EA043912B1 - Способ получения электрокомпетентных дрожжевых клеток и способ применения указанных клеток - Google Patents
Способ получения электрокомпетентных дрожжевых клеток и способ применения указанных клеток Download PDFInfo
- Publication number
- EA043912B1 EA043912B1 EA201990758 EA043912B1 EA 043912 B1 EA043912 B1 EA 043912B1 EA 201990758 EA201990758 EA 201990758 EA 043912 B1 EA043912 B1 EA 043912B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- yeast
- library
- electroporation
- dna
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 65
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 49
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 55
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 21
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 19
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 19
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 11
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 11
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 49
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 36
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.O=C([C@@H]1O2)CC[C@H]3[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000235036 Debaryomyces hansenii Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000010366 cell biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000001819 effect on gene Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229940080856 gleevec Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 229960000999 sodium citrate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011301 standard therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Description
Изобретение относится к улучшенной дрожжевой трансформации дрожжевых клеток и библиотекам дрожжевых клеток, трансформированных таким способом. Более конкретно, настоящее изобретение относится к трансформации дрожжей с помощью электропорации.
Уровень техники
На протяжении многих лет краеугольными камнями в лечении рака были хирургия, химиотерапия и радиотерапия. В течение последнего десятилетия для ряда раковых заболеваний в качестве стандартной терапии появились средства таргетной терапии, такие как иматиниб (Gleevec®) и трастузумаб (Herceptin®) - лекарственные препараты, направленные на раковые клетки за счет нацеливания на специфические молекулярные изменения, наблюдавшиеся главным образом в этих клетках.
Сейчас много ожиданий возлагается на иммунотерапию - вид терапии, использующий потенциал иммунной системы пациентов для борьбы с их заболеванием. Один из подходов к иммунотерапии включает конструирование клеток собственной иммунной системы пациентов, чтобы они распознавали и атаковали их опухоли. Этот подход, называемый адоптивным переносом клеток (АПК), привел к ряду заметных клинических ответов у пациентов с раком на поздних стадиях.
Тогда как обычно ожидается, что естественные T-клеточные рецепторы (TKP) обладают достаточной аффинностью для достижения эффективности лечения, во время разработки терапевтических TKP или их производных, таких как, например, растворимые TKP (pTKP), обычно желательно/необходимо так называемое созревание аффинности, чтобы вызывать эффективный иммунный ответ in vivo.
Для созревания обычно используется способ с применением поверхностного дисплея на основе дрожжей. Тем не менее, для создания библиотек, которые обладают достаточным разнообразием необходим высокоэффективный способ трансформации дрожжей.
На протяжении долгого времени существовало желание идентифицировать TKP, состоящих по существу из природных последовательностей альфа- и бета-цепи, которые специфически связываются с конкретными антигенами, такие как, например, TKP или их растворимые аналоги, могут быть разработаны для создания основы для потенциальных терапевтических подходов. Антигены, распознаваемые идентифицированными TKP могут ассоциироваться с заболеванием, таким как рак, вирусные инфекции, аутоиммунные заболевания, паразитарные инфекции и бактериальные инфекции. Следовательно, такие средства терапии могут использоваться для лечения указанных заболеваний.
Более того, после идентификации естественных или нативных TKP и определения их последовательностей можно ввести мутации, которые приведут к увеличению аффинности или времени полужизни, при необходимости, как это описано в заявке WO 2012/013913. Традиционно попытки идентификации TKP, которые специфически связываются с ассоциированным с заболеванием антигеном, таким как раковые вирусные, аутоиммунные или бактериальные антигены, ограничивались использованием образцов крови, взятых у доноров-добровольцев. Такие образцы используются для выделения T-клеток и их соответствующих TKP, которые связываются с ассоциированными с заболеваниями антигенами. Для этого подхода, как правило, требуется не менее 20 доноров. Процесс длительный и трудоемкий, и не существует гарантии, что будут идентифицированы T-клеточные рецепторы, связывающиеся с антигеном. В случае идентификации функциональных T-клеточных рецепторов они зачастую имеют слабую аффинность к антигену, низкую специфичность и/или не сворачиваются надлежащим образом in vitro. Разнообразие T-клеток, которые поддаются скринингу, ограничено разнообразием T-клеток среди доноров. Некоторые ассоциированные с заболеванием антигены, включая большинство раковых антигенов, являются аутоантигенами; поскольку отбор в вилочковой железе служит для устранения TKP, распознающих аутоантигены, то TKP, специфичные к ассоциированным с заболеванием антигенам, могут не присутствовать в естественном репертуаре доноров, или же могут иметь слабую аффинность к антигену.
Попытки создания библиотеки для выделения новых TKP со специфичностью связывания с антигенами продолжаются в течение нескольких лет. Создать TKP-библиотеки намного сложнее, чем сравнимые библиотеки антител, поскольку цепи TKP менее стабильны и часто не презентируются корректно. Трудности, связанные с созданием библиотеки TKP, чрезвычайно велики. Предпочтительно обеспечить сохранение вариаций в длине CDR3, (как было обнаружено в природном репертуаре). Существенная часть любой библиотеки обычно оказывается непригодной для использования вследствие стоп-кодонов, сдвига рамок считывания, проблем с фолдингом и комбинаций TKP-цепей, которые, возможно, просто не будут связываться с комплексом HLA. Принимая во внимание большое количество генов вариабельных участков альфа- и бета-цепей, а также генов J- и D-сегментов, шансов для получения и идентификации функционально активной свертывающейся альфа-цепи и функционально активной свертывающейся бета-цепи, которые совместно образуют TKP, связывающийся с антигенным пептидом с требуемой специфичностью, крайне мало.
