UA125076C2 - Спосіб приготування електрокомпетентних дріжджових клітин та спосіб використання згаданих клітин - Google Patents

Description

Цей винахід стосується поліпшеної дріжджової трансформації дріжджових клітин та бібліотекам клітин дріжджів, трансформованих у такий спосіб. Більш конкретно, цей винахід стосується трансформації дріжджів шляхом електропорації.

Передумова створення винаходу

На протязі багатьох років наріжними каменями лікування раку були хірургія, хіміотерапія та променева терапія. Протягом останнього десятиріччя для цілого ряду ракових захворювань як стандарти лікування з'явилися засоби таргетної терапії, такі як іматиніб (СіеемесФф) і трастузумаб (НегсеріїпФ) - лікарські препарати, мішенями яких ракові клітини, націлені на конкретні молекулярні зміни, які спостерігаються головним чином у цих клітинах.

Зараз багато надій покладають на імунотерапію - терапевтичні засоби, які задіюють можливості імунної системи пацієнта у боротьбі з його захворюванням. Один підхід до імунотерапії включає конструювання клітин власної імунної системи пацієнта таким чином, щоб вони були здатні розпізнавати та атакувати пухлини в його організмі. Цей підхід, який має назву адоптивне перенесення клітин (АПК), викликав низку дивовижних клінічних відповідей у пацієнтів із поширеним раком.

У той час як зазвичай очікується, що природні Т-клітинні рецептори (ТКР) виявляють достатньо високу афінність для того, щоб досягти терапевтичної ефективності, зазвичай під час розробки терапевтичних ТКР або їх похідних, таких як, наприклад, розчинні ТКР (рТКР), бажано або необхідно використовувати так зване "дозрівання афінності" для того, щоб викликати ефективну клінічну відповідь іп мімо.

Для дозрівання звичайно застосовують спосіб із використанням поверхневого дисплея на основі дріжджів. Тим не менш, для отримання бібліотек, які мають достатню різноманітність, необхідно використовувати високоефективний спосіб дріжджової трансформації.

Давно вже виникло бажання ідентифікувати ТКР, які по суті складаються з природних послідовностей альфа- і бета-ланцюгів, які специфічно зв'язуються з конкретними антигенами, такі як, наприклад, ТКР, або їх розчинні аналоги, можуть бути розроблені для забезпечення основи для потенційних терапевтичних підходів. Антигени, що розпізнаються ідентифікованими

ТКР, можна асоціювати з захворюванням, таким як рак, вірусні інфекції, аутоімунні захворювання, паразитарні інфекції та бактеріальні інфекції. Таким чином, такі терапевтичні

Зо засоби можна використовувати для лікування згаданих захворювань.

До того ж, після ідентифікації природних або нативних ТКР і визначення їх послідовностей можна ввести мутації, які зумовлять підвищення афінності або час напівжиття, за необхідності, як це описано у заявці УМО2012/013913. Традиційно спроби ідентифікувати ТКР, що специфічно зв'язуються з асоційованими з захворюванням антигенами, такими як ракові вірусні, аутоімунні або бактеріальні антигени, були обмежені використанням зразків крові, отриманими від донорів- добровольців. Такі зразки використовувалися для виділення Т-клітин та відповідних їм рецепторів ТКР, які зв'язують асоційовані з захворюванням антигени. Цей підхід звичайно потребує принаймні 20 донорів. Процес тривалий і потребує великих трудових затрат, і не існує гарантій ідентифікації антигензв'язувальних рецепторів Т-клітин. У випадках, якщо функціональні Т-клітинні рецептори ідентифікують, вони часто мають слабку афінність до антигену, низьку специфічність та (або) не згортаються належним чином іп міїго. Різноманітність

Т-клітин, які піддаються скринінгу, обмежена різноманітністю Т-клітин серед донорів. Деякі асоційовані із захворюванням антигени, включаючи більшість ракових антигенів, є аутоантигенами; оскільки відбір у тимусі служить для видалення ТКР, які розпізнають аутоантигени, ТКР, специфічні до асоційованих з захворюванням антигенів, можуть не бути присутніми у природному спектрі рецепторів донорів або можуть мати лише слабку афінність до антигену.

Спроби сконструювати бібліотеку для виділення нових ТКР зі специфічністю зв'язування з антигеном проводилися протягом декількох років. Бібліотеки ТКР набагато складніше сконструювати, ніж порівнювані бібліотеки антитіл, оскільки ланцюги ТКР менш стабільні і часто не презентуються правильно. Труднощі, пов'язані з конструюванням бібліотеки ТКР, величезні.

Переважним є збереження варіабельності довжин СОКЗ (яка виявлена у природному репертуарі). Суттєва частина будь-якої бібліотеки звичайно виявляється непридатною для застосування у зв'язку зі стоп-кодонами, зсувами рамок зчитування, проблемами з фолдингом і комбінаціями ланцюгів ТКР, які просто не можуть зв'язатися з комплексом НІГ А. Беручи до уваги велику кількість генів, які кодують варіабельні ділянки альфа і бета, а також генів, що кодують сегменти . і 0, ймовірність отримання та ідентифікації функціонуючого, такого, що згортається, альфа-ланцюга та функціонуючого, такого, що згортається, бета-ланцюга, які разом утворюють

ТКР, який зв'язується з антигенним пептидом з необхідною специфічністю, є надзвичайно (516) низькою.

