TWI720268B - 製備電轉感受態酵母細胞的方法以及使用所述細胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及酵母細胞的改進酵母轉化和由其轉化的酵母細胞庫。更具體地，本發明涉及透過電穿孔轉化酵母。

Description

製備電轉感受態酵母細胞的方法以及使用所述細胞的方法
本發明涉及酵母細胞的改進酵母轉化和由其轉化的酵母細胞庫。更具體地，本發明涉及透過電穿孔轉化酵母。
多年來，癌症治療的基石為手術、化療和放射治療。在過去十年中，靶向治療藥物，如伊馬替尼（Gleevec®，格列衛®）和曲妥珠單抗（Herceptin®，赫賽汀®）等藥物透過對準主要在這些細胞中所見的特定分子變化而靶向於癌細胞 – 這也已成為許多癌症的標準治療方法。
如今，令人興奮的是越來越多使用免疫療法治療，即利用患者免疫系統的力量來對抗疾病。免疫療法的一種方法涉及改造患者自身的免疫細胞，以識別和攻擊其腫瘤。這種稱為過繼細胞轉移(ACT)的方法已在晚期癌症患者中產生了一些顯著的療效。
雖然天然T細胞受體(TCR)通常預期具有足夠高的親和力以達到治療療效，但是，在開發治療性TCR或其衍生物，例如可溶性TCR (sTCR)時，通常期望/需要所謂的親和力成熟以在體內引發有效的免疫應答。
為了達到成熟狀態，通常應用一種酵母表面展示技術的方法。但是，為了產生具有足夠多樣性的文庫，需要一種酵母轉化的高效方法。
長期以來希望識別基本上由特異性結合特定抗原的天然α和β鏈序列組成的TCR，以便可以開發例如TCR或其可溶性類似物以為潛在治療劑提供基礎。被確定TCR所識別的抗原可能與疾病（如：癌症、病毒感染、自身免疫疾病、寄生蟲感染和細菌感染）有關。因此，這些療法可用於治療所述疾病。
此外，一旦發現天然或自然TCR，並確定了它們的序列，就可根據需要引入導致親和力或半衰期增加的突變，如WO2012/013913所述。過去對特異性結合疾病相關抗原（例如，癌症病毒、自身免疫或細菌抗原）TCR的發現嘗試局限於使用從志願者供體抽取的血液樣本。這些樣本用於分離T細胞及其相應的TCR，其與疾病相關抗原結合。這種方法通常需要至少20個供體。該過程漫長並且耗費勞力，且不能保證發現與抗原結合的T細胞受體。當識別功能性T細胞受體時，它們通常對抗原具有弱親和力、低特異性和/或在體外不當折疊。能夠被篩選的T細胞的多樣性限於供體內的T細胞多樣性。一些疾病相關抗原，包括大部分癌抗原，為自身抗原；由於胸腺選擇用於去除識別自身抗原的TCR，所以特異於疾病相關抗原的TCR可能不存在於供體的天然組成中，否則可能對抗原具有弱親和力。
對於分離具有抗原結合特異性的新TCR文庫，設計的嘗試已經持續了數年。由於TCR鏈不太穩定並且通常不能正確展示，因此TCR文庫遠比同類抗體文庫更難創建。構建TCR文庫非常複雜。優選保留CDR3長度變化（在自然譜系中發現）。大部分任何文庫通常不會終止密碼子、框架移位元、折疊問題、以及可能根本不會與HLA複合體結合的TCR鏈組合。考慮到大量的可變α和可變β基因以及J和D基因，產生和識別功能性折疊α鏈和功能性折疊β鏈（一起形成與具有所需特異性的抗原肽結合的TCR）的幾率極低。
在真核系統（如酵母）中產生核酸文庫及由此產生的重組產物（如藥物蛋白質）的方法的可用性相對於使用原核系統如（大腸桿菌）提供了顯著的優點。酵母通常可以生長為比細菌更高的細胞密度，並且容易適應於連續發酵加工。但是，由於缺乏關於轉化條件和外來核酸穩定引入酵母宿主細胞合適方法的相關知識，開發酵母物種作為產生重組產物和文庫的宿主/載體系統受到嚴重的阻礙。
DNA吸附到細胞表面是促進細胞電轉化的各種電和生物學參數之一。低強度的交替電場也可透過DNA滲透酶的電刺激促進DNA轉移到大腸桿菌中。關於聚電解質DNA電穿孔基因轉移的主要電擴散或電泳效應，已經積累了證據。透過電穿孔促進的電滲作用和膜內陷也有報告。
