas y
caetiacandinas, contiene un componente glucósido conectado a un
sistema de anillo aromático y dos ácidos grasos de cadena larga.
Estos compuestos tienen el mismo modo de acción que las
equinocandinas. Los esfuerzos de modificación química, además de los
programas de descubrimiento de productos naturales, han llevado a la
identificación de equinocandina, papulacandina o caetiacandina
clínicamente útiles. Es probable que finalmente se incorporen
análogos al uso clínico.
Matsumoto et al., publicaron que
Pneumocystis carinii, causa principal de muerte por neumonía
en pacientes con SIDA en los Estados Unidos, tiene
beta-glucano en la pared de su forma cisto
(Matsumoto, Y., et al., 1989. J. Protozool.,
36:21S-22S). Inhibidores de la síntesis de
beta-glucano, tales como papulacandinas y
equinocandinas, podrían por tanto tener eficacia en el tratamiento
de las infecciones por P. carinii. Schmatz et al.,
publicaron que en un modelo de rata de neumonía por P.
carinii, L-671,329 (una equinocandina) y
L-687,781 (una papulacandina) fueron efectivas para
reducir el número de cistos en los pulmones de ratas infectadas
(D.M. Schmatz et al., 1990. PNAS,
87:5950-5954). Estos resultados sugieren que
la síntesis de beta-glucano es una diana viable
para terapéuticos útil en el tratamiento de las infecciones por
P. carinii.
Se han hecho varios esfuerzos para aislar cepas
de bona fide resistentes a fármacos de S. cerevisiae
con la síntesis de beta-glucano afectada. Los
mutantes que se han aislado incluyen acu1 (Mason, M. et
al., 1989. Yeast Cell Biology Meeting, 15
agosto-20 agosto, 1989, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Resumen Nº 154);
acr1/2/3/4 (Font de Mora, J., et al., 1991.
Antimicrob. Agents Chemother., 35:12
2596-2601); y pap1 (Duran, A., et
al., 1992. En: Profiles in Biotechnology (T.G. Villa y
J. Abalde. Eds) Servicio de Publicaciones, Universidad de Santiago,
España. pp. 221-232). Una desventaja de estos
intentos fue la pobre potencia de aculeacina y papulacandina
contra S. cerevisiae.
En el presente trabajo, se usó como agente
selectivo una equinocandina más potente (L-733,560),
y se aislaron mutantes específicamente afectados en la síntesis de
glucano. El primer mutante descubierto en esta selección (cepa
R560-1C) se usó para clonar el gen FKS1. Se encontró
que un segundo mutante identificado en la búsqueda de cepas
resistentes a L-733,560 que era resistente a
equinocandina y muy sensible al inhibidor de la quitina sintasa, la
nicomicina Z. La quitina, al igual que el
beta-glucano, es un polisacárido esencial para la
integridad estructural de la pared de la célula fúngica. La
nicomicina Z inhibe el crecimiento celular y la polimerización
in vitro de la quitina. El segundo mutante también se usó
para clonar el gen FKS1.
Las moléculas de ADN que codifican las proteínas
implicadas en la biosíntesis de
1,3-beta-D glucano se identificaron,
clonaron, expresaron y usaron en ensayos in vitro para la
selección de compuestos antifúngicos, incluyendo compuestos que
afectan a la biosíntesis de la pared celular. La invención incluye,
pero no de forma limitante, las moléculas de ADN purificadas,
ensayos que emplean las moléculas de ADN, proteínas codificadas por
las moléculas de ADN, células que expresan las moléculas de ADN y
formas alteradas de la molécula.
La presente invención se refiere al aislamiento,
caracterización, expresión, y secuencia de una molécula de ADN que
codifica el gen 1 de sensibilidad a FK506 de S. cerevisiae
(FKS1), que también se conoce como ETG1, y para homólogos de FKS1,
que incluyen, pero no de forma limitante, a FKS2. El gen FKS1 se
obtiene a partir de una cepa de S. cerevisiae que es capaz de
producir la proteína de FKS1. Tales cepas de levadura son bien
conocidas en la técnica e incluyen, pero no de forma limitante, a
S. cerevisiae W303-1A, S288C, GRF88 e
YFK007.
El gen FKS2 se encontró en transferencias
Southern del ADN genómico de S. cerevisiae como una banda que
hibridaba con una sonda consistente en el ADN de FKS1.
A pesar de no poder predecir que pueda aislarse
un mutante en particular resistente o hipersensible a estos
fármacos, sin embargo, las técnicas de aislamiento de mutantes
hipersensibles o resistentes a fármacos son similares a las usadas
en el aislamiento de mutantes auxotróficos, sensibles a temperatura
y sensibles a UV descritas en MYG (infra). El gen FKS1
o los homólogos de FKS1 puede aislarse a partir de una genoteca de
ADN cromosómico por diversos métodos incluyendo: (1) complementación
de una mutación (fks1-1) obteniendo células
hipersensibles a los fármacos inmunosupresores FK506, ciclosporina A
u otros inhibidores de calcineurina; (2) complementación de una
mutación (fks1-2) obteniendo células resistentes a
equinocandinas; o (3) complementación de una mutación
(fks1-4) obteniendo células hipersensibles a
nicomicina Z. (GYG, infra, pp.
195-230).
El gen FKS1 o sus homólogos pueden aislarse a
partir del ADN cromosómico preparando una genoteca de fragmentos de
ADN en un vector de clonación de ADN y analizando la presencia de
FKS1 en clones individuales. Por ejemplo, puede obtenerse una
genoteca de ADN genómico de S. cerevisiae a partir de la cepa
GRF88 en el plásmido YCp50 de la American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, como ATCC
37415.
Puede prepararse una genoteca plasmídica aislando
el ADN cromosómico a partir de cultivos puros de los
microorganismos. Tales microorganismos incluyen, pero no de forma
limitante, las cepas de S. cerevisiae
W303-1A, S288C, GRF88, y MY2146 (YFK007). El ADN
cromosómico se fragmenta, por ejemplo, por digestión parcial con uno
o más enzimas de restricción, tales como BamHI, ClaI, BclI, Bg1II,
KpnI, Sau3AI, o XhoI, prefiriéndose Sau3AI. Los fragmentos de ADN
digeridos se separan por tamaño, y los fragmentos de tamaño
específico, de aproximadamente 2 a 15 kb de longitud, se insertan en
un vector de clonación.
Vector de clonación, como se usa en la presente
invención, se define como una secuencia de ADN que permite la
incorporación de un ADN experimental específico, siendo introducido
el ADN combinado en una célula hospedadora que puede existir de
manera estable y expresar la proteína dictada por el ADN
experimental. El ADN extraño combinado con el ADN del vector
constituye una molécula de ADN recombinante que deriva de la
tecnología recombinante. Los vectores de clonación incluyen, pero no
de forma limitante, plásmidos, bacteriófagos, virus y cósmidos.
El vector de clonación se corta con una
endonucleasa de restricción tal como Sa1I, se trata con fosfatasa y
los fragmentos de ADN se ligan con una ADN ligasa, prefiriéndose la
ADN ligasa de T4. Los vectores de clonación se usan para
transformar células hospedadoras competentes para la captación de
ADN. Las células hospedadores para clonación, procesamiento del ADN
y expresión incluyen, pero no de forma limitante, a bacterias,
levaduras, hongos, células de insecto y células de mamífero, siendo
el hospedador preferido Escherichia coli. Los hospedadores
más preferidos son E. coli K-12 cepas RR1,
HB101, JM109, DH11S o DH5a. Cuando se ligan aproximadamente 5 x
10^{4} fragmentos de ADN genómico independientes en un vector de
clonación, esto se llama genoteca. Una genoteca real es probable
que contenga una representación del genoma completo. Ejemplos de
tales genotecas se describen en Rose et al.,(GYG,
infra).
Las células hospedadoras competentes que captan y
mantienen estable una molécula de ADN recombinante en el proceso de
transformación pueden identificarse por su capacidad para crecer en
medio LB complementado con un fármaco selectivo de plásmido. Para
vectores plasmídicos que contienen el gen de resistencia a la
ampicilina, la ampicilina es el fármaco selectivo preferido. Para
obtener una representación completa de la genoteca, las mezclas de
transformación se extienden en la superficie de muchas placas de
agar y se incuban bajo condiciones apropiadas. Las células
transformantes pueden resuspenderse a partir de la superficie de las
placas de agar en un pequeño volumen de medio líquido, prefiriéndose
10 ml de medio LB. La suspensión celular se usa para inocular un
volumen mayor de LB líquido, complementado con el fármaco selectivo,
e incubado durante toda la noche a 37ºC. Entonces, el plásmido de
ADN se extrae a partir de las células por métodos conocidos en la
técnica.
Pueden elaborarse selecciones para identificar el
gen FKS1 o sus homólogos en la genoteca plasmídica. Una estrategia
requiere el uso de un mutante de S. cerevisiae resistente a
la equinocandina, tal como la cepa R560-1C
(MY2140). Las células se hacen competentes por absorción de ADN y
entonces se transforman con la genoteca de ADN. Los transformantes
que llevan el gen FKS1 mostrarán un descenso en la resistencia a
una equinocandina selectiva dependiente de plásmido. Esta
expectación se basa en la información de un análisis genético de la
cepa R560-1C. Cuando R560-1C se
empareja con cepas de tipo salvaje, los diploides heterocigóticos
tienen sensibilidad intermedia a la equinocandina en comparación
con los respectivos parentales, lo que sugiere que una copia única
del gen tipo salvaje puede hacer al mutante más sensible a las
equinocandinas.
Las alícuotas de la mezcla de transformación se
disponen en placas con medios selectivos para transformantes.
Después de la incubación que permite el crecimiento, se recogen,
mezclan y almacenan, preferiblemente por congelación a -80ºC en
medio complementado con glicerol al 25%. El título, definido como el
número de unidades formadoras de colonia por mililitro, se determina
por métodos conocidos en la técnica.
La identificación de transformantes que contienen
el gen FKS1 puede lograrse disponiendo la genoteca en placas de agar
que contienen medio selectivo para plásmidos de manera que en cada
placa crezca un número contable de colonias. Una porción de cada
colonia se transfiere a dos placas de agar por réplica de placas: la
primera placa contiene medio selectivo para plásmido complementado
con una concentración de la equinocandina selectiva que matan las
células con sensibilidad intermedia, y el segundo contiene sólo
medio selectivo para plásmido. Los clones positivos se definen como
aquellas colonias que crecen normalmente en la placa sin
equinocandina pero que crecen pobremente o nada en absoluto en la
placa que contiene equinocandina.
El fenotipo sensible a equinocandina puede
detectarse por diversas pruebas. En una prueba, las células a partir
de una colonia se ponen directamente en la superficie de las placas
que contiene diferentes concentraciones de la equinocandina
selectiva; se contabilizan las células que crecen pobremente tras
dos días de incubación.
En una segunda prueba, una porción de cada
colonia se transfiere por replicado a una placa de agar que contiene
la equinocandina selectiva a concentración aproximadamente doble de
la usada en la primera prueba. Los clones positivos no crecen en
estas placas.
En una tercera prueba, las células de una colonia
individual se inoculan en medio líquido selectivo para plásmido y se
crecen a saturación. Una alícuota del cultivo saturado se usa para
inocular medio líquido fresco complementado con o sin la
equinocandina selectiva. Tras la incubación, el crecimiento se mide
por densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm. Las colonias
que no pueden crecer en presencia de equinocandina se contabilizan
como positivas para sensibilidad incrementada a la
equinocandina.
En otra prueba, los clones potenciales se prueban
en un ensayo de microdilución del medio, en donde se prueba un
intervalo de concentraciones de la equinocandina selectiva. Los
clones positivos son más sensibles a la equinocandina selectiva que
los mutantes originales resistentes.
Pruebas tales como las descritas anteriormente
pueden usarse para analizar una genoteca de ADN genómico para
identificar un plásmido recombinante que contiene una copia
funcional del gen FKS1. Para determinar si el incremento en la
sensibilidad a equinocandina se debe a una copia codificadora de
FKS1 en el plásmido, los clones positivos se curan del ADN
plasmídico y se prueba el descenso en la sensibilidad a
equonocandina. Si el descenso de la resistencia a equinocandina se
debe a la presencia del plásmido, entonces la pérdida del plásmido
tiene como resultado la pérdida de este fenotipo. Las sensibilidad
a equinocandina puede medirse de diversas formas, preferiblemente
por el ensayo de microdilución del medio.
La prueba más directa de que el incremento de la
sensibilidad a equinocandina se debe a la presencia de un plásmido
que contiene el gen FKS1 puede obtenerse aislando el ADN plasmídico
a partir de un clon positivo. Las células de E. coli
competentes para captar el ADN se transforman con el plásmido, y los
transformantes se identifican y aíslan. El ADN plasmídico se aísla
a partir de E. coli transformada y entonces se digiere con
endonucleasas de restricción para obtener fragmentos de tamaños
específicos. El tamaño de cada fragmento puede estimarse por
métodos convencionales, tales como gel de electroforesis.
Digiriendo el plásmido con varios enzimas, se genera un mapa que
indica las posiciones de escisión; el mapa es diferente y específico
del fragmento clonado. Un mapa de restricción detallado es
suficiente para identificar un gen particular dentro del genoma.
Los fragmentos del gen clonado, generado por digestión con
endonucleasas, pueden purificarse a partir de geles de agarosa y
ligarse en vectores adecuados para secuenciación por métodos
conocidos en la técnica. Tales vectores incluyen, pero no de forma
limitante, pBR322, YEp13, YEp24, pGEM3Zf(+), pGEM5Zf(+) y
pGEM7Zf(+), prefiriéndose pGEM3Zf(-) y pGEM7Zf(-). Se prepara ADN
de doble hebra a partir de cada plásmido y se usa para
secuenciación.
Una segunda estrategia para identificar clones
que contiene el gen FKS1 utiliza su capacidad para complementar una
mutación FK506 hipersensible. Se transforma un mutante hipersensible
a FK506 con ADN de la genoteca. Los transformados que ya no son
hipersensibles a FK506 se identifican incubando todos los
transformados en presencia de niveles de FK506 inhibitorios para el
crecimiento del mutante hipersensible pero no para la cepa de tipo
salvaje. Sólo crecen las cepas que contiene ADN que comprende el gen
FKS1. Puede elaborarse una estrategia similar usando ciclosporina A
o cualquier otro inhibidor de calcineurina para el que el mutante
es hipersensible.
Una tercera estrategia para identificar clones
que contienen el gen FKS1 utiliza su capacidad para complementar una
mutación que confiere hipersensibilidad a la nicomicina Z. El
mutante sensible a la nicomicina Z, tal como MS14, se trasforma con
ADN de la genoteca. Los transformantes que ya no son hipersensibles
a nicomicina Z se identifican incubando todos los transformantes en
presencia de niveles de mikomicina Z inhibitorios para el
crecimiento del mutante hipersensible pero no para la cepa salvaje.
Sólo crecen las cepas que contiene ADN que comprende el gen
FKS1.
El gen FKS2, un homólogo de FKS1, puede aislarse
a partir de ADN cromosómico. El ADN cromosómico se aísla a partir de
cultivos puros de microorganismos que se sabe contienen FKS2
mediante análisis por transferencia Southern, usando métodos
estándar. El ADN cromosómico se fragmenta por digestión con varios
enzimas. El aislamiento de FKS2 puede llevarse a cado usando una
sonda que consiste en una molécula de ADN con una región de
secuencia de nucleótidos similar a una porción del gen FKS1. Sólo se
necesita que la longitud de este fragmento sea suficientemente
grande para conferir especificidad por FKS2 en un análisis de
hibridación de ADN a partir de un organismo que contiene FKS2. Este
fragmento también puede ser más largo que la longitud máxima
requerida para alcanzar especificidad de hibridación. Los fragmentos
preferidos son el fragmento KpnI de FKS1 de 3,5 kb o el fragmento
PstI-SphI de FKS1de 10 kb.
Los genes FKS1 o FKS2 de S. cerevisiae
pueden usarse para aislar y caracterizar genes homólogos en hongos
patogénicos. Los análisis de hibridación de transferencias Southern
muestran que existen genes estrechamente relacionados con FKS1 y
FKS2 en los hongos patogénicos. Puesto que los hongos patogénicos
que incluyen, pero no de forma limitante, cepas de C.
neoformans, C. albicans, A. fumigatus,
Magnaportha grisea, y Ustilago maydis, tienen
1,3-beta-D glucano en sus paredes
celulares, es probable que exista un homólogo funcional de FKS1 o
FKS2 en cada uno de estos hongos. También es probable que exista un
homólogo funcional de FKS1 o FKS2 en otros organismos que tiene
1,3-beta-D glucanos en sus paredes
celulares. Ejemplo de tales organismos incluyen, pero no de forma
limitante, a P. carinii.
Homólogos de FKS1 y FKS2 pueden detectarse
aislando ADN cromosómico a partir de C. albicans, C.
neoformans, A. fumigatus, M. grisea, y U.
maydis. Una porción del ADN cromosómico se corta completamente
con varios enzimas de restricción, tales como EcoRI, HindIII,
EcoRV, C1aI y XhoI. Los fragmentos de ADN digeridos se separan en
gel de electroforesis. Entonces los fragmentos se transfieren a un
soporte de membrana sólido tal como membrana de nitrocelulosa o
nailon, siendo el método preferido la membrana de nailon. Entonces,
la transferencia en nailon se hibrida con una sonda marcada. La
sonda puede marcarse con un radioisótopo. El radioisótopo elegido
es ^{32}P. Un fragmento de ADN puede radiomarcarse por un
procedimiento de desplazamiento de mella (tal como el descrito en
Rigby et al., (1977) J. Mol. Biol.,
113:237-251) o un procedimiento de cebado
aleatorio (tal como el descrito en Feinberg y Vogelstein (1983)
Anal. Biochem., 132:6-13),
prefiriéndose el procedimiento de cebado aleatorio. La
transferencia se hibrida durante toda la noche con un fragmento
radiomarcado, siendo las sondas preferidas el fragmento
SalI-ClaI de FKS1 de 1,4 kb, el fragmento
Sa1I-ClaI de FKS1 de 3,5 kb o el fragmento
PstI-BglII de FKS2 de 1,7 kb. Al día siguiente se
lava la transferencia y luego se expone a una película
XAR-5 y se revela. Las condiciones para lavar la
transferencia son tales que sólo los genes con alto grado de
homología hibridarán con la sonda y aparecerán en la
autoradiografía. El tamaño y patrón de los fragmentos digeridos que
hibridan con la sonda generan un mapa genómico. Para cada
organismo, el mapa es suficiente para identificar específicamente en
el cromosoma los homólogos de FKS1 o de FKS2.