Наявність засобів для отримання бібліотек нуклеїнових кислот і рекомбінантних продуктів, які ними продукуються, таких як фармацевтичні білки, у еукаріотичних системах, таких як дріжджі, надає значні переваги відносно використання прокаріотичних систем, таких як Е. соїї.

Дріжджі звичайно можливо виростити до більшої густини клітин, ніж бактерії, і вони легко пристосовуються до безперервних процесів ферментації. Однак розвитку різних видів дріжджів у системах хазяїн/вектор для отримання рекомбінантних продуктів та бібліотек сильно перешкоджає брак знань про умови трансформації і нестача належних засобів для стабільного введення чужорідних нуклеїнових кислот у дріжджові клітини-хазяї.

Серед різних електричних (та біологічних параметрів, які прискорюють електротрансформацію клітин, слід згадати адсорбцію ДНК на клітинній поверхні. Змінні електричні поля низької інтенсивності також сприяють перенесенню ДНК у бактерії Е. сої, ймовірно, за рахунок електричної стимуляції ДНК-пермеаз. Відбувається накопичення знань про домінантний електродифузійний або електрофоретичний вплив на генний трансфер шляхом електропорації ДНК як поліелектроліту. Також повідомлялося про електроосмотичні ефекти та інвагінацію мембрани, якій сприяє електропорація.

Прикладання електричного поля до мембрани дріжджової клітини веде до утворення тимчасових пор, які відіграють вирішальну роль у процесі електропорації. Генератор сигналів електропорації забезпечує напругу (у кВ), яка рухається крізь зазор (у см) між електродами. Ця різниця потенціалів визначає так звану "напруженість електричного поля", де Е вимірюється у кКВ/см. Кожна клітина має свою власну критичну напруженість поля для оптимальної електропорації. Це зумовлюється розміром клітини, будовою мембрани та індивідуальними характеристиками самої клітинної стінки. Наприклад, клітини ссавців зазвичай потребують прикладання від 0,5 до 5,0 кВ/см перед тим, як відбудеться загибель клітини та (або) електропорація. Взагалі, необхідна напруженість поля обернено залежить від розміру клітини.

Заявка ЕР2257638А1 стосується способів трансформації дріжджів шляхом електропорації.

Вони включають комбінацію ацетату літію (ГіАс) та дитіотреїту (ДТТ) як засобів кондиціювання клітини, обидва з яких використовувалися для підвищення частоти трансформації дріжджів. Як показано у Таблиці 2, виключення попередньої обробки ДТТ або ГіАс призводить в результаті до відповідного зменшення ефективності на 93,3 95 і 85,7 Фо.

Зо Аналогічно, Зтійй і співавт. (у статті Т Сеї! Кесеріог Епдіпеегіпд апа Апаїузів Овіпд Ше Увєаві

Оівріау Ріанйопт. МеШоса5 Мо! ВіоІ. 2015;1319:95-141) розкривають результати дослідження зв'язування ТКР з антигенами, такими як пептидні ліганди МНС (рермнс). Акцент був зроблений на конструюванні афінності ТКР з метою використання молекул цього класу аналогічно здійснюваному зараз із антитілами. Для більш швидкого конструювання ТКР і аналізу їх зв'язувальної здатності автори використали як платформу систему дріжджового дисплея. Експресія та конструювання одноланцюгової форми ТКР, аналогічної фрагментам 5СЕм із антитіл, дозволяє ТКР набути афінну зрілість з багатьма можливими лігандами рермнс.

До того ж, платформа на основі дріжджового дисплея дозволяє швидко генерувати варіанти

ТКР з різноманітними афінностями зв'язування та аналізувати специфічність та афінність без потреби в очищенні розчинних форм ТКР. У статті описані способи конструювання та аналізу одноланцюгових ТКР за допомогою дріжджового дисплея.

Дріжджові бібліотеки не досягли розмірів або ефективності, яких було досягнуто у випадку фагових бібліотек, типовий максимальний розмір фагової бібліотеки становить від 1079 до 101, у той час як типова дріжджова бібліотека має розмір у 107. Хоча нещодавній прогрес у розвитку протоколів електропорації (див. Спао, Маїшге Ргоїосоїв 1(2):755-768 (2006)) надав можливість досягти максимального розміру дріжджової бібліотеки у 5 х 107 за одну трансформацію. Все ще є справедливим твердження, що наразі розміри дріжджових бібліотек все ще значно нижчі за звичайно досяжні розміри бібліотек фагового дисплея, які становлять від 1079 до 1011.

Вищезгадані способи і розкриття, хоча й забезпечують досягнення все більшої ефективності трансформації, все ще є трудомісткими і потребують багато часу та повторювальних зусиль для акумулювання багатьох невеликих бібліотек у діапазоні розміру від 1092 до 107 для отримання більших та комбінованих бібліотек розміром у діапазоні від 105до 109.

Селекція за допомогою бібліотек дріжджового дисплея із використанням для сортування клітин як магнітних мікросфер, так і активованої флуоресценції, забезпечує ефективний і чутливий спосіб збагачення специфічними зв'язувачами антигенів-мішеней, особливо за рахунок його сумісності з флуоресцентно-активованим сортуванням клітин (ЕАС5). Перевазі цієї стратегії селекції заважає обмежений розмір типових бібліотек дріжджового дисплея у зв'язку з низькою ефективністю трансформації дріжджових клітин.