Доступность средств для создания библиотек нуклеиновых кислот и рекомбинантных продуктов, полученных с их помощью, таких как фармацевтически применимые белки, в эукариотических системах, таких как дрожжи, обеспечивает существенными преимуществами по сравнению с использованием прокариоти-ческих систем, таких как E. coli. Как правило, дрожжи можно выращивать с более высокой плотностью клеток, чем бактерии, и они легко адаптируются к непрерывному процессу ферментации.
- 1 043912
Тем не менее, разработка видов дрожжей в качестве систем хозяев/векторов для получения рекомбинантных продуктов и библиотек связана с серьезными затруднениями вследствие отсутствия знаний об условиях трансформации и подходящих средств для стабильного введения чужеродных нуклеиновых кислот в дрожжевую клетку-хозяина.
Среди различных электрических и биологических параметров, которые способствуют проведению электротрансформации клеток, находится адсорбция ДНК на поверхности клетки. Переменные электрические поля низкой интенсивности также способствуют переносу ДНК в бактерии вида E. coli, предположительно, за счет электрической стимуляции пермеаз ДНК. Получены доказательства доминирующего электродиффузионного или электрофоретического воздействия на генный трансфер посредством электропорации ДНК как полиэлектролита. Также сообщалось о электроосмотическом воздействии и впячивании мембраны, которому способствует электропорация.
Воздействие электрическим полем на мембрану дрожжевой клетки приводит к образованию временных пор, играющих решающую роль в процессе электропорации. Генератор электропорационного сигнала создает напряжение (в кВ), которое распространяется через зазор (в см) между электродами. Данная разность потенциалов определяет то, что называется напряженностью электрического поля, где Е измеряется в кВ/см. Каждая клетка обладает своей собственной критической напряженностью поля для оптимальной электропорации. Это связано с размером клетки, строением мембраны и индивидуальными характеристиками самой клеточной стенки. Например, для клеток млекопитающих обычно требуется между 0,5 и 5,0 кВ/см до наступления клеточной смерти и/или электропорации. В целом, требуемая напряженность поля обратно пропорциональна размеру клетки.
EP 2257638 A1 относится к способам трансформации дрожжей с помощью электропорации. Они включают комбинацию ацетата лития (LiAc) и дитиотреита (ДТТ) в качестве кондиционирующих веществ, оба из которых применяются для повышения частоты трансформации дрожжевых клеток. Как показано в табл. 2, отсутствие предварительной обработки ДТТ или LiAc приводило к соответствующему снижению эффективности на 93,3% и 85,7%.
В равной степени, в работе Smith и соавт. (в статье: T Cell Receptor Engineering and Analysis Using the Yeast Display Platform. Methods Mol Biol. 2015; 1319:95-141) описано исследование в отношении TKP при связывании с антигенами, такими как пептидные лиганды MHC (pepMHC). Существовала заинтересованность в конструировании аффинности TKP, чтобы использовать этот класс молекул аналогичным образом, как это делается сейчас с антителами. Чтобы сконструировать TKP и анализировать их связывающие свойства быстрее, в качестве плат формы использовали систему дрожжевого дисплея. Экспрессия и конструирование одноцепочечной формы TKP, аналогично фрагментам scFv из антител, позволяют TKP набирать аффинную зрелость с рядом возможных лигандов pepMHC. Кроме того, платформа на основе дрожжевого дисплея позволяет быстро получать варианты TKP с различной аффинностью связывания и анализировать специфичность и аффинность без необходимости очистки растворимых форм TKP. В статье описаны способы конструирования и анализа одноцепочечных TKP при использовании дрожжевого дисплея.
Дрожжевые библиотеки не достигли размеров или эффективности, достигнутой библиотеками фагового дисплея, типичный максимальный размер фаговой библиотеки составляет 1010-1011, тогда как типичная дрожжевая библиотека имеет размер 107. Хотя недавний прогресс в разработке протоколов электропорации (см. Chao, Nature Protocols 1(2):755-768 (2006)) позволил достигнуть максимального размера дрожжевой библиотеки в 5х107 за одну трансформацию. До сих пор остается справедливым утверждение, что имеющиеся на данный момент размеры дрожжевых библиотек все еще значительно меньше того, что достижимо в обычных условиях для библиотек фагового дисплея размером 1010-1011.
Способы и информация, изложенные выше, хотя и обеспечивают достижение все более высокой эффективности трансформации, остаются трудоемкими, требуя значительной затраты времени и повторных попыток объединения многочисленных малых библиотек размером 106-107 в более крупные и комбинированные библиотеки в диапазоне 108-109.