Las mutaciones del gen FKS1, incluyendo, pero no
de forma limitante, fks1-1 o disrupciones o
deleciones de FKS1, son útiles para la selección de inhibidores de
glucano sintasa. Tal selección depende del cambio en la
susceptibilidad a inhibidores de glucano sintasa de tales mutaciones
comparada con una cepa salvaje de FKS1. Puede usarse cualquier
técnica capaz de detectar esta diferencia. Es particularmente útil
un ensayo de zona de inhibición en placas de agar.
Es sabido que hay una cantidad considerable de
redundancia en varios de los codones que codifican aminoácidos
específicos. Por tanto, esta invención también se dirige a aquellas
secuencias de ADN que contiene codones alternativos que codifican la
traducción eventual del aminoácido idéntico. Para los propósitos de
esta especificación, se definirá como una variación degenerada una
secuencia que lleve uno o más codones de recambio. También están
incluidas en el alcance de esta invención mutaciones en la
secuencia de ADN o en la proteína traducida que sustancialmente no
alteran las propiedades físicas últimas de la proteína expresada.
Por ejemplo, la sustitución de leucina por valina, lisina por
arginina, o glutamina por asparagina puede no causar cambios en la
funcionalidad del polipéptido.
Es sabido que las secuencias de ADN que codifican
un péptido puede alterarse de manera que codifiquen para un péptido
con propiedades diferentes de las del péptido que aparece en la
naturaleza. Los métodos para alterar las secuencias de ADN incluyen,
pero no de forma limitante, la mutagénesis dirigida específica de
sitio. Ejemplos de propiedades alteradas incluyen, pero no de forma
limitante, cambios en la afinidad de un enzima por un sustrato o de
un receptor por un ligando.
Según se usa en la presente invención, un
"derivado funcional" de un ADN o proteína de FKS1 modificado es
un compuesto que posee una actividad biológica (funcional o
estructural) que es sustancialmente similar a la actividad
biológica del ADN o proteína de FKS1. El término "derivado
funcional" pretende incluir a los "fragmentos",
"variantes", “variantes degeneradas”, "análogos",
"homólogos" o los "derivados químicos". El término
"fragmento" quiere referirse a cualquier subgrupo de
polipéptido contenido en la proteína FKS1. El término
"variante" quiere referirse a una molécula sustancialmente
similar en estructura y función a la proteína entera o a un
fragmento de ésta. Una molécula es "sustancialmente similar" a
una proteína modificada si ambas moléculas sustancialmente tienen
estructuras similares o si ambas moléculas poseen actividad
biológica similar. Por tanto, si las dos moléculas poseen
sustancialmente similar actividad biológica, se consideran variantes
incluso si la estructura de una de las moléculas no se encuentra en
la otra o incluso si las dos secuencias aminoacídicas no son
idénticas.
El término "análogo" se refiere a una
molécula de función sustancialmente similar a la proteína completa o
a un fragmento de ésta.
"Homología sustancial" o "similitud
sustancial", cuando se refiere a ácidos nucleicos significa que
los segmentos o sus hebras complementarias, cuando se alinean y
comparan de forma óptima, son idénticas con la inserciones o
deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos el 75% de los
nucleótidos. Alternativamente, existe homología sustancial cuando
los segmentos hibridarán con una hebra o su complementaria.
Los ácidos nucleicos reivindicados en la presente
invención pueden estar presentes en células completas, en lisados
celulares o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente
purificada. Un ácido nucleico se considera sustancialmente
purificado cuando se purifica fuera de contaminantes
medioambientales. Por tanto, una secuencia de ácido nucleico aislada
a partir de las células se considera sustancialmente purificada
cuando se purifica a partir de componentes celulares por métodos
estándar mientras que una secuencia de ácido nucleico químicamente
sintetizada se considera sustancialmente purificada cuando se
purifica a partir de sus precursores químicos.
Las composiciones de ácido nucleico de esta
invención pueden derivarse a partir de ADN genómico o ADNc,
preparado por síntesis o por combinación de técnicas.
Los ácidos nucleicos naturales o sintéticos que
codifican la subunidad 1,3-beta-D
glucano sintasa de la presente invención pueden incorporarse en
vectores de expresión. Normalmente los vectores de expresión que
incorporan la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa será adecuado para la replicación en un hospedador. Ejemplos
de hospedadores aceptables incluyen, pero no de forma limitante,
células procarióticas y eucarióticas.
La frase "sistema de expresión recombinante"
como se usa en la presente invención significa un cultivo
sustancialmente homogéneo de organismos hospedadores adecuados que
lleva de forma estable un vector de expresión recombinante. Ejemplos
de hospedadores adecuados incluyen, pero no de forma limitante,
bacterias, levaduras, hongos, células de insecto, células de planta
y células de mamífero. Generalmente, las células de sistema de
expresión son la progenie de una célula sencilla ancestral
transformada.
El ADN de la subunidad clonada de
1,3-beta-D-glucano
sintasa obtenido a través de los métodos descritos en la presente
invención puede expresarse recombinantemente por clonación molecular
en un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros
elementos reguladores de transcripción apropiados, y transferirse en
células hospedadoras procarióticas o eucarióticas para producir una
subunidad recombinante de
1,3-beta-D-glucano
sintasa usando métodos estándar.
Los vectores de expresión se definen en la
presente invención como secuencias de ADN que se requieren para la
transcripción de copias de genes clonadas y la traducción de sus
ARNm en un hospedador apropiado. Pueden usarse tales vectores para
expresar genes eucarióticos en diversos hospedadores tales como
bacterias, algas verdeazuladas, células de plantas, células de
insectos, células fúngicas y células de animales.
Vectores diseñados específicamente permiten el
transporte de ADN entre hospedadores tales como
bacterias-levadura,
bacterias-células animales o
bacterias-hongos o bacterias-células
de invertebrados. Un vector de expresión construido apropiadamente
debería contener: un origen de replicación para replicación autónoma
en las células hospedadoras, marcadores seleccionables, un número
limitado de sitios de enzimas de restricción útiles, potencial para
alto número de copias, y promotores activos. Un promotor se define
como una secuencia de ADN que dirige a la ARN polimerasa para unirse
al ADN e iniciar la síntesis de ARN. Un promotor potente es aquel
que hace que los ARNm se inicien con alta frecuencia. Los vectores
de expresión pueden incluir, pero no de forma limitante, vectores de
clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos
especialmente diseñados o virus.
Pueden usarse diversos vectores de expresión de
mamíferos para expresar la subunidad recombinante de
1,3-beta-D-glucano
sintasa en células de mamífero. Vectores de expresión comercialmente
disponibles que puede ser apropiados para la expresión de la
subunidad recombinante de
1,3-beta-D-glucano
sintasa incluyen, pero no de forma limitante, pcDNA3 (Invitrogen),
pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene),
EBO-pSV2-neo (ATCC 37593),
pBPV-1(8-2) (ATCC 37110),
pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224),
pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198),
pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), y
\lambdaZD35 (ATCC 37565).
Pueden usarse diversos vectores de expresión para
expresar la subunidad recombinante de
1,3-beta-D-glucano
sintasa en células bacterianas. Vectores de expresión comercialmente
disponibles que puede ser apropiados para la expresión de la
subunidad recombinante de
1,3-beta-D-glucano
sintasa incluyen, pero no de forma limitante, pET11a (Novagen),
lambda gt11 (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen),
pKK223-3 (Pharmacia).
Pueden usarse diversos vectores de expresión para
expresar la subunidad recombinante de
1,3-beta-D-glucano
sintasa en células fúngicas. Vectores de expresión comercialmente
disponibles que pueden se apropiados para la expresión de la
subunidad recombinante de
1,3-beta-D-glucano
sintasa incluyen, pero no de forma limitante, pYES2 (Invitrogen),
vector de expresión de Pichia (Invitrogen).
Pueden usarse diversos vectores de expresión de
células de insecto para expresar la subunidad recombinante de
1,3-beta-D-glucano
sintasa en células de insectos. Vectores de expresión comercialmente
disponibles que pueden ser apropiados para la expresión de la
subunidad recombinante de
1,3-beta-D-glucano
sintasa incluyen, pero no de forma limitante, pBlue Bac III
(Invitrogen), así como pAcUW1 y pAc5G1 (PharMingen).
Puede usarse un vector de expresión que contiene
el ADN que codifica la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa para la expresión de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa modificada en una célula hospedadora recombinante. Las
células hospedadoras recombitantes pueden ser eucarióticas o
procarióticas incluyendo, pero no de forma limitante, bacterias
tales como E. coli, células fúngicas tales como levaduras,
células de mamífero incluyendo, pero no de forma limitante, líneas
celulares de origen humano, bovino, porcino, de mono y roedor, y
células de insectos incluyendo, pero no de forma limitante, líneas
celulares derivadas de Drosophila y del gusano de la seda.
Líneas celulares derivadas de especies de mamíferos que pueden ser
adecuadas y que están disponibles comercialmente, incluyen, pero no
de forma limitante, las células L
L-M(TK^{-}) (ATCC CCL 1.3), células L
L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC
CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1
(ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651),
CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3
(ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26) y
MRC-5 (ATCC CCL 171).
El vector de expresión puede introducirse en las
células hospedadoras a través de una cualquiera de varias técnicas
incluyendo, pero no de forma limitante, transformación,
transfección, lipofección, fusión protoplásmica, y electroporación.
Las células que contienen el vector de expresión se propagaron
clonalmente y se analizaron individualmente para determinar si
producían la subunidad
1,3-beta-glucano sintasa. La
identificación de los clones de la célula hospedadora que expresan
la subunidad recombinante de
1,3-beta-D-glucano
puede hacerse de varias formas, incluyendo, pero no de forma
limitante, la reactividad inmunológica con anticuerpos contra la
subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa.
La expresión del ADN de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa también puede llevarse a cabo usando ARNm sintético
producido in vitro o ARNm nativo. El ARNm sintético o ARNm
aislado a partir de las células que producen la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa puede traducirse de forma efectiva en sistemas basados en
células incluyendo, pero no de forma limitante, extractos de germen
de trigo y extractos de reticulocitos, así como traducido de forma
efectiva en sistemas basados en células incluyendo, pero no de forma
limitante, la microinyección en oocitos de rana, prefiriéndose la
microinyección en oocitos de rana.
El término "homología sustancial", cuando se
refiere a polipéptidos, indica que el polipéptido o la proteína en
cuestión muestra homología al menos de aproximadamente el 30% con la
proteína en cuestión que aparece de forma natural, normalmente al
menos de aproximadamente homología del 65%.
La subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa puede expresarse en una célula hospedadora apropiada y
usarse para descubrir compuestos que afecta a la subunidad
1,3-beta-D-glucosa
sintasa.
La presente invención también se dirige a métodos
para selección de compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN
que codifican la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa o que modulan la función de la proteína subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa. Los compuestos que modulan estas actividades pueden ser
ADN, ARN, péptidos, proteínas o moléculas orgánica no proteicas. Los
compuestos pueden modular incrementando o atenuando la expresión del
ADN o ARN que codifica la subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa o la función de la proteína subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa. Los compuestos que modulan la expresión del ADN o ARN que
codifica la subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa o la función de la proteína subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa modificada puede detectarse por diversos ensayos. El ensayo
puede ser un simple ensayo "si/no" para determinar si hay
cambio en expresión o función. El ensayo puede hacerse cuantitativo
por comparación de la expresión o función de una muestra problema
con los niveles de expresión o función en una muestra estándar.
Pueden prepararse kits que contienen ADN de la
subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa, anticuerpos contra la subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa, o la proteína subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa. Tales kits se usan para detectar el ADN que hibrida con el
ADN de la subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa o para detectar la presencia de la proteína subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa o fragmentos peptídicos en una muestra. Tal caracterización
es útil para varios propósitos incluyendo, pero no de forma
limitante, estudios forenses, taxonómicos o epidemiológicos.
Las moléculas de ADN, moléculas de ARN, proteína
recombinante y anticuerpos de la presente invención puede usarse
para analizar y medir los niveles de ADN de la subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa, ARN de la subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa o proteína subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa. Las proteínas recombinantes, moléculas de ADN, moléculas de
ARN y anticuerpos se prestan ellas mismas para la formulación de
kits adecuados para la detección y tipaje de la subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa. Tal kit comprendería un soporte compartimentalizado
adecuado para mantenerse confinado en un recipiente cerrado. El
soporte además contendría reactivos tales como una proteína
subunidad recombinante de
1,3-beta-D-glucano
sintasa o anticuerpos contra la subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa modificada adecuados para detectar la subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa. El vehículo también puede contener un medio de detección
tal como un antígeno marcado o sustratos de enzima.
Composiciones farmacéuticamente útiles que
contienen moduladores de la actividad de la subnidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa, puede formularse de acuerdo con métodos conocidos tales
como la mezcla de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplo
de tales vehículos y métodos de formulación pueden encontrarse en
Remingtons's Pharmaceutical Sciences. Para formar una composición
farmacéuticamente aceptable adecuada para administración efectiva,
tales composiciones contendrán una cantidad efectiva de la proteína,
ADN, ARN o de modulador.
Las composiciones terapéuticas o diagnósticas de
la invención se administran a individuos en cantidades suficientes
para tratar o diagnosticar los trastornos. La cantidad eficaz puede
variar según diversos factores tales como las condiciones del
individuo, peso, sexo y edad. Otros factores incluyen el modo de
administración.
Las composiciones farmacéuticas puede
proporcionarse al individuo por diversas vías tales como subcutánea,
tópica, oral e intramuscular.
El término "derivado químico" describe una
molécula que contiene restos químicos adicionales que normalmente no
son parte de la molécula base. Tales restos puede mejorar la
solubilidad, vida media, absorción de la molécula base.
Alternativamente, los restos pueden atenuar efectos secundarios no
deseados de la molécula base o reducir la toxicidad de la molécula
base. Ejemplos de tales restos se describen en diversos textos,
tales como Remington's Pharmaceutical Sciences.
Los compuestos identificados según los métodos
descritos en la presente invención pueden usarse sólo a las dosis
apropiadas. Alternativamente, puede ser conveniente la
administración conjunta o la administración secuencial de otros
agentes.
La presente invención también tiene el objetivo
de proporcionar formulaciones tópicas, orales, sistémicas y
parentales farmacéuticamente apropiadas para uso en los nuevos
métodos de tratamiento de la presente invención. Las composiciones
que contienen compuestos identificados según esta invención como el
ingrediente activo pueden administrarse en una amplia variedad de
formas de dosificación terapéutica en vehículos convencionales de
administración. Por ejemplo, los compuestos pueden administrarse en
formas de dosificación oral tales como comprimidos, cápsulas
(incluyendo cada una formulaciones de liberación temporizada y
liberación sostenida), píldoras, polvos, gránulos, elixires,
tinturas, soluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones, o por
inyección. Asimismo, también pueden administrarse de forma
intravenosa (bolo e infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica
con o sin oclusión, o intramuscular, todas las formas usadas son
conocidas por los especiales en las técnicas farmacéuticas.
De forma ventajosa, los compuestos de la presente
invención puede administrarse en una dosis única diaria, o la
dosificación total diaria puede administrarse en dosis divididas en
dos, tres o cuatro veces diarias. Además, los compuestos de la
presente invención pueden administrarse de forma intranasal a través
del uso tópico de vehículos intranasales adecuados, o a través de
vías transdérmicas, usando aquellas formas de parches de piel
transdérmicos bien conocidas por los especialistas en esta técnica.
Para administrarse en forma de un sistema de libramiento, la
administración de la dosis será, por supuesto, continua mejor que de
forma intermitente durante todo el régimen de dosificación.
Para combinación de tratamiento con más de un
agente activo, donde los agentes activos están en formulaciones de
dosificación separadas, los agentes activos se administrarán
simultáneamente, o pueden administrarse cada uno separadamente a
tiempos escalonados.
Los regímenes de dosificación que utilizan los
compuestos de la presente invención se seleccionan de acuerdo con
diversos factores que incluyen tipo, especie, edad, peso, sexo y
condición médica del paciente; la severidad del estado que se va a
tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del
paciente; y el compuesto en particular empleado en éste. Un médico o
veterinario especialista puede fácilmente determinar y prescribir
la cantidad efectiva de la droga requerida para prevenir, mostrar o
parar el progreso del estado. La precisión óptima para conseguir
las concentraciones de fármaco en el intervalo que rinde eficacia
sin toxicidad requiere un régimen basado en la cinética de la
disponibilidad de fármaco para los sitios diana. Esto implica una
consideración de la distribución, equilibrio y eliminación de un
fármaco.
Las muestras biológicamente puras de S.
cerevisiae MY2095 (YFK007), S. cerevisiae MY2140
(R560-1C), S. cerevisiae MY2147
(YFK532-7C), S. cerevisiae MY2148 (YFK798),
S. cerevisiae MY2256 (YMO148, YFK0978), S. cerevisiae
MY2257 (YFK1088-23B), S. cerevisiae MY2258
(YFK1088-16D), S. cerevisiae MY2259
(YFK1087-20B), S. cerevisiae MY2260
(YFK1087-20A) y el ADN de los plásmidos pFF119 y
pFF334 se han depositado en la colección permanente de la American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para
definir más detalladamente la invención sin que, sin embargo,
limiten la invención a los detalles de estos ejemplos.
Las recetas de los medios usados en éste trabajo
incluyen, pero no de forma limitante las siguientes.
| Extracto de bacto-levadura | 10 g |
| Bacto-peptona | 20 g |
| Dextrosa | 20 g |
| Agua destilada hasta 1 litro | |
| Esterilizada por autoclavado |
Para medio YEPD sólido, añadir
Bacto-agar al 2% (20 gramos) antes de
autoclavar.
| Extracto de bacto-levadura | 10 g |
| Bacto-peptona | 20 g |
| Dextrosa | 20 g |
| Adenina sulfato | 60-80 mg |
| Agua destilada hasta 1 libro | |
| Esterilizada por autoclavado |
Para medio YPAD sólido, añadir
Bacto-agar al 2% (20 gramos) antes de
autoclavar.
Diluir 1 parte de CaCl_{2} 1 M estéril en 100
partes de YPAD.
