CN112824528A - 一种α-苦瓜素基因及其在哺乳动物细胞内的过表达方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种密码子改造过的α‑苦瓜素基因，属于基因工程领域。本发明的基因序列如SEQ ID NO.2所示，能够在哺乳动物细胞内表达；其蛋白产物对癌细胞具有杀伤作用，有望应用于新型抗肿瘤基因治疗药物的制备，前景良好。

Description

一种α-苦瓜素基因及其在哺乳动物细胞内的过表达方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种α-苦瓜素基因及其在哺乳动物细胞内的过表达方法。
背景技术
α-苦瓜素(Alpha-momorchain，α-MMC)是从苦瓜籽中提取分离的一种核糖体失活蛋白，能专一地水解真核细胞核糖体28S r RNA第A4324位上的腺嘌呤碱基与核糖之间的N-C糖苷键，释放出1个腺嘌呤碱基，阻遏延长因子EF-2与核糖体的结合，从而抑制蛋白质的合成。α-苦瓜素具有抗肿瘤(包括绒毛膜癌、黑色素瘤、鼻咽癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌等)、抗病毒、抗真菌、抗生育及免疫调节等作用。
α-MMC基因可以在原核细胞和酵母细胞中表达，却难以在哺乳动物细胞内表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以在哺乳动物细胞内表达α-苦瓜素基因。
本发明的技术方案包括：
一种基因片段，序列如SEQ ID NO.2所示。
一种重组表达载体，它的序列包括SEQ ID NO.2。
进一步地，所述重组表达载体的载体骨架为GV141载体。
一种在哺乳动物细胞中过表达α-苦瓜素的方法，它是将序列如SEQ ID NO.2所示基因片段表达于哺乳动物细胞中。
优选地，它是将前述的重组表达载体转入哺乳动物细胞中，使序列如SEQ ID NO.2所示基因表达。
优选地，所述哺乳动物细胞是293T细胞。
前述基因片段或重组表达载体在制备抗癌药物中的用途。
本发明具有如下有益效果：
发明人在前期实验发现，直接将未经优化α-MMC基因转入293T细胞，无法有效表达。
通过多次密码子优化以及设计，得到了本发明可以在哺乳动物细胞中表达的优化的α-苦瓜素基因序列，该优化的序列并非将所有密码子都改为哺乳动物偏好密码子，而是有选择地改变特定的密码子，最终表达效果良好。
本发明的α-MMC基因序列(SEQ ID NO.2所示的序列)能在动物细胞内大量表达，可以引起哺乳动物细胞死亡，若将其靶向转入肿瘤细胞，将有希望制成抗肿瘤的基因治疗药物，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：GV141载体的结构示意图。
图2：转化子电泳鉴定；1#：阴性对照(ddH2O)；2#：阴性转化子(空载自连对照组)；3#：阳性对照(GAPDH)；4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp；5-12#：1-8号转化子(阳性转化子)。
图3：基因转录水平检测图。
图4：细胞镜检图。
图5：蛋白免疫印迹检测图。
具体实施方式
实施例1本发明α-MMC基因的构建方法
本发明的α-MMC基因以SEQ ID NO.1为模板，优化特定的密码子，得到本发明的α-MMC基因序列(如SEQ ID NO.2所示)。
SEQ ID NO.1：
Figure BDA0002281445840000021
Figure BDA0002281445840000031
SEQ ID NO.2：
Figure BDA0002281445840000032
实施例2本发明α-MMC在哺乳动物细胞表达
1.载体构建
人工合成序列如SEQ ID NO.2所示的序列，使用酶切/酶联的方式将其插入GV141载体(元件顺序：CMV-MCS-3FLAG-SV40-Neomycin；如图1所示)的多克隆位点，优选地，为NheI/XhoI位点；得到重组过表达载体。
2.PCR鉴定
使用引物CMV-F进行PCR，电泳检测条带大小。如图2所示，阳性转化子的PCR产物大小为1279bp，阴性转化子(空载体自连)PCR产物大小为434bp。
CMV-F(SEQ ID NO.3)：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG。
3.测序鉴定
使用测序进一步确认阳性转化子。
4.转染细胞
采用载体转染细胞的方法，将重组过表达载体转染293T细胞。
以下将以实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。
实验例1转染和表达效率检测
一、方法
使用实施例2的方法将本发明α-MMC基因序列构建到GV141载体的多克隆区，转入293T细胞，为实验组(OE)；再以空载体(GV141载体)转入293T细胞作为阴性对照(NC)。细胞转染质粒用量如表1所示。
表1细胞转染质粒用量
Figure BDA0002281445840000041
1.使用qPCR对基因转录进行检测
转入α-MMC基因后24h，收集转α-MMC基因的细胞，提取RNA，使用如下引物进行qPCR检测。
qPCR引物：
内参基因ACTB的引物：上游，GGCGGCACCACCATGTACCCT(SEQ ID NO.4)；下游，AGGGGCCGGACTCGTCATACT(SEQ ID NO.5)；
目的基因α-MMC的引物：上游，TTCCGTTTCAGGAGCAGGAC(SEQ ID NO.6)；下游，TCGGCAAGATAGCCCATAATG(SEQ ID NO.7)。
2.细胞生物活性观察
转入α-MMC基因后96h和144h，分别显微镜下观察293T细胞。
3.α-MMC蛋白的检测
转入α-MMC基因后96h和144h，裂解细胞，离心取上清，做免疫印迹检测，以抗α-MMC蛋白质的单克隆抗体为一抗，以酶标兔抗小鼠IgG为二抗。实验设置GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)内参照。
二、结果
1.α-MMC转录活性
如图3和表2所示，对照组没有α-MMC转录(NC组目的基因Ct值为35.00，是因为PCR总循环数是35)，而实验组有明显的α-MMC转录。OE组gene表达丰度(以2-ΔΔCt计)是NC组的714894.800倍(p＜0.05)。
表2 Ct值与2-ΔΔCt计算
Figure BDA0002281445840000042
Figure BDA0002281445840000051
2-ΔΔCt法计算说明：ΔCt＝目的基因Ct值-内参基因Ct值，-ΔΔCt＝NC组ΔCt平均值-各样品ΔCt值。2-ΔΔCt反映各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平
2.细胞生物活性
无论是转入α-MMC基因后96h还是144h，OE组有较多的死亡细胞，而NC组细胞几乎无细胞死亡。
3.α-MMC蛋白检测
结果如图5，1为阴性对照细胞裂解液样品，2为目的基因质粒转染293T后样品。可看出不论96h或144h，细胞裂解液中皆有显著的表达条带，144h后含量更多。
