CN112048445A - 汉逊酵母重组covid-19病毒样包膜颗粒疫苗细胞株 - Google Patents

Abstract

本发明为汉逊酵母重组COVID‑19病毒样包膜颗粒疫苗细胞株，该细胞株中包括汉逊酵母重组COVID‑19病毒样包膜颗粒S刺突蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:1所示；汉逊酵母重组COVID‑19病毒样包膜颗粒M膜蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:2所示；汉逊酵母重组COVID‑19病毒样包膜颗粒E包膜蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:3所示。该细胞株具有更高的免疫保护水平和更高的人群免疫覆盖率、绿色经济、人体更安全。

Description

汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒疫苗细胞株

技术领域

本发明涉及免疫治疗技术领域，具体为汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒疫苗细 胞株。

背景技术

SARS-CoV-2病毒共有4种结构蛋白："S"刺突蛋白、"E"包膜蛋白、"M"膜蛋白和"N"核蛋白，还包含16种非结构蛋白；其氨基酸总数的80％，SARS-CoV-2病毒基因组的核苷 酸A、T含量≥50％。

Nature Reviews Immunology 2020July的美国贝勒医学院科学家报道：以一种安全的方式 获得高水平的抗ARS-CoV-2的中和抗体(NAb)可能是有效疫苗的关键。科学家们正在竞 相开发安全有效的疫苗来预防COVID-19，至少有十几种候选疫苗已经在临床上或很快进入 临床研发阶段。来自动物试验和人体试验的新研究已经表明了一些潜在的趋势，重点是达到 高水平的中和抗体。例如，疫苗诱导的假病毒中和抗体滴度与猕猴的保护效果相关。对冠状 病毒尖峰蛋白的中和抗体最终可能成为一种免疫相关物。评估了化学灭活病毒疫苗PiCoVacc (天然的COVID-19包膜颗粒疫苗)在猕猴(Macaca mulatta)中的免疫原性和保护效果，这 是一种非人灵长类物种，显示了由SARS-CoV-2感染引起的COVID-19样疾病。在第0、7 和14天(n＝4)，分别用中剂量(3μg/剂)或高剂量(6μg/剂)的PiCoVacc对猕猴进行三 次肌内免疫。所有接受PiCoVacc的猕猴在SARS-CoV-2攻击后的咽或肺中都没有可检测到 的病毒，诱导小鼠中和抗体滴度达数千，猕猴中和抗体滴度达400。Ad5载体COVID-19疫 苗(一种亚单位疫苗)在健康成年人中是可耐受和免疫原性的。在所有剂量浓度(5×10¹⁰、 1×10¹¹和1.5×10¹¹病毒颗粒/人)下，一剂疫苗在大多数情况下均可诱导特异性抗体和T细 胞反应参与者。快速第14天观察到特异性T细胞反应，针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2 的特异性体液反应在疫苗接种后第14天达到高峰28天。虽然我们发现高剂量疫苗比中剂量 和低剂量疫苗更具免疫原性，但它也具有较高的反应原性。高剂量组的一些受试者出现严重 发热、疲劳、呼吸困难、肌肉疼痛和关节疼痛。抗SARS-CoV-2的中和抗体在第0天全部阴 性.在第14天中度增加，在接种后28天达到高峰。高剂量组中和抗体的几何平均滴度为34.0 (95％可信区间22.6–50.1)，明显高于中剂量组的16.2(10.4–25.2)和低剂量组的14.5(9.6 –21.8)。特别是参与者中已有的Ad5中和抗体滴度为低或阴性(≤1:200)或高(>1:200)； 导致不能接种第二剂Ad5载体COVID-19疫苗的特异性记忆B的加强剂。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是提供一种汉逊酵母重组ARS-CoV-2 病毒样包膜颗粒疫苗细胞株。该细胞株具有更高的免疫保护水平和更高的人群免疫覆盖率、 绿色经济、人体更安全。