YPAD con glicerol (20 g/litro) en lugar de
dextrosa
| Bacto-levadura nitrógeno base | 6,7 g |
| sin aminoácidos | |
| Dextrosa | 20 g |
| Polvo completo de aminoácido | 0,87 g |
| Agua destilada hasta 1 litro | |
| Esterilizada por autoclavado |
Para medio SC sólido, añadir
Bacto-agar al 2% (20 gramos) antes de
autoclavar.
| 0,8 g | Adenina |
| 0,8 | L-Arginina |
| 4,0 | L-Ácido aspártico |
| 0,8 | L-Histidina |
| 1,2 | L-Isoleucina |
| 2,4 | L-Leucina |
| 1,2 | L-Lisina |
| 0,8 | L-Metionina |
| 2,0 | L-Fenilalanina |
| 8,0 | L-Treonina |
| 0,8 | L-Triptófano |
| 1,2 | L-Tirosina |
| 0,8 | Uracilo |
| 6,0 | L-Valina |
Mezclar con un mortero.
Se preparan omitiendo uno o más compuestos del
polvo completo de aminoácido. Por ejemplo, el polvo exento de Trp es
idéntico al polvo completo de aminoácidos excepto que no se añade
L-triptófano.
Se prepara añadiendo FK506 al medio SC
autoclavado cuando se ha enfriado a 50-52ºC. El
medio se dispensa en placas de petri y se permite su solidificación.
El medio SC sólido que contiene L-733,560 se
prepara de una forma análoga.
| 0,87 g | polvo exento de Trp |
| 6,7 g | Levadura nitrógeno base sin aminoácidos |
| 20 g | dextrosa |
| 1000 ml | agua destilada hasta volumen |
Ajustar el pH a 5,8 con KOH 5M.
Las placas exentas de Trp se hacen con 20 g/l de
agar.
Esterilizar por autoclavado.
| 0,87 g | polvo exento de uracilo |
| 6,7 g | Levadura nitrógeno base sin aminoácidos |
| 20 g | dextrosa |
| 182 g | sorbitol |
| 1000 ml | agua destilada hasta volumen |
Ajustar el pH a 5,8 con KOH 5M.
Esterilizar por autoclavado.
Añadir 20 g/l de agar al medio exento de
uracilo/sorbitol antes del autoclavado.
Añadir 6 g/l de agar al medio exento
uracilo/sorbitol antes del autoclavado.
Como en exento de trp/dextrosa pero con 20 g/l de
glicerol sustituyendo a la dextrosa.
Se preparan esencialmente según los métodos
descritos en Maniatis (infra).
Las cepas y el ADN se aislaron y se manipularon
por procedimientos estándar (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T.
Maniatis, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, segunda edición,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
(1989); referido como Maniatis; y “Current Protocols in Molecular
Biology”, F.M. Ausubel et al., editores, John Wiley e hijos,
Nueva York (1987), referido como Current Protocols). Muchos de los
procedimientos de trabajo con S. cerevisiae se describen en
M.D. Rose, F. Winston, y P. Hieter, “Methods in Yeast Genetics: a
Laboratory Course Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), referido como MYG y en C.
Guthrie y G.R. Fink, editores, Methods in Enzymology, volumen
194: “Guide of Yeast Genetics and Molecular Biology”, Academic
Press, Inc., New York (1991), referido como GYG.
Lista de
cepas
| Nombre de la cepa | Propiedades relevantes | Nº. MY | ATCC |
| YFK005 | MATalfa FKS1 (wt) | MY2094 | 74059 |
| YFK007 | MATa FKS1 (wt) | MY2095 | 74060 |
| YFK093 | MATa FKS1 fkr3 (506^{R}) | MY2088 | 74055 |
| YFK132 | MATa fks1-1 (506^{s}) | ninguno | |
| YFK531-5A | MATalpha fks1-1 (506^{s}) | ninguno | |
| YFK532-7C | MATa fks1-1 (506^{s}) | MY2147 | |
| YFK532-10B | MATa fks1-1 (506^{s}) | ninguno | |
| YFK798 | MATa fks1-1/YEp-A2B | MY2148 | |
| YFF2409 | MATa fks1-5::HIS3 | ninguno | |
| YFF2411 | MATa fks1-6::HIS3 | ninguno | |
| W303-1A | MATa FKS1 (wt) | MY2141 | |
| W303-1B | MATalpha FKS1 (wt) | ninguno | |
| R560-1C | MATa fks1-2 (560^{R}) | MY2140 | |
| X2180-1A | MATa FKS1 (wt) | MY2136 | |
| MS10 | MATa fks1-3 (560^{R}) | MY2144 | |
| MS14 | MATa fks1-4 (560^{R}, nik^{S}) | MY2145 | |
| D1-22C | MATa fks1-4 (560^{R}, nik^{S}) | ninguno | |
| GG100-14D | MATalpha FKS1 (wt) | ninguno |
Plasmidos
| Plásmido | Descripción | Fuente del ADN clonado |
| pFF119 | FKS1 clonado en YCp50 | GRF88 |
| pJAM54 | FKS1 clonado en YEp24 | YFK093 |
| pMS10 | FKS1 clonado en YCp50 | GRF88 |
| pFF250 | Fragmento BglII-PstI de | YFK007 |
| FKS2 de 1,7 kb. | ||
| pFF334 | Fragmento EcoRI de | S288C |
| FKS2 de 10 kb. |
Cepas y plásmidos adicionales se muestran en las
figuras
Para cuantificar la sensibilidad de una cepa
particular de S. cerevisiae a un compuesto tal como FK506,
L-733,560 o nicomicina Z, se siguió el siguiente
procedimiento.
Día
1
Inocular la cepa(s) en 2 ml de medio SC o
medio SC sustituyendo si se requiere un polvo exento en particular
por un marcador auxótrofo (p.e., ura3, his4, etc.). Se crece
durante toda la noche a 30ºC con agitación suavemente.
Día
2
Subcultivar 20 mcL de cada cepa de toda la noche
en 2 ml de medio reciente; se incuba durante 4-6 h
a 30ºC.
Sembrar una placa de microtitulación de 96
pocillos de fondo plano de doce columnas estéril con 75 mcL de medio
SD o SD exento en las columnas 2 a 12. En la columna 1, se siembran
150 mcL del medio.
Disolver el fármaco de interés a 4X la
concentración deseada. Para L-733,560, se prepara
una solución de 64 mcg/ml en SD estéril. Alicuotar 75 mcL de la
suspensión de fármaco en la columna 3. Usando una pipeta automática
multicanal, transferir 75 mcL de la columna 3 a la columna 4,
pipetear arriba y abajo tres veces para mezclar, y entonces
transferir 75 mcL de la columna 4 a la columna 5. Repetir la
dilución seriada hasta que se alcanza la columna 12; después de
mezclar, desechar 75 mcL a la basura.
Marcar tubos estériles de 5 ml marcados con cada
cepa que se va a testar. Disponer alícuotas de 2 ml de los medios
apropiados en cada tubo. Leer la A_{600} de las cepas, y diluir
los cultivos de manera que la DO final será 0,0014. Por ejemplo, si
la A_{600} de una cepa es de 0,7041, subcultivar 4 mcL en 2ml de
los medios.
Inocular cada cepa en una fila determinada
añadiendo 75 mcL del inóculo en las columnas 2 a 12. No añadir
células en la columna 1, ya que la columna 1 es el blanco. La
columna 2 sirve como control sin fármaco o de crecimiento 100%.
Entonces, se incuban las placas durante toda la noche a 30ºC sin
agitación
Día
3
Tras aproximadamente 24 horas de incubación, la
placa se agita suavemente para resuspender las células y se lee la
absorbancia a longitud de onda de 600 nm.. El % de crecimiento del
control para cualquier pocillo determinado puede calcularse
dividiendo el valor de absorbancia de ese pocillo por el valor de la
columna 2 en la misma fila. Si se hace esto para cada columna, los
datos puede dibujarse como "porcentaje del crecimiento del
control" vs. "concentración de fármaco". La curva
dosis-respuesta resultante puede usarse para
comparar las sensibilidades al fármaco de varias cepas.
Se aisló S. cerevisiae YFK132 a partir de
la cepa S. cerevisiae YFK007 (tipo salvaje; MY2095; ATCC
74060) por procedimientos de mutagénesis estándar con etil metano
sulfonato (EMS) (Sherman et al., 1986 in "Laboratory course
manual for methods in yeast genetics", Cold Spring Harbor Press).
La cepa parental YFK007 es sensible a aproximadamente 50 mcg/ml de
FK506 y es insensible a 100 mcg/ml de CsA. La cepa mutante YFK132 es
hipersensible a FK506.
YFK007 se creció durante toda la noche en 25 ml
de YEPD a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación, y se
resuspendieron en 10 ml de tampón fosfato potásico 0,05 M (pH 7) a
una densidad de 3 x 10^{8} células/ml. La suspensión celular se
diluyó hasta 1,24 x 10^{8} células/ml y se dividió en dos
muestras.
A una muestra se le añadieron 0,588 ml de EMS (Nº
Cat. de Sigma M0880). Se añadió el mismo volumen de agua destilada a
la segunda muestra como control. Las suspensiones celulares tratadas
se incubaron a 25ºC. A varios tiempo, se tomaron muestras y se
añadieron a 8 ml de tiosulfato sódico al 5% para inactivar la
mutagénesis. Las células inactivadas se diluyeron en agua, se
dispusieron en placas de agar YEPD y se incubaron a 25ºC. Las
células de los cultivos tratados y no tratados con EMS se
extendieron en placas de YEPD a varias diluciones, y se contaron las
colonias para determinar la viabilidad celular tras la
mutagénesis.
Las placas de YEPD que contenían colonias
mutagenizadas se replicaron en placas de agar SC que contenían 0,1 ó
10 mcg/ml de FK506, y se incubaron a 25ºC. Se analizaron
aproximadamente 1.200 colonias. Tres cultivos que no crecieron en
medio SC + FK506 se identificaron y analizaron más
detalladamente.
Uno de estos cultivos, designado como YFK132,
mostraba fenotipo hipersensible a FK506 (sensible a 0,1 mcg/ml de
FK506), era sensible a 10 mcg/ml de CsA y era lento creciendo.
Para determinar si los fenotipos de YFK132 eran
el resultado de una única mutación, se llevaron a cabo análisis de
tétradas en cruces entre cepas mutantes y de tipo salvaje.
YFK132 se cruzó con la cepa YFK005 de tipo
salvaje y un segregante meiótico del diploide resultante se
retrocruzó dos veces con YFK007 para generar las cepas
YFK531-5A, YFK532-7C y
YFK532-10B. Los fenotipos de hipersensibilidad a
FK506 y crecimiento lento de YFK132 cosecregaron en todos los
cruces, indicando que estos fenotipos son el resultado de una
mutación en un único gen. YKF132 es un mutante
fks1-1 de YFK007.
La sensibilidad de YFK132 a la equinocandina
L-688,786 se determinó en un ensayo de difusión en
disco.
YFK132 y su parental (YFK007) se crecieron en 2,5
ml de medio SC líquido y se diluyeron hasta 6,25 x 10^{7}
células/ml con agua destilada. Se inoculó medio de cultivo SC
fundido que contenía agar al 2% (130 ml) con 4 ml de cultivo
diluido e inmediatamente se vertió en placas de bioensayo de 245 x
245 mm. Después de que el que medio solidificara, se pusieron en la
superficie del medio discos de filtro estériles que contenían FK506
(1, 10 y 50 mcg) o L-688,786 (1, 10 y 50 mcg) y se
incubaron a 28ºC. Después de 18 horas, se midieron las zonas de
inhibición de crecimiento.
Como se muestra en la siguiente tabla, YFK132 es
más sensible a L-688,786 que su cepa parental
(YFK007).
| Cantidad de L-688.786/disco (microgramos) | Tamaños de la zona (mm) | |
| YFK007 | YFK132 | |
| 1 | 0 | 8,4 |
| 10 | 8,7 | 16,8 |
| 50 | 8,7 | 18,0 |
El gen de la
1,3-beta-D-glucano
sintasa (FKS1) se clonó por complementación del fenotipo
hipersensible a FK506 de YFK532-10B (MATa,
ade2-101, his3-\Delta200,
leu2-\Delta1, lys2-801,
trp1-\Delta1, ura3-52, fks1 1).
El planteamiento general para clonación de genes por complementación
de fenotipos mutantes es esbozado por M.D. Rose y J. R. Broach (en
GYG, pp. 195-230).
La genoteca de ADN plasmídico se obtuvo a partir
de E. coli ATCC 37415. Esta genoteca fue creada por M.D. Rose
et al., (Gene, 60, 237-243, 1987),
insertando fragmentos Sau3AI parcialmente digeridos de 10 a 20 kb
del ADN genómico de levadura a partir de la cepa GRF88 en el vector
de transporte de levadura YCp50.
Las células de YFK532-10B se
prepararon para transformación por electroporación, esencialmente
como describen D.M. Becker y L. Guarente, (en Guthrie y Fink,
supra, pp. 182.187). Las células destinatarias se crecieron
en placas de agar que contenía medio YPAG complementado con adenina
sulfato al 0,004%. Las células de una zona de crecimiento completo
(1 mm x 5 mm) se inocularon en 50 ml de medio
YPAD-25C (YPAD complementado con CaCl_{2} 25 mM)
en un matraz Erlenmeyer y se incubaron a 30ºC en un agitador
rotatorio (225 rpm, 2'' amplitud orbital). El cultivo se creció
hasta una densidad óptica de 1,3 a 600 nm y se transfirió a tubos
de centrífuga de polipropileno desechables de 50 ml estériles. Las
células se recogieron por centrifugación a 3.500 rpm durante 5 min
a 4ºC en una centrífuga refrigerada Sorvall RT6000. El sedimento
celular se resuspendió con 25 ml de agua estéril enfriada en hielo
por agitación a velocidad máxima, se recogieron con centrifugación
y se lavaron otra vez con 25 ml de agua estéril enfriada en hielo.
El sedimento celular se resuspendió con 10 ml de sorbitol 1 M
estéril enfriado en hielo. La suspensión celular lavada se
transfirió a un tubo de centrífuga de polipropileno desechable de
10 ml estéril, y las células se recogieron por centrifugación a
3.500 rpm durante 10 min a 4ºC. El sedimento celular se resuspendió
con 0,1 ml de sorbitol 1 M estéril enfriado en hielo.
Una porción (50 mcL) de la suspensión celular
lavada se transfirió a un tubo de microfuga estéril. Una alícuota (1
mcL conteniendo ca. 500 ng) de la genoteca de ADN plasmídico
(Banco A) se añadió a las células, se mezcló suavemente, y se incubó
en hielo durante aproximadamente 5 min. La suspensión celular se
transfirió a cubetas de electroporación estériles frías de 0,2 cm y
se pulsaron a 1,5 kV, 25 \muF, 200 ohm (BioRad Gene Pulser con
controlador de pulso). Inmediatamente se añadieron 3 ml de sorbitol
1M estéril enfriado en hielo y se mezcló suavemente.
Se transfirieron quince alícuotas (0,2 ml) a
tubos de cultivo estériles. Se añadió a cada tubo agar blando exento
de uracil/sorbitol (3,5 ml) que contenía sorbitol 1 M en agar blando
(0,6%) a 46ºC para formar una mezcla, y cada mezcla se vertió sobre
una plata de agar al 2% hecha con el mismo medio que contiene
sorbitol, obteniéndose un total de quince placas. El procedimiento
se repitió hasta que se obtuvieron 210 placas.
Las placas se incubaron a 30ºC. Tras 24 hr, cada
placa se cubrió con 3 ml de agar blando exento de uracilo/sorbitol
que contenía 1 mcg/ml de FK506 (se añadió una solución de reserva de
5 mg/ml de FK506 en etanol al medio autoclavado que se había
enfriado a 55ºC). Las placas se incubaron a 30ºC durante 6 días
mas. Las células de las colonias transformantes se purificaron
rallando colonias sencillas de las placas de agar que contenía medio
exento de uracilo complementado con 0,1 mcg/ml de FK506.
\newpage
Las colonias de transformantes purificados se
inocularon en 1,5 ml de medio exento de uracilo en tubos de cultivo
de 16 mm y se incubaron en un rotatubos a 30ºC durante dos días. El
ADN plasmídico se preparó básicamente como describen J.N. Strathern
y D.R. Higgins (en Guthrie y Fink, supra, pp.
319-329) de acuerdo con el método 1 y se
transformaron en la cepa DH11S competente de E. coli
(Bethesda Research Laboratories). El ADN plasmídico se preparó a
partir de E. coli resistente a ampicilina usando el
procedimiento QIAGEN-tip 500 (QIAGEN Inc.,
Chatsworth, CA). El plásmido resultante se designó como PFF119.
La capacidad de pFF119 para complementar la
mutación fks1-1 se confirmó por curación espontánea
del plásmido en el transformante original. La curación reestablece
el fenotipo de hipersensibilidad a FK506. La retransformación con
pFF119 reestablece la resistencia a FK506.
pFF119 se digirió con varias combinaciones de
endonucleasas de restricción y se analizó por electroforesis en gel
de agarosa. Los resultados muestran que pFF119 contiene una
inserción de aproximadamente 15 kb de ADN.
Un fragmento SphI de 11 kb procedente de la
región de 15 kb se transfirió al sitio SphI del plásmido YCplac33
[R.D. Gietz y A. Sugino, Gene,
74:527-534 (1988)] en ambas orientaciones
dando los plásmidos pFF133 y pFF135. Estos plásmidos también fueron
capaces de complementar el fenotipo de hipersensibilidad a FK506 de
la mutación fks1-1.
Se crearon subclones anidados del ADN clonado
linearizando pFF133 y pFF135 con BamHI, digiriendo parcialmente con
Sau3AI, y recircularizando las moléculas con ADN ligasa. Sólo dos de
los subclones (pFF172 y pFF173) fueron capaces de complementar
fks1-1. De este modo, la complementación del ADN se
localizó en una región con un mínimo de 6,0 kb y un máximo de 7,8 kb
de ADN, entre el primer sitio SphI y el segundo sitio BglII.
Se creó un alelo de
inserción-deleción del ADN que complementa
fks1-1 de la siguiente manera. El fragmento
SphI-PstI de pFF133 de 8,8 kb se insertó entre los
sitios SphI y PstI del policonector del vector de E. coli
pGEM-5Zf(+) (Promega, Madison, WI) dando el plásmido
pFF174. El fragmento BamHI- XhoI HIS3 de 1,3 kb del plásmido pJJ215
(J.S. Jones y L. Prakash, Yeast,
6:363-366 (1990)) se insertó por ligación de
extremos romos (véase Current Protocols, p. 3.5.10) entre
los dos sitios KpnI del plásmido pFF174 dando los plásmidos pFF186
(orientación sentido) y pFF187 (orientación antisentido). Los
fragmentos de inserción-deleción de 6,6 kb se
escindieron por digestión con SstI + SphI y se purificaron por
electroforesis en gel de agarosa. La mutación por
inserción-deleción se creó por sustitución génica en
una sola etapa (véase R. Rothstein, GYG, pp.