Отбор на основе библиотеки дрожжевого дисплея с использованием для сортировки клеток как магнитных частиц, так активированной флуоресценции, предоставляет эффективный и чувствительный способ обогащения специфическими связывающими агентами к антигенам-мишеням, в частности за счет его совместимости с сортировкой клеток с активированной флуоресценцией (FACS). Однако преимущество данной стратегии отбора умаляет ограниченный размер типичных библиотек дрожжевого дисплея вследствие низкой эффективности трансформации клеток дрожжей.
Таким образом, существует необходимость в эффективных способах получения библиотек белков, например библиотек TKP при использовании дрожжей.
В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения электрокомпетентных дрожжевых клеток, включающий этапы: а) выращивания дрожжевых клеток до ОП600 от около 1,0 до 2; б) промывки клеток холодной водой; в) промывки клеток холодным раствором, содержащим сорбит и CaCl2; г) инкубирования клеток в растворе, включающем ацетат лития и трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP); д) промывки клеток холодным раствором, содержащим сорбит и CaCl2; е) ресуспендирования клеток в растворе, содержащем сорбит; и ж) факультативно, подходящего хранения указанных клеток.
- 2 043912
В изобретении предложен, таким образом, высоко эффективный способ трансформации дрожжевых клеток, например для получения усовершенствованных библиотек дрожжевых клеток. Способы по изобретению устраняют существенные затруднения в применении технологии дрожжевого дисплея в качестве практического инструмента для доступа к намного большему разнообразию TKP, которое не было исследовано ранее.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу трансфекции электрокомпетентных дрожжевых клеток, включающему этапы: а) обеспечения электрокомпетентными дрожжевыми клетками в соответствии со способом в соответствии с настоящим изобретением; б) промывки клеток холодным раствором, содержащим сорбит; в) смешивания клеток с ДНК, подвергающейся трансфекции, для получения пред-электропорационной смеси; г) переноса указанной пред-электропорационной смеси в подходящую кювету для проведения электропорации, и д) электропорации указанных клеток при значениях от около 2,5 до около 12,5 кВ/см в течение от около 2 до около 5 мс.
Предпочтительным является способ в соответствии с настоящим изобретением, в котором молекула указанной ДНК является линейной или кольцевой. Более предпочтительным является способ в соответствии с настоящим изобретением, в котором указанная ДНК включает библиотеку фрагментов ДНК, кодирующих библиотеку интересующих белков, например, в форме библиотеки поверхностного дисплея на основе дрожжей. Наиболее предпочтительным является способ в соответствии с настоящим изобретением, причем указанная библиотека дисплея является библиотекой T-клеточных рецепторов (TKP).
Неожиданно было обнаружено, что при использовании трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) в качестве восстановителя эффективность трансформации по этому способу в соответствии с настоящим изобретением выше по сравнению с ДТТ, например, выше, чем 1х108 трансформантов дрожжей/мкг векторной ДНК, предпочтительно выше, чем 2х108 трансформантов дрожжей/мкг векторной ДНК.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу получения усовершенствованной дрожжевой библиотеки представляющих интерес белков, например, в виде библиотеки поверхностного дисплея на основе дрожжей, включающему этапы: а) обеспечения трансфицированными дрожжевыми клетками в соответствии с настоящим изобретением; б) разведения трансфицированных клеток раствором сорбита в питательной среде с получением смеси в соотношении 1:1; в) ресуспендирования клеток в подходящей питательной среде; г) факультативно, проведения разведений для подсчета разнообразия и посева указанных разведений на планшеты со средой SD-CAA, содержащей канамицин; и д) перенесения указанной библиотеки в подходящую питательную среду и расширение указанной библиотеки с помощью электропорации; и е) факультативно, надлежащего хранения расширенной библиотеки.
Предпочтительным является способ в соответствии с настоящим изобретением, в котором указанная библиотека дисплея является библиотекой T-клеточных рецепторов. Предпочтительным является способ в соответствии с настоящим изобретением, в котором разнообразие указанной библиотеки выше, чем около 1012.
В контексте настоящего изобретения понятие вектор экспрессии обозначает ДНК-конструкцию, которая включает точку начала автономной репликации (ARS), сайт инициации транскрипции и, по меньшей мере, один структурный ген, кодирующий белок, который экспрессируется организмомхозяином. Сайт репликации, или точка начала репликации, - это любая последовательность ДНК, контролирующая репликацию векторов клонирования и экспрессии. Вектор экспрессии также, как правило, содержит надлежащие контрольные области, такие как один или несколько энхансеров и/или промоторов, супрессоров и/или сайленсеров, и терминаторов, которые контролируют экспрессию белка в дрожжевых клетках-хозяевах. Векторы экспрессии согласно настоящему изобретению могут также содержать маркер селекции, включающий необходимый ген, описанный в настоящем изобретении. Вектор экспрессии также факультативно содержит другие селектируемые маркеры, которые находятся в широком доступе и хорошо известны специалистам данной области. Векторы экспрессии - это один вид векторов. Векторы факультативно могут содержать одну или несколько последовательностей (элементов) ARS из одного или нескольких штаммов дрожжей.
Понятие функционально связанный означает, что сегменты ДНК организованы таким образом, что выполняют предписанную им функцию совместно, например, транскрипция инициируется в промоторе и проходит через кодирующий сегмент до терминатора.
Понятие трансформация или трансфекция означает введение ДНК или других нуклеиновых кислот в реципиентную дрожжевую клетку-хозяина, которая меняет генотип.
