CN111961685A - CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠、建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因敲除技术领域，公开了一种CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠、建立方法，通过载体设计和构建，及gRNA和Cas9蛋白的制备；设计gRNA序列和打靶载体；利用In‑Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白；显微注射及F0鼠鉴定；将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠；F1代鼠的繁殖和鉴定；将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，成果获得了多囊肾基因PKD1基因敲除小鼠。
Description
技术领域
本发明属于基因敲除技术领域，尤其涉及一种CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠、建立方法。
背景技术
基因敲除(knockout)是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。基因敲除和基因嵌入技术是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/LoxP系统、FLPI系统等。基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。然而，现有基因敲除效果差。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有基因敲除效果差。
解决以上问题及缺陷的意义为：CRISPR Cas9系统是近年来兴起的一种新型基因编辑技术。它是一种原核生物免疫系统，被用来抵抗噬菌体病毒和外源质粒等外来遗传物质的入侵。它能够识别并切断外源DNA，正是由于如此精确的靶向功能，使得外源基因的表达被沉默。
CRISPR Cas9基因编辑技术，构建基因敲除小鼠模型的试验研究有很多，其作为一种新型的基因编辑工具，相较于传统基因编辑技术具有操作便捷、低成本、高效率等优点。CRISPR/Cas9系统具有设计灵活、成本低、操作简单、准确性高、可多位点同时打靶等优势。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠、建立方法。
本发明是这样实现的，一种CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法，所述CRISPRCas9条件性基因敲除鼠建立方法通过载体设计和构建，及gRNA和Cas9蛋白的制备；设计gRNA序列和打靶载体；利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白；显微注射及F0鼠鉴定；将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠；F1代鼠的繁殖和鉴定；将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代。
进一步，所述CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白。
进一步，所述CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠。
进一步，所述CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，至少3只经PCR和Southern验证的F1代鼠；冻存：3年。
本发明的另一目的在于提供一种所述CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法在大型哺乳动物的基因敲除模型构建中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：CRISPR Cas9系统是近年来兴起的一种新型基因编辑技术。它是一种原核生物免疫系统，被用来抵抗噬菌体病毒和外源质粒等外来遗传物质的入侵。它能够识别并切断外源DNA，正是由于如此精确的靶向功能，使得外源基因的表达被沉默。迄今为止，Cas9广泛用于在各种物种和细胞类型(包括人类细胞系、细菌、斑马鱼、酵母、小鼠、果蝇、圆虫、大鼠、普通作物、猪和猴子)中实现有效的基因组编辑。
本发明通过载体设计和构建，及gRNA和Cas9蛋白的制备；设计gRNA序列和打靶载体；利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白；显微注射及F0鼠鉴定；将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠；F1代鼠的繁殖和鉴定；将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，大大提高基因敲除效果。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠的建立方法流程图。
图2是本发明实施例提供的繁育方案示意图。
图3是本发明实施例提供的鉴定方案示意图。
图4是本发明实施例提供的PCR引物1鉴定为阳性的小鼠(突变型:3.4kb)示意图。
图5是本发明实施例提供的PCR引物2鉴定为阳性的小鼠(突变型:4.0kb)示意图。
图6是本发明实施例提供的测序结果示意图。
图7是本发明实施例提供的Southern Blot验证示意图。
图8是本发明实施例提供的4只小鼠均为阳性示意图。
图9是本发明实施提供的定位策略概述图。
图10是本发明实施提供的点图概述图。
图11是本发明实施提供的GC内容分发概述图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠、建立方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明提供的CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠的建立方法包括以下步骤：