281-301). Esta interrupción se confirmó por análisis
de hibridación de la transferencia Southern del ADN genómico
digerido con PstI y sondeado con el fragmento
SphI-PstI de 8,8 kb a partir del plásmido pFF174.
Los parentales no interrumpidos dan un fragmento genómico único de
9,8 kb que hibrida con la sonda. Un mutante interrumpido en el que
se inserta HIS3 en la orientación sentido, por ejemplo YFF2409, da
fragmentos de 3,9 y 3,7 kb, mientras que un mutante interrumpido
antisentido, por ejemplo YFF2411, da fragmentos de 4,9 y 2,7 kb.
Una cepa haploide con el alelo inserción-deleción
tiene fenotipos básicamente idénticos a un fks1-1
mutante: es de crecimiento lento, hipersensible a FK506 e
hipersensible a L-7233,560. Los diploides creados
cruzando haploides de inserción-deleción con
haploides fks1-1 son de crecimiento lento e
hipersensible a FK506 mostrando que la mutación de
inserción-deleción no complementan la mutación
fks1-1.
Estos resultados prueban que los dos alelos son
del mismos gen y que pFF119 porta el gen FKS1. Por tanto, las
mutaciones de inserción-deleción se refieren como
fks1-5::HIS3 y fks1-6::HIS3.
El análisis de hibridación de Southern del ADN
genómico aislado a partir de varias cepas de S. cerevisiae y
digeridas con diferentes enzimas de restricción revela que algunas
cepas tienen una variante de FKS1 que tienen un mapa de restricción
que difiere ligeramente del gen de GRF88. Las cepas con genes FKS1
con mapas de restricción similares al de GRF88 (G.R. Fink) incluyen
SC347 (J. Hopper), W303-1B (R. Rothsetin), S288C
(R.K. Mortimer) y A384A (L. Hartwell). Las cepas con uno como
YFK007 incluyen YPH1 (Phil Hieter), YFK005, YFK093, DS94 (E. Craig)
y DS95 (E. Craig).
Un fragmento genómico PstI de 2,5 kb que hibrida
de forma cruzada con la sonda FKS1 se detectó en transferencias
Southern del ADN genómico a partir de S. cerevisiae. Este
fragmento no derivaba de la región FKS1 del genoma. Cuando se
digirió el ADN genómico con BglII + PstI, el fragmento tenía un
tamaño de 1,7 kb. El ADN genómico se aisló a partir de la cepa
YFK007, se digirió con BglII + PstI, y se fraccionó en un gel de
agarosa. La región del gel que contenía el fragmento que hibridaba
de forma cruzada se escindió, y el ADN se aisló usando el
procedimiento de extracción QIAEX (QIAGEN Inc.). El ADN extraído
se insertó entre los sitios para BamHI y PstI en el policonector del
plásmido pGEM-3Zf(+), y el ADN ligado se transformó
en la cepa DH11S (Bethesda Research Laboratories). Los
transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron sobre la
base de la presencia de ADN que hibridaba de forma cruzada por
hibridación de colonia (Maniatis, supra). El ADN plasmídico
se aisló a partir de los clones positivos y se digirió con KpnI +
PstI. KpnI se usó en lugar de BglII, puesto que el sitio BglII se
perdió durante la ligación con el vector. La presencia de un
fragmento de 1,7 kb que hibrida de forma cruzada con la sonda FKS1
se confirmó por análisis de hibridación de la transferencia
Southern. El plásmido resultante se denominó pFF250.
El fragmento de 1,7 kb se usó para analizar una
genoteca lambda (Stratagene, nº. cat. 951901) del ADN genómico de
levadura de la cepa S288C por hibridación en placa (Maniatis,
supra). El ADN se aisló a partir de clones positivos, se
digirió con varios enzimas de restricción, y se analizaron los
fragmentos de hibridación por hibridación de transferencia Southern.
Se clonó un fragmento de EcoRI de 10 kb que lleva la región de
hibridación en el sitio de EcoRI de pBluescript II KS(+)
(Stratagene) en ambas orientaciones dando los plásmidos pFF334 y
pFF336.
Se creó una mutación de
inserción-deleción del ADN
BglII-PstI de 1,7 kb por inserción del fragmento
PstI TRP1 de 0,8 kb de pJJ246 ( J.S. Jones y L. Parakash,
Yeast, 6:363-366 (1990)) entre los sitios
AflII y BbsI por ligación de extremos romos. El fragmento de
interrupción de 2,1 kb se escindió con PstI + KpnI. La mutación de
inserción-deleción se insertó por sustitución
génica en una etapa en el cromosoma de un diploide heterozigótico
fks1-5::HIS3/+ y homocigótico trp1/trp1. El ADN
genómico de los transformantes Trp^{+} se digirió con BglII +
HindIII + PstI. El locus no interrumpido da un fragmento de
hibridación de 1,7 kb, mientras que la mutación de
inserción-deleción da fragmentos de 1,4 y 0,7
kb.
Se hizo esporular un transformante heterocigótico
en el locus de la mutación de inserción-deleción y
se analizó minuciosamente en YPAD. Las esporas Trp^{+} His^{-}
eran viables. Sin embargo, las esporas Trp^{+} His^{+} eran
inviables. De este modo, la mutación de
inserción-deleción define un nuevo locus FKS2, y la
mutación de inserción-deleción de este locus
(fks2::TRP1) es sintéticamente letal con
fks1-5::HIS3. Estos resultados se interpretan como
que los productos de FKS1 y FKS2 tienen funciones coincidentes y
que cuando la función de alguno se inactiva, a través de
interrupción genética o por inhibición de sus productos génicos con
L-733.560, las células no son viables.
Se construyó una genoteca de ADN genómico que
contiene el gen FKS1 en el plásmido YEp24 por métodos estándar (Rose
y Broach, 1991, Methods in Enzymology,
194:195-230).
El ADN genómico de alto peso molecular se preparó
a partir de la cepa de levadura YFK093 (MY2088, ATCC 74055),
parcialmente digerido con Sau3AI y fraccionada por tamaño sobre un
gradiente de sacarosa. Una fracción de ADN digerido con Sau3AI que
oscilaba entre 10-15 kb se llenó parcialmente con el
fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, usando dATP y dGTP.
El vector multicopia (Yep24) se digirió con SalI
y se llenó parcialmente con el fragmento klenow de la ADN polimerasa
I usando dCTP y dTTP. Tras las reacciones de relleno, los ADN se
extrajeron con fenol una vez y se precipitaron con etanol. Los ADN
genómicos parcialmente rellenos y los vectores se ligaron y
transformaron en células HB101 por selección por resistencia a
ampicilina.
Se generaron dos genotecas independientes
juntando clones generados en transformaciones separadas. Una
genoteca contenía ca. 34.100 transformantes mientras que la
segunda genoteca contenía ca. 15.000 transformantes. Se
calculó por digestiones con enzimas de restricción que la frecuencia
de recombinantes en estas genotecas era de \sim95%.
La cepa W303-1A se transformó por
el método del esferoplasto (MYG) con genotecas genómicas de
levadura obtenidas a partir de D. Botstein (1982, Cell,
28:145-154). Los transformantes seleccionados
de medio exento uracilo se juntaron y conservaron a -80ºC en
glicerol al 20%. Tras determinar el título (unidades formadoras de
colonias (CFU)/ml), se extendieron alícuotas de las reservas a
\approx 5 x 10^{3} CFU por placa en medio exento de uracilo que
contenía la equinocandina semisintética L-733,560 a
0,5 mcg/ml ó 1,25 mcg/ml. Esta concentración de
L-733,560 es suficiente para seleccionar clones
resistentes. Se aislaron veintisiete colonias resistentes al
fármaco. El fenotipo de resistencia de estos clones se cuantificó
en un ensayo MIC líquido. Brevemente, L-733,560 se
diluyó de forma seriada a través de los pocillos de una placa de
microtitulación estéril de manera que la concentración en cada fila
oscila de 16 a 0,03 mcg/ml con incremento de 2 veces después de que
se añadió un volumen igual de una suspensión celular en medio
líquido exento de uracilo. Tras 24 h a 30ºC, las placas se leyeron
en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm, y se
calculó el porcentaje de crecimiento del control en cada pocillo
(relativo a un pocillo control sin fármaco). El resultado de la
curva dosis-respuesta se usó para determinar la
resistencia relativa a la cepa parental. Un clon fue de
16-32 veces más resistente que la cepa parental; los
otros fueron de 2 a 4 veces más resistentes. El clon más
resistente, R560-1 se caracterizó más
detalladamente.
Puesto que estas cepa se aisló como una forma
transformante a partir de la genoteca genómica, era de esperar que
la resistencia se debería al gen residente del plásmido contenido en
R560-1. Para probar esto, la cepa se curó del
plásmido por selección con el método del ácido
5-fluoroorótico (MYG). La pérdida del
plásmido y de su gen residente URA3 hace a las células resistentes
al ácido 5-fluoroorótico, y la auxotrofía a uracilo
se confirmó por la ausencia de crecimiento en medio exento de
uracilo. Sorprendentemente, la resistencia al fármaco del derivado
curado (R560-1C) no había cambiado por la pérdida
del plásmido. Estos resultados sugieren que R560-1C
es un mutante espontáneo resistente a equinocandina de la cepa
W303-1A. R560-1C fue tratado con
otros inhibidores de la beta-glucano sintasa tales
como L-688,786, L-646,991
(cilofungina) y L-687,781 (papulacandina) en un
ensayo de MIC líquido. Los resultados ilustran que el fenotipo de
resistencia no es específico para L-733,560 sino
que también incluye a inhibidores de la síntesis de
1,3-beta D beta -glucano estructuralmente
relacionados y no relacionados. Para determina si los fenotipos de
R560-1C eran el resultado de una mutación única, se
llevaron a cabo análisis de tétradas en diploides formados por
cruce de cepas de mutante y de tipo salvaje.
R560-1C se emparejó con la cepa de tipo salvaje
W303-1B, se hizo esporular, se analizó
minuciosamente y se cuantificó la sensibilidad a
L-733,560 por el ensayo MIC líquido. La resistencia
a fármacos segregaba 2:2 en estas tétradas, probando que la
resistencia se debe a una mutación en un único gen. Esta mutación se
denominó fks1-2.
Usando la información del análisis genético de
R560-1C, se ideó un método de selección para clonar
el alelo de tipo salvaje de fks1-2. Cuando
R560-1c se emparejó con la cepa de tipo salvaje
W303-1B, los diploides heterocigóticos resultantes
fueron de sensibilidad intermedia a L-733,560, lo
que sugería que una única copia del gen FKS1 de tipo salvaje haría
al mutante más sensible a las equinocandinas. Por clonación de una
genoteca de ADN de S. cerevisiae en R560-1C,
se pueden seleccionar transformantes de sensibilidad intermedia a
L-733,560dependiente de plásmido. Los métodos de
microdilución del medio y replica de placas discriminan entre
diploides heterocigóticos y R560-1C a 4 mcg/ml de
L-733,560.
La genoteca genómica total de S.
cerevisiae del ejemplo 9 se transformó en S. cerevisiae
R560-1C por el método del esferoplasto (Maniatis,
supra). Se seleccionaron los clones Ura^{+} en medio exento
de uracilo, se rasparon de las placas, juntaron y conservaron
congelados a -80ºC en glicerol al 20%. Las alícuotas de la genoteca
se dispusieron en placas de medio exento de uracilo a
200-300 CFU/placa. Tras la incubación a 30ºC durante
24 h, las colonias de cada placa se replicaron en: 1) placas de
medio exento de uracilo complementado con 4 mcg/ml de
L-733,560, y 2) placas de medio exento de uracilo.
Los clones probables se identificaron por crecimiento pobre en las
placa complementado con el fármaco y crecimiento fuerte en las
placas libres de fármaco. Se usaron tres pruebas adicionales para
establecer qué clones potenciales eran realmente sensibles al
fármaco. En una prueba, los clones probables se inocularon en medio
líquido exento de uracilo en placas de microtitulación y se
crecieron durante 24 h a 30ºC. Usando un inoculador de Dynatech,
se inocularon células de cada pocillo en: 1) medio exento de uracilo
complementado con 4 mcg/ml de L-733,560; y 2) medio
exento de uracilo. El crecimiento se cuantificó
espectrofotométricamente., y el crecimiento pobre en el medio
complementado con fármaco se contabilizó como positivo. En una
segunda prueba de resistencia al fármaco, las colonias se pusieron
directamente en placas de medio exento de uracilo complementado con
4 mcg/ml de L-733,560 y se contabilizó el
crecimiento lento tras 24 h a 30ºC. En la tercera prueba, los
clones probables se pusieron directamente en placas de medio exento
de uracilo, se crecieron durante 24 h a 30ºC, luego se replicaron
en placas con medio exento de uracilo complementadas con 10 mcg/ml
de L-733,560. El crecimiento se contabilizó tras 24
h a 30ºC.
Nueve clones probables fueron positivos en todos
los ensayos de sensibilidad intermedia al fármaco. Una cepa (S277)
fue casi tan sensible a L-733,560 como la cepa de
tipo salvaje. Para cuantificar la sensibilidad al fármaco del clon
S277, se llevó a cabo un ensayo MIC líquido. El clon resistente al
fármaco (S277) fue significativamente más sensible que el mutante
(R560-1C), y casi tan sensible como la cepa de tipo
salvaje (W303-1A). Para verificar que la
sensibilidad mediada por fármaco de S277 se debía al gen clonado que
contenía, el plásmido se curó por el método del ácido
5-fluoroorótico. Un ensayo MIC reveló que la
pérdida del plásmido tenía como resultado la inversión de la
sensibilidad intermedia a L-733,560, de modo que el
clon curado del plásmido era tan resistente al fármaco como el
mutante resistente salvaje (R560-1C). Finalmente,
la retransformación de R560-1C con el ADN
plasmídico aislado de S277 rindió clones Ura^{+} que eran
idénticos al clon original sensible al fármaco (S277) en sus
sensibilidad intermedia a L-733,560.
El ADN plasmídico se aisló a partir del clon
sensible al fármaco (S277) y se transformó en E. coli por los
métodos descritos en Maniatis. Se aislaron dos plásmidos con
inserciones de tamaño diferente en se caracterizaron por mapeo con
endonucleasas de restricción; uno (pJAM53) tenía una inserción de 14
kb, y el segundo (pJAM54) tenía una inserción de 8 kb. El mapeo de
restricción ilustró que la inserción en pJAM54 estaba contenida
completamente en el fragmento de 14 kb de pJAM53. Ambos plásmidos
conferían sensibilidad intermedia a L-733,560, como
se juzgó en ensayos de MIC líquido, cuando se introdujeron por
transformación en la cepa R560-1C.
Clones de fagos individuales que contienen los
genes de la calcineurina se identificaron a partir de una genoteca
de ADN genómico de levadura de la cepa S288C en
lambda-DASH (Stratagene, nº. cat. 943901) por
hibridación con sondas sintetizadas a partir del ADN genómico de
levadura por PCR (Foor et al., Nature,
360;682-684 (1992)). Los genes CNA2 y CNB1 se
mapearon para los fragmentos de ADN BglII de 4,3 kb y EcoRV de 1,3
kb en los clones de fago aislados, respectivamente. El fragmento
CNB1 se insertó en el sitio SmaI de pBluescript II KS(+) en la
orientación lacZ y se transfirió como un fragmento
BamHI-EcoRI al vector transportador multicopia
seleccionable por TRP1 de levadura YEplac112 (Gietz & Sugino,
1988, supra), dando el plásmido YEp-B. El
fragmento CNA2 se insertó en el sitio BamHI de YEp-B
dando YEp-A2-B. Este plásmido se
transformó por electroporación en la cepa fks1-1
YFK531-5A dando la cepa YFK798.
La cepa YFK532-7C, un mutante
fks1-1, es al menos mil veces más sensible a FK506 y
CsA (conocidos inhibidores de la calcineurina) que la cepa YFK007,
una cepa FKS1 de tipo salvaje. YFK007 y YFK532-7C
pueden usarse para seleccionar inhibidores de calcineurina.
La cepa YFK532-7C también es
8-10 veces más sensible que la cepa YFK007 a los
inhibidores de la glucano sintasa de las clases equinocandinas y
papulacandinas. Por tanto, estas cepas pueden usarse para
seleccionar inhibidores de la glucano sintasa.
Se idearon cepa indicadoras de selección para
identificar inhibidores de la calcineurina. Las sobreexpresión de
calcineurina de levadura en el mutante fks1-1 (cepa
YFK798) constituye la más general de estas. Cualquier inhibidor
dirigido hacia calcineurina muestra reducción del diámetro de zona o
un descenso en la zona de claridad (algunas veces ambos). Los
inhibidores de glucano sintasa no muestran ningún efecto y por
tanto puede distinguirse de los inhibidores de calcineurina.
Para identificar positivamente los inhibidores de
la glucano sintasa, se instituyó un método de selección con la cepa
R560-1C y su parental W303-1A de
forma idéntica al descrito para los inhibidores de calcineurina. La
pérdida completa de zona, o una marcada reducción de tamaño, en
R560-1C frente a W303-1A indica un
inhibidor de la glucano sintasa. No se ven zonas con los inhibidores
de calcineurina usando este par de cepas.
La selección inicial consiste en una
determinación del tamaño de la zona diferencial en dos placas
comparando la sensibilidad del mutante fks1-1 de
levadura (YFK532-7C, hipersensible a FK506 y CsA)
con la cepa de FKS1 de tipo salvaje (YFK007). Cada cepa se crece a
28º-30ºC en medio YPAD/CaCl_{2} 10 mM con agitación a 220 rpm
(hasta fase log media o tardía). Los cultivos se diluyen 1:10 con
agua, y se miden los valores de DO a 600 nm (contra un blanco de
YPAD/CaCl_{2} 10 mM diluido de forma similar 1:10 con agua). El
valor de DO se multiplica por 10 para estimar la DO del cultivo.