跨酵母細胞膜的電場應用可產生對電穿孔過程至關重要的暫態孔。電穿孔信號發生器提供跨過電極之間間隙(cm)的電壓（單位kV）。該電位差定義了所謂的電場強度，其中E等於kV/cm。每個細胞都有自己的臨界場強用於最佳電穿孔。這由細胞大小、膜組成和細胞壁本身個體特徵決定。例如，哺乳動物細胞通常需要0.5-5.0 kV/cm電場強度才能發生細胞死亡和/或電穿孔。通常，所需的場強與細胞大小成反比。
EP2257638A1涉及透過電穿孔轉化酵母的方法。這些包括作為細胞調節劑的乙酸鋰(LiAc)和二硫蘇糖醇(DTT)的組合，它們都被用於提高酵母轉化的頻率。如表2所示，DTT或LiAc預處理的消除導致效率分別降低93.3%和85.7%。
同樣，Smith等人（在：T Cell Receptor Engineering and Analysis Using the Yeast Display Platform. Methods Mol Biol. 2015; 1319:95-141一文中）公開了關於抗原作為肽-MHC (pepMHC)配體結合過程中TCR的一項研究。改造TCR親和力以便以現在與抗體相似的方式使用這類分子，對此已經引起了關注。為了改造TCR以及更快速地分析它們的結合特徵，他們使用酵母展示系統作為平臺。表現和設計類似於來自抗體的scFv片段的單鏈形式TCR可使TCR與多種可能的pepMHC配體親和力成熟。此外，酵母展示平臺允許人們快速產生具有多種結合親和力的TCR變體，並分析特異性和親和力，而不需要純化可溶形式的TCR。本文介紹了使用酵母展示技術進行單鏈TCR設計和分析的方法。
酵母文庫沒有達到噬菌體文庫已經實現的大小或效率，典型的最大噬菌體文庫大小為1010 至1011 ，而典型的酵母文庫大小為107 。雖然電穿孔方案的最新進展（參見Chao, Nature Protocols 1(2):755-768 (2006)）在單次轉化中可實現最大5 x 107 大小酵母文庫。迄今為止實現的酵母菌文庫大小仍然顯著低於噬菌體展示文庫常規可實現的1010 至1011 大小，這一表述仍然正確。
在實現越來越高的轉換效率的同時，上述方法和披露內容仍然很費力，花費了大量時間和重複努力，將106 至107 大小範圍的多個小型文庫積累形成108 至109 大小範圍的較大組合文庫。
使用磁珠和螢光啟動細胞分選方法的酵母展示文庫的選擇提供了一種有效和靈敏的方法，以富集靶向抗原的特異性結合物，特別是其與螢光啟動細胞分選(FACS)的相容性。但是，由於酵母細胞轉化效率低，典型酵母展示文庫大小有限阻礙了這種選擇的優勢。
因此，需要使用酵母產生蛋白質文庫（例如TCR文庫）的有效方法。
本發明的一個方面提供了一種製備電轉感受態酵母細胞的方法，其包括以下步驟：a)將酵母細胞生長至OD600值約1.0-2；b)用冷水洗滌細胞；c)用包含山梨糖醇和CaCl2的冷溶液洗滌細胞；d)將細胞孵育成於含乙酸鋰和三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)的溶液；e)用包含山梨糖醇和CaCl2的冷溶液洗滌細胞；f)將細胞重懸於包含山梨糖醇的溶液中；和g)任選地，適當地儲存所述細胞。
因此，本發明提供了一種轉化酵母細胞的高效方法，例如，用於產生改進的酵母細胞文庫。本發明的方法消除了將酵母展示技術作為一種實際工具應用的重大瓶頸，可進入以前未被探索的更大的TCR多樣性空間。
本發明的另一方面涉及一種轉染電轉感受態酵母細胞的方法，其包括以下步驟：a)提供根據本發明方法的電轉感受態酵母細胞；b)用包含山梨醇的冷溶液洗滌細胞；c)將細胞與待轉染的DNA混合以形成預電穿孔混合物；d)將所述預電穿孔混合物轉移到合適的電穿孔比色皿中，e)在約2.5kV/cm至約12.5kV/cm之間對所述細胞進行電穿孔約2至約5ms。
優選根據本發明的方法，其中所述DNA為線性的或環狀的。更優選的是根據本發明的方法，其中所述DNA包含編碼相關蛋白質文庫的DNA片段文庫，例如以酵母表面展示文庫的形式。最優選的是根據本發明的方法，其中所述展示文庫為T細胞受體(TCR)文庫。