S101：利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白；
S102：将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠；
S103：将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，至少3只经PCR和Southern验证的F1代鼠；冻存：3年。
本发明提供的CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠的建立方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠的建立方法仅仅是一个具体实施例而已。
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例1：
1.方法
针对小鼠Pkd1基因设计的gRNA，携带loxP位点的donor载体，以及Cas9mRNA共注射到小鼠受精卵中，获得的F0代首建鼠需要进行PCR鉴定、测序验证，然后与野生型小鼠配种传代，交付F1代阳性鼠。
2.gRNA引物序列(SEQ ID NO：1)
gRNA1(反向)：ATGATGAACCTGGCAAGTCAGG
gRNA2(正向)：CCGTACATATTCGTTGTTAAGGG
3.繁育方案，如图2所示。
4.鉴定方案，如图3所示。
5.PCR筛选，如图4和图5所示：
PCR引物1(退火温度60.0℃)：(SEQ ID NO：2)
5’arm正向引物(F1)：5’-AAGGTCCCCATTCGCTAAGACAAAC-3’
3’loxP反向引物(R1)：5’-GTGGAACAATGCCCAGTCTGA-3’
PCR引物2(退火温度60.0℃)：(SEQ ID NO：3)
5’loxP正向引物(F2)：5’-GTAAACGTTCAAGATAACTTCG-3’
3’arm反向引物(R2)：5’-GAAGGTGAACTCGAGTGGATAGT-3’
PCR结果：
F1代小鼠(编号3，5，7，9)均为PCR阳性。
6.测序验证，如图6所示。
PCR引物1的测序引物：(SEQ ID NO：4)
5’Sequence primer(F3)：5’-CCGGAACCGGGGAGTTGG-3’
PCR引物2的测序引物：(SEQ ID NO：5)
3’Sequence primer(F4)：5’-TCGCACCGAGGATACTTGG-3’
测序结果：
小鼠ID：3(以其中1只阳性鼠为例)
7.Southern Blot验证，如图7所示。
4只F1阳性鼠(3，5，7and9)取鼠尾进行SouthernBlot验证，验证方案及结果如下：
Southern Blot酶切理论大小：
5’Probe-Bsu36I：6.71 kb-WT，4.68 kb-MT
3’Probe-EcoRV：14.42 kb-WT，3.52 kb-MT
5’探针引物：(SEQ ID NO：6)
5’Probe forward primer：5’-GGAAATCCCAGTCCTAGTCCATAGTTG-3’
5’Probe reverse primer：5’-TCATCCCTAAAGACAACGCGCCTA-3’
3’探针引物：(SEQ ID NO：7)
3’Probe forward primer：5’-GATTGAGAATGGAGGCTTGGGATC-3’
3’Probe reverse primer：5’-TATGAGGAGGCATGGGTAGGACGAT-3’
结果：
4只小鼠均为阳性，如图8所示。
实施例2：
1、小鼠Pkd1有条件的基因敲除项目(CRISPR/Cas9)*-vC
1.1目的：
通过CRISPR/Cas介导的基因组工程创建Pkd1条件敲除小鼠模型(C57BL/6N)。
1.2策略摘要：
Pkd1基因(NCBI参考序列：无；集合体：ENSMUSG00000032855)位于小鼠第17号染色体上。
鉴定出46个外显子，第1外显子的ATG起始密码子和第46外显子的TAG终止密码子(解说词：ENSMUST00000035565)。
选择第2-8外显子作为条件敲除区域(cKO区域)。删除此区域应导致鼠标Pkd1基因功能的丧失。
为了工程化靶向载体，将使用BAC克隆RP24-282C1作为模板通过PCR产生同源臂和cKO区域。
Cas9，gRNA和靶向载体将被共同注入受精卵中，以产生cKO小鼠。
幼犬将通过PCR和随后的测序分析进行基因分型。
注意：纯合突变体胚胎在胚胎第(E)14.5天后开始死亡。由E13.5引起水肿，由E15.5引起胰腺囊肿，并由E16.5引起肾囊肿。杂合子成年后会出现肾脏
和肝脏
的囊肿。
外显子2从大约1.68％的编码区开始。外显子
的敲除将导致基因移码。
用于5'-loxP位点插入的内含子1的大小：13672bp，和用于3'-loxP位点插入的内含子8的大小：500bp。
有效cKO区的大小：
cKO区没有任何其他已知基因。
图9为定位策略概述图；
图10为点图概述图；
注意：同源臂和cKO区的序列与其自身比对，以确定是否存在串联重复序列。无明显串联在点图矩阵中找到重复项。因此，该区域适用于PCR筛选或测序分析。
图11为GC内容分发概述图；
注意：分析同源臂和cKO区的序列以确定GC含量。找不到明显的高GC含量区域。因此，该区域适用于PCR筛选或测序分析。
BLAT搜索结果表(上)
注意：对基因组进行BLAT搜索外显子2上游3000bp部分。没有发现明显的相似性。
BLAT搜索结果表(下)
注意：对基因组进行BLAT搜索外显子8下游3000bp部分。没有发现明显的相似性。
1.3基因和蛋白质信息：
Pkd1多囊藻毒素1，瞬时受体电位通道相互作用[小家鼠(家鼠)]；
基因ID：18763，于2019年10月15日更新。
1.4基因总结
官方符号：MGI提供的Pkd1；
官方全名：多囊藻毒素1，由MGI提供的瞬态受体电位通道相互作用
主要来源：MGI：MGI：97603
查看相关合奏：ENSMUSG00000032855
基因类型：蛋白质编码
RefSeq状态：为有效
生物：老鼠的肌肉
血统真核生物；后生动物Chordata；Craniata；椎骨；Euteleostomi；哺乳动物；埃塞俄比亚Euarchontoglires；怒视；啮齿类；肌吗；Muroidea；鼠科；村前；穆斯小家鼠；