综上，本发明的α-MMC基因序列(SEQ ID N0.2所示的序列)能在动物细胞内大量表达，可以引起哺乳动物细胞死亡，若将其靶向转入肿瘤细胞，将有希望制成抗肿瘤的基因治疗药物，具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都医学院
<120> 一种α-苦瓜素基因及其在哺乳动物细胞内的过表达方法
<130> GY044-2019P018212CC
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 789
<212> DNA
<213> 苦瓜(Momordica charantia)
<400> 1
gatgttagct ttcgtttgtc gggtgctgat cctagatcct atgggatgtt catcaaagat 60
ttgaggaatg ctcttccatt tcgagagaaa gtgtacaata tacctctctt acttccttcc 120
gtttcaggag caggacgata cttactaatg catctcttca attacgacgg aaaaaccatc 180
acagtggccg tagatgtaac aaacgtttac attatgggct atcttgccga tacaacatcc 240
tactttttta acgagcctgc tgctgaatta gcttctcaat atgtattccg agacgctagg 300
aggaagatta cacttccata ttctggcaat tacgaaaggc ttcaaattgc tgcaggcaag 360
ccaagagaaa aaatccccat tggactccca gcgttggata gtgcaataag caccttgctg 420
cattatgact ccacagctgc cgctggggca ctgcttgtac tcattcagac cactgcggag 480
gctgcgagat ttaagtatat tgagcaacaa attcaagaaa gagcttacag agacgaggtc 540
ccgagtctag caactataag tttagaaaac agttggtctg gtctctccaa acaaatccag 600
ttagcgcagg gcaataatgg aatatttaga actcctattg tgcttgtgga taacaaagga 660
aatcgagtcc agataaccaa cgttacttca aaagttgtaa cctccaacat acagttattg 720
ttaaacacac gaaatattgc agagggtgac aacggcgatg tttctacaac acatggcttt 780
tcgagctac 789
<210> 2
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gacgtgagct tccgcctgag cggcgccgac ccccgcagct acggcatgtt catcaaggac 60
ctgcgcaacg ccctgccctt ccgcgagaag gtgtacaaca tccccctgct gctgcccagc 120
gtgagcggcg ccggccgcta cctgctgatg cacctgttca actacgacgg caagaccatc 180
accgtggccg tggacgtgac caacgtgtac atcatgggct acctggccga caccaccagc 240
tacttcttca acgagcccgc cgccgagctg gccagccagt acgtgttccg cgacgcccgc 300
cgcaagatca ccctgcccta cagcggcaac tacgagcgcc tgcagatcgc cgccggcaag 360
ccccgcgaga agatccccat cggcctgccc gccctggaca gcgccatcag caccctgctg 420
cactacgaca gcaccgccgc cgccggcgcc ctgctggtgc tgatccagac caccgccgag 480
gccgcccgct tcaagtacat cgagcagcag atccaggagc gcgcctaccg cgacgaggtg 540
cccagcctgg ccaccatcag cctggagaac agctggagcg gcctgagcaa gcagatccag 600
ctggcccagg gcaacaacgg catcttccgc acccccatcg tgctggtgga caacaagggc 660
aaccgcgtgc agatcaccaa cgtgaccagc aaggtggtga ccagcaacat ccagctgctg 720
ctgaacaccc gcaacatcgc cgagggcgac aacggcgacg tgagcaccac ccacggcttc 780
agcagctac 789
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
cgcaaatggg cggtaggcgt g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
ggcggcacca ccatgtaccc t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
aggggccgga ctcgtcatac t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
ttccgtttca ggagcaggac 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
tcggcaagat agcccataat g 21

Claims (7)

1.一种基因片段，其特征在于：序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于：它的序列包括SEQ ID NO.2。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：其载体骨架为GV141载体。
4.一种在哺乳动物细胞中过表达α-苦瓜素的方法，其特征在于：它是将序列如SEQ IDNO.2所示基因片段表达于哺乳动物细胞中。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：它是将权利要求3所述的重组表达载体转入哺乳动物细胞中，使序列如SEQ ID NO.2所示基因表达。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述哺乳动物细胞是293T细胞。
7.权利要求1～3所述基因片段或重组表达载体在制备抗癌药物中的用途。
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