令人驚奇地是，發現透過使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)作為還原劑，本發明方法的轉化效率高於DTT，例如高於1 x 108 個酵母轉化體/μg載體DNA，優選高於2 x 108 個酵母轉化體/μg載體DNA。
本發明的另一方面涉及用於產生相關蛋白質的改進酵母文庫的方法，例如以酵母表面展示文庫的形式，其包括以下步驟：a)提供根據本發明方法的轉染酵母細胞；b)將轉染細胞在生長培養基中稀釋為山梨糖醇溶液的1:1混合物；c)將細胞重懸於合適的生長培養基中；d)任選地，進行稀釋以計算多樣性，並將所述稀釋液鋪在含有卡那黴素的SD-CAA平板上；e)將所述文庫轉移到合適的生長培養基中並且由電穿孔擴展所述文庫；f)任選地，適當地存儲所述擴展文庫。
優選的是根據本發明的方法，其中所述展示文庫為T細胞受體文庫。優選的是根據本發明的方法，其中所述文庫的多樣性高於約1012 。
在本發明的背景中，術語「表現載體(expression vector)」是指包括一個自主複製位點(ARS)——轉錄起始位元點和至少一個編碼將在宿主生物體中表現的蛋白質的結構基因的DNA構建體。複製位點或複製起點是控制克隆和表現載體複製的任何DNA序列。表現載體通常還含有適當的控制區域，例如一個或多個增強子和/或啟動子，抑制子和/或沉默子，以及控制宿主酵母中蛋白質表現的終止子。根據本發明的表現載體還可能含有包含本文所述必需基因的選擇標誌物。表現載體還任選地含有可廣泛獲得和本領域技術人員熟知的其他可選擇標誌物。表現載體是載體的一種類型。載體可任選地包括來自一種或多種酵母菌株的一種或多種ARS序列（元素）。
術語「可操作地連接」是指DNA區段被排列成使得它們一致地作用於其預期目的，例如，轉錄在啟動子中開始，並透過編碼區段進行至終止子。
術語「轉化」或「轉染」是指將DNA或其他核酸引入改變基因型的受體酵母宿主細胞中。
術語「轉化體」或「轉化細胞」是指經歷轉化的受體酵母宿主細胞及其後代。
除非另有說明，否則「大約」應為給定值的 +/- 10%。
可用於本發明的電穿孔方法的載體包括pYD載體、一般可以透過酵母細胞或核酸繁殖的任何其他載體及其衍生構建體。本發明的表現載體可以基於任何類型的載體，只要載體可以轉化、轉染或轉導宿主酵母細胞即可。在一項優選的實施方案中，表現載體基於酵母質粒，特別是來自釀酒酵母的質粒。在酵母細胞轉化後，編碼文庫序列的外源DNA被細胞吸收，隨後由轉化細胞表現。
更優選的情況是，表現載體可以是可在大腸桿菌或酵母中繁殖的酵母細菌穿梭載體(Struhl, et al.(1979) Proc. Natl. Acad. Sci.)。納入大腸桿菌質粒DNA序列（如pBR322）有助於在大腸桿菌中定量製備載體DNA，從而有效轉化酵母。
可用作穿梭的酵母質粒載體的類型可以是複製載體或整合載體。複製載體是一種酵母載體，由於存在DNA複製的功能來源，其能夠介導其獨立於酵母染色體DNA的自身維持。整合載體依賴於與染色體DNA的重組以促進複製，並因此繼續維持宿主細胞中的重組DNA。複製載體可以是基於2微米的質粒載體，其中DNA複製起點源自內源性2微米質粒酵母。或者，複製載體可以是自主複製(ARS)載體，其中「明顯的」複製起點源自酵母的染色體DNA。任選地，複製載體可以是著絲粒(CEN)質粒，除了上述一種DNA複製起點之外，還攜帶已知含有著絲粒的酵母染色體DNA序列。
載體可以以閉環形式或線性形式轉化成酵母細胞。透過整合載體轉化酵母，雖然具有可遺傳的穩定性，但是當載體呈緊密環形可能效率很差（例如，每μg DNA僅產生約1-10個轉化體）。具有與酵母染色體DNA同源的DNA序列中的游離末端的線性化載體以更高的效率（100-1000倍）轉化酵母，並且轉化DNA通常被發現整合到與切割位點同源的序列中。因此，透過用適當的限制性內切核酸酶切割載體DNA可以提高轉化效率並靶向作用於染色體整合位點。整合轉化可適用於釀造酵母的基因修飾，條件是轉化效率足夠高，並且用於整合的靶DNA序列在不破壞宿主細胞代謝所必需基因的區域內。