Отже, існує потреба в ефективних способах отримання білкових бібліотек, наприклад, 60 бібліотек ТКР, з використанням дріжджів.

В одному аспекті цього винаходу пропонується спосіб приготування електрокомпетентних дріжджових клітин, що включає стадії: а) вирощування дріжджових клітин до значень ОЮвоо між приблизно 1,0 і 2; б) промивки клітин холодною водою; в) промивки клітин холодним розчином, що містить сорбіт і СасСі»; г) інкубування клітин у розчині, що містить ацетат літію і трис(2- карбоксиетил)фосфін (ТСЕР); д) промивки клітин холодним розчином, що містить сорбіт і Сасі»; е) ресуспендування клітин у розчині, що містить сорбіт; і ж) необов'язково, принагідного зберігання згаданих клітин.

У зв'язку з цим предметом цього винаходу є високоефективний спосіб трансформації дріжджових клітин, наприклад, для отримання поліпшених бібліотек дріжджових клітин. Способи за винаходом усувають значну перешкоду при застосуванні технології дріжджового дисплея як практичного інструмента для досягнення набагато ширшого простору для різноманітності ТКР, раніше недослідженого.

У ще одному аспекті цей винахід також стосується способу трансфекції електрокомпетентних дріжджових клітин, що включає стадії: а) забезпечення електрокомпетентними дріжджовими клітинами відповідно до способу за цим винаходом; б) промивки клітин холодним розчином, що містить сорбіт; в) змішування клітин із ДНК, призначеної для трансфекції, з утворенням пре-електропораційної суміші; г) перенесення згаданої пре-електропораційної суміші у відповідну кювету для електропорації, і д) електропорації згаданих клітин при значеннях від приблизно 2,5 кВ/см до приблизно 12,5 кВ/см протягом від приблизно 2 до приблизно 5 мс.

Переважним є спосіб відповідно до цього винаходу, в якому згадана ДНК є лінійною або кільцевою. Більш переважним є спосіб відповідно до цього винаходу, в якому згадана ДНК містить бібліотеку фрагментів ДНК, які кодують бібліотеку білків, що становлять інтерес, наприклад, у вигляді бібліотеки поверхневого дисплея на основі дріжджів. Найбільш переважним є спосіб відповідно до цього винаходу, в якому згадана бібліотека дисплея є бібліотекою Т-клітинних рецепторів (ТКР).

Несподівано було виявлено, що при використанні трис(2-карбоксиетил)фосфіну (ТСЕР) як відновлювального засобу ефективність трансформації за способом відповідно до цього винаходу є вищою у порівнянні з ДТТ, наприклад, вище ніж 1 х 108 дріжджових

Зо трансформантів/мкг векторної ДНК, опереважно вище ніж 2 х 108 дріжджових трансформантів/мкг векторної ДНК.

У ще одному аспекті цей винахід стосується способу отримання поліпшеної дріжджової бібліотеки білків, що становлять інтерес, наприклад, у вигляді бібліотеки поверхневого дисплея на основі дріжджів, що включає стадії: а) забезпечення трансфекованими дріжджовими клітинами відповідно до способу за цим винаходом; б) розведення трансфекованих клітин розчином сорбіту у поживному середовищі з отриманням суміші у співвідношенні 1:1; в) ресуспендування клітин у відповідному поживному середовищі; г) необов'язково, здійснення розведень для розрахунку різноманітності і висівання згаданих розведень на планшети з середовищем 50О-САА, яке містить канаміцин і д) перенесення згаданої бібліотеки у відповідне поживне середовище та розширення згаданої бібліотеки шляхом електропорації; і е) необов'язково, відповідне зберігання згаданої розширеної бібліотеки.

Переважним є спосіб відповідно до цього винаходу, в якому згадана бібліотека дисплея є бібліотекою Т-клітинних рецепторів. Переважним є спосіб відповідно до цього винаходу, в якому різноманітність згаданої бібліотеки є вищою ніж приблизно 10172.

У контексті цього винаходу термін "вектор експресії" означає ДНК-конструкцію, яка включає точку початку реплікації, яка забезпечує автономну реплікацію (АКБ), сайт ініціації транскрипції та принаймні один структурний ген, що кодує білок, який експресується організмом-хазяїном.

Сайт реплікації, або точка початку реплікації являє собою будь-яку послідовність ДНК, яка контролює реплікацію векторів клонування та експресії. Вектор експресії зазвичай також містить відповідні ділянки контролю, такі як один або декілька енхансерів та (або) промоторів, супресорів та (або) сайленсерів, і термінаторів, які контролюють експресію білка у дріжджовій клітині-хазяїні. Вектори експресії за цим винаходом можуть також містити селектовний маркер, що містить суттєвий ген як описано у цьому документі. Вектор експресії також необов'язково містить інші селектовні маркери, які є у широкому доступі і добре відомі спеціалістам у цій галузі. Вектори експресії є одним типом векторів. Вектори можуть необов'язково містити одну або декілька послідовностей (елементів) АКЗ із одного або декількох штамів дріжджів.

Термін "функціонально пов'язані" означає, що сегменти ДНК організовані таким чином, що вони функціонують у взаємодії за їх призначенням, наприклад, транскрипція ініціюється у промоторі і проходить через кодувальний сегмент до термінатора.

Термін "трансформація" або ""трансфекція" означає введення ДНК або інших нуклеїнових кислот у реципієнтну дріжджову клітину-хазяїна, яка змінює генотип.