本发明解决所述技术问题采用的技术方案是：提供一种汉逊酵母重组COVID-19病毒样 包膜颗粒疫苗细胞株，其特征在于，该细胞株中包括汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗 粒S刺突蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:1所示；汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒M膜蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:2所示；汉逊酵母重组COVID-19病毒样 包膜颗粒E包膜蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:3所示。

汉逊酵母为HU-11多形汉逊酵母，HU-11多形汉逊酵母的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被 破坏的DNA序列如SEQ ID NO：4所示。

该细胞株制备时pMPT-S-M-E质粒的构建过程是：从pMPT-M、pMPT-E质粒双酶切位点处分别获得M及E基因的表达框，以pMPT-S质粒为骨架，依次将M及E的表达框插入 至pMPT-S质粒中Acc III酶切位点处；构筑后质粒在最后一个表达框的后面保留1个Sac I 酶切位点，S与M表达框之间引入一个Nhe I酶切位点，M与E表达框之间引入一个Not I 酶切位点；引入的Nhe I、Not I酶切位点在质粒中单一存在。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)本专利的汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒疫苗细胞株由S棘蛋白、M膜蛋白和E包膜蛋白组成。我们的表达系统汉逊酵母ATCC34438株不同于绝大多数单位的汉逊酵母ATCC26012株。已经构建成功汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒疫苗转化子细 胞株；经第13代平皿传代培养半定量PCR筛选得到67株高拷贝细胞株。从上述第13代筛 选获得的细胞株4株中再次进行PCR筛选出1株重组高拷贝细胞株COVID-19病毒样包膜颗 粒疫苗工程细胞株，S棘蛋白、M膜蛋白和E包膜蛋白基因拷贝数达100个上下；异源整合 在汉逊酵母ATCC34438株染色体的多个转座子位置；基因重组菌细胞株的遗传稳定性大于 40个二分裂世代。并且已经开始进行该工程细胞株全基因组测序；预期取得S棘蛋白、M膜 蛋白和E包膜蛋白基因全序列数据以及整合目的基因的定量拷贝数据的基因组铁证。

上述工程细胞株的1mL种子管细胞，经过4至5级扩大培养；种子细胞经24次二分裂倍增，发酵液体积扩大到1200升(1500升生产发酵罐)(这里的1500升发酵罐，为30升罐 发酵的放大规模发酵)。汉逊酵母ATCC34438株高密度发酵，每升发酵液的细胞密度高达2 ×10¹⁴个。汉逊酵母ATCC34438株特有的甘油去阻遏诱导表达。按照汉逊酵母ATCC34438 株重组HBsAg病毒样包膜颗粒疫苗原液的中试生产数据：1500升生产发酵罐生产发酵罐生 产周期为80小时，年生产发酵55罐，可年产ARS-CoV-2病毒样包膜颗粒疫苗原液26.4公 斤；可分装剂量20μg/针COVID-19疫苗13亿剂。与COVID-19疫苗现有技术相比，特别 是化学灭活ARS-CoV-2病毒包膜颗粒疫苗(PiCo-Vacc)现有技术相比；汉逊酵母重组COIDV 19包膜颗粒疫苗具有更高的免疫保护水平和更高的人群免疫覆盖率、绿色经济、人体更安全。

2)汉逊酵母重组COIDV 19包膜颗粒疫苗设计剂量为20μg/针；按免疫程序0、1、6月免疫接种3针；获得的免疫保护水平为：50％人群SARS-CoV-2中和抗体(NAb)滴度≥1000，判定为高应答，免疫保护长达5-8年；30％人群SARS-CoV-2NAb滴度为500-999，判 定为正常应答，免疫保护3-5年；≤20％人群SARS-CoV-2NAb滴度为100-499，判定为正常 应答，免疫保护1-3年；≤5％人群SARS-CoV-2NAb)滴度为10-99，判定低应答，应按免 疫程序为0、1、6月免疫复种3针。

