ES2303496A1 - Metodo analitico perfeccionado para la deteccion de hepatitis c oculta, aplicaciones del mismo y su correspondiente kit de diagnostico. - Google Patents
Metodo analitico perfeccionado para la deteccion de hepatitis c oculta, aplicaciones del mismo y su correspondiente kit de diagnostico. Download PDFInfo
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Abstract
Método analítico perfeccionado para la detección de hepatitis C oculta, aplicaciones del mismo y su correspondiente kit de diagnóstico. Dicho método analítico está basado en la técnica del inmunoensayo y se han determinado las condiciones operativas más idóneas para permitir la detección de la hepatitis C oculta. El kit de diagnóstico es el complemento de dicho método. La presente invención tiene aplicación en medicina, investigación biomédica y el campo de las técnicas analíticas.
Description
Método analítico perfeccionado para la detección
de hepatitis C oculta, aplicaciones del mismo y su correspondiente
kit de diagnóstico.
La presente invención se encuadra dentro del
campo técnico de la identificación y detección del virus C de la
hepatitis (VHC).
Más específicamente, la presente invención
proporciona un método analítico perfeccionado y su correspondiente
kit de diagnóstico para la detección de dicho virus C con especial
utilidad en la identificación y detección de las llamadas
"infecciones ocultas por VHC", que no pueden ser detectadas en
muestras de suero o plasma por los métodos analíticos
convencionales, empleados en la actualidad.
El VHC pertenece a la familia de virus animales
denominada Flaviviridae, género Hepacivirus. El
genoma del VHC (VHC-ARN a partir de aquí) consiste
en una molécula de ARN monocatenario de polaridad positiva de
alrededor de 9,4 kilobases (kb) de longitud. Se asume que la
replicación del VHC ocurre mediante la síntesis de una cadena de
ARN de polaridad negativa, es decir, complementaria a la molécula
de ARN genómico del virus que, a su vez, sirve como molde para la
síntesis de nuevas moléculas del ARN genómico. Aunque el hígado es
el principal órgano diana para la infección por VHC, este virus
puede, potencialmente, infectar cualquier tipo de célula, tejido u
órgano dentro del cuerpo humano.
Actualmente existen técnicas que permiten
diagnosticar sin dificultad la infección por VHC en un paciente
mediante la detección en muestras de su suero o plasma de
anticuerpos frente a antígenos del VHC (anti-VHC a
partir de aquí) o del VHC-ARN.
Sin embargo, existe una forma de infección por
VHC descrita muy recientemente, que se caracteriza por ser
"serológicamente silenciosa", en la que los pacientes
infectados no presentan frente a los kits de detección comerciales
ni anti-VHC ni VHC-ARN en su suero
ni en su plasma ("infección oculta" a partir de aquí).
El perfil general de este tipo de pacientes es
el de personas con análisis de la función hepática anómalos desde
períodos de tiempo prolongados, esto es, niveles sanguíneos
anormalmente altos de las enzimas hepáticas. En estos pacientes se
han evaluado todas o una gran parte de las causas conocidas de
enfermedades hepáticas, en los que se han tenido que descartar
sustancialmente todas ellas ya sea con base a datos analíticos,
clínicos o epidemiológicos, por ejemplo: infección por el virus B
de la hepatitis (los pacientes eran antígeno de superficie de la
hepatitis B y VHB-ADN en suero negativos), VHC (los
pacientes eran anti-VHC y VHC-ARN en
suero negativos), hepatitis autoinmune crónica, hepatitis
alcohólica, síndrome de Gilbert, cirrosis biliar, así como
trastornos autoinmunes, metabólicos y genéticos, junto con factores
de riesgo de daño hepático como ingesta de alcohol, drogas,
fármacos, transfusiones, tatuajes, piercings, comportamiento sexual
descuidado, etc.
Por lo tanto, estamos ante un sector de la
población, con una función hepática alterada que los métodos
analíticos actuales no son capaces de justificar, y que cuya causa
puede ser una infección oculta por una forma de virus C de la
hepatitis. La imposibilidad de diagnosticar de una forma rápida,
eficaz y segura con los medios actuales este tipo de infección tiene
una doble repercusión de gran importancia:
- -
- En primer lugar desde el punto de vista del propio paciente, el cual se encuentra en una situación de total desventaja frente a los pacientes cuya enfermedad es detectable en suero o plasma por los métodos analíticos actuales, en cuyo caso el médico especialista puede ocuparse de su dolencia particular y proporcionarle la terapia más adecuada para su situación concreta.
- -
- En segundo lugar desde el punto de vista epidemiológico y de propagación de la enfermedad derivada del des-conocimiento de la misma tanto por parte del portador como de los especialistas. Así, los pacientes infectados con la forma oculta del virus C de la hepatitis portan VHC-ARN en las células mononucleares de su sangre periférica pero no en su suero, lo que debe ser tenido muy en cuenta en el caso de donaciones de sangre, órganos, hemodiálisis, etc. los cuales pueden estar infectados sin que, en principio, hubiera sospecha de ello. Por otra parte, el conocimiento de la enfermedad, permitirá al especialista aconsejar al paciente las medidas elementales de seguridad para evitar contagios indeseables en su círculo habitual.
Dentro del campo técnico en que nos encontramos,
los investigadores emplean el inmunoensayo como una técnica
analítica habitual, por la fiabilidad de sus resultados. En
particular el enzimoinmunoensayo (EIA) es una técnica analítica
habitual, por su carácter de metodología sencilla, reproducible, de
interpretación objetiva que permite procesar una gran cantidad de
muestras de fluidos corporales en poco tiempo, lo que facilita su
implementación en laboratorios de menor complejidad.