Термін "тгрансформант" або "трансформована клітина" означає реципієнтну дріжджову клітину-хазяїна, яка зазнає трансформацію, та її нащадків. "Близько" означає х/- 10 95 від зазначеної величини, якщо не вказано інакше.

Вектори, застосовні у способах електропорації за винаходом, включають вектор ру, будь- які інші вектори та конструкції, які походять із них, які можуть реплікуватися у клітинах дріжджів, або нуклеїнові кислоти взагалі. Вектором експресії за цим винаходом може бути будь-який вектор за умови, що вектор може трансформувати, трансфекувати або трансдукувати дріжджову клітину-хазяїна. У переважному втіленні основою для вектора експресії є дріжджова плазміда, особливо плазміда з 5. сегемізіає. Після трансформації дріжджових клітин екзогенна

ДНК, яка кодує послідовності бібліотеки, поглинається клітинами і згодом експресується трансформованими клітинами.

Більш переважно, вектор експресії може бути човниковим вектором для дріжджів і бактерій, який може реплікуватися в клітинах або Е. соїї, або дріжджів (5ігиПЙі, еї а. (1979) Ргос. Маї!. Асад. збсі.). Введення послідовностей ДНК плазміди Е. соїї, такої як рРВК322, прискорює отримання векторної ДНК в Е. сої у достатній кількості, і, отже, ефективну трансформацію дріжджів.

Види плазмідних векторів дріжджів, які можуть відігравати роль човників, можуть включати реплікуючий вектор або інтегруючий вектор. Реплікуючий вектор є дріжджовим вектором, який здатний опосередковувати свою власну підтримку, незалежно від хромосомної ДНК дріжджів, дякуючи наявності функціонуючої точки початку реплікації ДНК. Інтегруючий вектор базується на рекомбінації з хромосомною ДНК для сприяння реплікації і таким чином продовження підтримки рекомбінантної ДНК у клітині-хазяїні. Реплікуючий вектор може бути вектором на основі 2-мікронної плазміди, у якому точка початку реплікації ДНК отримана з 2-мікронної плазміди дріжджів. Альтернативно, реплікуючий вектор може бути автономно реплікуючим вектором (АК5), у якому "видима" точка початку реплікації отримана з хромосомної ДНК дріжджів. Необов'язково, реплікуючий вектор може бути центромерною (СЕМ) плазмідою, яка на додаток до однієї з вищезгаданих точок початку реплікації ДНК має послідовність хромосомної

ДНК дріжджів, яка, як відомо, несе центромеру.

Зо Ці вектори можна трансформувати у клітини дріжджів у вигляді замкненої кільцевої структури або лінійної структури. Трансформація дріжджів інтегруючими векторами, хоча й характеризується спадковою стабільністю, не може бути ефективною, якщо вектор знаходиться у вигляді замкненої кільцевої структури (наприклад, створюючи лише близько 1-10 трансформантів/мкг ДНК). Лінеаризовані вектори з вільними кінцями, розташованими у послідовностях ДНК, гомологічних хромосомним ДНК дріжджів, трансформують дріжджі ефективніше (у 100-1000 разів), і трансформуюча ДНК звичайно інтегрується у послідовності, гомологічні до сайту розщеплення. Отже, розщеплюючи векторну ДНК відповідною рестрикційною ендонуклеазою, можливо підвищити ефективність трансформації і зробити мішенню хромосомний сайт інтеграції. Інтегративна трансформація може бути застосовною до генетичної модифікації пивних дріжджів за умови, що ефективність трансформації є достатньо високою і послідовність ДНК як мішень для інтеграції знаходиться у межах ділянки, що не руйнує гени, необхідні для метаболізму клітини-хазяїна.

Штами дріжджів, які можливо трансформувати способом електропорації за винаходом, включають види дріжджів роду Засспаготусеб5, такі як Засспаготусев сегемівзіає, і роду

Зспігозасспаготусев, такі як Зспігозасспаготусев Ротрбе. В одному втіленні клітини дріжджів є диплоїдними клітинами дріжджів. Альтернативно, клітини дріжджів є гаплоїдними клітинами, такими як штам "а" і «а» гаплоїдних клітин дріжджів. "Бібліотека Т-клітинних рецепторів" у контексті цього винаходу може включати відповідні частини ТКР людини та (або) мутованих ТКР людини, які підлягають скринінгу, переважно одноланцюгові форми ТКР, наприклад, одноланцюговий у форматі Мв-лінкер-Ма (олТКР); або одноланцюговий у форматі Ма-лінкер-Мв, необов'язково злитого з саморозщеплюваним пептидом, наприклад, 2А-пептидом. Можливо також застосовувати опубліковані описи способів оптимізації експресії ТКР із мінімальною модифікацією дикого типу амінокислотної послідовності (наприклад, 52утслак, А. Г. еї аІ. Сотесіоп ої ппийі-депе аеїсієпсу іп мімо ивіпад а віпдіє "зеїї- сіваміпд" 2А реріїде-разеай геїгоміга! месіог. Маї Віоїесппо!ї 22, 589-594 (2004); Мапд, 5. еї аї.