附图说明

图1、pMPT-S-M-E质粒结构图及酶切位点图；

图2、S蛋白、M蛋白和E蛋白的三个基因DNA序列的电泳验证；

图3、EcoR1(FD0274)BamH1(FD0054)双酶切回收质粒中S、M、E蛋白基因DNA 序列片段的电泳验证；

图4、质粒PMPT-a、PMPT-b、PMPT-c，EcoR1、BamH1双酶切大片段的电泳验证；

图5、配对连接PMPT-a、PMPT-b、PMPT-c质粒片段和S、M、E转化子的PCR电泳验 证；

图6、pMPT-S质粒经AccIII、NheI双酶切，回收S基因表达盒；pMPT-M质粒经NotI、NheI双酶切，回收M基因表达盒；pMPT-E质粒经AccIII、NotI双酶切回收E基因表达盒； S基因、M基因和E基因表达盒酶切产物电泳检查。

图7、pMPT-S-M-E质粒DH5a转化子PCR验证扩增转入基因的电泳验证；

图8、汉逊酵母(ATCC34438)重组COVID-19包膜颗粒半定量PCR筛选得到的67株高拷贝细胞株。

具体实施方式

下面结合实施例及附图进一步解释本发明，但并不以此作为对本申请保护范围的限定。

本发明汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒疫苗细胞株中包括汉逊酵母重组ARS -CoV-2病毒样包膜颗粒S刺突蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:1所示；汉逊酵母重组 ARS-CoV-2病毒样包膜颗粒M膜蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:2所示；汉逊酵母 重组ARS-CoV-2病毒样包膜颗粒E包膜蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:3所示。

HU-11多形汉逊酵母的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被破坏的DNA序列如SEQ IDNO： 4所示。

实施例1、pMPT-S-M-E质粒构建

S、M、E蛋白基因DNA序列的合成及克隆：以pMPT质粒为骨架进行基因改造，得到 带有不重复双酶切位点的pMPT-a、pMPT-b、pMPT-c质粒。合成S、M、E基因，分别克隆 至上述pMPT质粒的EcoR I/BamH I之间。原pMPT质粒骨架的区域不做任何改动。见图1、 pMPT-S-M-E质粒结构图及酶切位点图。

宝生物9760质粒提取试剂盒提取质粒S、M、E 3个蛋白基因DNA序列。将提取的质粒取1μL上样电泳验证，电泳验证见图2的S蛋白、M蛋白和E蛋白的三个基因DNA序 列的电泳验证，条带明亮。

Thermo快切酶EcoR1(FD0274)BamH1(FD0054)双酶切，回收质粒中S、M、E蛋白 基因DNA序列片段。电泳验证如图3所示。

S、M、E质粒各酶切两份，40uL体系：

全部上样，电泳DL10000、S酶切、M酶切、E酶切、DL15000；

提质粒PMPT-a、PMPT-b、PMPT-c，EcoR1、BamH1双酶切，回收4000bp附近质粒大 片段(载体2700bp)，电泳验证如图4所示。

采用两次酶切进行双酶切，具体过程如下：

A:AccIII酶切(宝生物1113A)