也称为PC1；mFLJ00285；
表达：在成年卵巢(RPKM37.1)，成年肺(RPKM32.2)和其他25个组织中普遍表达。
直系同源物：人类
1.5基因组背景
位置：17 A3.3；1712.4厘米；在基因组数据查看器中查看Pkd1；
外显子计数：47；
1.6转录本信息：该基因有10个转录本
基因：Pkd1ENSMUSG00000032855
描述：多囊藻蛋白1，瞬时受体电位通道相互作用[来源：MGI符号；Acc：MGI：97603]
基因同义词：PC-1，PC1，polycystin-1
17号染色体位置：24,549,834-24,596,508前向链。
GRCm38：CM001010.2；
关于该基因：该基因具有10个转录本(剪接变体)，204个直向同源物，10个旁系同源物，是1个Ensembl蛋白家族的成员，并与113个表型有关。
成绩单表：
2、小鼠Pkd1条件性基因敲除项目(CRISPR/Cas9)-vC
2.1 gRNA靶序列：
(SEQ ID NO：8)gRNA-A1(基因匹配反向链)：TGCTGATGCCCTTCAGTGGC-AGG
(SEQ ID NO：9)gRNA-A2(基因的匹配反向链)：ATTTATCTGAGCAAAGGTTC-AGG
(SEQ ID NO：10)gRNA-B1(基因的匹配反向链)：CCTCTGCTGATGCCCTTCAG-TGG
(SEQ ID NO：11)gRNA-B2(基因的匹配反向链)：ATAAAAATTTATCTGAGCAA-AGG
2.2脱靶分析
gRNA-A1的脱靶分析表：
gRNA-A2脱靶分析表：
gRNA-B1的脱靶分析表：
gRNA-B2脱靶分析表：
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江西中医药大学
<120> CRISPR Cas9 条件性基因敲除鼠、建立方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgatgaacc tggcaagtca ggccgtacat attcgttgtt aaggg 45
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggtcccca ttcgctaaga caaacgtgga acaatgccca gtctga 46
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaaacgttc aagataactt cggaaggtga actcgagtgg atagt 45
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccggaaccgg ggagttgg 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgcaccgag gatacttgg 19
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaaatccca gtcctagtcc atagttgtca tccctaaaga caacgcgcct a 51
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gattgagaat ggaggcttgg gatctatgag gaggcatggg taggacgat 49
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgctgatgcc cttcagtggc agg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atttatctga gcaaaggttc agg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctctgctga tgcccttcag tgg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ataaaaattt atctgagcaa agg 23
Claims (5)
1.一种CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法，其特征在于，所述CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法通过载体设计和构建，及gRNA和Cas9蛋白的制备；设计gRNA序列和打靶载体；利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白；显微注射及F0鼠鉴定；将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠；F1代鼠的繁殖和鉴定；将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代。
2.如权利要求1所述的CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法，其特征在于，所述CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白。
3.如权利要求1所述的CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法，其特征在于，所述CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠。
4.如权利要求1所述的CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法，其特征在于，所述CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，至少3只经PCR和Southern验证的F1代鼠；冻存：3年。
5.一种如权利要求1～4任意一项所述CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法在所有生物模型中的基因敲除模型构建中的应用。
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