Ремеіортенпі ої оріїтаї! Бісівігопіс Іепіїміга! месіог5 Тасійаев Нпідн-Ієме! ТСА депе ехргезвіоп апа гориві їштог сеї гесодпійоп. Сепе Тег 15, 1411-1423 (2008); Киваї), у. еї а). Расійацпуд таїснєй раїгпд апа ехргезвіоп ої ТСВ спаїпв іпігодисед іпіо питап Т сеїІв. Віоса 109, 2331-2338 (2007);

Сопеп, б. у. єї ам. Епнапсей Апійштог Асіїмйу ої Т СеїЇє Епдіпеетейд (о Ехргезз Т-СеїЇ Весеріогв 60 мій а бесопа Оізиіде Вопа. Сапсег ВНез 67, 3898-3903 (2007); ЗспоМеп, К. В. 9. єї аі. Содоп тоаіїїсайоп ої Т сеї! гесеріог5 аоме еппапсейа Тшпсіопа! ехргезвіоп іп Мапздепіс питап Т сеїЇв.

Сіїп. Іттипої. 119, 135-145 (2006)).

Співвідношення векторної ДНК та інсертованої ДНК знаходиться у діапазоні від приблизно 1:0,5 до приблизно 1:10, наприклад, 1:0,5, 1:1; 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 або 1:10. В одному втіленні у реакції використовують близько 1 мкг векторної ДНК і близько 1 мкг інсертованої ДНК. В іншому втіленні в реакції преципітації використовують близько 1 мкг векторної ДНК і близько 2 мкг інсертованої ДНК. В іншому втіленні в реакції преципітації використовують близько 1 мкг векторної ДНК і близько З мкг інсертованої ДНК. У ще іншому втіленні в реакції преципітації використовують близько 1 мкг векторної ДНК і близько 4 мкг інсертованої ДНК. У ще іншому втіленні в реакції преципітації використовують близько 1 мкг векторної ДНК і близько 5 мкг інсертованої ДНК.

В одному втіленні суспензія клітин містить від близько 50 до близько 400 мкл дріжджових клітин, наприклад, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 мкл дріжджових клітин.

В одному втіленні суспензія дріжджових клітин містить від близько 1 до близько 10 х 109 дріжджових клітин/мл, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 х 109 дріжджових клітин/мл.

В одному втіленні напруженість поля, використана для електропорації дріжджових клітин, складала від близько 0,5 кВ/см до близько 12,5 кВ/см, наприклад, 0,5, 1,0, близько 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5,6,0, 6,5, 7,0, 7,5,8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5 кВ/см.

В одному втіленні дріжджові клітини піддають електропорації за електричної ємності від приблизно 10 до приблизно 50 мкФ, наприклад, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50.

В одному втіленні дріжджові клітини суспендують при концентрації від близько 0,1 до близько 10 М сорбіту і від 0,1 до 10 мМ Сасі» або МодсСі», наприклад, 0,1,0,25,0,5,0,75,1,0,2,0, 3,0,4,0,5,0,6,0, 7,0, 8,0, 9,0 або 10,0 М сорбіту, або, наприклад, 0,1,0,25,0,5,0,75,1,0,2,0, 3,0, 4,0,5,0,6,0, 7,0, 8,0, 9,0 або 10,0 мм Сасі» або Мосіг

В одному втіленні дріжджові клітини інкубують при концентрації від близько 0,01 до близько 1,0 М ГСіАс, наприклад, 0,01,0,02,0,03,0,04,0,05,0,06,0,07,0,08,0,09,0,1,0,2,0,3,04, 0,5, 0,6, близько 0,7, 0,8, 0,9 або 1,0 М ГАс, і від 1 до 100 мМ ТСЕР, наприклад, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, близько 70, 80, 90 або 100 мМ ТСЕР.

За цим винаходом пропонуються способи трансформації дріжджових клітин, які включають

Зо електропорацію суспензії клітин, яка містить дріжджі разом із однією або декількома нуклеїновокислотними конструкціями. Трансформація дріжджових клітин може призвести до утворення будь-чого від одного клону до популяції дріжджових клітин (тобто, до дріжджової бібліотеки або дріжджових бібліотек), які можна використовувати для скринінгу на а) пептид(и) або білок (білки), презентовані на поверхні дріжджових клітин за допомогою зв'язування з білками поверхні дріжджів або асоціації через специфічний ковалентний зв'язок або нековалентну взаємодію з білками поверхні дріжджових клітин або іншими компонентами; б) пептид(и) або білок (білки), експресовані внутрішньоклітинно; або в) пептид(и) або білок (білки), які секретуються у позаклітинний простір, такий як культуральне середовище, або осаджуються на твердій поверхні. Такі дріжджові бібліотеки можуть бути зручно використані для багатьох призначень, для скринінгу та визначення характеристик взаємодії між пептидом (пептидами) або білком (білками) з іншим білком, пептидом, ДНК, РНК або іншими хімічними складовими, які можуть бути введені у дріжджові клітини або екзогенно додані. Конкретними прикладами є застосування, що стосуються дріжджового дисплея, двогібридної дріжджової системи, тригібридної дріжджової системи тощо.

Предметом цього винаходу є спосіб трансформації дріжджових клітин, що включає електропорацію суспензії клітин, яка містить дріжджі разом із однією або декількома нуклеїновокислотними конструкціями, які містять одну або більше регуляторних послідовностей та один або декілька генів чи генних сегментів, використовуючи одне або декілька із опору, напруженості поля і тривалості імпульсу, достатніх для трансформації дріжджових клітин.

В одному втіленні напруженість поля становить від близько 2,5 кВ/см до близько 12,5 кВ/см.