Porciones (100 ml) de medio YPAD/CaCl_{2} 10 mM que contiene agar
al 1,5%, equilibrados a 45ºC en un baño de agua, se siembran con
cultivo de forma que la densidad final de células en el agar tuviera
un valor de DO de 0,015 (es decir, 3 x 10^{6} cfu/ml; una muestra
del cálculo se proporciona a continuación). El agar sembrado se
vierte en placas Nunc de 500 cm^{2}. Una vez que las placas de
agar han solidificado, alícuotas de 10 mcL de muestras que
contienen los compuestos probados, como los extractos de
fermentación, se disuelven en agua, metanol o etanol al 100%, o
hasta 50% de DMSO y se sitúan en cada miembro del conjunto de dos
placas en matrices 11 por 8.
Las placas se incubaron durante 48 h a
28-30ºC. Los diámetros de las zonas se leen en los
bordes más externos y se recogen en mm. La claridad de la zona se
anota como clara (sin designación), turbia (h), o muy turbia (vh).
Las zonas muy turbias se ven mejor observando la placa bajo una luz
elevada situada entre el disco del ensayo y un muro oscuro.
1. L-679,934 (FK506) disuelto en
metanol.
2. L-644,588 (ciclosporina A)
(Sandimmune) se vende en vehículo Cremaphor a una concentración de
100 mg/ml. Las diluciones pueden hacerse en metanol al 50% o etanol
al 50% mezclando de forma vigorosa en cada etapa. El cremaphor se
mantiene turbio en estas diluciones pero la ciclosporina esta
biodisponible.
3. L-733,560 disuelto en
metanol.
4. L-678,781
(di-hidropapulacandina) disuelto en metanol.
5. L-636,947 (aculeacina)
disuelto en metanol.
Almacenar todos los patrones a -20ºC.
Los cultivos de levadura durante toda la noche
tendrán valores de DO que oscilaran de 7 a 10 (es decir, 0,7 a 1,0
para las diluciones 1:10). Un cultivo con una DO de 8,9 se diluye
1:593 para obtener una suspensión con una DO de 0,015. Por tanto,
una porción de 100 ml de agar YPAD/CaCl_{2} 10 mM podría
inocularse con 169 ml de cultivo.
Primera
selección
| Controles | Tamaño de la zona (mm) | ||
| YFK007 | YFK532-7C | YFK798 | |
| (tipo salvaje) | (fks1-1) | (fks1-1 + CN) | |
| 20 ng FK506 | ninguno | 15-17 | halos vh 13 |
| 10 mcg CsA | ninguno | 18-20 | halos vh 15 |
| 10 mcg L733,560 | 16-18 | 22-24 | 22-24 |
| 20 mcg aculeacina | 22-24 | 27-30 | 27-30 |
| 20 mcg papulacandina | 20-22 | 26-28 | 26-28 |
Segunda
selección
| Controles | Tamaño de la zona (mm) | |
| W303-1ª | R560-1C | |
| 20 ng FK506 | ninguno | ninguno |
| 10 mcg CsA | ninguno | ninguno |
| 10 mcg L733,560 | 16-18 | 8 vh |
| 20 mcg aculeacina | 18-22 | 17-20 |
| 20 mcg papulacandina | 15-18 | 14-16 |
Una zona al menos 2 mm mayor en
YFK532-7C que en YFK007 indica la presencia de un
inhibidor de la calcineurina o de la glucano sintasa.
Una zona que se reduce o enturbia en YFK798
comparada con la vista en YFK532-7C indica que el
desconocido es un inhibidor de calcineurina.
Una zona que se reduce en R560-1C
comparada con W303-1A indica que está presente un
inhibidor de la glucano sintasa.
Los extractos libres de células se prepararon a
partir de células mutantes y de tipo salvaje crecidas hasta fase
logarítmica como se ha descrito previamente (Kang y Cabid,
PNAS, 83:5808-5812, 1986). Tras la
homogeneización con partículas de vidrio, las células no rotas y los
restos se eliminaron por centrifugación a baja velocidad (1.000 x g
durante 5 min). Los fluidos sobrenadantes se centrifugaron a
100.000 x g durante 60 min y los sedimentos se lavaron con 2,5 ml
(por gramo de células húmedas) de tampón que contenía fosfato
potásico 0,05 M (pH 7,5), DTT 0,5 mM y PMSF 1,0 mM. El sedimento
lavado se resuspendió en el mismo tampón conteniendo glicerol al 5%.
Este sirve como fuente de membranas microsomales que contienen las
actividades enzimáticas de quitina y glucano sintasa. La reacción
estándar de 1,3-beta-D glucano
sintasa se inició mezclando 35 mcg de proteína en el cocktail I, que
incluye tampón TEK (Tris cloruro 125 mM, pH 7,5, KF 31 mM y EDTA 1
mM), PBS al 25%, pH 7,0, GTP-gamma-S
3,31 mcM y BSA al 0,25% en un volumen total de 69 mcL, con el
cocktail II, que incluye 4 unidades de alfa-amilasa,
25 mcg de UDP-glucosa y 1 microCi de
UDP-^{3}H-glucosa, en un volumen
total de 11 mcL. Después de 150 minutos de incubación a 30ºC, se
midió la incorporación de
UDP-^{14}C-glucosa en glucano tras
la precipitación con ácido tricloroacético.
Se activaron con tripsina 125 mcg los extractos
anteriores y se mezclaron con un volumen igual (50 mcL) de cocktail
de reacción de la quitina sintasa, que incluyen Tris 0,5 M, pH 7,5,
MgCl 40 mM, GlcNAc 320 microM, mezcla sustrato
^{14}C-UDP-GlcNAc y digitonina al
0,8%. Tras 30 minutos de incubación a 30ºC, la
^{14}C-glucosa incorporada se precipitó con ácido
tricloroacético al 10%, se recogió en discos de microfibras de
vidrio GF/A de Whatman y se contó.
MS10 y MS14, se aislaron como mutantes
resistentes a la equinocandina en dos experimentos diferentes.
En el primer experimento, aproximadamente 45 mcg
(40 mcL de solución 1,12 mcg/ml) de la equinocandina semisintética
L-733,560 se extendieron sobre la superficie de cada
una de las cuatro placas que contenían medio sólido YNBD (el medio
YNBD es el mismo que el medio SC pero sin aminoácidos). Se permitió
que la solución se secara al aire antes de que se pusieran en cada
placa 1 x10^{6} células de la cepa X2180-1A de
S. cerevisiae crecidas recientemente durante toda la noche
en medio YNBD. Tras el crecimiento a 28ºC durante cuatro días, se
picaron como mutantes resistentes a equinocandina tres colonias
capaces de crecer en presencia de L-733,560. Uno de
estos mutantes se designó como MS14.
El segundo experimento se llevó a cabo como se ha
descrito anteriormente con las modificaciones siguientes: La
concentración del L-833,560 usada fue de
aproximadamente 22,5 mcg/placa. El inhibidor se añadió a 20 ml de
medios YNBD que se habían fundido y luego enfriado a 50ºC. Se
prepararon cuatro placas; entonces se extendieron sobre la
superficie de cada placa 1 x 10^{6} células de la cepa
X2180-1A de S. cerevisiae. Tras el
crecimiento a 28ºC durante 4 días, se aislaron 12 colonias
resistentes. Uno de estos mutantes se designó como MS10.
Basándose en estos experimentos la frecuencia de
mutación del mutante MS14 es de 1,3x10^{-6}, mientras que la
frecuencia de mutación del mutante MS10 es de 3x10^{-6}.
MS10 y MS14 no exhibieron resistencia múltiple a
fármacos cuando se testaron contra un panel de más de 30 inhibidores
que afectaban a la síntesis de la pared celular, membrana, esterol
y proteína. Las células de las cepas de levadura MY2144 y MY2145 que
portaban las mutaciones respectivas MS10 y MS14 se crecieron durante
toda la noche en medios YPAD y SC. A partir de los cultivos durante
toda la noche, las células se diluyeron 1:10 en los mismos medios y
se permitió crecimiento adicional durante 4-6 horas.
Las pruebas de resistencia/sensibilidad a fármacos se llevaron a
cabo por el ensayo de difusión en disco en placas que contenían 20
ml de medios sólidos YPAD o SC y 3 x 10^{6} células. Las células
se añadieron a medios prefundidos que se enfriaron hasta 50ºC antes
de verterlos en las placas. Los discos de filtro estériles que
conteniendo los diferentes fármacos se situaron en la superficie de
las placas seguido de incubación a 28ºC durante 1-2
días. Los tamaños de las zonas de inhibición de crecimiento se
midieron como indicación de resistencia/sensibilidad relativa al
fármaco. El mutante MS14 es muy sensible al inhibidor de la
síntesis de quitina nicomicina Z y resistente a la equinocandina
L-377,560.
Las relaciones de dominancia/recesividad de las
mutaciones en MS10 y MS14 se determinaron comparando el fenotipo de
resistencia a fármaco de células haploides y diploides usando los
ensayos de difusión en disco y de microdilución del medio. Los
resultados de estos ensayos muestran que la supersensibilidad a
nicomicina Z de las células MS14 es recesiva mientras que el
fenotipo de resistencia a equinocandina es semidominante. Por el
contrario, el fenotipo de resistencia a equinocandina de las
células MS10 es dominante.
Los datos de la tabla siguiente son la
concentración mínima de varios fármacos requerida para inhibir el
crecimiento de cada mutante y su parental
X2180-1A.
| MIC | |||
| Cepa | L-733,560 | Papulacandina | Nicomicina Z |
| (\muM) | (mcg/ml) | (mcg/ml) | |
| X12180-1A | 0,045 | 5,5 | >100 |
| MY2144 (fks 1-3) | 0,75 | 15 | >100 |
| MY2145 | 2,0 | 5,5 | 0,2 |
Se probaron las actividades de síntesis de
glucano y quitina en las preparaciones de crudo enzimático asociadas
con las membranas celulares. La sensibilidad del mutante de
1,3-beta-D-glucano
sintasa a L-733,560 y papulacandina se probó junto
con la sensibilidad de las sintasas de quitina a nicomicina Z.
Los resultados de estos experimentos revelaron
que MS10 y MS14 tienen niveles normales de
1,3,-beta-D glucano sintasa que son altamente
resistentes a L-733,560 pero sólo marginalmente
resistentes a la papulacandina. La quitina sintasa no se ve afectada
en su sensibilidad por nicomicina Z. Los datos de la tabla siguiente
muestran los IC_{50} para los inhibidores de la glucano sintasa
(L-733,560 y papulacandina) y para el inhibidor de
la quitina sintasa (nicomicina Z) en ensayos de
1,3-beta-D glucano sintasa y quitina
sintasa, respectivamente. Se usaron cantidades iguales de proteínas
de membrana para cebar cada reacción.
| IC_{50} | |||
| Cepa | L-733,560 | Papulacandina | Nicomicina Z |
| (\muM) | (mcg/ml) | (mcg/ml) | |
| X12180-1A | 6,1 | 5,08 | 0,74 |
| MY2144 (fks 1-3) | 38,0 | 11,1 | 0,60 |
| MY2145 (fks 1-4) | 65,0 | 11,5 | 0,64 |
Se realizó un cruce genético entre MS14
(equinocandina-resistente y nicomicina
Z-sensible) y la cepa de tipo salvaje
GG100-14D (equinocandina-sensible y
nicomicina Z-resistente). Se hicieron esporular las
células diploides resultantes y las tétradas secaron seguido de
análisis fenotípico y de resistencia a fármacos de los segregantes
meióticos. Los resultados demostraron que los dos fenotipos
resistentes a equinocandina y supersensibilidad a nicomicina Z
cosegregan, lo que sugería que una mutación génica única es
responsable de los dos fenotipos.
La cepa D1-22C es un segregante
meiótico del cruce anterior. Esta cepa es resistente a
equinocandina, hipersensible a nicomicina Z y Ura^{-}. Las
células de la cepa D1-22C se transformaron con la
genoteca genómica del ADN de levadura construida en el vector
basado en el centrómero YCp50 (M. Rose et al., Gene,
60:237-243, 1987). Esta es la misma genoteca
de ADN que se usó en el ejemplo 6. Se llevó a cabo una doble
selección para prototrofía a uracilo y supersensibilidad a
nicomicina Z por disposición de los transformantes en placas
exentas de Ura que contenían 75 mcg/ml de nicomicina Z. Sólo las
colonias que pueden crecer en ausencia de uracilo y en presencia de
nicomicina Z crecerán. Por tanto, este ensayo es selectivo para
transformantes que han recibido los plásmidos recombinantes que
portan fragmentos de ADN capaces de complementar el fenotipo de
supersensibilidad a nicomicina Z. De las 20 colonias prototróficas a
uracilo resistentes a nicomicina Z aislada por este esquema, 3
clones eran también sensibles a la equinocandina
L-733,560. Uno de estos tres transformantes es la
cepa denominada 9-3B y contiene un plásmido con el
gen complementario. El plásmido de esta cepa se designó como pMS14
ya que complementa los fenotipos MS14 en las células mutantes
transformadas (cepa D1-22C). El plásmido pMS14 se
rescató a partir de las células de levadura (clon
9-3B), se propagó en E. coli y se
retransformó en la cepa D1-22C. Se ensayaron la
resistencia/sensibilidad a L-733,560 y nicomicina Z
de tres transformantes por el método de la microdilución del medio.
En los 3 transformantes testados se invirtió la resistencia a
equinocandina y la sensibilidad a nicomicina Z.
Se construyó un auxótrofo a uracilo, que llevaba
la mutación de resistencia a equinocandina de MS10, cruzando MS10
con GG100-14D. Se transformó un segregante meiótico
resistente a equinocandina con el plásmido recombinante de copia
única pMS14 y se ensayó la susceptibilidad a equinocandinas de los
transformantes por el ensayo de microdilución del medio. Los tres
transformantes testado mostraban sensibilidad a
L-733,560. Por el contrario, las células mutantes
transformadas con el plásmido control YCp50 permanecían resistente a
equinocandina. Por tanto, el plásmido recombinante pMS14, que
complementa los fenotipos de resistencia a equinocandina y la
sensibilidad a nicomicina de la mutación de MS14 también
complementa el fenotipo de resistencia a equinocandina de MS10. Este
resultado sugiere que las dos mutaciones representan dos alelos
diferentes del mismo gen.
Las células de levaduras que contenían las
mutaciones de MS10 o MS14 se transformaron con el plásmido de copia
múltiple pJAM54 (que contenía FKS1). Como pMS14, pJAM54
complementaba los dos fenotipos de resistencia a equinocandina y
sensibilidad a nicomicina causados por la mutación de MS14. pJAM54
también complementaba el fenotipo de resistencia a equinocandina de
la cepa MS10.
El plásmido pJAM54 (un plásmido multicopia que
contenía FKS1) y el plásmido de copia única pMS14 se digirieron con
enzimas de restricción y se analizaron por análisis de hibridación
de Southern usando un fragmento interno de FKS1 como sonda de
hibridación. Ambos análisis de Southern y de enzimas de restricción
mostraron que pJAM54 y pMS14 contenían el mismo gen, denominado
FKS1. La mutación en MS10 se refiere, por tanto, como
fks1-3, y la mutación en MS14 se refiere como
fks1-4.
Para determinar si existen homólogos de FKS1 en
el cromosoma de C. neoformans B-3502, se
digirió una muestra del ADN genómico total de esta cepa con HindIII,
y los fragmentos se separaron en un gel de agarosa al 0,8%. El gel
se sondeó con el fragmento AflII-XhoI de pJAM54 por
el método de Southern, y se lavó bajo condiciones altamente
rigurosas. Se visualizó en la autorradiografía un fragmento de
aproximadamente 15 kb de longitud. Más probablemente, este
fragmento contiene todo o una porción del homólogo de FKS1 de C.
neoformans B-3502.
Se llevaron a cabo experimentos de hibridación de
transferencia Southern similares con un fragmento de FKS2 como
sonda.
Se construye una genoteca de ADNc fagémido del
ARN poli (A)+ de C. neoformans B-3502
esencialmente según el método de Edman et al. (1990. Mol.
Cell. Bio., 10(9):4538-4544). E.
coli XL-1B se coinfectó con la genoteca
fagémida y un fago auxiliar (R408) de manera que se formaran
aproximadamente 500 placas por placa de agar. Las placas se
transfieren a nitrocelulosa y se sondearon por métodos estándar,
usando un fragmento de FKS1 como sonda. Tras lavar, los filtros se
expusieron a una película, y la autorradiografía se usó para
identificar clones fagémidos específicos que hibridan con FKS1.
Entonces, el ADN plasmídico se aisló a partir de los ADNc
transfectantes, se propaga y analiza por digestión con endonucleasas
de restricción.
Para aislar los homólogos de FKS2 se llevan a
cabo experimentos similares con una sonda de FKS2.
Los pulmones completos de ratas
Sprague-Dawley machos infectados con P.
carinii se homogeneizan con un homogeneizador Brinkmann y se
aísla el ADN como se ha descrito (P.A. Liberator, et al.,
1992, J. Clin. Micro.,
30(11):2968-2974). Se digieren de dos a cinco
microgramos de ADN purificado con una endonucleasa de restricción
tal como EcoRI, y los fragmentos se separan en un gel de agarosa.
El ADN se transfiere a un soporte sólido tal como nitrocelulosa y
se sondea por el método de Southern (Southern, E.M. 1975, J.
Mol. Biol., 98:503-517) para fragmentos
con homología con FKS1. Lavando la transferencia con rigor
reducido, pueden identificarse genes ligeramente homólogos.
Se llevan a cabo experimentos de hibridación de
transferencia Southern similares con un fragmento FKS2 como
sonda.
Los homólogos de FKS1 de P. carinii se
clonan preparando una mini-genoteca a partir de la
región del gel de agarosa donde el fragmento de hibridación se
visualizó en la transferencia Southern. Tras la extracción con
fenol: CHCl_{3} para eliminar contaminantes, los fragmentos de ADN
de esta área del gel se ligan en un vector plasmídico apropiado y
se transforman en E. coli. Los clones de E. coli que
portan la mini-genoteca se extienden en placas de
agar y los insertos homólogos a FKS1 se sondean por lisis in
situ de la colonia. El ADN de los transformantes individuales
se transfiere a nitrocelulosa, se hibrida con un fragmento del ADN
de FKS1 radiomarcado, se lava y expone a la película. Las colonias
que contiene un inserto con homología con FKS1 se visualizan en la
película; entonces el ADN plasmídico se aísla a partir de los clones
positivos, se propaga y analiza. El análisis de la secuencia de ADN
por métodos estándar se usa para establecer la extensión de la
homología de FKS1, y la homología funcional puede demostrarse por
expresión interrumpida de FKS1 en S. cerevisiae.