切PMPTa+S和PMPTc+E两份

DNA 16uL

Buffer 2uL

AccIII 2uL

各做3支，37℃酶切1h。

乙醇沉淀，回收，晾干后30uL水溶解成各1支。

B：切三份：

PMPTa+S AccIII端完成，NheI待切

PMPTb+M NotI、NheI待切

PMPTc+E AccIII端完成，NotI待切

37℃，10min

电泳，全部上样：DL15000、pMPTa+S、pMPTb+M、pMPTc+E

片段回收：pMPTa+S回收质粒+表达盒，约10840bp

pMPTb+M回收表达盒，约2575bp

pMPTc+E回收表达盒，约2134bp

电泳检查：大小正确

DL15000、S回收、DL10000、M回收、E回收

配对连接pMPT-a、pMPT-b、pMPT-c质粒片段和S、M、E片段，并转化DH5a感受态 细胞，挑取转化子。

连接3组：

22℃1h

分别转化DH5a菌株：

50uLDH5a+4uL连接产物，冰浴30min，42℃热击45s，冰浴2min

加入SOC培养基至1mL，37℃170rpm培养1h，涂LB(+Amp)平板培养。

挑取平板菌落：pMPTa+S、pMPTb+M、pMPTc+E各16株。

分别划线LB(+Amp)平板培养,并做菌体PCR。PCR检测，电泳验证如图5所示。图5、配对连接pMPTa、pMPTb、]pMPTc质粒片段和S、M、E转化子的PCR电泳验证。转化子 提取质粒，得到pMPT-S、pMPT-M、pMPT-E质粒。

pMPT-S-M-E质粒构建：从pMPT-M、pMPT-E质粒双酶切位点处分别获得M及E基因 的表达框，以pMPT-S质粒为骨架，依次将M及E的表达框插入至pMPT-S质粒中Acc III 酶切位点处。构筑后质粒在最后一个表达框的后面保留1个Sac I酶切位点，S与M表达框 之间引入一个Nhe I酶切位点，M与E表达框之间引入一个Not I酶切位点。引入的Nhe I、 Not I酶切位点在质粒中单一存在。

pMPT-S质粒经AccIII、NheI双酶切，回收大片段，获得质粒基因骨架及S基因表达盒。 pMPT-M质粒经NotI、NheI双酶切，回收小片段，获得M基因表达盒。pMPT-E质粒经AccIII、 NotI双酶切，回收小片段，获得E基因表达盒。酶切产物电泳检查见图6。

将三个基因片段用T4连接酶22℃连接，1h，转化DH5a感受态细胞，涂LB(+Amp)平板，37℃培养过夜。挑取转化子，PCR验证能够扩增转入基因，电泳验证如图7所示。

实施例2、基因电穿孔技术导入酵母细胞

pMPT-S-M-E质粒用Sac I酶切，质粒线性化，低温操作将质粒和汉逊酵母感受态细胞预 混，并通过瞬时高压电穿孔方法导入汉逊酵母基因组。电击后加入培养基37℃孵育1h，完 成细胞修复，菌液涂布MD固体培养平皿，31℃培养3-5天，存活细胞长出可见菌落，从中 挑选优质转化子。

瞬时高压电穿孔的具体过程是：

电转化第一次：

质粒酶切：

37℃1h

乙醇沉淀：30uL水溶解

分两份，电转化：

涂MD固体平板，32℃培养。

实施例3、转化子的传代培养筛选

电击细胞经孵育修复，在MD固体培养基缓慢生长出菌落，挑取生长快的600株转化子 移入新的培养基传代，经多次传代培养，不断提高生长速度，促进质粒整合到细胞染色体中。

实施例4、平皿传代培养、半定量PCR筛选高拷贝细胞株

汉逊酵母(ATCC34438)重组COVID-19包膜颗粒疫苗的pMPT-S-M-E转化子平皿传代培养第13代的PCR筛选获得高拷贝转化子共67株(部分转化株如图8所示，汉逊酵母(ATCC34438)重组ARS-CoV-2包膜颗粒半定量PCR筛选得到100个上下高拷贝细胞株)。 转化后菌落经数次传代生长速度提高，经PCR检测淘汰不能扩增S、M、E基因拷贝数的菌 落，并对扩增条带测序，验证插入基因正确。

进一步进行2个高拷贝细胞株的全基因组测序；定量测定包膜颗粒pMPT-S-M-E的目的 基因拷贝数。

实施例5、工程菌株三代种子库制备

菌株转入MD液体培养基培养，数次传代适应后，制备PSL、MSL、WSL三代菌株库， 即原代、主代、工作菌株。

将获得的三代菌株库中的菌株进行发酵纯化后得到汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜 颗粒疫苗细胞株，进行30升中试发酵；具体过程是：