У певних втіленнях напруженість поля становить 0,5 кВ/см, 1,0 кВ/см, 1,5 кВ/см, 2,0 кВ/см або 2,5 кВ/см. Ці значення враховують, що кювета для електропорації має зазор 0,2 см. Вищі значення напруженості поля можливі, але їх застосовність у значній мірі залежить від розробки приладу, який здатний генерувати потужніший імпульс.

В одному втіленні тривалість імпульсу становить від близько З мілісекунд до близько 10 мілісекунд. В одному конкретному втіленні тривалість імпульсу становить близько 4 мілісекунд.

Обробка клітин способами електропорації за винаходом здійснюється шляхом прикладання електричного поля до суспензії дріжджових клітин між двома електродами. Напруженість поля необхідно регулювати з прийнятною точністю, щоб електропорація здійснювалася без 60 пошкодження клітин або з мінімальним пошкодженням клітин. Відстань між електродами можна виміряти, а відповідну напругу за формулою Е-М/і можна прикласти до електродів (Е - напруженість електричного поля у В/см; М - напруга у вольтах; а - відстань у см).

Генератори імпульсів для проведення методик, описаних тут, є і були доступними на ринку протягом декількох років. Одним із відповідних генераторів сигналів є Сепе Риїзег ІІ (Віо-Наай

І арогасогієв, Іпс., Геркулес, Каліфорнія, США). Типова схема складається з приладу Сепе Риїзег

ІЇ, з'єднаного з додатковою ємністю плюс контролером імпульсів плюс модулями.

Електропорацію використовують у межах цього винаходу для сприяння введенню ДНК у дріжджові клітини. Електропорація є процесом використання імпульсного електричного поля для тимчасового надання проникності клітинним мембранам, що дозволить макромолекулам, таким як ДНК, проходити всередину клітин. Однак реальний механізм, за яким ДНК переноситься всередину клітин, до кінця незрозумілий. Для трансформації, наприклад, Сапаїда

Татаїа електропорація несподівано ефективна, якщо клітини піддають дії експериментально згасаючого імпульсного електричного поля, яке має напруженість поля від близько 10 до близько 13 кВ/см і значення опору близько К5 (129 Ом) і константу часу близько 4,5 мс.

Зазвичай опір та ємність або задані, або їх може вибрати користувач, залежно від вибраного устаткування для електропорації. У будь-якому випадку налагодження устаткування виконують відповідно до інструкцій виробника для забезпечення відповідних напруженості поля та параметрів згасання.

Цей винахід також стосується високоефективних способів трансформації дріжджів, які забезпечують високий рівень експресії будь-якого (яких) одного або декількох бажаних ендогенних (тобто таких, що присутні усередині цієї дріжджової клітини за природних умов) або гетерологічних генів. Способи за винаходом також стосуються способу приготування бібліотек, наприклад, які експресують ТКР, олтТКР, химерних сполук або їх фрагментів.

Згідно з одним із сценаріїв вектори експресії, які несуть гени, що становлять інтерес, можуть бути трансформовані у дріжджові клітини-хазяї шляхом електропорації для утворення одного клону або бібліотеки, яка включає багато трансформованих клітин, які експресують внутрішньоклітинні білки (наприклад, ядерні або цитоплазматичні білки), мембранні білки (наприклад, білки, що пронизують мембрану, або білки, прикріплені до поверхні клітинної мембрани), або секретовані білки. Існує можливість використовувати трансформовані клітини

Зо або бібліотеки для очищення білків, вивчення функцій білків, ідентифікації білок-білкових взаємодій або ідентифікації нових білкових зв'язувачів або партнерів по взаємодії. Важливо відзначити здатність генерувати дуже великі дріжджові бібліотеки, які презентують або експресують ТКР і фрагменти ТКР. Бібліотека може бути піддана селекції антигенами-мішенями для ідентифікації ТКР, які зв'язуються з селектуючими антигенами.

Оскільки трансформовані дріжджі мають тенденцію втрачати штучно сконструйовані плазміди, корисно використовувати культуральне середовище з метою здійснення на них тиску позитивного відбору. Якщо штам є ауксотрофним мутантом для суттєвого метаболіту і якщо використовувана векторна плазміда містить маркерний ген, здатний відновлювати прототрофію штаму, наприклад, ген ГЕБО2, цей тиск відбору може бути вчинений шляхом невключення метаболіту в культуральне середовище. Існують інші засоби отримання такого ж самого результату, і вони також можуть бути використані для втілення винаходу.

Залежно від природи структурного гена, який становить інтерес, продукт або продукт експресії може залишатися у цитоплазмі дріжджової клітини-хазяїна або бути секретованим.

Було виявлено, що не тільки білки, які залишаються у клітині, але й такі, які секретуються, є розчинними. Якщо продукт або продукт експресії має залишитися у дріжджовій клітині-хазяїні, взагалі може бути бажаним мати індуковну ділянку ініціації транскрипції для того, щоб до моменту досягнення трансформантом високої густини була відсутня або незначна експресія або утворення бажаного продукту. Після достатнього періоду часу для того, щоб продукт або продукт експресії експресувався, клітини можна відокремити за допомогою традиційних засобів, наприклад, центрифугування, лізису, і продукт, який становить інтерес, виділити. Залежно від природи та використання продукту, лізат можна піддати очищенню різними способами, такими як хроматографія, електрофорез, екстракція розчинниками, кристалізація, діаліз, ультрафільтрація або їм подібні. Хроматографічні способи включають, без обмеження, газову хроматографію, ВЕРХ, колонкову хроматографію, іонообмінну хроматографію та інші хроматографічні способи, відомі спеціалістам у цій галузі. Ступінь чистоти може змінюватися від близько 50 95 до 90 95 і вище, переважно аж до 100 95.