Понятие трансформант или трансформированная клетка означает реципиентную дрожжевую клетку-хозяина, которая подверглась трансформации, и ее потомство.
Около означает +/-10% заданного значения, если не указано иное.
Векторы, применимые в способах электропорации по изобретению, включают вектор pYD, любые другие векторы, и их производные конструкции, которые могут реплицироваться в дрожжевых клетках, или нуклеиновые кислоты в целом. Вектор экспрессии по настоящему изобретению может быть основан на векторе любого типа при условии, что этот вектор может трансформировать, трансфицировать или трансдуцировать дрожжевую клетку-хозяина. В предпочтительном варианте осуществления основой
- 3 043912 вектора экспрессии является дрожжевая плазмида, в особенности из S. cerevisiae. После трансформации дрожжевых клеток экзогенная ДНК, кодирующая последовательности библиотеки, поглощается клетками и затем экспрессируется трансформированными клетками.
Более предпочтительно, вектор экспрессии может быть челночным вектором дрожжей и бактерий, который способен реплицироваться как в E. coli, так и в дрожжах (Struhl, et al. (1979) Ргос. Natl. Acad. Sci.). Включение последовательностей ДНК-плазмиды E. coli, такой как pBR322, способствует получению векторной ДНК в E. coli в достаточном количестве и, таким образом, эффективной трансформации дрожжей.
Виды дрожжевых плазмидных векторов, которые могут служить в качестве челноков, могут быть реплицирующим вектором или интегрирующим вектором. Реплицирующий вектор является дрожжевым вектором, способным опосредовать его собственную поддержку, вне зависимости от хромосомной ДНК дрожжей, посредством присутствия функциональной точки начала репликации ДНК. Интегрирующий вектор основан на рекомбинации с хромосомной ДНК в целях содействия репликации и, таким образом, дальнейшей поддержке рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине. Реплицирующий вектор может быть на основе 2-микронной плазмиды, в которой точка начала репликации ДНК получена из 2-микронной плазмиды дрожжей. Альтернативно реплицирующий вектор может быть автономно реплицирующим (ARS) вектором, в котором очевидная точка начала репликации получена из хромосомной ДНК дрожжей. Факультативно, реплицирующий вектор может быть центромерной плазмидой (CEN), которая в дополнение к одной из указанных выше точек начала репликации ДНК имеет последовательность хромосомной ДНК дрожжей, несущей, как известно, центромеру.
Векторы могут быть трансформированы в клетки дрожжей в закрытой кольцевой форме или в линейной форме. Трансформация дрожжей с помощью интегрирующих векторов, хотя и характеризуется наследуемой стабильностью, может быть неэффективной, когда вектор имеет замкнутую кольцевую форму (например, с выходом лишь 1-10 трансформантов на мкг ДНК). Линеаризованные векторы со свободными концами, находящиеся в последовательностях ДНК, гомологичных хромосомной ДНК дрожжей, трансформируют дрожжи более эффективно (в 100-1000 раз), и трансформирующая ДНК обычно интегрируется в последовательности, которые гомологичны сайту расщепления. Таким образом, при расщеплении векторной ДНК с помощью подходящей экдонуклеазы рестрикции возможно увеличить эффективность трансформации и произвести нацеливание на хромосомный сайт интеграции. Интегративная трансформация можно применяться к генетической модификации пивных дрожжей при условии, что эффективность трансформации достаточно высока, и последовательность ДНК в качестве мишени для интеграции находится внутри области, которая не разрушает гены, необходимые для метаболизма клетки-хозяина.
Штаммы дрожжей, которые могут быть трансформированы с помощью способа электропорации согласно изобретению, включают виды из рода Saccharomyces, такие как Saccharomyces cerevisiae и рода Schizosaccharomyces, такие как Schizosaccharomyces Pombe. В одном варианты осуществления дрожжевые клетки являются диплоидными клетками дрожжей. Альтернативно дрожжевые клетки являются гаплоидными, таким как штамм a- и а-гаплоидных дрожжевых клеток.
Библиотека T-клеточных рецепторов в контексте настоящего изобретения может включать подходящие части TKP человека и/или TKP человека с мутациями, подлежащие скринингу, предпочтительно, одноцепочечную форму TKP, например, одноцепочечный в формате Vβ-линкер-Vα (scTKP); или одноцепочечный в формате Vα-линкер-Vβ, факультативно, слитый с саморасщепляющимся пептидом, например, 2A-пептидом. Также могут быть использованы опубликованные способы оптимизации экспрессии TKP с минимальной модификацией аминокислотной последовательности дикого типа (например, Szymczak, A. L. et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol 22, 589-594 (2004); Yang, S. et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther 15, 14111423 (2008); Kuball, J. et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood 109, 2331-2338 (2007); Cohen, C. J. et al. Enhanced Antitumor Activity of T Cells Engineered to Express T-Cell Receptors with a Second Disulfide Bond. Cancer Res 67, 3898-3903 (2007); Scholten, K. B. J. et al. Codon modification of T cell receptors allows enhanced functional expression in transgenic human T cells. Clin. Immunol. 119, 135-145(2006)).