Actualmente existen inmunoensayos comerciales
para determinar en sangre anti-VHC. En estos EIA se
detectan anticuerpos frente a las proteínas estructurales (core y
envuelta) y no estructurales (NS) del VHC. Por otra parte, la
sensibilidad de los EIA comerciales para determinar
anti-VHC en sangre difiere según qué antígenos del
VHC se utilicen para recubrir la fase sólida, ya sean proteínas
individuales ó fusionadas ó fragmentos peptídicos.
El EIA comercial para la detección de
anti-VHC en suero ó plasma humano comprende los
siguientes componentes activos:
- -
- una fase sólida (por ejemplo, los pocillos de una microplaca) revestida de una mezcla de antígenos del VHC: core y/o E2/NS1 y/o NS3 y/o NS4 y/o NS5. La mayoría de los EIA comercializados incluyen al menos los antígenos core, NS3 y NS4.
- -
- control negativo y control positivo de la reacción,
- -
- diluyente de muestra,
- -
- solución de lavado,
- -
- diluyente de conjugado,
- -
- conjugado,
- -
- tampón de substrato y/o solución de substrato,
- -
- solución de parada.
El campo técnico de acción del método EIA
comercial para detectar anti-VHC es la infección
clásica por VHC.
Estos EIA, llamados de cribaje (screening) que
sirven para cribar una muestra de una población de individuos que
han podido estar en contacto con el VHC, presentan una eficacia
reconocida igual o superior al 99% en términos de especificidad y
una sensibilidad analítica cercana al 100% en pacientes con
infección clásica por VHC.
La especificidad del método EIA comercial
disminuye en poblaciones de sujetos inmunocompetentes, como
donantes voluntarios de sangre, personal sanitario, trabajadores de
instituciones penitenciarias o personal militar. Así mismo, la
sensibilidad es menor en individuos inmunodeprimidos [datos del
centro para el control de las enfermedades de Atlanta, EE.UU.,
según la publicación: Morbidity and Mortality Weekly Report
2003;52(No.RR-3):
1-13].
1-13].
Si bien la técnica del inmunoensayo tiene ya un
protocolo de trabajo sobradamente establecido no se escapa a ningún
especialista en el campo, que la determinación específica de cada
antígeno o anticuerpo concreto requerirá de un esfuerzo
investigador para encontrar las condiciones operativas y los
reactivos adecuados a cada caso concre-
to.
to.
Como referencia de lo anterior se aporta una
relación de publicaciones que utilizan el método EIA para
determinar anti-VHC.
(1) Kuo G, et al. Science
1989;244:362-364.
(2) Alter HJ, et al. Lancet
1989;2:1006-1008.
(3) Van der Poel CL, et al.
Vox Sang 1992;62:208-212.
(4) Kleinman S, et al.
Transfusion 1992;32:805-813.
(5) Okamoto H, et al.
Hepatology 1992;15:180-186.
(6) Sällberg M, et al. J Clin
Microbiol 1992;30:1989-1994.
(7) Sällberg M, et al. Immunol
Lett 1992;33:27-33.
(8) Bresters D, et al. J Med
Virol 1992;37:187-191.
(9) Sato A, et al. J Med
Virol 1994;44:88-91.
(10) Sällberg M, et al. J Med
Virol 1994;43:62-68.
(11) Mondelli MU, et al. J Clin
Microbiol 1994;32:2523-2527.
(12) Chen M, et al.
Gastroenterology 1999;116:135-143.
(13) Toyoda H, et al. Am J
Gastroenterol 1999;94:2230-2236.
(14) Laperche S, et al. J Clin
Microbiol 2005;43:3877-383.
(15) Netski DM, et al. Clin
Infect Dis 2005;41:667-675.
(16) Muerhoff AS, et al. J Med
Virol 2008;80:411-418.
En particular, las publicaciones (5), (6), (7),
(8), (9), (10) y (16) del listado anterior hacen referencia al uso
del antígeno core en la determinación de anti-VHC
en distintas situaciones clínicas de la infección clásica por VHC.
Como se puede comprobar en las citadas publicaciones, se ha
empleado proteína core o péptidos de diferentes tamaños para
detectar anticuerpos anti-core del VHC.
A modo de ejemplo, en la referencia (5) se
describe el uso de un péptido sintético core 5-23,
que permite detectar anti-VHC por EIA.
En las publicaciones (6) y (7) y otras
relacionadas se lleva a cabo un análisis de las regiones
antigénicas de la proteína core del VHC (que comprende los
aminoácidos 1 a 190) para identificar las regiones inmunodominantes
mediante el uso de péptidos sintéticos que permitan caracterizar la
respuesta inmune en la infección "clásica" por VHC. En
concreto: 1) se identifica un péptido que comprende los aminoácidos
1-17 del extremo amino de la proteína core; 2) se
localiza la región antigénica principal en la secuencia de
aminoácidos 9-16; 3) mediante EIA usando un péptido
core se detectan anticuerpos anti-VHC de tipo IgG
en el 83% de los sueros de pacientes con anti-VHC
detectable por EIA comercial.
