JP2019503653A5

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Publication number: JP2019503653A5
Application number: JP2018524760A
Authority: JP
Filing date: 2016-12-12
Publication date: 2020-12-17
Anticipated expiration: 2036-12-12

Claims

外来ＤＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むｉｎｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）トランスポゾン系であって、
配列番号１からなる核酸配列を有する第１の逆方向反復、
前記第１の逆方向反復の下流の外来ＤＮＡ配列、及び、
前記外来ＤＮＡ配列の下流の第２の逆方向反復、ここで当該第２の逆方向反復は配列番号２からなる核酸配列を有する、を含有する第１のベクターと、
配列番号４のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有する第２のベクターと、
を含むトランスポゾン系を得ることと、
（ｉｉ）前記外来ＤＮＡ配列が前記細胞のゲノムに組み込まれるように、前記第１のベクター及び前記第２のベクターを前記細胞に導入することと、
を含み、
前記トランスポザーゼが前記細胞中で発現され、前記第１のベクターからの前記外来ＤＮＡ配列の切出し及び切り出された外来核酸の前記細胞のゲノムへの組込みを触媒する、方法。
前記外来ＤＮＡ配列が抗生物質耐性タンパク質、ｓｉＲＮＡ、レポータータンパク質、サイトカイン、キナーゼ、抗原、抗原特異的受容体、サイトカイン受容体又は自殺ポリペプチドをコードし、
前記第１のベクターが、前記外来ＤＮＡ配列に操作可能に連結した非原核生物プロモーターを好ましくは更に含み、且つ、エンハンサー、サイレンサー又はインシュレーターを任意に更に含み、
さらに好ましくは、前記非原核生物プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記第２のベクター中の前記プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ又はマスト細胞からなる群から選択される免疫細胞であるか、あるいは、
骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血又は歯髄に由来する幹細胞であり、
前記細胞は好ましくはヒト細胞である、
請求項１に記載の方法。
導入工程の前に前記第１のベクターを線状化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
前記第１のベクター及び前記第２のベクターをリン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、細胞スクイージング、ソノポレーション、光学トランスフェクション、インペールフェクション、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルス形質導入、又はデンドリマー、リポソーム若しくはカチオン性ポリマーによるトランスフェクションによって前記細胞に導入する、請求項１に記載の方法。
外来ＤＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むためのキットであって、
容器と、
トランスポゾン系であって、
配列番号１からなる核酸配列を有する第１の逆方向反復、
前記第１の逆方向反復の下流の配列番号２からなる核酸配列を有する第２の逆方向反復、及び、
前記外来ＤＮＡ配列を導入するための前記第１の逆方向反復と前記第２の逆方向反復との間のクローニング部位を含有する第１のベクターと、
配列番号４のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有する第２のベクターと、
を含むトランスポゾン系と、
前記容器に付随し、前記トランスポゾン系の使用方法を示す取扱説明書と、
を含み、
前記第１のベクターが、細菌複製に必要とされる原核生物配列を欠くミニサークルＤＮＡであり、
前記トランスポザーゼが、前記第１のベクターからの前記外来ＤＮＡ配列の切出し及び切り出された外来ＤＮＡ配列の前記細胞のゲノムへの組込みを触媒する、キット。
前記第２のベクター中の前記プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項７に記載のキット。
前記第１のベクターが、前記第１の逆方向反復の下流かつ前記クローニング部位の上流に非原核生物プロモーターを更に含み、該非原核生物プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項７に記載のキット。