Соотношение векторной ДНК к инсертированной ДНК находится в диапазоне от около 1:0,5 до около 1:10, например, 1:0,5, 1:1; 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 или 1:10. В одном варианте осуществления в реакции используют около 1 мкг векторной ДНК и около 1 мкг инсертированной ДНК. В другом варианте осуществления в реакции преципитации используют около 1 мкг векторной ДНК и около 2 мкг инсертированной ДНК. В другом варианте осуществления в реакции преципитации используют около 1 мкг векторной ДНК и около 3 мкг инсертированной ДНК. В еще одном варианте осуществления в реакции преципитации используют около 1 мкг векторной ДНК и около 4 мкг инсертированной ДНК. В еще одном другом варианте осуществления в реакции преципитации используют около 1 мкг векторной ДНК и около 5 мкг инсертированной ДНК.
- 4 043912
В одном варианте осуществления клеточная суспензия включает от около 50 до около 400 мкл дрожжевых клеток, например, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 мкл дрожжевых клеток.
В одном варианте осуществления в суспензии дрожжевых клеток содержится от около 1 до около
10х109 дрожжевых клеток/мл, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10х109 дрожжевых клеток/мл.
В одном варианте осуществления напряженность поля, используемого для электропорации дрожжевых клеток, составляла около от 0,5 до около 12,5 кВ/см, например, 0,5, 1,0, около 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5 кВ/см.
В одном варианте осуществления дрожжевые клетки электропорировали при электрической емкости от около 10 до около 50 мкФ, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50.
В одном варианте осуществления дрожжевые клетки суспендировали при концентрации от около 0,1 до около 10 М сорбита и 0,1 до 10 мМ CaCl2 или MgCl2, например, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 или 10,0 М сорбита, или, например, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 или 10,0 мМ CaCl2 или MgCl2
В одном варианте осуществления дрожжевые клетки инкубируют при концентрации от около 0,01 до около 1,0 М LiAc, например, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, около 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 М LiAc, и 1-100 мМ TCEP, например, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, около 70, 80, 90 или 100 мМ TCEP.
В изобретении предложены способы для трансформации дрожжевых клеток, включающие электропорацию клеточной суспензии, содержащей дрожжи вместе с одной или несколькими нуклеиновокислотными конструкциями. Результатом трансформации дрожжевых клеток может стать любая форма от отдельного клона до популяции дрожжевых клеток (т.е., дрожжевая библиотека или библиотеки), которые могут использованы для скрининга (а) пептида(ов) или белка(ов), представленных на поверхности дрожжевых клеток за счет связывания с поверхностным белком дрожжей или ассоциации посредством специфической ковалентной связи или нековалентного взаимодействия с белками поверхности дрожжевых клеток или другими компонентами; (б) пептида(ов) или белка(ов), экспрессируемых внутриклеточно; или (в) пептида(ов) или белка(ов), которые секретируются во внеклеточное пространство, такое как культуральная среда, или осаждаются на твердой поверхности. Такие дрожжевые библиотеки могут легко применяться для различных целей, для скрининга или определения характеристик взаимодействий между пептидом(ами) или белком(ами) с другим белком, пептидом, ДНК, РНК или другими химическими веществами, которые могут быть введены в дрожжевые клетки или добавлены экзогенно. Конкретными примерами являются те, что представлены дрожжевым дисплеем, дрожжевыми двойными гибридами, дрожжевыми тройными гибридами, и т.д.
В изобретении предложен способ трансформации дрожжевых клеток, включающий электропорацию клеточной суспензии, содержащей дрожжи вместе с одной или несколькими конструкциями нуклеиновой кислоты, включающими одну или более регулирующие последовательности и один или более генов или генных сегментов, при использовании одного или более из сопротивления, напряженности поля и длительности импульса, достаточных для трансформации дрожжевых клеток.
В одном варианте осуществления напряженность поля составляет от около 2,5 до около 12,5 кВ/см. В конкретных вариантах осуществления напряженность поля составляет 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 или 2,5 кВ/см. Данные показатели учитывают, что кювета для электропорации имеет зазор 0,2 см. Возможны более высокие показатели напряженности поля, но их практическое применение зависит во многом от разработки прибора, который может генерировать более сильные импульсы.
В одном варианте осуществления длительность импульсов составляет от около 3 до около 10 миллисекунд. В конкретном варианте осуществления длительность импульсов составляет около 4 миллисекунд.
Воздействие на клетки способами электропорации по изобретению производится с приложением электрического поля к суспензии дрожжевых клеток между двумя электродами. Напряженность поля должна быть с оправданной точностью скорректирована, так чтобы электропорация клеток проходила без повреждений, или же при минимальных повреждениях клеток. Расстояние между электродами может быть измерено и на электроды подано подходящее напряжение в соответствии с формулой E=V/d (Е=напряженность электрического поля в В/см; V=напряжение в вольтах; и d=расстояние в см).
Генераторы импульсов для проведения процедур, описываемых в настоящем изобретении, доступны и были доступны на рынке в течение многих лет. Один из подходящих генераторов сигнала - Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США). Обычная схема представлена прибором Gene Pulser II, соединенным с дополнительной емкостью и контроллером импульсов плюс модули.