可以透過本發明的電穿孔方法轉化的酵母菌株包括釀酒酵母屬中的酵母菌種（如：釀酒酵母）和粟酒裂殖酵母屬（如粟酒裂殖酵母）。在一項實施方案中，酵母細胞為二倍體酵母細胞。或者，酵母細胞為單倍體細胞，例如，酵母單倍體細胞的「a」和「α」菌株。
本發明背景中的「T細胞受體文庫」可以包括待篩選的人和/或突變人TCR的合適部分，優選為單鏈形式的TCR，例如：Vβ-接頭-Vα單鏈(scTCR)；或Vα-接頭-Vβ單鏈，任選地與自切割肽融合，例如，2A-肽。還可以使用公開的方法優化對野生型氨基酸序列進行最小修飾的TCR表現（例如：Szymczak, A. L. et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide–based retroviral vector.Nat Biotechnol 22, 589–594 (2004); Yang, S. et al.Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther 15, 1411–1423 (2008); Kuball, J. et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood 109, 2331–2338 (2007); Cohen, C. J. et al. Enhanced Antitumor Activity of T Cells Engineered to Express T-Cell Receptors with a Second Disulfide Bond. Cancer Res 67, 3898–3903 (2007); Scholten, K. B. J. et al. Codon modification of T cell receptors allows enhanced functional expression in transgenic human T cells. Clin. Immunol. 119, 135–145 (2006))。
載體DNA與插入DNA的比例在約1:0.5至約1:10的範圍內，例如1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在一項實施方案中，在反應中使用約1μg載體DNA和約1μg插入DNA。在另一項實施方案中，沉澱約1μg載體DNA和約2μg插入DNA。在另一項實施方案中，沉澱約1μg載體DNA和約3μg插入DNA。在另一項實施方案中，沉澱約1μg載體DNA和約4μg插入DNA。在另一項實施方案中，沉澱約1μg載體DNA和約5μg插入DNA。
在一項實施方案中，細胞懸液包含約50至約400μl的酵母細胞，例如50、100、150、200、250、300、350、400μl酵母細胞。
在一項實施方案中，酵母細胞懸浮液為約1至約10 x 109 個酵母細胞/mL，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 x 109 個酵母細胞/mL。
在一項實施方案中，用於電穿孔酵母細胞的場強為約0.5 kV/cm至約12.5 kV/cm，例如，0.5、1.0、約 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5 kV/cm。
在一項實施方案中，酵母細胞以約10至約50μF的電容電穿孔，例如，10、15、20、25、30、35、40、45或50。
在一項實施方案中，將酵母細胞懸浮在約0.1 至約10M山梨醇和0.1至10mM CaCl2 或MgCl2 中，例如，0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0M山梨醇或例如，0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 或 10.0mM CaCl2 或MgCl2 。