1)以200ml种子培养基解冻液氮贮存菌种，接种至培养基中，均分两个0.5L摇瓶，31℃ 培养22小时作为一级种子；

2)以1600ml种子培养基将一级种子转接入二级种子培养基中，均分6个1L摇瓶，31℃ 培20小时作为二级种子；

3)将12L发酵培养基调pH至5.5加入30L发酵罐中，将二级种子接入后，30-31℃经甘油、甲醇两碳源，生长、去阻遏和诱导三时相，共培养85-96小时，在停止诱导2-3小时 后收获细胞。将冷冻的细胞匀浆。

培养基

1.氯化钙溶液的配制

准确称量CaCl₂11.33g，放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至200ml。

2.微量元素溶液的配制

准确称量以下试剂：

将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至200ml。

3.维生素溶液的配制

准确称量以下试剂：

d-Biotin 6mg

Thiamin HCl 2000mg

将生物素首先溶解在10ml的50％异丙醇中，待溶解后再加入Thiamin HCl，然后加适量 去离子溶解后水定容至100ml。

4.痕量元素溶液的配制

准确称量以下试剂：

将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子溶解后水定容至50ml。

以上四种溶液分别除菌过滤备用。

5.种子盐溶液的配制

准确称量以下试剂：

将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至1600ml。

6.用2000ml三角瓶称取甘油27g，混合盐溶液360mL，加去离子水定容至1800ml,等量分装于两个2000ml三角瓶中，110℃、30分钟高压蒸汽灭菌。

110℃、30分钟高压蒸汽灭菌空消500ml三角瓶2个，1000ml三角瓶6个，100ml 和500ml量筒各一个。

7.一级种子培养基

在超净台中，无菌操作量取灭菌后的甘油水溶液各100ml，分别置于灭菌后 的2个500ml三角瓶中，并分别加入：

将加入的溶液摇匀。

8.二级种子培养基

在超净台中以无菌操作技术取灭菌后的甘油水溶液1600ml置于灭菌后的2000ml三角 瓶中，并分别加入：

9.发酵培养基

准确称量以下试剂并溶解于2000ml去离子水中。

取一个500ml小烧杯称取520g甘油，加泡敌10ml在线灭菌，然后加：

10.补料培养基

取一个1000ml三角瓶，量取87gNH₄H₂PO₄、260g甘油，加去离子水500ml，加入包裹好的补料管线，110℃、30分钟灭菌。

11.去阻遏溶液

用5000ml三角瓶，量取甘油1800g，加去离子水660ml，加入包裹好的补料管线，110℃、 30分钟灭菌，冷却后无菌操作加入过滤除菌的盐溶液540ml。

12.诱导溶液

用1000ml三角瓶，量取甘油400ml，加入包裹好的补料管线，110℃、30分钟灭菌，冷却后无菌操作加入甲醇1600ml。

本发明未述及之处适用于现有技术。

序列表

<110> 天津和睦健民生物科技有限公司

<120> 汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒疫苗细胞株

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 1

atgtttgttt tccttgttct gttgccactg gtctctagtc agtgcgttaa tcttacaacc 60

agaactcaac tcccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccccgac 120

aaagttttca gatcctccgt tctccattcg actcaggact tgttcctccc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccacgc tatccatgtc tctggcacca atggcactaa gaggtttgat 240

aaccccgtcc tcccatttaa tgatggcgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacatc 300

atcagaggct ggatttttgg cactactctc gattcgaaga cccagtccct ccttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgcgaatttc aattttgtaa cgatccattt 420

ttgggcgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtctat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cctttctcat ggacctcgaa 540