Para aislar homólogos de FKS2 se llevaron a cabo
experimentos similares con una sonda de FKS2.
El ADN genómico se aisló a partir de A.
nidulans FGSCA4, también conocido como el tipo salvaje de
Glasgow, y A. nidulans MF5668 por métodos conocidos en la
técnica (Tang et al., (1992) Mol. Microbiol.,
6:1663,1671). El ADN cromosómico se cortó completamente con
varios enzimas de restricción y los fragmentos digeridos de ADN se
separaron por electroforesis. Los fragmentos del ADN de A.
fumigatus se transfirieron a una membrana de nailon derivada
con amina cuaternaria Zeta-Probe GT fabricada por
BioRad y los fragmentos del ADN de A. nidulans se
transfirieron a membranas de nailon Nytran (S&S; Southern,
(1975) J. Mol. Biol., 98:503-517). Se
prepararon transferencias duplicadas del ADN de A.
nidulans. Todas las transferencias se hibridaron con sondas
radiomarcadas con ^{32}P por cebado aleatorio (Feinberg y
Vogelstein (1983) Anal. Biochem.,
132:6-13). La sonda para la transferencia de
A. fumigatus fue un fragmento SalI-ClaI
radiomarcado de 1,25 kb aislado a partir de pJAM54 que contenía el
gen FKS1. Una transferencia de A. nidulans también se
hibridó con esta sonda y la otra transferencia de A. nidulans
se hibridó con un fragmento KpnI-PstI radiomarcado
de 1,7 kb de pFF250 que contenía una porción del gen FKS2. Las
transferencias se hibridaron toda la noche bajo condiciones
rigurosas y se lavadas por métodos rigurosos (Maniatis et
al., supra). Luego, las transferencias se expusieron a
una película XAR-5 y se revelaron por métodos
convencionales (Laskey y Mills (1977) FEBS Letters,
82:314-316). Ambas sondas hibridaban con
fragmentos de cada ADN de Aspergillus testado. Las
transferencias ilustran que el ADN genómico de A. nidulans es
homólogo al fragmento SalI-ClaI de S. cerevisiae
de 1,25 kb del gen FKS1 y al fragmento
KpnI-PstI de 1,7 kb del gen FKS2. El ADN de A.
fumigatus también es homólogo al fragmentos
SalI-ClaI de S. cerevisiae de 1,25 kb del gen
FKS1.
Para clonar los homólogos de A. nidulans,
se obtuvieron dos genotecas de cósmidos del ADN genómico de A.
nidulans a partir del Fungal Genetics Stock Center. Los vectores
cósmidos son plásmidos modificados que contienen secuencias
"cos" requeridas para el empaquetamiento del ADN en partículas
del bacteriófago lambda (Maniatis et al., supra). Los
cósmidos también contienen un origen de replicación y un marcador
de resistencia al fármaco y pueden introducirse en E. coli
por procedimientos de transformación estándar y propagarse como
plásmidos. Las secuencias Cos permiten que fragmentos de ADN de 35 a
45 kb se liguen al vector para ser empaquetados dentro de partículas
lambda y posteriormente circularizarse tras la infección de E.
coli. Se construyeron dos genotecas completas de cósmidos en los
vectores LORIST2 y pWE15 de Brody et al., (Nucleic Acids
Research, 19:3105-3109). El cósmido
pWE15 contiene un origen de replicación CoIEl mientras que LORIST2
contiene un origen de replicación del bacteriófago lambda. Las
secuencias de ADN que son inestables en un vector a menudo son
estables en el otro (Evans et al., (1987). Methods in
Enzymol., Berger y Kimmel Eds. Academic Press, New York, Vol.
152:604-610). Los clones de las genotecas de
cósmidos se transfieren a membranas Nytran y se analizan por métodos
conocidos en la técnica (Maniatis et al.). Las sondas son los
fragmentos de los genes FKS1 y FKS2 descritos anteriormente. Si los
homólogos de FKS1 y FKS2 están ausentes de las genotecas de cósmidos
o las secuencias son inestables, se analizan genotecas adicionales.
Si los homólogos están ausentes de las genotecas preexistentes o si
sólo se aísla parte del gen, se construye una genoteca genómica
parcial Sau3AI de A. nidulans en el Stratagene Vector Lambda
Dash usando un kit de clonación obtenido del fabricante y métodos
de la técnica (Maniatis).
Se usa metodología similar para clonar los
homólogos de FKS1 y FKS2 de A. fumigatus.
fksA es la designación de un homólogo de FKS1 y
FKS2 de Aspergillus nidulans. Se demostró a nivel de ADN la
homología entre los genes FKS1 y FKS2 y el ADN genómico de A.
nidulans. Esta homología establece las bases de una estrategia
para clonar homólogos de Aspergillus.
Una genoteca genómica de A. nidulans
construida en el vector cósmido pWE15 de Stratagene (Brody et
al., 1991, Nucleic Acids Research,
19:3105-3109) se obtuvo del Fungal Genetics
Stock Center. Esta genoteca de cósmidos consta de 2.832 cósmidos
individuales que contiene transformantes de E. coli
divididos entre 30 placas de microtitulación. Se transfirieron mil
cuatrocientos ochenta y ocho transformantes a membranas de nailon
derivadas con amina cuaternario Zeta-Probe GT
(fabricada por BioRad) como transferencias de colonias.
Las transferencias de colonias de las placas de
microtitulación (96 colonias/placa; 1 transferencia/placa) se
hicieron como sigue: se crecieron cósmidos individuales en medio LB
(Maniatis, supra) en discos de microtitulación durante toda
la noche y posteriormente se inocularon en agar LB que contenía 50
microgramos por ml de ampicilina. Tras siete horas de crecimiento,
se hicieron dos transferencias de colonias a partir de cada placa
y los filtros se transfirieron a placas recientes. Las colonias se
crecieron durante cuatro horas adicionales y se fijaron a los
filtros. Los filtros se trataron con NaOH 0,5 N, se neutralizaron
con Tris 1 M pH 7,5/NaCl 1,5 M, se lavaron en Tris 1 M pH 7,5/NaCl
1,5 M/SDS al 0,2%, y se lavaron otra vez en Tris 1 M pH 7,5/NaCl 1,5
M. Las transferencias duplicadas se hibridaron con un fragmento KpnI
de FKS1 de 4,0 kb radiomarcado (^{32}P) aislado a partir de pJAM54
y un fragmento PstI-KpnI de 1,7 kb aislado a partir
de pFF250. Todas las sondas ^{32}P se radiomarcaron por cebado
aleatorio (Feinberg y Vogelstein (1983) Anal. Biochem.
132:6-13). Las transferencias se hibridaron
usando condiciones recomendadas para las membranas Zeta fabricadas
por Biorad. Inicialmente se detectó una colonia con sólo la sonda
FKS2. Este cósmido se designó como pGS1, y la hibridación con los
genes FKS1 y FKS2 se confirmó posteriormente por análisis de
trasferencia en ranura de ADN con ADN del cósmido purificado. El ADN
del cósmido se aisló a partir de cultivos crecidos durante diez
horas en medio LB y se purificó con un kit maxi plásmido Qiagen. Se
prepararon transferencias en ranura de ADN duplicadas aplicando 1,5
microgramos de cada muestra en membrana de nailon derivada con
amina cuaternaria Zata-Probe GT (BioRad) con un
aparato de transferencia en ranura Minifold II según las
indicaciones del fabricante (Schleicher y Schuell). Las muestras
fueron ADN de pGS1, el vector de ADN pWE15 y ADN a partir de un
cósmido que no hibrida. Las transferencias en ranura se hibridaron
como se ha descrito para las transferencia de colonias. Ambas sondas
de FKS1 y FKS2 hibridaban especialmente con el ADN de pGS1 y no con
el ADN del vector cósmido pWE15 o con el ADN aislado a partir de una
colonia que no hibrida.
Se estimó que la inserción del cósmido pGS1 era
de \sim30 kb por digestión con endonucleasas de restricción y
electroforesis de gel de agarosa y se liberó del vector por
digestión con NotI o EcoRI. Los fragmentos de restricción
específicos de pGS1 con homología con FKS2 se identificaron por
hibridación de transferencia Southern usando las mismas condiciones
de hibridación. Se subclonó un fragmento EcoRI de 11,0 kb que
hibridaba con FKS2 en el vector Bluescript (Stratagene) para
construir el subclon pGS3. Se determinó un mapa de restricción por
digestión con endonucleasas de restricción y electroforesis en gel
de agarosa de los fragmentos de restricción y se muestra en la
figura 3. La región de pGS3 homóloga a FKS2 se localizó por
hibridación Southern de las trasferencias de los fragmentos de
restricción con la sonda FKS2. Se determinó que el fragmento
PstI-EcoRV de 568 pb era interno a la región de
hibridación y específico para fksA basándose en las siguientes
evidencias: el fragmento PstI de 1,7 kg que bordea por la izquierda
y el fragmento EcoRV de 2,4 kb que bordea por la derecha hibridaban
con FKS2.
Como algunas genotecas genómicas contienen genes
reordenados o ADN resultante de la ligación de fragmentos de
restricción no contiguos, se llevó a cabo la hibridación de
transferencia Southern con el gen FKS2 de S. cerevisiae y
una sonda homóloga para determina si el cósmido pGS1 y su derivado,
pGS3, eran colineales con el genoma de A. nidulans. La sonda
homóloga fue el fragmento PstI-EdoRV específico de
fksA de 568 pb aislado a partir de pGS2. El plásmido pGS2 se
construyó por subclonación de un fragmento SalI de pGS1 de 6,0 kb en
Bluescript (Stratagene). El ADN genómico de A. nidulans se
digirió con SalI, EcoRI, EcoRV, KpnI y EcoRI/SstII. Los datos de
hibridación indicaban que se encontraron los fragmentos de
restricción de tamaño apropiado del ADN genómico para enzimas
proximales al sitio EcoRV del fragmento PstI-EcoRV
interno, pero no se encontraron fragmentos de restricción del ADN
genómico correspondientes con sitios de restricción distales a este
sitio EcoRV. El cósmido pGS1 y su derivado pGS3 son colineales con
el genoma A. nidulans desde la parte derecha del sitio EcoRI
hasta el segundo sitio EcoRV del mapa de restricción de pGS3
mostrado en la figura 3.
Para asegurar el aislamiento de un clon cósmido
que contenga el gen fksA de A. nidulans completo, se analizó
otra genoteca. Se obtuvo una genoteca de cósmidos de A.
nidulans construida en el vector pLORIST2 (Brody et al.,
1991, Nucleic Acids Research,
19:3105-3109) a partir del Fungal Genetics
Stock Center. La genoteca se analizó exactamente igual como se ha
descrito para el aislamiento de pGS1, excepto en que la sonda fue el
fragmento PstI-EcoRV interno de A. nidulans
de 568 pb. Un clon cósmido, p11G12, de entre 2.880 cósmidos
analizados, hibridaba fuertemente con la sonda. El análisis de
transferencia en ranura del ADN con ADN del cósmido purificado
confirmó la hibridación con la sonda homóloga de A nidulans
así como con la sonda FKS2. La sonda homóloga fue el fragmento
PstI-EcoRV de 568 pb aislada a partir de pGS4. El
plásmido pGS4 se construyó por subclonación del fragmento
PstI-EcoRV de pGS3 de 568 pb en Bluescript. La
colinearidad de p11G12 con el ADN genómico de A. nidulans se
determinó por hibridación de la transferencia Southern con la sonda
de FKS2. Los enzimas de restricción probados fueron
EcoRV-BglII, EcoRV-KpnI,
EcoRV-SalI, PstI, SpeI y XbaI. Los fragmentos de
restricción obtenidos con p11G12 se correspondían con los obtenidos
con el ADN genómico de A. nidulans. Los datos indicaban que
el fragmento PstI-EcoRV de 568 pb específico para
fksA está flanqueado a cada lado por \sim7,0 kb de ADN que es
colineal con el genoma. Un fragmento XbaI de 11,0 kb de p11G12 que
hibridaba con FKS2 y que es colineal con el genoma se subclonó en
Bluescript para construir pGS6. Se determinó un mapa de restricción
por digestión con endonucleasas de restricción y por electroforesis
en gel de agarosa de los fragmentos de restricción y se muestra en
la figura 4.
La secuencia de ADN se determinó manualmente por
el método de Sanger et al., (Proc. Natl Acad. Sci.,
74:5463) usando un kit "Sequenase" fabricado por United
States Biochemical o usando el Applied Biosystems Model 373A DNA
Sequencing System con un "Prism Ready Reaction DyeDeoxy Terminator
Cycle Sequencing Kit". El ADN molde se obtuvo a partir de los
siguientes plásmidos: pGS4, pGS7, pGS6, pGS15, pGS16, pGS17, pGS18,
pGS19, pGS20 y pGS21. El plásmido pGS7 se construyó subclonando la
inserción XbaI de pGS6 de 11,0 kb en pBR322. El fragmento KpnI de
3,6 kb y el fragmento XhoI de 2,2 kb de pGS6 fueron subclonados en
pGEM7 para construir pGS15 y pGS16, respectivamente. Se construyó
una serie de deleciones anidadas en pGS15 por digestión parcial con
Sau3A usando un método descrito por Gewain et al., (1992,
Gene, 119: 149). Brevemente, el plásmido pGS15 se
linearizó con BamHI que está en el sitio de multiclonación del
vector y el ADN se precipitó y resuspendió. Alícuotas de un
microgramo en mezclas de reacción de 15 microlitros se sometieron a
digestión parcial en tampón Sau3A 1X (New England Biolabs). El
enzima se diluyó a 0,75 unidades/microlitro en tampón de
almacenamiento (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,4,
EDTA 0,1 mM, DTT 1mM, BSA 200 mg/ml, glicerol al 50%) y se diluyó
dos veces de forma seriada ocho veces más en tampón de
almacenamiento. Se añadió un microlitro de cada dilución así como el
control no diluido a cada tubo que contenía 14 microlitros y la
mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Las reacciones se
terminaron por adición de 3,4 microlitos de tampón de parada que
contenía EDTA 50 mM y se calentaron a 65ºC durante 20 minutos. El
ADN se sometió a electroforesis y los fragmentos de tamaños
apropiados se purificaron del gel con un protocolo Qiagen Qiaquick.
Los fragmentos se cuantificaron y religaron con 25 ng de ADN por
cada cinco microlitros de reacción de ligación. Las ligaciones que
contenían los cuatro fragmentos mayores se precipitaron y digirieron
con Csp451 en reacciones de cinco microlitros. El sitio Csp451 está
entre el sito BamhI y el KpnI del vector. Esta digestión fue
necesaria para eliminar cualquier fragmento contaminante que no
contenga una deleción. Todas las muestras de ADN se transformaron
en DH5aFIQ, y los recombinantes apropiados se identificaron por
digestión con endonucleasa de restricción. Las deleciones contenidas
en los plásmidos pGS17, pGS18, pGS19, pGS20 y pGS21 se muestran en
la figura 4.
La secuenciación de la inserción
PstI-EcoRV de 568 pb de pGS4 se inició en ambas
direcciones usando cebadores de secuenciación KS y SK que se unen al
vector (Stratagene). La secuencia fksA se usó para diseñar cebadores
para extender la secuencia en ambas direcciones de cada hebra de la
inserción. Se hicieron cebadores para cada extremo de la secuencia
de la inserción de 568 pb de pGS4 y se usaron para extender la
secuencia de fksA con pGS7 como molde. Esta información se usó para
diseñar cebadores para extender la secuencia en ambas direcciones
usando ADN de pGS15 y pGS16 como molde. La secuencia 3' adicional se
obtuvo con los plásmidos pGS17, pGS18, pGS19, pGS20 y pGS21 que
contenían las deleciones anidadas. La secuenciación se inició usando
un cebador SP6 que se une al vector (Promega) y en los casos en que
la secuencia de los plásmidos no solapaba, se usó para extender la
secuencia un cebador basado en la secuencia de fksA. Los cebadores
basados en la secuencia de fksA también se usaron para obtener la
secuencia de la hebra opuesta usando como molde pGS6. La secuencia
se ensambló y analizó con el paquete de software de análisis de
secuencia del University of Wisconsin Genetics Computer Goup
(GCG).
La secuencia de ADN de fksA de 2.565 nucleótidos
se determinó con la secuencia de 1.600 nucleótidos basada en ambas
hebras (figura 5). Se dedujo un supuesto marco abierto de lectura de
885 aminoácidos que mostraba identidad del 67% con las proteínas
FKS1 y FKS2 de S. cerevisiae. Las secuencias de aminoácidos
se compararon con el
programa GAP^{TM} (GCG). La región de FKS2 homóloga a fksA se extiende desde el aminoácido 943 al aminoácido 1799, este está próximo al carboxilo terminal. La primera mitad del supuesto marco abierto de lectura de fksA (aminoácidos 1-427) es más homóloga a FKS2, mostrando una identidad del 82%, mientras que la última mitad es un 53% idéntica.
programa GAP^{TM} (GCG). La región de FKS2 homóloga a fksA se extiende desde el aminoácido 943 al aminoácido 1799, este está próximo al carboxilo terminal. La primera mitad del supuesto marco abierto de lectura de fksA (aminoácidos 1-427) es más homóloga a FKS2, mostrando una identidad del 82%, mientras que la última mitad es un 53% idéntica.
La localización del gen fksA en pGS6 puede
determinarse en base a la información de secuencia y mapeo del
transcrito. La porción del gen fksA que se ha secuenciado empieza en
el nucleótido 311 a la derecha del cuarto sitio PstI de pGS6 como
se muestra en el mapa de restricción en la figura 4. Basándose en la
homología obtenida entre el producto del gen fksA y los productos de
los genes FKS1 y FKS2 de Saccharomyces, se puede deducir que
la dirección de transcripción de fksA es desde la izquierda hacia la
derecha en el mapa de restricción de pGS6 mostrado en la figura 4.
El gen fksA se localizó más detalladamente en pGS6 por mapeo del
transcrito. El ARN total de A. nidulans se aisló por métodos
conocidos en la técnica como describe Timberlake (Biol. and Mol.