Por otra parte, en la referencia (17) y otras
relacionadas se describe tanto el uso de péptidos sintéticos de la
proteína core de genotipo la como antígenos de VHC para detectar
anti-VHC. El empleo de péptidos de core de VHC con
secuencias de aminoácidos 1-18,
10-24, 11-28 1-30,
10-43 y otros, produjo diferentes porcentajes de
detección de anti-VHC mediante EIA. A modo de
ejemplo, el porcentaje de detección de anti-VHC en
sueros de pacientes con infección clásica por VHC genotipo 1 (con
resultado anti-VHC positivo por EIA comercial)
usando cada péptido fue: 78% con core 1-18; 89% con
core 10-24; 85% con core 11-28; 93%
con core 1-30; 100% con core 10-43.
En esta publicación no se refieren datos de determinación de
anticuerpos anti-core en sujetos
anti-VHC negativo por EIA comercial.
El equipo investigador que ha desarrollado la
presente invención viene utilizando el inmunoensayo durante los
últimos años para sus determinaciones de VHC tanto en sangre (suero
ó plasma) como en sobrenadantes de cultivos de células humanas. Ha
utilizado el inmunoensayo para las determinaciones analíticas de
VHC en muestras de suero o plasma y en muestras de sobrenadantes de
cultivos celulares, con resultados expuestos en las referencias
siguien-
tes:
tes:
(1) Quiroga JA, et al.
Hepatology 1991;14:38-43.
(2) Quiroga JA, et al. Clin
Diag Lab Immunol 1994;1:545-551.
(3) Quiroga JA, et al. J Infect
Dis 1996;173:300-305.
(4) Martín J, et al.
Cytokine 1998;10:635-644.
(5) Quiroga JA, et al. J Clin
Microbiol 2006;44:4559-4560.
Si bien los EIA comerciales detectan
anti-VHC en la infección "clásica" por VHC, no
funcionan (es decir, se obtiene un resultado negativo) con la
variedad "oculta" de la enfermedad. Posiblemente, los EIA
comerciales no son suficientemente sensibles para detectar
cantidades traza de anti-VHC. La razón por la que
pueden no funcionar correctamente es que la mezcla de antígenos que
recubren la fase sólida puede interferir e impedir la detección de
cantidades traza de anti-VHC.
Para solventar estos problemas se han intentado
algunas modificaciones o aplicaciones alternativas.
Así, se determinó la presencia de
anti-VHC mediante la prueba MONOLIS® HCV
Ag-Ab ULTRA (Bio-Rad Laboratories,
Marnes-la-Coquette, Francia) en
muestras de suero de pacientes diagnosticados de infección oculta
por VHC (resultado anti-VHC negativo con los EIA
comerciales: Ortho HCV 3.0 ELISA, Ortho Diagnostic Systems,
Raritan, NJ, EE.UU.; e INNOTEST HCV Ab IV, Innogenetics, Gante,
Bélgica). La prueba MONOLIS® HCV Ag-Ab ULTRA sólo
fue capaz de detectar la presencia de anti-VHC en
el suero de 1 paciente con infección oculta por VHC [Quiroga JA,
et al. J Clin Microbiol
2006;44:4559-4560].
De estos datos se deduce que las alternativas
para detectar anti-VHC no han funcionado.
De lo anteriormente expuesto se deduce que es
evidente la necesidad de disponer de un método rápido, seguro y
eficaz para la determinación de la existencia de infección oculta
por VHC en un sujeto que se sospeche pueda estar infectado. El
método "gold standard" para identificar una infección oculta
por VHC es la detección de VHC-ARN en tejido
hepático obtenido mediante una biopsia de hígado.
En este sentido, la Patente Española Nº.
200303050 describe un método analítico basado en la técnica de la
hibridación in situ que permite la detección en tejido
hepático del VHC-ARN y por tanto, la identificación
de la infección oculta por VHC que no puede detectarse en muestras
de suero o plasma por los métodos analíticos convencionales.
No obstante, la biopsia es un procedimiento
invasivo que no siempre se realiza pues entraña riesgos para el
enfermo. Por tanto, se necesita disponer de un método sencillo y
sensible que permita realizar el diagnóstico en sangre de la
infección "oculta" por VHC.
Los investigadores han profundizado en la
búsqueda de los parámetros determinantes del protocolo de
inmunoensayo (por ejemplo, método de preparación de la matriz de
reacción, pretratamiento de las muestras anterior a la reacción
inmunoquímica, tipo y concentración del antisuero conjugado, tiempo
necesario para que se produzca la reacción inmunoquímica, etc.)
para el diagnóstico de una potencial infección oculta por virus
C.
La presente invención, tal y como se describe en
su enunciado, se refiere a un método analítico perfeccionado para
detección de hepatitis C oculta, a las aplicaciones del mismo y a
su correspondiente kit de diagnóstico.
En concreto, refiere a un inmunoensayo de
cribaje. Una realización preferente de lo anterior es un
inmunoensayo seleccionado entre un ELISA, un radioinmunoensayo, un
inmunoensayo fluorescente, quimioluminiscente o
bioluminiscente.
Dicho inmunoensayo de cribaje para la detección
de hepatitis C oculta utiliza muestras de suero o plasma derivado
de sangre periférica o proveniente de órganos, fluidos producidos o
secretados por células aisladas, o secreciones de tejidos o de
órganos.
Una realización preferente de la invención está
constituida por un inmuonensayo de cribaje para la detección de la
hepatitis C oculta que utiliza como antígeno un péptido de la
proteína Core del VHC, y una realización más preferente aún utiliza
como antígeno el péptido representado por la secuencia SEQ.ID.NO:
1.
La realización más preferente de la invención es
un ELISA que utiliza como antígeno el péptido representado por la
secuencia SEQ.ID.NO: 1.