在一項實施方案中，將酵母細胞溫育在約0.01至約1.0M LiAc中，例如，0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、約0.7、0.8、0.9或1.0M LiAc，以及1至100mM TCEP中，例如，1、10、20、30、40、50、60、約70、80、90或100mM TCEP。
本發明提供了轉化酵母細胞的方法，包括對含有酵母與一種或多種核酸構建體的細胞懸液進行電穿孔。酵母細胞的轉化可以發生於從單個克隆到酵母細胞群體（即，酵母文庫）的任何地方，其可用於篩選(a)透過與酵母細胞表面蛋白質或其他組分的特異性共價鍵或非共價相互作用結合到酵母表面蛋白或締合的方式展示在酵母細胞表面上的肽或蛋白；(b)細胞內表現的肽或蛋白質；或(c)分泌到細胞外空間（如培養基）中或沉積在固體表面上的肽或蛋白質。此類酵母文庫可以方便地適用於多種應用，以篩選或表徵肽或蛋白質與可以引入酵母細胞或外源添加的另一種蛋白質、肽、DNA、RNA或其他化學物質之間的相互作用。具體實例是在酵母展示、酵母雙雜交、酵母三雜交等中發現的實例。
本發明提供了一種用於轉化酵母細胞的方法，包括使用一種或多種電阻、場強和足以轉化酵母細胞的脈衝持續時間電穿孔含有酵母以及一種或多種核酸構建體的細胞懸浮液，所述核酸構建體包含一種或多種調節序列和一種或多種基因或基因片段。
在一項實施方案中，場強為約2.5 kV/cm至約12.5 kV/cm。在某些實施方案中，場強為0.5 kV/cm、1.0 kV/cm、1.5 kV/cm、2.0 kV/cm或2.5 kV/cm。這些值考慮到電穿孔比色皿有0.2cm的間隙。較高場強是可能的，但其實用性在很大程度上取決於能夠提供更強脈衝裝置的開發。
在一項實施方案中，脈衝持續時間為約3毫秒至約10毫秒。在一項特定實施方案中，脈衝持續時間約為4毫秒。
透過本發明的電穿孔方法對細胞的處理是透過對一對電極之間的酵母細胞懸浮液施加電場來進行的。場強必須進行相當準確的調整，以使細胞電穿孔對細胞不會發生損傷或損傷最小。之後可以測量電極之間的距離，可對電極施加根據公式E = V/d得出的適當電壓（E=電場強度，單位V/cm；V=電壓，單位伏特；d=距離，單位cm）。
用於執行本文所述程式的脈衝發生器已經上市多年。一種合適的信號發生器為Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)。典型的設置包括連接到電容延長器+的Gene Pulser II和脈衝控制器+模組。
本發明中使用電穿孔以便於將DNA引入酵母細胞。電穿孔是使用脈衝電場來暫態透化細胞膜的過程，以讓大分子（如DNA分子）進入細胞。但是，DNA轉移到細胞中的實際機制尚不清楚。例如，對於轉化假絲酵母，當細胞暴露於具有約10至約13 kV/cm的場強、大約R5電阻值（129歐姆）的實驗衰減脈衝電場、時間常數約4.5ms時，電穿孔的效率令人驚訝。通常，根據所選擇的電穿孔設備，存在電阻和電容或可由用戶選擇。無論如何，設備按照製造商的說明進行配置，以提供適當的場強和衰減參數。
本發明還涉及允許高水準表現任何一種或多種所需內源（即天然存在於該酵母細胞內）或異源基因的酵母轉化的高效方法。本發明的方法還涉及製備文庫的方法，例如表現TCR、scTCR、嵌合體或其片段的文庫。
在一種情況下，攜帶感相關基因的表現載體可以透過電穿孔轉化到酵母宿主細胞中以產生單個克隆或由許多表現細胞內蛋白質（例如，核或細胞質蛋白）、膜蛋白（例如，跨膜蛋白或膜附著蛋白）或分泌蛋白的轉化細胞組成文庫。人們將能夠使用轉化細胞或文庫來純化蛋白質、研究蛋白質功能、識別蛋白質 - 蛋白質相互作用或識別新的蛋白質結合物或相互作用的配偶體。重要的是，產生展示或表現TCR和TCR片段的非常大的酵母文庫的能力。文庫可以透過靶抗原進行選擇，以發現與選擇抗原結合的TCR。
由於轉化酵母具有失去人造構建質粒的傾向，因此使用培養基以對其施加正向選擇壓力是有利的。當菌株為必需代謝物的營養缺陷突變體時以及當使用的載體質粒包含能夠恢復菌株原生質體的標誌物基因（例如LEU2基因）時，可以透過忽略培養基中的代謝物來施加該選擇壓力。存在其他方法來獲得相同的結果，這些方法也可用於實踐本發明。