Biol. of Plant-Pathogen Interactions, 1986). El
ARN se sometió a electroforesis en agarosa al 1,5%, formaldehído 2,2
M, tampón MOPS 1X, se transfirió a membranas de nailon Nytran
(Schleicher y Schuell) y se hibridó según un protocolo de Gelman
Sciences (protocolo número 6, Protocolos de aplicación para
BioTrace Binding Matrices). La hibridación del fragmento PstI- EcoRV
de pGS6 específico de fksA, de 568 pb en la transferencia del gel
detectó un único transcrito. Un transcrito de tamaño idéntico se
detectó con los dos fragmentos proximales PstI de pGS6, un
fragmento PstI de 1,2 kb y un fragmento PstI de 0,7 kb, pero no se
detectó transcrito con el fragmento PstI-SpeI de
pGS3 de 1,4 kb que es el 5' del fragmento PstI-PstI
de 1,2 kb (el fragmento PstI-SpeI de 1,4 kb se
aisló a partir de pGS9 que se construyó por subclonación del
fragmento de pGS3 en Bluescript). Estos datos indican que el
transcrito fksA empieza en el fragmento PstI-PstI
de 1,2 kb. Los datos de secuencia indican que el gen fksA se
extiende más allá del sitio EcoRV de pGS6. El fragmento
NdeI-NheI de pGS6 de 1,6 kb no detectó un
transcrito, lo que indica que el transcrito termina antes del sito
NdeI. En resumen, el transcrito fksA empieza dentro del fragmento
PstI de 1,2 kb y termina entre el sitio EcoRV y el secundo sitio
NdeI de pGS6. Es posible que las secuencias reguladores del gen fksA
estén localizadas en 5' del fragmento PstI de 1,2 kb.
Para clonar homólogos de FKS1 y FKS2 a partir de
hongos fitopatogénicos tales como Magnaporthe grisea y
Ustilago maydis, se aísla ADN genómico de alto peso
molecular por el método descrito por Atkins y Lambowitz (Mol.
Cell. Biol., 5:2272-2278), parcialmente
digerido por el enzima de restricción, Sau3AI, y se clona en el
vector Lambda-Dash de Stratagene usando un kit de
clonación obtenido a partir de los fabricantes y métodos de la
técnica (Maniatis). Las genotecas se analizan usando sondas de FKS1
y FKS2 esencialmente como se describe anteriormente.
El mutante resistente a
L-733,560, MY2256 (también conocido como YFK0978 y
YM0148) se aisló a partir de la cepa YFK0931-07B
usando procedimientos estándar. Se usaron cuatro cepas parentales
congénitas (fks1-1) (YFK0931-03B,
YFK0931-07B, YFK0931-10C y
YFK0932-01C) en la búsqueda del mutante. Los
genotipos de las cuatro cepas se listan a continuación. Las cepas
contienen el plásmido pDL1 que contiene un elemento ARS, un
centrómero y los genes CNB1, SUP11 y URA3.
Esta búsqueda de mutante se diseñó para
identificar mutaciones en el gen FKS2 que confieran resistencia a
equinocandina. Brevemente, las cepas parentales se crecieron durante
toda la noche en 5 ml de medio YPAD10Ca (medio YPAD que contiene
CaCl_{2} 10 mM) a 28ºC. Las células se diluyeron a 1 x 10^{3}
células/ml en YPAD10Ca y se repartieron alícuotas (0,2 ml) de los
cultivos en 96 pocillos de microtitulación individuales. Los
cultivos se crecieron hasta la saturación a 28ºC. Se diluyeron las
células de cinco pocillos 1:20 y se determinó la densidad óptica a
660 nm (OD_{660}) para calcular el promedio de densidad celular
para cada cultivo (1 OD_{660} = 3,3 x 10^{7} células/ml).
Se pusieron en placas cuarenta cultivos de cada
cepa sobre medio YPAD10Ca que contenía 1mcg/ml de
L-733,560. Las placas se incubaron a 28ºC. Se
picaron dos colonias de cada placa con fármaco, clonalmente
purificadas en medio -Ura y YPAG y crecidas a 28ºC. Se picaron dos
clones independientes de cada placa a placas maestras de medios -Ura
y YPAD10Ca. Las placas maestras se replicaron a medio exento
estándar, medio YPAD10Ca y medio YPAD10Ca que contenía 1 mcg/ml de
FK520, FK506, L-733,560, 10 mg/ml de ciclosporina A
o 0,1 mcg/ml de rapamicina. Las placas se incubaron a 28ºC. La
sensibilidad a la temperatura se determinó mediante el replicado de
los originales en medio YPAD e incubando las placas a 37ºC. Las
placas se contaron después de dos o tres días.
A partir de este experimento, se identificaron
dieciocho mutantes independientes que crecieron en medio
YPAD10
Ca que contenía L-733,560 (1 mcg/ml) de aproximadamente 3,7 x 10^{9} células analizadas. Estos mutantes pcr (resistentes a pneumocandina) eran resistentes a L-733,560 y sensibles a los inmunosupresores FK506, FK520, CsA y rapamicina. Uno de los mutantes (MY2256) también poseía un fenotipo sensible a la temperatura a 37ºC. Se midieron las sensibilidades de MY2256 y su cepa parental (YFK0931-07B) a L-733,560, FK530, FK506, CsA y rapamicina, y los resultados se muestran a continuación. Como se muestra en la tabla siguiente, el mutante es significativamente más resistente a L-733,560 que su parental. MY2256 y YFK0931-07B exhiben sensibilidades similares a los inmunosupresores testados.
Ca que contenía L-733,560 (1 mcg/ml) de aproximadamente 3,7 x 10^{9} células analizadas. Estos mutantes pcr (resistentes a pneumocandina) eran resistentes a L-733,560 y sensibles a los inmunosupresores FK506, FK520, CsA y rapamicina. Uno de los mutantes (MY2256) también poseía un fenotipo sensible a la temperatura a 37ºC. Se midieron las sensibilidades de MY2256 y su cepa parental (YFK0931-07B) a L-733,560, FK530, FK506, CsA y rapamicina, y los resultados se muestran a continuación. Como se muestra en la tabla siguiente, el mutante es significativamente más resistente a L-733,560 que su parental. MY2256 y YFK0931-07B exhiben sensibilidades similares a los inmunosupresores testados.
Se prepararon fracciones de membrana mixtas a
partir de MY2256 y YFK0931-07B y se valoró la
sensibilidad de la actividad
1,3-beta-D-glucano
sintasa a L-733,560 en las preparaciones de membrana
parcialmente purificadas usando procedimientos estándar. Las
actividades específicas de la actividad
1,3-beta-D-glucano
sintasa de YFK0931-07B y MY2256 fueron 60 y 45
nmoles de
UDP-D-[6-^{3}H]Glucosa
incorporada por mg^{-1} hr^{-1}. El IC_{50} de la actividad
del enzima de las cepas mutante y parental fue de
16-24 mcM y 0,21 mcM, respectivamente, indicando que
la actividad
1,3-beta-D-glucano
sintasa en MY2256 es resistente a L-733,560. MY2256
se caracterizó más detalladamente.
MY2256 (MATa fks1-1 pcr1) se
cruzó con la cepa de tipo salvaje YFK0005 (MATalfa FKS1+ PCR1+) para
generar la cepa YFK0996-11B.
YFK0996-11B (MATa fks1-1 pcr1) se
emparejó con YFK0688-14B (MATalfa
fks1-1 PCR1+), se hizo esporular y secó. En las 29
tétradas de cuatro esporas y las 12 tétradas de tres esporas de este
cruce, el fenotipo pcr1 (resistencia a L-733,560)
segregaba 2^{r}:2^{s} indicando que el fenotipo pcr1 es el
resultado de una única mutación. Las cepas MY2259 (también conocida
como YFK1087-20B, MATalfa fks1-1
pcr1) y MY2260 (también conocida como YFK1087-20A,
MATa fks1-1 pcr1) se generaron a partir de este
cruce. Al igual que el mutante MY2256 original, MY2259 y MY2260
contienen las mutaciones fks1-1 y pcr1. Sin embargo,
estas cepas no contienen el plásmido pDL1 que estaba presente en el
mutante original.
YFK0996-11B (MATa
fks1-1 pcr1) se cruzó también con YFK0005 (MATalfa
FKS1 PCR1). En este cruce, las mutaciones pcr1 y
fks1-1 segregan independientemente. En las 16
tétradas de cuatro esporas y las 20 de tres esporas, el patrón de
segregación de las tétradas 1 Ditipo Parental: 1 Ditipo No
Parental: 4 Tetratipo es indicativo de dos genes no ligados. Este
cruce también demostró que el fenotipo pcr1 se expresa en un
trasfondo FKS1. Las esporas FKS1 pcr1 son resistentes a
L-733,560 y a los inhibidores de calcineurina FK520,
FK506 y CsA. Las cepas MY2257 (también conocida como
YFK1088-23B, MATa FKS1+ pcr1), MY2258 (también
conocida como YFK1088-16D, MATalfa FKS1+ pcr1) y
YFK1088-02D (MATa FKS1+ pcr1) se segregaron a partir
de este cruce. Como se muestra en la tabla siguiente, estos
productos de segregación contienen la mutación pcr1 en un trasfondo
FKS1 tipo salvaje y falta el plásmido pDL1 presente en el mutante
original.
Para determinar si la mutación pcr1 mapeaba en el
gen FKS2, se cruzó YFK1088-02D (MATa pcr1) con
YFF2720 (MATalfa fks2::TRP1). En las 31 tétradas de cuatro esporas y
6 de tres esporas de este cruce, todos los productos de segregación
mostraron los fenotipos parentales de resistencia a
L-733,560 (pcr1) y auxotrofia a triptófano (trp1) o
sensibilidad a L-733,560 y prototrofia a triptófano
(fks2::TRP1). Estos resultados demuestran que la mutación pcr1 está
estrechamente ligada al gen FKS2. En dos cruces adicionales,
YFK0996-23D (MATa pcr1 cnbl::LYS2) se emparejó con
YFF2720 (MATalfa fks2::TRP1) y con YFF2721 (MATalfa fks2::TRP1). En
las 78 tétradas ensayadas, todas las esporas fks2::TRP1 eran
sensibles a L-733,560 apoyando el modelo de que la
mutación pcr1 mapea en el gen FKS2 regulado por calcineurina.
En resumen, la mutación pcr1 está en un único
gen, segrega independientemente de fks1-1, se
expresa en una célula FKS1 y está estrechamente ligado al gen FKS2.
En consecuencia, el alelo pcr1 se ha renombrado como
fks2-1.
Las sensibilidades de las cepas pcr1
(fks2-1) fks1-1 y pcr1
(fks2-1) FKS1 a L-733,560,
L-639,947 (aculeacina) y L-687,781
(di-hidropapulocandina) se determinaron en ensayos
MIC. Brevemente, se crecieron las cepas hasta la fase estacionaria
en 5,0 ml de medio YPAD líquido. Se crecieron precultivos de MY2256
en YPAD10Ca líquido. Los ensayos MIC se llevaron a cabo por
triplicado en placas de microtitulación de pocillo plano con 100 mcL
de medio YPAD. Al primer pocillo se añadió 100 mcL de una solución
4x del fármaco en medio YPAD. Para servir como control se hizo una
solución de reserva de 160 mcL de DMSO por mcL de YPAD. Se añadieron
100 mcL de esta solución al pocillo inicial para las cepas crecidas
en presencia del solvente, pero en ausencia del fármaco. Se
realizaron diluciones seriadas 1/2 del fármaco hacia la parte
inferior de la placa.
Los cultivos se diluyeron a 5 x 10^{5}
células/ml en YPAD (1 DO_{660} = 3,3 x 10^{7} células/ml). Se
añadieron 100 mcL de cultivo diluido a cada pocillo, se
resuspendieron e incubaron a 28ºC. Tras 48 horas, se resuspendieron
los cultivos y se midieron las densidades celulares en un lector de
placas de microtitulación SLT Laboratories 340 ATTC. Las
concentraciones CMIs que se presentan en la tabla siguiente
representan las concentraciones de fármaco que tienen como resultado
menos del 10% de crecimiento de la cepa crecida en ausencia de
fármaco.
| CIM (ng/ml) | |||||
| Cepa | L-733,560 | FK506 | FK520 | CsA | Rapamicina |
| YFK0931-07B | 30 | 30 | 60 | 5.000 | 7 |
| MY2256 | 4.000 | 60 | 60 | 5.000 | 7 |
| Análisis de tétrada de pcr1 vs fks1-1 | ||||
| Genotipo/Cepas | Ditipo parental | Ditipo no parental | Tetratipo | |
| pcr1 fks1-1 x FKS1 | 5 | 1 | 10 | cuatro esporas |
| YFK0996-11B | ||||
| x | 1 | 5 | 14 | tres esporas |
| YFK005 | ||||
| 6 | 6 | 24 | total | |
| (6) | (6) | (24) | esperado | |
| CIM (mcg/ml) | |||
| Genotipo/Cepa | L-733,560 | L-636,947 | L-687,781 |
| (Aculeacina) | (Dihidropapulocandina) | ||
| Tipo salvaje | 0,1 | 1 | 40 |
| YFK0005 | |||
| fks1-1 PCR1 | 0,05 | 0,5 | 10 |
| YFK0688-14B | |||
| fks1-1 pcr1 (fks2-1) | 4 | >40 | >40 |
| MY2256 | |||
| YFK0996-11B | |||
| MY2259 | |||
| MY2260 | |||
| FKS1 pcr1 (fks2-1) | 0,625 | >40 | >40 |
| MY2257 | |||
| MY2258 |
La subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa recombinante se produce en un sistema de expresión
bacteriano tal como E. coli. El casete de expresión de la
subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa se transfiere en un vector de expresión de E. coli,
vectores de expresión incluyen, pero no de forma limitante, las
series pET (Novagen). Los vectores pET sitúan la expresión de la
subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa bajo el control estrechamente regulado del promotor del
bacteriófago T7. Tras la transferencia de esta construcción en un
hospedador E. coli que contiene una copia cromosómica del
gen de la ARN polimerasa de T7 dirigida por el promotor inducible
lac, la expresión de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa se induce por la adición al medio de cultivo de un
apropiado sustrato lac (IPTG). Los niveles de subunidad
1-3-beta-D-glucano
sintasa expresada se determinan mediante los ensayos descritos en
la presente invención.
Vectores de baculovirus derivados del genoma del
virus AcNPV se diseñan para proporcionar alto nivel de expresión de
ADNc en la línea Sf9 de células de insecto (ATCC CRL Nº 1711). El
baculovirus recombinante que expresa el ADNc de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa se produce por los siguientes métodos estándar (Manual
InVitrogen Maxbac): las construcciones de ADNc de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa se ligan en el gen polihedrina en diversos vectores de
transferencia de baculovirus, incluyendo el vector pAC360 y el
BlueBac (InVitrogen). Los baculovirus recombinantes se generan por
recombinación homóloga seguido por la cotrasfección del vector de
transferencia de baculovirus y el ADN de AcNPV linearizado (Kitts,
P.A., Nucl. Acid. Res., 18, 5667 (1990)) en las
células Sf9. Los virus pAC360 recombinantes se identifican por la
ausencia de cuerpos de inclusión en las células infectadas y los
virus pBlueBac recombinantes se identifican en base a la expresión
de \beta-galactosidasa (Summers, M.D. y Smith,
G.E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin Nº 1555). Tras
la purificación de la placa, se mide la expresión de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa.
El auténtico receptor de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa se encuentra en asociación con las células infectadas. La
subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa activa se extrae de las células infectadas por lisis
hipotónica o con detergente.
Alternativamente, la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa se expresa en la línea celular Schneider 2 de
Drosophila por cotransfección de las células Schneider 2 con
un vector que contiene el receptor modificado secuencia abajo del
ADN y bajo el control de un promotor de metalotionina inducible, y
un vector que codifica el gen de resistencia a neomicina G418. Tras
el crecimiento en presencia de G418, se obtienen células resistentes
y se induce la expresión de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa por la adición de CuSO_{4}. La identificación de
moduladores de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa se lleva a cabo mediante ensayos que usan células completas
o preparaciones de membrana.
La subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa producida de forma recombinante se puede purificar por
varios procedimientos, incluyendo, pero no de forma limitante,
cromatografía de afinidad de anticuerpo.
Las columnas de afinidad de anticuerpo de la
subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa recombinante se hacen añadiendo anticuerpos
anti-subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa a Affigel-10 (Biorad), un soporte de gel que
es activado con ésteres de N-hidroxisuccinimida de
forma que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte
de partículas del gel de agarosa. Los anticuerpos se unen entonces
al gel a través de enlaces amida con el brazo espaciador. Los
ésteres activados restantes son entonces eliminados con etanolamina
HCl (pH 8) 1 M. La columna se lava con agua seguido por
glicina-HCl (pH 2,6) 0,23 M para eliminar cualquier
anticuerpo no conjugado o proteína extraña. Luego la columna se
equilibra en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,3) junto
con agentes solubilizantes de membrana apropiados tales como
detergentes, y los sobrenadantes de los cultivos celulares o los
extractos celulares que contienen la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa solubilizada se pasa lentamente a través de la columna.
Entonces la columna se lava con solución salina tamponada con
fosfato (PBS) complementada con detergentes hasta que la densidad
óptica (A_{280}) cae hasta la basal; entonces se eluye la proteína
con glicina-HCl (pH 2,6) 0,23 M complementada con
detergentes. La proteína de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa se dializa posteriormente contra PBS.
La subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa se clona en un vector de expresión de mamífero. El vector de
expresión de mamífero se usa para transformar una línea celular de
mamífero para producir una línea celular de mamífero recombinante.
La línea celular de mamífero recombinante se cultiva bajo
condiciones que permiten la expresión de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa. La línea celular de mamífero recombinante o las membranas
aisladas de la línea celular de mamífero recombinante se usan en
ensayos para identificar compuestos que se unen a la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa recombinante.
Las células recombinantes que contienen el ADN
que codifica una subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa, membranas derivadas de las células recombinantes o
preparaciones de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa recombinante derivada de las células o membranas pueden
usarse para identificar compuestos que modulan la actividad de la
subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa. La modulación de tal actividad puede ocurrir a nivel de
ADN, ARN o proteína o combinaciones de estos. Un método de
identificación de compuestos que modulan la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa comprende:
(a) mezclar un compuesto de ensayo con una
solución que contiene la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa para formar una mezcla;
(b) medir la actividad de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa en la mezcla; y
(c) comparar la actividad de la subunidad
1,3-beta-D-glucano
sintasa de la mezcla con un patrón.
Se determinó la secuencia de ADN de FKS1 y se
muestra en la figura 6.
Se determinó la secuencia de aminoácidos de FKS1
y se muestra en la figura 7.
Se determinó la secuencia de ADN de FKS2 y se
muestra en la figura 8.
Se determinó la secuencia de aminoácidos de FKS2
y se muestra en la figura 9.