ggaaagcagg gcaatttcaa gaatctcagg gaatttgtgt ttaagaacat tgatggctat 600

tttaagatct attctaagca cacgcccatt aacctggtgc gtgatctccc ccagggcttt 660

tcggctctgg aaccattggt agatttgcca atcggcatta acatcactag gtttcagact 720

ctgctcgctc tgcatagaag ttatttgact cccggagatt cttcttcggg ctggacagct 780

ggagctgcag cttattatgt gggctatctc cagcccagga cttttctgct gaaatacaac 840

gagaacggaa ccattacaga tgctgtggac tgcgcactcg accccctctc ggaaacaaag 900

tgcacgttga aatccttcac tgtggaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt cagatttccg aatattacca acttgtgccc gtttggcgaa 1020

gtctttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tacgcttgga accggaagag aatcagcaac 1080

tgcgttgctg attactctgt cctgtacaat tccgcatcgt tctccacctt taagtgctac 1140

ggagtgtctc cgaccaaact gaacgatctc tgcttcacta acgtctatgc agattcgttc 1200

gtaattagag gcgatgaagt cagacaaatc gctccaggac aaaccggaaa gattgccgat 1260

tacaattaca aactgccaga tgatttcaca ggctgcgtca tcgcctggaa ctctaacaac 1320

cttgactcta aggtcggcgg taattacaat tacctgtaca gattgtttcg aaagtctaac 1380

ctcaagccgt ttgagagaga catttcgacc gaaatctatc aggccggaag cacaccgtgt 1440

aacggagtcg aaggcttcaa ctgttacttt ccgctgcaat cgtacggatt ccaacccacc 1500

aacggagttg gataccagcc atacagagtg gtagtgcttt ctttcgaact tctgcacgca 1560

ccagcaactg tctgtggacc gaagaagtct accaacttgg ttaagaacaa gtgtgtcaac 1620

ttcaacttca acggactgac cggcacagga gtccttaccg agtccaacaa gaagttcctg 1680

cctttccagc aattcggccg agacattgcc gacaccaccg acgctgtccg tgacccacag 1740

acccttgaga ttctcgacat tacaccatgt tcctttggtg gtgtcagtgt tatcacacca 1800

ggaacgaaca cctctaacca ggtcgctgtg ctttaccagg acgttaactg cacggaagtc 1860

cctgtggcaa ttcacgcaga ccaactcact cctacttggc gcgtctactc tacgggatcg 1920

aacgtgtttc aaacgcgcgc aggctgtctg atcggagccg aacacgtcaa caactcgtac 1980

gagtgtgaca tccccattgg tgcaggtatc tgcgccagct accagaccca gactaactcc 2040

cctcggcggg cccgcagtgt ggccagccaa tccatcattg cctacaccat gtcgcttgga 2100

gccgagaact cggttgccta ctccaacaac tccattgcca tccccacgaa ctttaccatt 2160

agcgtgacca cggagattct cccagtgtcc atgaccaaga cgtccgtaga ctgtacgatg 2220

tacatttgtg gtgactcgac cgagtgcagc aaccttttgc tgcaatacgg cagcttctgt 2280

acgcaactga accgagcact gaccggaatc gccgttgagc aagacaagaa cacccaagag 2340

gtcttcgccc aagtcaagca gatttacaag acgccaccaa ttaaggactt cggtggtttc 2400

aacttctcgc aaatcctgcc agacccatcg aagccaagca agcgatcgtt cattgaggac 2460

ctgcttttca acaaggtgac gcttgccgat gccggcttca tcaagcaata cggtgactgc 2520

cttggtgata ttgctgcccg agacctcatt tgcgcccaga agttcaacgg ccttaccgtc 2580

ctgccacctc tgctcacgga tgagatgatt gcccagtaca cctccgccct gctggcgggt 2640

acgatcacct ccggttggac cttcggtgca ggtgctgccc tgcagatccc attcgccatg 2700

