CN117431248A - 一种靶向cd3e的dna、dna疫苗及其应用和构建方法 - Google Patents

一种靶向cd3e的dna、dna疫苗及其应用和构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117431248A
CN117431248A CN202311385075.1A CN202311385075A CN117431248A CN 117431248 A CN117431248 A CN 117431248A CN 202311385075 A CN202311385075 A CN 202311385075A CN 117431248 A CN117431248 A CN 117431248A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cd3e
sequence
dna
region
dna vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311385075.1A
Other languages
English (en)
Inventor
游小燕
葛良鹏
丁玉春
樊欣
刘雪芹
刘一帆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Academy of Animal Sciences
Original Assignee
Chongqing Academy of Animal Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Academy of Animal Sciences filed Critical Chongqing Academy of Animal Sciences
Priority to CN202311385075.1A priority Critical patent/CN117431248A/zh
Publication of CN117431248A publication Critical patent/CN117431248A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种靶向CD3E的DNA、DNA疫苗及其应用和构建方法，所述DNA是通过对野生型CD3E编码序列的信号肽、疏水区、跨膜区和亲水区的一个或多个区域的序列进行优化而得到的，且所述DNA具有针对野生型CD3E蛋白的免疫原性。本发明构建的DNA疫苗，以DNA形式进入胞内，并能产生人CD3特异性抗体，解决了体外无法获得天然折叠状态CD3蛋白的技术瓶颈以及CD3抗体获得困难等技术问题，可促进CD3靶点抗体药物的研发。

Description

一种靶向CD3E的DNA、DNA疫苗及其应用和构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程和重组DNA疫苗技术领域，具体涉及一种靶向CD3E的DNA、DNA疫苗及其应用和构建方法。
背景技术
CD3是T细胞表面的重要标志，与T淋巴细胞表面受体(T-cell receptor,TCR)以非共价键结合形成TCR/CD3受体复合物，介导T细胞识别抗原和信号。据全球药物研发数据库显示，CD3为TOP5的热门靶点，在生物医药领域具有广泛应用前景。CD3包括五条肽链，分别为CD3δ、CD3ε(CD3E)、CD3γ、CD3ζ和CD3η，其中CD3E包括一个免疫受体酪氨酸激活基序和一个免疫球蛋白样亚基，也是CD3抗体常用的靶点。当前，靶向CD3E的抗原通过识别异源二聚体的CD3ε，激活T细胞，达到肿瘤杀伤目的。
根据相关资料，1986年第一个被FDA批准上市的单抗药物就是CD3ε的单抗Muromonab，用于治疗器官移植后的急性排斥反应。其他靶向CD3ε的单克隆抗体包括Otelixizumab、Teplizumab、Visilizumab等，可用于治疗克罗恩病和糖尿病等。
在T细胞导向的双特异性抗体中，CD3ε是靶点之一。例如Catumaxomab抗体由一个靶向肿瘤EpCAM的小鼠IgG2a抗体和一个靶向CD3ε的大鼠IgG2b抗体组成。
在专利文献中也包括大量靶向CD3ε的抗体专利申请。例如中国专利申请CN112533950A公开了抗CD3e(T细胞表面糖蛋白CD3ε链)抗体、抗原结合片段及其用途。中国专利申请CN115052897A公开了双特异性人源化PLAP(胎盘碱性磷酸酶)CD3ε链(CD3e)抗体，以及通过向患者施用该双特异性PLAP CD3e抗体来杀伤PLAP阳性癌细胞的方法。
这些抗体基本上都是用于T细胞导向的肿瘤治疗应用。但是由于其靶向的异源CD3ε蛋白的结构和功能存在不确定性和批间差异性，制约了CD3E作为靶点的应用。而且抗体的生产工艺极为复杂，成本较高，更不用说双特异性抗体的生产。同时由于体外很难获得天然折叠状态的CD3蛋白，尚未开发出CD3E的蛋白质疫苗。
而DNA疫苗与传统蛋白质疫苗相比，可以触发广泛的免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫，刺激T细胞、B细胞和抗体的产生，且DNA疫苗生产过程简单，对温度和湿度要求不高，方便储存和运输。
DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的新型疫苗，是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第3代疫苗。它是由插入一种或多种外源基因的质粒DNA(通常来自细菌)和真核调控元件构成，载有外源抗原的质粒DNA在真核表达载体控制下，可在哺乳动物的各类细胞中表达出相关的抗原蛋白。将重组有外源抗原编码基因的质粒，通过电穿孔等方法导入人或动物的细胞内，通过宿主细胞的转录系统，在被免疫对象的活体细胞内合成抗原蛋白，从而诱导其产生免疫应答。
例如中国专利申请CN 112266411A公开了一种新型冠状病毒疫苗及其应用，具体涉及截短的Spike蛋白，包含所述截短的Spike蛋白的融合蛋白，包含编码所述截短的Spike蛋白或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，以及包含所述核酸分子的载体和宿主细胞。此外，本申请还涉及包含所述截短的Spike蛋白、融合蛋白、核酸分子或载体的药物组合物，特别是DNA疫苗。
中国专利申请CN101851631A公开了一种密码子优化的EV71 VP1基因及其核酸疫苗，针对的是肠道病毒71型。
中国专利申请CN110205335A公开了以序列优化的分泌形式的FAPα为基础的肿瘤DNA疫苗的应用。
尽管大量的DNA疫苗研究成为热点并取得了一定的进展，但仍面临DNA疫苗免疫效力低等挑战，由于DNA疫苗对细胞的转染率较低，表现在体内外的表达效率偏低，不借助外力，一般裸质粒就需要采用高剂量进行治疗，由此导致临床需要很高剂量，对成本的增加和副作用的增加都是很大的问题。而且当前DNA疫苗基本上用于抗病毒，披露过的针对肿瘤的DNA疫苗也不是靶向T细胞的DNA疫苗。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的是提供一种靶向CD3E的DNA、DNA疫苗及其应用和构建方法。
本发明的技术方案具体为：
一种DNA，其特征在于，所述DNA是通过对野生型CD3E编码序列的信号肽、疏水区、跨膜区和亲水区的一个或多个区域的序列进行优化而得到的，且所述DNA具有针对野生型CD3E蛋白的免疫原性。
优选地，所述DNA的序列包含SEQ ID NO:1-4所示的一种或多种序列，SEQ ID NO:1-4分别编码CD3E蛋白的信号肽、疏水区、跨膜区和亲水区序列。
本发明还提供了所述DNA在构建靶向CD3E基因的DNA疫苗中的应用。
本发明提供了一种靶向CD3E基因的DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗包含本发明所述DNA和真核表达载体。优选地，所述真核表达载体为pcDNA3.1。
本发明还提供了所述DNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)优化序列：在CD3E基因序列基础上，分别优化信号肽、疏水区、跨膜区以及亲水区序列；
2)合成序列：合成得到优化序列后的CD3E合成序列；
3)构建载体：将步骤2)所得CD3E合成序列连接到真核表达载体中得到载体-CD3E质粒；
4)克隆：将步骤3)构建的载体-CD3E质粒转化到宿主菌中，筛选获得质粒重组菌，扩增测序验证，即得所述DNA疫苗。
最优选地，本发明所述DNA疫苗的构建方法包括以下步骤：
1)优化序列：在CD3E基因序列基础上，分别优化信号肽、疏水区、跨膜区以及亲水区序列得到SEQ ID NO：1-4；
2)合成序列：分析优化后序列，在序列两端分别添加XbaI与EcoRI两个酶切位点后进行合成得到CD3E合成序列；
3)构建载体：用HindIII与XhoI双酶切pcDNA3.1骨架载体，将步骤2)所得CD3E合成序列连接到所述pcDNA3.1载体中得到pcDNA3.1-CD3E质粒；
4)克隆：将步骤3)构建的pcDNA3.1-CD3E质粒转化到大肠杆菌中，筛选获得pcDNA3.1-CD3E重组菌，扩增测序验证，即得所述DNA疫苗。
有益效果
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
目前，疫苗主要以蛋白形式存在，但由于体外无法获得天然折叠状态CD3蛋白，因此其蛋白疫苗构建困难。本发明构建的pcDNA3.1-CD3E DNA疫苗，以DNA形式进入胞内，并能产生人CD3特异性抗体，解决体外无法获得天然折叠状态CD3蛋白的技术瓶颈，促进CD3靶点抗体药物的研发。
此外，尽管靶向CD3的抗体是热门研究方向，但由于CD3蛋白结构的复杂性和特殊性，获得CD3抗体非常困难。而本发明构建的靶向CD3E的pcDNA3.1-CD3E DNA疫苗，操作简单，成本低廉，转染293细胞后，可以更方便地获得特异性人CD3抗体。
总体而言，本发明得到的疫苗具有制作简单、成本低廉、易保存、易运输等便利性特点。
附图简要说明
图1显示了本发明构建的pcDNA3.1-CD3E质粒的电泳图。
图2显示了本发明构建的pcDNA3.1-CD3E中CD3E的序列测序图谱。
图3显示了本发明构建的pcDNA3.1-CD3E转染细胞表达的人CD3E蛋白的SDS-PAGE检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明。但需要指出的是，本发明以下所举实施例仅仅是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不代表本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围，以所附权利要求的保护范围为准。