В рамках настоящего изобретения электропорацию используют для облегчения введения ДНК в дрожжевые клетки. Электропорация - это процесс использования импульсного электрического поля для временной пермеабилизации клеточных мембран, что позволяет макромолекулам, таким как ДНК, проникнуть в клетки. Тем не менее, реальный механизм, по которому ДНК переносится в клетки, еще не достаточно хорошо понят. Электропорация неожиданно эффективна для трансформации, к примеру, Candida famata, когда на клетки воздействуют экспериментально затухающим импульсным электрическим полем с напряженностью поля от около 10 до около 13 кВ/см и величиной сопротивления около R5
- 5 043912 (129 Ом), и с константой времени, составляющей около 4,5 мс. Обычно сопротивление и емкость либо установлены, либо могут быть выбраны пользователем в зависимости от выбранного оборудования для электропорации. В любом случае настройку оборудования проводят в соответствии с инструкциями производителя для обеспечения надлежащих напряженности поля и параметров затухания.
В изобретении далее предложены высокоэффективные способы трансформации дрожжей, которые позволяют достичь высокий уровень экспрессии любого из или нескольких желаемых эндогенных (т.е., существующих в природе в такой дрожжевой клетке) или гетерологичных генов. Способы согласно изобретению далее относятся к способу получения библиотек, например, таких, которые экспрессируют TKP, scTKP, химеры или их фрагменты.
Согласно одному сценарию векторы экспрессии, несущие интересующие гены, могут быть трансформированы в дрожжевые клетки-хозяева посредством электропорации, чтобы получить отдельный клон или библиотеку множества трансформированных клеток, экспрессирующих внутриклеточные белки (например, ядерные или цитоплазматические белки), мембранные белки (например, белки, пронизывающие мембрану или прикрепленные к мембране белки), или же секретируемые белки. Специалист будет в состоянии использовать трансформированные клетки или библиотеку для очистки белков, изучения функций белков, идентификации белок-белковых взаимодействий или идентифицировать новые связывающие агенты или партнеров по взаимодействию белков. Важно отметить способность создавать крупные библиотеки на основе дрожжей, способные презентировать или экспрессировать TKP и фрагменты TKP. Эта библиотека может подвергаться селекции антигенами-мишенями в целях идентификации TKP, которые связываются с селектирующими антигенами.
Поскольку трансформированные дрожжи имеют тенденцию терять искусственно сконструированные плазмиды, полезно использовать культуральную среду, чтобы оказывать на них давление положительное отбора. Если штамм является ауксотрофным мутантом в отношении существенного метаболита, и когда используемая векторная плазмида включает маркерный ген, способный сохранять прототрофность штамма, например, ген LEU2, данное давление отбора может быть оказано за счет устранения метаболита из культуральной среды. Существуют другие средства получения того же результата, которые также могут использоваться для практического осуществления данного изобретения.
В зависимости от природы интересующего структурного гена продукт или продукт экспрессии может оставаться в цитоплазме дрожжевой клетки-хозяина или секретироваться. Было обнаружено, что растворимым являются не только белки, остающиеся в клетке, но и те, что секретируются. В тех случаях, когда продукт или продукт экспрессии должен оставаться в дрожжевой клетке-хозяине, в целом может быть желательным, чтобы в наличии имелась индуцируемая область инициации транскрипции, так чтобы до достижения трансформантом высокой плотности, экспрессия или генерация желаемого продукта была на низком уровне или отсутствовала. После достаточного времени для экспрессии продукта или продукта экспрессии клетки можно выделять обычными способами, например, с помощью центрифугирования, лизиса, и выделить интересующий продукт. В зависимости от природы и применения продукта лизат может подвергаться различным способам очистки, таким как хроматография, электрофорез, экстрагирование растворителя, кристаллизация, диализ, ультрафильтрация или тому подобным. Хроматографические способы включают, но без ограничения, газовую хроматографию, ВЭЖХ, колоночную хроматографию, ионообменную хроматографию и другие способы хроматографии, известные специалистам данной области. Степень чистоты может варьироваться от около 50 до 90% или выше, предпочтительно, вплоть до около 100%.
Альтернативно продукт экспрессии или интересующий продукт может секретироваться в культуральную среду и производиться на непрерывной основе, если среду частично удаляют, экстрагируют желаемый продукт, например, с помощью колоночной или аффинной хроматографии, ультрафильтрации, преципитации или подобных способов, и использованную среду удаляют или производят ее рециркуляцию восстановлением необходимых компонентов. Пермеат, содержащий продукт после ультрафильтрации, может дополнительно подвергаться концентрированию, дополнительно с помощью выпаривания, с последующей кристаллизацией или преципитацией с помощью спирта и/или регулирования уровня рН. Специалистам данной области известны многие варианты обработки. Если необходимо вызвать секрецию продукта, то обычно для этого задействован конститутивный сайт инициации транскрипции, хотя могут использоваться и неконститутивные участки.
Другие предпочтительные варианты осуществления могут быть понятны из примеров со ссылками на чертежи согласно настоящему описанию, тем не менее, не ограничиваясь ими. В соответствии с целями изобретения все цитируемые источники включены в данное описание во всей полноте путем ссылки.
На чертеже представлено сравнение улучшенной эффективности трансфекции TCEP в сравнении с ДТТ в одинаковых условиях.
Примеры
В практическом осуществлении изобретения используются, если не указано иное, обычные методики электропорации клеток и клеточной биологии дрожжей, которые хорошо известны в данной области техники.