根據相關結構基因的性質，產物或表現產物可以保留在酵母宿主細胞的細胞質中或分泌產物或表現產物。已經發現，不僅保留在細胞中的蛋白質而且所分泌的蛋白質都是可溶的。當產物或表現產物保留在酵母宿主細胞中時，通常可能需要具有誘導型轉錄起始區，使得在轉化體達到高密度之前，所需產物表現很少或沒有表現或產生。在產物或表現產物表現足夠的時間之後，可以透過常規方法（例如，離心、裂解）分離細胞，分離出相關產物。根據產物的性質和用途，裂解物可接受各種純化方法，如色譜法、電泳、溶劑萃取、結晶、透析、超濾等。層析方法，包括但不限於氣相色譜法、HPLC、柱層析法、離子交換層析法和本領域技術人員已知的其他層析方法。純度可以在約50%至90%或更高，優選為至多約100%之間變化。
或者，表現產物或相關產物可以分泌到培養基中，並連續產生，其中培養基被部分抽出，提取所需的產物，例如透過柱或親和層析法、超濾法、沉澱法等提取，並透過還原基本組分廢棄或再迴圈廢棄的用過的培養基。含有來自超濾產物的滲透物可進一步濃縮，進一步透過蒸發、隨後使用醇和/或pH調節進行結晶或沉澱。本領域技術人員知道許多過程選項。當分泌產物時，通常使用組成型轉錄起始區，儘管也可使用非組成型區域。
可以參考如本文所述的附圖，從實施例導出其他優選實施方案，但不限於此。為了本發明的目的，本文中引用的所有參考文獻透過引用的方式併入。
除非另有說明，本發明的實踐採用了本領域熟知的細胞電穿孔和酵母細胞生物學的常規技術。I. 培養基 1. YPD 培養基 酵母提取物 10 g 細菌蛋白腖 20 g 葡萄糖 20 g
用H2 O將體積調至1L（添加無菌葡萄糖至高壓滅菌溶液） 2. SD-CAA (pH 4.5)： 檸檬酸鈉二水合物 14.8 g（50 mM 最終） 檸檬酸一水合物 4.2 g（20 mM 最終）
在800mL H2 O中，高壓滅菌。 糖胺酸 5.0 g 酵母氮堿（不含氨基酸） 6.7 g 葡萄糖 20 g
用H2 O和無菌過濾器將體積調至1L 3. SD-CAA 板： 山梨醇 182.2 g 瓊脂 15 g 檸檬酸鈉 14.8 g 檸檬酸一水合物 4.2 g在800mL H2O中，高壓滅菌，冷卻至~55℃。
Figure 106139472-A0305-02-0019-1
在200ml H2O和用無菌過濾器，加入冷卻的高壓滅菌溶液
II.電轉感受態酵母細胞的製備
將20μl來自-80℃的新鮮解凍酵母儲備液在YPD瓊脂平板上劃線，並在30℃下孵育2天。將單個菌落(取整個菌落)從YPD瓊脂平板上取出放入15ml YPD培養基，在30℃下進行過夜振盪。次日早晨，將10ml培養物轉移到100ml新鮮YPD培養基中，並在30℃下繼續振盪7小時。測定OD600，1μl冷YPD培養基接種至OD600為0.2。將振盪燒瓶置於預冷(4℃)的振盪器中。將振盪器編程為在工作日開始前5小時開始加熱(30℃)和振盪(250rpm)。進行孵育直到OD600達到1.5，通常為振盪開始後6小時。
如果未另外說明，後續步驟必須在冰上和冷卻溶液、管、比色皿和離心機上進行。
將細胞在2000g和4℃下沉澱3分鐘(在10個50ml Falcon管中的2個步驟過程)，用25ml冷H2O洗滌兩次，並以2000g沉澱3分鐘。細胞用25ml冷山梨糖醇、1M/CaCl2、1mM2洗滌；並以2000g沉澱3分鐘。將細胞重懸於25ml乙酸鋰、10mM的100mM/TCEP。使用帶有過濾器蓋的50ml Falcon 管進行曝氣；將細胞在30℃下以160 rpm振盪孵育30分鐘，置於冰上，細胞以2000g和4℃沉澱3分鐘。細胞用25ml冷1M山梨醇/1mM CaCl2 洗滌；在2000g和4℃下沉澱3分鐘，用25ml冷的1M山梨糖醇洗滌；在2000g和4℃下沉澱3分鐘。將細胞懸浮在冷1M山梨糖醇錐形管中，直至每次電穿孔反應的終體積為400μl。電轉感受態細胞可以直接儲存在-80°C 下。在使用樣本進行電穿孔之前，已經透過離心（2000g，4℃，5分鐘）除去洩漏的鹽，並用1M冷山梨糖醇洗滌兩次。III. 電穿孔