本领域技术人员公知，本发明所述CD3E是T细胞表面重要标志CD3的组成部分之一。CD3与T淋巴细胞表面受体(T-cell receptor,TCR)以非共价键结合形成TCR/CD3受体复合物，介导T细胞识别抗原和信号，其包括五条肽链，分别为CD3δ、CD3ε(即CD3E)、CD3γ、CD3ζ和CD3η；其中CD3E包括一个免疫受体酪氨酸激活基序和一个免疫球蛋白样亚基，也是CD3抗体常用的靶点。当前，靶向CD3E的抗原通过识别异源二聚体(CD3δ/CD3ε)的CD3ε，激活T细胞，达到肿瘤杀伤目的。
本领域技术人员公知，DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的新型疫苗，是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第3代疫苗。它是由插入一种或多种外源基因的质粒DNA(通常来自细菌)和真核调控元件构成，载有外源抗原的质粒DNA在真核表达载体控制下，可在哺乳动物的各类细胞中表达出相关的抗原蛋白。将重组有外源抗原编码基因的质粒，通过电穿孔等方法导入人或动物的细胞内，通过宿主细胞的转录系统，在被免疫对象的活体细胞内合成抗原蛋白，从而诱导其产生免疫应答。DNA疫苗与传统蛋白质疫苗相比，可以触发广泛的免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫，刺激T细胞、B细胞和抗体的产生，且DNA疫苗生产过程简单，对温度和湿度要求不高，方便储存和运输。
免疫相关的其他技术和使用的仪器设备、材料等都是本领域技术人员所熟知的，例如用抗原免疫动物(例如小鼠)、ELISA分析抗体量等。本发明中未特别指明其中所采用的技术、仪器设备和材料的，都可以使用本领域技术人员所熟知的能够达到相同目的的其他任何技术、仪器设备和材料等；即使本发明中特别指明了其中所采用的技术、仪器设备和材料的，也不表明本发明只能采用这些技术、仪器设备和材料，仅仅代表本发明的优选方案，本领域技术人员仍然可以采用本领域技术人员所熟知的能够达到相同目的的其他任何技术、仪器设备和材料。
实施例1、pcDNA3.1-CD3E DNA疫苗构建
1)在CD3E基因(Gene ID:916，具体序列参见NCBI)序列基础上，优化得到信号肽(SEQ ID NO:1)、疏水区(SEQ ID NO:2)、跨膜区(SEQ ID NO:3)和亲水区(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列，交由擎科生物科技股份有限公司合成。
其中，所述信号肽基因序列如以下SEQ ID NO:1所示：ATGCAGAGCGGGACCCACTGGAGGGTGCTGGGGCTGTGTCTGCTGTCCGT GGGCGTGTGGGGC
所述疏水区基因序列如以下SEQ ID NO:2所示：
CAGGACGGCAACGAGGAGATGGCCTACAAGGTGAGCATCTCCGGCACCA
CCGTGATCCTGACATGCCCTCAGTACCCCGGGTCCGAGATCCTGTGGCAG
CACAACGACAAAAACATTGGCGGAGATGAGGACGACAAAAACATCGGGA
GCGATGAGGACCACCTGAGCCTGAAAGAGTTCAGTGAGCTGGAGCAGAG
CGGCTACTATGTGTGCTACCCAAGAGGCAGCAAGCCTGAGGACGCCAACT
TCTACCTGTACCTGCGGGCCAGAGTGTGCGAGAACTGCATGGAGATGGACGTGATGTCA
所述跨膜区基因序列如以下SEQ ID NO:3所示：
GTGGCCACCATCGTGATCGTGGACATATGTATCACAGGCGGCCTATTGCTGCTGGTGTACTACTGGAGC
所述亲水区基因序列如以下SEQ ID NO:4所示：
AAGAACCGGAAGGCCAAGGCTAAGCCCGTGACACGGGGGGCCGGAGCCGGCGGCAGGCAGAGAGGCCAGAACAAGGAGAGACCCCCACCTGTGCCCAACCCTGATTACGAGCCAATCAGAAAGGGCCAGAGAGACCTGTACAGCGGCCTGAACCAGCGGAGGATCTGA
2)在步骤1)合成的序列两端加上EcoRI与XbaI酶切位点，得到合成CD3E靶向序列。
3)用HindIII与XhoI双酶切pcDNA3.1骨架载体，将步骤2)所得合成CD3E靶向序列连接到真核表达载体pcDNA3.1中,获得pcDNA3.1-CD3E载体。
4)将步骤3)所得pcDNA3.1-CD3E载体转化感受态细胞，涂布于含氨苄抗性LB平板，37℃培养过夜，挑选单个白色菌落，接种至含氨苄的LB液体培养基中培养过夜。采用小量质粒提取试剂盒(Omega)提取质粒，进行酶切鉴定，并将质粒进行测序验证。将该表达质粒命名为pcDNA3.1-CD3E质粒。
实施例2、体外表达验证
1)提取实施例1所得pcDNA3.1-CD3E质粒，酒精沉淀法析出质粒，灭菌水溶解，将质粒浓度调整至1μg/μl备用；
2)复苏293细胞至24孔板，细胞生长至80％时，使用EZ Trans转染试剂(上海李记生物)转染；
3)37℃，5％ CO2培养箱培养6-18h，去除含EZ Trans-DNA复合物的培养液，更换新的培养液。
4)37℃，5％ CO2培养箱培养6天；