Альтернативно, продукт експресії або продукт, що становить інтерес, може секретуватися у культуральне середовище і отримуватися безперервно, якщо середовище частково видаляють, бажаний продукт екстрагують, наприклад, за допомогою колонкової або афінної хроматографії, бо ультрафільтрації, преципітації тощо, і відпрацьоване середовище відкидають або піддають рециркуляції шляхом відновлення суттєвих компонентів. Пермеат, який містить продукт ультрафільтрації, можна додатково піддати концентруванню, додатково випарюванню, що супроводжується кристалізацією, або преципітації за допомогою спирту та (або) корекції рівня рН. Спеціалістам у цій галузі відомі численні варіанти здійснення процесу. Якщо необхідно викликати секрецію продукту, як правило, буде задіяна конститутивна ділянка ініціації транскрипції, хоча можуть використовуватися неконститутивні ділянки.

Про інші переважні втілення можна дізнатися з прикладів з посиланням на фігури, описані у цьому документі, тим не менш, вони не обмежуються наведеними тут. Для цілей цього винаходу всі цитовані джерела включені в цей документ шляхом посилання в усій повноті.

На Фігурі 1 показане порівняння поліпшеної ефективності трансфекції при використанні

ТСЕР у порівнянні з ДТТ в однакових умовах.

Приклади

При втіленні винаходу використовуються, якщо не вказано інакше, традиційні методики електропорації у клітини та клітинної біології дріжджів, добре відомі фахівцям у цій галузі.

І. Середовища 1. Середовище ХРО

Дріжджовий екстракт 10 г

Бакто-пептон 20 г

Декстроза 20 г довести об'єм до 1 л додаванням Нг2О (додати стерильний розчин глюкози до автоклавованого розчину) 2. Середовище 5О-САА (рн 4,5):

Цитрат натрію, дигідрат 14,8 г (кінцева концентрація 50 мМ)

Лимонна кислота, моногідрат 4,2 г (кінцева концентрація 20 мМ) у 800 мл Н2гО, автоклавувати.

Казамінові кислоти 5,0 г

Основа азотного агару для дріжджів (без амінокислот) 6,7 г

Глюкоза 20 г довести об'єм до 1 л додаванням НО і стерилізувати фільтрацією

Зо 3. Чашки з середовищем 50-САА

Сорбіт 182,2 г

Агар 15 г

Цитрат натрію 14,8 г

Лимонна кислота, моногідрат 4,2 г у 800 мл НО, автоклавувати і охолодити до «55 70.

Казамінові кислоти 5,0 г

Основа азотного агару для дріжджів (без амінокислот) 6,7 г

Глюкоза 20 г

Сульфат канаміцину 35 мг у 200 мл НО і стерилізувати фільтрацією, додати до охолодженого автоклавованого розчину

ІЇ. Приготування електрокомпетентних дріжджових клітин 20 мкл щойно відталого від температури -80 "С штаму з колекції Уеєазі 5іосК засівали штрихами на чашки з агаром УРО та інкубували протягом двох діб за температури 30 "с.

Поодинокі колонії (зібрати всю колонію) збирали з чашок із агаром ХРО у 15 мл середовища

МРО ії струшували протягом ночі за температури 30 "С. Наступного ранку 10 мл культури переносили у 100 мл свіжого середовища УРО і продовжували струшування протягом 7 год. за температури 30 "С. Визначали ООвоо і 1 л холодного середовища УРО засівали до досягнення значення ОЮвоо, що становить 0,2. Колбу для струшування поміщали у попередньо охолоджений (4 "С) струшувач. Струшувач програмували таким чином, щоб нагрівання (30 "С) і струшування (250 об/хв) починалося за 5 год. до початку робочого дня. Інкубацію проводили до досягнення значення ОЮвоо 1,5, що звичайно відбувалося через б год. після початку струшування.

Наступні етапи необхідно проводити на льоді і з охолодженими розчинами, пробірками, кюветами та центрифугою, якщо не зазначено інакше.

Клітини осаджували центрифугуванням при 2000 4 і 4 "С протягом З хв (2-стадійний процес у 10 пробірках типу Фалькон на 50 мл), двічі промивали 25 мл холодної НгО і осаджували при 2000 уд протягом З хв. Клітини промивали у 25 мл холодного розчину сорбіту, 1 М/Сасі», 1 мМ; і осаджували при 2000 у протягом З хв. Клітини ресуспендували у 25 мл розчину ацетату літію, бо 100 мМ/ГСЕР, 10 мМ. Використовували пробірки типу Фалькон на 50 мл із фільтрувальною кришкою для забезпечення аерації; клітини інкубували за температури 30 "С при струшуванні при 160 об/хв протягом 30 хв, поміщали на лід і клітини осаджували центрифугуванням при 2000 д і 4 "С протягом З хв. Клітини промивали у 25 мл холодного розчину 1М сорбіту/1 мМ

Сасі»; і осаджували при 2000 4д і 4 "С протягом З хв, і промивали у 25 мл холодного 1М розчину сорбіту; і осаджували центрифугуванням при 2000 д і 4"С протягом 3 хв. Клітини ресуспендували у конічній пробірці у холодному 1 М розчині сорбіту до кінцевого об'єму 400 мкл на процедуру електропорації. Електрокомпетентні клітини можна зберігати безпосередньо за температури -80 "С. Перед використанням зразків для електропорації, солі, що просочилися, необхідно видалити центрифугуванням (2000 д, 4 "С, 5 хв), і промити зразки двічі холодним розчином сорбіту, 1 М.

І. Електропорація 400 мкл клітин змішували з 5-10 мкл ДНК (векторна) у Н2О, витримували на льоді протягом

З хв і переносили у попередньо охолоджену кювету для електропорації з зазором 0,2 см. За допомогою системи для електропорації Віокай МісгоРиїзег клітини були електропоровані при 2,5 КВ. Типові константи часу становили близько 4 мс, переважно 4 мс. Електропоровані клітини переносили у 10 мл суміші 1 М сорбіт: середовище УРО за температури 30 "С на 1 годину без струшування. Клітини збирали при 2000 д протягом 3 хв за кімнатної температури та ресуспендували у 10 мл середовища 5ЮО-САА за кімнатної температури. Для розрахунку різноманітності були здійснені розведення (від 1:105 до 1:107). Розведення у планшетах з середовищем 5О-САА, яке містить канаміцин, інкубували протягом 1 доби за температури 30 "С та трьох діб за кімнатної температури. Бібліотеку переносили у 100 мл середовища 50О-САА (переважно на процедуру електропорації) і продовжували струшування протягом 24 год. за температури 30 "С при 160 об/хв. Розширені бібліотеки можна використовувати безпосередньо для індукції або зберігати за температури 4 "С протягом двох тижнів. Довготривале зберігання може здійснюватися заморожуванням у 30 9о гліцерині за температури -80 "С.

Використовуючи найбільш оптимальні умови для електропорації, можливо за узвичаєною практикою досягти ефективності трансформації дріжджів близько 2х108 дріжджових трансформантів/мкг векторної ДНК (див. Фігуру 1). Оскільки цю ефективність трансформації досягли у мінімальному об'ємі клітин (100 мкл), вона дуже легко піддається автоматизації та

Зо здійсненню на системах для електропорації у багатолункових планшетах.

Claims (11)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб приготування електрокомпетентних дріжджових клітин, що включає стадії, у яких: а) вирощують дріжджові клітини до значень ОЮвоо між 1,0 і 2; б) промивають клітини холодною водою; в) промивають клітини холодним розчином, що містить сорбіт і Сасіг; г) інкубують клітини з розчином, що містить ацетат літію і трис(2-карбоксіетилуфосфін (ТСЕР); д) промивають клітини холодним розчином, що містить сорбіт і Сасіг»; е) ресуспендуюь клітини у розчині, що містить сорбіт.

2. Спосіб за п. 1, який додатково включає стадію зберігання згаданих клітин.

3. Спосіб трансфекції електрокомпетентних дріжджових клітин, що включає стадії, у яких: а) забезпечують електрокомпетентні дріжджові клітини, отримані відповідно до способу за п. 1 або 2; б) промивають клітини холодним розчином, що містить сорбіт; в) змішують клітини із ДНК, призначеної для трансфекції, з утворенням преелектропораційної суміші; г) переносять преелектропораційну суміш у відповідну кювету для електропорації, і д) виконують електропорацію згаданих клітин при значеннях від 2,5 до 12,5 кКВ/см протягом від 2 до 5 мо.

4. Спосіб за п. 3, в якому згадана ДНК є лінійною або кільцевою.

5. Спосіб за п. З або 4, в якому згадана ДНК містить бібліотеку фрагментів ДНК, які кодують бібліотеку білків, що становлять інтерес, наприклад, у вигляді бібліотеки поверхневого дисплея на основі дріжджів.

6 Спосіб за п. 5, в якому згадана бібліотека дисплея є бібліотекою Т-клітинних рецепторів (ТКР).

7. Спосіб за будь-яким із пп. 3-6, у якому ефективність трансформації є вищою ніж 1х108 дріжджових трансформантів/мкг векторної ДНК, переважно вищою ніж 2х108 дріжджових трансформантів/мкг векторної ДНК.

8. Спосіб отримання поліпшеної бібліотеки поверхневого дисплея на основі дріжджів з білків, що 60 становлять інтерес, що включає стадії, у яких:

а) забезпечують трансфековані дріжджові клітини відповідно до способу за будь-яким з пп. 3-7; б) розводять трансфековані клітини розчином сорбіту у поживному середовищі з отриманням суміші у співвідношенні 1:1; в) ресуспендують клітини у відповідному поживному середовищі; г) за необхідності, здійснюють розведення для розрахунку різноманітності і висівають згадані розведення на планшети з середовищем 50-САА, яке містить канаміцин; і д) переносять згадану бібліотеку у відповідне поживне середовище та розширюють згадану бібліотеку шляхом електропорації.

9. Спосіб за п. 8, який додатково включає стадію зберігання згаданої розширеної бібліотеки.

10. Спосіб за п. 8 або 9, в якому згадана бібліотека дисплея є бібліотекою Т-клітинних рецепторів.

11. Спосіб за будь-яким з пп. 8-10, в якому різноманітність згаданої бібліотеки є вищою ніж 10172, 10000 я як щк - 8000 Же чо: війн е . о - 2000 о ФГ І1