將400μl細胞與5-10μl DNA（載體）在H2 O中混合，保持在冰上3分鐘並轉移到預冷的0.2cm電穿孔比色皿中。使用BioRad MicroPulser 電穿孔系統，細胞以2.5 kV進行電穿孔。典型的時間常數為約4ms，優選為4ms。將電穿孔的細胞在30℃下轉移到10ml 1:1的山梨醇:YPD培養基混合物中1小時，不振盪。在室溫下以2000g收集細胞3分鐘，並在室溫下再懸浮於10ml SD-CAA中。進行稀釋，以計算多樣性（1:105 至1:107 ）。將含有卡那黴素的SD-CAA平板上的稀釋液在30℃下孵育1天，在室溫下孵育3天。將文庫轉移到100ml SD-CAA（優選為由電穿孔），並在30℃、160 rpm下繼續振盪24小時。擴展的文庫可直接用於誘導或在4°C 下儲存兩週。在-80℃下可在30 %甘油中長期冷凍儲存。
透過使用最佳的電穿孔條件，人們可以常規地實現約2 x 108 個酵母轉化體/μg載體DNA的酵母轉化效率（參見圖1）。由於這種轉化效率在最小的細胞體積(100μl)中實現，因此它非常適用於自動化和多孔電穿孔裝置。
無
圖1顯示了與相同條件下的DTT相比TCEP改進轉染效率的比較。
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國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (15)

  1. 一種製備電轉感受態酵母細胞的方法，該方法包括以下步驟：a)將酵母細胞生長至OD600值1.0至2；b)用冷水洗滌細胞；c)用包含山梨糖醇和CaCl2的冷溶液洗滌細胞；d)將細胞孵育於包含乙酸鋰和三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)的溶液；e)用包含山梨糖醇和CaCl2的冷溶液洗滌細胞；以及f)將細胞重懸於包含山梨糖醇的溶液中。
  2. 如請求項1所述的方法，進一步包括以下步驟：儲存所述細胞。
  3. 一種電轉感受態酵母細胞，可藉由如請求項1所述的方法獲得。
  4. 一種轉染電轉感受態酵母細胞的方法，該方法包括以下步驟：a)提供以如請求項1所述的方法所製備的電轉感受態酵母細胞或如請求項3所述之電轉感受態酵母細胞；b)用包含山梨醇的冷溶液洗滌細胞；c)將細胞與待轉染的DNA混合以形成預電穿孔混 合物；d)將所述預電穿孔混合物轉移到合適的電穿孔比色皿中；以及e)在2.5kV/cm至12.5kV/cm之間對所述細胞進行電穿孔2至5ms。
  5. 如請求項4所述的方法，其中所述DNA為線性的或環狀的。
  6. 如請求項4所述的方法，其中所述DNA包含編碼相關蛋白質文庫的DNA片段文庫。
  7. 如請求項6所述的方法，其中所述DNA片段文庫為酵母表面展示文庫。
  8. 如請求項6所述的方法，其中所述展示文庫為T細胞受體(TCR)文庫。
  9. 如請求項4所述的方法，其中轉化效率高於1 x 108個酵母轉化體/μg載體DNA。
  10. 如請求項4所述的方法，其中轉化效率高於2 x 108個酵母轉化體/μg載體DNA。
  11. 一種用於產生相關蛋白質的改進酵母文庫的方法，該方法包括以下步驟：a)提供藉由如請求項4至10中任一項所述方法所獲得的轉染酵母細胞；b)將轉染細胞在生長培養基中稀釋為山梨糖醇溶液 的1：1混合物；c)將細胞重懸於合適的生長培養基中；d)進行稀釋以計算多樣性，並將所述稀釋液鋪在含有卡那黴素(kanamicin)的SD-CAA板上；和e)將所述文庫轉移到合適的生長培養基中並且由電穿孔擴展所述文庫。
  12. 如請求項11所述之方法，其中所述酵母文庫為酵母表面展示文庫。
  13. 如請求項11所述之方法，進一步包括以下步驟：存儲所述擴展文庫。
  14. 根據請求項11所述的方法，其中所述展示文庫為T細胞受體文庫。
  15. 根據請求項11所述的方法，其中所述文庫的多樣性高於1012。
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