Esta realización más preferente detecta mediante
EIA anti-core de VHC de tipo IgG en el suero del
98% de pacientes con infección clásica por VHC genotipo 1 (con
resultado anti-VHC positivo por EIA comercial). La
aplicación novedosa es que también detecta
anti-core de VHC de tipo IgG en el suero del 40% de
pacientes con infección oculta por VHC (es decir, con resultado
anti-VHC negativo por EIA comercial), por lo que
puede afirmarse que el método analítico objeto de esta invención
aumenta la sensibilidad de los EIA descritos, mejora el diagnóstico
serológico y puede ser útil para la trazabilidad de la infección
oculta por VHC.
Otra realización de la invención es un
inmuoensayo de cribaje que utiliza como antígeno un péptido que
contiene el representado por la secuencia SEQ.ID.NO: 1.
Por otra parte, en otros experimentos efectuados
por los investigadores se observó que péptidos de menor longitud,
con secuencias de entre 6 y 10 aminoácidos a partir del extremo
amino de la proteína core, presentaban funcionalidad como antígeno.
Sin embargo, la sensibilidad de la detección de
anti-VHC era menor que usando el péptido de 15
aminoácidos de la realización más preferente de la invención.
De modo que otra realización de la invención
utiliza como antígeno del inmunoensayo de cribaje un péptido con al
menos 6 aminoácidos correlativos a partir del extremo
NH-terminal del péptido representado por SEQ.ID.NO:
1.
De acuerdo con las opciones que ofrece el estado
de la técnica, dicho inmunoensayo puede utilizar un antisuero
marcado con un marcador isotópico o no isotópico. Entre estos
últimos, una realización preferente de la invención comprende
utilizar un fluoróforo, un cromóforo, una enzima o cualquier otra
molécula que produzca un conjugado apto para el inmunoensayo. Una
realización más preferente aún utiliza un antisuero
anti-IgG humana conjugado con la enzima peroxidasa
de rábano (anti-IgG-HRP).
Otra realización preferente de la invención está
constituida por un kit de diagnóstico para la puesta en práctica de
dicho método analítico para la detección de la hepatitis C oculta.
En concreto, dicho kit comprende como elementos fundamentales del
inmunoensayo de cribaje a realizar una Matriz de reacción, Reactivo
VHC, Agente bloqueante, Diluyente de muestra, Solución de lavado,
Solución de conjugado y Reactivos para el revelado de la reacción
inmunoquímica.
En concreto, el inmunoensayo de cribaje que se
puede efectuar con este kit está seleccionado entre un ELISA, un
radioinmunoensayo, un inmunoensayo fluorescente, quimioluminiscente
o bioluminiscente.
Dicho inmunoensayo de cribaje contenido en el
kit para la detección de hepatitis C oculta utiliza muestras de
suero o plasma derivado de sangre periférica o proveniente de
órganos, fluidos producidos o secretados por células aisladas, o
secreciones de tejidos o de órganos.
Una realización preferente de este kit de
diagnóstico utiliza el péptido representado por la SEP.ID.NO.1 o un
péptido mayor que lo contenga.
Otra realización de este kit utiliza un péptido
de al menos 6 aminoácidos correlativos a partir del extremo
NH-terminal del representado por la SEQ.ID.NO:
1.
El método analítico de la presente invención
basado en la técnica del inmunoensayo puede resumirse
esquemáticamente como sigue:
Dado que el método analítico de la presente
invención está destinado especialmente a la detección de
anti-VHC en la infección oculta, es preciso poner a
punto las diferentes etapas de la técnica general a este caso
concreto, para poder conseguir el método analítico perfeccionado
objeto de la presente invención.
La reacción inmunoquímica en la que se basa la
técnica del inmunoensayo en fase sólida se lleva a cabo en un
soporte o matriz de reacción que puede ser del tipo microplaca
dividida en celdillas o pocillos para muestras individuales, tubos,
esferas, tiras o combinaciones de los mismos, de un material
orgánico del tipo poliestireno, polietileno, polivinilo,
policarbonato, celulosa, etc.
Las moléculas diana del método son anticuerpos
anti-VHC específicos de la proteína estructural
core del virus C de la hepatitis. Las muestras que contienen estas
moléculas diana pueden ser de suero o plasma. Estas muestras
provendrán de pacientes en los que no se detecten en su suero o
plasma los anticuerpos anti-VHC ni el
VHC-ARN por los métodos comerciales disponibles,
pero posean valores anómalos sostenidos de las enzimas hepáticas en
sangre. Las muestras se obtienen normalmente a partir de una
extracción de sangre de los pacientes.
Los siguientes ejemplos ilustran el método de la
invención sin ser en modo alguno limitantes de ésta.