cagatggcct accggttcaa cggtattgga gtcacgcaga acgtcctcta cgagaaccag 2760

aaactgatcg ccaaccagtt caacagtgcg atcggcaaga tccaggactc gctttcctcc 2820

acagcgagcg cacttggaaa acttcaggac gtggtcaacc agaacgcgca ggcgctgaac 2880

acgcttgtca agcagcttag ctccaacttc ggtgcgatct ccagcgttct gaacgacatc 2940

ctctcgcgcc tcgacaaggt tgaggctgag gtgcagatcg ataggctgat cacgggccga 3000

cttcagagct tgcagacata cgtgacccag cagctgatca gagccgcgga gatccgagcg 3060

tccgcgaacc ttgcggctac caagatgtcg gagtgcgtgc ttggacaatc gaaacgagtc 3120

gacttctgcg gaaagggcta ccaccttatg tccttccctc agtcggcgcc tcatggtgtg 3180

gtcttcctgc acgtgaccta cgtccctgcg caagagaaga acttcacgac cgcccctgcg 3240

atctgccatg acggaaaagc ccacttccct cgtgagggtg tcttcgtctc gaacggcacc 3300

cactggttcg tgacccaacg gaacttctac gagccacaga tcatcaccac cgacaacaca 3360

ttcgtgtccg gtaactgcga cgttgtgatc ggaatcgtca acaacacagt ctatgaccct 3420

ctgcagcctg agctggactc gttcaaagag gagctggata agtacttcaa gaaccatacc 3480

tcgccagacg ttgacctggg tgacatctct ggcatcaacg cctcggtcgt gaacatccag 3540

aaagagatcg accgcctcaa cgaggtcgcc aagaatctga acgagtccct catcgacctc 3600

caggaactcg gaaagtacga gcagtacatc aaatggccat ggtacatctg gctgggtttt 3660

atcgccggcc tgatcgccat cgtaatggtg accattatgc tctgctgcat gaccagctgc 3720

tgcagctgtc tcaagggctg ctgttcttgc ggctcctgct gcaagttcga cgaggacgac 3780

tccgagccag tgctcaaagg agtcaagctg cactacacat aa 3822

<210> 2

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

atggccgatt cgaacggtac tattacggtt gaggaactga aaaagctcct ggagcagtgg 60

aacctcgtca tcggcttcct gttcctcacc tggatctgtc ttctccaatt cgcctatgcc 120

aacagaaaca gatttttgta catcattaag ctgatcttcc tctggctgct ctggccagtc 180

actctggctt gctttgtgct tgcggcagtt tacagaatca attggatcac cggtggcatc 240

gctatcgcca tggcctgcct tgtcggcttg atgtggctca gctacttcat tgcgtctttc 300

agactgtttg cccgaacgcg atccatgtgg tcgttcaacc ccgagaccaa cattctgctc 360

aacgtaccac ttcacggcac tatcctgacc agacctcttc tggagtccga actcgtcatc 420

ggagctgtga tccttcgagg acaccttaga attgcaggac accacctggg acgctgcgac 480

atcaaggacc tgcctaagga gattaccgtt gctacatctc gaacgctttc ttattacaaa 540

ttgggagcct cgcagcgtgt ggccggcgac tccggttttg ctgcatactc gcggtacagg 600

attggcaact acaagctcaa caccgaccat tcctctagct ccgacaatat tgctttgctt 660

gtccagtaa 669

<210> 3

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

atgtactcct tcgtttcgga agaaaccggc actctcatcg tcaattccgt gcttctgttt 60

cttgctttcg tggttttcct gctcgttacc ctggccatcc tcacggcact tcgactgtgt 120

gcctactgct gcaacattgt gaacgtgtcg cttgtcaagc cttctttcta tgtctactcc 180

agagtcaaga acctgaactc ttccagagtc ccagacctcc tggtctaa 228