5)SDS-PAGE检测：转染细胞培养6天，胰酶消化收集细胞，超声波破碎，收集细胞上清，取10μl进行SDS-PAGE，通过电转将蛋白转至PVDF膜上，用1.5％的脱脂奶粉封闭，室温孵育1.5h，弃封闭液，加入稀释好的抗体His-probe abtibody(H-3)(Santa Cruz Biotechno-logy)：sc-8036Alexa Fluor 680(Santa Cruz Biotechno-logy)(1:1000稀释)，室温孵育2h，用TBST缓冲液(Solarbio)洗涤5次，5min/次，用Odyssey双色红外荧光成像系统成像。
以人血清为阳性对照，未转染细胞为阴性对照，通过SDS-PAGE检测，如图3所示结果证实：pcDNA3.1-CD3E转染细胞能表达人CD3E蛋白。
实施例3、体内表达验证
1)大量提取实施例1所得pcDNA3.1-CD3E质粒，酒精沉淀法析出质粒，灭菌水溶解备用；
2)选择遗传背景一致，体重相差±3g的8周龄昆明白母鼠(维通利华)10只，随机分为2个组，即实验组与对照组，每组5个重复。
3)免疫方法(具体免疫方法详见下表2)：实验组按质粒：佐剂＝1：1，每次右腿肌肉注射50μl，注射完成后，再使用NEPA21电转仪(NEPA GENE)活体电转，隔天免疫1次，总计7次；对照组用无菌水替换质粒，按照无菌水：佐剂＝1：1，每次右腿肌肉注射50μl，注射完成后，再使用NEPA21活体电转，隔天免疫1次，总计7次。
表1小鼠免疫方法
组别 对照组 实验组
第0天质粒(μg) 0 0.1
第2天质粒(μg) 0 0.645
第4天质粒(μg) 0 1.74
第6天质粒(μg) 0 4.725
第8天质粒(μg) 0 12.84
第10天质粒(μg) 0 34.95
第12天质粒(μg) 0 94.8
质粒总量(μg) 0 150
质粒体积(μl) 0 25
佐剂体积(μl) 25 25
4)免疫完成后第2周，采集小鼠眼眶血，分离血清；
5)Elisa检测：Human CD3 epsilon&CD3 delta Heterodimer Protein(ACROBiosystems)以0.5μg/ml浓度50μl包被于ELISA板中，4℃孵育过夜，用PBST(Solarbio)洗3次，加入1％ BSA封闭2h；PBST洗3次，加入50μl小鼠血清(1：10稀释)，室温孵育1h；PBST洗3次，加入1:5000稀释的Mouse Anti-Human IgG Fab Monoclonal SecondaryAntibody(南京金斯瑞生物科技有限公司)室温孵育1h；PBST洗3次后，加入TMB(Solarbio)进行显色20min；加入2mol/L硫酸溶液终止，用酶标仪读取OD450 nm值。
以人血清为阳性对照，Elisa检测结果显示：实验组小鼠免疫后第2周产生人CD3抗体(具体结果详见下表2)，对照组未检测到人CD3抗体。
表2：免疫小鼠ELISA检测结果
以上结果表明，本发明所述DNA能够在体内表达人CDE3蛋白，并有效诱导人CD3抗体的产生，可以作为有效的DNA疫苗。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的技术常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知技术不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干调整和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (7)

1.一种DNA，其特征在于，所述DNA是通过对野生型CD3E编码序列的信号肽、疏水区、跨膜区和亲水区的一个或多个区域的序列进行优化而得到的，且所述DNA具有针对野生型CD3E蛋白的免疫原性。
2.根据权利要求1所述的DNA，其序列包含SEQ ID NO:1-4所示的一种或多种序列，SEQID NO:1-4分别编码CD3E蛋白的信号肽、疏水区、跨膜区和亲水区序列。
3.根据权利要求1或2所述DNA在构建靶向CD3E基因的DNA疫苗中的应用。
4.一种靶向CD3E基因的DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗包含权利要求1或2所述的DNA和真核表达载体。
5.根据权利要求4所述的DNA疫苗，其特征在于，所述真核表达载体为pcDNA3.1。
6.权利要求4或5所述DNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）优化序列：在CD3E基因序列基础上，分别优化信号肽、疏水区、跨膜区以及亲水区序列；
2）合成序列：合成得到优化序列后的CD3E合成序列；
3）构建载体：将步骤2）所得CD3E合成序列连接到真核表达载体中得到载体-CD3E质粒；
4）克隆：将步骤3）构建的载体-CD3E质粒转化到宿主菌中，筛选获得质粒重组菌，扩增测序验证，即得所述DNA疫苗。
7.权利要求6所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）优化序列：在CD3E基因序列基础上，分别优化信号肽、疏水区、跨膜区以及亲水区序列得到SEQ ID NO：1-4；
2）合成序列：分析优化后序列，在序列两端分别添加XbaI与EcoRI两个酶切位点后进行合成得到CD3E合成序列；
3）构建载体：用HindIII与XhoI双酶切pcDNA3.1骨架载体，将步骤2）所得CD3E合成序列连接到所述pcDNA3.1载体中得到pcDNA3.1-CD3E质粒；