I. Среды.
- 6 043912
1. Среда YPD:
дрожжевой экстракт 10 г;
бактопептон 20 г;
декстроза 20 г;
довести объем до 1 л, добавив H2O (добавить стерильный раствор глюкозы в автоклавированный раствор).
2. SD-CAA (pH 4,5):
дигидрат цитрата натрия 14,8 г (конечная концентрация 50 мМ);
моногидрат лимонной кислоты 4,2 г (конечная концентрация 20 мМ);
в 800 мл H2O, автоклавировать;
казаминовые кислоты 5,0 г;
основа азотного агара для дрожжей (без аминокислот) 6,7 г;
глюкоза 20 г;
довести объем до 1 л, добавив H2O, и провести стерильную фильтрацию.
3. Чашки с SD-CAA:
сорбит 182,2 г;
агар 15 г;
цитрат натрия 14,8 г;
моногидрат лимонной кислоты 4,2 г;
в 800 мл H2O, автоклавировать и охладить до ~55°C;
казаминовые кислоты 5,0 г;
основа азотного агара для дрожжей (без аминокислот) 6,7 г;
глюкоза 20 г;
сульфат канамицина 35 мг;
в 200 мл H2O и провести стерильную фильтрацию, добавить в охлажденный раствор после автоклавирования.
II. Подготовка электрокомпетентных дрожжевых клеток.
Производят высев штрихами 20 мкл свежеразмороженного штамма из коллекции Yeast stock, хранившегося при -80°C, на чашки с агаром YPD и инкубируют в течение двух дней при 30°C. Отдельные колонии (собрать колонию целиком) собирают из чашек с агаром YPD в 15 мл среды YPD и производят встряхивание в течение ночи при 30°C. На следующее утро 10 мл культуры переносят на 100 мл свежей среды YPD и продолжают встряхивание в течение 7 ч при 30°C. Определяют ОП600 и 1 л холодной среды YPD засевают до ОП600 0,2. Колбу для встряхивания помещают в предварительно охлажденный (4°C) встряхиватель. Встряхиватель запрограммирован на включение подогрева (30°C) и встряхивания (250 об./мин) за 5 ч до начала рабочего дня. Инкубирование проводится до достижения ОП600 в 1,5, что достигалось обычно через 6 ч после начала встряхивания.
Последующие этапы проводят на льду при использовании охлажденных растворов, пробирок, кювет и центрифуги, если не указано иное.
Клетки осаждают при 2000 g и 4°C в течение 3 мин (2-этапный процесс в 10 пробирках Falcon, 50 мл), дважды промывают в 25 мл холодной H2O и осаждают центрифугированием при 2000 g в течение 3 мин. Клетки промывают в 25 мл холодного раствора сорбита, 1 М/ CaCl2, 1 мМ; и осаждают центрифугированием при 2000 g в течение 3 мин. Клетки ресуспендируют в 25 мл раствора ацетата лития, 100 мМ/TCEP, 10 мМ. Пробирки Falcon 50 мл с фильтровальной крышкой используют для аэрации; клетки инкубируют при 30°C со встряхиванием при 160 об./мин в течение 30 мин, помещают на лед и клетки осаждают центрифугированием при 2,000 g и 4°C в течение 3 мин. Клетки промывают 25 мл холодного раствора 1 М сорбита/1 мМ CaCl2; и осаждают центрифугированием при 2000 g и 4°C в течение 3 мин, и промывают в 25 мл раствора 1 М холодного сорбита; и осаждают центрифугированием при 2000 g и 4°C в течение 3 мин. Клетки ресуспендируют в конической пробирке в холодном 1 М растворе сорбита до конечного объема 400 мкл на одну процедуру электропорации. Электрокомпетентные клетки можно хранить непосредственно при -80°C. До использования образцов для электропорации просочившиеся соли необходимо удалить центрифугированием (2000 д, 4°C, 5 мин) и дважды промыть холодным раствором сорбита, 1 М.
III. Электропорация.
400 мкл клеток смешивают с 5-10 мкл ДНК (векторной) в H2O, выдерживают на льду в течение 3 мин и переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации с зазором 0,2 см. С помощью системы для электропорации BioRad MicroPulser клетки электропорируют при 2,5 кВ. Типичные константы времени составляли около 4 мс, предпочтительно, 4 мс. Электропорированные клетки переносят в 10 мл смеси в пропорции 1:1 сорбита 1 М: среда YPD при 30°C на 1 ч без встряхивания. Клетки собирают с помощью центрифугирования при 2000 g в течение 3 мин при комнатной температуре и ресуспендируют в 10 мл SD-CAA при комнатной температуре. Были сделаны разведения для подсчета разнообразия (от 1:105 до 1:107). Разведения в планшетах со средой SD-CAA, содержащей канамицин, инкубируют в течение 1 дня при 30°C и в течение трех дней при комнатной температуре. Библиотеку перено-
Claims (13)
- сят в 100 мл среды SD-CAA (предпочтительно, на процедуру электропорации) и продолжают встряхивать в течение 24 ч при 30°C при 160 об./мин. Размноженные библиотеки можно использовать непосредственно для индукции или хранить при 4°C в течение двух недель. Долгосрочное хранение можно производить с помощью замораживания в 30% глицерине при -80°C.При использовании наиболее оптимального условия электропорации в обычных условиях можно достичь эффективности трансформации дрожжевых клеток, составляющей около 2х108 дрожжевых трансформантов/мкг векторной ДНК (см. чертеж). Поскольку данная эффективность трансформации достигнута в минимальном объеме клеток (100 мкл), она очень легко поддается автоматизации и осуществлению на устройствах для электропорации в многолуночных планшетах.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения электрокомпетентных дрожжевых клеток, включающий этапы:а) выращивание дрожжевых клеток до ОП600 между 1.0 и 2;б) промывка клеток холодной водой;в) промывка клеток холодным раствором, содержащим сорбит и CaCl2;г) инкубирование клеток в растворе, содержащем ацетат лития и трис-(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP);д) промывка клеток холодным раствором, содержащим сорбит и CaCl2;е) ресуспендирование клеток в растворе, содержащим сорбит.