Ejemplo
1
Para obtener la muestra de suero o plasma, se
realiza la extracción de 10 ml de sangre venosa mediante un
dispositivo apropiado y se dispone la sangre en un tubo de cristal
tipo Vacutainer® (Beckton-Dikinson, Plymouth, RU)
con gel en la parte inferior, diseñado para la obtención de suero,
o que contenga anticoagulante (170 unidades internacionales de
heparina de litio) para la obtención de plasma. La sangre se
centrifuga 20 minutos a 1.200 x g a temperatura ambiente (entre 20
y 25ºC) en una centrífuga Heraeus Megafuge 1.0R (Heraeus, Osterode,
Alemania). Se separa la capa superior que contiene el suero o
plasma y se dispone aproximadamente 1 ml en un tubo de poliestireno
con tapón, apto para almacenar el suero o plasma a -20ºC hasta su
empleo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El reactivo VHC utilizado en el método objeto de
la invención es un pentadecapéptido sintético con secuencia
representada por SEQ.ID.NO: 1, que comprende los aminoácidos del 5
al 19 del extremo N-terminal de la proteína core
del VHC (en adelante, péptido core 5-19). El
péptido core 5-19 fue sintetizado por la compañía
GeneScript Corporation (Scotch Plains, NJ, EE.UU.) El péptido core
5-19 liofilizado contiene 7 mg de proteína con una
pureza del 93,8% según análisis realizado por cromatografía líquida
de alta resolución y espectrometría de masas. El péptido core
5-19 liofilizado se disuelve en H2O ultrapura
(Milli-Q; Millipore, Molsheim, Francia) para obtener
una concentración de 1 mg/ml; se reparte en partes alícuotas de
220 \mul en tubos estériles de polipropileno de 1 ml con tapón y
se almacena a una temperatura de -20ºC hasta su empleo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La fase sólida consiste en una placa de
poliestireno microtiter EIA de 96 pocillos de fondo plano, sin
tapa, estéril (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.). Para preparar la
matriz de reacción, se descongela hasta 4ºC una alícuota de péptido
core 5-19 de las descritas en el ejemplo 2. Se
prepara una solución de reactivo de 10 \mug/ml de concentración
para lo que se mezclan 110 \mul de péptido core
5-19 reconstituido y 10,89 ml de solución tamponada
de carbonato sódico 0,1 M pH 9,6 pre-enfriada a 4ºC.
En cada pocillo de la placa se disponen 100 \mul de solución de
péptido core 5-19 de 10 \mug/ml y se incuba
durante 18 horas a una temperatura de 4ºC sin agitación en una
cámara frigorífica modelo S-1000-2
(Azkoyen, Madrid, España). Al finalizar la incubación cada pocillo
de la placa se lava 2 veces con un volumen de 200 \mul de
solución de lavado formada por tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,4
al que se añade 0,05% de
polioxietilen-(20)-sorbitan monolaureato
(Tween-20®; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
EE.UU.). Al acabar el último lavado se retira el exceso de solución
de lavado por inversión de la placa sobre una toalla de papel. A
continuación se añaden 150 \mul del agente bloqueante compuesto
por solución tamponada de fosfato sódico y potásico 0,1 M pH 7,4
suplementada con 10% de suero fetal bovino inactivado por
calentamiento a 56ºC durante 30 minutos (Sera Laboratories
International Ltd., West Sussex, RU) a la que se añade 0,05% de
Tween-20® y se incuba 60 minutos a 37ºC en una
estufa Heraeus modelo I-42. Al final de la
incubación se retira el exceso de agente bloqueante por inversión
de la placa. Cada pocillo se lava 2 veces con un volumen de 200
\mul de solución de lavado. Al acabar el último lavado se retira
el exceso de solución de lavado por inversión de la placa sobre una
toalla de papel. Al finalizar esta etapa la matriz de reacción está
lista para proceder a incubar con las muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se descongela la muestra de suero o plasma desde
-20ºC hasta temperatura ambiente (entre 20 y 25ºC), volteando el
tubo para homogeneizar su contenido antes del pretratamiento. Este
pretratamiento es una etapa crucial en el método objeto de
invención, paso no especificado en los protocolos de la mayoría de
los EIA comerciales. Consiste en una incubación cuya finalidad es
adsorber los componentes de la muestra para eliminar las uniones
antígeno-anticuerpo no específicas que puedan
enmascarar las cantidades traza de anti-VHC. Se
disponen 50 \mul de muestra de suero o plasma en un microtubo de
polipropileno de 1,5 ml de capacidad (Sarsted, Nümbrecht, Alemania)
y se añaden 450 \mul de solución tamponada de fosfato sódico y
potásico 0,1 M pH 7,4 suplementada con 10% de suero fetal bovino
(Sera Laboratories International Ltd.) a la que se añade 0,05% de
Tween-20® (Sigma). La mezcla se incuba 1 h a 37ºC
en un incubador Thermomixer modelo 5436 (Eppendorf, Hamburgo,
Alemania).
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ejemplo
5
Unas muestras pretratadas según el ejemplo
anterior (100 \mul) se añaden a los pocillos de la matriz de
reacción; la placa se cubre con una lámina transparente ("Plate
Sealer", Perkin Elmer - Wallac, Turku, Finlandia) y se incuba 1
h a 37ºC en una estufa Heraeus modelo I-42. Al
finalizar la incubación se retira la lámina transparente y cada
pocillo se lava 5 veces con un volumen de 200 \mul de solución de
lavado. Al acabar el último lavado se retira el exceso de solución
de lavado por inversión de la placa sobre una toalla de papel.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El antisuero conjugado usado en el método objeto
de invención es un antisuero policlonal
anti-inmunoglobulina de tipo G (IgG) humana
obtenido en conejo mediante inmunización con IgG aislada de sueros
humanos normales y conjugado con la enzima peroxidasa de rábano
(anti-IgG-HRP; DakoCytomation A/S,
Glostrup, Dinamarca). El antisuero conjugado se suministra en forma
líquida en solución tamponada de Tris-HC1 0,05
mol/l, NaN_{3} 15 mmol/1, pH 7,2 con una concentración de 1
mg/ml. Se mantiene a 4ºC hasta su uso. Para preparar la solución de
antisuero conjugado se mezclan 11 \mul de
anti-IgG-HRP y 11 ml de solución de
agente bloqueante (descrito en el ejemplo 3) por lo que se obtiene
una dilución 1:1000, óptima para este tipo de EIA [Harlow D &
Lane D. Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, New York; 1988: pp592]. Se añaden 100 \mul de la
solución de antisuero conjugado a cada pocillo de la reacción para
detectar la reacción inmunoquímica
antígeno-anticuerpo; la placa se cubre con una
lámina transparente ("Plate Sealer", Perkin Elmer - Wallac) y
se incuba 1 h a 37ºC en una estufa Heraeus modelo
I-42. Al finalizar la incubación se retira la
lámina transparente y cada pocillo se lava 5 veces con un volumen
de 200 \mul de solución de lavado. Al acabar el último lavado se
retira el exceso de solución de lavado por inversión de la placa
sobre una toalla de papel.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
En el método objeto de invención se emplea como
solución de revelado la sal diamónica de
2,2'-azinobis-[3-etilbenzotiazolina-6-ácido
sulfónico] (ABTS; Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). ABTS es un
substrato cromogénico de la peroxidasa de rábano que da lugar a la
formación de un producto de color verde cuando se oxida. ABTS se
suministra como solución líquida lista para su uso (no requiere
preparación ulterior) y se almacena a 4ºC hasta su empleo. Antes de
usar la solución de ABTS se atempera a temperatura ambiente (entre
20 y 25ºC). El substrato ABTS (100 \mul/pocillo) se añade a los
pocillos de la microplaca y se incuba durante 30 minutos en
oscuridad (para lo cuál se tapa completamente la placa, por ejemplo
con una capa de papel de aluminio) con agitación suave en un
agitador Atom modelo 85 (Atom, Barcelona, España). Opcionalmente,
como solución de parada de la reacción se emplea
n-Dodecilsulfato sódico (Calbiochem - Biosciences
Inc., La Jolla, CA, EE.UU.) al 1A (100 \mul/pocillo). La reacción
se mide en un lector de placas Whittaker modelo 2001 (Anthos
Labtec Instruments, Salzburgo, Austria) a una longitud de onda de
405 nm con longitud de onda de referencia a 620 nm. La intensidad
del color verde dependerá de la cantidad de anti-VHC
presente en la muestra analizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se obtienen las muestras de pacientes
diagnosticados de infección oculta por VHC según el procedimiento
descrito en el ejemplo 1. Se procede a analizar la muestra para
detectar la presencia de anti-VHC mediante ELISA
con el método objeto de la invención. Para ello, se prepara la
matriz de reacción conforme a la descripción del ejemplo 3 usando
el reactivo del ejemplo 2. Se realiza el pretratamiento de la
muestra (en este caso, suero) según el ejemplo 4 y la reacción
inmunoquimica conforme al ejemplo 5 y se procede a detectar la
presencia de anti-VHC mediante ELISA siguiendo los
procedimientos descritos anteriormente en los ejemplos 6 y 7. La
determinación se lleva a cabo por duplicado empleando como
controles las muestras de 3 personas sanas (controles negativos) y
1 paciente anti-VHC positivo por ELISA comercial
(control positivo) obtenidas y procesadas según lo descrito en los
ejemplos 1, 4 y 5. Al medir la reacción se obtienen los siguientes
resultados:
- Los controles negativos dan valores promedio
de 0,047, 0,055 y 0,050 unidades de absorbancia a 405/620 nm; el
valor promedio de los 3 controles negativos es 0,051 unidades de
absorbancia a 405/620 nm y la desviación estándar calculada es
0,004.
- El valor promedio del control positivo es
0,789 unidades de absorbancia a 405/620 nm.
- Se establece el valor de corte entre resultado
NEGATIVO y POSITIVO (valor "cut-off" del
ensayo) como la suma del valor promedio de los 3 controles negativos
más cinco veces la desviación estándar del valor promedio.
- El valor "cut-off" del
ensayo resulta ser de 0,071 unidades de absorbancia a 405/620
nm.
Paciente Nº 1:
Paciente (mujer) que acude a consulta por
presentar valores anómalos de las enzimas hepáticas. Se descartan
las causas conocidas de enfermedad hepática, incluyendo la
infección "clásica" por VHC (anti-VHC y
VHC-ARN no detectables en suero por los métodos
comerciales). Se detecta en biopsia hepática la presencia de
VHC-ARN genotipo 1 por lo que se diagnostica
infección oculta por VHC y se demuestra lesión del hígado (cirrosis
hepática con actividad inflamatoria).
- El suero del paciente Nº. 1 da valores de
absorbancia a 405/620 nm de 0,166 y 0,172 unidades; el valor
promedio del suero del paciente Nº. 1 es de 0,169 unidades de
absorbancia a 405/620 nm. Comparado con el valor
"cut-off" del ensayo, el valor promedio del
suero del paciente Nº. 1 resulta ser mayor, por lo que se le asigna
un resultado POSITIVO: el suero analizado contiene anticuerpos
anti-VHC.
Paciente Nº 2:
Paciente (hombre) que acude a consulta por
presentar valores anómalos de las enzimas hepáticas. Se descartan
las causas conocidas de enfermedad hepática, incluyendo la
infección "clásica" por VHC (anti-VHC y
VHC-ARN no detectables en suero por los métodos
comerciales). Se detecta en biopsia hepática la presencia de
VHC-ARN genotipo 1b por lo que se diagnostica
infección oculta por VHC y se demuestra lesión del hígado
(hepatitis crónica periportal con fibrosis en estadio 2).