Para identificar la mutación
fks1-1 en la cepa R560-1C, se
prepararon plásmidos incompletos a los que les faltaba una porción
de la secuencia que codifica FKS1 a partir del plásmido pJAM54
mediante digestión con enzimas de restricción (incluyendo, pero no
de forma limitante, KpnI, SstI, BglII, XhoI) y purificación por
electroforesis en gel de agarosa. Los plásmidos incompletos se
purificaron a partir del gel usando métodos estándar y se
transformaron en la cepa R560-1C. Sesenta
transformantes Ura^{+} seleccionados en medio exento de uracilo se
pusieron sobre el mismo medio, se crecieron durante 24 h a 30ºC,
luego se replicaron en placas con medio exento de uracilo
complementado con 40 \mug/ml de L-733,560 e
incubaron durante 2 días a 30ºC. El crecimiento de los clones en
placas sin uracilo y con fármaco sugeriría que: 1) el plásmido
incompleto era reparado en los extremos del hueco a través de
recombinación homóloga con el cromosoma de la cepa
R560-1C; y 2) el hueco abarcaba la mutación
fks1-2. Por el contrario, si el hueco abarcaba una
región del cromosoma que no contiene la mutación
fks1-2, el plásmido reparado portaría el gen FKS1
salvaje intacto, y los transformantes serían parcialmente sensibles
al fármaco. Cincuenta y seis de los sesenta clones transformados con
la versión KpnI-incompleta de pJAM54 eran
resistentes al fármaco. Se aisló el ADN plasmídico de estos clones,
se amplificaron por propagación en E. coli y se
transformaron en YLIP137, una cepa de levadura con una
inserción-deleción en la copia cromosómica de FKS1.
La cepa YLIP137 es fenotípicamente similar a la cepa YFF2409
descrita en el ejemplo 1, es decir, la copia cromosómica de FKS1 en
YLIP137 se ha inactivado funcionalmente. La copia de FKS1 que porta
el plásmido es la única copia funcional de FKS1 en estas células; si
son resistentes a L-733,560, debe ser porque el
plásmido porta la versión mutante de fks1-2 de FKS1.
Los transformantes Ura^{+} de YLIP137 se seleccionaron en medio
exento de uracilo, y se analizó la susceptibilidad de varios clones
a L-733,560 por ensayos MIC líquido. Todos los
clones eran tan resistentes al fármaco como el mutante
R560-1C original. Hemos designado el plásmido
incompleto reparado original que porta la mutación
fks1-2 pJAM67.
El fragmento de restricción KpnI del plásmido
pJAM67 tiene 3,5 kb de longitud. Para identificar un fragmento más
pequeño que porte la mutación fks1-2, se
reemplazaron los fragmentos del gen FKS1 en el plásmido pJAM54 con
el fragmento correspondiente de pJAM67 (fks1-2), se
transformaron las nuevas construcciones en YLIP137, y se ensayó la
resistencia al fármaco de los clones usando ensayos MIC líquido. De
esta forma se determinó que la mutación fks1-2
estaba en un fragmento SalI-NcoI de ca. 0,8
kb de pJAM67. Este fragmento se subclonó en un plásmido de E.
coli adecuado para la secuenciación de ADN
(pGEM3(z)f).
La secuencia del fragmento
SalI-NcoI de ca. 0,8 kb se determinó usando
el secuenciador de ADN automatizado Modelo XXXX de Applied
Biosystems, Inc. según las especificaciones del fabricante. Los
datos de secuencia se analizaron usando el paquete de software GCG
del Genetics Computing Group, Madison Wisconsin. La comparación de
la secuencia de ADN del fragmento SalI-NcoI
(longitud exacta = 771 pb) de pJAM67 con la de FKS1 reveló un único
cambio. En el nucleótido en posición 469 del fragmento
SalI-NcoI de FKS1, la base es T (timina); en el
fragmento de ADN de fks1-2, la base nucleotídica en
la posición correspondiente es A (adenina). Cuando se traduce en
proteína, este cambio tiene como resultado la sustitución de
isoleucina (Fks1-2p) por fenilalanina (Fks1p) en
posición 639 de la secuencia proteica primaria de 1.877 aminoácidos.
Una hipótesis es que este cambio es responsable de la resistencia a
L-733,560 de la cepa R560-1C y de la
actividad
1,3-b-D-glucano
sintasa derivada de ella.
El ADN genómico total de Candida albicans
ATCC10261 se digirió completamente con BamHI y KpnI y se separó por
electroforesis en gel de agarosa usando un gel al 0,8%. Una porción
de los fragmentos de ADN del gel se transfirió a un filtro de
nitrocelulosa y se sondeó con un fragmento SalI-ClaI
de 1,25 kb de FKS1 de S. cerevisiae mediante transferencia
Southern (Maniatis, supra). Un fragmento de ca. 2 kb
de ADN de Candida hibridó con la sonda, y se escindieron los
fragmentos de la región correspondiente del resto del gel, se
purificó por métodos estándar y se ligó en el vector
pGEM3(z)f (Stratagene) digerido con BamHI y KpnI. La
mezcla de ligación se transformó en células competentes de E.
coli y se seleccionaron los transformantes portadores de
plásmido en medio que contenía ampicilina y se mezclaron. Para
identificar los clones que portaban un plásmido con el ADN homólogo
de FKS1 de C. albicans de 2 kb, se extendieron alícuotas de
la mezcla de transformantes sobre medio selectivo, y las colonias se
transfirieron a nitrocelulosa, se lisaron por métodos estándar y se
sondearon con el fragmento SalI-ClaI de 1,25 kb
marcado con [^{32}P] aislado de pJAM54. Los filtros se lavaron
bajo condiciones de alto rigor y se expusieron a una película.
Diecinueve colonias parecían dar una señal positiva en la
transferencia. Usando la colonia original como fuente, se crecieron
células de cada clon potencial en medio líquido y se aisló el ADN
del plásmido. El ADN se digirió con KpnI y BamHI, y se sondearon
fragmentos separados en geles de agarosa al 0,8% con el fragmento
radiomarcado SalI-ClaI de 1,25 kb de pJAM54 mediante
transferencia Southern. Tres de los diecinueve plásmidos contenían
un fragmento ca. 2 kb que hibridaba intensamente con la
sonda. El plásmido con el fragmento KpnI-BamHI del
homólogo de FKS1 de C. albicans se ha designado como pGJS1.
El gen de Candida que es homólogo a FKS1 se designó como
FKS1can.
La secuencia nucleotídica del fragmento
ca. 2 kb de pGJS1 se determinó usando métodos estándar. Para
las dos primeras reacciones de secuenciación, el ADN de pGJS1
desnaturalizado se hibridó con el "cebador T7" y con el
"cebador SP6" disponibles de Stratagene. Todos los demás
reactivos, incluyendo el enzima "Sequenase v. 2", eran de U.S.
Biochemicals y se usaron según las especificaciones del fabricante.
Los resultados de la secuencia de ADN de las primeras reacciones se
usaron para diseñar los cebadores oligonucleotídicos de 18 bases que
eran complementarios al "extremo" de la secuencia de estas
primeras reacciones. Estos cebadores se usaron en el siguiente grupo
de reacciones. El proceso se continuó hasta que pudiera generarse un
marco abierto de lectura codificador de proteína contiguo a partir
de los datos de reacciones de secuenciación individuales, usando el
programa de análisis GCG del Genetics Computing Group (Madison,
Wisconsin).
La secuencia peptídica predicha del homólogo de
FKS de C. albicans (Fksc1p) se comparó con la secuencia
proteica de Fks1p de S. cerevisiae. Los aminoácidos 1 a 689
de Fksc1p alineaban con los restos 460 a 1.147 de Fks1p, usando el
programa GAP del Genetics Computing Group. Las dos secuencias
peptídicas eran 79% idénticas y 88% similares la una a la otra sobre
este intervalo. Esto constituye un grado muy alto de homología y
sugiere que es muy probable que las dos proteínas sean
funcionalmente similares. En particular, la fenilalanina en posición
639 de Fks1p, que se identificó en el gen mutante fks1- 2 como un
resto importante para la susceptibilidad de tipo salvaje a la
inhibición por equinocandina (supra) era idéntica a la
fenilalanina 180 de la secuencia aminoacídica de Fksc1p dada en la
figura CD1. Se cree que: 1) FKS1can codifica una subunidad sensible
a equinocandina de la
1,3-beta-D-glucano
sintasa de C. albicans; 2) el resto de la secuencia proteica
de Fksc1p mostrará un grado similar de homología a Fks1p; 3) las
mutaciones en FKS1can similares, pero no de forma limitante, a la
mutación fks1-2 tendrá como resultado la disminución
de la susceptibilidad de la actividad del enzima
(1,3-beta-D-glucano
sintasa que contiene la subunidad Fksc1p mutante) y células
completas (células C. albicans que expresan el Fksc1p
mutante) a la inhibición por equinocandina.
Se evaluó el efecto de la pérdida de una copia
funcional de FKS1 o FKS2 sobre la sensibilidad a la toxina asesina
de levadura. La prueba de susceptibilidad a toxina requiere que a
la cepa problema le falte el virus asesino M_{1}, puesto que las
cepas que contienen el virus producen toxina (K^{+}) y son inmunes
(I^{+}) a su activación, y no es posible distinguir el fenotipo
asesino resistente (Kre^{-}) del fenotipo inmune (I^{+}). Las
cepas construidas con inserciones-deleciones de
FKS1(YLIP179 e YLIP183; fks1::HIS3) o FKS2 (YLIP186 e
YLIP190; fks2::TRP1) eran K+I+; por tanto, el virus M1 tenía que ser
curado de las cepas antes de que pudiera analizarse el fenotipo Kre.
YLIP179, YLIP183, YLIP186 e YLIP190 se crecieron toda la noche a
37ºC. Al día siguiente, se transfirió una alícuota del cultivo de
toda la noche a medio reciente (dilución 1:1.000) y se continuó con
la incubación a 37ºC. Después de tres pases, las células se rayaron
del cultivo sobre placas de agar, y se aislaron colonias
individuales y se analizó la incapacidad de producción de toxina
asesina en un ensayo de placa. El ensayo de placa se realizó
mediante: 1) añadir 1 x 10^{5} células en fase logarítmica de la
cepa S6 muy sensible a la toxina asesina en agar YPAD fundido que
contiene tampón citrato, pH 4,7, 0,25 M y azul de metileno al 0,03%
(YPAD Cit MB): 2) verter en las placas y dejar el agar sembrado que
solidifique; 3) aplicar una capa de la cepa problema a la
superficie de la placa; y 4) incubar a 25ºC durante 24 h y buscar
una zona clara alrededor de la placa. Las cepas que no producían
esta zona no expresaban la toxina activa (K^{-}) y no eran inmunes
(I^{-}). En derivados de YLIP179, YLIP183, YLIP186 e YLIP190
curados de virus asesino M1 mediante este procedimiento se analizó
la susceptibilidad a la toxina asesina mediante una modificación
del ensayo de placa. Cada cepa problema se sembró en agar YPAD Cit
MB fundido y se aplicó una cepa muy asesina (K12) como un parche.
Bajo estas condiciones, hay poca o ninguna zona de monocapa de
células cuando la cepa de ensayo roblema es Kre^{-}. Todos los
aislados K^{-}I^{-} derivados a partir de cepas fks1::HIS3 y
cepas fks2::TRP1 eran sensibles a la toxina producida por la cepa
K12; los ensayos control con varias cepas Kre^{-} conocidas (S706,
S708 y S726; descritas en la Patente de Estados Unidos 5,194,600,
tablas I y VI) realizados bajo las mismas condiciones mostraron poca
o ninguna zona. Por tanto, las mutaciones de pérdida de funciones en
FKS1 o FKS2 tenían como resultado células que eran fenotípicamente
distintas de las cepas con mutaciones de pérdida de función en
cualquiera de los genes KRE descritos en la patente de Estados
Unidos Nº 5,194,600.
Se midió la susceptibilidad de dos mutantes kre
diferentes a inhibidores de
1,3-beta-D-glucano
sintasa. Se crecieron las cepas S442 (KRE1 KRE5), S708
(kre1-3) y S726 (kre5-1) en medio
YPAD líquido hasta la fase estacionaria, luego se sembraron en agar
YPAD fundido a una concentración final de 1 x 10^{5} células por
ml antes de verterlo en placas petri. Para analizar la sensibilidad
al fármaco, se aplicaron pneumocandina B_{0}, equinocandina B,
dihidropapulocandina y L-733,560 (cuatro
inhibidores conocidos de
1,3-beta-D-glucano
sintasa) a la superficie de las placas y se midió el diámetro de
cada zona de inhibición de crecimiento después del crecimiento a
30ºC durante 24 h. La metodología para este ensayo es esencialmente
como la descrita anteriormente, y las cepas R560-1C,
W303-1A, YLIP179 (fks1::HIS3) e YLIP186 (fks2::TRP1)
se ensayaron para comparar bajo las mismas condiciones. El diámetro
de la zona es generalmente un buen indicador de susceptibilidad para
un inhibidor y puede usarse para medir la resistencia o
hipersensibilidad relativa a la cepa congénita de tipo salvaje.
Usando estos criterios, las células R560-1C eran
resistente, las células YLIP179 eran hipersensibles y las células
YLIP186 eran de susceptibilidad similar a la cepa de tipo salvaje
para los cuatro inhibidores de
1,3-beta-D-glucano
sintasa. Por el contrario, los mutantes kre [S708
(kre1-3) y S726 (kre1-5)] eran
equivalentes a su cepa parental de tipo salvaje (S442) en
susceptibilidad a todos los cuatro compuestos. Por tanto, no había
efecto de las mutaciones kre sobre la sensibilidad de estos
inhibidores de
1,3-beta-D-glucano
sintasa, mientras que los alelos mutantes de FKS1 tenían como
resultado la resistencia (fks1-2) o
hipersensibilidad (fks1::HIS3) a estos compuestos. Los resultados
implican que un ensayo microbiano para la inhibición de
1,3-beta-D-glucano
sintasa basado en la susceptibilidad diferencial de una pareja de
cepa mutante/salvaje no sería efectivo con estos mutantes kre, pero
podría ser efectivo con estos mutantes fks1.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: DOUGLAS, Cameron M.
\hskip3,3cmCHREBET, Gary L.
\hskip3,3cmCLEMASl, Joseph
\hskip3,3cmEL-SHERBEINI, Mohammed
\hskip3,3cmFOOR, Forrest
\hskip3,3cmKAHN, Jennifer,
\hskip3,3cmKELLY, Rosemarie, -PARENT, S.A.
\hskip3,3cmMARRINAN, Jean, -RAMADAN, N.M.
\hskip3,3cmMORIN, Nancy, -REGISTER, E.A
\hskip3,3cmONISHI, Janet, -SHEI, Gan-Ju
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ADN QUE CODIFICA LAS SUBUNIDADES DE LA 1,3-BETA-D GLUCANO SINTASA
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: JOSEPH A. COPPOLA - MERCK & CO., INC.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 126 EAST LINCOLN AVENUE - P.O. BOX 2000
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: RAHWAY
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NJ
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 07065
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ for Windows Versión 2.0
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/619.554
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 1 de agosto de 1996
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: COPPOLA, JOSEPH A
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 38.413
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 19104PI
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 732-594-6734
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 732-594-4720
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TELEX:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7655 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1876 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7070 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1895 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2565 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 855 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2069 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 690 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
Claims (13)
1. Una molécula de ADN básicamente pura que
codifica FKS-1 o FKS-2 que tiene una
secuencia de ácido nucleico seleccionada entre la secuencia de la
figura 6 (SEC. ID. Nº 1), la secuencia de la figura 8 (SEC. ID. Nº
3), la secuencia de ADN de la figura 10 (SEC. ID. Nº 5), la
secuencia de la figura 11 (SEC. ID. Nº 7).
2. La molécula de ADN de la reivindicación 1 que
codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la
secuencia de la figura 7 (SEC. ID. Nº 2), la secuencia de la figura
9 (SEC. ID. Nº 4), la secuencia de aminoácidos de la figura 10 (SEC.
ID. Nº 6), la secuencia de la figura 12 (SEC. ID. Nº: 8).
3. La molécula de ADN de las reivindicaciones 1 ó
2 que se ha aislado de un microorganismo.
4. La molécula de ADN de la reivindicación 3,
habiéndose seleccionado el microorganismo entre Aspergillus
fumigatus, Aspergillus nidulans, Candida
albicans, Cryptococcus neoformans, Pneumocystis
carinii y Saccharomyces cerevisiae.
5. La molécula de ADN de la reivindicación 4,
siendo el microorganismo Saccharomyces cerevisiae.
6. La molécula de ADN de la reivindicación 1 que
tiene el mapa de restricción seleccionado entre la figura 1, figura
2, figura 3 y figura 4.
7. La molécula de ADN de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que está unida de forma operativa a
secuencias reguladoras de forma que el ADN puede expresarse tras la
introducción en una célula procariótica o eucariótica.
8. Una proteína básicamente purificada codificada
por la molécula de ADN de una cualquier de las reivindicaciones 1 a
6.
9. Una célula transformada con la molécula de ADN
de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Anticuerpos contra la proteína purificada de
la reivindicación 8.
11. Un vector que comprende el ADN de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. Un método para identificar compuestos que
modulen la actividad de glucano sintasa que comprende:
(a) cultivar dos microorganismos, llevando el
primer microorganismo el ADN de FKS1 y el ADN de FKS2 intactos como
se define en la reivindicación 1, y llevando el segundo organismo un
ADN de FKS1 o un ADN de FKS2 mutante que tiene una sensibilidad a
FK-506 alterada.
(b) incubar alícuotas de los microorganismos de
la etapa (a) con una cantidad cuantificable de un compuesto conocido
que afecta a la glucano sintasa;
(c) incubar alícuotas de los microorganismos de
la etapa (a) con compuestos de ensayo; y
(d) medir la actividad de glucano sintasa en los
microorganismos de la etapa (b) y de la etapa (c).
13. Un método para identificar compuestos que
modulan la actividad de la subunidad
1,3-beta-D glucano sintasa, que
comprende:
(a) mezclar un compuesto de ensayo con una
solución que contiene una subunidad
1,3-beta-D glucano sintasa como se
define en la reivindicación 8 para formar una mezcla;
(b) medir la actividad de la subunidad
1,3-beta-D glucano sintasa en la
mezcla; y
(c) comparar la actividad de la subunidad
1,3-beta-D glucano sintasa de la
mezcla con un patrón.
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