- 2. Способ по п.1, дополнительно включающий этап подходящего хранения указанных клеток.
- 3. Электрокомпетентные дрожжевые клетки, полученные способом по п.1 или 2, обладающие повышенной эффективностью трансфекции.
- 4. Способ трансфекции электрокомпетентных дрожжевых клеток, включающий этапы:а) обеспечения электрокомпетентными дрожжевыми клетками, полученными в соответствии с п.1 или 2, или электрокомпетентными дрожжевыми клетками в соответствии с п.3;б) промывки клеток холодным раствором, содержащим сорбит;в) смешивания клеток с ДНК, подвергающейся трансфекции, для получения предэлектропорационной смеси;г) переноса указанной пред-электропорационной смеси в подходящую кювету для электропорации, и д) электропорации указанных клеток при значениях от 2.5 до 12.5 кВ/см в течение между 2 и 5 мс.
- 5. Способ в соответствии с п.4, причем указанная ДНК является линейной или кольцевой.
- 6. Способ в соответствии с п.4 или 5, причем указанная ДНК содержит библиотеку фрагментов ДНК, кодирующих библиотеку интересующих белков, например, в форме библиотеки поверхностного дисплея на основе дрожжей.
- 7. Способ в соответствии с п.6, причем указанная библиотека дисплея является библиотекой Tклеточных рецепторов (TKP).
- 8. Способ получения улучшенной дрожжевой библиотеки интересующих белков, включающий этапы:а) обеспечения трансфицированными дрожжевыми клетками в соответствии со способом в соответствии с любым из пп.4-7;б) разведения трансфицированных клеток раствором сорбита в питательной среде с получением смеси в соотношении 1:1;в) ресуспендирования клеток в подходящей питательной среде; иг) переноса указанной библиотеки в подходящую питательную среду и расширения указанной библиотеки путем электропорации.
- 9. Способ по п.8, дополнительно включающий этап проведения разведений для подсчета разнообразия, и посева указанных разведений на планшеты с SD-CAA, содержащей канамицин.
- 10. Способ в соответствии с п.8 или 9, причем дрожжевая библиотека интересующих белков находится в форме библиотеки поверхностного дисплея на основе дрожжей.
- 11. Способ по любому из пп.8-10, дополнительно включающий этап подходящего хранения указанной расширенной библиотеки.
- 12. Способ по любому из пп.8-11, причем указанная библиотека дисплея является библиотекой Tклеточных рецепторов.
- 13. Способ в соответствии с любым из пп.8-12, причем разнообразие указанной библиотеки выше чем 1012.-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102016121899.5 | 2016-11-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043912B1 true EA043912B1 (ru) | 2023-07-05 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11104894B2 (en) | Method for preparing electrocompetent yeast cells, and method for using said cells | |
| JP5647009B2 (ja) | 酵母を形質転換するための方法 | |
| JPH04505104A (ja) | 相同組換え法を用いてのタンパク質の生成 | |
| US20210308260A1 (en) | Non-integrative Listeria-based vaccine and method for inducing antitumor immune response | |
| EA043912B1 (ru) | Способ получения электрокомпетентных дрожжевых клеток и способ применения указанных клеток | |
| CN109810197B (zh) | 用于高效扩增nk的人工抗原递呈细胞及其构建方法 | |
| CN113528546B (zh) | 编码新型冠状病毒p.1突变株抗原的dna分子、dna疫苗及应用 | |
| CN111117967A (zh) | 制备过表达外源基因的细胞的方法 | |
| CN113862286B (zh) | 编码sars-cov-2病毒c.37突变株抗原的dna分子、dna疫苗及应用 | |
| RU2762410C1 (ru) | Модификация дрожжевой двугибридной системы, которая позволяет тестировать взаимодействия между белками внутри многокомпонентных белковых комплексов | |
| US7175998B2 (en) | Stable Acanthamoeba protein expression systems | |
| CN113862285A (zh) | Sars-cov-2病毒b.1.617.2突变株dna疫苗及应用 | |
| CN115197968A (zh) | 抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建、筛选方法及其应用 | |
| CN111484982A (zh) | 一种人结直肠腺癌细胞trpv1基因敲除细胞株及应用 | |
| Odon et al. | 692. Analysis of 2A-Mediated ‘Cleavage’ |