4）克隆：将步骤3）构建的pcDNA3.1-CD3E质粒转化到大肠杆菌中，筛选获得pcDNA3.1-CD3E重组菌，扩增测序验证，即得所述DNA疫苗。
CN202311385075.1A 2023-10-25 2023-10-25 一种靶向cd3e的dna、dna疫苗及其应用和构建方法 Pending CN117431248A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311385075.1A CN117431248A (zh) 2023-10-25 2023-10-25 一种靶向cd3e的dna、dna疫苗及其应用和构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311385075.1A CN117431248A (zh) 2023-10-25 2023-10-25 一种靶向cd3e的dna、dna疫苗及其应用和构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117431248A true CN117431248A (zh) 2024-01-23

Family

ID=89549184

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311385075.1A Pending CN117431248A (zh) 2023-10-25 2023-10-25 一种靶向cd3e的dna、dna疫苗及其应用和构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117431248A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110981968B (zh) 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN107630024B (zh) 编码h5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的基因及其应用
CN112142851B (zh) 一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG及其制备方法和应用
CN110551187B (zh) 化学合成的h7n9禽流感病毒na蛋白胞外区抗原片段及制备方法和应用
CN113186223A (zh) 一种新冠病毒疫苗的表达载体及其构建方法、应用和疫苗
Sremac et al. Recombinant gas vesicles from Halobacterium sp. displaying SIV peptides demonstrate biotechnology potential as a pathogen peptide delivery vehicle
CN113249408B (zh) 一种靶向激活体液免疫和细胞免疫的核酸疫苗载体构建及应用
CN104911195A (zh) 一种修饰的抗狂犬病病毒HEP-Flury株M蛋白及其单克隆抗体的制备和应用
CN111454989A (zh) 一种嵌合型基因i型乙型脑炎病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN103360497A (zh) 一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用
CN106905434A (zh) 一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用
CN101015689A (zh) 基于血管紧张素ⅱ的肿瘤多肽疫苗
CN117431248A (zh) 一种靶向cd3e的dna、dna疫苗及其应用和构建方法
CN113372452B (zh) 一种细粒棘球绦虫重组蛋白CTLA4-IgV-EgG1Y162及其应用
CN115779079A (zh) 一种可增强与佐剂协同免疫效力的电荷调控型抗原蛋白
CN115073565A (zh) 重组新型冠状病毒s蛋白三聚体及其制备方法与应用
CN1994465B (zh) Ccr5自体多肽疫苗及其制备方法
CN110066827B (zh) 含猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因的重组杆状病毒转移载体、重组杆状病毒及制备方法和应用
CN106929512A (zh) St2抗原的制备及其专用编码dna分子
CN106397602A (zh) 一种分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗
CN105504058A (zh) 一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法
CN109985235A (zh) 鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗
CN112250768B (zh) 牛副流感病毒重组抗原及其应用
CN116496416B (zh) 一种法氏囊结构蛋白vp2多表位串联表达蛋白
CN117003898B (zh) 一种lhrh4-crm197-lf多聚重组蛋白及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination