MXPA98001570A - Vacunas de virus de inmunodeficiencia felina de subtipos multiples - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones novedosos para proteger a gatos de infección por una amplia gama de cepas de VIF, utilizando una vacuna de VIF de subtipos múltiples;se describen vacunas de VIF de subtipos múltiples que comprenden virus completos libres de células o líneas celulares infectadas con virus;se describen también métodos para vacunar gatos con las presentes composiciones de vacuna;los gatos vacunados de conformidad con los métodos y composiciones de la presente invención, exhiben respuestas inmunes celular y humoral protectoras contra VIF cuando se exponen a cepas homólogas o heterólogas de VIF;la presente invención se refiere también a líneas celulares de felino novedosas que son susceptibles a infección por VIF, y a sus métodos de uso.

Description

VACUNAS DE VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA FELINA DE SUBTIPOS MÚLTIPLES La presente invención fue hecha con apoyo del gobierno bajo un proyecto de investigación apoyado por la concesión de Institutos Nacionales de Salud No. NIH A130904. El gobierno de los E.U.A. tiene ciertos derechos en esta invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los gatos domésticos están sujetos a infección por varios retrovirus, incluyendo virus de leucemia felina (VLFe), virus de sarcoma felino (VSFe), oncoronavirus endógeno tipo C (RD-114), y virus formador de sincicios de felino (VFSFe). De estos, el VLFe es el patógeno más significativo, ocasionando diversos síntomas que incluyen neoplasmas linforreticulares y mieloides, anemias, trastornos mediados inmunológicamente, y un síndrome de inmunodeficiencia que es similar al síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) humano. Recientemente, un mutante particular de VLFe defectuoso de replicación, designado como VLFe-SIDA, ha sido asociado muy particularmente con propiedades inmunosupresoras. El descubrimiento de lentivirus T-linfotrópicos felinos (designados ahora como virus de inmunodeficiencia felina, VIF) fue reportado primero por Pedersen y otros (1987).

Se han reportado características del VIF en Yamamoto y otros (1988a): Yamamoto y otros (1988b); y Ackley y otros (1990). Los datos seroepidemiológicos han mostrado que la infección por VIF es innato para los felinos domésticos y silvestres en todo el mundo. Una gran variedad de síntomas están asociados con la infección por VIF, incluyendo aborto, alopecia, anemia, conjuntivitis, rinitis crónica, enteritis, gingivitis, hematoquezia, anormalidades neurológicas, periodontitis y dermatitis seborreicas. La marca inmunológica de los gatos domésticos infectados con VIF es una supresión crónica y progresiva sus linfocitos CD4+ de sangre periférica, una reducción en la relación celular CD4-CD8 y, en algunos casos, un incremento en linfocitos que llevan CD8. En base a características moleculares, bioquímicas e inmunopatológicas, la infección de gatos por VIF es considerada ahora un mejor modelo de SIDA felino que el VLFe-SIDAF. Se ha reportado clonación y análisis de secuencias de VIF en Olmsted y otros (1989a); Olmsted y otros (1989b); y Talbott y otros (1989)., Hosie y Jarret (1990) describieron la respuesta serológica de gatos infectados con VIF. Los subtipos de virus VIF pueden clasificarse de acuerdo con el inmunotipo en base al nivel de anticuerpos de neutralización cruzada provocado por cada cepa (Murphy y Kingsbury, 1990). Recientemente, se han clasificado virus en subtipos de acuerdo a su genotipo en base a homologías de secuencias de nucleótidos. Aunque la subtipificación de VIH y VIF es en base al genotipo (Sodora y otros, 1994; Rigby y otros 1993; y Lou agie y otros, 1993), se sabe poco acerca de la correlación entre el genotipo y el inmunotipo de los subtipos. Los aislados virales de VIF se clasifican actualmente en cuatro subtipos de VIF: A, B, C y D. (Kakinuma y otros, 1995). Se han descrito aislados infecciosos y clones moleculares infecciosos para todos los subtipos de VIF, excepto para el subtipo C (Sodora y otros, 1994). El subtipo C de VIF solamente ha sido identificado de ADN celular de gatos de Canadá (Sodora y otros, 1994: Rigby y otros 1993; Kakinuma y otros, 1995). Una dificultad principal en el desarrollo de una vacuna de VIF ha sido la identificación de una propuesta de vacuna que se efectiva contra una amplia gama de cepas de VIF, incluyendo aislados de campo de diferentes subtipos o clases. La profilaxis con vacuna contra VIF ha sido lograda contra cepas homologas y ligeramente heterólogas usando una vacuna de una sola cepa, pero no contra la exposición a cepas moderadamente a altamente heterólogas (Johnson y otros, 1994; Yamamoto y otros 1993). Por lo tanto, continúa la necesidad de una vacuna que proteja contra subtipos múltiples de VIF.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una vacuna que provoca una amplia gama de inmunidad protectora contra infecciones de VIF en un animal huésped. Específicamente, la invención presente se refiere a una vacuna de VIF de subtipos múltiples que se prepara utilizando aislados virales libres de células de diferentes subtipos de VIF, o una combinación de líneas celulares infectadas cada una con un prototipo diferente de virus VIF de diferente subtipo. Los gatos vacunados con las vacunas VIF de la presente invención desarrollan respuestas inmunes humorales y celulares contra cepas de VIF homologas y heterólogas. La presente invención también se refiere a líneas celulares de felino novedosas, que son susceptibles a infección por subtipos múltiples de VIF. Las líneas celulares de la presente invención son útiles para propagar y producir subtipos múltiples de VIF, así como para usarlas en vacunas de VIF de acuerdo con los métodos de la presente invención. Además, las líneas celulares pueden usarse también en lugar de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de felino en pruebas de neutralización viral de VIF de antisuero felino.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figu ra 1 muest ra los niveles de t ransc riptasa inve rsa (TI ) de VIFß a n g y VIFs h i p roducidos después de infecta r líneas celula res FeT-lC y FeT-J con estas cepas de VIF . La figu ra 2 muest ra la inmuno reacción de anticue rpos anti-VIF de gatos vacunados con subtipo dual con p roteínas de VIF , detectada po r inmunoblot . El núme ro sob re cada mancha representa el número de vacunaciones recibidas por el animal cuando se probó el suero. La figura 3 muestra la in unoreacción de anticuerpos anti-VIF de gatos vacunados con triple subtipo con proteínas de VIF, detectada por inmunoblot. El número sobre cada mancha representa el número de vacunaciones recibidas por el animal cuando se probó el suero. La figura 4 muestra la inmunoreactividad de anticuerpos anti-VIF de gatos vacunados con triple subtipo con péptido SU-V3-2 de VIF, detectada por ELISA. La figura 5 muestra la inmunoreactividad de anticuerpos contra VIF de gatos vacunados con triple subtipo con péptido TM-C1 de VIF, detectada por ELISA. La figura 6 muestra títulos de anticuerpo de neutralización cruzada de suero de gatos infectados, ya sea con VIFpet (AP), VIFDÍX (AD), VIFUKS (AU), VIFßang (BB), VIFAOIBI (BA), y VIFshi(Ds). Se probó el suero antes de infección (columna 1), 6 meses después de infección (columna 2), y 12 meses después de infección (columna 3), contra el subtipo A VIFpßf el subtipo B VIFBang' y subtipo D VIFshi en la línea celular FeT-lC. Se probó por lo menos 3 gatos por cada cepa y los resultados muestran el título de NV de un gato representativo de cada cepa. Se obtuvieron resultados similares usando CMSP primarias para la prueba de NV.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SED ID NO. 1 es un secuencia de aminoácidos de un péptido de cubierta de superficie de VIF designado como SV-V3-2. SEQ ID NO. 2 es un secuencia de aminoácidos de un péptido de ransmembrana de VIF designado como TM-C1. SEQ ID NO. 3 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 4 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 5 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 6 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 7 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 8 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 9 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 10 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 11 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 12 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 13 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 14 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 15 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF. SEQ ID NO. 16 es una secuencia de nucleótidos de un iniciador de RCP de VIF.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y composiciones de vacuna novedosos, útiles para inducir inmunidad protectora contra infección de VIF en un animal huésped susceptible. Las composiciones de vacuna descritas en la presente, cuando se administran a un animal huésped, inducen respuestas inmunes protectoras humorales y celulares contra infección por cepas homologas y heterólogas de VIF. Las composiciones de vacuna pueden comprender aislados virales de VIF libres de células o líneas celulares infectadas con VIF. En una modalidad preferida, la composición de vacuna de la presente invención comprende cepas de VIF de dos diferentes subtipos de VIF. De preferencia, la composición de vacuna comprende 3 cepas de VIF, cada cepa de un subtipo diferente de VIF. Muy preferiblemente, por lo menos una cepa de VIF de cada uno de los subtipos A, subtipo B y subtipo D de VIF, está incluida en la composición de vacuna. En una modalidad específica, la composición de vacuna comprende líneas celulares infectadas con VIFpet- y VIFshi. En otra modalidad, la composición de vacuna comprende líneas r celulares infectadas con VIFpßt-, VIFBang-, y VIFshi. La presente invención contempla específicamente el uso de otras cepas de VIF representativas de todos los subtipos de VIF o una porción de ellos. Por ejemplo, pueden estar incluidos VIFDÍX O VIFUKS en las composiciones de vacuna, además de, o en lugar de, VIFpet, con la finalidad de proveer un prototipo de virus VIF de subtipo A. Pueden hacerse adiciones o substituciones similares con otras cepas de VIF para prototipos de virus de VIF de subtipo B y D. Como se describe en la presente, las composiciones de vacuna de la presente invención pueden comprender virus de VIF completos libres de células, o porciones del virus, proteínas y polipéptidos de VIF, así como líneas celulares infectadas con VIF, o una combinación de virus libres de células y líneas celulares infectadas. Las composiciones de vacuna que comprenden líneas celulares infectadas con VIF pueden comprender líneas celulares múltiples, infectadas cada con un subtipo diferente de VIF. Las composiciones de vacuna de la presente invención abarcan también construcciones de VIF a base de vector viral recombinante que pueden comprender, por ejemplo, VIFenv, gag/pro, o env-gag/pro. Cualquier vector viral adecuado que puede usarse para preparar construcciones recombinantes de vector/VIF, está contemplado para usarse con la presente invención. Por ejemplo, pueden usarse vectores virales derivados de adenovirus, enfermedad eruptiva de aves, virus de herpes felino, vaccinia, enfermedad eruptiva de canarios, enfermedad eruptiva de insectos, enfermedad eruptiva de cerdos y otras conocidas en la técnica, con las composiciones y métodos de la presente invención. Pueden construirse vectores de polinucleótidos recombinantes que codifican y expresan componentes de VIF, utilizando técnicas estándar de ingeniería genética conocidas en la técnica.

Además, las diferentes composiciones de vacuna descritas en la presente pueden usarse separadamente y en combinación una con otra. Por ejemplo, inmunizaciones primarias de un animal pueden usar construcciones de VIF a base de vector recombinante, teniendo componentes de un solo subtipo o de subtipos múltiples, seguido por refuerzos secundarios con composiciones de vacuna que comprenden líneas celulares infectadas con VIF inactivado. Otros protocolos de inmunización con las composiciones de vacuna de la invención son evidentes para las personas expertas en la materia y se contemplan dentro del alcance de la presente invención. Se probaron las vacunas de VIF de subtipos múltiples descritas específicamente en la presente, para determinar su inmunogenicidad y eficacia en gatos. Fueron monitoreados en gatos libres de patógenos específicos (LPE) vacunados con las composiciones de vacunas presentes para analizar respuestas inmunes humorales y celulares, antes y después de exposición a las cepas homologas y heterólogas de VIF. Las respuestas humorales fueron monitoreadas midiendo la actividad de anticuerpo neutralizante viral (NV) y las respuestas celulares fueron monitoreadas midiendo la actividad citotóxica de los linfocitos T (CLT). Se probó in vitro suero e inmunocitos de gatos vacunados para determinar sus actividades NV y CLT, respectivamente, contra cepas homologas y heterólogas de VIF, y se demostró que las vacunas pueden provocar protección de amplio espectro contra infección por VIF. De acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, combinando aislados de prototipos virales de diferentes subtipos de VIF, o combinando células individuales infectadas con prototipos virales de diferentes subtipos, puede producirse una vacuna efectiva de VIF de subtipos múltiples. Todas las cepas de VIF, además de las ejemplificadas específicamente en la presente, están contempladas para usarse con la presente invención. Se ha descrito un número de aislados de VIF en la literatura, y son conocidos para el experto en la materia. VIFpet ha sido descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,037,753. Otros aislados de VIF que han sido descritos pueden aislarse fácilmente de gatos infectados por personas expertas en la materia, utilizando técnicas estándar. Los métodos para aislar y cultivar VIF se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,037,753 y 5,118,602, que se incorporan en la presente como referencia. Las líneas celulares novedosas ejemplificadas en la presente pueden usarse en los métodos de vacuna y composiciones de la presente invención. También están contempladas otras células o líneas celulares que son susceptibles a infección por cepas de VIF, incluyendo células mononucleares de sangre periférica. También pueden usarse polipéptidos naturales, recombinantes o sintéticos de proteínas virales de VIF, y fragmentos de péptido de los mismos, como composiciones de vacuna de conformidad con los presentes métodos. En una modalidad preferida, los polipéptidos de VIF derivados de subtipos múltiples de VIF, están combinados en una composición de vacuna y se usan para vacunar a un animal huésped. Por ejemplo, puede combinarse en la vacuna los polipéptidos a base de glicoproteína de envoltura de VIF de por lo menos dos cepas prototipo de VIF de diferentes subtipos. Los polipéptidos pueden ser homólogos a una cepa o pueden comprender polipéptidos "híbridos" o "quiméricos", cuya secuencia de aminoácidos se deriva de polipéptidos de unión o enlace de por lo menos dos subtipos distintos de VIF. Los procedimientos para preparar polipéptidos de VIF son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede sintetizarse polipéptidos de VIF utilizando métodos de síntesis en fase sólida (Merrifield, 1963). Puede producirse también polipéptidos de VIF utilizando técnicas de ADN recombinante en las cuales una molécula de polinucleótido que codifica una proteína o péptido de VIF, es expresada en una célula huésped, tal como bacteria, levadura, o líneas celulares de mamífero, y la proteína expresada es purificada utilizando técnicas estándar de la técnica. La presente invención también se refiere a líneas novedosas de células T felinas que son susceptibles de infección por VIF. Específicamente, están ejemplificadas células tanto dependientes como independientes de interleucina- 2 (IL-2). En la presente se describen líneas celulares designadas como FeT-lC y FeT-J. La línea celular FeT-lC es dependiente de IL-2, mientras que la línea celular FeT-J es independiente de IL-2. Las líneas celulares de la presente « invención son útiles para proveer un vehículo para inmunización de VIF de gatos, así como para propagar y producir cepas virales de VIF in vitro. Las líneas celulares no infectadas FeT-lC, dependientes de IL-2, y FeT-J, independientes de IL-2, fueron analizadas por 20 veces para determinar la actividad de transcriptasa inversa (TI) en fluidos de cultivo y para determinar la secuencia proviral de VIF mediante RCP, y se confirmaron como negativos para VIF. La línea celular FeT-J fue altamente infectable con todas las cepas probadas de VIF, incluyendo VIFshi, VIFDÍX, VIFUKS , VIFpet y VIFßang, pero fue más difícil para infectar directamente con VIFshi. La presente invención también se refiere a productos celulares producidos por las líneas celulares de la presente invención. Los productos celulares pueden aislarse y detectarse utilizando procedimientos conocidos para el técnico experto. También se puede producir anticuerpos para las líneas celulares utilizando los métodos conocidos, y se contempla con la presente invención. 5 Las líneas celulares no infectadas de VIF, designadas como FeT-lC (Acceso ATCC No. CRL 11968), y como FeT-J (Acceso ATCC No. CRL 11967) fueron depositadas con la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland el 24 de Agosto de 1995. Líneas celulares infectadas VIFBang, (Acceso ATCC No. 0 11975) y VIFshi (Acceso ATCC No. 11976), se depositaron con la American Type Culture Collection el 25 de Agosto de 1995. k Los presentes cultivos se depositaron bajo r condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante el tiempo en que esté pendiente esta 5 Solicitud de Patente, determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas, titulado en el mismo bajo 37 CFR 1.14 y 35 U.S.C. 122. El depósito estará disponible, según se requiera por las leyes extranjeras de Patentes en los países en los cuales se presentan las contrapartes de la presente Solicitud o 0 su progenie Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención en derogación de los derechos de patente concedidos por acción gubernamental. Además, el depósito del presente cultivo será 5 guardado y hecho disponible al público de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, es decir, será guardado con todo el cuidado necesario para mantenerlo viable y no contaminado durante un período de por lo menos cinco años después de la Solicitud más reciente para la habilitación de una muestra del depósito, y en cualquier caso, durante un período de por lo menos treinta (30) años después de la fecha de depósito o para la vida ejecutable de cualquier Patente que pueda expedirse describiendo el cultivo. El depositante reconoce la obligación de reemplazar el depósito si el depositante es incapaz de producir una muestra cuando sea solicitada, debido a la condición del depósito. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público del presente depósito de cultivo serán retiradas irrevocablemente por la concesión de una Patente que la describe. De conformidad con los métodos de la presente invención, las composiciones de vacuna de VIF descritas en la presente son administradas a huéspedes susceptibles, típicamente gatos domésticos, en una cantidad efectiva y en una manera para inducir inmunidad protectora contra exposición o infección subsecuente del huésped por VIF. Típicamente, las vacunas se administran parenteralmente, por inyección, por ejemplo, ya sea subcutáneamente, intraperitonealmente, o intramuscularmente. Otros modos adecuados de administración incluyen administración oral o nasal. Usualmente, las vacunas se administran a un huésped por lo menos dos veces, con un intervalo de una o más semanas entre cada administración. Sin embargo, se contemplan otros regímenes para las administraciones inicial y de refuerzo de la vacuna, y puede depender del juicio del practicante y del animal huésped particular a tratar. Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las vacunas se preparan típicamente como inyectables, por ejemplo, soluciones o suspensiones líquidas. Las vacunas se administran en una manera que es compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sea terapéuticamente efectiva e inmunogénica en el receptor. Los patrones de dosificación y administración óptimos para una formulación particular de vacuna pueden ser determinados fácilmente por un experto en la materia. Los virus y células en una formulación de vacuna pueden ser inactivadas o atenuadas utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se les puede inactivar o atenuar a virus intactos y células infectadas mediante exposición a paraformaldehído, formalina, fenol, luz UV, temperatura elevada y similares. La cantidad de virus de VIF intacto libre de células en una dosis de vacuna usualmente estará en la escala aproximadamente de 0.1 mg a aproximadamente 5 mg, y de manera más usual aproximadamente de 0.2 mg a aproximadamente 2 mg. La dosificación para formulaciones de vacuna que comprende líneas celulares infectadas con VIF contendrá usualmente aproximadamente de 106 a aproximadamente 108 células por dosis, y más usualmente aproximadamente de 5 x 106 , a aproximadamente 7.5 x 107 células por dosis. Los virus o las células se combinan típicamente con un adyuvante justo antes de su administración. Los adyuvantes usados en las formulaciones de vacuna típicamente son, ya sea dipéptido de treonil-muramilo (MDP) (Byars y otros, 1987), o una combinación de adyuvantes completos e incompletos de Freud. Una variedad de otros adyuvantes adecuados para usarse con los métodos y vacunas de la presente invención, tales como alumbre, son bien conocidos en la técnica y se contemplan para usarse con la presente invención. La presente invención se refiere además a un método novedoso para analizar anticuerpos neutralizadores de virus (NV) en una muestra, utilizando las líneas celulares no infectadas de la presente invención. A diferencia de las CMSP que expiran después de un número limitado de pases, y no se propagan tan fácilmente como las células FeT-lC o FeT-J, las células FeT-lC y FeT-J son una línea celular establecida y puede conservarse en frío fácilmente para uso futuro. Los resultados obtenidos para las pruebas de NV utilizando células FeT-lC son más altamente reproducibles que las pruebas de NV utilizando CMSP, debido a que las CMSP de diferentes gatos LPE tienen variabilidad individual en velocidad de crecimiento celular e infectabilidad de VIF. Además, las CMSP para las pruebas de NV tienen que obtenerse de gatos LPE que requieren alojamiento y mantenimiento libres de gérmenes para eliminar posible infección un vivo que puede afectar una prueba de NV in vitro utilizando CMSP. De esta manera, una línea celular de felino tal como FeT-lC, que puede ser infectada fácilmente con VIF de diferentes subtipos, puede substituir ventajosamente a las CMSP en las pruebas de NV. En la presente, se utilizan las siguientes abreviaciones de las cepas de VIF: Cepa (Subtipo) Abreviación Petaluma (A) VIFpet Dixon (A) VIFDÍX UK8 (A) VIFUKS Bangston ( B) VIFB a n g Aomo ri -1 (B) VIFA o m i Aomo ri -2 (B) VI FA o m 2 Shizuoka (D) VIFs h i MATERIALES Y MÉTODOS Cultivos Celulares. Todas las líneas celulares en suspensión se cultivaron en RPMI 1640 que contenía suero de carnero fetal (SFC) al 10% inactivado con calor, lOmM de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazin-n' -2-etanosulfónico) , 2 mM de L-glutamina, 50 µg/ml de gentamicina y 5xl0~5 M de 2-mercaptoetanol. Las células dependientes de IL-2 fueron suplementadas con 100 U/ml de IL-2 humano recombinante (Cetus Corporation, Emeryville, Calif.). Las células en suspensión se pasaron a una concentración celular de 0.5-4xl06 células/ml y se recultivaron en medio de cultivo reciente dos veces a la semana. Todas las células de monocapa se pasaron dos veces una semana a una concentración celular inicial de 2xl06 células/ml. Los fluidos de cultivo de tejido (FCT) de células infectadas con VIF se cosecharon dos veces en una semana, se rotaron a 3000 rpm durante una hora para remover células residuales, y se guardaron a -20°C, o a -70°C para aquellos FCT programados para usarse inmediatamente para prueba. Se infectó células susceptibles a VIF (lxlO6 células/ml) con VIF que tenía una actividad de transcriptasa inversa (TI) de aproximadamente 30,000 cpm/ml. Purificación de VIF. Se centrifugó individualmente fluidos de cultivo de tejidos de líneas celulares infectadas con VIF a 2000 - 3000 rpm durante una hora para remover las células. Los virus en el FCT se formaron en pellas mediante ultracentrifugación a 16000 rpm durante dos horas, y se purificaron mediante ultracentrifugación primero sobre un gradiente discontinuo de sacarosa 10/50% (p/w) y después sobre un gradiente de sacarosa continuo 10/50% (Pederson y otros, 1987; Yamamoto y otros, 1988). Cada uno de los aislados virales fue inactivado con paraformaldehído estéril al 1.25% (0.22 µm de filtrado estéril) durante 18 horas y subsecuentemente se dializó extensamente contra PBS estéril. Los virus inactivados se diluyeron hasta una concentración de 500 µg/ml con PBS estéril, y 250 µg/0.5 ml de cada cepa se colocó en tubos de microcentrífuga estériles y se guardaron a -70°C. Las cepas de VIF inactivadas se descongelaron a temperatura ambiente y se combinó 250 µg de virus inactivado en 0.5 ml de PBS estéril con 0.5 ml de adyuvante, justo antes de inmunización. Las líneas celulares infectadas con VIF se inactivaron separadamente con paraformaldehído estéril al 1.25% durante 18 horas, se lavaron tres veces con PBS estéril, se resuspendieron en PBS estéril reciente a una concentración aproximadamente de 5.0xl07 células/ml en tubos estériles y se guardaron a 4°C. Típicamente, se combinó aproximadamente 2.5 x 107 de células infectadas inactivadas en 0.5 ml de PBS estéril con 0.5 de ml adyuvante, justo antes de inmunización. Se usó como adyuvante 250 µg/0.5 ml de dipéptido de treonil-muramilo (adyuvante MDPMF75.2; Chiron Corporation, Emerville, California). Prueba de CLT. Se estimuló células mononucleares de sangre periférica (CMSP) con concanavalina A (Con A) durante 3 días antes de infección con VIF, durante 10 días (Song y otros, 1992). Estas células sirvieron como células blanco para la prueba de CLT. Se generó actividad de CLT mediante cocultivo de CMSP estimuladas con Con A, con CMSP autólogas infectadas con VIF inactivado por radiación y UV durante 5 días. Estas células sirvieron como las células efectoras estimuladas. El día de la prueba, se marcaron células blanco con 50 µCi de Na51Cr?4 durante una a tres horas, se lavaron tres veces y después se agregó un número fijo de células objetivo marcadas (5x10* células/pozo) a placas de microtítulo. Se agregó células efectoras en triplicado en varias relaciones de células efectora/blanco (es decir, 100:1, 50:1, y 10:1). Las placas se centrifugaron durante 1 minuto a 400 rpm y se incubaron a 37°C durante 4 horas. Las células objetivo de control marcadas con si Cr se lisaron con detergente para obtener valores de liberación máximos. Los sobrenadantes de los pozos de muestras de prueba se recogieron y la radiación se cuantificó usando un contador de gama. La liberación espontánea se determinó incubando células objetivo marcadas con s l C r en ausencia de células efectoras. El porcentaje de citotoxidad específico se calculó como: % de citotoxicidad = (100) (liberación de prueba - (liberación espontánea de cpm de cpm promedio) promedio) (liberación máxima - (liberación espontánea de de cpm promedio cpm promedio Inunoblot y prueba de inmunoabso rbente ligado a enzima (ELISA). El virus purificado con gradiente de sacarosa se usó como substrato para una prueba de in munoblot como se describe en Yamamoto y otros 1993. VIFpet del fluido del cultivo de tejido de células infectadas se esclareció por centrifugación a baja velocidad (2000 rpm por 45 minutos), se concentró por ultracentrifugación (16,000 rpm por 2 hr), y se purificó por ultracentrifugación sobre un gradiente de sacarosa continuo de 10/50% (p/v). El virus purificado por este procedimiento se usó como el substrato para la prueba de inmmunoblot.

Se usó una modificación de una técnica inmmunoblot previamente descrita (Yamamoto y otros, 1991a). Se prepararon tiras de manchas de virus, solubilizando virus en SDS al 0.1%, seguido de electrof resis sobre gel de SDS-poliacrilamida al 10% y transferencia electroforética sobre membrana de nitrocelulosa. Muestras de suero de gatos vacunados se diluyeron a 1:50 en regulador de pH 3 (cloruro de sodio a 0.15 M, ácido edítico a 0.001 M, base de tris a 0.05 M, Tween 20 a 0.05% y albúmina de suero de bovino al 0.1%) y se incubaron con tiras de manchas de virus en pozos separados de placa de inmunoblot durante 18 horas a 37°C. Las tiras de manchas se lavaron individualmente con solución de lavado (NaCl a 0.15 M y tween 20 al 0.05% en H2O desionizada), se incubaron con IgG anti-gato biotinilada (Vector Laboratories, Burlingame, California) durante 1 hr a 37°C, y se lavaron 3 veces con solución de lavado. Las tiras se incubaron después individualmente con Streptavidin (Vector Laboratories) conjugada con peroxidasa de rábano durante 30 minutos. Después de lavado extensivo, cada tira se incubó con una solución de substrato fresca (dia inobencidina al 0.005%, 400 µg/ml de NÍCI2 , y H2O2 al 0.001% en regulador de pH tris a 0.1 M, pH 7.4) a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con H2O destilada en exceso al establecerse bandas visibles, y las tiras se secaron con papel secante. Los pesos moleculares de las bandas sobre los inmunoblots se determinaron después comparándolos con la distancia de migración de los patrones de pesos moleculares sobre una tira previamente teñida con negro de amido. El suero de control positivo y negativo se incluyó en cada análisis de inmunoblot como controles internos para evaluación de diagnóstico. La prueba de ELISA específica de antígeno viral se ha descrito anteriormente (Yamamoto y otros, 1991a; Yamamoto y otros 1993). VIFpet purificado con gradiente de sacarosa y péptidos de envoltura de superficie (ES) y de transmembrana (TM) de regiones conservadas (C) y variables (V) de VIFpet se aplicaron sobre placas de Inmunolon de 96 pozos (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, Virginia) a 250 ng/pozo con regulador de pH de bicarbonato (pH 9.6) durante 12 a 18 horas a 37°C y se usaron como substratos para ELISA. La secuencia de aminoácidos del péptido ES-V3-2 es: Gly Ser Trp Phe Arg Ala lie Ser Ser Trp Lys Gin Arg Asn Arg Trp Glu Trp Arg Pro Asp Phe (SEQ ID NO. 1); y la secuencia de aminoácidos del péptido TM-C1 es: Gin Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys Lys lie. (SEQ ID NO. 2). Los péptidos sintéticos se sintetizaron sobre un sintetizador de péptidos de Bioserarch 9500 (Biosearch, San Rafael, California) usando química de síntesis de péptidos FMOC (Magazine y otros 1988). La pureza de los péptidos sintetizados se determinó por la presencia de un sólo pico sobre cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa y fue confirmada por análisis de secuencias de aminoácidos realizada sobre la muestra pico. Las placas revestidas con péptido se lavaron una vez con regulador de pH 3 inmediatamente antes de usarse. Las muestras de suero se diluyeron a 1:200 en regulador de pH 3 y se le incubaron en los pozos revestidos con antígeno de VIF durante 1 hora a 37°C, después se lavaron 6 veces. Los pozos se lavaron con una solución de lavado, se incubaron con IgG antigato biotinilada (Vector Laboratories, Burlingame, California) durante 1 hora a 37°C, se lavaron 6 veces y se incubaron con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (Vector Laboratories) durante 1 hora a 37°C. Los pozos después se lavaron 6 veces con solución de lavado y se incubaron con solución de substrato de ELISA (tetrametilbencidina al 0.005% y H2O2 al 0.015% en solución de citrato al 0.96%) a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con ácido fluorhídrico a 0.1 M al establecerse un color visible de reacción en los patrones secuencialmente diluidos que consistían de suero de gato positivo a VIF conocido. La absorción de luz se midió con un lector de BioRad ELISA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) a una densidad óptica de 414 nm. Reacción en Cadena de Polimerasa (RCP). Los niveles de ADN proviral de las células infectadas se monitorearon por RCP diferencial, que recientemente se desarrolló para distinguir cepas de VIF múltiples de los mismos o diferentes subtipos (Okada y otros, 1994). Como medios para incrementar la sensibilidad de RCP, se usaron las series de iniciadores de RCP anidada mostrados en el cuadro 1. Se realizó RCP en una reacción de dos etapas, primero con un par de iniciadores externos (comunes para todas las cepas de VIF) bajo condiciones como se describen en Okada y otros, 1994 en la segunda etapa de RCP, 1/25 del producto de primera etapa se amplificó usando los iniciadores internos (específicos para cada cepa de VIF). Usando RCP anidada, las células infectadas con VIFpet' VIFUKS' VIFßang' VIFAO?GÍ' I om2' y VIFshi se pueden distinguir unas de otras.

CUADRO 1 GRUPOS DE INICIADORES PARA RCP DIFERENCIAL Subtipo Cepa Iniciador Secuencia Posición* (orientación) Bruoos de iciadores externos Todos NO coiún {*) GAAATGTATAATATTGCTGG (SEQ ID NO. 3) 1S70 «.» coiún (-) GAATTGATTTTGATGACATCC (SEQ ID NO. 4) ¿112-2092 Brunos de iniciadores internos PetalUia Pet (*) TAGTAGTTATAGTGaTACTA (SEQ ID NO. 5) 1659-1678 et (.) TCTTTAAGGCTTCAGTCACCT (SEQ ID NO.6) 1914-1964 ÜK-8 U I ( + ) GTACAAATAGTAGTAGTACAA (SEQ ID NO. 7) 1646-1666 UKÍ (-) TCGTTAAGGCTTCAGTCACCG (SEQ ID NO. 8) 19(4-1964 Bangston . (*) GGGACTACTAGCAATGGAATA (SEQ ID NO.9) 1654-1674 Bang (-) AGTGCCTCAGTTATTTTATCC (SEQ ID NO. IO> 1979-1959 fioßori-1 Í.01 ( + ) TGGG ACTG ATG ATAGTAA AAC (SEQ ID NO. 11) 1654-1674 fl?1 (-) AGTGCCTCAGTTATTTTATCC (SEQ ID NO. 12) 1379-1959 flo«ori-2 fl?2 ( - ) TGGGACTGATAATAGTG AAAC (SEQ ID NO. 13) 1654-1674 fl?2 (-) AGTGCCTCAGTTATTTTATCC (SEQ ID NO. 14) '* Shizuoka S i ( + ) TCATCATTTCCAACATGTC (SEQ ID NO. 15) 1663-1681 Slli (-) AATGCTTCAGTTATTTGATC (SEQ ID NO. 16) 1979-1960 «Las posiciones de nucleótidos corresponden a las de la secuencia de Pentaluia y los núneros representan la posición desde el inicio de la secuencia env.

La cantidad de ADN proviral por célula se determinó por RCP semicuantitativa, en la cual se hicieron varias diluciones de ADN extraído de un número conocido de células.

Por ejemplo, si se usaron 105 células para extracción de ADN, entonces una dilución de 10~5 de la preparación de ADN corresponderá aproximadamente al ADN presente en una sola célula. La RCP se realizó sobre estas diluciones de ADN variables y la dilución final que dio un resultado de RCP positivo se considera como la dilución de punto final. El número de células correspondientes a la dilución de punto final se usa para determinar el porcentaje de células infectadas con virus en una preparación de células dada de acuerdo con la siguiente fórmula: % de células infectadas -- 1 x 100 Z en donde Z = número de células correspondientes a la dilución de punto final. Prueba de transcriptasa inversa (TI). La presencia de ADN polimerasa (TI) dependiente de ARN se sometió a prueba en sobrenadantes de cultivo de células esencialmente como lo describe Rey y otros. La prueba de TI para detectar VIF usó poli( rA)-oligo(dTi2-?s ) como un iniciador de molde exógeno, cuatro diferentes trifosfatos de desoxi ribonucleótido, KCl a 20 mM con Mg++ como catión divalente y trifosfato de timidina (TTP) marcado con 5 µCi [3H]~ por muestra. Cinco µCi [3H]TTP dieron un conteo total promedio de 1,200,000 cpm usando mezcla de fluido de escintilación (una parte del xileno a 9 partes del producto escintilador de conteo biodegradable de Research Products International) sobre un contador de escintilación de Beckman LS250 (Beckman Instruments, Inc. Palo Alto, California). Como resultado, los valores de TI para muestras probadas fueron menores que 1,200,000 cpm/ml. Prueba de neutralización viral. Una estrategia para desarrollar pruebas de NV específicas de cepa y de subtipo se han descrito (Okada y otros 1994). Diluciones en serie de suero inactivado con calor se incubaron con 100 TCID50 de cada cepa de VIF durante 45 minutos a 37"C en una placa de 24 pozos antes de la adición de células mononucleares de sangre periférica de felino (CMSP) (4 x 105 células/ml) o FeT-lC células suceptibles a VIF (2xl05 células/ml). Después de 3 días de cultivarse, las células se lavaron una vez con solución salina equilibrada con solución de Hank para remover virus residual del cultivo y después de la células se volvieron a suspender en medios de cultivos frescos (RPMI-1640 que contenía suero de ternera fetal inactivado con calor al 10%, regulador de pH de HEPES a 10 mM, 50 µg/ml de gentamicina, 2-mercaptoetanol a 5x10-5 M, y 100 unidades/ml de recombinante humano IL-2). La infección de células por virus fue supervisada por pruebas de TI dependientes de Mg++ de los fluidos del cultivo cosechados a los 9, 12, 15 y 18 días del cultivo. Los sueros se consideraron positivos para anticuerpos NV cuando la actividad de TI fue de <25% de cultivos de control infectados que consistían de suero de LPE.

A continuación están los ejemplos que ilustran los procedimientos, incluyendo el mejor modo, para poner en práctica la invención. No se deberá interpretar estos ejemplos como limitantes. Todos los porcentajes están en peso y todas las proporciones de las mezclas de solventes están en volumen a no ser que se indique lo contrario.

EJEMPLO 1 LINEAS CELULARES INFECTADAS POR FIV Se usó una línea de células T felinas dependientes de interleucina 2-(IL-2), novedosa, que es una línea madre de una clona de FeT-lM dependiente de IL-2, para establecer las líneas celulares individuales infectadas crónicamente con, ya sea VIFpet, VIFDÍX, VIFUKS , VIFßang, VIFAom2, o VIFshi. Se ha descrito la clona de FeT-lM (también referida como FetlM de VIF) en la Patente de E.U.A. No. 5,275,813, la cual se incorpora en la presente por referencia, y se le usó para producir una línea celular independiente de IL-2, la FL-4 (descrito también en la Patente de E.U.A. No. 5,275,813), y que produce crónicamente VIFpet, La línea celular FeT-lC es altamente infectable con aislados de VIF de diferentes subtipos, A, B y D. El paso a largo plazo de la línea celular Fet-lC disminuye su infectabilidad, especialmente al subtipo D de VIF, por lo tanto, el número de pasos deberá ser menor que aproximadamente 35 pasos para velocidades óptimas de infección con VIF o para su uso en ensayos de NV. Los análisis de RCP y de antígenos de núcleo viral semicuantitativos, indicaron que todas las líneas celulares expuestas a VIF eran infectadas significantemente con cepas VIF individuales. Se ha desarrollado también una línea celular felina independiente de L-2, susceptible a la infección de VIF, a partir de células FeT-lC. Se puede infectar esta línea celular, designada como FeT-J, con VIF, por cocultivo usando medios o células infectadas de VIF. Por ejemplo, se cultivó conconta ente una línea celular FeT-lC infectada en ausencia de IL-2 con células FeT-J no infectadas para establecer una línea celular FeT-J infectada por VIFBang independiente de IL-2 (designada como Bang/FeT-J). En el método de infección de cultivo conjunto, se combinó las células Bang/FeT-lC con células Fet-J no infectadas en una relación de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 10:1 (infectada: no infectada). Se cultivó una mezcla celular en medios con ausencia de IL-2 durante varios días y se deja perecer las células FeT-lC. Las células restantes consistían en células FeT-J infectadas por VIFBang. De esta manera, se puede usar las células FeT-lC infectadas por VIF para infectar las células FeT-J y establecer las líneas celulares FeT-J independientes de IL-2 con diferentes subtipos de VIF. El método de cultivo conjunto con células FeT-lC infectadas por VIF dio por resultado líneas celulares FeT-J independientes de IL-2 produciendo niveles de moderados a altos de diferentes subtipos de VIF.

Se infectó también la línea celular FeT-lC con VIFshi y se le paso excesivamente para producir una línea celular dependiente de IL-2 designada Shi/FeT-lC. Se cultivó después conjuntamente la línea células Shi/FeT-lC con FeT- J en ausencia de IL-2 y en la línea celular infectada por VIFshi independiente de IL-2 se designó como Shi/FeT-J. La línea celular Shi/FeT-J independiente de IL-2 produce niveles más altos de VIFshi que la línea celular Shi/FeT-lC dependiente de IL-2 (figura 1) . Se realizó también el desarrollo de una línea celular FeT-J infectada con VIFpang sin el uso de línea celular FeT-lC. Se infectó la línea celular FeT-J directamente con inóculos de VIFßang libres de células y se le hicieron pases extensamente sin IL-2. A la línea celular productora de VIFßang independiente de IL-2 se le designó Bang/FeT-J. La línea celular Bang/FeT-J produjo niveles más altos de VIFßang que la línea celular Bang/FeT-lC dependiente de IL-2, la cual se desarrolló infectando la línea celular FeT-lC con VIFBang (figura 1) .

EJEMPLO 2 VACUNAS DE VIF DE SUBTIPOS MÚLTIPLES Se retiró las células infectadas por VIF de los sobrenadantes por centrifugación, se les inactivo y se les usó como vacuna. Similarmente, virus VIF completos fueron comvertidos a pellas a partir de sobrenadante sin células por medio de ultracentrifugación, y se les inactiv . Se inactivo tanto las células infectadas como los virus por tratamiento con paraformaldehído al 1.25% durante 24 horas a 5°C, seguido de lavado extenso o diálisis contra PBS, respectivamente . Este método inactiva eficientemente el VIF sin pérdida de inmunogenicidad. Los inmunógenos de VIF producidos de acuerdo con el método en cuestión son altamente efectivos para inducir inmunidad protectora (Yamamoto y otros, 1993; Yamamoto y otros, 1991a; Yamamoto y otros, 1991b). Se contempla que podría usarse aislados virales atenuados en las composiciones de vacuna de la presente invención. Aunque se superinfectó una línea celular FeT-lC infectada por VIFs i con la cepa VIFpet para producir una sola línea celular con subtipos múltiples de VIF (es decir, una línea celular FeT-lC de subtipos múltiples A/D) en el transcurso de dos meses de infección conjunta, disminuyeron los niveles provi rales de VIFshi del 50% a menos del 5% mientras que los niveles provi rales de VIF?et aumentaron concomitantemente en aproximadamente el 50%. De esta manera, el mantenimiento de una sola línea celular infectada con subtipos múltiples de VIF para su uso en una vacuna de VIF, no es la modalidad preferida de la invención en cuestión. Por consiguiente, en una modalidad de la invención en cuestión, fueron desarrolladas composiciones de vacunas a partir de dos líneas celulares individuales, infectándose cada ¿. línea con un subtipo diferente de VIF. En una modalidad específica, la composición de vacuna VIF de subtipo doble comprendía la combinación de una línea celular infectada por el subtipo A de VIF (Pet/FL-4) con una línea celular infectada por el subtipo D de VIF (Shi/FeT-lC). Se inactivo las líneas celulares infectadas por el subtipo A y el subtipo D como se describe, combinadas en números iguales de células (2.5 x 107 células, cada una en 250 µg de MDP) y se les usó para inmunizar gatos. Se vacunó 3 gatos LPE con células Pet/FL-4 inactivadas y se vacunó otros 4 gatos con células Shi/FeT-lC inactivadas (2.5 x 107 células/dosis). Después de una serie de 4 vacunas, la vacuna del subtipo doble (PeT/FL-4 y Shi/FeT-lC) indujo los anticuerpos anti-VIF, incluyendo títulos significativos de anticuerpos de NV para ambas cepas de VIF sometidas a prueba (figura 2 y cuadro 2, experimento I). Se expuso a 4 gatos vacunados con el subtipo doble (PeT/FL-4 y Shi/FeT-lC) a VIFBang(50 CID50 ) - Los 3 gatos vacunados con PeT/FL-4 y dos de los vacunados con Shi/FeT-lC, se expusieron a 50 CIDso de VIFBang. Los 2 gatos restantes vacunados con Shi/FeT-lC se expusieron a 50 CIDso de VIFshi. Todos los gatos vacunados con el subtipo doble fueron negativos para VIFßang por aislamiento de virus y RCP de CMSP a las 6 semanas después de infección (pi), mientras que todos los gatos inmunizados en falso fueron positivos tanto para VIFßapg como para VIFshi por aislamiento de virus y por RCP a las 6 semanas después de infección (cuadro 2, experimento I). En contraste, cada gato de los grupos vacunados con PeT/FL-4 y Shi/FeT-lC que fue expuesto a VIFßang fue positivo para VIFßang. Como se esperaba, todos los gatos vacunados con VIFshi y expuestos subsecuentemente a VIFshi, fueron negativos para VIFshi a las 6 semanas después de infección. De esta manera, la vacuna del subtipo doble específicamente ejemplificada, previno o retrasó la infección contra exposición a VIFshi homólogo, así como contra exposición a VIFßang heterólogo. Los gatos vacunados con subtipo doble (células Pet/FL-4 y células Shi/FeT-lC) desarrollan anticuerpos para VIF específicos para la proteína de núcleo viral p25 (llamada también VIF p28) después de la segunda inmunización (figura 2). Títulos de anticuerpos más altos a otros antígenos virales fueron demostrados después de la tercera a cuarta inmunización. Los anticuerpos NV contra VIFpet se desarrollaron después de la segunda inmunización, mientras que los anticuerpos NV contra VIFshi se desarrollaron después de la cuarta inmunización (cuadro 4). Se detectaron respuestas de CLT a VIFpet y VIFshi tan inmediatamente como en la tercera inmunización en todos los gatos sometidos a prueba (cuadro 3) y se desarrollaron respuestas de CLT más fuertes a ambas cepas después de la cuarta inmunización. Además, dos de los tres gatos sometidos a prueba desarrollaron respuestas de CLT a VIFBang después de la cuarta inmunización. Los resultados indican que después de las cuatro vacunas, la vacuna del subtipo doble indujo respuestas fuertes de CLT a VIFpet y VIFshi (cuadro 3) y altos anticuerpos de VIF, incluyendo títulos de anticuerpos NV, para ambas cepas de VIF (cuadro 4). Los gatos inmunizados con células Shi/FeT-lc inactivadas desarrollaron anticuerpos de VIF específicos de la proteína de núcleo viral p25 después de la segunda inmunización, y anticuerpos a otros antígenos virales después de la tercera inmunización (figura 2). Los anticuerpos NV para VIFshi en estos gatos se desarrollaron después de la cuarta inmunización, mientras que los anticuerpos NV para VIFpet no fueron detectados en el transcurso de las inmunizaciones. Los gatos vacunados con Shi/FeT-lC desarrollaron respuestas de CLT a VIFs i solo después de la cuarta inmunización, pero no * desarrollaron respuestas de CLT a VIFpet, incluso después de la cuarta inmunización (cuadro 3). Los gatos inmunizados con células Pet/FL-4 inactivadas desarrollaron anticuerpos a p25 después de la segunda inmunización (figura 2) y a otros antígenos virales, incluyendo anticuerpos NV a VIFp8t después de la segunda a tercera inmunización (cuadro 4). Las únicas respuestas de CLT detectadas en gatos inmunizados con células Pet/FL-4 fueron para VIFpet. En conclusión, la vacuna de VIF del subtipo doble indujo títulos de anticuerpo NV más rápidos y más altos y respuestas de CLT para ambas cepas de VIF, que las vacunas de un solo subtipo. Los gatos LPE inmunizados en falso no desarrollaron anticuerpos virales, anticuerpos NV, ni respuestas de CLT contra VIF.

CUADRO 2 PROTECCIQNN DE GATOS CON VACUNA DE VIF DE SUBTIPOS MÚLTIPLES No. de Cepa de VIF de Proiedio de anticuerpos HV Aislaiiento de Régiien de gatos exposición (CID-i)1 en el dia 0 p.i. contra' Virus y RPC protección (5) Tipo de vacuna Pet Shi Bang Vacuna de subtipo 5 dual Prueba I (AtD) Células Pet/FL-4. Células Shi/FeT-lC 5 FIV?,„ (50 Cito.) 1000 550 <10 3/5 negativos 3/5 (¿Ot a 6 sei. p.i.; Células Pet/FL- . 3 FIV?„, (50 CID-i) 1000 <10 <10 Todos positivos 0/3 (Ot a 6 sei. p.i.) Células Shi/FeT-lC 2 FIV?„, (50 CID.») <10 75 <10 Todos positivos 0/2 (Ot a 6 sel. p.i.) Células Shi/FeT-lC 2 FIVski (50 CI--.) <10 30 <10 Todos positivos 0/2 (Ot a 6 sei. p.i.) falso 3 FIV?„, (50 CU-») <10 <10 <10 Todos positivos 0/3 (Ot a i sei. p.i.) falso 2 FI?su (50 Cldso) <10 <10 <10 Todos positivos 0/2 (Ot a 6 sei. p.i.) ]_Q Vacuna de tiple subtipo Prueba II (AfB.ll) Células Pet/FL-* . , Células Bang/FeT-J t Células Shi/FeT-lC* FIVuns 1000 370 1000 HS 2/3 (¿7t a 24 sel. p.i.) Células Bang/FeT-J FlVms <10 <10 1000 HA 0/2 » Células Bang/FeT-J FIV|„, <10 <10 100 HA 1/2 FeT-J falso no infectado FIVws <10 <10 <10 HA FeT-J no infectado FIVMS <10 <10 <10 HA 0/2 Falso, solo adyuvante FIVBKS <10 <10 <10 HA 0/2 15 FeT-J no infectado FIVi,,, <10 <10 <10 HA 0/1 Falso, solo adyuvante FIV?,„ <10 <10 <10 KA 1/2 1.- Todos los inóculos de exposición de VIF se produjeron in vitro infectando PBMC priiario de gatos SPF. Todos los inóculos divididos en alicotas se guardaron a -70'C y se les descongeló a temperatura aibiente justo antes de usar. 2.- p.i. - después de infección con VIF. 3.- Ho : no hecho. 4.- Los resultados de HV son después de la tercera vacunación. 5.- La cuarta vacunación será efectuada con células Shi/FeT-J inactivadas en lugar de células Shi/FeT-lC inactivadas -o 5 CUADRO 3 RESPUESTAS DE CLT DE GATOS VACUNADOS CON SUBTIPO DOBLE 3a. Vacunación 4a. Vacunación Relación Efector: Objetivo Relación Efector: Objetivo Catt Tipo ide vacuna Objetivo CTl 10:1 50:1 100:1 10:1 50:1 100:1 K55 Pet t Shi Pet 0 9 20 17 25 33 Bang ND ND ND 0 0 14 Shi 0 9 8 7 11 17 3L4 Pet . Shi Pet 0 11 19 0 11 19 Bang ND ND ND 0 0 0 Shi 0 9 13 0 9 17 N55 Pet * Shi Pet ND ND ND 0 11 17 Bang ND ND ND 0 0 7 Shi ND ND ND 0 9 15 H55 Shi Pet 0 0 0 0 ? 0 Bang NI ND ND 0 0 0 Shi 0 0 0 0 7 15 007 Shi Pet ß 0 0 0 0 ? Bang ND ND ND ß 0 0 Shi 0 0 0 0 0 8 2H5D Pet Pet 0 7 15 s 15 25 Bang ND ND ND 0 0 0 Shi 0 0 0 0 0 0 361 Pet Pet 0 10 14 6 13 19 Bang ND ND ND 0 0 0 Shi ß 0 0 0 0 0 H7P Falso Pet 0 0 0 0 0 0 Bang ND ND ND 0 0 0 Shi í 0 0 0 ? 0 CUADRO 4 TITULO! 3 DE NEUTRALI ZACION DE VIRUS (NV) DE GATOS VACUNADOS CON SUBTIPO DOBLE Pre-vacunación Después de 25 vacunación Después de 49 vacunación Cat No. Vacuna VIF Pet Bang Shi Pet Bang Shi Pet Bang Shi K55 Pet + Shi )10 )1? )10 100 (10 (10 1000 (10 100 3L4 Pet + Shi >10 no MO 180 (10 (10 1000 (10 1000 N55 Pet + Shi >10 MO >10 10 (10 (10 1000 (10 1800 973 Pet . Shi )10 )10 )10 10 (10 (10 1000 (10 100 H55 Shi )10 >10 110 )10 )10 «10 (10 (10 50 008 Shi )1? >10 )10 no )10 (10 (10 (10 180 007 Shi )10 no )10 >10 no «10 (10 (10 10 999 Shi )10 >10 no no )10 (10 «10 (10 50 361 Pet no )10 >10 (10 (10 (10 1000 (10 (10 362 Pet )10 no >10 10 (10 (10 1000 (10 (10 2H5D Pet )10 )1? >1l 100 (10 (10 1000 (10 (10 8C2 Falso >10 >10 )1ß )1ß )1ß no >10 )10 >10 8C8 Falso )10 )10 >1í no .10 >10 )10 >10 no H7P Falso >10 )10 )10 no no >18 >10 M? no 868 Falso )10 )10 ne -10 (10 (10 (10 (10 (10 RF5 Falso )10 no >1l (10 (10 (10 (10 (10 (10 En una modalidad preferida, la composición de vacuna de la presente invención comprende una vacuna de VIF de subtipo triple preparada a partir de tres líneas celulares, cada línea celular habiendo sido infectada con una cepa viral de un subtipo de VIF diferente (A o B o D) . Tres gatos libres de patógeno específico fueron inmunizados con una vacuna de subtipo triple (VIFpet + VIFBang + VIFshi). Otros gatos fueron inmunizados con vacunas VIFßang de subtipo individual para evaluar la inmunogenicidad del VIFßang macrofagotrópico como componente de la vacuna. Los resultados del título del anticuerpo NV indican que las vacunas de subtipo triple (VIFpet + VIFßang + VIFshi) y las vacunas VIFBang del subtipo individual produjeron altos títulos de anticuerpo antiviral incluso después de la segunda inmunización (Cuadro 2, prueba II y Cuadro 5). Así, puede usarse VIF linfotrópico y macrofagotrópico como componentes de las composiciones de vacuna de la presente invención. Los tres gatos LPE inmunizados con una combinación de células Pet/FL-4 inactivadas, Bang/FeT-J inactivadas, y Shi/FeT-lC inactivadas (2.5xl07 células en 250 µg del total de MDP), desarrollaron anticuerpos contra VIF específicos para la proteína p25 del núcleo viral y para otros antígenos virales, incluyendo la proteína de cubierta ES y TM de VIF, después de la segunda inmunización (Figuras 3,4,5). Se desarrollaron anticuerpos NV para VIFpet, VIFBans.,+ VIFshi en la mayoría de los gatos poco después de la segunda inmunización y en todos los gatos mediante la tercera inmunización (Cuadro 5). Además, un gato tenía anticuerpos NV que reaccionaban en forma cruzada con VIFuKß después de la tercera inmunización. Cuatro gatos LPE inmunizados únicamente con células Bang/FeT-J inactivadas desarrollaron anticuerpos VIF específicos para la proteína p25 del núcleo viral y otros antígenos virales después de la segunda inmunización (Figura 3). Se desarrollaron anticuerpos NV para VIFBang en estos gatos después de la segunda inmunización (Cuadro 5), mientras que no se detectaron anticuerpos NV para VIFpet durante el curso de las inmunizaciones. Las respuestas de CLT de gatos inmunizados tres veces con la vacuna VIF de subtipo triple (células Pet/FL-4, Bang/FeT-J y Shi/FeT-lC) a células objetivo de VIF de subtipo A, B y D, se muestran en Cuadro 6. Se detectaron respuestas de CLT para los tres subtipos de VIF probados. Así, la vacuna de subtipo triple indujo una respuesta amplia de CLT y títulos de anticuerpo más rápidos y superiores de cubierta ES y NV, que la vacuna de subtipo individual. Ni las FeT-J no infectadas ni los gatos LPE inmunizados con Sham desarrollaron anticuerpos virales o anticuerpos NV.

CUADRO 5 ITUl -OS DE NEUTRALIZACIÓN DE VIRUS C NV) DE GATOS VACUNADOS CON SUBTIPO TRIPLE Pre-vicunieiéi Besoués de 25 vacunación tt-pßí. do ; IS vi-umcí.n CR Vacua VIF Pet Bing Shi uu Pet Ba?| Shi UM Pet Bug Shi UK0 Tt 055 Pet-lani-Shl (10 (11 (10 (10 1000 1000 (10 (10 1000 1000 10 (10 QY1 Pet.Sing.Shi (11 (10 (11 (10 100 1000 100 (10 1000 1000 1000 (10 TBS Pet.Ben9.5hi (11 (11 <1í (10 (10 1000 10 (10 100 1000 100 100 ÍE iaag (11 (11 (10 (10 (10 100 (10 (10 (10 1000 (10 (10 A Bug (11 (11 (19 (10 (10 10 (10 (10 (10 100 (10 (10 QVO Bll| (11 (11 (10 (10 (10 100 (10 (10 (10 100 (10 (10 IÍ2 36. FeT-3 no infectada <1t (11 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 3SS FeT-í ?o infectidi (11 (11 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 ast Falso (11 (11 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 367 Falso (11 (11 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 (10 los títulos de KV sen títulos pro-tedio de áos pruebas separadas de NV.

CUADRO 6 RESPUESTAS DE CLT DE GATOS VACUNADOS CON SUBTIPO TRIPLE DESPUÉS DE LA TERCERA INMUNIZACIÓN Gato No. VIF objetivo Relación E:T Actividad de CLT (% de liberación de cromo) QY1 V VIIFFpp88 1 10000 44% 5500 21% 10 QY1 VviIrFBBaann-g -1-.0uu0 xa-í> 50 16% 10 1% QY1 V VIIFFUUKSS 1 10000 23% Tas VIFßan g 100 50 3% 10 Tas VIFshi 100 50 1% 10 0.3% J55 VVIIFFuUKKd8 110000 10% 5500 2% 10 1% EJEMPLO 3 Anticuerpos NV para subtipos de VIF Se desarrolló también una prueba para anticuerpos NV para VIF utilizando las células FeT-lC de la presente invención. Se probó el suero de gatos infectados con VIFpet y gatos LPE vacunados con células Pet/FL-4 inactivadas o virus VIFpat inactivado, para determinar el título de anticuerpo NV utilizando células FeT-lC o CMSP, de conformidad con el método de prueba de NV descrito en la presente invención. Se utilizaron como suero de control los sueros de dos gatos LPE que fueron no vacunados y no infectados con VIF. Los sueros de gatos vacunados e infectados con VIF tuvieron un título alto de anticuerpo NV de 1000 o más, mientras que los sueros de gatos LPE no vacunados no tuvieron título de anticuerpo NV detectable. La prueba de NV basada en FeT-lC da resultados de título de anticuerpo NV comparables con los que se obtienen utilizando CMSP primarias de gatos (Cuadro 6). Este hallazgo demuestra que los títulos de anticuerpo NV en una prueba de NV utilizando células FeT-lC se correlaciona con aquellos resultados obtenidos con una prueba de NV utilizando CMSP. Por lo tanto, las células FeT-lC pueden utilizarse ventajosamente en lugar de CMSP en la prueba estándar de NV para VIF, dado que las células FeT-lC pueden ser infectadas con todos los subtipos de VIF y pueden propagarse fácilmente en cultivos de tejidos.

CUADRO 7 Títulos de NV determinados en FeT-lC y CMSP Títulos de NV Fuente del suero FeT-lC CMSP Vacunados1 5000 5000 Vacunados1 >1000 >1000 Infectados^ 1000 1000 Infectados2 >1000 >1000 Inmunizados con células no infectadas3 <10 <10 Inmunizados con células no infectadas3 <10 <10 1 - Suero de gatos vacunados con células Pet/FL-4 inactivadas 2- Sueros de gatos infectados con VIFpet 3- Sueros de gatos inmunizados con células FeT-J no infectadas inacativadas EJEMPLO 4 Petepriinación del inmunotipo de cepas de VIF Se llevaron a cabo estudios in vitro utilizando células FeT-lC para evaluar si el subtipo de VIF reflejaba el inmunotipo de VIF. La determinación del inmunotipo es importante para entender la función de los anticuerpos NV en la protección por vacunas. Se probaron los antisueros de gatos infectados con cepas VIF subtipo A (VIFPet, VIFDix, VIFUK8), subtipo B (VIFBang, VIFAoml), y subtipo D (VIFShi) para determinar su capacidad para neutralizar estas cepas in vitro utilizando células FeT-lC en la prueba de NV (Figura 6). Todos los antisueros de la prueba tuvieron actividad neutralizante contra la cepa VIF homologa correspondiente. VIFpet, una cepa del subtipo A, fue neutralizada significativamente en forma cruzada mediante antisueros de gatos infectados con VIFDÍX-VIFpet difiere de VIFDÍX en aproximadamente 9% en regiones de glucoproteína de cubierta de superficie (Env). Los antisueros de gatos infectados con cepas VIF de subtipo A neutralizaron en forma cruzada del subtipo B VIFßang, pero no neutralizaron VIFshi del subtipo B. Los antisueros de gatos infectados con cepas de subtipo B y D solo neutralizaron en forma cruzada otras cepas VIF dentro del subtipo homólogo. Además, los antisueros de gatos infectados con VIFUKS neutralizaron VIFBang, pero no neutralizaron las cepas VIF dentro del subtipo A. Aunque VIF-UKS se clasifica como subtipo A (Sodora y otros, 1994; Rigby y otros, 1993; Kakinuma y otros, 1995), estos resultados sugieren que los antisueros para VIFU S reconocen la cepa del subtipo B, pero no reconocen las cepas del subtipo A, y pueden explicar cómo las vacunas de VIFpet inactivadas fueron inefectivas contra VIFUKS y VIFshi (Johnson y otros, 1994). Así, existe una correlación definida entre el fenotipo y el inmunotipo. Aunque los análisis genotípicos permiten la clasificación de la cepa de VIF, los estudios de anticuerpos de neutralización en forma cruzada reflejan la inmunogenicidad de las cepas de VIF, el cual es un parámetro importante en la protección hu ural de amplio espectro brindada por las vacunas.

EJEMPLO 5 Tropismos de células a VIF Se comparó el tropismo celular de cepas de VIF obtenidas a partir de líneas celulares FeT-lC y FeT-J con las cepas de VIF obtenidas a partir de CMSP primarias (cuadro 8).

Dos aislados de VIF, VIFUKS y VIFBang , son igualmente linfotrópicos y macrófagot rópico, "mientras que VIFshi es altamente linfotrópico. VIFpet fue más linfotrópico que macrofagotrópico, y su tropismo celular no fue afectado significativamente por su origen celular. El macrofagotropismo de VIFBang no fue afectado por el origen celular del virus.

Dado que el tropismo celular de las cepas VIF de la línea celular FeT-lC infectada es comparable con aquel producido a partir de CMSP primarias del virus desarrollado en células FeT- 1C, puede utilizarse como inoculo para pruebas de NV y también como un inoculo in vivo en estudios para evaluar alternativas terapéuticas y profilácticas.

CUADRO 8 Tropismo celular de aislados FIV TCIDsoa FIV Fuente de FeT-lC PBMC tfecrófago Microglia (subtipo) FJ-V alveolar pr-?naria Pe-aiuma (A) PBMC 104 104 102 ND Pe-aiuma (A) FeT-lCb 104 104 ÍO1 ND Petaluma (A) FL-44 104 104 ÍO1 ND Dixon (A) FeT-lC 104 103 ÍO1 ND UK8 (A) PBMC 102 103 103 ND UK8 (A) FeT-lC 103 103 103 ND Bangston (B) PBMC 103 ÍO3 103 102 Bangston (B) FeT-lCb 103 103 103 102 Bangston (B) FeT-Jb 103 103 103 102 Shizuoka (D) PBMC 102 ÍO3 <1 ND Shizuoka (D) FeT-l 3 103 103 <1 ND Shizuoka (D) FeT-Jb 103 103 ND ND a Todos los inóculos del virus fueron ajustados a 120,000 cpm/ml de actividad de TI antes de la titulación en 5xl05 células/ml de células T de felino (FeT-lC), o células primarias de felino, y los resultados representan el título más alto del virus cosechado después de 21 días de cultivo. b Las mismas células que las vacunas de células infectadas.

Debe entenderse que los ejemplos y modalidades descritas en la presente invención son únicamente para propósitos ilustrativos, y que varias modificaciones o cambios a la luz de la misma serán sugeridas por los expertos en la técnica, y deberán incluirse dentro del espíritu y alcance de esta solicitud, y el alcance de las reivindicaciones anexas.

LISTADO DE SECUENCIAS l)INFORMACION GENERAL i) INFORMACIÓN DEL SOLICITANTE: Nombre del solicitante: UNIVERSITY OF FLORIDA Dirección: 223 Grinter Hall Ciudad: Gainesville Estado/ rovincia: Florida País: E.U.A. Código Postal/Zip: 32611 Teléfono: (352) 392-8929 Fax: (352) 392-6600 Nombre del solicitante: REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA Dirección: 2150 Shattuck Avenue, Suite 520 Ciudad: Berkeley Estado/Provincia: California País: E.U.A. Código Postal/Zip: 94704 Teléfono: (510) 748-6600 Fax: (510) 748-6639 ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Vacunas de Virus de Inmunodeficiencia Felina de Subtipos Múltiples iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 16 iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: A) DIRECCIÓN: Saliwanchik & Saliwanchik B) CALLE: 2421 N.W. 41st Street, Suite A-l C) CIUDAD: Gainesville D) ESTADO: Florida E) PAÍS: E.U.A. F) CÓDIGO POSTAL: 32606 v) FORMA DE LECTURA EN LA COMPUTADORA: A) TIPO DE MEDIO: Disco Flexible B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, versión #1.30 vi) DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD: A) NUMERO DE SOLICITUD: E.U.A. B) FECHA DE PRESENTACIÓN: C) CLASIFICACIÓN: viii) INFORMACIÓN SOBRE APODERADO/AGENTE A) NOMBRE: Pace, Doran R. B) NUMERO DE REGISTRO: 38,261 C) REFERENCIA/NUMERO DE DOCUMENTO: UF152 ix) INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES: A) TELEFONO: (904) 375-8100 B) TELEFAX: (904) 372-5800 FORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 22 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: Gly Se r T rp Phe A rg Ala lie Se r Se r T rp Lys Gln A rg Asn 1 5 10 A rg T rp Glu T rp A rg P ro Asp Phe 15 20 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 14 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Gln Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys Lys lie 1 5 10 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 20 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: GAAATGTATA ATATTGCTGG 20 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 21 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: GAATTGATTT TGATTACATC C 21 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 20 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: TAGTAGTTAT AGTGGTACTA 20 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 21 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: TCTTTAAGGC TTCAGTCACC T 21 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 21 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7; GTACAAATAG TAGTAGTACA A 21 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 21 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: TCTTTAAGGC TTCAGTCACC T 21 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 21 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: GGGACTACTA GCAATGGAAT A 21 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 21 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: AGTGCCTCAG TTATTTTATC C 21 2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 21 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) Xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11; TGGGACTGAT GATAGTAAAA C 21 2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 21 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA; SEQ ID NO: 12: AGTGCCTCAG TTATTTTATC C 21 2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 21 pares de bases B) TIPO; ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: TGGGACTGAT AATAGTGAAA C 21 2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 21 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: AGTGCCTCAG TTATTTTATC C 21 2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 19 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: TCATCATTTC CAACATGTC 19 FORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 20 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE CADENA: sencilla D) TOPOLOGÍA: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: AATGCTTCAG TTATTTGATC 20 REFERENCIAS CITADAS Pedersen, Niels C, Janet K. Yamamoto, Patente de los E.U.A. No. 5,037,753, expedida el 6 de Agosto de 1991. Pedersen, Niels C, Janet K. Yamamoto, Patente de los E.U.A. No. 5,118,602, expedida el 2 de Junio de 1992. Byars, N.E., A.C. Allison (1987) "Adjuvant formulation for use in vaccines to elicit both cell ediated and humoral immunity," Vaccine 5:223-228. Pedersen, N.C., E.W. Ho, M.L. Brown, J.K. Yamamoto (1987) "Isolation of a T-lymphot ropic virus from domestic cats with an immunodeficiency-like syndrome," Science 235:790-793. Yamamoto, J.K., N.C. Pedersen, E.W. Ho, T. Okuda, G.H. Theilen (1988a) "Feline immunodeficiency syndrome - a comparison between feline T - lymphot ropic lentivirus and fenile leukemia virus," Leuke ia, Suplemento de Diciembre 2:204S-215S. Yamamoto, J.K., E. Sparger, E.W. Ho, P.H. Adersen, T.P. O'Connor, C.P. Mandeli, L. Lowenstine, N.C. Pedersen (1988) "Pathogenesis of experimentally induced feline immunodeficiency virus infection in cats," Am. J. Vet. Res. 49:1246-1258. 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Claims (4)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 5 1.- Una composición de vacuna que comprende inmunógenos de VIF, caracterizada porque dichos inmunógenos son capaces de producir una respuesta inmune contra una pluralidad de subtipos de VIF en un animal susceptible a VIF. 2.- La composición de vacuna de conformidad con la 10 reivindicación 1, caracterizada porque dicha composición de vacuna se selecciona del grupo que consiste de construcciones ' de VIF de vector viral recombinante, polipéptidos de VIF derivados de múltiples subtipos de VIF, virus múltiples VIF completos libres de células, y líneas celulares múltiples, 15 caracterizada porque cada una de dichas líneas celulares es infectada con una cepa de VIF de un subtipo diferente de VIF. 3.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque dicho virus VIF o línea celular infectada con VIF, son tratados de una manera tal para 0 inactivar dicho virus o dicha línea celular antes de administrar dicha vacuna a dicho animal huésped. 4.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque dicho virus VIF o línea celular infectada con VIF, son tratados de una manera tal para 5 atenuar dicho virus o dicha línea celular antes de administrar dicha vacuna a dicho animal huésped. ? 5.- El uso de inmunógenos de VIF en la preparación de una composición de vacuna para inducir una respuesta inmune protectora contra la infección por una pluralidad de tipos de VIF en un animal huésped susceptible. 5 6.- El uso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque dicha composición de vacuna se selecciona del grupo que consiste de construcciones de VIF de vector viral recombinante, polipéptidos de VIF derivados de múltiples subtipos de VIF, virus múltiples VIF completos libres de 10 células, y líneas celulares múltiples, en donde cada una de dichas líneas celulares es infectada con una cepa de VIF de un i subtipo diferente de VIF. 7.- El uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho virus VIF o línea celular infectada 15 con VIF, son tratados de una manera tal que se inactiva dicho virus o dicha línea celular antes de administrar dicha vacuna a dicho animal huésped. 8.- El uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho virus VIF o línea celular infectada 20 con VIF, son tratados de una manera tal que se atenúa dicho virus o dicha línea celular antes de administrar dicha vacuna a dicho animal huésped. 9.- El uso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque dicho subtipo de VIF se selecciona del 25 grupo que consiste de los subtipos A, B, C y D. 10.- El uso de conformidad con la reivindicación 5, A caracterizado porque después de por lo menos una inmunización primaria que comprende administrar una construcción de VIF de vector viral recombinante, se administra un refuerzo subsecuente con la composición de vacuna, seleccionándose ésta 5 del grupo que consiste de construcciones de VIF de vector viral recombinante, polipéptidos de VIF, virus VIF completos libres de células, y líneas celulares infectadas con VIF. 11.- Una línea de células T derivadas de felino, caracterizada porque dicha línea de células es susceptible a 10 ser infectada con por lo menos un subtipo de VIF, caracterizada porque dicho subtipo de VIF se selecciona del grupo que M j. consiste de los subtipos A, B, C y D. 12.- La línea celular de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque dicha línea celular se 15 designa como FeT-lC. 13.- La línea celular de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque dicha línea celular es infectada con por lo menos una de las cepas del virus VIF, seleccionada del grupo que consiste de VIFDÍX, VIFUKS , VIFßang, 20 VIFAoml, VIFAon.
2. 2, VIFpet y VIFshi. 14.- La línea celular de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque dicha línea celular es independiente de IL-2. 15.- La línea celular de conformidad con la 25 reivindicación 14, caracterizada porque dicha línea celular es infectada con por lo menos una de las cepas de virus VIF, seleccionada del grupo que consiste de VIFDÍX, VIFUKS , VIFßang, VIFAoml, VIFAorn2, VIFpet VIFshi- 16.- La línea celular de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque dicha línea celular se designa como FeT-J. 17.- Un método para detectar o determinar la cantidad de anticuerpos de neutralización viral de VIF en una muestra, que comprende poner en contacto dicha muestra con VIF, cultivar después una línea celular de conformidad con la reivindicación 10, en dicha muestra durante una cantidad efectiva de tiempo, cultivar dichas células en medio de cultivo fresco y determinar después el grado de actividad de la transcriptasa inversa en dichos medios de cultivo. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque dicha línea celular se selecciona del grupo que consiste de líneas de células designadas como Fet-lC y FeT-J.