- El suero del paciente Nº.2 da valores de
absorbancia a 405/620 nm de 0,102 y 0,107 unidades; el valor
promedio del suero del paciente nº. 1 es de 0,105 unidades de
absorbancia a 405/620 nm. Comparado con el valor
"cut-off" del ensayo, el valor promedio del
suero del paciente Nº. 2 resulta ser mayor, por lo que se le asigna
un resultado POSITIVO: el suero analizado contiene anticuerpos
anti-VHC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se obtienen las muestras de pacientes en
hemodiálisis con sospecha de infección oculta por VHC según el
procedimiento descrito en el ejemplo 1. Se procede a analizar la
muestra para detectar la presencia de anti-VHC
mediante ELISA con el método objeto de la invención. Para ello, se
prepara la matriz de reacción conforme a la descripción del ejemplo
3 usando el reactivo del ejemplo 2. Se realiza el pretratamiento de
la muestra (en este caso, plasma) según el ejemplo 4 y la reacción
inmunoquímica conforme al ejemplo 5 y se procede a detectar la
presencia de anti-VHC mediante ELISA siguiendo los
ejemplos 6 y 7 de la técnica descritos anteriormente. La
determinación se lleva a cabo por duplicado empleando como
controles las muestras de 3 personas sanas (controles negativos) y
1 paciente anti-VHC positivo por ELISA comercial
(control positivo) obtenidas y procesadas según lo descrito en los
ejemplos 1, 4 y 5. Al medir la reacción se obtienen los siguientes
resultados:
- Los controles negativos dan valores promedio
de 0,057, 0,063 y 0,068 unidades de absorbancia a 405/620 nm; el
valor promedio de los 3 controles negativos es 0,062 unidades de
absorbancia a 405/620 nm y la desviación estándar calculada es
0,0057.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- El valor promedio del control positivo es
0,715 unidades de absorbancia a 405/620 nm.
- Se establece el valor de corte entre resultado
NEGATIVO y POSITIVO (valor "cut-off" del
ensayo) como la suma del valor promedio de los 3 controles
negativos más cinco veces la desviación estándar del valor
promedio.
El valor "cut-off" del
ensayo resulta ser de 0,091 unidades de absorbancia a 405/620
nm.
Paciente Nº 3:
Paciente (hombre) que debido a su enfermedad
renal crónica lleva sometiéndose desde hace más de 12 meses a
hemodiálisis. Periódicamente se realiza controles analíticos y
presenta valores anómalos de enzimas hepáticas.
- El plasma del paciente Nº.3 da valores de
absorbancia a 405/620 nm de 0,163 y 0,143 unidades; el valor
promedio de la muestra del paciente Nº.3 es de 0,153 unidades de
absorbancia a 405/620 nm. Comparado con el valor
"cut-off" del ensayo, el valor promedio de la
muestra del paciente Nº.3 resulta ser mayor, por lo que se le
asigna un resultado POSITIVO: el plasma analizado contiene
anticuerpos anti-VHC.
Paciente Nº 4:
Paciente (hombre) que debido a su enfermedad
renal crónica (ERC) lleva sometiéndose desde hace más de 12 meses a
hemodiálisis. Recibe transfusiones de sangre debido a la anemia
asociada a ERC. En un control analítico presenta valores anómalos
de enzimas hepáticas.
- El plasma del paciente Nº.4 da valores de
absorbancia a 405/620 nm de 0,092 y 0,094 unidades; el valor
promedio de la muestra del paciente Nº.4 es de 0,093 unidades de
absorbancia a 405/620 nm. Comparado con el valor
"cut-off" del ensayo, el valor promedio de la
muestra del paciente Nº.4 resulta ser mayor, por lo que se le
asigna un resultado POSITIVO: el plasma analizado contiene
anticuerpos anti-VHC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se obtienen las muestras de personas con riesgo
potencial de infección oculta por VHC (por ejemplo, familiares de
pacientes con infección oculta por VHC) según el procedimiento
descrito en el ejemplo 1. Se procede a analizar la muestra para
detectar la presencia de anti-VHC mediante ELISA con
el método objeto de la invención. Para ello, se prepara la matriz
de reacción conforme a la descripción del ejemplo 3 usando el
reactivo del ejemplo 2. Se realiza el pretratamiento de la muestra
(en este caso, suero) según el ejemplo 4 y la reacción
inmunoquímica conforme al ejemplo 5 y se procede a detectar la
presencia de anti-VHC mediante ELISA siguiendo los
ejemplos 6 y 7 de la técnica descritos anteriormente. La
determinación se lleva a cabo por duplicado empleando como
controles las muestras de 3 personas sanas (controles negativos) y
1 paciente anti-VHC positivo por ELISA comercial
(control positivo) obtenidas y procesadas según lo descrito en los
ejemplos 1, 4 y 5. Al medir la reacción se obtienen los siguientes
resultados:
- Los controles negativos dan valores promedio
de 0,046, 0,050 y 0,047 unidades de absorbancia a 405/620 nm; el
valor promedio de los 3 controles negativos es 0,048 unidades de
absorbancia a 405/620 nm y la desviación estándar calculada es
0,0025.
- El valor promedio del control positivo es
1,466 unidades de absorbancia a 405/620 nm.
- Se establece el valor de corte entre resultado
NEGATIVO y POSITIVO (valor "cut-off" del
ensayo) como la suma del valor promedio de los 3 controles
negativos más cinco veces la desviación estándar del valor
promedio.
- El valor "cut-off" del
ensayo resulta ser de 0,060 unidades de absorbancia a 405/620
nm.
Paciente Nº 5:
Familiar (hermana) de paciente (hombre)
diagnosticado de infección oculta por VHC genotipo 1b y hepatitis
crónica lobulillar leve, que acude a consulta para revisión médica
y control analítico.