<210> 4

<211> 797

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 4

atgtataaat cttatggaga aagggcgaag tgaagtctca cccatctaag gtcgccagca 60

gactacttaa tttgatggaa tccaagcaaa caaacctctg cgcttctgtg gatgtgacta 120

aaactcagga attattggag cttcttgata aactgggccc ttacatctgc cttgtcaaaa 180

ctcatattga catagtagag gacttctctt atgaacacac cattttacca ttacaggact 240

tgcaaagaaa cacaacttca tgatttttga agacagaaag tttgctgata ttaggaaaca 300

cagtcaaact acagtataag ggaggaattt atcgaacatc caagtgggcc gatatcacga 360

atgcacacgg agtgactggc gcaggaattg ttgaaggtct taaacaggcc gcagaagaaa 420

gtacagatga gccacgtggg cttttgatgc ttgctgagct ctcttcaaag ggatcattag 480

ctaccggtga gtatactcaa aaaactgtgg aaatagcgaa aagcgataaa gaatttgtca 540

ttggatttat tgcacagaga gacatgggag gtcgtgagga aggctttgac tggctgatca 600

tgactccagg agttggttta gatgataaag gtgattctct gggccaacag tacagaactg 660

ttgatgaagt gatgcaaaca ggaaccgatg tcattatcgt tggaagaggt ttattcggaa 720

aaggaagaga tcctgaagtg gaagggaaga gatacagaaa tgctgggtgg gaagcttaca 780

agcggcgcat tgcttaa 797

Claims (6)

1.一种汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒疫苗细胞株，其特征在于，该细胞株中包括汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒S刺突蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:1所示；汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒M膜蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:2所示；汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒E包膜蛋白的优选码DNA序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的细胞株，其特在于，汉逊酵母为HU-11多形汉逊酵母，HU-11多形汉逊酵母的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被破坏的DNA序列如SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求1所述的细胞株，其特在于，该细胞株制备时pMPT-S-M-E质粒的构建过程是：从pMPT-M、pMPT-E质粒双酶切位点处分别获得M及E基因的表达框，以pMPT-S质粒为骨架，依次将M及E的表达框插入至pMPT-S质粒中Acc III酶切位点处；构筑后质粒在最后一个表达框的后面保留1个Sac I酶切位点，S与M表达框之间引入一个Nhe I酶切位点，M与E表达框之间引入一个Not I酶切位点；引入的Nhe I、Not I酶切位点在质粒中单一存在。

4.根据权利要求1所述的细胞株，其特在于，已经构建成功汉逊酵母重组COVID-19病毒样包膜颗粒疫苗转化子，经第13代半定量PCR筛选得到67株高拷贝细胞株；从第13代定量PCR筛选获得的细胞株中再次进行PCR筛选挑选出4株重组高拷贝细胞株COVID-19病毒样包膜颗粒疫苗工程细胞株，S棘蛋白、M膜蛋白和E包膜蛋白基因拷贝数为100个；异源整合在染色体的多个转座子位置；基因重组菌细胞株的遗传稳定性大于40个二分裂世代。

5.根据权利要求1所述的细胞株，其特在于，该细胞株的1mL种子管细胞，经过4至5级扩大培养和高密度发酵，细胞干重100克/升；种子细胞经24次二分裂倍增，发酵液体积扩大到1200升，生产发酵罐周期为80小时，年生产发酵55罐，能年产COVID-19病毒样包膜颗粒疫苗原液26.4公斤；能分装剂量20μg/针COVID-19疫苗13亿剂。

6.根据权利要求1所述的细胞株，其特在于，汉逊酵母重组COIDV 19包膜颗粒疫苗设计剂量为20μg/针；按免疫程序0、1、6月免疫接种3针；获得的免疫保护水平为：50％人群SARS-CoV-2中和抗体(NAb)滴度≥1000，判定为高应答，免疫保护5-8年；30％人群SARS-CoV-2NAb滴度为500-999，判定为正常应答，免疫保护3-5年；≤20％人群SARS-CoV-2NAb滴度为100-499，判定为正常应答，免疫保护1-3年；≤5％人群SARS-CoV-2NAb滴度为10-99，判定低应答，应按免疫程序为0、1、6月免疫复种3针。

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