- La muestra de suero Nº.5 da valores de
absorbancia a 405/620 nm de 0,169 y 0,173 unidades; el valor
promedio de la muestra Nº.5 es de 0,171 unidades de absorbancia a
405/620 nm. Comparado con el valor "cut-off"
del ensayo, el valor promedio de la muestra Nº.5 resulta ser mayor,
por lo que se le asigna un resultado POSITIVO: el suero analizado
contiene anticuerpos anti-VHC.
Paciente Nº 6:
Familiar (cónyuge) de paciente (hombre)
diagnosticado de infección oculta por VHC genotipo 1, que acude a
consulta para revisión médica y control analítico.
- La muestra de suero Nº. 6 da valores de
absorbancia a 405/620 nm de 0,111 y 0,112 unidades; el valor
promedio de la muestra Nº. 6 es de 0,112 unidades de absorbancia a
405/620 nm. Comparado con el valor "cut-off"
del ensayo, el valor promedio de la muestra Nº. 6 resulta ser
mayor, por lo que se le asigna un resultado POSITIVO: el suero
analizado contiene anticuerpos anti-VHC.
Claims (21)
1. Un método para la detección de hepatitis C
oculta, caracterizado porque utiliza muestras de suero o
plasma de pacientes y porque comprende la realización de un
inmunoensayo de cribaje.
2. Un método según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho inmunoensayo de cribaje está
seleccionado entre un ELISA, un radioinmunoensayo, un inmunoensayo
fluorescente, uno quimioluminiscente o uno bioluminiscente.
3. Un método según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque dichas muestras son de suero o plasma
derivado de sangre periférica o proveniente de órganos del
paciente.
4. Un método según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque dichas muestras son fluidos producidos
o secretados por células aisladas del paciente.
5. Un método según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque dichas muestras provienen de
secreciones de tejidos o de órganos.
6. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho
inmunoensayo de cribaje utiliza como antígeno un péptido de la
proteína Core del VHC.
7. Un método según la reivindicación 6,
caracterizado porque dicho péptido contiene el péptido
representado por la SEQ.ID.NO: 1.
8. Un método según la reivindicación 6,
caracterizado porque dicho péptido es el representado por la
SEQ.ID.NO: 1.
9. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque es un ELISA que
utiliza como antígeno el péptido representado por la SEQ.ID.NO:
1.
10. Un método según la reivindicación 6,
caracterizado porque dicho péptido contiene al menos seis
aminoácidos correlativos a partir del extremo
N-terminal del péptido representado por la
SEQ.ID.NO: 1.
11. Un método según una de las reivindicaciones
1 a 10, caracterizado porque dicho inmunoensayo de cribaje
utiliza un antisuero marcado con un marcador isotópico.
12. Un método según una de las reivindicaciones
1 a 10, caracterizado porque dicho inmunoensayo de cribaje
utiliza un antisuero anti-IgG humana conjugado con
un marcador no isotópico.
13. Un método según la reivindicación 12,
caracterizado porque dicho marcador no isotópico está
seleccionado entre un fluoróforo, un cromóforo, una enzima o
cualquier otra molécula que produzca un conjugado apto para el
inmunoensayo.
14. Un método según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicho marcador no isotópico es la
enzima peroxidasa de rábano,
anti-IgG-HRP.
15. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque es un ELISA que
utiliza como antígeno el péptido representado por la SEQ.ID.NO: 1 y
porque utiliza un antisuero anti-IgG humana
conjugado con la enzima peroxidasa de rábano,
anti-IgG-HRP.
16. Un kit para la detección de la infección
oculta de hepatitis C que comprende los componentes necesarios para
realizar un inmunoensayo de cribaje, caracterizado porque
utiliza muestras de suero o plasma de pacientes.
17. Un kit según la reivindicación 16,
caracterizado porque dicho inmunoensayo de cribaje está
seleccionado entre un ELISA, un radioinmunoensayo, un inmunoensayo
fluorescente, uno quimioluminiscente o uno bioluminiscen-
te.
te.
18. Un kit según las reivindicaciones 16 ó 17,
caracterizado porque el antígeno que utiliza dicho
inmunoensayo de cribaje es un péptido que contiene o es el
representado por la SEQ.ID.NO: 1.
19. Un kit según las reivindicaciones 16 ó 17,
caracterizado porque dicho inmunoensayo de cribaje es un
ELISA que utiliza como antígeno el péptido representado por la
SEQ.ID.NO: 1.
20. Un kit según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, caracterizado porque dicho
inmunoensayo es un ELISA que utiliza como antígeno el péptido
representado por la SEQ.ID.NO: 1 y un antisuero
anti-IgG humana conjugado con la enzima peroxidasa
de rábano, anti-IgG-HRP.
21. Un kit según las reivindicaciones 15 ó 16,
caracterizado porque el antígeno que utiliza dicho
inmunoensayo de cribaje es un péptido que contiene al menos seis
aminoácidos correlativos a partir del extremo
N-terminal del péptido representado por la
SEQ.ID.NO: 1.
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| ES200800493A ES2303496B1 (es) | 2008-02-21 | 2008-02-21 | Metodo analitico perfeccionado para la deteccion de hepatitis c oculta, aplicaciones del mismo y su correspondiente kit de diagnostico. |
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| PCT/ES2009/000019 WO2009103828A1 (es) | 2008-02-21 | 2009-01-16 | Método analítico perfeccionado para la detección de hepatitis c oculta, aplicaciones del mismo y su correspondiente kit de diagnóstico |
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